Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние обусловливающих факторов на гормональную регуляцию ключевых ферментов глюконеогенеза при стрессе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние обусловливающих факторов на гормональную регуляцию ключевых ферментов глюконеогенеза при стрессе"

АКАДЕМИЯ МВДИЩНСКИХ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИШТИТУТ БИОХИШИ

На правах рукописи

КОЛОСОВА Ирина Евстафьевна

НПИЯНИЕ ОБУСЯОЙ1ИЙАЩИХ ФАКТОРОВ НА ГОРг-ЮНАЛЬНУЮ 3ЕГУЛЯЩЮ КЛЮЧЕ ШХ ФЕРМЕНТОВ ГЛЮК0НЕ0ГЕНЕЗА ПРИ СТРЕССЕ

03.00.04 - биохимия

Автореферат

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск-1991

Работа выполнена в лаборатории биохимии питания Институт биохимии Сибирского отделения АШ СССР.

Научный руководитель

Официальные оппоненты -

Ведущая организация

член-корреспондент АМН СССР, профессор ПАНИН Л.Е.

доктор биологических наук, Мошкин М.П.

кандидат биологических наук, Гришанова А.Ю.

Институт питания АМН СССР.

Защита состоится " " _ 1991 года в

_ часов на заседании специализированного совета

К 001.37.01 в Институте биохимии СО АШ СССР по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт биохимии СО АШ СССР.

Автореферат разослан " " _ 1990 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук

■'¿и с 1С е

Филатова Т.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поддержание здоровья и работоспособности человека невозможно без создания комплекса профилактических мер, опирающихся на знание закономерностей процессов адаптации. Б основе первичной профилактики должно находиться рациональное питание, как одно из наиболее физиологичных средств, влияющих на адаптивные возможности организма. Однако проблема создания научно-обоснованных рационов до сих пор не является полностью решенной (Панин Л.Е., 1987; Волгарев М.Н. и др., 1989; Гаппаров М.М., 1989; Мс Cormic , 1989). Невозможно рекомендовать наиболее адекватный тип питания, основываясь только на таких традиционных критериях, как возраст, пол человека, его энергозатраты в связи с производственной деятельностью (Конышев fl.А., 1985). Следует учитывать влияние конкретных климато-географических условий проживания человека и тип обмена, складывающихся под действием этих условий (Панин Л.Е., 1987). В то же время исследования, посвященные сравнительному изучению качественно различных рационов питания на эндок-ринно-метаболическое состояние здорового человека, проживающего на Крайнем Севере, практически отсутствуют.

Обмен веществ в организме во многом определяется характером питания (Панин Л.Е., 1978; Гаппаров М.М. и др., 1987; Okitolonda, 1988). Питание, выступая в качестве внешнего "обусловливающего" фактора (Селье Г., 1972), может изменять ответ организма на различные экстремальные воздействия (Волгарев М.Н. и др., 1988; Park et ai . 1986). В процессе адаптации происходит сложная перестройка биорегуляции, направленная на восстановление и поддержание го-меостаза. Важная роль в энергообеспечении организма и поддержании нормогликемии принадлежит глюконеогенезу.

Данные о влиянии алиментарных факторов на активность ключевых ферментов биосинтеза глюкозы - ФЕПКК, ФДФазы и Г-б-Фазы - немногочисленны и фрагментарны. Не изучено влияние стресса, в частности интенсивной физической нагрузки, на активность этих ферментов у крыс, получавших различные диеты. Неизвестны механизмы повышения активности ФЕПКК в ответ на мышечную деятельность.

Превращаясь из внешнего фактора во внутренний, пища способна влиять на обмен веществ через субстратное или эндокринное звено регуляции. В этом отношении большой интерес, как внутренние "обусловливающие" факторы, представляют такие соединения, как глюкоза и липопротеиды. В настоящее время установлено, что липопротеиды

участвуют в регуляции различных внутриклеточных процессов (Панин Л.Е., 1983; Attic et al , 1981; Chiselli et al , 1981). Показано существование кооперативного эффекта адаптивных гормонов и липопротеидов (Панин Д.Е., Ыаянская Н.Н., 1987). Однако роль липопротеидов и их взаимодействие с гормонами в регуляции активности ферментов ГНГ не изучена.

Функциональное состояние системы мононуклеарных фагоцитов также может выступать в качестве внутреннего "обусловливающего" фактора. Известно, что предварительная стимуляция CMS значительно повышает неспецифическую резистентность организма к экстремальным факторам (Ермольева З.В., Вайсберг Г.Е., 1976; Маянский Д.Н., 1983; Altura , 1980). Сведения о зависимости интенсивности ГНГ от состояния СШ малочисленны и противоречивы ( Веггу, Shackieford , 1984; Knowl et al , 1987). Неизвестно влияние стимуляции СШ на активность ферментов ГНГ в тканях животных, выполняющих физическую нагрузку.

Универсальными внутриклеточными посредниками действия гормонов являются циклические нуклеотиды, однако механизмы регуляции их содержания в клетке весьма сложны и до сих пор полностью не ясны. Не исследовано влияние липопротеидов и их совместного действия с гормонами на содержание цА№ и цГШ.

Выяснение механизмов регуляции активности ключевых ферментов глюконеогенеза и содержания циклических нуклеотидов в тканях не только углубит наши недостаточные знания в этой области, но и позволит выявить пути направленной коррекции метаболизма в условиях стресса. Рациональное питание является одним из таких наиболее перспективных направлений.

Цель исследования. Изучить роль обусловливающих факторов в изменении эндокринно-метаболических взаимоотношений и активности ключевых ферментов глюконеогенеза в организме в условиях стресса. Часть исследований провести на людях, часть - в эксперименте на животных.

