Сократимость, энергетический метаболизм и фосфолипидный состав миокарда при экспериментальном сахарном диабете, осложненном ишемией

Джавадов, Сабзали Абиль Оглы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сократимость, энергетический метаболизм и фосфолипидный состав миокарда при экспериментальном сахарном диабете, осложненном ишемией
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сократимость, энергетический метаболизм и фосфолипидный состав миокарда при экспериментальном сахарном диабете, осложненном ишемией"

й'З

, а й 2;

ордена дружбы народов российский университет дружбы народов

На правах рукописи

УДК 610.379—008,04—092.4 : 010.127—002

ДЖАВАДОВ Сабзали Абиль Оглы

СОКРАТИМОСТЬ, ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ МЕТАБОЛИЗМ

И.ФОСФОЛИПИДНЫЙ СОСТАВ МИОКАРДА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ, ОСЛОЖНЕННОМ ИШЕМИЕЙ

(03.00.04 — биохимия; 14.00.06 — кардиология)

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва—1992

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте кардиологии им. Д. Абдуллаева МЗ Азербайджанской Республики и Кардиологическом научном центре РАМН.

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, профессор Б. Ф. Коровкин, доктор медицинских наук, профессор В. А. Тутельян, доктор медицинских наук, профессор Л. Ф. Николаева.

Ведущая организация — Всероссийский научно-исследовательский центр профилактической медицины МЗ РФ.

Защита состоится « № » декабря 1992 г. в 14 час: на заседании специализированного совета Д 053.22.02 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, медицинский факультет, ком. 224.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6.

Автореферат разослан « •» ноября 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук, профессор

В. Э. ТОРБЕК

ОШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

А??ххальность_ПЕОбломы. Сахарныа диабет, сопровождаемый относительная или adeолютнея недостаточностью инсулина и поюргликэ-миеа, влияет практически на все системы организма, приводя в коночном счото к прогностически неблагоприятным ослояионклм, главным образом, со стороны сордэчно-сосудиотоа системы (ретинопатия, нефропатая, инфаркты, инсульты, гангрена и т.д.). Изучение метаболизма киекзрда при сзхэрном диабете давно найдется в центре внимзкия многие исоэяователой. Да поданного вромоди ухудшения сократительно* функции сердца у больных сахарным дизЗетом связывали с развитием аторосклероза, гипертонии, аягио-патиз и других сопутствующих патологиг у этих Сольных. Однако, начиная с 70-х годов проводился ряд исслэдованкг на животных с использованием различил моаэлзг экспериментального сахарного диабета, результаты которых свидетельствует о специфическом поражении сердца при данной патаюпш <Rubier s. et »i, i?72,

197B, Hamby R.I. et al, 1474, Penpargkul S. »t al, 1900, Dhallfl N.S. et »1, 19G3, Pierce G.N. et al, 19S0, Regan T.J., 1991). В

остром гориодз ввода низ экзогенного инсулина практически полностью прздотврапзэт функциональные изменения в сердце. В некоторых случаях нарушение сократигельвоа способности сордца носит нообра-тимыа характер и определяется как диабетическая кардаомиопатия

(Sanderson J.E. et «1, 1978, Fein F.3. et ml, 1900, Regan T.J., 1991) ,

Основными характерными для диабетических сердец нарувониями механической функции является уменьшение фракции изгнания и скорости сокраЕэяия и расслзйлзния, а такого нарушение диастолическоз фуНК1у£И сердца (Rubiвг S. et al, 1976, Penpargkul В. et al, 1980, Fein et ml, 1934, Z«rtch S.W. ßt al, 1983,

Regan Т. J., 1991). НЭСМОТрл На ПрОВвДЭНИЭ МНОГОЧИСЛЭЕНЫХ

исследования, точныа молекулярный механизм(ы) нарушения сократительной способности миокарда при сахарном даабото не кзвестен(ы). Хотя были обнаружены дефекты в отдельных звеньях метаболизма и функции сократительных кардиомиоцитоэ. Причинно-следственная взаимосвязь между этими нарушениями нэ установлена из-за отсутствия комплексного исследования сердца на одноа и тоа т.'.э подели сахарного диабета, К метаболическим нарушениям, обнаруженным в сердце при сахарной диабет», относятся: изкененаэ кзофермэнтного ешктра икофийряллярноа АТФ-ззы <pi*rce g.n,.

Dhalla U.S., 1904, Pol 1 лек P.S. et «1, 1966) | ДОфвКТЫ В

сократительных Солках (актин и миозин), обусловленные нарушением ИХ структуры И КОЕфОрмаЦЙИ (DlUmann H.H., 19ВО, Malhotra д. et «i, j90i, m*ihotrл а. , 1<?91) i изменение кальциевого гомеостаза кардисмиоцэтов за счот нарушения активности формантов и насосов, рогулирухякх внутриклеточную кондантрацкп Са2+ при сокращении и

раГ^ЛЭйЛОЕИИ СОрДЭЧНОЙ ИКЗШ tPenpargkul S. et al, 1981, Lopa«chuk D.D. et «1, 19B3, Ganqulу P.K. et «1, 1987, ttaklno N. et al, 1987, Ferrari R. et «1, 1991>t ДОфЭКТЫ В ЗНерГвТИЧбСКОК КвТабОЛИЗКв, В

частности, в процессе гликолиза и гликогенолизэ в цетоплззме, а так:», трккарбоновых кислот (Кребса) и окислительного

фосфорилирования В МИТОЮНДрИЯХ Iftlllson T.B. et al, 1976, Pi«p«r G.M. et «1, 1903, Pi ere* G.rt., Challa N.S., 1985, Killer Т.В., Jasper» 3.R., 1991, Strodtar D. et al, 1991)» НаруНОНИЗ ЛИПВДНОГО

обмана, в пораув очеродь, ^-окисления жирных кислот, увеличения концентрации свободных жирных кислот и их производных, кетоновых

ТОЛ И триглицэридов (Pauleon D.J., Ci-a*s «.F., 19В0, Rsavert G.H. , Chen Y.-D.I., 1989, Uopanchuk Q.D., Cp»-fford M., 1909, Paulson D.J. et »1, 1991).

Следует отмотать, что укеяьеэние сскратигельяоа активности сердца при сахарной диабета иояат быть вызвано также внеклеточными факторами. Ими является увеличение кондавтрашш г-дасолизироаанного гемоглобина {особенно HaAjc> <Gorion В. et al, 1977, Babbay К.Н. «i, 1979) t уданывниэ содзсязеин тирзоидшх гормонов, в частности

Т3 и Т4 «Saundere J. et al, 1978, Pcnpargkul S. et al, I960, Garber D.W. et al, 1983)j ПОВЬКЗНИЗ КОНЦЭПТраЦИИ СБОбОДНЫХ КОфНЫХ КИСЛОТ И кетоновых тел В Крови (Heaven 8.М., Chen Y.-D.I., 1988, Paulmon D.J. et al, 1991) И ДРУП®.

Одним из главных аспектов в изучении диабетических сордоц является действие игемии на их метаболизм и функцию. Экспериментальны«) исследования, проведанные до сиз пор на разных видах животных с использованием различных кодалоа диабета и YXQмии, свхЕетельствуот о шеокоа чувствительности диабетических сардрц К иземии ПО сравнению с контрольными «Feuvray D. et al,

1980, Ingerebreteen C.B. et al, I960, Mochiruki I. et el, 1934},

однако.ккеотся ряд работ на пвдгвврвдзщих это заключение «Apetein

С.О., 1988, Tani И., Neely J.R. , 19ВЗ, Seymour A.-M.L., Braenari

m.j., 1991), что оставляет данную проблему открытой как для экспериментаторов, так и для клиницистов.

Таким образом, в настоящзе вромя накопилось огромное

количество летературных данных, свидетельствующих о стщфпосхом повреждении сердца при сахарном диабета, и выявлены некоторые кетаболическяе нарушения, характерные для диабетического сердца. Однако, отсутствует комплексное исслодовавяэ действия сахарного диабета на осноаяыэ метаболические звенья и сократимость сердца в нор® и, в особенности, при ишемии.

Шль я задачи работа. Целью яастояаюа работы являлось изучение сократимости, энергетического метаболизма и фосфолипияного состава сердца, а такт Ca24" чувствительности сердца при зксга-ржентальасм диабете, осложненном ииемкеа. ■ Для роет пил данное проблемы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить сокрзтклиьяую функцию диабетических сердец в нор« п ПОСЛ» К23ЮВ1 и регорфузкъ

2. Оцэнить люгонь повреждения дыхательной функции мигохондриа в диабетических сердцах в норме я после юемии и регарфузиш

3. Выяснить зависимость поспшемического восстано&гания миокарда от стагони нарушения дыхательноа функции китохондриа для контрольных я диабетических сердец;

4. Исследовать активность креатанфосфокиназы (KSK) и ее изофермен-тов, а тгкхя тканевого содержания высокоэнергетичэских фосфатов, в частности, ФКр и АТФ в диабетических сердцах)

5. Оценить чувствительность диабетических сердец к изменению вно-кязточноа кониэнтрзсш кальция в норме и поело икмовв

8. Исследовать холичэственвьа состав отдельных классов фссфо-липидов, а также лизофосфоглиозрвдов диабетических сердец в норме и посла йеэмии и репэрфузш, '

Научная новизна работы, В диссертационной работе впервые проезде но комплексное исследование физиологических (скорость сокращения и расслаблэния, систоличоскоо и даастолическое давления, частота сердечных соиращзниа и работа сорока) и биохимических {дыхательная функция митохондрия, количественный анализ отдельных классов фосфолипидов и лизофосфоглицэрздов, Са^-чувствительность, активность KSK и еэ изофермонтоа, содержат» накроэргических фосфатов) параметров сердца с использованием одноа и тоа та кодэля экспериментального сахарного диабета. Использование нового оригинального котода определения скорости дыхания кигохоцдриз в волокнах миокарда, обработанных сапонинов, позволило избежать все возможные артефакты, связанные с выделением этих оргакелл, к оцэшггь дахатольаую функцию во всех популяциях митохондрия баз пх

пролэратизяого выделения. В хода работы было установлено, что сахарный диабет вызывает значительное уменьшения скорости дахакия китсхондриа в сердде. При этом. нарушение дьаательвоа функции не связано с механически* повреждением структурной целостности митохоядриальноа мембраны, о чем свидетельствует ' полное ингиЗи-ровакш максимальной скорости дыхания карбоксиатрахтилазидом (КАТ) - сгагифичоским ингиЗетором АТ0-АЙ5 транслоказы, участвушза в трак торта АГФ из митохондрия в цитоплазму. Эта лаянью, в первую очередь, указывают на снижение скорости синтеза ATS в результате варувения процесса окислительного фосфорилирования в митохонхриях. Кроме сигтозз, сахарный диабет также нарупает транспорт ATO в миокарда, что может Сыть обусловлено значительным снижением' в диабетических сердцах процента относительного ускорения дыхания митохондрия креатином, а таюно общэа активности митохондриальяоа и КЗ форм КОК.

Путем количественного анализа отдельных классов фосфолипидов било установлено, что в сердцах диабетических ¡кидг.лых уровень кардиолипива достоверно е;ж>, а концентрация сфингомивлина, а также лизофосфоглицеридов, являющихся токсическими продуктами гидролиза фосфолипвдрз, наоборот, значительно выш, чем в контрольных сергдах. ПредстазлэЕныо в диссортационЕоа работе данные вгарвыа дают возможность сформулировать возможную роль низкса концентрации кардиолнпина и высокого содержания лкзофосфоглидаридов в нарушении энергетического катаболизма и сократимости миокарда при сахарном диабете. В хода работы установлено, что диабетические сердца менее чувствительны к изменении вноклэточног концентрации Са2+, чем контрольные, что указывает ез развитие кальциевая перегрузки в кардаоииоцетах при сахарном дазбэто.

Исподьзоззниэ кзекки разной продсшотельностыз (острая - 40 мин, глубока - 80 ¡asa.) дзло возможность впервые рассмотреть ИЗКОЕ0ЕИЭ физиологических и биохимически, параметров сердца в зависимости от продолжительности ииемя.

