Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биосинтез белка в печени кролика при экспериментальной ишемии миокарда

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биосинтез белка в печени кролика при экспериментальной ишемии миокарда"

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ЛИТОВСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

МАШАНАУСКАС ТАУРАС КАЗИМЕРОВИЧ

БИОСИНТЕЗ БЕЛКА В ПЕЧЕНИ КРОЛИКА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ МИОКАРДА

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени нандидата биологических наук

ВИЛЬНЮС -1990

Работа выполнена на кафедре биологической и биоорганической химии и в лаборатории патохимии ЦНИЛ Каунасской медицинской академии

Научный руководитель

член-корреспондент Литовской АН,доктор биологических наук, профессор А.К. ПРАШКЯВИЧЮС

Официальные оппоненты

член-корреспондент Литовской I доктор химических наук, профессор Б.А. ЮОДКА

доктор биологических наук А.А. ГИНЕЙТИС

Ведущая организация .- НИИ экспериментальной и

клинической медицины Ю Литовской республики

Защита состоится "Ш" ........ 1990 г. в ^

часоЕ на заседании специализированного совета'К 011.05.01 в Институте биохимии Литовской Академии наук (232021, г. Вильнюс, ул. Мэкслннинку, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библяотзхе Института биохимик Литовской АН.

Автореферат разослан ... Г/^. 1990 г.

-Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

30ШТЕ-Е>АЖЕНЕНЕ

.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Как известно, ишегдическая болезнь сердце и ее крайнее проявление - инфаркт миокарда приводит к значительным нарушениям 'клеточного ютаболизма как в сердечной мышце, так и в других органах, в том числа и в печени /Гузеева В.А., 1977; Кателышцкая Л.И. и др., 1983; Фетисова Т.В., 1978; Демуров Е.А. и др., 1985/. Однако особого внимания заслуживает нарушение белкового обмена, так как от этого процесса, в основном, зависит функциональное состояние не только органов, но и организма в целом. Печени принадлежит исключительная роль в белковом обмене, ,ак как в этом органе синтезируется белки не только для собственных потребностей клеток, но и ^ля других органов а тканей /Buttery Г..Т., Vernon B.G., I9ßOj Iber P.L., bathaa P.S.,1985/.

-В этом плане экспериментальная ишемия миокарда (ЭИМ) является удобной моделью для решения проблемы стабильности функционирования бе-локсинтезирующего аппарата клеток. Известно, что при ишемии миокарда изменяются структурно-функциональные свойства компонентов аппарата трансляции как миокарда, так и печени. Исследование первого этапа биосинтеза белка (образование ачиноацил-тРНК) показало, что в первые сут-■ ки ЭИМ снижается акцепторная активность тРНК печени кроликов по ря j аминокислот /Йрашявичюс А.К. и др., I982-; Родовк-.эо Г.А., 1984/. В это же время изменяется функциональная активность рибосом /Лекис A.B., 1985/ и ряда аминоацил-тНЖ-синтетаз как в экстрактях печени, так и в составе высокомолокулярннх комплексов /Иванов Л.Л-., 1985; Родсвячюо Г.А., 1984/. Однако до настоящего времени не установлены причинно-следственные связи нарушения биосинтеза'белка при данной патологии, не ясно, какой этап является определяющим и какие кашовенты аппарата трансляции в наибольшей степени ответственны за эти изменения.

Цель и задачу, исследования. На основании актуальности вышеизложенной проблемы целью настоящей работы явилось изучение бвлоксшпези-ругщей. активности аппарата трансляции клеток печени гри ЭИМ, а твкао изыскание возможностей повышения его устойчивости к Бездействию ше-мш1. В соответствии с целью исследования необходимо бзло решть сле-дувдие задачи:

1. Определить содержание общего белка и РНК во фракции гомоге-ната печени и уровень сиосянтеза белка в этом органе через ,|2 ч сосле, всспраазведония ЭИМ.

2. Изучит:, биосин-тез белка в бесклеточкых $елсксщтези|зующих системах при ЭИМ и факторы, влияющие на- его уровень.

3. Провести азторадиограф^ческий анализ продуктов трансляции эндогенных мРКК бесклеточных балокеинтазирующих систем

4. Проверить возмонность коррекция изменения функциональной активности трансляционного аппарата клеток печени при ЗИМ цутем профилактического щшиененяя биологически активного вещества.

Научная новизна работы. Впервые показано, что через 12' ч после воспроизведения 312,1 уровень биосинтеза белка в бесклеточной системе, при налички оптимальных концентраций компонентов, значительно увеличивается. Пойазано, что одним из основных факторов, ответственных за это увеличение, яв.1язотся ашноашл-тРНК-синтетазы (АРСазы). Впервые показано, что через 12 ч после воспроизведения ЗИМ происходит увеличена уровня включения радиоактивных аминокислот в белки с молекулярной массой около 30-35 кДа и 60-70 кДа, синтезируемые в бесклеточной системе»

Установлена принципиальная возможность направленной коррекции биосинтеза белка в печени при 3Ж. В профилактическом и лечебном отношении перспективным является использование биомассы культивируемых клеток полисциаса папортниколистного (Polyeciaa flltclfolia Bailey) препарата которого, обладая, антистрессовыми и адаптогенными свойствами, оказывают стабшшзцущее воздействие на активность компонентов бнлоксинтезирующей систеш при данной патологии.