Для достижения поставленной цели решить следующие задачи:

1. Изучить изменение эндокринного фона и содержания ряда метаболитов в крови людей, получавших качественно различные рационы питания на Крайнем Севере. Оценить роль внешнего обусловливающего фактора (питание) в поддержании нормогликемии в условиях экологического напряжения.

2. Выяснить особенности и закономерности влияния алиментар-

них факторов на активность ферментов глюконеогенеза в печени и почках крыс в состоянии физиологического покоя и при интенсивной физической нагрузке.

3. Раскрыть основные механизмы изменения активности ФЕПКК в печени крыс в ответ на физическую нагрузку и в динамике восстановительного периода после нее.

4. Изучить влияние некоторых гормонов, участвующих в адаптации организма к действию экстремальных факторов, а также кооперативного эффекта гормонов и сывороточных липопротеидов, на активность ФЕПКК в переживающих срезах печени и почек крыс.

5. Оценить роль циклических нуклеотидов и сывороточных липопротеидов (внутренний обусловливающий фактор) как посредников в механизме действия адаптивных гормонов на процессы ГНГ в опытах in vitro.

6. Показать, что возможным звеном в сопряжении внешнего (питание) и внутреннего (липопротеиды и гормоны) факторов может быть система мононуклеарных фагоцитов.

Научная новизна. Показано, что питание играет роль внешнего обусловливающего фактора, оказывающего большое влияние на эвдок-ринно-метаболические взаимоотношения у человека, проживающего в условиях Крайнего Севера. Замена части углеводов в рационе на белки и жиры приводила к снижению кортизола, инсулина и общих ли-пидов в сыворотке крови, тогда как содержание АКГГ, общего белка, суммарной фракции ЛПОШ и ЛПНП повышалось. Содержание глюкозы в крови при этом практически не изменялось. Полученные результаты позволили обосновать оптимальное соотношение основных нутриентов в рационах человека на Севере.

Впервые проведено комплексное изучение влияния алиментарных факторов на активность ключевых ферментов ГНГ в печени и почках крыс в состоянии физиологического покоя и при физической нагрузке. Установлено, что содержание крыс на белкоЕо-липидном рационе приводило к значительному повышению активности ФЕПКК в печени, а преобладание в пище углеводов вызывало обратный эффект. Ответ ГНГ на физнагруз!усвязан, преимущественно,'с активацией ФЕПКК в печени и зависел от характера питания животных.

Впервые установлено, что ответ ключевых ферментов ГНГ на интенсивную физическую нагрузку зависит от состояния системы мононуклеарных фагоцитов. Предварительная стимуляция СМ5 продигиоза-ном усиливала активацию ФЕПКК и TAT в печени в ответ на плавание. Важная роль в индукции ФЕПКК принадлежит активации лизосомального

аппарата клетки.

ß опытах in vitro показано, что повышение активности TAT в срезах печени крыс в ответ на совместное действие адреналина, гидрокортизона и продигиозана происходило только при добавлении ЛПОШ, ЛПНП или ЛПШ в среду инкубации. Повышение активности ФЫ1КК в срезах печени происходило только в присутствии гидрокортизона и ЛПОШ или ЛПШ. Этот механизм получил название кооперативного эффекта. Ь нем липопротеиды играют роль внутреннего обусловливающего фактора, модулирующего действие гормонов.

¿первые показано влияние липопротеидов сыворотки крови на содержание цАМФ в переживающих срезах печени крыс. Установлено, что ЛПОПН, ЛПНП или ЛПШ^ не влияли на базальный уровень цАМБ, тогда как ЛПШ^ вызывали его достоверное снижение. Описан положительный кооперативный эффект ЛПОШ и адреналина или гидрокортизона в повышении содержания цАМБ в срезах печени.

Выявлены конкурентные взаимоотнопения между адреналином и гидрокортизоном, тормозящие увеличение содержания цАШ в ответ на адреналин. Инсулин снижал базальный уровень цАШг после небольшого лаг-периода.

Практическое значение. Работа представляет собой экспериментальное изучение молекулярных механизмов адаптации человека и животных к действию субэкстремальных и экстремальных факторов и носит преимущественно теоретический характер. Выяснение регуляторной роли липопротеидов сыворотки крови (кооперативный эффект липопротеидов и адаптивных гормонов ) позволило глубже понять механизмы поддержания углеводного гомеостаза при действии на организм чрезвычайных раздражителей и связь этих механизмов с факторами питания.

Установлено, что увеличение белков и жиров, при одновременном снижении углеводов, в рационах питания (оптимальный вариант) оказывает антистрессовое влияние на организм человека и является наиболее адекватным в экстремальных условиях Азиатского Севера.

Результаты данной работы использованы в монографиях: Панин Л.Е. "Биохимические механизмы стресса", Новосибирск, 1983; Панин Л.Е., Маянская H.H. "Лизосомы: роль в адаптации и восстановлении", Новосибирск, 1987.

Положения, выносимые на защиту:

I. Питание играет роль внешнего обусловливающего фактора, изменяющего характер эццокринно-метаболических взаимоотношений в

организме человека. Соотношение белков, жиров и углеводов, равное 16 : 40 : 44, оказывает антистрессовый эффект и является оптимальным в условиях Крайнего Севера.

2. Характер питания изменяет активность ключевых ферментов ГНГ в печени и почках у интактных животных, влияет на изменение их активности при действии на организм чрезвычайных раздражителей. Наиболее чувствительным к действии пищевых факторов ферментом является ФЕПКК,.активность которого снижается при углеводном и повышается при белково-липидном типе питания.

3. Повышение активности ФЕПКК в печени крыс при интенсивной шаечной деятельности связано как с аллостерической модификацией фермента, так и с ивдукцией его синтеза. Стимуляция системы мо-нонуклеарных фагоцитов предварительным введением продигиозана усиливает ответ ФЕПКК и TAI в печени крыс при действии на организм экстремальных факторов.