Осяоваце положения, вдюсаде на за^пт?:

1. ЭксперЕлон'.адьшй сахарный даабот вызывает достоверное сшна-нио сократительной функция сердца;

2. Экспериментальная сахарные диабет Еызнзает серьэзшо нарупандя энергетического метайолззьа, в частности сдягеза и транспорта АТФ, a xaiw.0 фосфолипгдаого состава кшокарда с чувствительности сардца к внеплаточноку кальцию;

3. Резистентность диабетически сердец к шзомш определяется.

главный образом, продолтгтельиоотью и гяземыз последней, о чем свидетельствует совокупность функциональных и биохдмг-ческкх данных, полученных в период достшешпесного восстановления.

Н§етЭ;Ш?§1ШШ£??33_®1Ность_работа.. Настояязя работа зяосэт вклад в развитие фундзмонтальнкх представления о механизмах развития дисфункции сердца при сахарном диабете.

Результаты рзботы показывают, что одним из осяовшле дефектов в метаболизме миокарда при сахарном дизбете является нарусениэ энергетического метаболизма (синтеза и транспорта ATO), а также фосфслипядного состава и Са2+-чувствигельности сердечных клеток. Это имеет больиое знзчеанэ в поникании патогенеза и лечония сердачзой недостаточности и диабетической кардиомиопатии у больших, страдапцих сахарным диабетом.

Использованныз з данной работе новыа кзтод для определения скорости дыхания митохондрия в сапонин-обработаяных волокнах миокарда демонстрировал.высокую информативность и точность и может быть широко применен (и уже применяется) при проведении зксгюрияентддьккх к клкгачоокяс исслздованха в разных областях юяидгаы для" определения степени повреждения дыхзтельноа функции митохондрии без-их'препаративного выделения.

Особор значение для практическое кодадаяы имеет исследование фушахиояальЕЪ!х л метаболических параметров миокарда при сахарном диабете, ослояшенвом и^эмдая и регюрфузиэа. Одинаковая с нормальными сердцами или высокая резистентность диабетических сердец к острой кеш дзет возможность объяснить появление комых болеа у больных, страдавших сахарным диэбеток, осложненным июмическоа болезнью сердца. Плохое восстановление работы сердца вместе с ухудшением биохимических показателей (дыхательная функция митохондрий, кальциевая чувствительность сердечных клеток, фосфолипиднья состав мембран и др.) объясняет развитие прогностически неблагоприятных осложнения диабетического миокарда при длительном точении ИЕфэркта или комической болззнк сердца. Низкая резистентность дизбатачэскюс сердец к глубокоз иаауки играет важное зяачоЕиэ и может бьггь учтена такжо в кардиохирургии при гостгаюгаяеском восстановлении сократительной функции этих сордоц.

Ащобвсщ^аботы^ Основные результаты исследования бьш! доложены на IX Симпозиуме американской секции МОйС' (Бостон, 1687),

на 1У Всесоюзной консервации "Ультрзстру шурша основы патологии органов и ткаяеа" (Тбилиси. 108Э), ва I Ресцубликаяскоа биохимической конференции {Baity, 1990), ва Кеадународном симпозиуме "Триглэдарэды: роль при диабета а атеросклерозе" (Бена, 1990), на III Симпозиуме -Физиология и патофизиология сердца и коронарного кровообращения" (Киев, 1992), на Конгрессе кардиологов Венгрии (Будатшт, 1992).

~Ъзулътаты работы были представлены также в локшта на ¡шш колодах кардиологов Европы (Буд^.юат, 1991).

Апробация диссертации состоялассь 2А июня 1692 г. на заседании Ученого совета НИИ кардиологии МЗ Аззрб. Республики совместно с президиумом биохимического общества рэспублики и была рокомон-дрвана к защите.

Публикации.. По материалам диссертации опубликованы 23 работа в отечество ккьо: и иеадународаа научных изданиях и подучено I авторское саадэтяьство.

Обьом и структура работы. Диссертация состоит из вводеняя, обзора литературы (4 главы), описания ваториалов и котодов, результатов (5 глав) и их обсувдэния, выводов и списка цкгщроваа-ноа литературы кз Ш названия. Работа изложена на 2S3 страницах машинописного текста, иллюстрирована 40 рисунками и 30 таблицами.

СОДБРВАННЕ РАБОТЫ ИАТЕИШЫ 11 МЕТОДЫ

Эксдарииенты проводились на беспородных крысах и кроликах, • в такке на крысах линии -meter- и Ново-Зеландских кроликах. Были использованы сакда босом 250-350 г (крысы) и 1,7-2,2 кг (кролики).

Над «к. эмзпориис1ита(а.!Юго диоеота у кр0ХйС0В бала СОЗДЗНа ПОД

неьйутвловш нархозои путем внутривенного введения 160 кг/кг в.т. аялокс8н - татрапирата ("merck», фрг), растворенного в физиологическом раствора. Диабет длился чэтара и восемь нэдаль, в точен® которых уровзнь гликозы оцэнивзлея через каждую неделю о помощью индикаторных ПОЛОСОК ("Dextraotix", "ППее-, ВЭЛИКОбрИГаНИЯ) . &1Я экспериментов использовались живота, у которьз содаржаниз глюкозы в крови колебалось в прэделгх 28,0-30,0 толь/л (диабет: 28,3* 0,7, контроль: 5,620,4). Эксшрикоггтальньа даэбет .у крыс был вызван путем внутривенного введения 80 мг/кг в.т. или путем шутркбршинного зводеняя 200 кг/кг в.т. аллоксен - тетращцрата ("Merck", ОРТ), -растворенного в 0,1 М цитратнои бу£аре, рН 4,5. Как в прэдыдудем случае продалюггельность диабета составила четыре

л восемь педаль. Для экспериментов бьии отобраны животные с уровнем глюкозы в крови 25,0-30,0 имолъ/л (диабет: 27,е±0,в, контроль: 6,1*0,3).

Модель перфузии сердца. 'СорДЦЭ ПЭрфуЗИрОВаЛИСЬ ретроградно

через аорту при 37°с по методу Лэнгендорфа при постоянном пэрфузионном давлении, равном 85-70 мм рт.ст. Скорость протока находилась в предала! 12,0-13,0 мл/мин/r сердца как для нормальных, так и для диабетических сердец ' крыс и кролиг На самописде регистрировались скорость сокращения (+dp/dt) и с. , >сть расслабления (-<ip/dt) сердца, внутрижелудочковое систолическое (СД) и диастолическое (ДЯ), а также аортальное (шрфузионное, АД) давление и частота сердечных сокрасгниз (ЧСС). Кроме того, были рассчитаны развиваемое давление (РД), как разность между СД и ДД, и работа сердца (PC), как произведение ?Д на ЧСС. Перфузия проводилась в режиме нередаркуляции с использованием буферного раствора Кребсэ-Хонзелкатз, содержащего (в «М) nací - ив. n«hco3

- 23, N«EDTA - 0,3» KCl - 4,7, KH2P04 - 1.2, CaCl2 - 3,0, MgSO^ -

I,2, pH 7.35±0,05, глюкозы - 5,5 (для перфузии сердца кролика) или

II,0 мМ (для перфузии сердца крысы) и лактатз - 1,0 (для перфузии сердца кролика). Ддя остановки сердец перед ишемиеа, а также в ходе реперфузии после, ишемии был использован кардисплегическиа раствор госпиталя Святого ToMacá, содержа да (в мМ) n»ci - но, N«HC03 - 10, N»EDTA - 0,5, KCl - 1Ь, СаС12 -1,2, MgCl2 - 16, pH

7,8. pH растворов определялся после полного их насыщения карбогевом (95Í 02 и 5% С02) при 37°С.

Модель тотальной ишемии 6ЫЛЭ СОЗДЭНЗ НЭ ПврфуЗИрубМЫХ СврДЦЗХ

крыс и кроликов. Для этого сердца сначала были трфузированы раствором Кребса-Хевгеляата в течение 25-30. мин, а потом остановлены кардиоидегическим растворов • госпиталя Св.Томаса в течение 3-5 юш. Кшомия была вызвана полным выключением протока в течение 8 мин (Гл.З), 40 мин (Гл.1 - Гл.З), 60 кт (Гл.1 - Гл.4) и 80 мин (Гл.5). Во всех случаях была использоизна нормотерми-ческая (37°С) тотальная кардкоплэгическая ишемия. За ишемивй следовала рзперфузия сначала кардиоплегичесгавд раствором в течение 15 мин, а потом раствором Кребса-Хензеляйта в течение 30 мин, при которой и оданивалось постишемическое восстановлениз сердца.

Дыхательная функция китахондрий. СКОрОСТЬ ДЫХвНИЯ МИТОХОНДРИЙ

была определена по ранее описанному методу <v«k»i»r v. et «i, i?er> в биопсианых "образцах, полученных из эндокарда контрольных и диабетических сердец. Данный метод но требует выделения

югтохсндриа и дает возможность определить дыхательную функцию китохондриа а 10-15 юг образца. Биопсияныэ образцы были отделены от соединительной ткани я разделаны на пучки волокон диаметром 0,2-0,3 мм. Далее пучки (обычно 10-15 итук) волокон инкубировались в течению 30 куш в раствора А (соствв см. ниже), содержащем 50 ккг сапонина в X мл раствора, для разрушения сарколеммы (продасс скит—сватая). После этого пучки отмывались в теченда 10 мин в растворе Б (состав си. шоке) беь ВЭФ, Все процедуры проводились при 4°С. Скорость дахания сканированных волокон была определена с помощью электрода Кларка в оксиграфическоа ячейке, содержащей 3 мл раствора Б, при 22°С и интенсивном герамешивании. Растворимость кислорода принимали равной 460 кг-атома/мл. Скорость дыхания выражали в нг-атом О/киа/кг сухого веса образца. Растворы А и Б содержали 10 мМ ЭГТА-СаЭГТА буфер (свободная концентрация Са2+-0,1 ккМ), 3 кМ свободньа мд2*,'20 кМ таурин, 0,5 мМ детиотреотол, 20 мМ имвдазол. pH 7,0. и имели ионную силу, равную 0,16 М, регулируемую добавлэвдэм 2<м~морфалкно)зтаясульфокгта калия (MES-K). раствор А содержал таюке 5 кЫ мдАХй и 15 мМ ФКр. Раствор Б содержал 3 мМ фосфатного иона и 3-5 мг/кл бычьего сывороточного альбумина, лишенного свободных жирных кислот.

Для измерения скорости поглощения кислорода в митохондриях обработанные сапонином волокна переносились в оксиграфическую ячейку, содержащую раствор Б с субстратами (5 мМ гдутамата и'2 мМ" малага), но боз акцептора фосфатной группы (АДФ). В этих условиях записывали скорость базального дыхания <vQ). Скорость дыхания митохондрия усиливалась с добавлением ICO мкМ АДО (уаДф>- Добавление 20 м,Ч креатина активировало работу митохондриального изофер-мевта КОК и увеличивало скорость поглощения кислорода (v^). Максимальная скорость <vKaKC) дыхания регистрировалась при добавлении высокой концентрации (1,0 мМ) АДФ, но в дальнейшем резко снижалась посла добавления 35 мМ КАТ, ингибитора АХФ-АДО-транслоказы (VK3T)-

анализ вэф и активности как. Содержание адениннуклэотидоа (ATO, АДО и AYO), ФКр и общэго креатина определяли в замороженных в жидком азоте сердцах после их экстракции с помощью 6Х перхлорноя кислоты и 1056 метанола. ФКр и общиа креатин определяли обычным химическим методом с использованием а-нафтола и диацэтяа. Определение аденивнуклвотвдав производили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

седая активность к4+с в миокарде и сыворотка была определена

сдактрофстометричесхи по скорости обратной креатинкизазной реакции с использованием сопряженной ферментной системы по ранее описанному методу <Ro»*iki s., i?67>, Разделение изоферментов КФК проводили методом горизонтального электрофореза в IX агарозном гелэ.

Экстракция, разжигание и количествен»»« еналиэ сссЯюлилилов.

Экстракцию фосфолигидоэ из гомогейата миокарда проводили по методу Фолчв и соазт. (Polch л. «t »i, 1737). Для разделения фосфолипидов использовали двумерную тонкослойную хроматографию на пластинках размером 10x10 см <Ki»«»igei 60 f^, -n«rck-, вРГ). Количественное определение фосфора в пятнах, содержащих фосфолипвды. ' проводили с помощью никрометода, описанного Васковским и соавт.