Практическая ценность работы. Полученные результаты расширяют представление о причинах и механизмах, вызывающих нарушение биосинтеза бвлк.£ в печени при ЗИМ, что необходимо при создании фундаме"-' тальной тооретичесокй базы для целенаправленного поиска наиболее эффективных путей нормализации белкового обмена при данной патологии. Теоретичоские выводы работы о функционировании трансляционного аппарата клеток печени при ЭИМ включены в курс лекций по биохимии для студентов Каунасской медицинской академии.

Настоящая диссертационная работа выполнена в рамках заданий Зсесоюзной научно-технической программы 0.69.01 "Разработать эффективные метода и средства профилактики, диагностики и лечения основных заболеваний сердечно-сосудистой систеш" по теме 0I.0I.07H "Изу-. чить белоксинтезарующие, энергетические и иммунохимические особенности клеток печень и миокарда при гипоксичгоких состояниях органов" (№ гос. регистрации 01850002032).

Для решения поставленных задач в ходе экспериментальной работы был разработан метод изучения функционирования белоксинтезирующего • аппарата клеток печени in vitro - комбинированная бесклеточная белоксинтезирующая система из почьни кроликов (рац. предложение £ 483 ЮЛА). Предложенный мет^д применяется в лаборатории патохиыии ЩП1Л при Каунасской медицинской академии.

Апробация работы: Материалы диссертации докладывались: на научной конференции "Актуальные вопросы обмена веществ в организме человека и животных" /Вильнюс, 1987/; на республиканской научной конференции "Актуальные проблемы экспериментальной и клинической патологии" /Каунас, 1987/'; на научной конференция молодых ученых-медиков Латвийской ССР /Рига, 1988/; на 1-ой республиканской конференции молодых ученых-медиков ЛнтСИ3 /Каунас, 1988/; на 1У съезде биохимиков Литовской ССР /Вильнюс, 1988/.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Ооъем и структура диссертации. Диссертации- состоит из введения , обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы /254 названий/. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит II таблиц и 18 рисунков.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования: белоксинтезяругацая система аечени кроликов в норме, через 12 ч после воспроизведения ЭИМ, а также при применении до воспроизведения Э1СЛ препарата полисциаса.

Для экспериментов использовали кроликов-самцов массой 2,5-3,5 кг. Исследования проводили с препаратами 'АРСаз, тРНК, полирибосом и ами-ноацил-тРНК, выделенных из печени кроликов в норме /контроль/, через 12 ч после воспроизведения ЭИМ, а также из печени животных, которым перед операцией скармливали биомассу полисциаса. Указанный срок экспериментальной ишемии выбран на основании joro, что через 12 ч после воспроизведения ЭИМ в печени кроликов отмечены наиболее выраженные изменения как уровня я скорости биосинтеза белка /Лекис A.B., 1986/, так функциональной активности отдельных компонентов аппарата трансляции /Родовичюс'Г.А., 1984; Иванов Л.Л., 1985; Мартинкус 3. П., 1989/. '

Острую ишемию миокарда воспроизводили наложением-лигатуры на переднюю нисходящую ветвь левой венечной артерии сердца кролика но методу Косицкого Г.И. /¿963/ с модификацией Вяткуса A.C. /1968/.

Препараты тРНК и? печени кроликов выделяли, используя принцип метода Brungrabor E.F. /1962/, основанного на денатурации белков экстракта ткани фенолом с последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлю-лозе.. Препараты суммарных тРНК деацилирозали по методу Choo A*H. et al. /1977/ и дополнительно очищали гельтхроматографпей на сефадексе G—100.

, Суммарные препараты полирибосом выделяли по методике Wettsteln P.D. et al. /1363/. Препараты суммарных аминоацил-тРНК-синтетаз получали хроматографией на ДЗАЗ-целлклозо постриб.осомной надосадочной жидкости по методу Keller Е.В., Zameonlk Р.с. /1956/. Количественное определение нуклеиновых кислот проводили по методу Schaldt G., Thanhauser G. /1945/.

Содержание адениновых ну;слеотидов определяли в экстрактах печени, приготовленных по методу Williamson J.R., Corney В.Е. /1969/. Разделение пукле отидоэ проводили с помощью жидкостного хроматографа высокого давления "Мшшихром" на колонке со сорбентом DEAE-Si Poly-ol ("Serva").

Активность неоргашческой пирофосфатазы определяли по приросту неорганического фосфата, который измеряли по методу Flake с.н., Sübbarow J. /1925/.

Концентрацию белка определяли по методу Lowry 0. et al. /1951/ ЕЛИ Warburg О., Christian W. /19«/.

Смеоь ашноацил-тРНК, в составе которых находилась С-лейцил- ■ тРНК, выделяли по методу Hellthaler G., Rotzsch (i. /1979/.

