Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональная характеристика структур печени в норме и при хроническом воздействии природным сероводородсодержащим газом Астраханского месторождения

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональная характеристика структур печени в норме и при хроническом воздействии природным сероводородсодержащим газом Астраханского месторождения"

На правах рукописи

¿ЬА

005020053

ПАНКРАШОВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУР ПЕЧЕНИ В НОРМЕ И ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ СЕРОВОДОРОДСОДЕРЖАЩИМ ГАЗОМ АСТРАХАНСКОГО МЕСТОРОЖДЕНИЯ

(экспериментальное исследование)

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДПР 2072

Астрахань - 2012

005020053

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Наумова Любовь Ивановна

доктор медицинских наук, профессор Смирнов Алексей Владимирович, ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрав-соцразвития России, кафедра патологической анатомии, заведующий кафедрой

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Родзаевская Елена Борисовна, ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет» Минздравсоц-развития России, кафедра гистологии, профессор кафедры

ФГБОУ ВПО Ставропольский государственный университет

Защита состоится «20» апреля 2012 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

Автореферат разослан » іМСі^і^ьС^ 2012года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Нестеров Юрий Викторович

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Печень является органом, участвующим в сосудистых, секреторных, синтетических и метаболических процессах, обеспечивающих связывание и обезвреживание токсических веществ эндогенного и экзогенного происхождения, в результате которых обеспечивается гомеостаз (Захлебаева В.В., 2007; Здорнова О.В., 2010; Neyrinck A.M. et al., 2004). Исследования функционального состояния структур гепатоцитов при воздействии токсических веществ в малых концентрациях представляет несомненный интерес, поскольку реакция печени на токсиканты определяет реактивность организма. Снижение функциональной способности печеночных клеток ведет к нарушению антитоксической функции печени (Суханова В.А., Думкина Г.З., 1975). Ухудшение экологической ситуации в результате воздействия химических токсикантов является одним из факторов, определяющих изменение физиологических функций и процессов физиологической адаптации в человеческом организме и обуславливающих развитие широкого спектра заболеваний, в том числе печени (Забродский П.Ф., 1994; Боева О.И., 1998; Fleming L.E. et al., 1992). Уже в начальный период промышленно-профессионалыюй интоксикации изменяется состав и функции печеночных клеток, связанные с активной трансформацией в ней ксенобиотиков (Яковлева В.В. с соавт., 1995).

Нарастающие темпы научно-технического прогресса вызывают массу проблем в вопросах охраны окружающей среды, в профилактике и лечении экологически обусловленных заболеваний. Безотходные технологии химической, нефтеперерабатывающей и газовой промышленностей являются реальностью далекого будущего, а в настоящее время именно они возглавляют список самых вредных производств (Резаев A.A. с соавт., 1996, Агаджанян H.A. с соавт., 2000, Трубников Г.А. с соавг., 2002, Кузьмина Л.П., 2008, Мадаева И.М. с соавт., 2009). Астраханский газоперерабатывающий комплекс стал основным источником загрязнения атмосферы в Астраханской области за счет регулярного выброса продуктов переработки газа и его конденсата. В результате рабочие и жители прилежащих населенных территорий оказываются в зоне продолжительного воздействия сероводородсодержащеш газа, концентрация которого в окружающем воздухе чаще всего не превышает предельно допустимой. Распространенность патологии печени и желчевыводящих путей среди людей перечисленных категорий рассматривается многими исследователями как результат негативного влияния природного газа (Великанов Э.Б. с соавт., 1989, Орлов М. А., Давыдова JL Д., 1991; Воробьева Т.Е. с соавт, 2000, БучинВ.Н. с соавт., 2007, Ломтева Т.Ф., 2002, Бунина A.B., 2004, Пюрведжалова Э.Б., 2004).

Поражения печени при воздействиях малых доз органических и неорганических химических токсикантов, их сочетаний зачастую клинически протекает бессимптомно, создавая иллюзию медико-социального благополучия, затрудняя и осложняя диагностический процесс (Hodgson M.J. et al., 1991). В связи с этим проблема понимания структурно-функциональных изменений и последующей диагностики поражений печени малыми концентрациями природного газа Астраханского месторождения приобретает большое практическое значение.

Цель исследования: дать морфофункциональную характеристику структурам печени в норме и при хроническом ингаляционном воздействии природным газом Астраханского месторождения.

Задачи исследования:

1) Изучить структурную организацию печени крыс в норме и при хроническом ингаляционном воздействии природным газом Астраханского месторождения в течение 120 суток.

2) Провести анализ метаболической функции печени путем изучения био-

химической и гистохимической характеристики различных видов обменов (белкового, липидного, углеводного) в норме и при хроническом ингаляционном воздействии природным газом Астраханского месторождения в течение 120 суток.

3) Оценить резервные возможности структур печени через 30 суток после

окончания воздействия природным газом Астраханского месторождения.

4) Определить зависимость между морфофункциональными изменениями и

активностью метаболических процессов в структурах печени крыс при хроническом ингаляционном воздействии природным газом Астраханского месторождения в течение 120 суток и в восстановительный период.