<V»«kov*ky V.E. et »1, 1973).

результаты совственшх юследования и кч овцу5шелие

г-ллва_ t_. Действие экспериментального сахарного диабета ..на сократи; тельную способность сердца в норме и при ишемии.

Как уже было отмочено выше, сахарный диабет вызывает специфическое повреждений сердца у людей и животных независимо. от развития атеросклероза, гипертонии и других сердечно-сосудистых заболевания. Ранее были описаны случаи восстановления функциональных параметров сердца до нормы при введении инсулина через несколько недель после начала диабета (Fein f.в. «t »i, »vei, c3»rb«r d.w. »t «l, 19аз). Это заставило нас отказаться от термина "диабетическая кардаомиопатия" и использовать термин "диабетическое сердце". У экспериментальных животных серьезные нарушения сократительнрз функции и метаболизма сердца обычно наблюдаются через I мес после-начала диабета. В данной работе были исследованы физиологические параметры сердец диабетических животных через Г и 2 мес после начала диабета. Эксперименты выполнялись на двух видах животных - кроликах и крысах, отличие между которыми состоит в тон, что у кроликов диабет не усиливает развитие атеросклероза коронарных сосудов tnuier r.а.. mieon

r.b. , 1904).

Сравнительный анализ сердец через I шс после начала диабета демонстрировал достоверное- отличие между контрольными и диабетическими нивотньми (Табл. 1а). Так, диабет вызывал уменьшение максимальной скорости сокращения и расслабления сердца у кроликов на 25S <р<0,01) и 132 <р<0.05). соответственно. Кроме

Физиологические параметры изолированных пэрфузируемых по Ланген-дорфу сердец контрольных и диабетических животных, а) срок диабета - I месяц

Параметры

кролики

крысы

♦йР/аМкакс.) км рт.ст./с -<1Р/«МмаКС,) »я рг.ст./с

сд

км рт.ст.

да

мм рт.ст.

чсс

а-/е

им рт.ст.

ГС

км рт.ст./с

контроль даэсЗвт контроль диабет

(Г>»10) (п=8) <П=И> <п=8)

20124102 1509441м 32744144 29304127*

1239448 1083436* 26434111 24104104*

12149 11943 14448 14048

10*1 1142 1042 941

2,040,1 2,140.x**' 4,140,2 3,840,2*

1С745 11244 13044 13744

293414 240414* 542423 481±17*

б) срок диабета - 2 месяца

кролики крысы

Параметры контроль диабет контроль диабет

(п«9) (п=8) (П=И) (п»9)

мм рт.ст./с -аг>/а*, (макс.) мм рт.ст./с

сд г

им рт.ст.

да

КМ рт.ст.

чсс

УД./С

РД

мм рт.ст. РС

км ргг.ст./с

24394116 18424107*

1654187 13724125* 12448 И8±7

941 . 10±1 2,840,1 2,210,1 11117 . 107*0

33504121 30244119 27104120 , 23831108' 13849 13449 941 1042 4.240,1 3,840,2' 12046 12449

I**

310418 235411'

538421

470416*

* - р < 0,05, ** - р < 0,01, по сравнению с.контролем.

того, наблюдалось снижении ЧСС и PC у диабетических кроликов на 25$ (р<0,01) и 183» (р<0,05). Аналогичные результаты по оцзнке механической функции контрольных и диабетических сердец были получены для крыс. Так, «up/ot, -dP/dt, ЧСС и PC дяя диабетических крыс были, соответственно, на Ш, 93, I2S и IIS (р<0,05 во всех случаях) ниже, чем для контрольных (Табл. I).

Нага исследования не выявили достоверных различия моэду соответствушими животными с I-мес и 2-мес диабетом. Как видно из таблида I, PC у диабетических кроликов и крыс с I-кос диабетом была такоа жэ, что и у животных с 2-мес диабетом. Это дало нам основание использовать для проведения биохимических экспериментов животных только с I-мес сроком-диабета.

Исследования, проведанные в течение последних 20-30 лот, свидетельствуют о том, что сердечно-сосудистые заболевания среда больных, стоадзших сахарным диабетом, встречаются в 2-4 раза чаое ПО сравнении СО здоровыми <Hamby R.E. «t »1, 1974, Ahmed S.S. et

»1, 1973, Ragan T.J. et «1, 197(3, Bandaraon J.E. et >1, 177B> .

Результаты некоторых экспериментальных иссдэдованиа, выполненных на разных видах животных и с использованием разных модэлэа дагбета, свидэтельствухт о низкоа резистентности диабетических сердец к ИЕ8МИИ ИЛИ аноксии (Hoarae 0.3. »t al, 1973, Feuvray D. et al, 1900, :ngei-obr«t4n С.G. at al, 19B0, Mochlxukl I. at al,

l'a*), хотя в других работах эти выводы не находят подтверждения

(Halder В. et al, 1977, Sinclair-Smith B.C., Ople L.K., 197Э, Tan! M., Muai y J.R., 1998, Vogel U.M., Apstaln C.S., 1983, S*ymour A.-M.L-, Droentn M.J., 1991) . Vil ВЫДВИНУЛИ ПрОДПОЛОЖОЕИЭ, СОГЛЭСПО

которому резистентаость диабетических сердец к икемии определяется степенью ишемических • поврежданиа. Иными словами, если адаптационный механизм диабетических сердец мошт включиться в остром периода ишемии, то с продолжением ишемии он мошт нарушаться, что, в свою очередь, может уменьшить резистентность этих сердец к ишемии. Для подтверждения зтого предположения, а также дая объяснения существующих в литературе противоречивых данных, в настоящая работе ' были использованы 2 срока ишемии продолжительность» 40 мин и 60 мин, которые условно были названы как острая и глубокая, соответственно. При использовании кардкошзэгическоа остановки и решрфузии оба ввда ишемии носят обратимый характер, т.е. решрфузия приводит к восстановлении сократительной функции сердца ¡н»»г»» n.J.,«t ai, i9ai>. Однако, 60-юш ишемия оказывает более сильный давреадавдиа эффект на

струетурную и функциональную целостность миокарда, чем 40-мин, о чом свидетельствуют развитие итекической контрактуры, уманьшенш содержания макрозргов, ослабление дыхательной функции митохондрия, закислэкие внутриклеточной среды, наруяениэ липидного обмена и другие функциональные и биохимичоскиэ изменения.

Полученные результаты показывает, что решрфузия после 40-мин кав! лоского периода вызывал» восстановлений сократительной функции контрольных и диабетических сердец крыс. При этом степень восстановления РС диабетических животных не отличалась от контрольных (Рис. I). Для обеих груш сердац уменьшила РС составило около 503» от предшмических значениа соответствующих групп. Как показывают результаты этих экспериментов 40-шн икемия на выязила отличительных особенностей между контрольными и диэботичосюши сердцами крыс, т.е. резистентность как контрольных, так и диабетических сердац к ишемии была одинакова. Ещэ более интересными являются результаты экспериментов на диабетических кроликах, которые свидетельствуют о более высокой резистентности сордоц этих животных к 40-мин ксегои. Восстановление РС

до 5 10 15 20 25 30 ишемии Время сепэрфуаш, шш

Рис. I. Динамика восстановления работы сердца контрольных и диабетических крыс чероз 40-мин и ВО-мин тотальной ишемии. * - р<0,05.

40 игл

60 шн

диабетических кроликов после 40-мин тотальной игекии происходит лучсе контрольных. Данные, показывающие одинаковую или более высокую резистентность диабетических сердец к ишемии, по с равно низ с контрольными, были получены такта другими авторами tH«>d»r в. et

•1, 1977, Vogel M.M., ftp«tein С.S., 1993).

Для оцзнки степени восстановления функциональных параметров в более жестких условиях сердца контрольных и диабетических животных были исследованы через 60 мин тотальной ишемии. Данные показывают, что -HäP/dt, -dp/dt и ЧСС после регорфузии вслед за 60-мин ишемиоа у диабетических крыс были ниже контрольных, соответственно, на 263!, 3855 и 34% (р<0,01, во всех трех случаях). Наблюдалось очень слабое восстановление PC диабетических животных (в 2,3 раза ниже, чем контрольных) после 60 мин ишемии. Интересным является также сравнение данных, полученных после реторфузии, с предаломическими значениями. Если -юр/dt, -tjp/dt, рд, ЧСС и PC после рэперфузии составляют, соответственно, 31%, 295Б, 3555, 76% и 283 для контрольных сердец, то для диабетических сердец - 28%, 22%, 2435, 58Ï и 13% от соответствующих предииемических значения. Проведенаыа анализ результатов показывает, что в условиях 60-мин иазмии диабетические сердца оказывается менее резистентными к ишемии, чем контрольные (Рис. I).

Из полученных данных видно, что резистентность контрольных и диабетических сердец к ишемии варьирует в зависимости от продолжительности гсзекии. В более ранние сроки ишемии диабетические сердца переносят ишемию одинаково <зксшримента на крысах) или дамз лучше, чем контрольные (эксперименты на кроликах). Однако, восстановление сократительной способности диабетических сердец после глубокой ишемии происходит хуже, го сравнении с контрольными. Кроме того, наблвдаетоя также некоторое различие в динамике шспшемического восстановлэяия работы контрольных и диабетических сердец (Рис. I).

Таким образом, результата, представленные в этой главе, демонстрируют достоверное различие по основным физиологическим параметрам между изолированными контрольными и диабетическими сердцами при перфузии по Лангендорфу в течение 25-30 мин. Низкая сократительная активность диабетических сердец монет быть объяснена некоторыми метаболическими нарушениями, происходящими в сократительных кардиомиоцитах в условиях недостаточности инсулина и гипергликемии. Эти нарушения, вместе или каждое в отдельности, когут являться причиной уменьшения активности ниофпЭрилгярного

аппарата. Ими могут быть нарушение гомеостаза Са2+ внутри цитоплазмы за счет изменения его транспорта через сарколемму и мембрану саркоплазмэтического ретикулума, уменыпенмэ скорости длания митохондрий, с последующим нарушением синтеза и транспорта анергии в клетке, изменегае изоферментного сгактра сократительных белков, в частности, миофибриллярной АТФазы, нарушение фосфг "мпидаого состава плазматических мембран клетки и другие.

Оденка_энергетического метаболизма миокарда в норме и при

Экспериментальные исследования, выполненные до сих тар по кзучонио функциональной способности митохондрия при различных патологиях сердца, проводились на изолированных препаратах этих органелл. Однако, результаты, полученные на изолированных препаратах, полностью не отражают истинную картину метаболических и функциональных нарушении, происходящие в этих органеллах, поскольку в ходе выделэниа, особенно из поврежденных органов и тканеа, больоая часть (более 502) митохондрий теряется ч.осьп»г •t »i, 1975, был(»г м. »t «i, i9ai>. Б настоящей работе, с цэльс исключения различных артефактов, связанных с выделением, был использован новый метод определения скорости дыхания митохондрий в сапонин-скинированных волокнах сердца, который не требует выделения мигохондриальной фракции из сердца и дзет возможность определить дыхательные параметры митохондрий в 10-15 иг образца. ,

В первых сериях экспериментов мы провели сравнительное исследование скорости дахакия мэтохоаарий контрольных и диабетических сердец крыс и кроликов через I мес после начала диабета (Табл. 2). Было найдено, что скорость дыхания митохондрий диабетических сердец во всех условиях измерения достоверно ниже контрольных. Гак, v0, v^, v^ и VM2KC митохондрий диабетических сердец составили 83Ж, 81Ж, 7BS и 83Ж для крыс и 7855, 7056 и

80S для кроликов от соответствующих значении контрольных сердец. Другими словами, скорость дыхания митохондрий сордца при 1-мес диабете снизилась в среднем на у крыс и на 24% у кроликов.

Таким образок, данные, полученные в результате проведения этой серии экспериментов, показывает, что скорость дыхания митохондрий в сордцэх диабетических животных достоверна ниже, чем в контрольных сердцах. Низкая скорость поглощения кислорода может являться главной причиной уменьшения скорости окислительного

Таблица

Основные параметры скорости дьокккя ютохоглра создала у кончрольных и диабетических животных.