Определение уровня включения радиоактивных аминокислот in vivo в белки печени проводили путем введения животным внутрибрюшинно смесь 14С-аминоккслот в объеме 20 мл из расчета 59,2 МБк/кг. Через 20 мин извлекали печень и гомогенизировали в 3 объемах 50 трис-HCI буфера (рН 7,5), содержащего: 5 м!<1 MgClg , 25 мМ КцС1 , 0,25 М сахарозу и 500 мкг/мл гепарина. Гомогенаг центрифугировали для получения постмитохондриального и пострибосомального супернатантов. Общую радиоактивность в обоих видах супернатантов определяли путем нанесения 25 мкл на нитроцеллюлозные фильтры "Synpor ЫЗ" (ЧССР). Радиоактивность измеряли на свднтилляционном/счетчике "Delta 300" (Голландия). Эффективность счета - 60$. Для определения суммарного содержания ^С-аминокиочот в белках и аминоацил-тРНК 25 мкл супернатанта осаждали 1С$-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ), осадок переносили на нитроцеллтаозшю фильтры л промывали '5^-ной ТХУ. Определение уровня включения радиоактивных аминокислот в белки печени проводили путем инкубации при 37°С постмитохондриального а пострибосомного супернатантов с 0,1 М КСН (для гидролиза аминоацил-тРНК).в течение 20 мин с последуищш осаждением 10^-ной. ТХГ и перенесением полученных осадков на нитроцедлшозные фильтры, которые промывали 5^-ной ТХУ.

Активность АРСаз в суммарном препарате фермента определяли по начатьной скорости реакции аминоацилирования тРНК при насыщающих концентрациях субстратов. Реакционная смесь в объеме 0,25 мл содер-

кала: 100 i.í.l трис-HCI (pH 7,5), 2 i.í.i ATP, 10 мМ MgCl2 , 10 uM KCl, 50 мкг АРСаз, 150 мкг тРНК и 2 мкл гидролкзата 14С-белка хлореллы. Время инкубации - 3 мин при 25°С. Реакцию останавливали добавлением Годной ТХУ. Осадки переносили да нитроцеллшозные фильтры и определяли радиоактивность.'

Инкубационная смесь бесклеточной белоксинтезирующей с. зтомы в объеме 200 мнл содержала: 50 ыМ трис-HCI (pH 7,6), 5 мМ MgClg , 30 мМ KCl, I мМ ДТГ, 0,5 мМ АТР, 0,2 мМ (ЖР , 10 мМ креатинфосфат, [ мкг креатинфосфокиназы, 0,05 мМ каждую из нерадиоактив!шх аминокис-ют (исключая лейцин), 0,05 мГ.1 ^С-лейцин, 10 мкг суммарной тРНК, 200 мкг гэлирибосом и 125 мкг препаратов суммарные ЛРСаз. Об уровне 5иоскнтеза белка в бесклеточной системе судили по включению ^С-лей-щна в продукт трансляции эндогенных мРПК после инкубации проб при 57°С в течение 30 глин. Реакцию останавливали добавлением 0,1 М КОН ipoúH инкубйровали 20 мин для гидролиза аминоацил-тРНГ и осаждали :0^-ной ТХУ. Осадок переносили на нитроцеллшозные фильтры, промыва-си и определяли радиоактивность. Изучение уровня басклеточного синте-ia белка в присутствии ^4С-лейцил-тРНК проводили в стандартной систе-¡э, в которую вместо аминокислот и тРНК вносили 300 мкг препаратов ¡миноацил-тРНК, содержащих ^^С-лейцил-тРНК.

Время синтеза средней полипептидной цепи определяли по методу айтина В.П., Лермана М.И. /1977/. -г

Электрофорез в пошакриламидном геле,.в.присутствии додецилсуль-ата натрия, проводили по меФоду ЬаештИ U.K. /1970/. Для удаления олйрибосом при подготовке образцов для электрофореза, реакционную месь ультрацентрифугировали в течение I ч при 105 ООО х g . Авто-адиографический анализ продуктов трансляции а бесклеточной белоксин-азиругащей системе проводили по методика Клеменс М. /1987/. ■ . .

Достоверность результатов оценивали по t -тесту Стьадента Яакин Г.Ф., J980/.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ • ■

Изучение уровня биосинтеза белка в печени кролика три 12 ч ЗИМ

В табл. I представлены результаты исследования содержания бел-)в во фракциях печетш контрольных, оперяровашшх, а такяе получаз-IX до воспроизведения ЭИМ препаратов полясциаса кроликов. Получен-ie данные свидетельствуют о том, что через 12 ч после воспроизведе-ш ЭШ в постмитохоццркалыгслг супзрнатанте гс:.;огсната печени крат;:-

Содержание белков (в мг на I мг ДНК) в постмитоховд-риадьйсм и пострибосомном супернатантах гомогената печени кроликов / м i mj в а 6 - 8 /

Исследуемая Контроль 12 Ч ЭИМ 12 ч ЭИМ

фракция + полисциас

Постоитохондриальный •

супернатант 4,8*0,3 3,4-0,2 3,9*0,3х

Пострибосомный

супернатант 3,0*0,3 2,6*0,3* 2,8*0,2*

Примечание: м - Изменения статистически недостоверные

ков содержание белков снижается на 29% по сравнению с контролем. В этот же срок ЭИМ содержание белка в аналогичной фракции печени кроликов, которые перед операцией получали биомассу полисциаса, снижается статистически недостоверно. В пострибосомной фракщ.^ гомогеьлта печени всех исследуемых групп животных содержание растворимых белков практически одинаково. Таким образом, можно предположить, что наблюдаемые изменения в содержании белка в постмитохондриальной фракции гомогената печени реализуется за счет белков, осаждаемых центрифугировавшем при 105 ООО х g . Не исключено, что такими белками являются рибосом-Htíe белки. В таком случае через 12 ч после воспроизведения ЭИМ в печени кроликов, по-видимому, снижается содержание рибосом, что согласуется с нашими данными. Так, из табл. 2 следует, что количество суммарной РНК, основную долю которой составляют рибосомные РНК (рРНК) /Гайцхоки B.C., 1980/, в печени контрольных кроликов значительно выше, чем в печечи оперированных животных. Применение'биомассы полисциаса приводит к частичному восстановлению содержания РНК цри ЭИМ. Таким образом, полученные данные могу? свидетельствовать о снижении содержания рибосом в -печени кроликов после воспроизведения ЭИМ, что должно отразиться и на уровне биосинтеза белка в этом органе.