Научная новизна. Впервые исследована морфология структурных и метаболических изменений в печени в динамике в норме и на фоне хронического воздействия сероводородсодержащим газом в концентрации, не превышающей предельно допустимой. Дана характеристика метаболическим процессам в норме и в зависимости от срока ингаляционного воздействия природным газом низкой концентрации. Впервые дано морфологическое обоснование преобразованиям микроциркуляторного русла печени в норме и в зависимости от длительности воздействия сероводородсодержащим газом. Изучены регенераторные и адаптивные возможности структур печени в восстановительный период. По результатам исследования проведена оценка и выявлена взаимосвязь между структурными и метаболическими показателями в зависимости от срока хронического ингаляционного воздействия природным газом в концентрации по сероводороду 3 мг/мЗ.

Научно-нрактпческая значимость. Работа носит фундаментальный характер и представляет динамическую морфофункциональную характеристику структурных элементов печени крыс в норме, на фоне длительного воздействия сероводородсодержащим газом, а также в восстановительный период. Полученные данные позволяют выявить особенности структурных и метаболических преобразований в зависимости от срока хронического эксперимента и продемонстрировать негативное влияние длительно действующего природного газа с допустимой концентрацией сероводорода на состояние структурных элементов печени. Практическая значимость работы заключается в том, что она позволяет значительно расширить существующие представления о механизмах развития экологически обусловленной патологии печени и подвести морфологическую базу для объяснения некоторых клинических и диагностических проявлений заболеваний печени. Разработанный комплексный подход дает возможность не только в деталях охарактеризовать гистологические и гистохимические изменения в структурах печени, но и представить общую картину взаимодействующих процессов.

Полученные данные внедрены для преподавания соответствующих разделов гистологии, патологической и нормальной физиологии, патологической

анатомии, биохимии. Результаты исследования могут быть использованы в написании монографий, руководств по гепатолопш, токсикологии и патологической анатомии и служить в качестве методической основы для последующих исследований в этой области. Рекомендуется включать биохимические исследования крови для определения степени структурных и функциональных изменений печени при ее токсическом повреждении. Результаты исследования могут быть приняты во внимание при разработке нормативов предельно допустимых концентраций газа в производственных помещениях и санитарно-защитной зоне, прилегающей к газодобывающим и газоперерабатывающим предприятиям

Положения, иыиосимыс на защиту:

1. Степень структурных и метаболических изменений в печени зависит от

длительности воздействия природным газом в предельно допустимой концентрации.

2. Длительное воздействие сероводородсодержащего газа в предельно до-

пустимых концентрациях вызывает изменение биохимических показателей крови (общего белка, количества альбуминов, общего холестерина, липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП), триглицеридов, молочной и пировиноградной кислоты, АЛ'Г и АСТ) сопоставимых с динамикой метаболических процессов в структурах печени.

3. Длительное влияние природного газа в концентрации по сероводороду

Змг/мЗ вызывает стойкие гистологические изменения в печени, сохраняющиеся в течение месяца после прекращения его воздействия.

Апробацпя работы. Результаты работы доложены и обсуждены на конференциях: «Микроциркуляция человека в норме и патологии (экспериментальные и клинические аспекты)», Астрахань, 26-27 февраля 2009.; на IV Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов, Саратов, 23 - 25 сентября 2009; на 86-й Итоговой Научно-практической конференции сотрудников академии, врачей города и области, Астрахань, 2009; на 7-ой Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань, 3-8 мая 2010; на конференции «Бабухинские чтения в Орле», Орел, 2011; на III Эмбриологическом симпозиуме Всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «ЮГРА-ЭМБРИО-2011. Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных», Ханты-Мансийск, 5-6 октября 2011, на II международной научной конференции, посвященной 80-летию академика РАЕН, заслуженного работника высшей школы РФ, д.б.н., профессора Д.Л. Теплого, Астрахань, 2011.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 151 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследований, глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Указатель литературы включает в себя 142 отечественных и 91 иностранных источников. Работа содержит 8 таблиц, 39 рисунков из которых 32 фотографии.

Материалы и методы исследования.

Работа представляет собой экспериментальное комплексное исследование, выполненное на 244 беспородных крысах, самцах массой 213 ± 14 г, прошедших карантин в течение месяца. Протокол экспериментов был составлен в соответствии с принцами биоэтики, правилами лабораторной практики (GLP); этическим нормам, изложенным Женевской конвенции (1971), «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985); с приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003, «Об утверждении правил лабораторной практики», (Минздрав ССР № 755 от 12.08. 1977), а также положениями «Хельсинской Декларации по вопросам медицинской этики» и «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1989). Проведение экспериментальных исследований было оценено этической комиссией (заключение №5 от 02.12.2011)

Моделирование воздействия сероводородсодержащего газа проводилось путем помещения животных на 4 часа в специальные затравочные камеры. Все животные были распределены на 6 групп. Экспериментальные группы подвергались воздействию природного газа в концентрации 3,24+0,18 мг/мЗ по сероводороду на протяжении 5 дней в неделю в течение 120 суток. В пятую группу были включены животные для изучения восстановительных возможностей печени через 30 суток после окончания воздействия. Контролем служили крысы того же возраста, находившиеся в стандартных условиях вивария.