Уэд5 укр укакс укат АКДЙО Жр

Крысы Контроль 4,59 ±0,29 8,84 ±0,52 13,98 ±0,39 29.01 ±0,74 0,60 ±0,12 63,34 ±3,24 59.20 ±2.14 98.11 ±3,09 24,37 ±0,55

Диабет 3,81, ±0,18 7.14, ±0,43 ю.во,, ±0,23 24,17,, ±0.80 0,49 ±0,14 61,41 ±2,39 48,48, ±1,95 98,20 ±2,81 20,39, ±0.47 i

Кролики Контроль 3,72 ±0,21 8,53 ±0,34 13,52 ±0,53 27,55 ±0.61 0,58 ±0.10 74,14 ±4,2в 58,50 ±1,71 99,27 ±3,74 23,90 ±0.64 н 1

Диабет 2,90, ±0,24 ±0,25* 9.49,, ±0,32 22.13,, ±0,45 0,41 ±0,09 73,81 ±2.95 48.33, ±1,58 98,50 ±2,85 19,28, ±0,71

АКД - авдэгггор контроля дыхания гкр - продант ускорения дыхания

креатином, ЖАТ - продант инпйирования максимальной скорости дыхания КАТ. '* - р < 0,05, *» - р < 0,01, по сравнению с контролэм. Результаты представлены как "±л> от 10-11 экспериментов.

фосфоршрования в митохондриях диабетических сердец. Подобные результаты были получены на изолированных препаратах митохондрия <pi»rc» о., гь»11« п., ivas). Уменьшение проданта относительного ускорения скорости дыхания креатином свидетельствует о нарушили также транспорта ATO а сократительных кардиомиошггах го кроатинкиназному пути. Было найдено, что структурная оэлостность ките, ондриальноа мембраны сердца в условиях диабета не нарушается, о чем свидетельствует полное кнгиЗированиэ максимальной скорости дахания митохондрий под деаствием КАТ, являющимся специфическим ингибитором АТО-АДО трзнслоказы. Это дает основание ксндантрирозать наш внимание на возможной .роли АТО-АД® транслоказы, а также митохоядркэльного изоформентз КОК в нарушении транспорта ATO в клетках диабетического сердца.

Дыхательная функция мигохондрйа контрольных и диабетических сордац была исслэдоваяа через 40 мин и 60 мин тотальной ишемии и послэ регорфузии. Полученные результаты показывает, что как 40-миа кпомия, так и постюмичоская рогзэрфузия не вызывает- нарушения дыхательноа функции митохондрка у обоих видов животных. Так, при шемии и регорфузии скорость дыхания шгозондрш контрольных сердец умоньоается, соответственно, на 6% и 10% у кроликов и на 8Ж и IIS у крыс. Эти данные для диабетических сердец составляют, соответственно, 53 и 3S6 для кроликов и Ш и 15% для крас. (Рис. 2). Как видао, острая кзрдиоплзГическая киши и раперфузия не вызывают серьезных изменений в функциональное активности кетохонлриа. Следует отметить, что несмотря на воизмоаенность скорости дыхания как у контрольных, так и у диабетических животных, достовернее отлична кзящу этими грушами животных сохранялось в хода икши к ретарфузии. Это свидетельствует об одинаковой резистентности контрольных и диабетических сердец к острой„ишемии. При этом практически ео кэзяется транспорт АТС из матрикса через внутреннюю мембрану ыттохондриа, о чем свидетельствует значзяиэ SKp. При иаемии и ротарфузии также ко изменяется АДЗ-стамулирсзаннсэ .гдоеко у обоих групп сердец,

V -V .

макс о

Увеличение продолжительности ишмии до 80 мин и последующая репзрфузия демонстрировали более сильные изменения абсолютных и относительных параметров скорости дыхания митохондрий (Рис. 2)

а го

'макс

(в 55 от прэдишмического уровня)

CTV

а & £ о

Ши

m о

S а> s

о я а о я о са и а>

Так, скорость дыхания митохондрия контрольных сердец по еде ишемии и после реперфузии снизилась, в среднем, на 32$ и 36350 соответственно. Для диабетических сердец эти данные составляли, соответственно, 43% и 5335. В отличие от 40-мин, 60-кин ишемия выявила достоверные отличия между контрольными и диабетическими сердцами. Вадно, что дыхательная функция юггахондриа диабетических сордеч поело кпемии и послэ регаэрфузии повреждена б большей степени, по сравнению с контра..лыми. Кроме того, наблюдалось изменение относительного ускорения дохания креатином, лКр, который характеризует работу мэтохондриального гоофермента КОК. Нарушение АДО-завискмого дьосания (vKaKC-u0) свидетельствует об уменьионии АТОазноа активности и, в делом, процесса окислительного фосфори-лирования а мотохоядриях.

Таким обрззом, результата, представленные в этом раздаю работы, показывают, что дыхательная функция китохондриа контрольных и диабетических сердец го разному реагирует ва действие киэмии в зависимости от ее продолжительности. Если как контрольные, так и диабетические сердца в одинаковой степени реагирует на действио 40-мин ишемии, то с увеличением продолжительности югамии до 60 юн дыхательная функция диабетических сердец повреждается в большая степени, чем контрольных сердец. Кроме того, найдено, что достоверная разница в абсо.шгЕых и относительных' параметрах моэду контрольными и диабетическими сердцами, нгблвдзомэя в продшзмичоских группах, сохраняется как в комических, так и в ропорфузиодшх грушах.

Анализ сердец, выделанных из контрольных и диабетических аивотаых, демонстрировал некоторые отличительные особенности послодних (Табл. 3). Так, содержание ATO в диабетических сердцах крыс и кроликов составляет, соответственно, 03% к 7Q% (р<0,05, в обоих случаях) по сравнения) с контрольными сердцами. Содерканиэ АДЭ в зтих сердцах составляет, соотштственно, S33 и 6BS (р<0,05, в обоих случаях). Содеряаниэ АКФ в диабетических сердцах было такое вд, как в контрольных. Несмотря на уменьшение уровня ATO, а также АДФ, не наблюдалось достоверного отличия между контрольными и диабетическими сердцами по содержанию 5>Кр, хотя отмечалась небольшая тенденция (на 5%) к его уменьшению при диабете. Не была обнаружена также достовэрлая разница в уровне общего креатина

(Кр^) в миокарда (Табл. 3).

Таблица_3..

Тканевое содержание макроэргов в миокарде (в мкмолях/г. сухого веса ткани) контрольных и диабетических животных.

АТФ АД« АМФ ^обт ОКр «Роб«

Крысы Контроль 23,18 11,09 5,72 ±0,67 0,89 ±0,10 29,08 ±1,25 32,29 ±2,25 83,79 ±2,60

Диабет 19,27, ±1,14 3,60, ±0,47* 0,69 ±0,09 23,80, ±1,03* золе ±2,13 81,47 ±2,84

Кролики Контроль 21,71 5,29 0,80 27,81 31,84 84,39

±1,31 ±0,39 ±0,08 ±0,90 ±2,61 ±2,55

Диабет 18,44, . ±0,89* 3,51, ±0,42* 0,87 ±0,07 21,34, ±1,17* 30,77 ±2,08 82,21 ±1,32

АДНддщ • АТФ + АД® +■ АМФ

* - р < О,СБ, по сравнении с контрхшм.

Результаты представлены как м+я от 9-10 экспериментов,

В литературе существуют противоречивые данные по изменению содержания АТФ и ФКр в сердце в условиях экспериментального диабета. Так, результаты некоторых исследования показывают, что при диабета нзблвдается значительно© уменьшение уровня АТФ и ФКр

<А111 eon Т. В. at «1, 197А, Ml 1 lar Т.В., 1977). ОДВЭКО ИХвЮГСЯ

данные, сввдэтельствухвдю о неизменении этих макроэргов в диабетических сердцах экспериментальных животных <opi» l.h. «t ai,

1971, Seymour A.-M.L., Brosnan M.J., 1991).

Тотальная ишемия в течение 40 мин вызывала уменьшение содержания АТФ и ФКр как в контрольных, так и в диабетических сердцах обоих животных. Однако, стешнь уменьшения уровня данных макроэргов у контрольных я у диабетических ■ животных была различное. Так, содержанка АТФ в контрольных сердцах крыс снизилась до 2356, а в диабетических - до 31%, по сравнению с предаламичаскими значениями соответствующих групп. Для контрольных и диабетических сердец кроликов эти данные составляли, соответственно, Ш а 33» (Рис. ЗА). Еще боям интересным является анализ результатов по содержанию ФКр. Уровень этого макрозрга в

контрольных и диабетических сердцах крыс упал, соответственно, до IX и I7S, по сравнении с предшюмическими значениями соответствующих групп. В сердцах кроликов наблюдалось сшжэгиэ содержания ФКр до О и 182, соответственно. Несмотря на достоверное сгоиюнио содержания АДН в диабетических сердцах крыс (на 263!) и кроликов (на 203) в продиюмичэсноя группе, по сравнению с контрольными сердцами, з ишемич^скои группе достоверная разница между контролем и дизбетом по данному параметру не наблюдалась. Это может быть объяснено увеличением АДО и АМФ в результате усиления адекилаткиназноа (миокиназноа) реакции в сердце в условиях иаемии. Также но была установлена достоверная разница ковду контрольными и диабетическими сердцами по содержанию общего креатидз в иродашемическоа и ишемичоской группах.

Тотальная ишемия в течение 80 юш вызывала более сильную деградацию адетпшуклоотвдов и ФКр в обоих группах (Рис. 3). Гак, содерканш AIQ в контрольных и диабетических сердцах крыс упало до Ii% и 13%, по сравнению с предашэмическим ' содержанием этого макроэрга. Наблюдался полный распад ФКр в обеих группах сердец, несмотря лэ постоянный уровень обшэго креатина, который не отличался от предишемичэскоа величины. Кроме того, отмечалось значительное уменьшение АДН как в контрольных (на 68Ж), так и в диабетических (на 60Ж) сердцах, что свидетельствует о дзльвезшэ? деградации аденинвуклеотидов до аденозина и других продуктов распада при 60-мин ишемии.

Вэгорфузия сердец контрольных и дагбетических животных после 40-мин и ВО-мин ишемии демонстрировала разную степень восстановления АТФ и ОКр в исследуемых грушах. Так, уровень АТФ после реперфузии вслед за 40-мин кшоишг в контрольных сердцах крыс и кроликов восстанавливался, соответственно, до iZ% и 3« от предишемичоских значения. В диабетических сердцах восстановление данного какрозрга происходило в больиез степени и составило 62% и 812 для крыс и кроликов, соответственно (Рис. ЗА).

Содержание АДН в контрольных сердцах этих животных восстанавливалось, соответственно, до 43SS и 33%, а в диабетических - до 81% и 71Ж, от ¡тредиЕомнчоского уровня данного параметра. Неполное восстановление аденинауклэотидоз при реперфузии может быть объяснено необратимым их распадом в ходе ишемии. Отмечалось полное восстановление ФКр в обеих группах, содержание которого в рэперфузионноа группе было даже выше, чем в предашемическоя (фосфокреатиновыя "оваршут"). При этом сохранялась достоверная

100

&—& - КОНТРОЛЬ ф—О - ДМБЕТ

я 2

I I 40

"■< со

. I -ф

н 20Н

о «

К я © 3

чл я

СРОК ИШЕМИИ

40 млн

60 мин

НО

100

40 1шв

60 мая

ишешга

оепорфуаая

Ряс. 3. Изменение тканевого содержания АТФ (А) и ®Кр (Б) в сердцах контрольных и диабетических крыс после 40-мин и би-мин тотальной ишемии и решрфузии. * - р<0,05, «« - р<0,01.

разница между контролем и диабетом, наблюдаемая в предаю кическоа и ииемической грушах. После решрфузии содержание общего креатина в контрольных сердцах крыс и кроликов снизилось на 3035 и 2735, соответственно, в то время, как в диабетических сердцах уменьшение данного параметра не наблюдалось. Одинаковое содержание Кробд в контрольных и диабетических сердцах в предиземической • и ишем;. .эской группах и его уменьшение в диабетических сердцах во время решрфузии свидетельствует о возможной потере креатина клеткой и о его выходе в регюрфузат после 40-мин ишемии.