Результаты исследования этого показателя в печени кроликов представлены в табл. 3. Судя по этим данным, через 12 -ч после воспролз-веденяя ЭИМ уровень включения *4С-ешноки~лот в -белки постмитохочд-риальпого и пострибосомного супернатантов гомогената печени кроликов снижается на 62% и 49% соответственно. В то же время предварительное

введение кроликам перед операцией биомассы полисциаса стабилизирует

Отношение урЬвней РНК и ДНК во фракциях гомогената • печени кроликов /м4в|па5-6/

Исследуемая фракция

Контроль

12 ч ЭИМ

12 ч ЭИМ + полисциас

ПОСТГЛИТОХОНДрИаЛ! Л£Й

супернатант 0,85*0,01 Пострибосомный

супернатант 0,15*0,01 Рибосомный

осадок 0,70*0,01

0,59*0,04 0,73*0,02

0,20*0,02 0,12*0,01й 0,39*0,05 0,61*0,02

Таблица 3

Распределение -аминокислот (в имп/мин на I мг ДНК) во фракциях печени кроликов п н б - 8 / ■

Показателе

Контроль

12 ч ЗИЛ

12 ч ЭИМ + полисциас

Постмитохондриальнай супернатаж

Общая радиоактивность 7900*783 3967*506 Радиоактивность

белков 3912* 78 1477* -73

Радиоактивность

аминоацил-тРНК • 218* 79 413* 67

Пострибосомный супернатант

Общая радиоактивиость 4515*644 2202*333 Радиоактивность

белков 3803* 71 1941*141 Радпооктяззбсть

ашноацил-тРНК 149* 32 328* 41'

О910*738-£ 3534*133® 210* 77зе

3!!41*27331 Зч'78*10-1Й 135* 35

Прикзчаяиз: - Изменения статистически недостоверна

включение мэчепкх предшественников в белки печени, котороо пр «ткчес-ки не отличаете от контрольного значения. Следует отме'.л:ть, -гго через 12 ч после воспроизведется РИМ общая радиоактивность поспшто-

ховдриалыюй фракции печени ниже таковой в норме и при щедвзрительном скармливании кроликам биомассы полисдааса. Этот факт мажет быть связан со снижением при ЗИМ доставки белковых предшественников в клетки печени вследствие нарушения проницаемости клеточных мембран либо кровообращения, что имеет место при данной патологии /Лещинский Л.А. и др., 1976/. Снижение включения радиоактивных аминокислот в синтезируемые белки можно объяснить и изменением их содержания в цитозоле печени. Однако раннее в экспериментах In vivo показано, что в печени при ЭШ увеличивается время синтеза "средней" полипептидной цепи /Лекис A.B., 1986/. Таким образом можно предположить, что при инфаркте миокарда в клетках печени снижается интенсивность трансляции, что, возможг^, является одной из причин изменения биосинтеза белка.

Возникает вопрос, какие компоненты белоксинтезируюцего аппарата клеток печени в первую очередь ответственны за нарушение белоксинте-зирулцих процессов при ЗИМ, а также, на какие компоненты оказывает стабилизирующее влияю"* препарат подисциаса? Для решена^ поставленной задачи нами была разработана бесклеточная белоксинтезиругацая система из печени ;роликов, которая, в определенной мере, позволяет оценить вклад отдельных функциональных единиц трансляционного аппарата в процесс биосинтеза белка.

Об уровне биосинтеза белка в такой системе судили по включению ^С~лейиина в продукт трансляции эндогенных мРНК. .Результаты изучения этого показателя в гомологичных бесклеточных системах (табл. 4) свидетельствуют о том, что через 12 ч после воспроизведения ЗИМ уровень биосинтеза белка увеличивается на 80$ по сравнению с контролем. В то же время в системе, полученной из печени кроликов, которым перед воспроизведением ЭШ скармливали биомассу ползсциаса, этот показатель остается на контрольном уровне. Следует подчеркнуть, что в системе, полученной из печени контрольных животных, которым в течение двух дней скармливали биомассу полисциаса, уровень биосинтеза белка не отличается от контрольных значений.

Таблица 4

Уровень включения ^С-лейцина в продукт трансляции в гомологичной бесклеточной белоксянтезирупцей сис-. теме из печени кроликов

/ пмоль/мг рРНК/мин; М ¿ mj п ■ 9 - 18 /

Контроль JLÜ ч УШ i'¿ ч УШ + пслисциас

133,3 ± 8,3 241,4 ± 12,5 140,2 ± 8,7*

Примечание: - Изменения статистически недостоверные

Таким образом, из сопоставления экспериментальных данных по изучению уровня биосинтеза белка in vivo и in vitro (^абл. 3 и 4) видно, что направленность изменения уровня биосинтеза белка через 12 ч после воспроизведения ЭИМ различна. На основании этих данных можно сделать вывод, что через 12 ч после воспроизведения ЭИМ трансляционный аппарат печени кроликов не только не теряет своей эффективности, а в значительной мере активируется. Однако установленное in vitro увеличение синтеза белка при ЭИМ наблвдалось при оптимальных условиях функционирования трансляционного аппарата.