По истечении каждого срока эксперимента животным вводили внутри-брюшинно этаминал натрия в концентрации 40 мг/кг массы. Обзорные гистологические препараты получали путем окраски срезов толщиной 5-10 мкм гематоксилином и эозином. Коллагеновые волокна выявляли окраской по Ван Гизон, состояние гладкой мышечной ткани сосудистой стенки окраской ГОФП. Анализ тканевого обмена в печени проводился путем полуколичественного метода гистохимических реакций на белок прочным зеленым методом Шаффера (1957), углеводы ШИК-реакцией по Мс Manus (1946) в модификации Hotchkiss (1948), лшгады Суданом III (по Лилли Р., 1969). Для оценки интенсивности гистохимических реакций применяли условные обозначения: (0) — отсутствие окрашивания; (±) — сомнительный результат , (+) — слабое окрашивание; (++) — среднее окрашивание; (+++) — интенсивное окрашивание (К. Великан и Д. Великан, 1963; С.С. Касабьян,1961). В соответствии с принципами системного количественного анализа (Автандилов Г.Г., 1996, 2002) исследовались объемные доли (мкмЗ/мкмЗ) инфильтратов, диаметр центральных вен и количество двуядерных гепатоцитов. Для выявления изменения сосудистой проницаемости использовался 0,3%-ый раствор акридинового оранжевого с последующей люминесцентной микроскопией печеночных микрососудов.

Для оценки метаболических изменений были выбраны следующие биохимические показатели крови: содержание основных фракций белка определялись методом электрофоретического разделения на бумаге, общего холестерина, липопротеидов низкой плотности, липопротеиды очень низкой плотности, липопротеидов высокой плотности и тригаицеридов на автоматическом анализаторе «Union Carbaite» (Швеция), концентрация молочной кислоты с помощью колориметрирования методом Л.Г. Смирновой (1960) и пировиноградной кислоты методом Ю.Б. Филипповича (1982), производили определение активности

ACT (аспартатаминотрансферазы) и AJIT (аланиаминотрансферазы) методом Райтмана - Френкеля (Reitman S., Frankel А., 1957) с помощью стандартных наборов реактивов.

Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики с использованием критерия Стыодента - (t). Вычисляли среднее арифметическое выборочной совокупности (М), ошибку среднего арифметического (m), среднее квадратичное отклонение (а). Достоверность различия определяли в каждой серии по отношению к исходному значению (р). Материалы обрабатывались на персональном компьютере с помощью программ "Microsoft Office Windows 2003" "Microsoft Office Excel 2003"«Стат. обработка результатов в мед. исследованиях (критерий Стыодента)» (2006).

Результаты исследования и их обсуждение.

При обзорном исследовании препаратов, окрашенных гематоксилин-эозином, в контрольной группе четко определяются структурные компоненты портальных триад, от которых расходятся рядами гепатоциты характерного балочного расположения. Печеночные балки имеют ровный ход, между ними располагаются сипусоидные капилляры с прямым четким ходом, впадающие в центральную вену. Вена безмышечного типа с тонкой стенкой, состоящей из эндотелиальных клеток с темными нитевидными ядрами. Гепатоциты определяются как полигональные клетки, имеющие одно, реже два ядра. Количество двз'ядерных клеток в контрольной группе составило 57, 24 ± 2,73 (табл. 1). Портальные триады состоят из вены, артерии и желчного капилляра. Стенка последнею образована кубическим эпителием, отделенным от подлежащей паренхимы четкой, непрерывной границей, соответствующей базальной мембране. В просвете кровеносных сосудов кровь, контуры стенок четкие, гомогенно окрашены эозином, в артерии определяются правильно ориентированные ядра миоцитов, лежащие в 1 -2 ряда.

При окраске по Ван Гизону умеренную фуксинофилшо проявляет наружная оболочка сосудов, входящих в состав портальных триад. На общем фоне гомогенно распределенного красителя хорошо выявляются волокна.

Метаболическая функция структур печени оценивалась по результатам гистохимических исследований. При обзорном исследовании препаратов в контрольной группе животных умеренно положительную ШИК- реакцию дают основное вещество, коллагеновые волокна и мышечная ткань за счет содержания в них мукополисахаридов. Поэтому гомогенное окрашивание получают стенки сосудов. В паренхиме интенсивность окраски менее однородная из-за неодинаковой способности клеток накапливать гликоген. Интенсивность ШИК-реакции мало зависит от локализации гепатоцитов относительно зон ацинусов. В близко расположенных гепатоцитах может быть разной и структура гликогена. В одних гликоген имеет структуру крупных гаыбок, лежащих диффузно, в других в виде скопления мелких гранул.

Окрашивание печени прочным зеленым показало значительное содержание белка во всех структурах, особенно в стенках сосудов портальных трактов. Особую интенсивность окраски получают мышечные оболочки артериол. Хорошо окрашивается паренхима печени. Так как гепатоциты выполняют значительное число функций, связанных не только с белковым обменом, окрашивание придает паренхиме пестрый ячеистый вид.

Состояние микроциркуляторного русла оценивалось с помощью люминесцентной микроскопии после введения раствора акридинового оранжевого. При исследовании сосудов триад печени в контрольной группе с помощью стандартных методов окраски и фазово-контрастной микроскопии определяются четкие ровные контуры наружной и внутренней оболочек артериол, без участков спазма и расширения. Стенки однородно окрашиваются эозином, ядра миоцитов правильно ориентированы и лежат в 1 - 2 ряда. При окрашивании по Ван Гизону отмечается слабая фуксинофилия периваскулярной области и гомогенная пикринофилия мышечной оболочки сосудистой стенки. Что касается вен, то поскольку они являются сосудами безмышечного типа, их оболочка представлена тонким слоем эндотелиальных клеток с вытянутыми уплощенными ядрами. От портальных трактов расходится сеть синусоидных капилляров, имеющих ровный прямой ход и впадающих в центральную вену. Содержание углеводов в структурах сосудистых стенок дает умерено положительную ШИК-реакцию. Интенсивное окрашивание прочным зеленым демонстрирует значительное присутствие белка в стенках сосудов. При люминесцентной микроскопии после введения в сосудистое русло раствора акридинового оранжевого выявляется четкое окрашивание стенок сосудов. За счет транскапиллярного обмена лишь незначительная часть красителя регистрируется в периваскуляр-ном пространстве.

