Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль непаренхимных клеток печени в регуляции биосинтеза белка в гепатоцитах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль непаренхимных клеток печени в регуляции биосинтеза белка в гепатоцитах"

РГ6 ол

* г м оа

1 3 '' РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЙ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

иютитл тожт

на правах рукописи

ХАРЬКОВСКИЙ АНДРЕЯ. ВИКТОРОВИЧ

РОЛЬ НЕПАРЕНШЗЛН КЛЕТОК ПЕЧЕНО РЕГУЛЯЦИЙ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА В ГЕПАТОЦИТАХ

00.00.04.- биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 1993

- г -

Работа выполнена в лаборатории молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий Института биохимии СО РАШ

Научный руководитель - акадешгк РАМН, профессор Л.Е. Панин Официальные оппоненты- доктор медицинских наук,

Ведущая организация - Институт экспериментальной кардиологии БКЭД РАМН

на заседании специализированного Ученого Совета К 001. 37.01. Института биохимии СО РАМН по адресу: 630117 Новосибирск, ул. Академика Тиыакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии СО РАШ

Автореферат разослан "I " ШХ? 1993 г.

к1е дишяйов

кандидат медицинских наук НИ. Душкин

Запита диссертации состоится

и

■10 " дгЫдлЗ. 1993 г. в/0 час

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Т. Г. Филатова

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблема Изучение мехаюгеьоп регулягаш сймэна веществ в различных органах и тканях при функционально»* заягя-одши организма является одной из центральных проблем к иреме.*-ной биологической и медицинской науки (Панин Л Е., 198?. Херсон Ф. а , 1984, Саркисов , 1S87).

Особый интерес представляют взаииоотнедания клеток строил и паренхима при стрессе. Ш имеющися в литература сг^лзтсш. связь между активностью системы мононукгеарннх фагоцитов (CMS) я структурно-функциональными изменениями в органах и тканях не, вызывает сомнений (Ермольева 3.R ,1976. 1&янсккй A.R , 1£ш;сккй Д. Н., 1983, Панин Jl Е., Иаянская ЕЕ , 1987; Di Lusio N., 1867).

В настоящее время идет процесс накопления фактов, свка&-уедьствущих об участии шнонукхеаров а, особенно, терминального ввена CMS - резидентных к®крофагов в регуляции обмена белков, жиров и углеводов в паренхшных адзтках. Свяаь ыоазт осуществляться как непосредственно через мехкпетгочяые контакты с паренхимой, так и дистантно, череэ стану '"эдЕаторов. Джавано участие макрофагов в регуляции гэмопог»за, даагукного ответа ор-ганиака, в процессах свертызания крота. Ikmsmo т участнэ в регуляция пролиферации фибробластов я эядогч-.-; v; геегдов (Haifa R.R. et. 'kl., 1877,' Pierce а V., 1980, Fogeli^n А. К et al., 1081, Lasier A.,i983, Oka K. et al., 1983, VSLar^be J. et el. , 1983, Dawson P. A., 1989, ifeszaros K. et al. ,1931).

Ha проявлении межлеточяыг взакмакействхй в Еечвночаом.ЗЕй-нусе, основанных на непосредственных доясзаточзьк пыхш&шх в,-межклеточной передача визкомзлекулярцыг посрсддказа 6a22PS"e?ca' . современная трактовка строыагьно-пареяхиылтозЕнх отновзе?й в различных тканях организма (Wisse Е. et al., 1979, Rankin J. Д. , 1990).

Перспективным подходом в анализе стрэмалько-паренхимвтовш« взаимоотнешений является изучение тех изменений паренхимы печева и других органов, которые проявляются в условиях,; направленного воздействия на активность клеточкыя элементов язпршэр, стимуляции их с помощью липополисахаридов бактериального происхождения.

Цель и задачи исследования. "Дзл>ю кастояюто иссдажованкз было'изучение роли непарешшшых клеток печени в рэгуз&да бко-,

синтеза бзлэ в гепетоцита/.,

В работе были пеставхэна следующие задачи: , 1. Дать сравнительную характеристику белкового синтеза в раз .тачных органах и ткаах зксперииентальиых ¡¡швотных в условиях стимуляции от О&кгарзавь&шш яипополисахаридами и полинук-гзотидаии.

- 2. Исс^доьая г, СКЭ в регуляции биосинтеза белка в раз- ' личных органах в &S№<9ES3S.

3. О^яига ys:r/i:m кзяаренхишж клеток печени в регуляции бвзздахе&з де^ха, а культуре гепатоцитов при добавлении в среду инкубацж! .гаюпожсзхарадоа, мвжанэртиковдов и липолротеидов высокой плэхшяя {косперативаый эффект).

4.- йзучэт* роль резидентных макрофагов печени (клеток Купфе-' ра) ъ хндукции ткровияаминотраясферезы декстрансульфатоы и годовало«. -

5. Дать характеристику изменений рецепторного аппарата в ге-патоцятах и клерках печеночного синусоида к липопротеидаы высокой п низкой плотностей при стимуляции 01» продигиозанои.'

НатчКеу! шатана полученных результатов. Проведенные после-j дов&яш агуканий биосинтеза белка в паренхиме органов и тканей зкацвршйнтальшп етвотшс при стимуляции С№ различными препаратами впервые позволяли выявить зависимость скорости биосинте- • sa зша в ткадях от функционального состояния (Я®.

Ус7&8овлвяо, что стикузнция СЮ полиркбонатом вызывала из-менеяш , -прости биосинтеза» белка только в иммунокомпетентных и кроиегасфягЕ органах: тицусе, селезенке, костной шзге. В остальных ксмэдованкых органах и тканях процессы биосинтеза белка не кмккшсь, однако, при стимуляции СМ® продигиозаном, наСлвда&эей генерализованное увеличение скорости белкового синтеза праж^ехя во всех тканях.

