Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение белоксинтезирующего аппарата миокарда кролика при тотальной ишемии

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение белоксинтезирующего аппарата миокарда кролика при тотальной ишемии"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДКШЯ НАУК УССР

ИНСТИТУТ МСДШЯЯРНОЯ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

МАСКШШНАС Роландас Казевич

УДК 577.1+616.127+616.12-005.4

ИЗУЧЕНИЕ БЕИ0КСИНТЕЗИРШДЕГ0 АППАРАТА ШОКАРДА КРОЛИКА ПРИ ТОТАЛЬНОЙ ИШЕШИ

03,00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1990

Работа, выполнен* в отделе механизмов трансляции генетической информации Института молекулярной биологии и генетики АН УССР и на кафедре биологической и органической химия Каунасской медицинской академии

Научный руководитель: член-корр. АН УССР,

доктор биологических иаук А.0. £льская

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

0.0. Оаворова доктор биологических наук М.А. Тукало

Ведущее учреждение - Институт биохимии АН Литевскоя республики

Зящнта состоится "¿f" ce^JiTJL^ I990 г> чаосв на заседании специализированного совета Д 016.II .01 Института молекулярной биологии и генетики АН УССР п® адресу: 252627, Киев-143, ул. Злболотного 15О.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР.

Автореферат разослан " 1990 г.

Ученый секретарь

¡света И наук

О

специализированного совета п w--* доктор биологических наук Т.И. Бужиевскал

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОИ

Актуальность проблемы. Биосинтез белка является важнейшим процессом клеточного метаболизма. Нарушение или изменение многочисленных защитных, транспортных, каталитических и других функций белков и полипептид'ов при нарушении биосинтеза белка может иметь непоправимые последствия для жизнедеятельности метки или целого органа. Поэтому один из подходов к изучению механизмов белкового синтеза и его регуляции заключается в исследовании бе-локсинтезирующего аппарата и его компонентов в нормальных и измененных условиях жизнедеятельности организма.

Ишемическая болезнь сердца - одна из наиболее распространенных патологий в современном мирэ, развивается вследствие недостаточного обеспечения миокардиальных клеток кислородом и необходимыми субстратами. Лолное прекращение кровоснабжения обуславливает развитие тотальной ишемчи, которая является не только причиной нарушения основной функции сердечной мышцы - сокращения, но также морфологических / Reimer К.A., Jenninga Н.Э., 1986/ , и метаболических /Оетисова Т.В., Оролькис И.А., 1976; Хао Е. et al., 1976/ изменений в миокарде.

Для изучения механизмов нарушения различных метаболических процессов в миокарде используется ряд экспериментальных моделей /Anaiger L.C. et al., 1976} Hordaon P.B. et al., 1969} Schreiber S.S. et al. ,198V, в том числе и инкубация в камере с физиологическим раствором изолированной сердечной мышцы. Этот метод при физиологических температурах позволяет довольно простым способом получить гомогенно ишемизированную ткань, в которой морфологические и метаболические изменения во многом соответствуют таковым при ишемии миокарда ln vivo / A raigo г L.C., Кг.а 11 С.М., 1988$ Негйзоп P.B. et al., 1987/. Важно подчеркнуть, что до 20 мин эти изменения имеют обратимый характер, и линь затем постепенно становятся необратимыми. В связи с этим целесообразно изучать молекулярные механизмы нарушения белкового синтеза как в ранние сроки ишемии, когда еще не нарушена полностью его регуляция, так и в период наступления необратимых изменений.

К настоящему времени при ишемии миокарда довольно детально исследованы свойства лишь отдельных компонентов белоксинтезирув-щего аппарата,, в том числе некоторых аминоацил-тРНК-синтетаз (АРСаэ) и тРНК. Так, после 15- и 30-минутной тотальной ишемии в