Таким образом, были все основания предположить, что снижение уровня биосинтеза белка в клетках печени через 12 ч после воспроизведения Э>И связано с недостатком в клетках какого-нибудь компонента трансляционного аппарата. В первую очередь было обращено внимание на энергетическое обеспечение селокскнтезирутацей системы - АТР и GTP. На это указывали данные литературы, где отмечается, что при инфаркте миокарда нарушается энергетический обмен как в сердце, так и в печени /Демуров Е.А., Игнатова В.А., 1985; Гузеева В.А., 1977; Мешалкин E.H. и др., 1977/. Показано, что состояние аденилатной системы, главным образом, характеризует энергетическое обеспечение трансляционного аппарата клеток, в том числе этап.инициации Дгарова Н.Ю., 1976; Hunt Т., 1980; Walton G.M., Gill C.N., 1976/. Поэтому, в дальнейшем, для выяснения энергетического статуса клеток печени при ЭИМ, а также для определения возможных механизмов действия биомассы полисциаса при данной патологи!, было определено содержание адениновых нуклеоти-дов в печени кроликов.

Содержание адениновых нтклеотидов в

экстрактах печени при ЭИМ

В табл. 5 приведены результаты определения уровня АТР, АКР и AMP в печени кроликов в норме, через 12 ч после воспроизведения ЭИМ, а также при скаршшваяии кроликам перед операцией биомассы полисциаса. Полученные данные свидетельствуют о. том, что уже через 12 ч после воспроизведения ЭИМ в печени кроликов снижается содержание АТР на 35%. Одновременно наблюдается тенденция увеличения содержания в печени продуктов распада АТР, т.е. A DP и AMP, хотя содержание последнего увеличивается статистически недостоверно. Кроме того, при ЭИМ в печени кроликов'достоверно снижается суммарное содержание АТР, ADP и AMP, а также соотношение . ATP/ADP . С другой стороны, исследуемые показатели содержания адениновых нуклеотидов в печени кроликов, которым до воспроизведения Э1",1 скармливала биомассу полисциа-

са, практически не отличаются от контрольных значений. к

Таблица 5

Уровень ATP, A DP л AMP в печени кроликов / в мкыолях на I г печени; М t mj а а 10 - 13 /

Показатель Контроль . 12 ч ЭИМ 12 ч ЭШ

+ полнсциас

АТР 2,17*0,08 1,41*0,05 2,14*0,05s

АПР 0,68*0,05 0,83*0,03 0,63*0,04е

AMP • . 0,26*0,04 0,37*0,05й 0,14*0,09й

А!ЕР+АЕР4АЫ? 3,11*0,11 , 2,62*0,07 2,90*0,09й

АТР/АЕР 3,44*0,27 1,77*0,15 3,50*0,18й

АТР * | АПР 0,81*0,01 0,70*0,02 0,84*0,01й

Примечание; й - Изменения статистически недостоверные

' Следует отметить, что корреляция между язменониэм энергетичаско-го статуса клеток и синтезом белка показана для разных клеток, в тш числе л для.клеток печени /Ednaxda К. ot al., 1979 /. Сравнительно изболите изменения энергетического 'заряда адениновых я iy аил нов их нуклеотидов сильно влияпт на скорость и уровень белкового синтеза. Из табл. 5 видно, что чэрез 12 ч после воспроизведения ЗИМ в печени кроликов энергетический заряд адениновых нуклеотздов существенно снижается. В то ке время в печени кроликов, которые до операцгш падали биомассу полисциаса, этот показатель полностью восстанавливается и даже незначительно, но статистически достоверно, увеличивается. Можно предположить, что при данной патологии имеет место истощение аденилатной системы, в результате чего нарушается энергетическое обеспеченно клеток печени в целом.

Таким образом, одной из причин установленного раннее Ia vivo снижения уровня биосинтеза белка при ЭИМ (табл. 3), по-видимому, является нарушение энергетического обмена клеток печени, в том числе и снижение уровня АТР. В то же время профилактическое применение животным биомассы полиициаса, предотвращает деградации АТР и, тем самым, создает условия для поддержания биосинтеза белка на нормальном

уровне.

Если наблюдаемое нарушение биосинтеза бежа при ЗИМ in vivo можно объяснить снижением энергетического обеспечения клеток печени, то установленное изменение уровня биосинтеза белка in vitro невозможно объяснить этим фактором, так как бесклеточная белоксинтезирующая система в подпой т ¡о обеспочиваотся энерге тичосккми ресурс шли* В связи с этим, последующие экспериментальные исследования были направлены на изучение функциональной активности как самого аппарата трансляции, так и отдельных его компонентов при ЭИМ.