При В8»я&шаI продигиозана крысам различного возраста было обнарутгйэ.что -стимуляция СМФ не вызывает изменения белкового сшмэзз у ховэродцекных крысят, а также у старых животных. Хотя в яоадвяз&ы случае введение препарата приводило к достоверному увелщчё;!".;« скорости биосинтеза белка в головном моз/е. При сти-мулззди (Ш у беременных крыс за 4 дня до родов увеличение скорости белкового синтеза наблюдалось только в костном мозге и не отмечалось з печени,почках, лета, сердце, мышах и плаценте.

- 5 - . : ,;

У плодов в этих условиях биосинтез белка в иссхэду- tx '--S-SáS* не изменялся.

Используя культуругепзтоцитов, НП-клеток П0ЧЙ1»' (подушных как от интактньк акзоткьгх, гак и от крыс, стиму »гроше as i ЛИС) и сокультуру этих клеток .нами Оыдо показано, что ние скорости биосинтеаа бела а гепатоцитах агЕЯскт от ирясутс-; твия в среде культивирования НП-клеток или от янкубата HE-im-v ток. Эффект более выратен, есгс использовались ШЬклотки, ciEhv мутированных ЛГО яизотных. ' ' f;*

, Ет.ервые показано, что стимуляция CtíS сульфатом даотреда; вызывает индукцию тирозикакакютракгферазы неконкурентного tpfe по отноэбгию к гидрокортизону. 3 основе ивдувдга TAT в культура* гепатощпов под .влиянием гндрокоргюоне лелит присутствие . ренхкмпя клеток печени. Таю© вг.эрзш било пролзнонстрироваао, что'какрофаги печени, стимулирование? m vitro эимоганои клег сульфатом декстрина, вызывают индукции TAT в" культуре гепстоцлГ-'. тов. ' _ _ ' " ' .i

ПрИ стимуляции СМБ in vivo ЕРОДИГКОЗГЛ^'! KtCJJEiSS" оттчащ* фазовые изменения „количества редашгосо*.',« JKT.*: ^а'тюверхноеяй клеток Нупфзра: резное: уменьшение, в -»ссгэ;:

стимуляции и последующее восстановление ' а*'- дс-ямсл: * к-суткам. Через трое суток поста в^даш-.прояйпюзаяа- к/мй?*;;"". рецепторов к"лПШ на гепатоцитах вначнгедько у^'гггнзаюеь.;

Научно- практическое значение работы. • ■ Ib еюеку сег-фх^якй работа носит преимущественно теоретический характер н предела- , ляет собой исследование кедекуляркых »»xcsuissíob взаимодействий, связанных с регуляцией экспресс-:;? гековГ "Рабога в основном выполнена на печеяя и щетках' печеночного ' екнуежзда в норме' 'и при стимуляции CIS лип о rio лис ахаридг. • *ч различней природы, ' ' . ' "'* ' • : Решение поставленных г. диссертации ездач лвлявтег'необходимым этапом в изучении роли СКФ в поддержании гЧизсетага- в виваииемся организме, з форкафовсяии нових представлений о роле межклеточной кооперации в регуляции бвссингеза брлка в гЛрёнхй-ме органов и тканей.

Практическое значение работы состсит ь том, что го-тг^тпягб результату могут Ььггь иегюльзозакы для -рйарайат'Г? Kospa ксЬ. > гни, направленной на изучзкзе регенераторную кзизакзег:^- дланей. при их поврехвенкп. „Она • сзир^'этсл па-;кзкг®ссткй%'

эффекты ЛПС и полинуклеотидоз стимулировать биосинтез белка в паренхиме органов и тканей в связи с активацией С1И>. '

Если необходимо стимулировать биосинтез белка в иммуноком-петентньк и кроветворных органах предпочтительнее использовать полмрибонат, при необходимости стимулирования других органов -продигиозан.

Данные, характеризующие роль Citó на различных этапах онтогенетического развития также несомненно являются весьма важными с практической Т'ущм 8реякя.

Совокупность изученных фактов свидетельствует о перспективности данного подхода при изучении роли CMS в регуляции метаболически процессов я печени.

lio маоериалам исслэдования подана заявка на изобретение К 5022313 от 13 января 1992. г. : "Специфический стимулятор биосинтеза бзлка в имыунокоыпетентных и кроветворных органах". Псгучено положительное ре-иение Госкомизобретений.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Введение продигиозана половозрелы« животным приводит к гекеролизованному аффекту усиления биосинтеза белка, а при вве-

: детт животным полирибоната - только в органах, ответственных за иммунную и кроветворную функцию организма

2. Сутцеетвуег тканевоспецифическое различие индукции биосинтеза бежа при стимуляция СМФ крыс различного возраста.

3. Присутствие продигиозана, ЛПВП и глюкокортикоидов в среде инкубации нгпаронхимных . клеток печени j приводит к усилению биосинтеза белка в паренхгалшх клетках при переносе данной среды инкубации к ге/игоцитак. , .. ,

,4. ¡Заявленные изменения активности ТАТ и количества рецепто-. ров к ОТл на паренхимных клетках печени крыс зависят от'функционального состояния CMS крыс, .' '

Апроб^щ работы. Материалы диссертации доложены на Всесоюзном симпозиуме (с участием зарубелшых ученых) "Мэ^писУйя^ phagocyte system in normal and pathological . states" {Новосибирск, .1&90), 52-й научной конференции молодых ученых (Новосибирск; 1991),.! съезде иммунологов России (Новосибирск, 1932),, XI научной, конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" ,(.Челябинск, 1992), Научной конференции "Цро$мактика и экспериментальная терапия экстремальных и тер-

- 7 -

минальных состояний" (Сиск, 1992). .

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Объем работы. Диссертация написана на 135 страницах л состоит из введения, литературного обзора, материалов у методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы (из отечественных и иностранных источников). Работа содержит 22 таблицы и 9 рисунков.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научко-иссле->.. довательских работ Института биохимии СО РАМН по теме "Изучить роль системы иононуклеарных фагоцитов в регуляции экспрессии генов паренхимных клеток печени", номер государственной регистрации темы 01. 8.90. 056649. ' ' : • СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ' " * ; ' - ^

Материалы и методы исследования. Исследования быта выполнены на 252 крысах (самцах "и самках) линии Вастар'Б, "массой 180-250 грамм. '.'"'.['.У ,' ' ". ''

Основой для решения 'Поставленных аадач^Ывиось модулирование функционального состояния СМЗ>. Сл-тмулшгтта? t активация) моноцитов крови и ревйдентйых макросов тканей оп'/юстьляая-препаратами: сульфатом декстрана. (М. М. 500.000 ¿едьтов)этюодом. продигиозаяом, пояирибонвгом.' ' - '";•* . "

Все препараты вводили В хвостовую вену;крыс в фиакэлЬгй<ес-ком растворе1^ следутаа дозировках: продигкозан - Л; 25 ш- ка ,кг массы, сульфат декстрайй- 50 W/кг 'массы, исшфибокат - 100 мг/кг массы (подирибонат вводился"' ^Цтрйбрйвшяо). В случае Проведения эксперимент^ i;n vttrdдозы чййгеледуи^1мь!: ''проЩ-^оза-на. 7,5 мкг на 1 мл ^ультуральной среды,1:сульфата декбтрана 35 мкг/мл, опсонйзированного 'зимозана0,5 мг/мл. Для оценки роли С10>' в регуляций процессов физиологической' регенераций различных органов и тканей организма использовали следующие модели:"

. 1. Определяли изменение1¿корости белкового синтеза з различных органах и тканях крыс в онтогенезе в ноЬме it при стимуляции ' СЫФ липбполисахаридамй. Биосинтез белка оценивали у крысят в возрасте б дней-'после роадений), а'также у половозрел:^ и старых . крыс ( 3 года).' Оценили скорость биосинтеза' белка р лях' матери и плода при стимуляции СМВ 1итер:: ЛПС в ■ конце ' беременности. , Продигиозан' вводили крысам за'сутки до'заЛоя. 1 '-'■> ••• , 2. Изучали влияние полирлСоната 'на сосТЬ биосинтеза бел-

ка в органах и тканях взрослых животных. Препарат вводился за 4 и 24"часа до ваЗоя в дозе 100 мг/кг массы тела. Для подтверждения специфичности действия полирибоната был проведен эксперимент с введением нукяеината натрия.

3. Двя выяснения роли резидентных макрофагов в регуляции биосинтеза белка наш использовалась первичная культура гепатоцитов и HO-клеток" иачта. Последние выделялись от двух групп крыс: интактных и сталированных введением продигиозана. В дальнвйвем культиаиг-огояясь эти две суспензии непаренхимных клеток, а гак m сакультура гепатоцитов с интактными Ш-клетка-ая я гепатоцятоя со сгяцулярсванными HD-клетками; Для выяснения природы гвдогецки: медиаторов, определяющих взаимодействие гепа-тсцитоз и шГгеяеток использовали гидрокортизон в дозе 10 мкмоль и ЛПВП й ксщоятрагта 100 на 1 мл культуральной среды.

4. Для изучения влияния непаренхимных клеток печени на ин-ду.'здаю TAT р. лечгнк крае использовали сульфат декстрана. Для срав-^ния уо.тальвоьаду. кортизоловую индукцию TAT. Гормон вводили в/б за 3 таг.» до забоя в доза 5 мг на кг массы тела. Применяли -шсс зчгкгоыицин Д - ингибитор ДНК-зависимого синтеза РНК. Препарат вводили ü/ú за 1 час до введения гидрокортизона или суль-

. фата декстрана в дозе 1 мг па кг массы. При индуцировании TAT в культуре гевагодагов использовали инкубационную среду первичной культуры ютток Кушрера, стимулированных декстраном сульс^та или опсонизиговаяньи зимозаном.

5. Оценивали злиязше стимуляции CÏ.Œ in vive на рецепцию ЛПВП и ЛПНП генатоцигами, ыдкрофагамй к эндотелиальными клетоками печени Kpi-WH, ' ' '

В работе, ислодьвовали следующие методы:

1. ItoJtyvoHHe изолированных клеток печени (Seglon P.O. , 1975) в модифи/.:"*;« (Усшк'л iL Ф. , 198?)'.

2. -эированиг гепатоцитов и'непаренхимных клеток печени крысы (¿per.'íií F., 19S9).

Ou' мление скорости биосинтеза белка в различных органах и тканях гта in vivo, в культуре гепатоцитов и сокультуре гепа-тощп'"^ .. „"-"клеток печени крыс in vitro (Rabson R., Novelly G. D, 1960, ite-ka, Novelly B.D., 1961).

л. хуление различных ¡гдассов липопротеидов плаз мы крови методов .„.'оплотностногс центрифугирования (Hatch F.Т. .Lees R. ,1968). Б. Ь&чзцйё различкЕЙс классов липопротеидов плазмы крови крыс

- 9 -

(Fraker H.J. , Speck J.C. , 1978). -

6. Определение активности Ь-тирозин-г-оксоглут^ратаьяяот-рансферазы (Diainondstone Т. I., 1966).

7. Определение белка проводили по методу Лоури (Low- 0. Н. et al. , 1951).

Результаты экспериментов обработаны методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента ( Урбах Е Ю., 1963). Экспериментальные кривые оптимизированы с помощью критерия хи-квадрат.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНКЕ 1. Изменение синтеза белка в органах и тканях, крис при введении продигиозана и полирибоната

Модель, выбранная нами - исследование общего белгазого синтеза в органах и тканях экспериментальных кявотных, обладает высокой чувствительностью и являотоя наиболее показательным критерием интегральных метаболических изменений, происходящих в тканях. Стимуляция СМФ осуществлялась с помо?гг. бактериального ЛПС продигиозана и одного из представителей п .."'^иЗон'/клеотидов -полирибоната Это позволяло нам сравнить действа xsyx стимуляторов, различной химической природы природы и р;-. з действии препаратов на скорость биосинтеза белка в срглнгх и тканях крыс.

При СТИМУЛЯЦИИ СМФ продигяозаном in vivo у ПОЛОВО!С;1ШХ крыс наблюдалась выраженная индукция биосинтеза йзлка э бо.т- -шнстве органов и ткачей (таол. 1). Однако, в легочной ткачй:' в ответ на стимуляцию альвеолярных ма-рофагов продчгиозаиом серость биосинтеза белка достоверно не изменилась. Отсутствие эффекта усиления. биосинтеза белка наблюдалось и в ткани головного мозга

При введении полирибоната наиболее существенные изменения произошли в органах кроветворной и иммунной систем организма (табл.2). Здесь направленность изменений аналогична действию ai-пополисахаридов. Особенно сильно увеличивался биосинтез белка в тимусе через сутки после введения препарата (в 3,3 раз, р<0,01,. В селезенке биосинтез белка увеличился ухе чореэ 4 часа госле введения препарата и . продоллал возрастать в течение первые суток. В ткани костного мозга крыс усиление бкосгатеза бела отмечалось только через сутки после введения up карата.

Таблица 1

Влияние стимуляции СМФ продигиозаном на скорость биосинтеза белка в органах и тканях половозрелых крыс

Включение 14-С-лейцина в белок Органы и (иш./'ш. на 1 мг белка) хЮО ткани Лнтакгьуе животные Стимулированные животные _:____(?)____(7)_

печень 20,0+1,5 30,2+4,6*

П0Ч№ 21,5+1,3 33,3+2,7**

легкие 8,0+0,6 10,0+0,6

сердце 6,6+0,4 9,7+0,7**

>'ЫДЩЫ 5,3+0,4 8,7+1,6*

8,1+0,5 13,5+1,1***

г;;?овиой мсаг 6,6+0,4 8,3+0,7

тимус ¿5,2+0,9 17,1+1,8*

надпочечники .19,6+1,4 25,1+1,5*

селезенка 17,2+1,9 26,6+0,9**

костный «:озг 10,7+0,7 16,7+0,4***

Прлмачание: достоверные изменения по отнопению к контролю:

л - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001. В печени, легких, головном мозге, надпочечниках, сердцем мыэдах достоверных изменений скорости белкового синтеза не обна-рууй.чо во все исследуемые сроки после введения препарата

Для доказательства специфичности действия полирибоната были приведены сравнительные исследования с нуклеинатом натрия. Ламг-jS: npenspar является продуктом кислотного гидролиза рибонук-леинсаой кяслоты дрожжей. Нуклеинат вводился в/0 в такой же дозе, чм я полирибонат. Ни в одном из исследованных органов достоверно 'значимых изменений ке выявлено.

После стимуляции СМФ крыс продигиозаном отмечалось увеличе-ше скорости белкового синтеза практически во всех исследованных органач., что согласуется с известным фактом об усилении биосинтеза üa&iz при состояниях организма, связанных с активацией $унк«йй-0пФ : эндотоксемии, сепсисе, воспалении, иммунизации (Т.ле-!! >т.Хан Х.Ф. , 1970, Карпов С. П. и др., 1978, Панин JLE. и л.,. . л'^ЪЯ). Однако, вклад самих непаренхимных клеток в био-

■!>*5лица 2

Изменение скорости биосинтеза бежа в органах и тканях , крыс в разные сроки послз введения полирибоната

Органы и ткани

печень почки легкие сердце

МЫЕЦЫ

головной мозг тимус

надпочечники селезенка костный мозг

„Контроль

Включение 14-С-лейцина в белок .(га/л./мин. на 1 мг белка) х 100_ _Опыт_

68.9+5,5 53,4+2,7 52,214,7 23,0+1,2 9,Г+С',8 15,0+0,7 31,0+3,3 50.212,2 43,5+3,4 52,5+2,3

4 часа

_(б)_

52.-9+7,5 6'- ,7+3,2 1.0,4+2,2 Э3.6т0,9 7,6+0,4 15,4+1,4 35 'л2.о С.,8+7,4 58,0+5,^" 54,8+4,1

24 часа _(7)_

57,9+2,7 63,1+2,8** 51,8+5,4 23,5+1,4 11,5+0,9 17,3+0,9 101,8+21,9** . 54.5+2,4 71,: _ ',Д***

Примечание: достоверные различия по отношению к контраш

* - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,СО1. синтез белка незначителен. Это покагано ра.:-эе "з нашей лаборатории на. примере печени. Роль НП-клеток заключается прг^де всего в регуляции этого процесса в гепатоцигах (Панга: ЛЕ.-и др.1С90).

Синтетические полинукдеотидныз комплекс,1.', известны^ как эффективные адъюзг.нты, - способствует усилению квотного ответа. Они схож по своему действии на организм с Ж) и ' мурамиловым дяпептидом (ЗсЬгг^сИЛе ,1.1?., ЛЫтзоп А. , :1971)„- Однако, при введении полирибоиата крысам не отмечалось генерализованного усиления.биосинтеза белка. После 24-часовой стимуляции полнрибо-натом скорость биосинтеза белка воэрг --ала в здяогсомпетбктншс и кроветворных органак: в селезенке. тимусе, :летном '-'"^ге. Эти различия- в действии ЛЕС и полирибонутсботидов ' отгт- я на«« впервые.

Таким образом, полученные результаты сьед^тедьствуют о том, что введение продигиозана приводит к генерализованного

синтеза белка в органах и.тканях крыс, согласуется с результатами других авторов'использовавших ЛГЮ. При стимуляции

CMS продигиозаноы отмечалось увеличение скорости синтеза белка практически во всех тканях. При введении полирибоната синтез белка усиливался только в органах кроветворной и иммунной систем. Данные изменения были специфичные .и не воспроизводились нукле-кнатом натрия. Это свидетельствует о том, что данный препарат может использоваться как високоспецифичный стимулятор резидентных макрофагов тимуса, селезенки и костного мозга для усиления биосинтеза белка только в этих органах.

2. Роль систеш ькиэнуклеарных фагоцитов в регуляции био-

синггза Се а в органах и тканях крыс в онтогенезе JisiKKeйгаьдгеаальиого состояния CMS в процессе онтогенеза моrzri; уоеличигазь индивидуальную чувствительность организма ¡: сспсису <1(псок D. L. ,1979). Поэтому, нам представлялось инте-рсж:м. рпродедэнаг старост;.' биосинтеза белка в органах и тканях экспериментальных ¡шветны:-; различного возраста при стимуляции ОМ® лкпэчохгсахаркдом. В предыдущей главе было показано, что оттлул;,..::.: СМЬ лрод*:глозаном у взрослых крыс вызывала генерализованное увеличение скорости биосинтеза Селка в тканях.

Вгедэние продиткозгна старым животным приводило к стимуляции биосинтеза белка в легких в ткани головного кюзга. Во всех остальных исследованных нами органах не замечено значительных изменений скорости синтеза белка после введения препарата

Пэ-ги^.-мому, отсутствие эффекта стимуляции СМФ вызвано возрастной функциональной недостаточностью резидентных макрофагов у старых к'вотных. Из литературы известно снижение с возрастом способности клеток , Кудфера крыс очищдгь циркулирующую кровь от эндотоксинов, а кролика - от туш, введенной в кровеносное руслс, хотя количество резидентных макрофагов оставалось прежним (Бутенко Г. К., Терешша О.П. , 1991, Knook D. L. Broiwer А. . 1989, Соре Е. II У, , О i 1 ly S. А. , 1S90).

Б головного мозга функцию макрофагов выполняют, в той

дли 1'ноЛ о Арденн, астроциты, олигсдендроциты, клетки эндотелия сосут""« ' -- 'сга, микроглиальные элементы ЦНС. Такая множественность мач^ой-голодобних клеток, представленных в ЦНС, возможно, объясни;;; сзгсзедюо синтеза белка в головном мозге старых животных, Яре«:? того, недавно было обнаружено, что клетки, экспресси-руауз онтиген F4/80, появляются в головном мозге .и образует дреъовяйпук микроглин только после фагоцитоза старых нейронов и

аксонов (Ломакин М. С., 1S90).

Необходимо отметить, что у старых животных включение меченой аминокислоты в белок увеличивалось в печени, легких, селезенке; тимусе и надпочечниках по сравнению с аналогичным показателем у половозрелых крыс. Это усиление белкового синтеза объясняется кс'.тенсатояной реакцией организма в ответ на усиление протелну-ри", отмеченной у старых животных (С. F. A. Van Bozooljen, 1981).

скорость биосинтеза белка в мышцах достоверно спияа-v .... Нз отяечеио существенных изменений биосинтеза белка в поч-»к И «'ОДЯЙОМ ЬЙ>ЗГв.

У v^soposffiSKHHX животных практически ни в одном органе не •¿з^лллась скорость биосинтеза белка (за исключением мышечной Tfляп). Вероятно, это связано с функциональным напряжением резидентных макрофагов в этих органах. Это напряжение СМФ нозорсж-денных животных подтверждает и высокая скорость биосинтеза белка по сравнению со взрослыми животными. Это отмечено практически во всех исследованных органах, хотя и наблюдаются тканевоспецифи-ческие отличия выраженности этого процесса. Подобные изменения показаны тага» и для различных изоферментов (Kanungo M.S. et al. , 1970, Stone R. R. et al. ,1881).

У беременных самск биосинтез белка при введении стимулятора CMS - прглягнозана, увеличивался лишь в костном шзге (табл. 3). Это говорит об усиленной пролиферации клеток моноцитарного ряда - прекурсоров резидентных макрофагов. 'Однако, продигиозан не влиял на синтез белка в остальных органах. Отсутствие эффекта возможно связано с функциональными особенностями плацентарных макрофагов. Показано, что макрофаги, локализующиеся в плаценте в отличие от других резидентных макрофагов обладают иммуносуп-рессивиыми свойствами, возможно, вследствие высокой продукции простатландинов^ которая особенно усиливается под влиянием прогестерона (Yagel S. et al. , 1987).

Скорость синтеза белка в органах беременных самок была значительно выше, чем в аналогичных тканях взрослых животных: з печеночной ткани, в почках, в миокарде и в легочной ткани. Особенно резкие изменения происходили в ксотном мозге. В 5,4 раза усиливался биосинтез белка в костномозговой ткани беременных животных по сравнению с небеременными. Однако не было выявлено каких-либо изменений синтеза белка в мышечной ткани.

Таблица 3

Изменение скорости биосинтеза белка в органах и тканях беременных крыс через 24 часа после стимуляции СМФ продигкозансм, М±т

Органы1и ткани

Включение 14-С-лейцина в белок (к мл. /шн. на 1 мг белка) хЮО Контроль Опыт _(3)__(7)_

печень

почки

легкие

сердце

мышцы

костный мозг плацента

44,0+6,9 44,2+7,3 31,3+6,2 17,2+4,1 6,0+1,3 57,7+11,6 40,6+6,5

56,7+2,5 48,8+3,0 37,6+1,7 21,8+1,1 5,5+0,8 107,7+4,2 * 47,5+2,9

Примечание. В опыте шгошй-жзжсь крысы со сроком беременности 18 суток.

* - достоверные различи •..••г.^тав к контролю, р<0,05

Таблица 4

Старость биосинтеза белка ^ г; ¡-мах плодов крыс через 24. часа после введения продигиозана беременным самкам, М+т -

Органы

Включение 14-С-лейцина в белок (иип. /мин. на 1 мг белка) х100-контроль продигиозан

печень 71,2+10,6 57,0+5,7

(6) ' ■ (13)

сердце 61,6+7,9 56,2+3,5

(5) ■• (9)

кинцы 51,1+19,8 58,3+4,3

(4) (11)

При введении продигиозанз беременным самтам биосинтез белка не изменялся в исследованных органах плодов: печени, сердце, мышцах на поздней стадии эмбрионального развития (табл. 4). При этом скорость.биосинтеза белка была в несколько раз выше, чем в соответствующих органах материнского организма. Это подтверждает наше предположение о невозможности дальнейшей стимуляции бе-локе тгетачеегаи чродессов. в тех органах, г,?,в процессы биосинтеза болгл идут1 с очень высокой скоростью и где СМФ испытывает ■ " .'дИона-.-гте перекапряжние.

'.7,з:'. pepse полученные в нашей лаборатории данные о вли-.•:. .'\,;yrr.;i"i cd) продигиозаном моино заключить, что при бе. нуждается многократное увеличение скорости синтеза во всс." исследованных наш органах (Панин JL Е. и др. ,1989). Зроме того, известно, что это увеличение достигает своего пика лишь на поздней стадии беременности и снижается сразу после реж-дениь молодых животных (Millican P.E. et al., 1985).

Эффект отсутствия реакции на введение продигиозана почти во; всех органах мы объясняем предельной функциональной загруженностью СМФ в позднем пренатальном и раннем постнатальном'периоде, г., следовательно, невозможностью резидентных макрофагов способствовать усилению синтеза белка при введении продигиозана.

3. Роль резидентных макрофагов в регуляции биосинтеза бедка в культуре клеток печени

Для выяснения роли СЫО в регуляции биосинтеза белка в печени был проведен ряд экспериментов на культуре гепатоцитов, НП-клеток и сокультуре гепатоцитов о непаренхимными клетками печени. Крысам вводили в/в продигиозая и через сутки выделяли ге-патоциты и НЛ-клетки. Одновременно выделяли гепатоциты и НП-клетки от интактиого животного. Культивировали эти клетки. Кроме того, инкубировали сокультуру гепатоцитов и интактных ffll-клеток, гепатоцитов и стимулированных непаренхимных клеток. Полученные результаты указывают на незначительное увеличение скорости биосинтеза белка в культуре стимулированных непаренхимных клеток (табл.5).

При сокультивированш гепатоцитов и непаренхимных меток в соотношении 1:3 наблюдалось усиление биосинтеза белка в случае использования НП-клеток от стимулированных ЛПС животных, по сравнению с сокультурой гепатоцитов и непаренхимных клеток от интактных крыс.

Таблица 5

Влияние непаренхимных клеток, выделенных из печени ин-тактных и стимулированных продигиозаном крыс, на скорость биосинтеза белка в культуре гепатоцитов.

Условия Включение 14-С-лейцина в белок

культивирования (иш. /мин. на лунку)

Гепатоциты

Интактные НП-клетки

Стимулированные НП-клетки

Гепатоциты + интактные НП-клетки Гепатоциты +

стимулированные НП-клетки

17200 + 1190

(3) 5960 £ 350

(3)

8690 £ 1290

(4)

23640 +1990

(5)

33950 + 3270 * (4)

Примечание: * - достоверные изменения скорости биосинтеза белка по оть'сейк® к серии гепатощты + интакгныз im-fsu к.л (Р < 0,05).

Нами было показано, mo способствующие активации

синтеза белка, присутствугс в течение непродолжи-

тельного периода времени псг/"> - « ....rj* продигиозана Об этом говорит гот факт, что в культу!'«- к. г.:.чКиХ гепатоцитов. наблюдалось выраженное, но недостов^нс?; .. ./-личениэ синтеза белка под влиянием сыворотки взрослых ¡сг:г\ вторым за час до забоя вводился продигиозан. Если продагиогая вводили за 12 или 24 часа до забоя, то данного эффекта не отмечалось. При использовании сыворотки крови интактных крыс и продигиозана (совместно) синтез белка увеличивался, только в сокультуре гепатоцитов и НП-клеток, т. е., для увеличения скорости биосинтеза белка гепа-тоцитами под влиянием НП-клеток необходимо присутствие стимулятора СМФ и ряда веществ, находящихся в сыворотке крови.

В дальнейшем был конкретизирован механизм активирующего действия ШЬклетог на биосинтез белка в гепатоиитах. Оказалось, что'он связан с кооперативным э(Мектом продигиозана, глюкокорти-коидов и липопротеидов высотой плотности. Непаренхимные клетки

культивировались в бессывороточной среде ДОЕМ. Через сутки инку-бат НИ-клеток собирали, стерилизовали фильтрованием и добавляли к гепатоцитам. В это же время добавляли непосредственно к культуре гепатоцитов соответствующие реагенты в качестве контроля. В последнем случае эти вещества (продагиозан, гидрокортизон и ЛПБГО не .приводили к изменению скорости синтеза белка (табл.6). F? синтез бедка в гепатоцитах, если НИ-клетках инкуби-

г -TTC, гидрокортизоном и ЛПВП. Однако, значительно умяачягэгаеь скорость биосинтеза белка при воздействии инку-. ô&tiP^c-h- ерсдч кепаренхишых клеток, содержащей гидрокорти-sctî, продигиозан и ЛПВП.

Таким образом, тольта в присутствии гидрокортизона и ЛПВП развивался эффект стимуляции культивируемых НП-клеток под влиянием продигиозана, что оценивалось по увеличению скорости синтеза белка в культуре гепатоцитов при переносе к ним инкубационной

Таблица 6

Влияние инкубационной среды непаренхимных клеток, культивированных M часа с гидрокортизоном, ЛПВП и продигиозаном на биосинтез белка в культуре гепатоцитов (имп./мин. па лунку), М+т.

Культура гепатоцитов Условия Контроль Опыт

культивирования (среда ДМЕЮ (инкубационная среда

непаренхимных клеток) .(В)__(9)_

1. Вез добавок ; 19790 + 11S0 18510 +, .1790

2. Продигиозан 18490 + 1190 17740 + 1530

3. Гидрокортизон 1775D + 1460 14780 + 980

4. ЛПВП 178Э0 + 1410 16470 + 680

5. ЛПВП +' продигиозан + 18810 + 1950 33940 + 5210**

гидрокортизон

Примечание: ** - достоверные изменения по отношении к

контролю (Р<0,01). среды от НП-клеток. Данное увеличение скорости связано с реализацией кооперативного эффекта глюкокортикоидных гормоноя и ЛПВП, который запускает транслокацию лизоеомальных ферментов в ядро клетки, приводящей к активации хроматина (Панин Л. К., Маянская аа, 1987). .

- 18 -

4. Индукция тирозинаминотрансферезы под влиянием стимуляторов системы мононуклеарных фагоцитов

В качестве стимулятора СМФ в данном случае использовался декстрансульфат. Первоначально мы определили наиболее оптимальное время действия этого препарата для индукции TAT в печени и почках. Показано, что наиболее выраженная индукция фермента в печени наступала через 3-6 часов после введения препарата.' через 12 часов активность TAT значительно снижалась, но не достигала исходной величины. В почках отмечено значительное ее сниже-> кие через час после введения препарата Оно.носило довольно стойкий характер и сохранялось вплоть до 12 часов. > ; г .

В ходе дальнейших экспериментов продолжительность действия декстрансульфата в организме для проявления его действия на активность TAT' в печени и почках ограничиваюсь нами 4 часами. Для сравнения ш-исп'ользопали классический индуктор.TAT - ..гидрокортизон. •

введении гидрокортизона и декстрансульфата

1 - контроль .4 - сульфатдекстрана + гидрокортизон

2 -гидрокортизон 5 - гидрокортизон + актиномицин Д

. 3 - сульфатдекстрана 6 - сульфатдекстрана + актиномицин Л Показано, что. .под: влиянием,гидрокортизона активность TAT в печени увеличивалась в 4,8 раза по рравнению с, контролем, а при введении сульфагдекстрара увеличение,, было в,4,6 раза Цэи совместном введении гидрокортизона;.и ■ сульфатдекстрана увеличение

активности фермента носило аддитивный характер, превышая исходный уровень в 10,8 раз. Если за 1- час до введения гидрокортизона или сульфатдекстрана крысам вводили актиномицин Д. то это приводило к отмене индукции ТАГ (рис.1).

Т.о.-, аддитивный характер индукции TAT в печени под влиянием гидрокортизона и декстрансульфата говорит о независимом v.e-ханггж действия сбоих соединений. Действие первого реализуется чнгогольный рецептор гидрокортизона, действие второго -" 'и>уляцию СЫФ.

-.^лтаерядения роли резидентных макрофагов печени в ин-г^стш TAT нами были проведены эксперименты, в которых активность фермента определялась в культуре гепатоцитов при добавле-

Таблица 7

Влияние культуральной среды клеток Купфера, инкубированных in vitro 4 и 12 часов декстрансульфатом и зимоэаном, на активность TAT в культуре гепатоцитов,Щт

Условия культивирования Активность TAT

4 часа 12 часов

1. Среда ЫЕМ 4.2 + 0,2 4,1 + 0.5

(10) (5)

2. Среда ЫЕМ + декстрансульфат 3,1 ± 0,2 4,4 + 0,4

(5) (3)

3. Инкубационная среда 4,9 + 0,3 5,3 + 0,4

клеток Купфера ■4 (8) (3),

4. Инкубационная среда ; , 6.7 + 0.5 3,9 + 0.3

клеток Купфера + декстрансульфат (4) (3)

5. Инкубационная среда = ! 5,9 + 0,4 -

клеток Купфера + зимозан (4)

Достоверные различия: ■ ■ Р1-2'< 0,01 РЗ-4 < 0,01

(все значения приведены для' Р1-3 < 0,05 РЗ-5 < 0,05

четырехчасовой группы) ■ •

Примечание: Гепатоциты культивировали 24 часа. Клетки Купфера

стимулировали;декстрансульфатом или опсонизирован-ным зимозаном. Инкубационную среду клеток Купфера: стерилизовали и переносили в культуру гепатоцитов

нии инкубата от свепэвыделенных макрофагов печени, стимулированных in vitro сульфатом декстрана к аимозаном. Нами наблюдалась достоверно выраженная индукция TAT при добавлении инкубата от макрофагов в культуре гепагоцитов. 35

га

о

S >.

о к Ь Г« О О

о

4 S

с. X

а

6« f

О О)

fa

Д t—I • § gjj

E,

К

Рис. 2

1 2 3 123123 гепатоцкты , клсж: эндотелиальные Кутгфера' клетки вменение количества рецепторов к липопротеидам низкой (А) и высокой (Б) плотностей у. различных клеток печени при стимуляции СМФ продигкозаном !• - контроль 2 - стимуляций 24 часа

3 - стимуляция 72 часа : -

В случае предварительной стимуляции макрофагов сульфатом декстрала и зимозаном в условиях in vitro, увеличение активности TAT было достоверно выше, чем при добавлении инкубата от нести-мулирсшнкых к^этск Нупфера в случае воздействия иикубата К7Э'ч,ч в тзчекие 12 часов эффект индукции TAT в icy ль-

туре гепатоцитоа не наблюдался (табл.7).

5. Изменение колзгсзства рецепторов к липопротеидам высокой и низкой ллсгности в гепатоцитах и клетках печеночного - -глнуеоида при стимуляции СЮ продигиозаном <, В нашей работе проводилось определение поглощения и связывания ЛПНП и ЛГШП гепатоцитами, резидентными макрофагами и эк-дотелиалхными клетками печени в норме и в условиях стимуляции CMS крыс продигиозаном за 1 и 3 суток до забоя. • - .

Показано, что при введении экспериментальных животным проди-гиозана количество рецепторов к ЛПНП и их аффинитет на гепатоцитах, • ьгахрофоиах и эндотелиальных клетках печени существенно не изменялись. Аффинитет рецепторов к ЛПВП на тех а® клетках в условиях стимуляции СМ® продигиозаном также не изменялся, однако значительно менялось число рецепторов (рис.2). Оно снижалось на клетках Купфера через сутки после введения продкгиозана и частично восстанавливалось к 3 суткам» что говорит об усиления рецепторно обусловленного зндоцитоза На гепатоцитах число рецепторов к ЖШП. напротив, незначительно увеличивалось на первш и существенно на третьи сутки после стимуляции СМ». В контексте предыдущих исследований мы рассматриваем этот факт как показатель усиления биосинтеза одного из белков (рецепторов) на фоне общего усиления биосинтеза белка в печени при стимуляции С1Й.

вывода

1. Цри стимуляции С1В продигиозаном у половозрелых животньхк '' увеличивается скорость биосинтеза белка в печени, почках, ти; кусе. селезенка, костном мозге, ьшцах, сердце, надпочечниках и ; ■ ееменнкках. а при введении животным полирибоната - только в ти' кусе, селезенке и костном мозге.

2. У стадии крас, в отличие от половозрелых, индукция би-¿сдатера белка при стимуляции С10 происходит только в ткани го-

i' /Лоансго мозга. и легких. У новорожденных крыс стимуляция СЮ не /' вызывает .увеличения скорости биосинтеза белка в органах, и тка-

ий-:' '- .

tt;>'";/...а, .Отймулядая резидентных макрофагов печени (клеток Купфера) - Я-зкстрансульфатоы приводят к индукции TAT в гепатоцитах, которое ■; ■; полностью снимается акншомищшом Д.

; , 4. Стимуляции Cüffi продигиозаном вызывает снижение коли-■ ; чества рецепторов к ЛПШ и ЛПНП в клетках Купфера. Напротив, в гепатоцитах количество рецепторов к ЛПШ гначительно возрастает. Связывание, мечэкш .ЛПШ! и ЛПШ эндотелиальными клетками' в этих :Усжваи ве изменяется. ' ~ J. Б. Усилена биосинтеза белка в паренхишшх клетках печени в условий стимуляции клеток Купфера продитиозйком обусловлено кооперативным зфБегаоьг ЛШ и глшзкортиковдов.

.. Л-У;, ¡у, j 1 ■Iii

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Panin L. Е., Usynin I. F. , Goriarheva И V.", Наг'kovsky А. V. The effect of stimulation of mononuclear phagocyte system of protein synthesis in organs and tissues// Mononuclear phagocyte system in normal and pathological states: Тез. докл. Всесоюз. конф. - Novosibirsk, 1990. - P. 103-104.

2. Пстеряева 0. H., Харьковский А. В. Влияние инсулина и гидрокортизона на синтез апопротеина A-I в культуре гепатоцитов Тез. дока. 52-й науч. конф. молодых ученых, -г Новосибирск, 1991. С. 37.

3. Усынин И. Ф., Харьковский А. Е , Горячева М В., Панин А Е. Влияние иымуномодуляторов бактериального происхождения на метаболизм в паренхимных клетках печени: Тез. докл. I съезда иммунологов России. - Новосибирск, 1992.- С. 492-493.

4. Харьковский А. Е , Усынин И.Ф., Панин JL Е. Влияние стимуляции системы мононуклеарных фагоцитов на биосинтез белка в органах и тканях крыс в онтогенезе // Закторы клеточного и гумог рального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. XI, научной конференции. - Челябинск. 1992.- С. 107-108.

5. Харьковский А. Е , Усынин JL Ф. , Панин JL Е. Влияние стимуляции системы мононуклеарных фагоцитов продигиозаном на физиологическую регенерации органов и тканей крыс в онтогенезе // Профилактика и экспериментальная терапия экстремальных и терминальных состояний: Тез. докл. научной конференции. - Омск, 1992. -С. 191-192

6. Усынин И. Ф., Панин JL Е., Трубицына 0. М., Харьковский А. Е , Третьякова Т. А. Влияние стимуляции системы мононуклеарных фагоцитов на связывание ЛПВП и ЛГШП гепагоцитами, клетками Купфера и эндотелиальными клетками // БЭБМ (принята к печати).

3ак//3 Тир.ТЭЭ -экэ .Печ.л.Т,5 ?ормат ClxcA/TC .Б/мага о^с . I.

Гип.СО РАМН.г.Новосибирск.Т993г.