Рвперфузия контрольных и диабетических сердец после 60 мин гаемии выявила другда отличительные особенности этих двух груш сердец. Так содержание АГФ в контрольных сердцах крыс восстанавливалось до 23%, а в диабетических - до 14% (Рис. ЗА). Обшда уровень адениннуклеотидов составил, соответственно, 3255 и 263» от предашемического уровня. . Несмотря на одинаковую степень восстановления данного параметра, .достоверная • разница между контролем и диабетом, наблюдаемая в предашемическоя /групда, сохранялась и в рагарфузионной. Если содержание ФКр в контрольных сердцах восстанавливалось -до 3035, то в диабетических - до I8X (Рис. ЗБ). При этом общий креатин в контрольных сердцах составил 5056, ' а в диабетических - 4036 от соответствующих величин в лредишемической группе.

Таким образом, результаты этого раздела работы . свидетельствуют о достоверном уменьшении тканевого содержания , АТФ (на 21%) и АДО (на 36Ж), при постоянном уровне ФКр в условиях диабета без ишемии. Было найдено, что ишемия, в зависимости от ее продолжительности, вызывает разную степень изменений в тканевом содержании АТФ и ФКр, а также - других 'адениннуклеотидов .- и свободного креатина. Постишемическое : восстановление А1Ф и ФКр , через 40 мин ишемии в диабетических сердцах происходит лучше, ' чем в контрольных. Одной из причин -этого может быть высокое,, го сравнению с контролем, содержание АТФ и особенно ФКр в диабетических сердцах к концу 40-мин ишемии. Восстановление уровня АТФ и ФКр в диабетических сердцах происходило в меньшей степени по сравнению с контролем. Другими словами 60-мин ишемия, в отличив от 40-мин, оказывала отрицательное действие на диабетические сердца. 03 атом свидетельствует также уменьшение общего креатина в диабетических сердцах, содержание которого было меньше, чем в контрольных сердцах.

На основании полученных данных. можно стлать заключение о

том, что в диабетические сердцах наблюдается нарушение дахательной функции митохондрия и тканевого содержания АТФ. Кроме того, было найдено, что после острой ишемии (40 мин) энергетический метаболизм диабетических сердец нарушается в меньшей степени по сравнению с контрольными. Однако, увеличение продолжительности ишемии (80 мин) сопровождается ухудшением как дахательной функции митохондрий, так и псстишекического восстановления иакроэргов.

Рис. 4. Корреляционная зависимость между относительным изменением скорости дыхания митохондрия и степенью восстановления работы сердца контрольных и диабетических крыс после 40-мин и 60-мин тотальной ишемии.

Одной из причин низкого содержания А1Ф в диабетических сердцах может являться уменьшение дыхательной функции митохондрий в этих сердцах. Анализ полученных данных демонстрировал тесную корреляционную зависимость между относительным изменением скорости

дыхания митохондрий (средняя скорость дыхания, полученная во всех условиях измерения) и степенью восстановлений работы сердца после 40 кин и 60 мин ишемии как у контрольных <г«+0,920, р<0,05), так и у диабетических (г=+0,902, р<0,С5) хрыс (Рис.4). На наш взгляд, эти исследования были бы не полными без проведения экспериментов по определению обшей активности и активности отдельных изофермэнтсв КФК в сердце в условиях экспериментального диабета.

^^¿_Актгандсть_КФК_в_ж10кард9_и_в_сыв

КФК, является одним из основных ферментов энергетического метаболизма, участвующим в транспорте и использовании АТФ в клетке. Было найдено, что существует взаимосвязь между изоформентным спектром КОК и изменением сократительной активности мышцы, в результате действия различных факторов и патологий (Apple

F.S., Rogens М.А., 19ВЬ, Khuchua Z.A. et al, 1989, Kapelko V.l. et

•1, 1990). Исследования, проведенные на животных с использованиям различных видов кардиомиопатай, показывают значительное- нарушила энергетического метаболизма, в частности, общей активности и изоферментного спектра КФК (Sluvers R. et al, 198J, Cappasvo J.M. et al, 1989, Sake V.A. et al, 1971). ПрИНИМЗЯ ВО ВНИМаНИЭ

результаты этих, а также наших исследований, показывающих уменьшение сократительной активности сердца в условиях диабета (Гл. I), мы решили провести полный сравнительный анализ ойкай активности и изоферментного спектра КФК в миокарде контрольных и диабетических крыс и кроликов.

Результаты исследований показали, что сахарный диабет со сроком I мес вызывает значительное уменьшение обшэй активности КФК в миокарде и сыворотке (Табл. 4). Так, обаая активность фермента в диабетических сердцах крыс и кроликов на 27S (р<0,05) и 3i% (р<0,01) ниже, по сравнению с контрольными сердцами. С помощью электрофоротического анализа фермент был разделен-На 4 изоформы: митохондриальная, КМ, MB, ВВ формы. Анализ данных показал, что процентное соотношение отдельных изоферментов КФК существенно различается между контрольными и диабетическими сердцами. При этом основные изменения касаются митохондриальноа и ММ формы фермента. Так, митоюндриальная форма КФК у крыс падает от 31% до 2156 (р<0,05), а у кроликов - от 29% до I9i (р<0,05). Процентная активность ММ формы, наоборот, увеличиваатся от 51% до ВвЯ у крыс и от 49Х до 65Х (р<0,05, в обош случаях) у кроликов. Активность MB изоферконта у обоих животных имеет тенденцию к уменьшению, хотя

Таблица.^

Общая активность (в МЕ/мг бело) и процентное распределение отдельных изофермеятов КФК в гомогенате сердец контрольных и диабетических животных.

общая % от общей активности активность -

Миго ММ МВ ВВ

Крысы Контроль («=§> 8,97 ±1,03 31,3 ±2,9 51,2 ±4,в •15,в ±2,6 1.9 ±0,8

Диабет (п=8) ±0,81* 20,8, ±3,2 вв.2, ±5,5 11,7 ±2,0 1.5 ±0,9

Кролики Контроль (П=§) 9,39 ±0,58 29,3 ±0.9 49,3 ±2,3 20,3 ±1,8 1.4 ±0,3

Диабет (п=8) 6,24,, ±0,43** 19,0, ±1,2 64,8, ±6,8* 15,0 ±4,4 1.5 ±0,4

Мита (митохондриальная), ММ, ИВ, ВВ - 4 изофермента КФК.

* - р < 0,05, *' - р < 0,01, по сравнению с контролем. ■

разница не является достоверной. Активность ВВ формы у крыс и у кроликов при диабете практически не меняется.

Сравнительный анализ общей активности КФК в сыворотке контрольных и диабетических животных демонстрировал также значительное снижение егспшзости КФК в крови диабетических животных. Так, активность фермента была, соответственно, на 49Ж и 41% ниже в крови даабэткческиг крыс и кроликов по сравнению с контрольными. ....

Таким образом, полученные результата демонстрируют уменьшение общей активности, а также активности мигохсндриальной и МВ формы КФК в диабетических сердцах. Функциональные последствия уменьшения активности КФК в диабетических сердцах не установлены, в че".поста, не иг.остно приводит ли низкая активность КОК к уменьшении сократительной активности миокарда. Определенные особенности креатинкиназноа системы, характерные для скелетной и сердечной мьиц, дают основания высказать некоторые косвенные доказательства в пользу существования непосредственной взаимосвязи между низкой активностью КФК и ушншеяизм сократительной функции миофибриллярного аппарата. Так, было найдено, что один из изоферментоз КФК, ММ форма, локализован в миофибриллах и

катализирует росиктез AT® из ФКр и АДО. Молекулы AT», в свою очередь, участвуют в энергоснабжении миофибриллярного аппарата, разлагаясь с помощью АТФазы миозина (Bff»sm»n s.p., юэз). Было показано, что КФК также локализуется у сарколеммы <в«»«т«л s.p., 1*?85) и саркоплазматического ретикулума <s»k« v.a. »t «1, 197в). Кроме того, имеется «сггохондриальныа изофермент КФК, который синтезирует ОКр из АТФ и креатина. ОКр транспортирует энергию к миофибриллам, сэрколвммо, саркоплазматическому ретикулуму и другим участкам, в которых, как уже отмечалось выше, происходит рэсинтез АТФ при участии КФК. Расположение молекул КФК рядом с АТФазайи позволило говорить о существовании компзртаентизации КФК и отдельных пулов АТФ (Basiman S.P., 19B3I ,

На основании наших данных, показывающих уменьшение общей активности КФК в среднем на 31% в диабетических сердцах, можно говорить о нарушении работы миофибриллярной АТФазы в результате снимания содержания околомиофиЗриллярного. ■ пула АТФ . вследствие низкоа активности КФК. Диллман показал, тго • -активность Са2+-зависимои АТФазы миозина, характерной для' миофибриллярного аппарата, значительно уменьшается в сердда крысы при диабете

(Dillmann W.H., 1S»S0) . Кроме ТОГО, ГрИНфИД И СввЙН бЫЛО НЭЙД9Н0, что уменьшение активности миофибриллярной КФК на 17%,' вызванное ишемией, является одной из основных причин низкой сократительной активности ишемического миокарда (Sreenil.ld R., Swaln J., 1987). Низкая активность югтохондриального изофермента КФК, наблюдаемая в наших экспериментах, также может- способствовать уменьшению сократимости мюфиЗрилл в диабетических сердцах вследствие замедления скорости синтеза ФКр на вкгтшеа поверхности внутренней мембраны митохондрий. .Однако, не исключается возможность уменьшения активности данного изофермента, а также общей активности КФК за счет включения адаптационного механизма клетки в ответ на снижение скорости дыхания митохондрия сердца в условиях диабета (см. гл. 2.1). Причинно-следственная взаимосвязь между сократимостью миокарда и активностью КФК основным ферментом энергетического метаболизма сердца, ДО конца не выяснена. Укеньгание активности КФК в сыворотке диабетических животных в среднем га 45Х может быть результатом ; низкой активности данного фермента в сердца и. возможно, в скелетных ныщях этих животных.

. Таким образом, результаты, представленные в этом раздала работы, свидетельствует о достоверном уменьшении общей активности, а такие активности мигохондриального и MB изофермента КФК в

диабетически! сердцах, что, в своп очередь, может бьггь одвоа из причин снижения сократительной способности миокарда в условиях сахарного диабета.

Ко:тестшнша_анал10_фос$олщщдв_дааботот __сердца

ЗЛл_Исс.та2озяяке__основных__классов_дба51х_липид59_£_Ф9Й2лигойЗ§

сердца, в норке и при диэбете.

Учитывая огромную роль плазматических мембран в поддержании гигзне деятельности клетки, можно предположить, что любые функциональные и метаболические нарушения целостности клетки должны отразиться на количественном и качественном составе фосфолипидов. Для выяснения возможной ' роли фосфолипидов в укенылении сократительной функции диабетического сердца нами были исследованы основные классы фосфолипидов в норме и при диабете. Следует отметить, что процентное распределение отдельных классов фосфолипидов, представленное в таблице 5, хорошо совпадает с данными, полученными другими авторами (Simon G., Rousffr 0, 19Î.9,

Chien K.R. et al, 1981, Steenbergen G. , Jennlngs R.B., 1984). ЙЗ

таблиш видно, что I-мес экспериментальный диабет у крыс вызывает

Таблица_5х

восфолшмдныа состав миокарда контрольных и диабетических крыс.