Изучение функциональной активности компонентов • белоксинтезируищого аппарата клеток песета при

ш

В плане проверю! полученных экспериментальных данных, был изучен кинетический параметр, характеризующий процесс транс яции - время синтеза "средней" полипептидной цепи ( t ) /Лейтин В.Л., Лэрман М.И., 1977/. Проведенные'исследования показали, что t в системе бесклеточного синтеза бежа через 12 ч после воспроизведения ЯШ статистически достоверно снижается (контроль - 2,72 - 0,11 мин; 12 ч ЭИМ -2,10 - 0,08; п я II ). В то se время в системе, полученной из печени кроликов, которые перед воспроизведением ЭИМ подвергались воздействию биомассы полисциаса, этот показатель Уменьшается статистически недостоверно (2,34 - 0,15 мин). Полученные данные согласуются с результатами изучешш уровня биосинтеза бежа в гомологичных бесклеточных системах (табл. 4) и подтверждают тот факт, что при оптимальных условиях функционирования трансляционный аппарат печени кроликов при ЭИМ не теряет своей эффективности. С другой стороны, аппарат биосинтеза белка печени кроликов, получавших перед операцией препарат полисциаса, характеризуется достаточно высокой стабильностью.

Для более детального изучешш белоксиитезирующей способности клеток печенй при ЭИМ были использованы гетерологкческие бесклеточные системы. Нами установлено, что внесение в бесклеточпую систему из печени контрольных кроликов препаратов полирибосом, выделенных из печени экспериментальных животных, не оказывало влияния на уровень биосинтеза белка. Такая не ситуация наблюдалась и при изучении влияни,.. тРНК. Внесение же в систему бесклеточного синтеза белка, полученную из печени контрольных кроликов, .либо из печени кроликов, получавших перед операцией препарат полисциаса^ суммарных препаратов АРСаз, выделенных из печени через 12 ч после воспроизведешь ЭИМ, значительно

увеличивало уровень биосинтеза белка (табл. 6).

Таблица 6

Уровень включения 14С-лейцина в продукт трансляции в бесклеточной белоксинтезирующей системе из печени кролика

/ пмоль/мг рибосомной РНК/мин;

Источник вцделения АРСаз Источник вцделения тРНК и полирибосом

Контроль 12 Ч ЗИМ 12 ч ЗИМ . + полисциас

Контроль 133,3* 8,3 139,7* 9,5 149,9* 8,5

12 ч ЗИМ 255,1*12,9 241,4*12,5 ; 217,2* 8,1

12 ч ЗИМ + полисциас 167,4*11,6 129,9* 7,8 140,2* 8,7

С другой стороны, добавление суммарных препаратов АРСаз печени как контрольных кроликов, так и получавших до операции препарат по-лисциаса, в систему из печени кроликов, которым воспроизводили ЗИМ, снижало биосинтез белка практически до контрольного уровня. Полученные результаты позволили предположить, что увеличение уровня биосинтеза белка, установленное в гомологичной' системе, полученной из печени кроликов через 12 ч после воспроизведения ЗИМ, связано с повышением активности соответствующих АРСаз.

Для проверки этого предположения было проведено сравнительное изучение активности суммарных препаратов АРСаз печени всех исследуемых групп животных в реакции аминоацилирования тРНК с гидролизатом ■^С-белков хлореллы/Полученные данные (табл. 7) свидетельствуют о том, что через 12 ч после воспроизведения ЗИМ активность АРСаз почти в два раза превышает контрольное значение, а также активность ферментов, вэделешшх из печени кроликов, получавших до воспроизведения К"«! биомассу полисциаса. С другой стороны, активность суммарных пре- ■ штатов АРСаз, Евделенных из печени контрольных кроликов, которые подвергались воздействию биомассы полисциаса, не отличалось от контрольного значения.

Следует отметить, что установленное увеличение активности АРСаз пра ЗИМ согласуется с данными других авторов, изучавших активность этих ферментов в миокарде и печени при пеою:к миокарда /.'.'аргпнкус З.П., 1989; Тамулявичюс А.-А.Й., 1985; Родовичюс Г.А., 1954/.

Аминоацил-тРНК-синтетазная активность в суммарном препарате фермента печени кроликов в реакции амино-' ацилирования ТРНК ^С-аминокислотами гидролизата белка хлореллы / м ~ т| п = 8 - 10 /•

Активность (имп. на 50 мкг белка за I мин

Контроль Контроль 12 ч ЭИМ 12 ч ЭИМ

+ полисциас + полисциас

11128 ± 860 ■ 11803 ± 1178х 22265 ± 2209 12918 ± 1658я

Примечание: * - Изменения статистически недостоверные

Таким образом,наблюдаемое при ЭИМ увеличение активности АРСаз в суммарном препарате фермента (табл. 7) связано либо со стимуляцией их синтеза и увеличением содержания, либо с активацией ферментов под влиянием цитоплазмам веских факторов.

Одним из таких факторов может быть неорганическая пирофосфатаза (КФ 3.6.1.1), которая стимулирует образование аминоацил-тРНК, расщепляя неорганический пирофосфат, образующийся в ходе реакции активации аминокислот. Возможность регулящи такого рода была показана для высокомолекулярных комплексов АРСаз из миокарда свиньи, а также из печени кроликов в норме и при экспериментальной ишемии /Иванов Л.Л., 1985; Тамулявичюс А.-А.й., 1985/. Поэтому можно предположить, что изменение активности этого фермента, присутствующего в суммарных препаратах АРС-* аз, может быть одной из причин обнаруженного изменения их. активности при данной патологии. Полученные данные (табл. 8) подтвервдают это предположение.