миокарде свиньи обнаружено частичное перераспределение лейцил-тРНК-синтетаэной активности между фракциями свободных ферментов и высокомолекулярных комплексов /Стапуленис Р.Г. и др., 1987/. Установлено также увеличение АРСазной активности экстрактов миокарда после 15-минутной тотальной ишемии и уменьшение ее после 30-минутной ишемии /Тамулявичюс А.Л. и др., 1985/, а также обратимое уменьшение акцепторной активности некоторых тРНК /Коваленко М.И. и др., 1984/ вследствие появления их неактивных конформеров. Эти факты свидетельствуют о том,что в начальные сроки ишемии не происходит тотальный необратимый слом аппарата трансляции, а, по-видимому, действуют компенсаторные механизмы, направленные, в определенной мере, на стабилизацию биосинтеза белка. Однако эти механизмы, а также структурно-функциональные особенности других компонентов аппарата трансляции и нарушение- рибосомной стадии биосинтеза белка в условиях ишемического повреждения миокарда пока исследованы недостаточно, хотя такие данные имели бы существенное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение интегральной активности белоксинтезирующе-го аппарата и отдельных этапов рибосомной стадии биосинтеза белка в норме и при ишемии миокарда.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Определить скорость и уровень биосинтеза белка в бескле-точнкх системах, полученных из миокарда кролика после кратковременной (15 мин) и более длительной (30 мин) тотальной кшемш.

2. Определить вклад рибосомной стадии и ее отдельных этапов в возможное изменение биосинтеза белка при ишемии миокарда.

3. Сравнить состаз рибосомного пула нормального и ишемизи-рованного миокарда.

4. Провести электрофоретический анализ продуктов трансляции гндогеншлс мРНК в бесклеточных системах из интактного и ишемизи-рованного миокарда.

Научная новизна и практическая, ценность работы. С использованием разработанных бесклетсчных белоксинтвзируюцих систем обнаружено изменение скорости и уровня биосинтеза белка при кратковременной (15 мин) и более длительной (30 мин) ишемии сердечной кыицы. Установлено, что уменьшение этих параметров при ишемии зависит не только от дефицита таких энергетических соединений

как креатинфосфат (KP) и ATP, но и от изменений в самом аппарате трансляции. Так, при оптимальных концентрациях энергетических ком-юнентоз в бесклеточных системах из ишемизированного миокарда на-5людается увеличение времени синтеза "средней" полипептидной цепи, г.е. снижение скорости элонгации и терминации, и угнетение реини-диации. Обнаружены существенные изменения состава и функциональной активности отдельных классов рибосом, в том числе перераспределение между свободными и мембраносвязэнными, а также изменение бе-поксинтезирующей активности обоих классов рибосом при тотальной ишемии. С помощью электрофоретического анализа с последующей авторадиографией выявлены изменения в спектра белков, синтезированных в бесклеточной системе из ишемизированного 30 мин миокарда, в частности отмечено появление на авторадиограмме белковых фракций в гонах, соответствующих молекулярным массам 20 и 70 кДа.

Полученные результаты важны для понимания причин и механизмов^ лежащих в основе нарушения биосинтеза балка в миокардиальных клетках при ишемии, что может способствовать созданию теоретической базы для поиска средств нормализации белкового обмена при данной патологии. С другой стороны, представленные данные расширяют знания о функционировании эукариотического аппарата-трансляции в экстремальных условиях и о факторах, влияющих на его эффективность.

Теоретические выводы работы о функционировании аппарата белкового синтеза сердечной мышцы при ишемии включены в курс лекций по биохимии для студентов Каунасской медицинской академии.

Для решения поставленных задач в ходе экспериментальной работы был применен метод флюорографического анализа для ^С-мече-ных белков, разделенных методом электрофореза (рац. предложение № 516 КМА). Предложенный метод применяется в лаборатории патохи-мии ЦНИЛ при КМА.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались: на научной конференции молодых ученых медиков Литовской республики /Каунас, 1988/; на 1У съезде биохимиков Литвы /Вильнюс, 1988/; на III съезде кардиологов Литвы /Каунас, 1990/; на XIX и XX конференциях Федерации Европейских Биохимических Обществ /Рим, 1989 и Будапешт, 1990/; на X конференции Европейской секции Международного общества по изучению сердца /Роттердам, 1939/.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы /198 названия/. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 18 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТУ

Материалы и методы. Для экспериментов использовали кроликов-самцов массой 2,5-3,5 кг. Объектом исследования служило сердце кролика в норме и после 15- и 30-минутной инкубации сердечной мышцы в камере с физиологическим раствором (0,9% KCI). Время тотальной ишемии, соответствующее обратимым и необратимым изменениям в миокарде, было подобрано согласно литературным данным /.Arraigar L.C. et al., 1976/, где указывается, что метаболические и морфологические изменения в сердце после 25-40-минутной тотальной ишемии носят необратимый характер, в то время как реперфуэия данного органа после 15-20-минутной инкубации в камере практически полностью восстанавливает функции сердечной мышцы.

Фракцию S-ЗО получали путем центрифугирования гомогената сердечной мшцы при 30 ОООх g в течение 20 мин (постмитохонд-риальный супернатант).