Через 30 суток после начала воздействия природным газом в препаратах отмечается сохранность ацшарного строения. Балочное расположение гепа-тоцитов не изменено. Обнаружено расширение синусоидных капилляров, впадающих в центральную вену, и перисинусоидальный отек. Вена находилась в состоянии незначительной дилатащш. Количественный анализ диаметров центральных вен выявил тенденцию к увеличению показателя до 225, 7 ± 14,6 мкм (в контроле 217,4 ± 10,8 мкм). Вокруг центральной вены и сосудов портальных трактов формировались полиморфоноклеточные инфильтраты, их средняя площадь составила 457,8 ± 21,6 мкмЗ/мкмЗ (табл. 1). Такая реакция может быть расценена как защитная и стереотипная. Мобилизации подлежат местные элементы неспецифической защиты - клетки Купфера, а также бактерицидные системы фагоцитов (Величковский Б.Т., 2003, 2008). Максимальная скорость мобилизации клеточных элементов объясняется отсутствием базальной мембраны у гемокапилляров печени и наличием вен безмышечного типа. Роль клеток Купфера на этом не заканчивается: из общего числа биологически активных веществ, ими продуцируемых в активированном состоянии, особое внимание нужно обратить на факторы роста. Получив соответствующий стимул, гепа-тоциты изменяют митотическую активность в сторону увеличения (Никонова Е.А., 1982). В результате развивается компенсаторная полиплоидизация в ответ на импульс, о чем свидетельствует нарастающее число двуядерных гепатоци-тов- 128, 32 ±4,74 (табл. 1).

К морфологическим признакам реакции сосудов на воздействие природного газа можно отнести дилатацию венозного и капиллярного звеньев микроциркуляторного русла, что касается артериального звена, то здесь мышечные и эпителиальные элементы находятся в состоянии сокращения. В препаратах, окрашенных по ГОФП, ядра эндотелиальных клеток артериол выбухают в просвет сосуда и близко расположены друг к другу, образуя единую цепочку. Ядра гладких миоцитов округляясь, сливаются в сплошную неровную линию.

Таблица 1.

Морфометрические показатели в печени на разных сроках хронического ингаляционного воздействия сероводородсодержащим газом в концентрации

3 мг/мЗ, М±ш

KlVfMMOCI но iiCWÍUltíOHÚiX гьпатоцитов ■i ООО 000 мкм2 Дивмшр центральных sök, мкм Средняя гшащадь перипоргалъиых инфильтрате;?

Контроль п- 12 57.241-2,73 217,4 ± 10,0

30 .суток Д= 14 125.32 ± 4,74* 225,7 ± 14,6 45?,ö i 21,6

80 «так п= 12 153,68 £ 7,32* 253,2 112,5* 496,3 i 18.7

60. су гок п= 11 147,23 ¿ 5,4ÍT 274,7 ± 13,2 Ё37.1 ± -]6,Э-

120 суток 116:S1 ±ö,2ö* 268.3 оТЗ,/ i 17.8°

160 cv-гок п= 12 12'i .42 i 5,86" i 261,4 i 11.3* 492,3'118,0

Примечание: * - разница с контролем достоверна прир<0,05

О повышении сосудистой проницаемости свидетельствуют данные люминесцентной микроскопии. Отмечается интенсивный выход красителя в пе-риваскулярпое пространство. Увеличение проницаемости расценивается как защитная реакция (Новочадов В.В. с соавт., 2005), так как белки плазмы связывают токсины и задерживают их всасывание в кровь. Кроме того лейкоцитам обеспечивается быстрый выход из сосудистого русла для обеспечений защитных свойств, что морфологически проявляется клеточной инфильтрацией периваскулярпого пространства. Одним из факторов, участвующих в повышении проницаемости микроциркуляторного русла при воздействии природного газа, является эластаза, выделяемая стимулированными нейтрофилами (Ishii К. et al., 1996). Результатом действия протеолитических ферментов можно объяснить увеличение интенсивности ШИК-реакции волокнистых структур в оболочках сосудов. Отщепляющиеся от белков стромы шикозаминошиканы в процессе протеолиза, увеличивают свое содержание в соединительнотканных структурах и усиливают её тинкториальные свойства. В течение первых 30 суток эксперимента мы не видим явных процессов коллагенобразования. Однако увеличение пгикогеновых отложений в цитоплазме клеток периваскулярного пространства можно было бы расценить, как подготовку клеток к синтезу компонентов межклеточного вещества. А накопление крупных гликогеновых гранул в гепатоцитах расположенных вокруг портальных трактов как адаптивный запас, поскольку в клетках именно этой зоны ацинусов наиболее активируется метаболизм, в том числе эндогенных токсических соединений.