Таблица 8

Пирофосфатазная активность препаратов суммарных АРСаз печени кроликов /Ы&т|Оя5»6/

Активность, (нмсхль р^ на I мг белка за I мин)

Контроль . . Контроль 12 ч ЭИМ 12 ч ЭИМ

+ полисциас + полисциас

20,2 ± 1,0 13,1 ± 0,9 53,2 ± 2,2 29,4 ± 0,6

Результаты свидетельствуют.о резком увеличении при ЭШ пирофосфа-тазной активности. В то же время активность неорганической пирофосфата-зы в суммарных препаратах АРСаз, полученных из печени кроликов, которые перед операцией подвергались воздействию биомассы полисциаса, снижается, хотя контрольного значения не достигает. Следует отметить, что этот показатель для препаратов АРСаз, полученных из печени "контрольных кроликов, которым скармливали биомассу полисциаса, статистически достоверно снижается. Это явление остается не выяснено и требует дальнейших исследований.

Для окончательного решения вопроса о влиянии АРСаз на уровень биосинтеза бе.г'-а, нами была разработана бесклеточная белоксинтезпрующая система, в состав которой вместо аминокислот и тРНК вносили смесь ами-ноацил-тРНК, в составе которой содержалось *4С-^яейцил-тРНК. В такой системе исключается протекание первого этапа трансляции (образование аминоацил-тРНК), в котором ключевую роль играют АРСазы, а происходит непосредственный процесс синтеза бежа на рибосомах. Экспериментальные данные показали, что во всех исследуемых гомологичных бесклеточшх системах при наличии оптимальных количеств предшественников в випе амино-ацил-тРНК, уровень биосинтеза белка не изменяется. Исходя из представленных результатов можно предположить, что одним из основных факторов, ответственных за изменение уровня биосинтеза балка в печени при ЭИМ яв-лягтся АРСазы. Обращает на себя внимание то,, что скармливание кроликам перед воспроизведением ЭШ препарата полисциаса, препятствует изменению функциональной активности АРСаз и, тем самым, изменению уровня биосинтеза бежа. С другой стороны, есть все основания предположить, что изменение при ЭИМ функциональной активности АРСаз может отразиться не .только на уровень биосинтеза белка в клетках печени, но и оказывать влияние на спектр синтезируемых цитоплазматических белков. Поэтому дальнейшие исследования были направлены на изучение продуктов траясляцаи в бесклеточных б^локсинтезируьдих системах из печени кроликов.

Электрофоретический анализ продуктов трансляции в бесклеточной белоксинтезирующей системе в денатури-руюшх условиях с последующей авторадиографией , -

Нами было проведено электрофоретическое разделение белков, содержащихся в бесклеточных белоксинтезирующих -истемах, подученных из печени кроликов в норме, через 12 ч после воспроизведешь ЭИМ, а также кз печени животных, которые перед воспроизведением ЭИМ, подвергались . воздействию биомассы полисциаса. Для выявления продуктов трансляции эндогенных мРНК был приманен метод авторадиографил полученных гелей.

Рис. Авторадиография электрофорёррам-мы радиоактив1шх белков, синтезируемых в фракционир ванной бесклеточной белоксинтезирующей системе из печени кролика в норме (I), через 12 ч ЗИМ (2) и при 12 ч ЗИМ + полисциас (3). Стрелками обозначены маркерные белки: миоглобин (18 кДа), химотрипсиноген (25 кДа), овальбумия (43 кДа) и бы-,чий сьшороточный альбумин (67 кДа).

ШтХ-глйг,':.

•о?;-:'..

Анализ авторадиогэамм показал (рис.), что при данной патологии происходит некоторое перераспределение в спектре синтезируемых белков. Наиболее выраженные изменения наблюдаются в зонах с молекулярной массой 60 -.70 кДа И 30 - 35 кДа. Важно подчеркнуть; что в зоне с молекулярной массой 60 - 70 кДа при ЭШ. отмечается более интенсивное включение радиоактивной мотки в синтезируемые белки по сравнению с контролем, а тагам по сравнению с белкам этой же зоны, синтезированными в системе, полученной из печени кроликов, которые перед операцией подвергались воздействию биомассы полисциаса. Можно предположить, что под действием этого препарате, происходит относительное снижение уровня включения радаоак-тивнкх аминокислот в синтезируемые белки этой зоны. С другой стороны, в зоне о молекулярной массой 30 - 35 кДа наблюдается более интенсивное включение радиоактивных аминокислот в синтезируемые белки з системах, полученных как из печели кроликов через 12 ч после всейроиаведенля ЗИМ, так и из печена 01.ерировакных кроликов, предварительно получавших указанный препарат.

В то же время, следует отметить, что причины качезтвеняого изменения синтезируемых белков в печени кроликов при ишемии миокарда (12 %

ЗИМ) остаются яе выяснеными. Ими ммут быть: изменение спектра транслируемых мРЩ/ ВагтюШ-гаггега 1., 1969 / > перераспределение при ЭИМ рибосомного материала между классами свободных и мембраносвязэнных рябо-сом/Леклс А. В., 1986/ и другие. Однако эти вопросы окончательно не изучены и требуют дальнейшего экспериментального исследования.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено снижение включения радиоактивных аминокислот в белки постмитохолдриального и пострибосомного супернатантов гоыогената печени кроликов на 62£ и 49£ соответственно через' 12 ч после воспроизведения ЭИМ.

2. Одной из причин снижения уровня биосинтеза белка в печени при ЭИМ мажет быть уменьшение содержания АТР и увеличение продуктов его распада -дцр и АМР.

• 3. В гомологичной бесклеточной белоксинтезирунцей системе, выделенной из печени кроликов через 12 ч после воспроизведения ЭШ, установлено уве' личеаие уровня биосинтеза белка на 8С$ по сравнению с контролем, при этом отмечено уменьшение времени синтеза "средней" полипептидной цепи, что монет свидетельствовать об активации белоксинтезирукщего аппарата печени.

4. Использование гетерологических бесклеточных белоксинтезирующих систем из печени кроликов позволило установить, что одним из компонентов, о.зетственным за увеличение уровня бесклеточного синтеза белка при ЭИМ, являются АГСазы, о чем свидетельствуют также данные об увеличении их активности в реакции аминоацилирования тРНК при данной патологии.

5. Одной из причин увеличения активности АРСаз в составе суммарных препаратов при ЭИМ может быть одновременное увеличение активности диро-фосфатазы, расщепляющей пирофосфат - ингибитор реакции аминоацилирования.

6. Авторадиографический анализ продуктов трансляции бесклеточных белоксинтезирующих систем показал, что через 12ч после воспроизведения ЭИМ происходит увеличение уровня включения радиоактивных аминокислот в синтезируемые белки с молекулярной массой около 30-35 кДа и 60-70 кДа.

7. Установлено, что применение перед воспроизведением ЭИМ биомассы полисциаса стабилизирует уровень биосинтеза белка, состояние аденилат-ной системы и активность АРСаз при данной патологии.

Список рабрт.'опубликовадрос по теме диссертации '

I. Машанаускас.Т., Лекис А., Иванов Л., Лукошявичюс Л. Стимулирование биосинтеза.балка в печена кроликов биомассой культивируемых клеток Ро1уос1ао £111с1£о11а ВцЦоу // Актуальные вопросы обмена

веществ в организма человека и животных: Тез. докл. науч. конф. - Вильнюс, 1987. - С. 142-143.

2. Лекис А., Лукошявичюс Л., Машанаускас Т. Влияние экспериментального инфаркуа миокарда на активность белоксинтезирующого аппарата печени// Актуальные проблем экспериментальной и клинической патологии: Тез. докл. респ. науч. конф. - Каунас, 1987. - С. 40-42.

3. Мозурайти* Р., Лекис А., Машанауокас Т. Изучение уровня и скорости биосинтеза бежа в печени кролшсов в норме и при экспериментальной ишемии миокарда// Тез. докл. Объед. науч. конф. молодых ученых-медиков ЛатССР и стдектов Рижского медицинского института, посвящ. 70-летию ВЛКСМ. - Рига: МЗ ЛатССР, 1988. - T. I., ч. 2. -С. 53.

4. Машанаускас Т., Лекис А., Мозурайтис Р., Родовичюс Г. Изучение уровня биосинтеза белка в бесклеточкой система-из печени кроликов при экспериментальном шфаркте миокарда// Достижения биохимии в Литовской ССР: Тез. стендовых сообщ. 1У съезда биохкм. ЛитССР. -Вильнюс, 1988. - С. 108-109.

5. Машанаускас Т., Лекис А., Мозурайтис Р., Родовичюс Г. Изучение функпяональной активности компонентов аппарата трансляции печени кроликов при экспериментальной ишемии миокарда// Сб. науч. тр. 1-ой респ. конф. молодых ученых-медиков ЛитССР. - 1^аунас, 1988. -Ч. I. - С. 60-63.

6. Масколюнас Р., Лукошявичюс Л., Лекис А., Машанаускас Т., Мозурайтис Р. Изучение синтеза белка в бесклеточных белоксинтезиру-пцих системах из миокарда и печени кроликов при ишемии миокарда// Биохимия и морфология тканей сердца и других органов в условиях гипоксии: Сб. науч. тр./Йод ред. А.Прашкявичюса.-'- Вильнюс, 1988. -С. 108-114.

7. Лекис A.B., Машанаускас Т.К., Иванов JUL, Кунах В.А., Коваленко М.И., Лукошявичюс Л.Ю., Прашкявичюс А.К., Епьскат A.B. Еяпянзо культивируемых клеток полисциаса на биосинтез белка -в печени 1фоли-коа// Хим.-фармац. журн. .- 1988. - Т. 22, Js 8, - С. 970-973.

В. Машанаускас Т.К., Лекис A.B., Мозурайтис Р.Ю. Влияние культивируемых клеток полисциаса на состояние трансляционного аппарата почонп при ишемии мзо^арда// Сб. науч. тр. молодых учеша-медаков ЛатССР. - Еильшгс, 1989. - Вып. 2. - С. 16-19.

9. Машанаускас Т.К., Лекис A.B., Иванов Л.Л., Кунах В.А.. Дяея П.П., Багдонайте Д.А. Влияние биомассы культивируемых клеток колис-циаса на уровень АТР, Щ£ и AM? в печени кроликов при жспоримон-тальной ишемии мискардш// Биопсудшеры и_клетка. - 1990. - Т. ß

Ä3 .-С. 75-76

À