фосфо- ккг фосфора/ мг белка % от общего количества ФЛ

липиды контроль <п=8> диабет (п=7) контроль диабет <"=7>

ох 2,248tO,IOI 2,21410,085 4Ï,62±I,38 43,2в±1,07

фэ 1,725±0,098 I,54I±0,I22 31,8Г7±0,9й 29,14±1,24

сф 0,191±0,024 0,288±0,Q4I* 3,89±0,35 5,31±0,48**

ос+фи 0,355±0,037 0,365±0,029 6,45±0,в4 7,82±0,89

кл 0,893i0,0B8 0.664±0(081* 15,46±0,93 I2,44±I,I5*

лфх 0,0400,007 0,067±0,009** 0,55±0,23 1,02±0,15*

лфэ 0,028±0,008 0,043±0,008* 0,42±0,12 0,72*0,10*

5Лобш 5,54±0,4I 4,71±0,50

* -р< : 0,05, ** - р < 0,01, по сравнению с контролем,

изменения в абсолютных и относительных значениях отдельных классов фосфолипидов и лизофосфоглицэридов. Особый интерес представляет значительное и достоверное увеличение концентрации лизофосфати-далхолина (ЛФХ) и лизофосфзтидилэтаноламина (ЛФЭ) в диабетических сердцах на 682 и 5435, соответственно, по сравнению с контролем. В литературе практически отсутствуют данные ' о содержа®® лизофосфоглицвридоз в диабетических сердцах. Результаты наших исследований демонстрируют достоверные изкоеояия в содержании сфингскиелина (СФ) и кзрдаолипина (КЛ). Так, концентрация СФ в диабетических сердцах увеличилась на 5IS по сравнению с контролза. Дизбот вызывал сниженш уровня КЛ - специфичного для митохондрий фосфолипида, на 26SS по сравнению с контролем. Кроме того.

Тэблица_6г.

■Лигощный состав сердца крысы в норка и при диабете.

Липиш. Контроль (n=ä) Диабет («=7>

ТГ (мг/г белка) I4,I5i3,84 28,I7i8,49*

Х0общ. (мг/г бачка) 6,I8±2.30 12,6713,84*

ХССВОбОДНЫ2 (кг/г белка) 3,02iI,I3 5,28±I,62

Yp ■^этерифшщр. (мг/г белка) 3,I7iI,23 5,06±2,09

сжк (мкмоль/г белка) I2,45±2,78 38,62sII,I9*

®Азбщ<ккгвн/иг болка) 5,54±0,4I • 4,7Ii0,50

хсобщ:фЛхзщ I,I0±0,28 2.1710,35*

* - р < 0,05, го сравнению с контролзм.

наблюдалось снижзниэ, хотя не достоверное, абсолютного содержания фосфатидилзтанолашша (ОЭ) в диабетических сердцах на IIS, го сравнению .с контролза. Кахио-лиЗо заметаю кз.>,мнения в концэнтрациях фосфатвдилхолина (ФХ), фосфатидалсорина (ОС) и фосфзтидализозит(ол)а (СИ) во наблюдались (Рис. 5).

Е23 — ДИАБЕТ

Рис. 5. Влияние сахарного диабета и 60-мин тотальной ишемии на уровень основных классов фосфолипкдрв и лизофосфоглицэрздов (в % от контроля) сердца крысы. * - р<0,05, ** - р<0,01.

Диабет оказывал влияние также на содержание других классов липидов в сердца (Табл. 6). Так, наблюдалось достоверное повышение концентрации триглидеридов (ТГ). общего содержания холестерина (ХСойд) и свободных жирных кислот (С«К> в сердцах крыс при сахарном диабете. Особенно интересным являлось увеличение соотношения общего содержания холестерина к общему содержанию фосфолипвдов (ОЛобщ).

Таким образок, результаты представленные- в этом разделе работы, демонстрируют существенные изменения в содержании фосфолкпидов сердца крысы в условиях экспериментального диабета сроком I мес. Измененуэ содержания отдельных фосфолипидов и лизофосфоглицеридов отразилось на их обшем содержании, которое, хотя недостоверно, снизилось на 15%, по сравнению с контролем. Увеличения концентрации СО и лизофосфоглицеридов, а также уменьшение содержания Ы и И могут влиять на структурную целостность и функциональную активность . сердечных клеток диабетических животных. Следует отметать, что лизофосфоглицериды обладают детергентоподобным эффектом, и увеличение коядентрации этих токсических метаболитов в клетке также может играть существенную роль в нарушили работы сердца.

Зл§^_Изменение_увдвня__фо^лищов_сад®а_при_гаемш1_в^нИе_са-

В этом раздела работы был исследован фосфолипидный состав контрольных и диабетических сердец в условиях глубокой ишемии продолжительностью 60 мин и репэр^узии. Сравнительный анализ полученных данных показывает, что ишемия и репорфузия не влияют в одинаковой степени на уровень лизофосфоглицеридов в контрольных и диабетических сердцах, хотя в обоих случаях наблюдается повышение их концентрации. Если ишемия и реперфузия вызывают увеличение содержания ЛОХ в контрольных сердцах, соответственно, на 7055 (р<0,05) и 30%, то в диабетических - на 25% и 14% по сравнению с контролем. Нужно откатить, что увеличение концентрации ЛФХ в диабетических сердцах при ишемии не было достоверным. Содержание ЛФЭ в контрольных сердцах при ишемии и реперфузии увеличилось, соответственно, на 76% (рк0,01) и 44%, а в диабетических - на 29% (р<0,05) и 13% по сравнению с контролем. Как видно, концентрация лизофосфоглицеридов в диабетических сердцах при ишемии возросла в меньшей степени, чем в контрольных, сердцах (Рис. 6). Если содержание -ИХ и /г2Э в контрольных серцах при ишемии увеличилось.

- зг-

соответственно. на 705! и 78$, то в диабетических - на 25% и 29Ж по сравнении с контролем. Интересно, что несмотря на меньшую степень увеличения уровня лизофосфоглицвридов в диабетических сердцах при ишемии, абсолютные значения этих метаболитов в последних были выше, чем в контрольных.

2 О'В-Ч

о •о

I '

•I 0,11-&

ф «

0,09"

0,07 ~

0,05

до ишемия

Д-Д- КОНТРОЛЬ

О-О- ДИАБЕТ

по оде ишемии

поохе реиерфуши

Рис. в. Изменение содержания лизофосфогицэрвдов (ЛФГ=ЛФХ+ЛФЭ) в контрольных и диабетических сердцах крысы после 80-мин тотальноа ишеюш и регорфузии. t - р<о,05.

Таким образом, представленные результаты показывают, что экспериментальный диабет в течение I мес вызывал значительное и достоверное повышение концентрации лизофосфоглицзридов токсических веществ гидролиза фосфолипвдов в сердце крысы. Высокое содержание лизофосфоглицзридов также характерно дхя ишемических сердец, о чем свидетельствуют результаты экспериментов, проведенных на моделях региональной и тотальноа ишемии. Следует

отметать, что диабет, в отличие от иземии, вызывал резкие изменения в содарканиии фосфолипидов, в частности, приводил к увеличении концентрации СФ и уменьшению уровня КЛ и ФЭ в сердца. Было наадэно, что 60-мин тотальная транзигорная ишемия вызывала заметные нарушения в фосфолипвдяом составе контрольных и диабетических сердец. При этом достоверная разница в абсолютных значениях фосфолипидов, наблюдаемая иеаду контрольными и диабетическими сердцами до ииемии, сохранялась также после ишемии и реперфузии.

Увеличение содержания СФ и уменьшение уровня КЛ, по-видимому, происходят в результате нарушения процессов синтеза и(или) деградации этих фосфолипидов при сахарном диабете. Снижение содержания КЛ в митохондриях диабетических кивотных может играть спроделзнную роль в иг-шненш активности АТФ-АДО транслоказы с

Рас. 7. Схематическое изображение структуры внутренней мембраны митохондрия, показывающее фосфолипидного окружения АТФ-АДО транслоказы (АКТ) У.А. >1 »1., 19В7).

последующи нарушением транспорта энергии в миокарде. Данные, полученные в лаборатории Клингерберга и Сакса, свидетельствуют о то», что АТФ-АДО транслоказа находится в окружении кардаолипина -

МШЕМБРАННСБ ПРОСТРАНСТВО

МАТРИКС

-ДРУГИЕ ФОСФОШПЩН

специфического для кягохондриа фосфолипида, который играет большую роль в нормальном функционировании дыхательной цепи. <в*ук.,

КПпдегЬегд М. , 1985, Бак» У.А. а1, 1907). При ЭТОМ,

предполагается электростатическое взаимодействие отрицательно заряженных груш КЛ с АТФ-АДФ транслоказой, которая, в свою очередь, функционально сопряжена с митохондриальной креатишскназоЯ (Рис. 7). Было нзяшно, что каждая молокулэ АТФ-АДФ транслоказы образует комплекс с вестью молекулами КЛ (веург к., кипдегьэгд м., 1983). Исходя из этого, нарушение лзшвдного окружения фермента может повлечь за собой изменение его активности. Эти изменения могут носить компенсаторный характер вследствие уменьшения сократительной способности миокарда. Однако, причинно-следственная взаимосвязь между фосфолипщшым обменом и сократимостью сердца в условиях диабета не выяснена.

Сравшгаэльное исследование чувствшзльноста.диабетических сердец "к внеклеточной концентрации кальция в норке и после ишемии.

На основании существующих на сегодня данных мокно сделать вывод об увеличении кальциевой перегрузки сердечных клеток в хода развития сахарного диабета. Кальциевая перегрузка, в свою очередь, связана с нарушением электромеханического сопряжения в клетке и может являться одной из главных причин уменьшения сократительной способности миокарда. Мы предполагали, что чувствительность сердец с кальциевой перегрузкой к изменению внеклеточной концентрации кальция должна отличаться от нормальных сердец. Кроме того, ишемия может оказать разные аффекты на сердцэ в зависимости от степени нарушения Са2+ гомеостаза в предашемическом периода. Для проверки этих предположений мы определяли степень чувствительности контрольных и диабетических сердец к разным"концентрациям Са2+ в гарфузируемом растворе в норме и.после тотальной 60-мин ишемии.

В первой серии экспериментов обе группы сердец после периода стабилизации были перфузировавы этим же раствором Кребса-Ханзеляата, но. содержании разные концентрации СаС12, по принципу последовательного уменьшения его содержания в перфузате через кавдые 5 миа пэрфузии. СаС12 был использован в концентрациях 0,5; 1,0; 1,25; 1.50» 1,75> 2,0| 2,25) 2,50 и 3,0 мМ. Результаты показывают, что разные концентрации СаС12 в составе перфузируемого раствора вызывают в разной степени изменения в контрольных и диабетических сердцах," хотя эти изменения по отношению к изначальному уровни каэдоа группы одинаковы. Снижояиэ концентрации

СаС12 в горфузате приводило к дальнейшему паданию сократительной активности в обоих группах сердец. 1ак, при кониэнтрации СаС12 в горфузате 1,5 мМ и 1.0 мМ <ч!Р/<п контрольных сердец упало, соответственно, на 40Ж и 77%, ш сравнению с шрфузиэя в присутствии 3,0 мМ СаС12. Скорость сокрашния диабетических сердец в этих ко условиях была, соответственно, на 44Ж и 74% меньше, чем для этой группы сердец, пэрфузируемых с 3,0 мМ СаС12. Снижение концентрации СаС12 до 1,5 мМ и 1,0 мМ вызывало уменьшение -чр/ш в контрольных сердцах, соответственно, на 53Ж и 892, а в диабетических - на 61? и 90Ж, по сравнении с соответствующими группами при нормальной перфузии. При использовании 0,5 мМ СаС12 в составе раствора Кребса-Хензеляйта сократительная активность как контрольных, так и диабетических сердец Прекращалась, что свидетельствует о нарушении процесса электромеханического сопряжения в кардиомиоцитах в условиях низкой концентрации Са2+. РС. определяемая как произведение ЧСС на РД, также снижалась в ходе уменьшения содержатия Са2+ в гарфузате и практически при всех кондентрациях {крокл 1,0 мМ) было обнаружено достоверное различие между контрольными а диабетическими сердцами (Рис. 8А).