Активации перекисного окисления липидов на сегодня отводится роль одного из фундаментальных молекулярных механизмов патогенеза в развитии многих заболеваний, особенно вызванных действием токсических веществ

(Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Боев В.М. с соавт., 2001, 2002; Полунин И.Н. с соавт., 1999; Агаджанян H.A. с соавт., 2000; Тризно H.H. с соавт., 2005). Нами был определен дисбаланс в системе перекиснош окисления липи-дов - антиоксидантной защиты (ПОЛ - АОЗ) в сторону усиления пероксида-ции. Полученные результаты свидетельствует о том, что к конпу 30 суток воздействия газом усиливаются процессы свободнорадикального окисления, что проявляется увеличением концентрации малонового диальдегида и диеновых конъюгатов (рис. 1).

ьтесч'.п. 3»елг «Нут »ücyi Шеух Шсу*

Рис. 1. Содержание малонового диальдегида и каталазы крови при хроническом ингаляционном воздействии сероводородсодержащим газом в концентрации 3 мг/мЗ по сероводороду (нмоль/л)

Под действием свободных радикалов и липоперекисей происходит окисление липопротеидов, в первую очередь это затрагивает ЛПНП и ЛПОНП из-за большого содержания в них ненасыщенных жирных кислот и относительного дефицита а-токоферола (Климов А.Н. с соавт., 1999). Окисленные ЛПНП в силу своей токсичности повреждают эндотелиальные клетки и стимулируют синтетическую активность клеток Купфера.

В нашем исследовании проводился анализ содержания ОХ, холестерина ЛГ1ВП, ЛПНП и ЛПОНП, ТГ. К концу 30 суток воздействия природным газом отмечаются изменения профиля липопротеидов. Происходит увеличение содержания ОХ до 3,48 ±0,41 ммоль/л (вконтроле - 3,02 ±0,34 ммоль/л), в основном, за счет ЛПНП, так как он является основным поставщиком холестерина в клетки. Его концентрация составила 0,72 ± 0,07 ммоль/л (в контроле - 0,48 ± 0,05 ммоль/л) (табл. 2). Холестерин является важной составляющей клеточных мембран, способствующей их устойчивости к внешним воздействиям. Процессы повреждения и регенерации усиливают потребность клетки в холестерине, а медиаторы воспаления увеличивают его синтез в печени и выделение в кровь в составе ЛННП. ЛПВ11 транспортируют холестерин из тканей в печень для окисления его в желчные кислоты. В связи с увеличением потребности в холестерине количество ЛПВП снижается до 1,95 ± 0,08 ммоль/л (в контроле - 2,08 ± 0,03 ммоль/л) (рис. 2).

ММОЛЬ л

КОЙТрОД* iVT i'uKXI 'Х> <.yt K'ör-T 150 CST Рис. 2. Содержание липопротеидов высокой, низкой и очень низкой плотности в крови при хроническом ингаляционном воздействии сероводородсо-держащим газом в концентрации 3 мг/мЗ по сероводороду (ммоль/л).

Таблица 2.

Показатели липидного обмена в сыворотке крови лабораторных животных при хроническом ингаляционном воздействии сероводородсодержащим газом

в концентрации 3 мг/мЗ, М ± m

Срок

жсявш-Г,гейта Ш8П {їлиртщЩ ппип ішлатіщ тонн ((Ж ОПЬ/Гіу ОЙПІИЙ: хапестерйй (ммоль/п) Трійіицеридм (шоль/л)

s Контроль і 2.0 8 і&.07 0.4 В .t 3 06 0.84 i 0,05 3 0? І 0.34 і .84 І 0,21

1 ЗОсуте« 1 3 1 о;/2 І ожп 8,/Т-± 0,08 3:4 $ і 0 ,4 ": 1 4/ t

1 80 суток 1 a=lf> •1,84 4 0,05* 0,80 4 (УЖ 0,0:4, t 0,03 3.79 І 03: ¿.Ctö і 0,22 :

і 90 сіуок і а-14 1,72 і 0,Щ" 1,08 і 0,12" 0,35 ± 0,04 4,2 -і •;:> 35' 2.19 ± 0,1?' :

126 stvqx І ГГ ¡І 1 .So z 0.03* .1,35 і 0,08* 0,8? і ОХВ'2* 4..йг 0,28-' 2.10 + 0.12

і 150 кукж n-1'Э IMäO.I* 1.2 ± 3,Г 0,7« ± 0,04 4 1 й s 0.3!' 2,03 + 0.2

Примечание: * - разница с контролем достоверна при р<0,05

Влияние клеток синусоидной фракции на синтетические процессы в гепато-цигах проявляется изменением синтеза белка. При изучении белкового спектра крови через 30 суток воздействия природным газом нами выявлена тенденция к росту концентрации глобулинов и снижению альбуминов. Их концентрация составила 44,1 ± 4,3 г/л (в контроле 41,3 ±4,1 г/л) и 55,2 ± 3,1 г/л (в контроле 58,7 ± 3,6 г/л) соответственно (табл. 3).

Таким образом, результаты, полученные после 30 суток воздействия газом, свидетельствуют о токсическом действии данного поллютанта на структуры печени, что проявляется функциональными изменениями.