4. Действие адгштивных горюнов на ГНГ в печени связано с повкзениеы концентрации цАНЗ. Существует положительный кооперативный эффект в действия адреналина или гидрокортизона и ЛПОНП на содержание цАЫЗ, а также гидрокортизона и ЛПОНП или ЛПНП ка активность ФЕПКК в печени.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Конференции молодых ученых ИКЭМ (Новосибирск, 1984), У Всесоюзном симпозиуме "Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных реакций" (Рязань, 1985), Краевой научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Здоровье человека в Сибири" (Красноярск, 1986),1У Всесоюзной конференция "Адаптация человека к кяикато-географическим условиям и первичная профилактика" (Новосибирск, 1986), У Всесоюзном сиеотозиумз "Эколого-физиологические проблемы адаптации" (Москва, 1988).

Публикапки. По токз диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем работы. Диссертация излозена ка 173 страницах к.-.г:5-копиского текста. Состоит из введения, 3 глаз (литературного обзора, материалов и катодов исследования, собственных результатов), обсуждения, кгподов и списка использованной литературы ( оте_ чественных и 261 иностранных авторов). Работа содержит 17 таблиц и II рисунков.

Диссертация выполнена в .соответствии с планом научно-исследовательских работ Института биохимии СО АШ СССР по теме "Разрабо-

тать нормы и режимы питания производственных коллективов, работающих в субэкстремальных и экстремальных условиях, с целью профилактики стрессорно-обусловленной патологии", № государственной регистрации 01.8.90. 056644, проблема 37.11.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

материалы и методы исследований. Изучение зависимости эндо-кринно-метаболических взаимоотношений в организме от характера питания проведено на 45 практически здоровых мужчинах 19-20 лет, проживавших в п. Диксон Красноярского края и выполнявших работу 4 категории интенсивности труда. До начала эксперимента все испытуемые получали углеводный рацион с соотношением белков, жиров и углеводов 10 : 26 : 64 % от суточной калорийности (4400 ккал). Затем добровольцы переводились на сбалансированные рационы: оптимальный с соотношением белков, жиров и углеводов - 16 : 40 : 44 % и белково-липидный с соотношением этих же нутриентов - 20 : 50 : : 30 % от суточной калорийности (3800 ккал). Соотношение основных пищевых веществ в белково-липидном районе приближено к соотношению их в питании аборигенного населения Крайнего Севера, ведущего традиционный образ жизни. Оптимальный рацион - это рацион, разработанный под руководством Л.Е.Панина для пришлого населения Заполярья (Панин Л.Е. и др., 1983). Он предлагает адекватное увеличение в рационе тех нутриентов, метаболизм которых в организме человека в данных климато-географических условиях усилен.

Изучение влияния алиментарных факторов на активность ферментов глюконеогенеза в печени и почках выполнено на крысах-самках Вистар, получавших в течение 30 дней один из трех изокалорийных рационов (60 ккал на 100 г массы), в которых соотношение белков, жиров и углеводов по калорийности составляло: основной рацион -23 : 18 : 59 , углеводный - 7 : 20 : 73 , белково-липидный - 36 : : 40 : 24.

В работе использовали следующие экспериментальные модели и воздействия:

I. Физическая нагрузка - как естественный, часто встречающийся и легко дозируемый стрессорный фактор. Острое воздействие -плавание крыс в течение 3,5 часов с грузом 4 % от массы тела при температуре воды 33°С. Хроническое воздействие - плавание животных по I часу ежедневно в течение 10 суток в оптимальном (33°С) и неоптимальном (25°С) температурном режиме.

2. Для выяснения механизмов активации ферментов ГНГ крысам за I час до плавания внутрибрюшинно вводили различные ингибитору. Для блокирования ДНК-зависимого синтеза РНК использовали актино-мицин Д (0,1 мг/кг массы). Для подавления лизосомального аппарата клеток использовали препараты, вызывающие торможение транслокации лизосом к ядру - винбластин (0,1 мг/кг) и колхицин (0,2 мг/кг), а также ингибитор протеолитической активности - гордокс (25000 ед/кг).

3. Стимуляция СЩ бактериальным липополисахаридом использовалась для выявления роли стромально-паренхиматозных взаимоотношений в регуляции ферментов ГНГ в печени. С этой целью в опытах in vivo фармакопейный препарат продигиозана вводили крысам внутрибрюшинно (0,5 мл 0,005 % раствора на 100 г массы тела) за сутки до исследования. В опытах in vitro продигиозан добавляли в среду инкубации (0,1 мл 0,005 % раствора на I мл инкубационной среды).

4. Метод переживающих срезов печени и почек использовался с целью выяснения роли отдельных гормонов и липопротеидов сыворотки крови в регуляции активности ферментов ГНГ и содержания циклических нуклеотидов. Преимущество данного метода заключается в том, что сохраняются все особенности межклеточных взаимоотношений, жизнеспособность основной массы клеток, интактность плазматических мембран и внутриклеточных структур.

Срезы инкубировали в Кребс-Рингер фосфатном или бикарбонат-ном буфере pH = 7,4 в водяной бане при 37°С и постоянном покачивании. Использовались следующие концентрации гормонов в среде инкубации: гидрокортизон - 5хЮ~® М, адреналин - 5 xI0~® М, глюкагон -IxIO-7 М, инсулин - IxIO-7 М. Липопротеиды добавляли в концентрации 0,2 мг липопротеидного белка на I мл икубационной среды, что соответствует их концентрации в крови.