Результаты этой серии экспериментов демонстрируют достоверное различив между контрольными и диабетическими сердцами при изменении концентрации Са2+ в парфузируемом растворе. Из полученных данных видно, что диабетические сердца менее чувствительны к изменению внеклеточной концентрации Са2+, чем контрольные. Низкая чувствительность диабетических сердец к Са2+ особо заметна по скорости сокрашния и расслабления, а также по работе сердца. Уменьшение чувствительности диабетических сердец к Са2+ свидетельствует о кальциевой перегрузке этих сердец в ходе развития' сахарного диабета. Поскольку кальциевая перегрузка кардиомиоцитов игргэт главную роль в шюмическом и реперфузионном повреждениях миокарда, представляло большой интерес исследование сократительной способности контрольных и диабетических сердец (срок диабета - I кес) в зависимости от концентрации Са2+ в реперфузате посла тотальной 60-мин ишемии. Для этого, сердца послв иземии были регорфузированы сначала кардиоплегическим раствором госпиталя Св. Томаса (15 мин), а потом нормальным раствором Кребса-Хензеляйта, содержащим 3,0 мМ СаС12 (30 мин). В дальнейшей обе группы сердец были решрфузированы отдельными растворами Кребса-Хэнзеляйта, содержащими- разные концентрации СаС12 по принципу последовательного уменьшения содержания последнего в

400'

^ 300

о Ё

о р->

200 ~ 100

л-л- контроль О-О- диабет

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

Ж,

мМ

1,0 ..1,5 2,0 .2,5 3,С

диабэта-

Рис. 8. Изменение работы сердца (РС=РДхЧСС) контро лймс А'л чесгап крыс в зависимости от конпветрации Са в гарфузате до иие-мии (А) и послэ 80-мин тотальной ишемии. » - р<0,05, ** - р<0,01.

растворе в хода реперфузии через каждые 5 шин. Результаты экспериментов показали, что ишемия вызывает достоверное уменьшение основных физиологических параметров контрольных и диабетических сердец, сохранив достоверную разницу между ними в ходе реперфузии.

Как и в случае предилемии. сократительная деятельность обеих групп сердец прекращалась при использовании 0.5 мМ СаС12 в составе репорфузата. Достоверная разница между контрольными и диабетическими сердцами по -«1р/<п и -аг/сп, наблюдаемая при перфузии 3,0 мМ СаС12, сохранялась при всех других коншнтрашях последнего, за исключением 1.0 мМ. Реперфузия контрольных и диабетических сердец с нормальным раствором Кребса-Хензеляата приводила к восстановлению РС, соответственно, до ЗС% и 16% от" предишемических значений данного параметра. При снижении концентрации Са2+" в регерфуззте до 2.0> 1,5 и 1,0 мМ наблюдалось уменьшение РС контрольных крыс на 23%. 55% и 83%. а диабетических - на 355!. 61% и 81*. соответственно, по сравнению с абсолкггными значениями ' данного параметра при реперфузии с раствором Кребса-Хензеляата, содержащим 3.0 мМ СаС12. При всех используемых концентрациях СэС12 сохранялась достоверная , разница между контрольными и диабетическими сердцами (Рис. Ж).

Низкая чувствительность диабетических сердец к изменении внеклеточной коншнтрации Са2+ свидетельствует, в первую очередь, о кальциевой перегрузке сердечных клеток. В пользу этого выступает-данные об увеличении тканевого содержания Са2+ в диабетических сердцах на 35% по сравнению с контрольными <бсз.ы. ег «1, 1791). Повышение внутриклеточной концентрации Са2+ может происходить в результате возникновеш„. субклеточных дефектов в различных органеллах, участвующих в урегулировании уровня Са2+ при сокращении и расслаблении киофиЗриллярного • аппарата сердечных клеток. Сахарный, диабет вызывает кальциевую перегрузку в кардиомиоцигах в результате нарушения функции основных регулягорных механизмов транспорта кальция в сарколемме, саркоплазматическом ретикулуме и митохондриях. Кальциевая перегрузка и деструктивные изменения в сарколемме (уменьшение общего заряда гликокаликса, изменение продантного соотношения фосфолипшюв, накошюниэ лизофосфоглида ридов и другие) диабетических сердец, в свою очередь, уменьшают чувствительность по сладка к изменению внеклеточной коншнтрации Са2+ в оэрфузируемом растворе. Интересным является влияние тотальноа иаемиа на чувствительность диабетических сердец. В отличие от

контрольных, в диабетических сердцах PC и РЛ в меньшей степени реагируют на изменение коншнтрации Са2+ в пэрфузируемом растворе во время перфузии, что, по-видимому, свидетельствует о дальнейшей уменьшении отрицательного заряда на гликокаликсе в результат© смыва сиаловых кислот при реперфузии. Последнее, в своп очередь, увеличивает степень кальциевой перегрузки сердечных клеток с последующим усилением контрактуры миофибрилл. Увеличение кальциевой перегрузки при регврФузии еше больше уменьшает чувствительность диабетических сердец к внеклеточному кальцию, по сравнению с предитекиэг.

1аким образом, из представленных в этой главе результатов можно сделать вывод, что экспериментальный сахарный диабет нарушает чувствительность сократительных кардиокиоцитов к внеклеточному кальцию. Кальциевая перегрузка кардиомиоцотов, независимо от других факторов, может быть одной из главных причин снижения сократительной функции сердца с послэдрэдим развитием сердечной недостаточности и дилаташгонноя кардиомиопатаи при сахарном диабете.

UiiSô.5- Исследование, взаимосвязи моязду степенью нарушения ,дыха-

собндсти_контролных_и^абетотес1Ш

Для выяснения роли низкой скорости дахгния йгтохондрий в постишемическом восстановлении контрольных и диабетических сердец нами было проведено исследование в условиях более глубокой ишемии продолжительностью 80 мин. В этих исследованиях использовались только контрольные сердца и степень уменьшения скорости дахания этих сердец после 80-мин тотальной шэмии была такая ira, как и в случае использования диабетических сердец посла 80-мш иаемии. Видно, что тотальная нормотермическая ишемия в течение 80 мин вызывала достоверное уменьшение скорости дахания митохондрий, которое составило в среднем 4635 по сравнению с продкшешческим уровнем. Другими словами, степень нарушения дахательноа функции митохондрий в данном случае была аналогична той, которая наблюдалась в случае диабетических сердец с 60-мин ишемией, при которой было обнаружено уменьшение скорости дыхания митохондрий на 43$ (РИС. 9).

В следующей серии экспериментов сердца были пврфузированы сначала кардиоплэгическш раствором госпиталя Св.Томэса (15 мин), а потом нормальным раствором Кребса-Хензеляйта (30 мин) при 37°С.

Однако, в отличие от регорфузии диабетических сердец посла 60-мин ююкии, при хотороа наблюдалось восстановление РС на 13*, репэрфузия контрольных сердец после 80-мин ишемии не приводила к восстановлению механической работы (Рис. 9). Анализ основных

до поода пооле

ишемии ишемии оепврфуши

Рис. 9. Степень восстановления работы сердца (РС) контрольных и диабетических крыс при одинаковых значениях максимальной скорости (умзкс) дыхания мигоюндриа после "Ю-мин и 80-мин тотальной ишемии.

параметров скорости дыхания митохондрия показывает, что одним из основных отличия между исследуемыми группами является снижение процэнта относительного ускорения дыхания креатином (¡6Кр) в присутствии низкой концрнтрации (100 мкМ) АДФ, который отражает .работу креатинкиназной реакции на наружной поверхности внутренней мембраны митохондрия. Если данный показатель' в диабетических сердцах после 60-мин . ишемии уменьшался в 1,4 раза, то в контрольных сердцах после 80-мин ишемии - в 2,7 раза.

Анализ тканевого содержания макроэ^гических фосфатов, демонстрировал некоторое отличие в содержании АТФ и АЛЫ. Так, если 60-мин тюмия диабетических сердец вызывала сгижениэ АТФ и АДН на

87* и 60%, то 80-мин итемия контрольных сердец - на 94* и 77*, соответственно, по сравнению с предапемическими значениями этих веществ. В обоих случаях наблюдался полный распад ФКр.

Таким образом, полученные результаты показывают, что, несмотря на одинаковую стегонь нарушения дыхательной функции митохондрий, у контрольных сердец послэ 80-мин ишемии, в отличия от диабетических после 60-мин ишемии, не наблюдается восстановление сократительной способности миокарда. По-видимому, несмотря на одинаковую стегвяь нарушений в митохондриях, характер и последовательность этих изкененка в дятрга-г группах отличаются друг от друга. Большую роль в постишкическои восстановлении сократительной функции сердца может играть стегонь изменения процента относительного ускорения дыхания митохондрия крэатином.

Несмотря на значительное уменьшение скорости дыхания митохондрий и тканевого содержания МО после 80-мин иаемия, данный вид ишемии не является полностью необратимым. Хотя рэперфузия с кардиоплзгичосгам раствором без добавления кардиопротекгоров не вызывала восстановление кехзническог функции сердца, однако изменение состава кзрдиоплэгического раствора и условий регорфузии приводило к восстановлонюо его сократительной способности. В первой серии зксгоргогантов мы проводили ро перфузию кардиоплзптсескк« раствором только в условиях гипотермии при 22°С. Такая решрфузия вызывала небольшое восстановление (7% от прэдисзмичэского уровня) работы сердца. Во второй серии зкспэришнтов в состав кардиоплзгического раствора были добавлены 2 новых кардкопротектора - 10 мМ ФКр и 15 мМ глутаминовая кислота (ГК). Репэрфузия сердец этим кардиошюгическим раствором при 37°0 приводила к восстановлению РС до 13%. Наибольшее восстановление механической Функции сердца ::: сле 80-мин ишемии наблюдалось в третьей серии экспериментов при одновременном применении гипотермии и кардиопротекгоров (ФКр и ГК). При этом восстановление РС достигало 29% от предшемического уровня.

Восстановлзниэ РС в различных условиях регорфузии коррелировалось восстановленном дыхательной функции митохондрий. Решрфузия сердец при 37°С с использованном кардиоплзгического раствора без добавления хардиопротзктороз вызьшала дальнейшее уменьшение скорости дыхания митохондрий. Гипотермия оказывала положительный эффоет на скорость дыхания, вызывая по сравнению с предыдущей группой небольшое увеличение скорости дыхания митохондрий. Использование ФКр и ГК в качество кардиспротекторов в

составе кардиоплегического раствора его больше увеличивало скорость поглощения кислорода. Однако, во всех этих трех грушах реперфузии скорость дыхания не достигала абсолютных значения, полученных посла ишемии. Другими словами, несмотря на восстановление сократимости сзрдца, реперфузия оказывала поврождзвдаэ действие на дыхател^нух фуикцию митохондрий в этих условиях. Как и в случае сократительной функции, максимальная скорость дыхания среди исследозанных репэрфузиокных групп наблюдалась при одновременном использовании гипотермии и кордиопротекгоров. При этом скорость поглощения кислорода во всех условиях измерения составила примерно 5555 от предиземического уровня данного показателя.

Реггарфузия вызывала в разног степени изменения также в содержании АДН и ФКр в зависимости от состаза и условия реперфузии. Так, при использовании кзрдиоплегического раствора без добавления кардиопротекторсв и нормотермии происходило дальнейшее уменьшение содержания АТС. При этсм в сердцах ФКр не был обнаружен и наблюдалось резкое снижение уровня общего креатина, что свидетельствует о вь^ссде этого метаболита в межклеточное пространство через поврежденную во время ропорфузии сарколемму. Уменьшение температуры кардиоплегического раствора дэ 22°С вызывало восстановление уровня AIS до ?г, а ФКр - до 44Д от соотввтствувЕИХ предшюмических значонм этих макроэргов. Добавленио ОКр и ГК в состав регорфузата при 37°С приводило к увеличении концентрации АТС и СКр дэ 11% и 53%, а при одновременном применении гипотермии í. кардиопротектороз - до 13% и 03%, соответственно. Параллельно восстановлению содержания АТС и СКр происходило увеличение уровня общего креатина в миокарда в соответствующих группах реперфузии.

На оснозании полученных розультатсв можно сделать заключение о том, что при ишемии контрольные „и диабетические сердца отличаются друт от друга по характеру и последовательности нарушения дыхательной функции митохондрии, о чем свидетельствуют дашко о постиаомическом восстановлении (или нэвосстановлонии) сократительной способности этих сердец при одинаковых значениях скорости дыхания митохондрий. Кроме того, восстановлонио сократительной функции сердца посл^ глубокой ииемии, в основном, определяется состоянием процесса окислительного фосфорилирования в митохондриях, а не стационарным содержанием АТС в миокарда и зависит от условии решрфузии и состава реюрфузата.