Цитозольную фракцию получали центрифугированием постмитохонд-риального супернатанта при 125 ООО х g в течение 2 часов с последующей очисткой от эндогенных низкомолекулярных соединений на колонке с сефадексом G-25.

Скорость и уровень биосинтеза белка в норме и при 15- и 30-минутной ишемии определяли в бесклеточной системе, содержащей S-ЗО фракцию (система I), а также в реконструированной бесклеточной системе, включающей цитозоль и рибосомные препараты (система II). Реакционная смесь системы .1, объемом 50 мкл, содержала: 50 мМ трис-HCI (рН 7,6), 5 мМ MgCl2, 100 мМ KCI, 50 мМ креатин-фосфат, 2 мМ АТР, 0,1 мМ (0,04 KBq ) [!4С] аргинин и I о.е. Ao-q фракции S-30 . Для определения скорости биосинтеза белка использовали время инкубации реакционно;: смеси-15 мин при 37°С, которое соответствует прямолинейному участку зависимости образования продукта от времени инкубации, а для определения уровня биосинтеза белка - 60 ш, что соответствует плато этой кинети-

ческой кривой.

Инкубационная смесь системы II. в объеме 100 мкл содержала: 50 мМ трис-HCI (pH 7,6), 5 мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 10 мМ креатин-фосфат, 3 тег креатинфосФокинаэы, 0,25 мМ АТР, 0,25 мМ OTP , 2 мМ дитиотреитол, 0,025 мМ [^С] леРцин, 0,025 мМ каждую из нерадиоактивных аминокислот (исключая лейцин), 0,25 o.e. Apj¿g рибссомных препаратов и 0,1 o.e. A£gQ цитозоля. Смесь инкубировали 15 мин для определения скорости и 120 мин для определения уровня биосинтеза белка. Пробы обрабатывали как описано в /Некие A.B. и др., 1985/.

Время синтеза "средней" полипептидяой цепи определяли по методу Лейтина В.Л. и Лермана М.И. /1975/.

Суммарные рибосомы ( Н£ ) выделяли по модифицированной методике / zahringer J. et al., 1981 /. Для разделения свободных ( Rp ) и мембраносвяэанных ( йд ) рибосом использовали методику Бермана А.Е. /1977/. Препараты R t » и центрифугировали в центрифуге "SORVALL ОТО-75" (ротор ЛН-627) при 26 ООО об/шн в течение 3 часов и рассчитывали з них относительное содержание поли с о,много материала.

Электрофорез в лолианриламидлом геле в присутствии додецнл-сульбата натрия проводили по методу Laeali. U.K. /1970/. Для выявления продуктов трансляции бесклеточной белоксинтезирукзцей системы использовали метод авторадиографии. Окрашенные гели помещали в раствор "AMPLIFY" ("Amerahao") на I час, после чего высушивали и помещали в кассету с рентгенографической пленкой РМ-В. Кассету выдерживали 6-8 дней в холодильнике при температуре -80°С, а затем пленку проявляли.

Для определения интенсивности реинициации з процессе трансляции эндогенных мРНК в реконструированной белоксинтезируюцей системе использовали ингибитор инициации ауринтрикарбоновую кислоту (ATA). Соотношение уровней включения[ С]лойцина в продукт трансляции после 60 мин инкубации в присутствии ATA и без нео (контроль) явилось характеристикой эффективности реинициации.

Достоверность результатов оценивали по t-тесту Стьюдента /Яакин Г.Ф., 1980/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДШЕ

Изучение уровня биосинтеза белка в бесклеточных белоксинтезирующих системах из интактного и ише-мизкрованного миокарда

Скорость и уровень биосинтеза белка определяли в бесклеточной белоксинтезирущей системе, содержащей неочищенную фракцию S-30, в состав которой входят все необходимые компоненты аппарата трансляции - рибосомы, тРНК, АРСазы, белковые факторы, аминокислоты и энергетические ресурсы. Такая система в наибольшей степени отражает ситуацию in vivo.

Результаты экспериментов, представленных на рис. I, свиде-тельс£вуют о том, что уже кратковременная ишемия миокарда (15 мии) существенно влияет на функциональную активность трансляционного аппарата клеток миокарда. Так, скорость и уровень включения[ С} аргинина в ТХУ-нерастворимый продукт трансляции снижается на 38f° и 33% соответственно по сравнению с нормой. При увеличении времени ишемии . до 30 мин эти показатели соответственно уменьшаются на 63$ и 65%.