Методы исследования. Определение активности Г-б-5азы ( Неге, van Hoof . 1966) и ФЕПКК ( Hakagawa, Hagai , 1971) с некоторыми модификациями (Панин Л.Е. и др., 1977), активности <ЗДФ-азы ( Ыс Gilvery , 1955) И TAT ( Dianondstone , 1966).

Неорганический фосфор определяли методой Lovry, Lopes (1946), концентрацию белка в тканях измеряли биуретовым нэтодом ( Mokrash, Uo Gilvery , 1955), а в крови - методом Lovry et за (1951). Определение сахара в крови проводили о-толуидино-вым методой, концентрацию общих липидов определяли с помощью стандартных наборов Био- Laohema -Тест (4CSP), содержание суммарной фракции липопротеидов низкой и очень низкой плотности - турбидимэт-рическим методом (Климов А.Н. и др., 1966).

Концентрацию гормонов в сыворотке или плазме крови и содержание циклических нуклеотидов в тканях определяли радиоиммунными методами с помощью стандартных наборов советских и иностранных фирм.

Липопротеиды сыворотки крови вьщеляли методом дифференциального центрифугирования ( Hatch, Lees , 1968).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Влияние различных рационов питания на некоторые эндокринно--метаболические показатели крови человека

Как показали исследования, выполненные на молодых здоровых жителях Крайнего Севера,алиментарные факторы сильно влияют на состояние эвдокринно-кетаболических взаимоотношений в организме (рис. I). В сыворотке крови людей, получавших пищу с преобладанием углеводов, отмечен наиболее высокий уровень кортизола, низкое содержание АКТГ и повышенное, по сравнению с оптимальным рационом, содержание инсулина. Уменьшение количества углеводов в рационе вело к значительному снижению содержания кортизола и повышению -АКТГ. Белково-липидный тип питания вызывал повышение, по сравнению с оптимальным рационом, концентрации глекагона и инсулина в крови.

Повышенное содержание глюкагона у лиц, получавших белково-липидный рацион, является следствием активной секреции гормона в ответ на увеличение аминокислот и снижение глюкозы в крови (Кевдыш И.Н., 1985; Paqnol et al , 1988). Оба крайних варианта питания повышали содержание инсулина, однако причины этого эффекта различны. Увеличение концентрации гормона в ответ на углеводное питание связано, вероятно, с непосредственным действием глюкозы на его продукцию iß -клетками островков Лангерганса поджелудочной железы (Козлов М.Г., 1984; Gardner, Michaelis , 1979). Повышение инсулина в крови лиц с белково-липидным питанием обусловлено, вероятно, увеличением концентрации глюкагона (Seлиг Ф. и др., 1985).

Одновременное повышение содержания глюкагона и инсулина -гормонов с противоположным действием на метаболизм - в ответ на белково-липидный рацион имеет большое физиологическое значение. Инсулин обеспечивает поглощение и утилизацию клетками аминокислот, избыток которых связан с этим типом питания. Повышение содержания глюкагона не только стимулирует ГНГ из аминокислот, но также препятствует ингибирующему эффекту инсулина на выход глюкозы из пече-

ГЛЮКОЗА, ОБЩИЙ БЕЛОК, СУММАРНАЯ ОБЩИЕ ЛШВДЫ,

ммоль/л '/л

ЛПНП и ЛПОНП,

г/л

Рис. I. Влияние различных рационов питания на концентрацию гормонов и метаболитов в сыворотке яровн организованного контингента людей. М £ м.

Рационы: I . I - Углеводный ЕЮ - Оптимальный

- Белково-липидный

п - Р < 0,05 ; гга - Р<г 0,01 - достоверные изменения по

сравнении с углеводным рационом.

(н) - Р < 0,05 ; (ги) - Р< 0,01 - достоверные изменешш по

сравнения с оптимальным рационом.

ни, обеспечивая продукцию сахара на стабильном уровне.

Гормональные сдвиги направлены на утилизацию пищевых веществ, поступающих в избытке, и на биосинтез тех соединений, которые поступают в недостаточном количестве. Концентрация глюкозы в крови в меньшей степени, по сравнению с другими показателями, зависела от алиментарных факторов. Небольшое снижение ее отмечено только у добровольцев, получавших белково-липидный рацион, по сравнению с оптимальным. Ранее было показано, что содержание сахара в крови у аборигенов Азиатского Севера, питание которых имело белково-липидный характер, не отличалось от его содержания у жителей г. Новосибирска (Панин Л.Е., 1978). Поддержание нормогликемии, несмотря на большие колебания (в 1,5-3,0 раза) поступления углеводов с пищей, обеспечивается, главным образом, за счет изменения активности ключевых ферментов ГНГ.

Увеличение потребления белков и жиров приводило к повышению в крови суммарной фракции ЛПОНП и ЛПНП. Этот результат очень важен, так как отражает переключение энергетического обмена с "углеводного" типа на "липидный", весьма целесообразный в условиях Крайнего Севера (Панин Л.Е., 1978; 1983). Анализ полученных резуль татов и данных литературы (Панин Л.Е., Поляков Л.Ы., 1979; Ксжапеп et а1 , 1980) позволил заключить, что высокое содержание липопро-теидов в крови оказывало ингибирующий эффект на стероидогенез в на дпочечниках, в результате которого происходило снижение концентрации кортизола в крови. В этом случае липопротеиды, помимо своей основной функции - транспорта жиров в организме - выполняли также и регуляторную роль.

Следует отметить противоположную направленность изменений в крови содержания общих липидов и суммарной фракции ЛПОНП и ЛПНП. Наиболее высокое содержание липидов было в крови мужчин, получавших углеводный рацион, что положительно коррелировало с высоким уровнем инсулина. Известно, что инсулин является "липогенетичес-ким" гормоном, поэтому повышение содержания общих липидов обусловлено инсулин-зависимым усилением биосинтеза нейтральных жиров из углеводов.