Через 60 суток эксперимента наблюдается прогрессирование изменений в структурах печени и в биохимических показателях. Ацинарное строение не

нарушено, на многих препаратах отмечается извилистость синусоидных капилляров с нарушением балочного расположения гепатоцитов. Отмечается отек стромы, более выраженный в области триад. Регенераторная активность гепатоцитов прогрессивно нарастает, что прояатается увеличением числа двуя-дерных гепатоцитов (табл. 1). Максимальное количество гипертрофированных гепатоцитов определяется вокруг портальных триад, что согласуется с данными об их высокой чувствительности к гипоксии и повышенной способностью к физиологической регенерации (Романов Ю.А., Савченко Т.Н., 1986). В структуре портальных трактов происходят выраженные изменения, они расширены и умеренно полнокровны, местами определяются деформированные триады с участками геморрагий. Стенка сосудов инфильтрирована клетками и утолщена. Мышечная оболочка артериол неоднородно окрашена, нет упорядоченного циркулярного расположения ядер миоцитов, прогрессируют признаки отека. В периваскулярном интерстиции сосудов триад присутствует смешанная лим-фомоноцитарная инфильтрация очагового характера, интенсивно окрашенная гематоксилином. Изучение состояния структур окрашиванием по Ван Гизону в печени показало явную пикринофилию мышечных оболочек артериол и нарастающую фуксинофшшю периваскулярного пространства как сосудов портальных трактов, так и центральных вен.

Центральные вены определяются в состоянии дилатации, о чем свидетельствует увеличение диаметра (табл. 1). Известно, что перед впадением в центральную вену, синусоидные капилляры имеют приспособления, регулирующие ток крови и напоминающие сфинктеры. Ряд авторов предполагает, что это активированные клетки Купфера (Ефименко H.A. с соавт., 2003). Именно это обстоятельство может объяснить интенсивное кровенаполнение гемокапилляров, задержку токсических веществ и их избыточный контакт с клетками печени. Не стоит забывать и о зональной гетерогенности гепатоцитов, которая дополняется наличием межзональных различий в микроциркуляторной системе печеночных ацинусов. Отношение площади, занимаемой синусоидами, ко всей площади зоны, наиболее высоко в перивенулярной зоне (Орешкин Н.И. с соавт., 1978; Мишнев О.Д. с соавт., 1991), но диаметр гемокапилляров здесь меньше. В перипорталыюй зоне большая величина поверхности синусоидов и в нормальных условиях более благоприятные условия для обмена между кровью и гепатоцитамии (Lemoine Р. et al., 1982). Однако перипортальным гепатоцитам необходимо больше кислорода, поскольку они обладают большей способностью к аэробному обеспечению метаболизма (Loud А. V., 1968).

Биохимические исследования концентрации молочной и пировиноградной кислот по истечении 60 суток показывают нарастание гипоксии (рис. 3). Уменьшается детоксикационная емкость печеночных клеток, увеличивается количество метаболитов, образующихся в результате анаэробного дыхания. Нарастающая концентрация токсических веществ вызывает повреждения паренхимы печени. Морфологически это проявляется наличием в промежуточных зонах печеночных ацинусов некротизированных клеткок, образующих мелкие очаги с перифокальным воспалением.

ММОЛТ'Л

8 Т--........

—а—-Д (очо'пиыыгс'гога

6 4

О

ГГнромиог^адксм

контроль 30 суток 6«) суток у(> суток 120 суток 150 суток

Рис. 3. Изменение содержания молочной и пировиноградной кислот при хроническом ингаляционном воздействии сероводородсодержащим газом в концентрации 3 мг/мЗ по сероводороду (ммоль/л).

В цитоплазме эпителиальных клеток печени объем гликогеновых отложений значительно снизился. Поскольку данные включения являются неотъемлемым компонентом анаэробного гликолиза, а также в образования метаболитов типа пшкуроновой кислоты, участвующей в детоксикации, то этот феномен следует рассматривать как проявление механизма адаптации. Разные по степени содержания мукополисахаридов клетки интерстиция окрашиваются не одинаково, что придает неоднородность паренхиме печени. Однако можно отметить, что шикогенсодержащих клеток больше концентрируется вокруг портальных трактов. Это согласуется с данными, что гликолиз преобладает в перивенулярной зоне (Арцимович Н.Г. с соавт., 1992; .Татщегтапп К., Ка1г N.. 1982). С учетом нарастающей потребности организма и самой печени в условиях воздействия природного газа в питательных субстратах, расход глюкозы увеличивается, соответственно концентрация гликогеновых отложений уменьшается. В биохимических исследованиях крови сохраняется тенденция к повышению ОХ и холестерина ЛПНП (табл. 2), обеспечивающего возрастающие потребности тканей в нем, как в строительном материале. Количество ЛПВП в крови уменьшается (рис. 2). Это можно объяснить снижением акцепторных свойств ЛПВП из-за изменения белкового компонента, а именно снижения относительной концентрации альбуминов (табл. 3). Изменение соотношения белков в пользу относительного увеличения глобулинов и вследствие этого дефицит белкового компонента для формирования липопротеидов, а также снижение экскреторной способности мембран гепатоцитов способствуют накоплению в печени свободных жирных кислот, ТГ, структурных липидов и формированию избыточного количества липидных включений в гепатоцитах, что мы наблюдаем при окрашивании тканей печени Суданом III.

Таблица 3.