Необходимо отметить, что введение в систему дополнительного количества креатинфосфата резко повышало уровень включения метки, причем как в системе из интактного, так и из ишемизированного миокарда. Необходимость добавления КР и его влияние на повышение эффективности процесса трансляции могут быть объяснены тем, что креатинфосфат, участвуя в реакции регенерации ADP до ATP, по-видимому, нормализует соотношение ADP/ATP . Об этом же свидетельствует и тот факт, что добавление в реакционные смеси АТР и GTP имело гораздо меньший эффект чем КР. Это явление может быть связано о накоплением ADP и GDP , которые в отсутствии КР не могут быть переведены в трифосфаты.

Однако, несмотря на то, что в бесклеточных белоксинтезирую-щих системах из интактной и ишемизированной ткани, содержащих фракцию S-ЗО , концентрации ATP, OTP и КР были доведены до оптимальных, при ишемии миокарда наблюдалось заметное уменьшение скорости и уровня включения метки. Это позволяет предположить, что данное уменьшение связано не только с недостатком энергетических соединений, а определяется и другими факторами. Поэтому,

инкубации ,миц

Рис. I. Зависимость уровня включения[^С^-арпшина в ТХУ-нерастворккыЯ продукт трансляции в бесклеточной белоксинтезирутощей системе из миокарда кролика от времени инкубации, (о—о) - норма, (о—о) -15 мин ишемия, (п—а) - 30 мин ишемия.

для более детальной характеристики функционирования аппарата трансляции миокардиалькых клеток при ишемии были изучены отдельные стадии рибосокного этапа биосинтеза белка. Одним из кинетических параметров является время синтеза "средней" полипелтидней цепи, которое дает, в основном, представление о скорости элонгации.

Из полученных данных (табл. I) следует, что 15- и 30-минутная ишегая приводит к значительному увеличению этого показателя.

В системе с 3-30 фракцией была изучена и эффективность процесса реинициации. Двнн^о экспериментов (представленные на с. ) показали, что после 15- и 30-минутной ишемии этот процесс значительно угнетается, о чем свидетельствует уменьшение соотношения уровней включения метки в отсутствие и в присутствии ингибитора •инициации.

Уменьшение скоростной уровня биосинтеза белка, определяемое снижением скорости элонгации и угнетением процесса инициации при

- а -

таблица I

Время синтеза "средней" полипептидной цепи в бесклеточной белоксинтеэирующей системе из интактного и ишемизированного миокарда (мин; ¡1 - м; и = 3)

Норма Время тотальной ишемии

15 30

1,6 ± 0,1 3,5 ± 0,5 ' 4,1 ± 0,6

тотальной ишемии, указывает на снижение функциональной активности аппарата биосинтеза белка. Для выяснения вопроса, на какие же его компоненты ишемия миокарда оказывает наиболее выраженное влияние, нами была разработана реконструированная бесклеточная белоксинте-зирувщая система, включающая рибосомные препараты и цитоооль. Такал система белкового синтеза дает возможность исследовать активность рибосом и цитозольных компонентов в отдельности и оценить изменение их активности при ишемии. Влияние тотальной ишемии на функциональную активность препаратов рибосом и цитозоля было исследовано с помощью "перекрестных" систем. Результаты экспериментов (рис. 2) показали, что скорость биосинтеза белка в реконструированной бесклеточной системе, включающей рибосомы и цитозоль из ишемизированного 30 мин миокарда, уменьшается на 57%, а уровень -на 50% по сравнению с нормой. Следует отметить, что эти результаты соответствуют данным, полученным в системе с S-зо фракцией. Обнаруженные изменения не обусловлены различием в содержании АТР, OTP , КР и креатинфосфокиназы, так как их концентрации в системах были оптимальными. Из рис. 2 видно, что основная роль в нарушении биосинтеза белка принадлежит рибосомной фракции, поскольку в обеих системах, содержащих рибосомы из интактного миокарда, скорость и уровень биосинтеза белка гораздо вше, чем в системах с р!босомами из ишемизированной ткани. При этом вклад цитозольной фракции е разницу уровней биосинтеза белка в исследованных системах незначителен.