Низкое содержание общего белка в крови людей с углеводным питанием связано как с недостаточным поступлением белков с пищей, так и с угнетением их биосинтеза под влиянием избытка глюкокорти-коидов (Голиков П.П., 1988).

Переход на рационы с повышенным содержанием белков и жиров приводил к снижению в крови содержания кортизола и,следовательно,

к уменьшению его катаболического эффекта, что существенно расширяло адаптационные возможности организма. Полученные результаты указывают на антистрессовый характер оптимального и белково-липидного рационов.

Не обнаружено достоверных различий в действии этих рационов на большинство исследованных показателей. Исключение составляли глюкагон и инсулин, концентрация которых в крови добровольцев, получавших белково-липидное питание, была выше. Известно, что длительное повышение концентрации инсулина, даже в условиях нормогли-кемии, в дальнейшем может быть причиной нарушений обмена веществ и возникновения ряда заболеваний (Козлов М.А., 1984; Фелиг Ф. и др., 1985). Поэтому дальнейшее увеличение количества белков и жиров, по сравнению с их содержанием в оптимальном рационе, в условиях Севера является нецелесообразным.

2. Влияние алиментарных факторов на активность ферментов глюконеогенеза в печени крыс

Содержание глюкозы в крови животных, получавших один из трех изокалорийных рационов - основной, углеводный или белково-липидный - не зависело от качественного состава потребляемой пищи и колебалось в пределах 6,4-6,8 ммоль/л в течение всего эксперимента. Поддержание нормогликемии достигалось путем изменения активности ферментов ГНГ (рис. 2). Наибольшая зависимость от алиментарных факторов показана для ФЕПКК. Избыток углеводов в рационе приводил к ин-гибированию активности фермента, тогда как значительное их снижение вызывало, напротив, резкую активацию ФЕПКК, а также повышение активности Г-6-Фазы. Активность ВДФазы в печени не зависела от характера питания животных.

Изменение активности ферментов ГНГ определяется, прежде всего, продукцией глюкагона, инсулина и кортизола. Углеводное и белково-липидное питание вызывало повышение содержания инсулина в крови крыс (Филатова Т.Г., 1988). Аналогичные изменения концентрации гормона мы отмечали в крови людей, получавших подобные рационы (рис. I). Высокое содержание инсулина способствует утилизации глюкозы периферическими тканями и вызывает ингибирование ГНГ. Однако ингибирующий эффект инсулина в отношении ФЕПКК, согласно данным ряда авторов (Кендыш И.Н., 1985; Ех-ъоп , 1972), проявляется только в присутствии глюкозы или. других углеводов.

20 10

50 30 10

40 20

$ Е П К К

** Т

Углеводный Основной Белково-липидный

К Д,

Г-6-Фаза

(» )

Углеводный -Д-Фааа

Основной Белково-липидный

Углеводный Основной Белково-липидный

Рис. 2. Влияние различных рационов питания и хронической физической нагрузки на активность ферментов ГНГ печени (нмоль-мг белка-'''•мин-'''). М £ м, п = 7-11.

- Контроль

- Плавание при температуре воды 33°С

- Плавание при температуре воды 25°С.

(к)- Р < 0,05 - достоверность отличия плавания от контроля для данной диеты.

х - Р < 0,05; к* - Р < 0,01 - по сравнению с контролем на

основном рационе.

При белково-липидном питании ведущая роль в регуляции энергетического обмена, и ГНГ в частности, переходит от инсулина к глюкагону. Содержание последнего, как было показано нами (рис.1), возрастало в крови людей, получавших белково-липидный рацион. Это согласуется с данными других авторов ( Tiedgen, Seitz, , i960). Известно, что глюкагон активирует ФЕПКК ( Schudt , i960; KrausFriedmann , 1984) и Г-6-Фазу ( Tashima et ai , 1984). Дополнительный вклад в регуляцию ФЕПКК, вероятно, вносят и аминокислоты, которые могут усиливать гормональную активацию фермента (seitz et al , 1980).

Из трех исследованных ферментов ГНГ наиболее чувствительным к действию стресса, также как и к действию алиментарных факторов, является ФЕПКК (рис. 2). Следует подчеркнуть ярко выраженную зависимость ответа ФЕПКК на стресс от качества потребляемой животными пищи. Активность ФЕПКК не изменялась в ответ на тренировку в печени крыс, получавших основной рацион, и повышалась у животных с углеводным типом питания. Только плавание в холодной воде увеличивало активность ФЕПКК и снижало активность Г-6-Фазы в печени крыс с белково-углеводным питанием. В данном случае действие обусловливающего фактора (питания) даже более выражено, чем действие хронического стресса. Активность ФДФазы не изменялась под влиянием экстремальных факторов.

Таким образом, ФЕПКК играет ключевую роль в поддержании углеводного гомеостаза в организме как в норме, так и в условиях функционального напряжения организма. Изменение активности фермента в ответ на стресс зависит от характера питания, которое выступает в качестве внешнего обусловливающего фактора.

3. Влияние системы мононуклеарных фагоцитов на активность ферментов ГНГ в печени и почках крыс

Для стимуляции С® использовали бактериальный полисахарид продигиозан. Введение продигиозана за I сутки до исследования не влияло на активность ферментов ГНГ в печени крыс, находившихся в состоянии физиологического покоя, но значительно усиливало ответ £ЕПКК и TAT на интенсивную физическую нагрузку (рис. 3). Активность Г-6-Фазы не изменялась в ответ на плавание как контрольных, гак и стимулированных животных. Эффект продигиозана специфичен цля печени. В почках не выявлено его влияния на активацию ФЕПКК л TAT.