Показатели белкового обмена в сыворотке крови лабораторных животных при хроническом ингаляционном воздействии сероводородсодержащим газом

в концентрации 3 мг/мЗ, М ± m

Ж.ПйІчіМЙНГа Пскйзаі-гяя

Обижй. :(% ov общбга fewaj Глоб да'йыЗДУ га a( объезд Отношение і

toiftpoiib r)»15 тлігА ES;7>a.S '{58315 Д-: .3 і 4:1 1,4 ї 0.1

ЗО с*щ». 55,2: і 2,ї pm 44. : і 4.3 1 ;2ö i 0.0" :

60 «vre«.' S1.4't її,4 48,4 ± 2,8 :t5S%S 43,0 і 3.S МГ%) ¡,125:0,03*

SB etye». ff-14 Щ-Ґ?/-" 40.Г* г:.9 Ї'Л%> 3S.Sx3,ö ¡49%; 1,0 і Ö.07-

.120 ciyoK пИ2 73,8 1 ES' 37.2 (50",5%) 38,4 і 3,2 .(43.5%) ІШ t 0.08...................

ISOcSetöK '42,S і 3.7 (52%) ЗЭ.З і 2,7 (Ш) ■i,bs.i0,ir

Примечание: * - разница с контролем достоверна при р<0,05

Через 90 суток от начала эксперимента нарастают морфологические признаки нарушения гастоархитектоники печеночной ткани. Заметно нарушение структуры печеночного ацинуса с дископлексацией балочной структуры в отдельных его участках. Местами определяется вакуолизация и разрушения ге-патоцитов, преимущественно в промежуточных зонах ацинуса. Процессы регенерации, проявляющиеся гипертрофией гепатоцитов и полиплоидией ядер, снизились по сравнению с предыдущим сроком. Триады местами деформированы с явлениями лимфогистиоцитарной инфильтрации и фибротизащш вокруг сосудов, появляется интенсивная фуксинофилия нериваскулярной области. Отложение коллагена здесь носит как гомогенный, так и пучковый характер. Ядра эндотелиоцитов в сосудах набухшие, располагаются группами и возвышаются над внутренней стенкой сосуда. В периваскулярной области возле сосудистой стенки появляются гомогенные с единичными клетками участки, проявляющие интенсивную эозинофилию. Толщина стенок заметно не изменяется, но увеличивается просвет сосуда, особенно вен. Эластические волокна в сосудистой стенки подвергаются фрагментации, а кое-где дезорганизации. В препаратах печени, окрашенных фуксино-сернистой кислотой, отмечается значительное снижение содержания запасов гликогена в гепатоцитах. При анализе микропрепаратов создается впечатление оптически пустых клеток, имеющих хорошо выраженную оболочку. Это связано с возросшей потребностью в условиях токсического действия в субстратах клеточного дыхания всего организма. Более выраженное окрашивание по-прежнему сохраняется вокруг печеночных триад, поскольку именно в этих клетках интенсивнее происходит пиюконеоге-нез (ЪМвшшга Т. й а1., 1984; ОшзЮгГГ В., 1985). При этом от одной триады к другой формируются «дорожки», имеющие интенсивную ШИК-реакцию. Увеличение шикогеновых отложений в цитоплазме клеток промежуточной зоны

ацинусов можно расценить, как подготовку клеток к синтезу компонентов межклеточного вещества. Эта зона получает наименьшее количество кислорода и испытывает большее действие гипоксии. Известно, что гипоксия стимулирует выработку цитокшюв макрофагами, стимулированные фибробласты, увеличивают синтез эластических белков и коллагеновых фибрилл, что приводит к уплотнению и утолщению тканевого матрикса между триадами.

Максимальные изменения определяются через 120 суток эксперимента. Большинство печеночных ацинусов деформировано с нарушенной балочной системой расположения гепатоцитов. Регенераторные возможности гепатоци-тов снизились по сравнению с предыдущим сроком (табл. 1), что возможно, связано с токсическим действием компонентов природного газа на генетический аппарат клеток. Наибольшим изменениям подвергаются области триад: выявляется их деформация, связанная с наличием лимфогистиоцитарных инфильтратов. Площадь инфильтратов достоверно не изменилась по сравнению с предыдущими сроками эксперимента (табл. 1). Не отмечено улучшений и со стороны центральных вен. Чередующиеся этапы активации синусоидных клеток печени, сменяющих друг друга, ведут к хронизации болезни. В основе токсического повреждения печени решающее значение имеет непосредственное действие химического вещества на печеночную клетку, а именно мембраны эндоплазматического ретикулума. В результате нарушается проницаемость мембран, с выходом в кровь ферментов (в первую очередь, локализованных в цитоплазме), о чем свидетельствует нарастающая концентрация AJIT и ACT. Изменяются поверхностные свойства мембран эндоплазматического ретикулума с диссоциацией рибосом и нарушением синтеза белка. Резкое уменьшение белкового синтеза, а именно альбуминов, и, вследствие этого, дефицит белкового компонента для формирования липопротеидов способствуют дальнейшему накоплению в печени свободных жирных кислот, ТГ, структурных липидов и развитию жировой инфильтрации гепатоцитов(Нап D.W., 2002). Наряду с этим, вследствие метаболизма токсического вещества, нарастает образование свободных радикалов, которые являются инициаторами ПОЛ мембран эндоп-лазматической сети с последующим высвобождением активных ферментов и гибелью клеток. Вследствие взаимодействия яда с мембранами эндоплазматического ретикулума образуются лизолецитины (Laskin J.D. et al., 2001), которые могут вызывать второй этап повреждения клетки, ее дегенерацию, что проявляется наличием очагов некроза гепатоцитов.