Таким образом, результаты, полученные при использовании двух типов бесклеточных белоксинтезирукщих систем из интактного и ишемизированного миокарда кроликов, показали, что при ишемии прсис-

время инкубации, нцн

Рис. 2. Зависимость уровня включениялейцина в ТХУ-не-растворимый продукт трансляции в реконструированной бесклеточлой системе, включающей рибосомную фракцию и цитозоль из интактного и ишзмизированного миокарда кролика, от времени инкубации, (о—о) - рибосомы и цитозоль из интактного миокарда; (*—в) - рибосомы из интактного миокарда + цитозоль из ишемизиро-занного миокарда; (Л—Д) - рибосомы из ишемизиро-ванного миокарда + цитозоль из интактного миокарда; (А—А) - рибосомы и цитозоль из ииешзированного ш окарда.

ходит уменьшение скорости и уровня белкового синтеза, которое частично зависит от уменьшения энергетических ресурсов клетки, но главным образом - от изменений самого аппарата трансляции, Оказалось, что наиболее важным компонентом, ответственным за нарушение биосинтеза белка, является рибосомная фракция. В связи с этим далее анализировали рибосомный пул сердечной мышцы, а также определяли белоксинтезирующую активность разных классов рибосом, выделен-

них из интактного и ишемизированного миокарда.

Изучение рибосомного пула и функциональной активности рибосом разных классов при тотальной ишемии миокарда кролика

Показателями, характеризующими интенсивность работы белоксин-тезирующего аппарата клетки, является количество рибосом, а также степень вовлечения рибосом в процесс трансляции, которое определяется как доля полисом в общем пуле рибосом. Общий пул рибосом клетки состоит из мембраносвязанных и свободных рибосом. Согласно современным представлениям, на первых из них в основном синтезируются секретируемые, внеклеточные белки, тогда как на свободных -белки для нужд самой клетки Дишневская Е.Б., 1977/. Различные воздействия, вызывающие изменения биосинтеза белка в клетке, могут существенно повлиять на состояние рибосом. Поэтому, основываясь на предыдущих результатах нашей работы, было решено провести анализ полисомного состава свободных от мембран и мембраносвязан-ных рибосом, а также их доли в общем пуле рибосом в норме и после 30-минутной тотальной ишемии.

Для определения относительного содержания полисом в препаратах суммарных, свободных от мембран и мембраносвяэанных рибосом анализировали профили их распределения в градиенте плотности сахарозы и рассчитывали отношение площади под участком кривой, соответствующей полисомному материалу, к площади всей кривой (полисо-ш + моносомы). Результаты фракционирования рибосомных препаратов миокарда кроликов представлены на рис. 3. Из них следует, что при ишемии происходят изменения в профиле суммарных препаратов рибосом. Дальнейший седиментационный анализ свободных от мембран и мембраносвязанных рибосом показал, что изменения во фракции суммарных рибосом происходят главным образом благодаря изменениям в пуле свободных рибосом, так как доля полисом в пуле мембраносвязанных рибосом дачее после 30 мин ишемии остается практически неизменной. Так, оказалось, что доля полисом в препаратах суммарных рибосом уменьшилась с 0,73 до ß,6I (на 17%) после 30 мин тотальной ишемии. Доля полисом в препаратах свободных от мембран рибосом изменилась с 0,65 до 0,57 (на в то же время доля полисом в

пуле мембран освязоннюс рибосом уменьшилась с 0,81 до 0,79 (на 2,5%),

¿OS

номер фракции

Рис. 3. Результаты центрифугирования в линейном (10-40%) градиенте плотности сахарозы препаратов суммарных

рибосом, полученных из интактного (-) и ише-

мизированного 30 мин (--- ) миокарда кроликов.

г.е. практически осталась неизменной.

Были определены также соотношения количества свободных и мемб— раносвязанных рибосом в интахтной и ишомизированной сердечной мып-де. Количество свободных рибосом в норме составляет сколо 92^ всех рибосом, что согласуется с литературными данными /Явич М.Л., 1981/. 1осле 30 мин тотальной ишемии происходит значительное перераспределение рибосомного материала, и количество мембраносвязанных рибо-зом увеличивается с 3% до 41%.

Таким образом, можно сделать вывод, что тотальная ишемия приводит к значительным изменениям в составе клеточного пула рибосом. Эти изменения проявляются как в перераспределении рибосодаого гериала между класса;« свободных и мембраносая-занных рибосом, •sex i в изменении, в пределах каждого из этих классов, доли рибосои, ^посредственно занятых в трансляции vJPHX. Сбра^аат иа себя нкима-

те тот факт, что наиболее значительные изменения претерпевает класс свободных от мембран рибосом, так как уменьшается не только их количество, но и доля полисом в этом классе, т.е. занятость ри> босом непосредственно в процессе биосинтеза белка.

Использование "перекрестных" бесклеточных систем биосинтеза белка в описаных выше экспериментах дало возможность оценить влияние ишемии на рибосомную фракцию и цитозоль в отдельности. Систе ма такого типа была использована как для изучения белоксинтезиру-юцей активности отдельных классов рибосом, так и для характеристики этапов процесса трансляции. Следует отметить, что до сих пор данному вопросу в отношении миокарда почти не уделялось внимания, хотя есть немало данных о структурно-функциональных свойствах сво бодных от мембран и мембран ос вязанных рибосом из печени /Andrens Т.м., Tata J.K., 1971; Shafritz D.A., I97V. Результаты экспериментов, представленные в табл. 2, показывают, что включениеf^C лейцина в ТХУ-нерастворимый продукт трансляции в бесклеточной сис теме с фракцией свободных полирибосом из ишемизированного миокарда значительно уменьшается. В этом случае, как и в случае системы с суммарными препаратами рибосом, роль цитозоля незначительна, 8 то же время активность мембраносвязанных рибосом, судя по включению метки, увеличивается и достигает максимального уровня в присутствии цитозоля из интактного миокарда.

Таблица 2

£ункциопальная активность свободных от мембран и мембраносвя-занных рибосом в бесклеточной белоксинтезирухщей системе, включающей цитозоль и рибосомные препараты из интактного и ишемизированного (30 >»ин) миокарда. (Рн - рибосомы из интактного миокарда; Ри - рибосомы из ишемизированного миокарда; Цн - цитозоль из интактного миокарда; Ци - цитозоль из ишемизированного миокарда; Время инкубации системы 15'мин) /пмоль/I Ag¿o рибосомной фракции;

К асс рибосом Ри +

Свободные от

мембран 25,5± 0,9 22,7±0,6 18,б±0,5 15,8-1,0

Мембраносвязанные 2,2±0,б I,ZiO.fr б,2±1,0 3,8±0,7

Наши данные показывают, что в сердце более активны свобод-je рибосомы, составляющие бо'льшую часть общего пула рибосом. Ве-Эятно, что белоксинтезирующая активность мембраносэязанных рибо-эм увеличивается при ишемии из-за присоединения к мембранам сво-эдных полисом, не теряющих своей способности синтезировать белки, жно отметить, что относительный вклад цитозоля в белоксинтези-/ющую активность бесклеточной системы, включающей фракцию мемб-зносвязанных рибосом, заметно увеличивается. Чем это можно обздс-iTb? Как известно, с полирибосомами могут быть ассоциированы РСазы и факторы белкового синтеза, поскольку эти белки проявляют эспецифическоэ сродство к РНК /Федоров А.Н. и др., 1985; Rjasa-iov A.a. et а 1., 1987/. Клетка, избирательно изменяя сродство актеров инициации, элонгации, а также АРСаз к РНК (например, пу-ем фосфорилирования белков /Pendergast A.M. et; al., 1985; Sta-запоу A.s., Kandror K.v., 1984/) может изменять количество елков на полирибосомах. 5то, в свою очередь, может менять ско-ость процесса белкового синтеза. Исходя из этого можно предполо-ить, что при выделении свободных и мембраносвязанных рибосом из искарда, количество указанных белков, связанных со свободными олирибосомами, больше чем с мембран ос вязанными. ПЬэтому в озм отеки недостаток или потеря активности белковых факторов и АРСаз цитозольной фракции из ишемизированного миокарда сказывается большей степени при ее добавлении в реакционную смесь, содер-ащую мембраносвяэанныэ рибосомы.

С другой стороны, состав мРНК, транслируемых разными класса-и рибосом, может существенно различаться. Изменение состава или .ктивности тРНК или АРСаз в цитозольной фракции из ишемиэирован-юго миокарда может по-разному сказываться на скорости трансля-1ии отдельных мРНК.

Таким образом, ряд данных является определенным доказательст-юм того, что нарушение функциональной активности белоксинтезиру-)щего аппарата миокарда связано с изменениями в его рибосомном 1уле. Однако обнаружено также существенное ингибирупщее влияние 1итозоля из кшемичзского сердца на белсксинтезирующую активность «емб ран ос вязанных рибосом. Зозмсжно, это связано с наличием неактивных конформеров т?КК, которые появляются в цитозольной фрак-ишемизированного миокарда /Коваленко М.И. и др., 1934/. Однако следует отметать, что механизм со'наруженного явления пока

Рис. 4. Зависимость включения[14С]лейцина от времени инкубации в реконструированной бесклеточной белоксинтези-рующей системе из интактного (А) и ишемизироваяного (Б) миокарда без ATA (о—о) и в его присутствии (•—«).

не ясен и требует дальнейших экспериментальных исследований.

В дальнейших экспериментах, используя бесклеточную белоксин-тезирующую систему со свободными рибосомами, были исследованы особенности инициации с цель., определения и обсуждения возможной взш мосбязи между изменениями полисомного состава в сердечной мышце и скоростью протекания отдельных этапов трансляции в норме и при тотальной ишемии. Данные экспериментов показывают, что в бесклеточной системе со свободными рибосомами и цитозолем из интак-ной тка ни включение метки в присутствии ATA заметно уменьшается (рис. 4А Соотношение уровней включения [14скейцина в отсутствие и в присут стзии ингибитора инициации равно примерно 2, что указывает на существенную реинициацию эндогенных мРНК. Картина меняется в случав тотальной ишемии. Как видно из рис. 4Б, соотношение уровней включения мегки уменьшается до 1,5, что свидетельствует об уменьшении

уровня реинициации.

С другой стороны, некоторое увеличение количества 80S моно-

сом в пулах суммарных и свободных от мембран рибосом, установленное нами при анализе рибосомного материала в сахарозном градиенте, также подтверждает этот вывод, так как известно, например, что увеличение количества моносом и рибссомных субъединиц в перфузируемом сердце крысы la vitro является косвенным доказательством развития блока инициации / Као R., et al., 1976/. Таким образом, уменьшение реинициации в реконструированной системе, наряду с ранее откаченным увеличением времени синтеза "средней" полипептидной цепи, а также с данными об изменении полисомного состава разных классов рибосом при тотальной ишемии, позволяют предположить, что при данной патологии угнетается как инициация, так и элонгация полипептидной цепи. Использование реконструированной системы, в которой, как к в системе с S-ЗО фракцией, находятся оптимальные количества энергетических соединений, позволяет исключить одну из зозможньгс причин ингибирования реинициации - дефицит энергетических ресурсов, показывая тем самым, что в основе изменения скорости инициации лежат другие механизмы, для выявления которых необходимы дальнейшие исследования.

Электрофоретический анализ продуктов трансляции в бесклеточных белоксинтезирующих системах в норме и при ишемии

Как же отражается уменьшение скорости и уровня белкового синтеза, вызванное изменениями в аппарата трансляции, на составе синтезируемых полипептидов? Происходят ли изменения в спектре синтезируемых белков, появляются ли новые белки в ответ на развитие патологического процесса? Для решения этих вопросов был использован метод электрофоретического разделения синтезированных полипептидов с последующей авторэдиографией. Эксперименты были проведены на реконструированных бесклеточных системах, включающих суммарные препараты рибосом и цитозоль из интактного и ишемизироваиного миокарда. При анализе продуктов трансляции в реконструированной системе из интактной и ишемизированной ткани с помощью авторадиографии были отмечены некоторые изменения в спектре вновь синтезируемых полипептидов после 30 мин тотальной ишемии (рис. 5). Изменения набяо-давтся в двух зонах, соответствующих молекулярной масса 20 и 70 кДа (дорожка 2). Так как на денситограммах не было обнаружено различий в состава белков (на обеих дорсжках элекгрофорвграммы в вы-

Рис. 5. Авторадиография электрофореграммы продуктов трансляции в реконструированной бесклеточной системе, содержащей препараты суммарных рибосом и цитозоль из интактного (А) и ишемизированного 30 кян (Б) миокарда. Стрелками обозначены маркерные белки: миоглобин (18 кДа); химо-трипсиноген (25 кДа); овальбумин (43 кДа); бычий сывороточный альбумин (67 кДа), и места появления новых полипептидов.

А Б

ше указанных зонах видны идентичные белковые полосы), можно предлоло жить, что различия в зонах, соответствующих 20 и 70 кДа на авторадио граммах, свидетельствуют о гораздо большей скорости включения метки в данные белки при тотальной ишемии. Исходя из этих значений молекулярных масс, нельзя исключить появление при данной патологии стрессо вых белков типа БР 71 , которые активно синтезируются в клетках при некоторых экстремальных состояниях организма, в том. числе были обнаружены и на другой модели ишемии миокарда /Сигг1е И.И., 1987/. Пред полагается / тге1с1х ^.«Г., 1989/, что эти белки участвуют в восстаног лении важных метаболических функций в клетке, находящейся в условиях стресса (например, после теплового шока). Однако для однозначного утверждения необходимы дальнейшие исследования.

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что нарушение биосинтеза белка при тотальной премии миокарда заключается в уменьшении скорости протекания отдельных этапов рибосомной стадии (инициации, элонгации и, возможно, терминами), изменении активное^ и состава рибоссмного пула, а также в отмеченном на авторадиограмма>

екотором перераспределении спектра вновь синтезированных полипеп-ядов.

В Ы 3 О Д Ы

1. Проведено изучение биосинтеза белка в миокарде кроликов в орме л в разные сроки тотальной ишемии в бесклеч'счньпс системах раз-ичного вида (с 3-30 фракцией и реконструированная из рибосомной ракции и цитозоля):

а) показано уменьшение скорости и уровня биосинтеза белка з иокарде после 15- и 30-минутной тотальной ишемии;

б) установлено, что обнаруженное уменьшение зависит не только т истощения энергетических ресурсов, а связано, главным образом,

изменениями самого белоксинтезируюцего аппарата, в частности, с вменениями функциональной активности рибосодаой фракции.

2. Установлено нарушение процесса реинициации и увеличение вре-(ени синтеза "средней" полипептидной цепи при ишемии, что указывает 1а ингибирование отдельных этапов процесса трансляции: инициации, 1Л0нгации и, возможно, терминации.

3. Показано, что при ишемии имеет место существенное снижение юли свободных рибосом э общем пуле рибосом сердца, а также нехото->ое снижение полисомного материала в популяции свободных рибосом.

4. Отмечено уменьшение белоксинтезирующей активности свободных зибосом и увеличение ее в случае мембраносвязанных рибосом при ише-«ии и обнаружен ингибирующий эффект цитозольнсй фракции из ишемизи-эованного миокарда, наиболее ярко выраженный в системе с мембрано-;вязанными рибосомами.

5. Методом электрофореза в ДААГ'е с последующей авторадиогра-рией продуктов трансляции бесклеточной белоксинтезирующей системы доказано увеличение при тотальной ишемии скорости включения меченых аминокислот в полипептидные цепи с молекулярной массой 20 и 70 кДа.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I. Масколюкас И., Лукошквичюс Л., Лекис А., -.¡асаиаускас Т., зурайткс Р. Изучение синтеза белка в бесклеточных белоисин-тезирувщих системах ::з кокарда и печени кроликов при ипемии мискарна. - В кн.: В/схк:«л и морфология тканей сердца •/. других органов в условиях гипоксии: Сб. науч. тр.-/под р^д, к.арашкквичвса/. Вильнюс, 1У&3, с. 100-114.

2. Масколганас Р.К. Структурно-функциональные изменения в пуле рибосом миокардиальных клеток кроликов при тотальной ишемии. - В кн.: Сб. науч. тр. 1-й респ. конф. молодых ученых-медиков ЛитССР. Каунас, 1988, ч. 1, с. 54-57.

3. Лукошявичюс Л.Ю., Масколюнас Р.К. Влияние тотальной ишемии на белоксинтезирутаций аппарат миокарда кролика. - В кн.: Тез. стендовых сообщ. 1У съезда биохим. ЛитССР. Вильнюс, 1Э88, с. I06-IC8.

4„ Масколюнас Р.К., Лекис А.В., Коваленко М.И. Биосинтез бзл-ка в бесклеточных белоксинтезирущих системах из миокарда кролика при тотальной ишемии. - Биополимеры и клетка, 1989, т. 5. № I, с. 84-86.

5. Масколюнас Р.К. Электрофоретический анализ продуктов трансляции в бесклеточных системах из миокарда кролика в норме

и при ишзмии. - Биополимеры и клетка, 1989, т. 5, IP 5, с. 81-83.

6. Maskolitinas В. Ischemia of rabbit myocardium causes marked otructural and functional alterations in polyribosome preparations. - Int Abstracts of Communications of the I9th FEBS Meeting. Soma, 1989, Tu.I62.

7. liaskolliinas H., Liekls A. Effect of myocardial Ischemia on. protein synthesis in the heart. ~ J. Uolec. Cell. Cardiol., 1989, v. 21, suppl. 4, p. 27.

8. Maakollimaa В., Liekls A. Effect of total Ischemia on rl-boaomal preparations in cell-free system from rabbit myocardium. - In: Abstracts of Communications of Illth Congress of Lithuanian Cardiologists. Kaunas, 1990, p. 199.

/•--£ ч с