%

400 300 200 100

ФЕПКК TAT Г-6-Фаэа

Рис. 3. Влияние продигиозана и физической нагрузки на активность ферментов ГНГ (в % по отношению к активности ферментов в условиях физиологического покоя, принятой за 100 % - К) в печени крыс. М ± м, п = 6-12.

Г И - Продигиозан

ШШЛ - Плавание

VQ1 - Плавание + продигиозан

к - Р 0,05 - по отношению к контролю (*) - Р < 0,05 - по отношению к плаванию.

Известно, что ведущая роль в реализации действия бактериальных полисахаридов принадлежит системе мононуклеарных фагоцитов (Ермольева З.В., Вайсберг Г.Е., 1976; schade et ai, 1984). В печени СМФ представлена клетками Купфера, которые, в отличие от гепатоцитов, практически не обладают способностью к биосинтезу глюкозы (Усынин И.Ф., Панин Л.Е., 1986; Bojar et al , 1976). Полученные нами данные свидетельствуют о зависимости активности ключевых ферментов ГНГ, находящихся в гепатоцитах, от функционального состояния макрофагов печени.

Для выяснения возможных механизмов наблюдаемого эффекта использовано экспериментальное моделирование основных гормонально-метаболических изменений, происходящих в организме в ответ на плавание. С этой целью срезы печени крыс инкубировали в присутствии адреналина, гидрокортизона и липопротеидов сыворотки крови различных классов.

Таблица I

Влияние гормонов, липопротеидов и продигиозана на активность TAT (нмоль«мг белка-*.мин-*) в срезах печени крыс. М ± м, п = 7. Инкубация - 2 часа.

Условия опыта - ЛПОШ ЛПНП ЛПШ Продигиозан

- 9,3±1,2 12,7-1,4 II,7±I,4 11,0-1,5 12,4±1,9

Адреналин + Гидрокортизон 9,8±1,4 9,7±1,8 9,9^1,0 Ю,7±1,3

Адреналин + Гидрокортизон + Продигиозан II,I±I,4 13,7±1,3* 14,Iii,3* I3,7±I,4* -

к - Р <■ 0,05 - по отношению к контролю (без добавок).

Одни гормоны или липопротеиды не изменяли активности TAT и ФЕПКК в переживающих срезах печени крыс (табл. I). Повышение активности TAT вызывало только одновременное присутствие в среде инкубации адреналина, гидрокортизона и липопротеидов различных классов. Эффект совместного действия ЛПОШ и гормонов сохранялся и в том случае, если срезы готовили из печени крыс, которым про-дигиозан вводили за I сутки до исследования. Активность ФЕПКК в этих условиях не изменялась. Это свидетельствует об ином, более сложном характере регуляции фермента. Разные механизмы регуляции ФЕПКК и TAT отмечены ранее (Панин Л.Е. и др., 1982).

Таким образом, если питание играет роль внешнего обусловливающего фактора в регуляции ключевых ферментов ГНГ (как было показано в предыдущей главе), то состояние CMS может играть роль внутреннего обусловливающего фактора. Оба фактора, несомненно, взаимодействуют друг с другом, так как влияют на одни и те же показатели: обмен липидов, липопротеидов и гормонов. Предварительная стимуляция СЮ повышает адаптивные возможности организма, усиливая ответ ключевых ферментов ГНГ на стресс.

4. Изменение активности ФЕПКК под влиянием интенсивной физической нагрузки

Как видно из представленных на рис. 4 данных, плавание крыс, получавших основной рацион, в течение 3,5 часов с грузом 4 % от массы тела приводило к резкому повышению активности ФЕПКК в пече-

ни. Восстановление активности ФЕПКК после интенсивного плавания носило фазовый характер.

Активация ФЕПКК в ответ на мышечную нагрузку связана с индукцией, поскольку введение актиномицина Д препятствовало повышению активности фермента. Однако полного ингибирования ФЕПКК не происходило, что указывает на важную роль аллостерической регуляции фермента.

Активация фермента в ответ на плавание также значительно ин-гибировалась и при введении животным блокаторов, влияющих на состояние лизосомального аппарата клетки (рис. 5). Винбластин и колхицин препятствовали транслокации лизосом к ядру, гордокс вызывал стабилизацию лизосомальных мембран и снижение активности протеиназ (Маянская H.H., 1985; Kovacs et ai , 1982). В наших экспериментах гордокс и колхицин снижали повышение активности ФЕПКК в печени в ответ на плавание. Однако полного ингибирования, как и при введении актиномицина Д, также не наблюдалось. После введения гордокса и винбластина не было повышения активности 5ЕГ1КК через 6 часов после плавания. Активация лизосомальных ферментов и транслокация лизосом к ядру приводила к усилению биосинтеза белка на уровне транскрипции (Панин JI.E., Маянская H.H., 1987). Таким образом, усиление биосинтеза ФЕПКК в ответ на интенсивную физнаг-рузку является лизосомозависимым процессом.

Ранее нами было показано, что плавание животных вело к повышению концентрации II-0KC в крови. В печени отмечалась тенденция к повышению концентрации цАМ5 (Панин Л.Е. и др., 1979). При интенсивной мышечной деятельности происходило также повышение в крови содержания глюкагона и катехола,минов при одновременном снижении содержания инсулина (Виру A.A., 1981; Gorska, Gorski , 1989), изменялся липопротеидный спектр крови (Панин Л.Е., 1983). Действие глюкокортикоидов реализуется через индукцию ферментов, тогда как в действии других адаптивных гормонов выделяют, прежде всего,' аллостерическую модификацию ферментов по цАШ-зависимому пути (Голиков П.П., 1988; Фелиг Ф. и др., 1985). Все эти гормоны участвуют в регуляции ФЕПКК, однако данные о их влиянии на активность фермента неоднозначны.

Использование метода переживающих срезов печени крыс позволило глубже понять особенности влияния адаптивных гормонов на ФЕПКК. Проведенные эксперименты показали, что этот фермент наиболее чувствителен к действию глюкагона (рис. 6), который вызывал быстрое и длительное повышение активности. Это согласуется с дан-

Рис. 4. Изменение активности ФЕПКК (в % по отношению к активности фермента в условиях физиологического покоя, принятой за 100 %) в печени крыс в динамике восстановительного периода после плавания (•-•). Влияние

актиномицина Д (А—¡4). М - м, п. = 6-12.

к - Р с 0,05 - по отношению к контролю.

(к) - Р < 0,05 - достоверное действие актиномицина Д.

ными других авторов ( БсИисЗЪ , 1980; PгoЪst ег а1 , 1985). Анализ полученных результатов и данных литературы позволил предположить, что механизм повышения активности фермента определяется временем действия гормона: быстрая активация ФЕПКК зависела от аллостерической регуляции фермента, тогда как повышение активности через 2 часа связано с усилением его синтеза. Важная роль в обо их процессах принадлежит цАШ> ( СхпЬа1а et з\ 1982;

ВеаЪе et а1 , 1987).

Особый интерес представляло изучение влияния глюкортикои-дов и липопротеидов сыворотки крови на активность ФЕПКК. Наш выявлен кооперативный эффект в действии гидрокортизона и липопротеидов очень низкой или низкой плотности (табл. 2).

Инкубация срезов печени с одним гормоном или липопротеидами не влияла на базальную активность, но в то же время одновременное добавление гидрокортизона и ЛП0НП или ЛПНП вызывало повышение активности ФЕПКК. Эти данные еще раз подтверждает регуляторную роль липопротеидов сыворотки крови.

Таким образом, проведенные эксперименты позволяют объяснить повышение активности ФЕПКК в печени в ответ на плавание и подт-

40

30 20

10

л £

ОМ

к

Сразу после плавания

Через 6 часов после плавания

Рис. 5. Влияние некоторых блокаторов на изменение актив-

ности ФЕПКК (тюль-мин"*.мг белка-1) в печени крыс при физической нагрузке. М -и, а = 6-8.

К - активность ФЕЛКК в условиях физиологического покоя. I - плавание. За I час до плавания введен: 2 - винбластин; 3 - колхицин; 4 - гордокс.

1. к - Р 0,05 - по отношению к интактным животным в те

же сроки после плавания.

2. Активность ФЕПКК в состояниях I, 2, 3 (сразу после плавания и в состояниях I и 2 (через 6 часов после плавания) достоверно выше (Р < 0,01) по отношению к контролю.

Таблица 2

Влияние липопротеидов и гидрокортизона на активность ФЕПКК (нмоль-мг белка-''"•мин"*) в переживающих срезах печени крыс. Время инкубации - 120 минут. М £ м.

Условия опытов Без добавок лпонп ЛПШ

Контроль 7,9±0,8 7,210,8 к = 5

Гидрокортизон 7,7±0,7 9,0-0,8** 9,9±0,8** п. = 7

кк - Р < 0,01 - по отношению к контролю (без добавок), дос-

товерность посчитана разностным методом.

Рис. 6. Влияние гормонов на активность ФЕПКК в переживающих срезах печени крыс (в % по отношению к контролю -активности фермента при инкубации срезов без гормонов). М ± м, а = 6-9.

н - Р < 0,05 - по отношению к контролю.

зердить наши представления о двояком механизме его гормональной регуляции. Липопротеиды играют роль обусловливающего фактора в активации ФЕПКК.

5. Влияние гормонов и липопротеидов сыворотки крови на содержание циклических нуклеотидов в переживающих срезах печени крыс

Концентрация цАМФ в срезах печени крыс зависела от присутствия адаптивных гормонов в среде инкубации. Глюкагон уже через 2 ютнуты после добавления вызывал почти 4-х кратное повышение содержания цАМФ, инсулин значительно снижал это повышение. Эти результаты подтверждают данные других авторов ( Pilkis et ai, 1975;

Carrison, Borland , 1979).

Особый интерес представлял сравнительный анализ действия адреналина, гидрокортизона и липопротеидов. Адреналин также вызывал повышение содержания цА!й, хотя и в меньшей степени, по сравнению с глюкагоном. Эффект адреналина, как было установлено нами в опытах с применением адреноблокаторов, реализуется через ß -адрено-рецепторы.-Добавление гидрокортизона в среду инкубации не влияло на базальный уровень цАМФ, однако значительно препятствовало его

повышению в ответ на адреналин. Эти результаты позволяют предположить, что между этими гормонами существуют конкурентные взаимоотношения за места связывания на ^ -адренорецепторах клеточных мембран.

Показано, что ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВН£ не влияли на исходное содержание цАШ в срезах печени, тогда как ЛПШд вызывали некоторое снижение его концентрации. В то же время ЛПОНП значительно усиливали адреналин-зависимое повышение содержания цАШг. Одновременное добавление ЛПОНП и гидрокортизона также вело к увеличению концентрации нуклеотида. Липопротеиды других классов подобного действия не оказывали. Нами также не выявлено модулирующего эффекта ЛПОНП в действии инсулина - контргормона глюкокортикоидов и катехолаш-нов. Полученные данные свидетельствуют о существовании кооперативного эффекта ЛПОНП и адреналина или ЛПОНП и гидрокортизона в регуляции содержания цА® в переживающих срезах печени крыс.

Следует отметить, что совместное присутствие адреналина, гидрокортизона и ЛПОШ в среде инкубации вызывало менее выраженное повышение цАШ, чем в ответ на кооперативное действие адреналина и ЛПОНП. Это еще раз указывает на возможность рецепции глюкокортикоидов на ^р -адренорецепторах. Потенциирующая роль ЛПОНП не мешала проявлению этого эффекта.