В Ы в О л к

1. Экспериментальный сахарный диабет (срок дивбэта I и 2 мое) вызывает достоверное снижение сократительной функции сердца, в частности, скорости сокращения <+cjp/dt> и расслабления (-dP/at), частоты сердечных сокращений и работы сердца, у животных (крыс и кроликов)!

2. Диабетические сердца животных переносят острую кардиоплэги-чоскуга ишемию (срок ишемии 40 мин) лучше (сердца кроликов) или одинаково (сердца крыс) с контрольными, о чем свидетельствуют физиологические параметры в период постишемичзского восстановления. Глубокая кардиошвгическая ишемия (срок клемии 60 мин) ока-зызает бглэо отрицательное влияние на сократительную функцию диабетических сордец, по сравнению с контрольными;

3. Сахарный диабет вызывает значительное уменьшение скорости дыхания митохондрий в сердш. Нарушение дыхательной функции не связано с механическим повреждением структурной целостности нигохондриаль-нса мембраны, о чем свидетельствует полное ингибирование максимально д скорости дыхания карбсксиатр-ктилазидом (КАХ) - специфическим ингибитором АГС-АДО транслокзом, участвущра а транспорто АТФ из матрикса митохондрий э цитсплязму;

4. Сахарный диабет вызывает нарутание транспорта АГФ в миокарде в результате значительного сникеккя процента относительного ускорения дыхания митохондрия креатином, а также обпэг активности и активности митохондриальноа и MB форм креэтгчфосфскиназы. Значительное снижение активности кроаткнфосфоганзгы наблюдается также в крови диабетических животных;

5. Острая ишемия и последующал регазрфузия не влияют на скорость дыхания митохондрия как в контрольных, так и в диабетических сердцах, и достоверная разница нэ>аду исследуемыми группами, наблюдаемая в предишемическом периоде, сохраняется после ишемии и ре-перфузии. В отличиэ от остроа, глубокая ишемия и последующая реперфузия увеличивают разность моэду скоростями дыхания митохондрий контрольных и диабетических сордец, вызывая сникэниэ духательнгя функции митохондрия в последних;

6. При одинаковых значениях скорости дыхания митохондрия после ишемии степоыь восстановления диабетических сордец выше, по сравнению с контрольными. Лучшая или одинаковая с контрольными горзиосимость ишемии диабетическими сердцами, по-видимому, связана

с включением адаптационной завиты организма, приобретенной в ходе развитая сахарного диабета;

7. Сахарный диабет вызывает снижение содержания АТФ в миокарда и не влияет на уровень фосфокреатина (ФКр). Содержание АТФ и ©Кр в диабетических сердцах после острой ишемии уменьшается в меньшей стегани и восстанавливается лучше, чем в контрольных сердцах. Б отличво от острой, восстановлание уровня АТФ и ©Кр в диабетических сердцах поело глубокой ишемии происходит хуже, чем в контрольных.

8. Сахарный диабет вызывает увеличение концентрации лизофосфогли-шридов, обладающих токсическими свойствами, в миокарде. В отличкэ от ишемии, диабет вызывает изменение абсолютного и относительного содержания фосфолипидов, увеличивая концентрация сфингомиелина и уменьшая - кардиолипина и фосфатидилзтзноламина. В диабетических сердцах наблюдается значительное увеличение (в 2 раза) соотношения холестерина к фосфолишщам, которое является показателем степени текучести плазматических мембран;

9. Как острая, так и глубокая гаомия вызываэт повышение содержания лизофосфоглшериаов в диабетических сердцах. Поело обоих видов ишемии и роперфузии сохраняется достоверная разница кзвд контрольными и диабетическими сердцами, наблюдаемая в продишекичоскоа группе по содержанию лизофосфоглидеридоз и основных классов фосфолипидов;

10. Экспериментальный сахарный даэбвт значительно снижает чувствительность сердца к внеклоточноа коншнтрации Са2+, о чем свидетельствует низкиэ по сравнению с контрольными значения скорости сокращения и расслабления, а также работа диабетических сердец при различных концентрациях (от 0,5 до 3,0 мМ) Са2* в составе горфу-злонного раствора. Это, по-видимому, является результатом кальциевой перегрузки^сократительных кардиокиоцитов сердца при сахарной диабете. Глубокая ишемия и рогорфузия вызывают дальнейшее снежонез чувствительности диабетических сердец к внеклеточному кальцию в большей степени, чем контрольных;

11. Такиа образом, уменьшение сократительной способности сорццэ при экспериментальном сахарном диабете обусловлено нарушениями но уроане осноаных кэтаболических звеньев клетки, в частности онер-гетического кетаболизма, кальциевого гомеостаза и структурной далостности клеточных мембран. Резистентность диабетических сердец к езэмии определяется продолжительностью и тяжестью последней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Джавадов с.А. Энергетически метаболизм миокарда при экспериментальном сахарном диабете, осложненном ииемноа - Препринт И Ol. 1992. 24 с.

2. Джавадов С.А., Преображонскиа А.Н.. Сакс В.А. Влияние фосфо-креатина на уровень лизофосфоглювридоэ при тотальной ишемии миокарда крысы// Би01имия.-1986.-1в 4.-С .660-674.

3. Септот Э.К., Калликорм А.П., джавадов С.А., Преобрзжэнскиа А. Н., Лакомкин В.Л., Сакс В.А. Энергетическая зависимость на-рушенка сократительной функции миокаода в условиях кальциевое перегрузки кардиомио1щ-ов//Кардиология .-1982-» 7.-С.72-78.

4. Джавадов С.А. Влияние сахарного диабета на фосфолипидныа сос-таз миокарда в норме и при каемии - Препринт s 03. 1992. 23 с.

5.• Гельфгзт Е.Б., Джавадов С.А. Энергетический метаболизм сердечно-сосудистой системы: экспериментальные и клинические исследования : Библиографический указатель (I97&-I985 гг).-Баку, 1888.-IIS с. .

6. Джавадов С. А., Кузнецов A.B., Векслэр В.К., Сарс.л в.Г., Сакс В.А. Изучение взаимосвязи менту энергетическим метаболизмом и постишемическим восстановлением сократительно* функции миокарда: физиологические.биохимические и ультраструктурные исслэдо-вания //Труды 4-02 Всесоюзное конфер. ''Ультрастртат. основы патологии органов и тканая".-Тбилиси, IS89.-C.97-88.

7. Дкавадов С.А., Оароз В.Г., Гордадзо Н.Г. Изучение рогор-фузионного повреждения сарколэкмыв.з модели изолированного сердца крысы// Труды 4-оа Зсвсоюзиоа конфер. "Ультраструкг. основы патологии органов и тканей".-Тбилиси, 1989.-с.98-100.

8. Анюховскиа Е.П., Джавадов С.А., Преобрашнскиа А.Н., Белошапко Г.Г., РозенЕТграух Л.В., Сакс В.А. Влияние фосфокреатина и фосфокреатинина на метаболизм мембранных фосфолипидов при острой илемии миокарда//Кардиология.-1985.-в 8.-а. 64-68.

9. Дхавадоз С.А., Гельфгзт Е.Б. Изучение молекулярных механизмов повреждения структурноа целостности миокарда в результате действия иземии и кзрдиомиопатии в эксперименте // Труды 1-оа Респуб. бкохкм. контрен. - 1990.-с .61-62.

10. Джавадов С.А., Джафароз Э.С., Дкохаридзе Т.З. Изучение корреляции между сохратигэльноя способностью и энергетическим обменом миокарда при экспэринэнтальЕгм диабете'// Труда 1-оа Респуб. биохим. конферен. - IS90.-0 .63.

11. Кузнецов A.B., Векслэр В.И., Дкавадов С.А., Шаров В.Г., Сакс В.А. О количественноа связи между ишемическим пораяюниэм сердца и параметрами энергетического метаболизма //Вестник АЧН I992.-W 3.-С.21-26.

12. Джавадов.и.А., Эйюбова A.A., Гельфгат Е.Б., Погача Г. Изменение уровня киокардиальных лизофосфоглицэридов при эксгоримен-тальноа аллоксан-вызванноя диабетическоа кардаомиопатии. // Аз-меджурнал,-1992.-я 6.-с.42-47.

13. Джавадов С.А., эшобова A.A. ' Сравнительное изучение фосфоли-пидного состава миокарда крыс при экспериментальное игамии и диабетической кзрдиомиопатии//Азмедаурнал.-1992.-п 7.-С.2>23.

14. Дкавадов С.А., Мамедова Л.К., Гельфгат Е.Б., Погача Г. Изучение взаимосвязи мозду физиологическими параметрами кзолиро-ванного сердца и основными параметрами липидаого обтока при

экспериментальном диабете //Азмедаурнал.-1992.-я 8.-C.7z<—79-

15. Дчавадов O.A. Исследование чувствительности диабетического сердца к изменению внеклеточной концентрации кальция - Препринт В 02. 1992. 22 с.

16. Лжззадов С.А.. Ддохаридзе 1.3.. Дкалиашвили И.В.. Гельфгат Е. Б.. Сакс В.А., Погача Г. Исследование энергетического метаболизма и сократительной функции сердца с диабетической хэпдио-миопатиеи: действие ипемии и репорфузии // Биохимия. -1992. -№ 12.

17. Дкавалов С.А., Дкохаридзе Т.З., Джалиасвили И.В., Сакс В.А., Погача Г. Ис&лэдозанио основных параметров энергетического метаболизма и механической работы сердца при экспериментальном диабете сопутствующем с даюмдоя // Катер. Ill симп. "Сизиол. и пзтофиз. сердца и коронзрн. кровообращения". -Киев. I9S2.-С.4G-48.

18. Дкавадов С.А.. Степанов 9.А.. Логача Г.. Сакс В.А. Изучение взаимосвязи между энергетическим метаболизмом и восстановлением сократительная функции сордцз после глубокой гаемш // Матер. Ill симп. "Сизиол. и патофиз. сердца и ксронарн. кровэоОрзаония" -Клев. 1992 .-о .205-208.

19. Anukhovsky Е.Р., Javadov S.A., F"rеоЫиhensky A.N., Beloshapko G.G., Rosenshtraukh U.V., Saks V.A. Effect of phosphocrca t i пн and related Compounds on the phospholipid metabolism o-f ischemic heart// Blochen. Med. and rietabol . Biol. -USA. - lVBb.-V. 35. N. 3,—P. 327-334.

20. Sales V.A. , Kuznctsov A.V., Javadov S.A., Kupriyanov V.V., Sharov V.G., Veksler V.l., Kapslko V.l. Contents of high energy phosphates and rates o-f mitochondrial oxidative reactions: significance for cardiac contractile -function // J. Hoi. Cell. Cardiol. - 1907.-V.19, Sappl. IV. - S60.

21. Баке V.A. , Kuzncttov A.v., Javadov S.A., Veksler V.l., Sharov V.G., Kupriyanov V.V. The relationship between mitochondrial oxidation and physiological parameters of rat heart during ischemia // Molec. Biol. Cardiovasc. System.—Boston, 1987.— f>. 60.

22. Saks V.A., Kapelko V.l., Kupriyanov V.V., Kuinetsov A.V., Lakomkin V.L., Veksler V.l., Sharov V.G., Javadov S.O., Seppet E.K., Kairane C. Quantitative evaluation of relationship between cardiac energy metabolism and postlschemic recovery of contractile function //J. Moll. Cell. Cardiol. - USA.' -1989.-V. 21. Suppl . 1 . ¿7—78.

23. Gelfgat E.B., Javadov S.A., Irani R.A. Dynamics o-f changes o-f tri gl yceri des and o-f some parameters of myocardlAl contractility in experimental diabetes // Abetr. o+ Intern. Symp. "Triglyceridesi the role in diabetes and atherosclerosiS*.— Vienn>, Austria. Ч990.-Р-14.

2-4. A.c. a 1428986. Способ определения повреждения сарколеммы клеток сердца / Авторы: Шаоов в.Г., Дяавадов С.А., Вихерт А. и.. Сакс вХ (СССР7.-ä 4079065.-УТВ.31.Со.87.

4UÜ.92 г. Тип. РУД*}, 553,

Информация о работе

Джавадов, Сабзали Абиль Оглы
доктора медицинских наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.04

Автореферат

Сократимость, энергетический метаболизм и фосфолипидный состав миокарда при экспериментальном сахарном диабете, осложненном ишемией - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы