Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль различных популяций клеток печени в метаболизме липопротеидов высокой плотности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль различных популяций клеток печени в метаболизме липопротеидов высокой плотности"

КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Огп

0 л

_ Па правах рукописи

ХУАНГ ВЭЙ

РОЛЬ 1'ЛЗЛИЧПЫХ ПОПУЛЯЦИЙ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ В МЕГЛБОЛИЗМЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ ВЫСОКОЙ плотности

03.00.04 - БИОХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

МОСКВА 1993

Работа выполнена п лаборатории культур клеток и Iканей Кардиологического научной) исчпра 1'ДМП

11аучный руковолнтель: кандидат биологических паук п. corp. Бочаров Л.)!. Научный консудьгаш доктор медицинских наук, член-корр. РАМП, профессор Репин Ii.C.

Официальные оицонецгы доктор медицинских наук, профессор Долгов В. В. ачктор мединских наук, ст. н. сотр. Гарховская Т.Н.

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ РФ

Защита состоится " 22 " декабря 1993 года в 11 часов на заседании специализированного ученого совета К 01)1.22.02 в Кардиологическом научном центре PAIV1I1 но адресу Москва, 3-я Черепковскаа улица, д. 15а, кор. 7

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кардиологического научного центра РАМН

Автореферат разослан " " ноября 1993 года

Ученый секретарь снециализиронанпого совета кандидат биологических наук

Лешерова Т.Н.

Актуальность темы. Многочисленные эпидемиологические клинические и экспериментальные данные указывают на существование корреляции между заболеваемостью и смертностью от сердечнососудистых заболеваний вследствии атеросклероза и распространенностью некоторых типов дислипопротеинимии (Никульева, 1980; Лопухин и др., 1983). Частота распространения и скорость развития атеросклероза коррелирует с так называемым индексом атерогенности: отношение холестерина липопротеидов низкой плотности (ЛГТМП) п лнпопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) к холестерину липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), или отношение апо-В/апоА (Gofman, 1966; Репин, 1987). Повышение уровня ЛПВП в плазме крови при приеме гиполиподемичсских лекарств рассматривается как наиболее надежный критерий эффективности фармакотерапии (Brewer, 1985; Репин, 1987). Однако механизм регуляции уровня ЛПВП в кровотоке плохо изучен и поэтому трудно однозначно объяснить антиатерогенное действие ЛПВП.

В настоящее время наиболее признанной является концепция обратного транспорта холестерина ( т.е. переноса его из периферических тканей в печень для экскреции, в котором ведущая роль принадлежит ЛПВП), впервые предложенная Glomset (1985). Именно способность "собирать" холестерин, этерифицировать его и превращать в формы, которые могут захватываться клетками печени и подвергаться в них дальнейшим превращениям, позволяют рассматривать ЛПВП как липопротсиды, препятствующие развитию гиперхолестеринимии. Теоретическая важность и актуальность изучения метаболизма ЛПВП в печени очевидна и вряд ли требует дополнительной аргументации.

В настоящее время рассматриваются три основные возможности доставки холестерина в печень для последующего окисления. 1- Так называемый селективный транспорт, в результате которого эфиры холестерина (ЭХ), находящиеся в составе ЛПВП, поступают в печень по градиенту концентрации вне зависимости от существования каких-либо рецепторных структур. 2 - Путь, обусловленный транслокацией ЭХ в обмен на жирные кислоты с ЛПВП на ЛПНП, с последующим захватом ЛПНП, обогащенных ЭХ, рецепторами ЛПНП (апо-Е/апо-В) печени. 3 - Рецепторный захват ЛПВП, обусловленный наличием соответствующих специфических белков па поверхности клеток печени. В последние годы появились многочисленные сообщения о наличии специфических мест связывания ("рецепторов") для ЛПВП с

!

молекулярном массой около 1 НЖд на поверхности многих типов клеток, включая клетки печени. Однако, по-индимому, эти рецепторы не играют существенной роли в процессах удаления холестерина из периферических тканей и последующей его доставки в печень.

Недавно Fidge с соавг., 1992, исследуя связывание ЛПВП в мембранной фракции печени,. выявил дополнительный компонент, связывающий ЛПВП с более высокой афиниостыо. Учитывая различия в метаболизме ЛПВП в культуре гепатоцитов и данные, полученные в опытах in vivo, мы предположили, что в непаренхималыюм компартменте печени локализованы "рецепторы", характеризующиеся более высокой афинностыо взаимодействия с ЛПВП и принимающие участие в метаболизме ЛПВП и холестерина в печени.

Цель и задачи исследования. ЦЕЛЬ:

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ РАЗЛИЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ В МЕТАБОЛИЗМЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ В ПЕЧЕНИ

ЗАДАЧИ:

1. ИЗУЧИТЬ ПАРАМЕТРЫ СВЯЗЫВАНИЯ ЛПВПЗ В КУЛЬТУРАХ ГЕПАТОЦИТОВ, КУПФЕРОВСКИХ И ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ.

2. ВЫЯВИТЬ РОЛЬ АПО-А1 И АПО-АП ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ ЛПВП С ЛПВП-СВЯЗЫВАЮЩИМИ МЕСТАМИ В КУЛЬТУРЕ ГЕПАТОЦИТОВ И ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ.

3. ИЗУЧИТЬ РЕГУЛЯЦИЮ ЭКСПРЕССИИ ЛПВП-СВЯЗЫВАЮ1ЦИХ МЕСТ В КУЛЬТУРЕ ГЕПАТОЦИТОВ И ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ДЕКСАМЕТАЗОНОМ, ЭСТРАДИОЛОМ И ХОЛЕСТЕРИНОМ ИЗ ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ.

4. ИЗУЧИТЬ РОЛЬ ЛПВП-СВЯЗЫВАЮ1ЦИХ МЕСТ, ЛОКАЛИЗОВАННЫХ НА РАЗЛИЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ В МЕТАБОЛИЗМЕ ЛПВП ПЕЧЕНЫО.

Научная новизна. На основании исследований, проведенных в культуре эндотслиальных клеток печени, впервые показано наличие высокоаффинных ЛПВП связывающих мест, локализованных на эндотелии печени. Высокоафинное связывание (Р2) выявлено только па поверхности эндотслиальных клеток печени и не обнаружено на других

типах клеток, включая гспатоциты, купфферовские клетки, фибробласты кожи человека. Обнаружены различия в механизме регуляции экспрессии Р2 и известных ранее ЛПВП-рецепторов с Кд=20 мкг/мл (в дальнейшем называемых Р1). Так, дексаметазон дозозавнеимо и обратимо увеличивал концентрацию Р1 независимо от внутриклеточного содержания de novo синтезируемого холестерина, тогда как не влиял на количество Р2. Нагрузка клеток холестерином ЛПНП сопровождалась увеличением количества Р2 и не влияла на Р1. Впервые показано, что взаимодействие ЛПВП с эндотелиальными клетками печени приводит к ускоренному метаболизму частиц ЛПВП гепатоцитами.

Практическая ценность работы. Полученная культура эндотелиальных клеток печени может быть использована в качестве модельной системы для изучения молекулярных и клеточнх механизмов липидного обмена. Полученные данные о влиянии гормонов на экспрессию ЛПВП- связывакмцх мест могут служить основой для разработки новых методов и подходов при изучении роли эндокринных факторов в развитии атеросклеротических поражений организма. Апробация работы. Результаты работы доложены на межлабораторном семинаре в Кардиологическом научном центре РАМН, а также на 62 симпозиуме Европейского общества по изучению атеросклероза ( Иерусалим, 1993).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на страницах

машинописного текста, содержит таблиц и рисунков. Список литературы включает

источников, из которых отечественных и иностранных

авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на самцах и самках крыс линии Wistar, содержавшихся на стандартной лабораторной диете. Исследовались также адреналэктомированные (за 14-16 дней до опыта) животные. При глюкокортикодной терапии дексаметазон (50 мкг на ЮОг веса животного/0.4 мл прониленгликоля) вводили внутримышечно в течение

грех дней. Лииопротспдм получали препаративным ультрацентрифугированием из плазмы здоровых доноров (Lindgren, 1975). Чистоту фракции ЛПВПЗ оценивали электрофоретическнм анализом в 10% полиакрилампдном геле (ПААГ Bio-Red) с последующей окраской кумасси голубым и лазерным сканированием окрашенного геля. Меченис 125-1-ЛПВП проводили по методу (McFarlane, 1958). Выделение и культивирование гепатоцитов. Выделение гепатоцитов крысы проводили, используя процедуру двухэтаппой перфузии печени раствором коллагеиазы. Печень промывали in situ раствором Хэнкса со скоростью 40 мл/мин в течение 10- 12 минут. Печень по окончанию промывания переносили в установку для реперфузии 0.05% раствором коллагеиазы, приготовленном на растворе Хэнкса и содержащем дополнительно 5 мМ СаС12 и 50 мМ HEPES. Ферментативная обработка печени протекала в течение 15-20 минут при температуре перфузионного раствора 37°С и рН 7.5. Затем печень помещали в 20-30 мл охлажденного до 6-8°С раствора Хэнкса. Для выделения гепатоцитов суспензию полученных клеток трижды промывали 30-50 мл раствора Хэнкса, подвергая их процедуре дифференциального центрифугирования при 50g в течение 3-х минут. Жизнеспособность выделенных гепатоцитов оценивалась при помощи окрашивания 0.2% раствором трипанового голубого и составляла не менее 85-90%. Полученные гепатоциты разводились в необходимых соотношениях в базалыюй среде, состоящей из William's Е с добавкой инсулина (8 мкг/мл) и дексаметазона (10~5 М). Для культивирования клеток использовали культуральпую пластиковую посуду фирмы Costar, предварительно покрытую коллагеном. Суспензию клеток (из расчета Ю^/см^ поверхности) вносили в культуральпую посуду и помещали в С02-ипкубатор. Через 2-3 часа нсссвшис клетки удаляли промыванием поверхности раствором Хэнкса и вносили необходимое количество свежей базалыюй среды. В ряде опытов клетки культивировали в отсутствии или присутствии различных концентраций дексаметазона (10"9;\1 -10"5¡VI). Кроме того, в соответствующих экспериментах гепатоциты культивировали в присутствии эстрадиолоа (Ю'^М), холестерина в составе ЛПНП (50 мкг/мл), циклогексимида (0.5мМ), ловастатина (10 мкг/мл).

Выделение и культивирование эидотелиальных и купферовских клеток печени. Для выделения эидотелиальных и купферовских клеток к содержащей нспаренхимальные клетки печени надосадочной жидкости,

полученной при центрифугировании исходной суспензии клеток печени, добавляли 1мл 1% раствора протаминсульфата на 200 мл надосадочной жидкости для предотвращения агрегации клеток. Полученную суспензию иепаренхимальных клеток печени (НКП) дважды центрифугировали в растворе Хэнкса при 250g в течение 2-х минут для удаления разрушенных клеток. Осадок, содержащий НПКП, небольшую примесь гепатоцитов и эритроцитов, ресуспендировали в Хэнксе и центрифугировали в градиенте плотности метризамида (конечная концентрация 17.5%) при 400g в течение 20 минут. Затем флотирующую фракцию, содержащую НКП, отбирали и отмывали от метризамида в расторе Хэнкса при 250g 2 минуты. Жизнеспособность клеток, определяемая по окраске трипановым голубым, составляла не менее 95%.

Для разделения НКП на эндотелиальные и купферовские, и получения соответствующих культур, использовали метод селективной адгезии на пластике (Petroft, 1986). Дня получения коифлюэнтного мопослоя эндотелиальных и купферовских клеток, соответствующие суспензии вносились в культуральную посуду из расчета 2*11)5 эндотелиальных клеток на см^ поверхности и 3* 10^ НПКП на см2 поверхности. Клетки помещались в С02- инкубатор и через 2-3 часа менялась среда. В ряде опытов клетки культивировали в отсутствии или присутствии различных концентраций дексаметазона (Ю'^М -10"^М). Кроме того, в соответствующих экспериментах эндотелиальные клетки культивировали в присутствии эстрадиола (10~5 М) и холестерина в составе ЛПНП (50 мкг/мл).

Посадка и культивирование фибробластов из кожи человека и эндотелиальных клеток из пупочной вены человека. Клетки человека, любезно предоставленные доктором Ю.А. Романоым (лаб. культуры клеток и тканей, КНЦ РАМН), сажали в среде William's, содержащей 10 мкг/мл инсулина и 10% феталыюй сыворотки теленка, в культуральную посуду, покрытую коллагеном. Через 6 часов среду меняли на свежую. Через 72 часа клетки доростали до коифлюэнтного монослоя, их промывали теплым Хэнксом и меняли среду на среду William's, содержащую дексаметазон 10"^ М и инсулин 10 мкг/мл. Через 24 часа клетки использовали в эксперименте. Определение специфического связывания и интериализации 125-1-J1ПВ113 в культуре клеток.

Hjin определения связывании и интернализации но фиксированно» добавке меченого лигапда, клетки культивировали в течение 24-48 часов в 12-луночных планшетах. Перед экспериментом клетки промывали раствором Хэнкса и вносили среду, содержащую 10мкг/мл 125-1-ЛПВПЗ и БСА- 20 мг/мл в присутствии или отсутствии 20-кратного избытка немеченного лиганда. Клетки инкубировали в течение 2-х часов при Т=37°С, затем планшеты помещали на лед для определения деградации меченого лиганда. После этого клетки трижды отмывались охлажденным Хэнксом. После промывки клетки инкубировали 30 минут в среде, содержащей 100 мкг/мл диспазы и такое же количество протеазы при +4°С, при этом клетки сохраняли жизнеспособность и оставались прикрепленный к субстрату. По истечении времени инкубации раствор отбирали в счетные пробирки и определяли радиоактивность на гамма-счетчике (Compugamma, LKB). Специфическое связыване оценивали как разность радиоактивности в присутствии (отсутствии) 20-ти кратного избытка немеченого лиганда. Для определения интернализации лиганда, клетки соскабливали с подложки и определяли радиоактивность, аналогично описанному выше. Специфическую интернализацию определяли как разность радиоактивности в присутстии и отсуттии избытка немеченого лиганда. Данные представляли в нг спеифически вязанного лиганда на мг клеточного белка.

Определение параметров специфического связывания меченных ЛПВПЗ { Кд и 14) в культуре клеток.Константы диссоциации (Кд) и количество мест связывания (N) ЛПВПЗ определяли при 4° С (для предотвращения интернализации лиганда) и 37" С. Клетки инкубировали с меченым и немеченым (от 1 до 30 мкг/мл) лигандом. Количество специфически связавшегося лиганда определяли, как описано выше. Полученные результаты анализировали методом Скетчарда.

Определение деградации 125-1-ЛПВПЗ. Для определения деградации, в среда, собранные после завершения инкубации клеток с лигандом, добавляли ТХУ (конечая концентрация 10%) и инкубировали 10 mihi. при Т=56° С. Преципитат удаляли центрифугированием при 10000g« 10 минут. Для окисления свободного иода к супернатанту добавляли К1 (конечная концентрация 0.4%) и перекись водорода (конечная концентрация 1%). Пробы перемешивали и инкубировали при комнатной температуре 5-10 минут. Свободный иод экстрагировали хлороформом

15 минут. Количество деградировавших 1251-ЛПВП определяли, просчитыая радиоактивность в волной фазе. Получение биологически "модифицированных" 125-1-ЛПВП. Эпдотелиальные клетки культивировали в базальной среде, дополнительно содержащей 15 мкг/мл меченых ЛПВПЗ в нрисугствии или отсутствии избытка немеченого лиганда. Кондииионироваипую среду отбирали, стерилизовали фильтраций (0.22 мкм, "МПНрогс") и концентрировали на фильтре (50 КБ, Апнсоп МХ-50).

Исследование параметров связывания "модифицированных" ЛПВП с гепатоцитами проводили аналогично описанному выше. Электрофоретический анализ биологически "модифиироанных" ЛПВП. Эпдотелиальные клетки инкубировали в среде, дополнительно содержащей 15 мкг/мл 125-1-ЛПВПЗ и 20 мг/мл БСА. Инкубацию меченых ЛПВП проводили присутствии (отсутствии) избытка немеченых ЛПВП. По истечении времени инкубации клетки промывали, вносили свежую среду, не содержащую ЛПВП (в ряде экспериментов среда содержала 100 мкг на мл немеченых ЛПВП). Клетки культивировали 3 часа, затем центрифугировали (2000д X 10 мин.), к супернатанту добавляли ЮОмкг БСА и ТХУ (конечная концентрация 10%). Смесь перемешивали и инкубировали 30 мин. при Т=5б° С, затем образцы центрифугировали (10000 X ЗОмин.). Супернатант, содержащий ТХУ- растворимые продукты, удаляли, осадок промывали ледяным ацетоном, высушивали и вносили буфер образца для электрофореза. Электрофорез проводили в градиентном (5-23%) ПААГ в денатурирующих условиях в трис-глициновой буферной системе (ЬаеттМ, 1973).

Статистический анализ полученных результатов проводили методом Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика рецепторов к ЛПВП в культуре клеток

Рецспторнме структуры, связывающие апо-А содержащие липопротеиды, были выявлены и охарактеризованы на поверхности клеток из периферических тканей и гепатоцитов. Скетчардовские кривые, характеризующие связывание ЛПВП с этими типами клеток, удовлетворяют критериям однокомпонентного связывания, характеризующего присутствие одного типа рекепторнмх структур. Однако ЕП)СЕ с соавторами обнаружил, что снизывание ЛПВП в

мембранном фракции печени крыс удовлетворяет критериям двух-компопеитпого лиганд-рецепториого взаимодействия, что указывает на присутствие двух типов ЛПВП-связывающих мест в печени. Так как ранее не было показано наличие двух типов рецепторов для ЛПВП па генатоцнтах, мы предположили, что наличие дополнительного компонента на скетчардовской кривой обусловлено присутствием дополнительного рецептора на одной из фракций непаренхимальных клеток печени.

В этой связи мы провели скетчардовскин анализ связывания ЛПВПЗ не содержащих апо-Е аполипопротеида, в культурах гепатоцитов, эндотелиальиых и купферовских клеток печени.

4 т

С

ш с: с: ш л I X

со м о; ш о

со о

т~

X

0 12

1

а о ю о аз о

5 10 15 20 25 связанные ЛПВП (нг)

Рис.1. Скстчардовский анализ связывания ЛПВП в культурах гепатоцитов, купферовских и эндотелиальиых клеток печени. ♦-Эндотелиальные клетки печени, □ - гепатоциты, купферовские клетки печени

ЛПВП- связывающие места со сходной аффинностью присутствовали на всех клетках печени (Р1)- Кд=20 мкг/мл. Скстчардовская кривая связывания ЛПВП в культуре эндотелиальиых клеток указывала па присутствии второго более аффинного рецептора(Р2) с Кд=4 мкг/мл. Важно, что парралельные эксперименты на культурах клеток из

перефирических тканей показали, что на них присутствуют только Р1 и не представлены Р2.

ТАБЛИЦА 1. ПАРАМЕТРЫ СВЯЗЫВАНИЯ 1251-ЛПВП В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК (М+т)

параметры связывания лпвп Кд1 мкг/мл N1 нг/мг Кд2 мкг/мл N2 нг/мг

гепатоциты 20.3+3.1 112+12 - -

купферовские клетки печени 21.1+2.6 875+143 - -

эндотелиальные клетки печени 20.2+1.4 450+57 3.8+0.5 250+17

фибробласты кожи человека 20.4+2.1 215+45' - -

эндотелиальные клетки из пупочной вены человека 20.8+1.4 105+21 - -

Это хорошо согласуется с литературными данными, по называющими, что связывание ЛПВП в клетках из переферических тканей соответствует однокомпонентной скетчардовской кривой с Кд 20-40 мкг/мл. Тот факт, что эндотелиальные клетки сосудов не содержали Р2 указывают на органную специфичность данного рецептора. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что связывание ЛПВП в печени опосредуется двумя рецепторными структурами с различными параметрами связывания, что отличается от переферических тканей, где связывание опосредуется одним типом рецепторов.

Изучение роли апо-АТ и апо-АН аполипопротеидов в связывании ЛПВП ПиР2

В следующей серии экспериментов мы попытались охарактеризовать роль аполипопротеидов апо-А1 и апо-АП в связывании ЛПВП с 1*1 и Р2 рецепторами в культурах гепатоцпгов и зндотелнальных клеток печени.

Был проведен скетчардовский анализ спязыиапня ЛПВПЗ, содержащих преимущественно апо-А1 (до 95%) и ЛПВП, содержащие около 70% ано-ЛП п около 30% апо-АП.

СГ

ш с

О

г

X

сз

(О о; со о

со

I

о 1— X

о л X ЕС

о ю о

03

о

10 20 связанные ППВП (нг)

Рис. 2. Скетчардовский анализ связывания ЛПВП в культуре эндотелиальных клеток печени. □- ЛПВП, содержащие апо-А1; 0 ■ ЛПВП, содержащие апо-АП.

С" ш о

С X

о £ — л

га

(О к

03

о

ю о со о

10 15 20 25 связанные ЛПВП (нг)

Рис. 3. Скетчардовский анализ связывания ЛПВП в культуре гепатоцитов.

□- ЛПВП, содержащие апо-А1; 0 - ЛПВП, содержащие апо-АП.

Липопротеиды высокой плотности, содержащие в основном только аполииоиротеид апо-А!, связывались обоими типами клеток с Р1 рецептором,' так как в обоих культурах константа диссоциации, определяемая но скетчардовской кривой, составляла около 20 мкг/мл. ЛПВП, которые содержали оба типа агго-А аполипоиротеидов, взаимодействовали с Р1 и Р2 ЛПВП-рецепторамн в культуре эндотелиальных клеток печени и связывались с Р1 рецептором в культуре гепатоцитов. Количество мест связывания для Р1 в обоих культурах было выше при использовании в качестве лиганда апо-А1/АП содержащие ЛПВП. То есть данные результаты позволяют предположить, что Р1 рецептор связывает оба типа аполипопротелдов, в то время как Р2 рецептор принимает участие в связывании только апо-АП аполипопротеида.

В лияние дексаметазона па экспрессию Р1 и Р2

В следующей серии экспериментов мы охарактеризовали эффекты дексаметазона (синтетического аналога глюкокортикоидов), эстрадиола и влияние нагрузки клеток холестеринном из ЛПНП на экспрессию Р1 и Р2 связывающих мест в культуре гепатоцитов и эндотелиальных клеток печени (Таб.2).

Таблица 2. ВЛИЯНИЕ ДЕКСАМЕТАЗОНА НА ЭКСПРЕССИЮ Р1 И Р2 ЛПВП-СВЯЗЫВАЮЩИХ МЕСТ В КУЛЬТУРЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ И ГЕПАТОЦИТОВ (М+т)

параметры связывания ЛПВП Кд1 мкг/мл N1 нг/мг Кд2 мкг/мл N2 нг/мг

гепатоциты в присутствии дексаметазона (10-7М) 20.3+3.1 112+12 - -

гепатоциты в отсутствии дексаметазона 20.9+2.8 42+14 - -

эндотелиальные клетки печени в присутствии дексаметазона (10-7М) 20.2+1.4 450+57 3.8+0.5 250+17

эндотелиальные. клетки печени в ' отсутствии дексаметазона 20.4+2.8 N0 4.2+1.1 235+52

Дексаметазоп в физиологической концентрации увеличивал количество Р1 в обоих типах клеток. В гепатоцитах наблюдалось трех кратное увеличение количества мест связывания с 40 до 115 нг/мг клеточного белка. В культуре зндотелиальных клеток печени Р1 не определялись, однако при культивировании клеток в присутствии гормона количество Р1 составляло 450 нг/мг клеточного белка. Гормон не оказывал влияния на количество Р2. В культуре гепатоцитов Р2 не выявлялся.

Влияние эстрадиола на экспрессию Р 1 н Р2

В связи с тем, что дексаметазоп оказался позитивным индуктором Р1 в обоих культурах, последующие эксперименты по влиянию эстрадиола и холестерина из ЛПВП проводились на фоне присутствия гормона.

Таблица 3. Влияние эстрадиола на экспрессию ЛПВП-связывающих мест в культуре гепатоцитов и зндотелиальных клеток печени.

параметры связывания лпвп Кд1 мкг/мл N1 пг/мг Кд2 мкг/мл N2 пг/мг

гепатоциты в присутствии эстрадиола и дексаметазона (10-7М) 22.5+3.1 65+21 - -

гепатоциты в присутствии дексаметазона (10-7М) и в отсутствии эстрадиола 20.9+2.8 115+14 - -

эндотелиальные клетки печени в присутствии эстрадиола и дексаметазона (10-7М) 20.2+1.4 350 + 111 3.8+0.5 £50+17

эндотелиальные клетки печени в присутствии дексаметазона (Ю-7М) и в отсутствии эстрадиола 20.4+2.8 427 +12 4.2+1.1 235+52

В этих условиях эстрадиол в физиологической концентрации вызывал увеличение количества Р2 в культуре эндотелия печени с 245 до 765 нг/мг клеточного белка и достоверно, в два раза, снижал количество Р1 в культуре гепатоцитов. Существенного влияния на Р1 в культуре эндотелиальных клеток печени установить не удалось.

Таким образом, можно предположить, что гормоны, по-разному влияющие на Р1 и Р2 действительно регулируют разные рецепторные структуры. Не менее важным представляется эффект нагрузки клеток холестерином из ЛПНП, который, как сообщалось ранее, сопровождался увеличением количества ЛПВП-связывающих мест на клетках из периферических тканей и не оказывал влияния на ЛПВП-связывающие места в культуре паренхимальных клеток печени. Мы охарактеризовали влияние холестерина из ЛПНП на экспрессию Р1 и Р2 в культурах гепатоцитов и эндотелиальных клеток печени. Влияние нагрузки клеток холестерином из ЛПНП на экспрессию Р1 и Р2

В следующей серии экспериментов клетки культивировали в присутствии дексаметазона и ЛПНП в концентрации 50 мкг/мл. Нагрузка клеток холестерином не приводила к достоверным изменениям уровня Р1 в обоих типах клеток. В тоже время наблюдалось двухкратное увеличение количества Р2 в культуре эндотелиальных клеток печени. Р2 в культуре гепатоцитов ие выявлялся (Таб.4). Таблица 4.

ВЛИЯНИЕ ПРЕДИНКУБАЦИИ КЛЕТОК С ЛПНП НА ЭКСПРЕССИЮ Р1 И Р2 ЛПВП-СВЯЗЫВАЮЩИХ МЕСТ В КУЛЬТУРЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ И ГЕПАТОЦИТОВ (М+ш)

параметры связывания JIIMIII Кд1 мкг/мл N1 нг/мг Кл2 мкг/мл N2 нг/мг

генатоциты нредипкубиропанпые и присутствии ЛПНП (50мкг/мл) и лсксамстазопа (10-7М) 22.5+3.1 120+21 - -

гсиятоциты в присутствии дсксамстазона (10-7М) и в отсутствии ЛПНП 20.9+2.8 115+14 - -

параметры С11ЯЗМ1Ш1ИН ЛИ 1111 Кд1 мкг/мл N1 пг/мг Кд2 мкг/мл N2 Ш'/мг

эцдотслиальпыс клетки печени нредипкубированпые в нрисут-ствии Л111111 (50мк|/мл) и дексамстазона (10-7М) 20.2+1.4 450+57 З.Х+0.5 976+97

эилогслиальнмс клетки печени и присутствии дексамстазона (10-7М) и и отсутствии ЛIII111 20.4+2.8 579+230 4.2+1.1 245+57

Биологическая модификация ЛПБП клетками эндотелия печени Роль ЛПВП-связывающих мест, сходных по параметрам связывания с Р1, была изучена ранее в культурах клеток из переферических тканей и гепатоцитов. Поэтому, мы попытались изучить роль Р2.

•н лпвп

Ацлпвп

60 т

О 50 100 150 200 250 300

время (мин)

Рис. 4. Связывание нативных и биологически модифицированных ЛПВП в культуре гепатоцитов.

Для этого мы изучили метаболизм нативных и прединкубированных с эндотелием печени ЛПВП в культуре гепатоцитов. Далее мы будем

называть ЛПВП, нрединкубированные с эндотелиальными клетками печени, биологически модифицированными ЛПВП. ЛПВП, содержащие оба аполипопротеида апо-Л, инкубировали с культурой эндотелиальных клеток в отсутствии гормональных добавок. Необходимо подчеркнутьб что в этих условиях культивирования эндотелиальные клетки содержали только Р2. Таким образом мы изучали роль Р2- зависимого процессинга ЛПВП.

Гепатоциты специфически связывали в два раза больше модифицированных ЛПВП по сравнению с нативными ЛПВП(Рис.4). Скорость иитернализации модифицированных ЛПВП также значительно превышала скорость иитернализации нативных (Рис.5). То есть гепатоциты демонстрировали значительное увеличение захвата ЛПВП после того как липопротеиды, повидимому, подвергались Р2-ЛПВП зависимому процессингу эндотелиальными клетками печени.

•нЛПВП

Ж" лпвп

50 100 150 200 250 300

время (мин)

Рис. 5. Интернализация нативных и биологически модифицированных ЛII15 Г1 в культуре гепатоцитов.

Увеличение скорости связывания и иитернализации модифицированных ЛПВП сопровождалось увеличением скорости деградации аполипопротеидов, оцениваемой по увеличению количества

ТХУ растворимой радиоактивности после инкубации ЛПВП с гспатоцитами.

Скорость деградации нативных ЛПВП составляла около 7 нг ЛПВП/час/миллион гепатоцитов. Для модифицированного лиганда скорость деградации составляла около 45 нг на миллион клеток в час.

Таким образом, взаимодействие ЛПВП с эндотелиальными клетками печени (вероятно, опосредованное Р2) сопровождалось изменением биологических свойств ЛПВП, что приводило к значительному увеличению скорости процессинга модифицированных ЛПВП в гепатоцитах, сопровождаемой деградацией аполипопротеидов частиц. Наблюдаемое увеличение скорости метаболизма и деградации модифицированных ЛПВП в культуре гепатоцитов сопровождалось так же изменением параметров связывания модифицированных ЛПВП в культуре гепатоцитов.

4 т

С

ш с с

О)

15 х

X (О

«о в; ш о

со

I

о

т—

X

о

з

X

а. о ю о

ей о

2 -

1 -

5 10 15

связанные ЛПВП (нг)

20

Рис. 6. Скетчардовский анализ связывания нативных (♦) и биологически модифицированных (О ) ЛПВП в культуре гепатоцитов. Анализ экспериментальных данных методом Скетчарда показал, что после модификации ЛПВП частицы связывались с большей около 5-8 мкг/мл константой диссоциации с гспатоцитами (Рис.6). Для этих частиц определялось несколько большее количество мест связывания.

Представленные результаты позволяют сделать следующие выводы.

ВЫВОДЫ:

1. Выявлены два типа ЛППП-связываюпшх мест на поверхности эндотелнальных клеток печени. Р1 с Кд=20 мкг/мл и Р2 с Кд=4 мкг/мл.

2. Р1 выявлены на всех изученных культурах клеток (гепатоцитм, купферовские клетки печени, эндотелиальные клетки печени, фибробласты кожи человека, эндотелиальные клетки пупочной вены человека), тогда как Р2 присутствовали на поверхности только эндотелнальных клеток печени.

3. Физиологические регуляторы оказывали различное влияние на количество мест связывания для ЛПВП Р1 и Р2.

ДЕКСАМЕТАЗОН дозозависимо и обратимо увеличивал количество Р1 и не влиял на количество Р2.

ЭСТРАДИОЛ увеличивал количество Р2 и снижал количество Pl. НАГРУЗКА КЛЕТОК ЛПНП ХОЛЕСТЕРИНОМ сопровождалась увеличением количества Р2 и не оказывала влияния на количество Pl.

4. Связывание ЛПВП с Р1 опосредовалось апо липопротеидамп апо-АГ и апо-АП, тогда как связывание с Р2 выявлялось только при наличии апо-АН в составе ЛПВП.

5. Р2-зависимый процессинг ЛПВП в культуре эндотелнальных клеток печени сопровождался изменением метаболизма ЛПВП в гепатоцитах.

Ресектеритуемые ЛПВП в 2 раза более эффективно связывались и интернализовались в культуре гепатоцитов.

Скорость деградациии ресекретируемых ЛПВП увеличивалась в 5 раз по сравнению с нативными ЛПВП.

Связывание ресекретируемых ЛПВП с гепатоцитами характеризовалось Кд=8 мкг/мл.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Modification of high density lipoprotein by rat liver endothelial cells. Evidence for two pathways of HDL metabolism in the rat liver // 62nd EAS congress.-Jerusalem, Israel.-1993.Abstract.- P. 18.- в соавт. с Бочаровым А.В., Свиридовым Д.Д., Вишняковой Т.Г.

2. Glucocrticoid-dcpendent regulation of high density lipiprotein binding to cultured hepatocytcs // 62nd EAS congress.-Jerusalem, Israel.-1993.Abstract.- P. 12,- в соавт. с Бочаровым А. В., Свиридовым Д.Д., Вишняковой Т.Г.

3. Characterization of HDL-binding sites on hepatocytes, liver endothelial and Kupfler cells// 62nd EAS congress.-Jerusalem, Israel.-1993. Abstract.-P.12.- в соавт. с Бочаровым А.В., Свиридовым Д.Д., Вишняковой Т.Г., Репиным B.C.

4. Глюкокортикоид-зависимая регуляция экспрессии связывающих мест для липопротсидов высокой плотности в гепатоцитах крыс // Бюл. экспер. биологии и медицины,-1994- N 1-в печати

5. Влияние дексаметазона на экспрессию мест связывания липопротсидов высокой плотпости в культуре гепатоцитов крысы. Независимость эффекта гормона от внутриклеточного пула холестерина // Бюл. экспер. биологии и медицины.-1994- N 1- в печати

6. Характеристика связывающих мест для ЛПВП в культурах паренхимальных, эндотелиальных и купферовских клеток печени крыс // Бюл. экспер. биологии и медицины.-1994- N 2- в печати