Параллельное исследование содержание во всех проведенных экспериментах не выявило изменений концентрации данного циклического нуклеотида. Вероятно, цГШ не является внутриклеточным посредником исследованных нами адаптивных гормонов.

Ранее нами было показано, что повышение активности ФЕПКК в переживающих срезах печени крыс происходило только в ответ на глюкагон или кооперативное действие гидрокортизона и липопротеидов. Под влиянием этих же факторов значительно повышалась концентрация цАМЕ в срезах печени. Таким образом, изменение содержания цАШ> играет ведущую роль в опосредовании действия данных гормонов на активность фермента. Эффект липопротеидов следует рассматривать как прояг ление внутреннего обусловливающего фактора, модулирующего гормональную регуляцию содержания цА№£ и активности ФЕПКК в печени.

ВЫВОДЫ

I. Качественный состав рационов питания человека в условиях Крайнего Севера оказывает сильное влияние на адаптационные изменения обмена веществ и гормональные механизмы его регуляции. Рацион с соотношением белков, жиров и углеводов, равным 15 : 40 : 44, яб-

ляется наиболее адекватным для питания взрослого населения на Крайнем Севере.

2. Поддержание углеводного гомеостаза у животных с различным характером питания обеспечивается за счет изменения активности прежде всего ФЕПКК. При углеводном типе питания активность фермента в печени снижалась, при белково-липидном типе, напротив, резко увеличивалась. Активность Г-6-Фазы в печени и почках изменялась одно-направленно, но в меньшей степени. Активность ФДФазы в печени и почках не зависела от алиментарных факторов.

3. Качество потребляемой животными пищи изменяет ответ ФЕПКК в печени на физическую нагрузку в тренировочном режиме: на углеводном и белково-липидном рационах активность фермента увеличивалась, на основном - стабилизировалась на исходном уровне.

4. Повышение активности ФЕПКК в печени в ответ на интенсивную физическую нагрузку и в восстановительный период после нее (на основном рационе) связано с индукцией синтеза фермента; установлена связь этого механизма с функцией лизосомального аппарата клетки.

5. Стимуляция СШ предварительным введением крысам продигио-зана вызывала увеличение активации ФЕПКК и TAT в печени в ответ на интенсивную физическую нагрузку.

6. В регуляции активности ферментов ГНГ принимают участие ли-попротеиды сыворотки крови: увеличение активности TAT в переживающих срезах печени крыс в ответ на совместное действие адреналина, гидрокортизона и продигиозана наблюдается только в присутствии ли-попротеидов в среде инкубации. Повышение активности ФЕПКК в срезах печени в ответ на гидрокортизон происходит только при одновременном добавлении ЛПОНП или ЛПНП.

7. Выявлен положительный кооперативный эффект ЛПОНП и адреналина или гидрокортизона в регуляции содержания цАМФ в переживающих срезах печени крыс: добавление ЛПОНП в среду инкубации вело к повышению концентрации цА® в ответ на действие обоих гормонов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЫЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Панин JI.Е., Нечаев Ю.С., Колосова И.Е. Изменение активности ключевых ферментов ГНГ в печени и почках крыс при действии на организм субэкстремальных и экстремальных факторов //Билл, экспер. биол. мед.•- 1979 - № б. - С. 544-547.

2. Колосова И.Е. Изменение активности ключевых ферментов

гаГ под влиянием стрессовых факторов //В кн.: Механизмы адаптации гомеостатических систем при действии на организм субэкстремальных и экстремальных факторов. - Новосибирск, 1980. - С. 33-36.

3. Панин JI.E., Маянская H.H., Филатова Т.Г., Колосова U.E. Роль лизосом в адаптивных реакциях клетки //Бюлл. СО АМН СССР. -1982. - № 2. - С. 85-94.

4.Панин Л.Е., Колосова И.Е. Влияние гидрокортизона, адреналина, инсулина и липопротеидов сыворотки крови на содержание цШ> в переживающих срезах печени белых крыс //Бюлл. эксперим. биол. мед. - 1984. - № 3, ДЕ11.

5. Панин Л.Е., Колосова И.Е. Влияние гормонов и липопротеидов сыворотки крови на содержание цАМФ и цГМФ в переживающих срезах печени крыс //Пробл. эндокрин. - 1985. - № 3. - С. 69-73.

6. Панин Л.Е., Колосова И.Е. 0 кооперативном эффекте адаптивных гормонов и липопротеидов сыворотки крови в регуляции содержания цАШ в печени //Циклические нуклеотиды и система регуляции ферментативных реакций: Тез. докл. У Всесоюз. симп. - Рязань, 1985. -С. 93.

7. Панин Л.Е., Третьякова Т.А., Атучина Н.В., Смоленцева И.И., Колосова И.Е. Роль системы мононуклеарных фагоцитов в адаптации организма к физическим нагрузкам //Адаптация человека к климато-геог-рафическим условиям и первичная профилактика: Тез. докл. 1У Всесоюз. конф. - Новосибирск, 1986. - Т. 2. - С. 142.

8. Атучина Н.В., Смоленцева И.И., Колосова И.Е., Останина Л.С. Влияние продигиозана на активность ключевых ферментов углеводного обмена и липопротеидный спектр крови крыс при физической нагрузке// Здоровье человека в Сибири: Тез. докл. Краевой научно-практ. конф. молодых ученых и специалистов. - Красноярск, 1986. - С. 73-74.

9. Панин Л.Е., Колосова И.Е. Влияние физической нагрузки и рационов питания на активность ключевых ферментов глюконеогенеза в печени белых крыс //Эколого-физиологические проблемы адаптации: Тез. докл. У Всесоюз. симп. - М., 1988. - С. 171.