Вследствие нарушения сложных биохимических процессов в печеночной клетке, ядро ее получает импульс для перестройки, обеспечивающей пролиферацию (Бустаманте Д. с соавт., 2001). Процессы дегенерации и регенерации идут параллельно. Преобладание процессов пролиферации ведет к восстановлению нарушенных функций гепатоцитов, что мы наблюдали в ранние сроки эксперимента. Усиление процессов дегенерации приводит к прогрессированию изменений в печеночных клетках с некрозом и последующим развитием фиброза. При повреждениях печени химическими веществами в малых дозах вслед за процессом дегенерации печеночных клеток после прекращения действия токсических веществ наступают, а в большом числе случаев и преобладают, процессы функциональной и морфологической регенерации. К числу факторов, определяющих механизмы развития сложных биохимических процессов в печени, относится и расстройство интралобулярного кровообращения с последу -

ющей ишемией и развивающейся вследствие этого пшоксемией, что приводит к раннему нарушению ферментных систем субклеточных структур гепатоци-тов. Гипоксия, активация клеток Купфера и клеток Ито, высокая концентрация провоспалительных цитокинов обуславливает интенсификацию процессов коллагенообразования, особенно в зонах, недополучающих кислород. Таким образом, между портальным трактами в промежуточных зонах ащшусов появляется уплотнение матрикса, еще более усугубляющее гемодинамические расстройства.

Так называемый восстановительный период, т.е. через 30 суток после окончания воздействия природным газом демонстрирует некоторую положительную динамик}'. Отмечается увеличение количества полиплоидных клеток и уменьшение клеточной инфильтрации. В паренхиме печени продолжаются процессы фибротизации, степень микроциркуляторных расстройств снижается по сравнению со 120 сутками эксперимента. Отсутствие обратного развития деструктивных процессов подтверждает хроническую направленность явлений фиброза. Биохимические показатели демонстрируют положительную динамик}' в направлении процессов восстановления, но полной нормализации процесса К этому периоду не наступает.

Выводы.

1. На начальных этапах хронического воздействия природного газа изменения в паренхиме печени носят функциональный характер, что проявляется активацией и гипертрофией печеночных макрофагов, нарастанием клеточной инфильтрации, а также нарастанием полиплоидизации гепатоцитов по сравнению с интактными животными. На поздних сроках эксперимента нарастающее нарушение метаболического равновесия в результате повреждающего действия сероводородсодержащего газа приводит к структурным изменениям печеночной дольки и перестройке микроциркуляторного русла в результате прогрессирующей пролиферации соединительной ткани.

2. Хроническое действие природного газа приводит к изменениям в сосудах микроциркуляторного русла: усилению клеточной инфильтрации, отеку, преобразованию капиллярного русла, усилению проницаемости, последующему интенсивному коллагенообразованию в периваскулярной зоне сосудов портальных триад.

3. Хроническая ингаляция природного газа сопровождается нарушением метаболизма в печени с соответствующим изменением гистохимической картины. В связи с возросшей потребностью в субстратах клеточного дыхания в условиях токсического действия газа количество углеводов в периферических зонах ацинусов по сравнению с интактными животными снижается. Интенсивная ШИК-позитивная реакция и высокое содержание белка в структурах центральных зон ацинусов свидетельствует об активной пролиферации соединительной ткани. В цитоплазме клеток паренхимы увеличивается содержание липидов.

4. В результате изменения метаболизма гепатоцитов по мере увеличения срока эксперимента уменьшается концентрация альбуминов крови и ЛПВП, увеличивается содержание глобулинов, продуктов анаэробного гликолиза, трансаминаз, холестерина и тришицеридов, ЛПНП и ЛПОНП.

5. Хроническое воздействие токсиканта в малых концентрациях вызывает структурные изменения в печени, сохраняющиеся через 30 суток после окон-

чания эксперимента. Положительную динамику восстановительного периода демонстрируют, в основном, биохимические показатели крови Практические рекомендации.

1. Результаты диссертационного исследования рекомендуется к использо-

ванию в комплексе мероприятий профилактических медицинских осмотров инженерно-технических работников газовой промышленности региона.

2. Полученный в работе фактический материал об эффектах действия малых

доз сероводородсодержащего газа на структуры печени рекомендуется учитывать при разработке нормативов предельно допустимых концентраций газа в производственных помещениях и санитарно-защитной зоне, прилегающей к газодобывающим и газоперерабатывающим предприятиям.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Панкратова, Е.Ю. Морфологические изменения микроциркуляторнош

русла респираторной системы и желудочно-кишечного тракта при воздействии токсических веществ / Т. А. Шишкина, Л.И. Наумова, И.Ю. Чернова, Е.Ю. Панкратова // Материалы конференции молодых ученых «Микроциркуляция человека в норме и патологии (экспериментальные и клинические аспекты) 26-27 февраля 2009 г. - Астрахань, 2009. - С. 24-27.

2. Панкратова,Е.Ю. Оценка функциональнойактивностимикроциркулятор-

нош русла на фоне хронического действия сероводородсодержащего газа / Шишкина Т. А., Наумова Л.И., Панкратова Е.Ю., И.Ю. Чекунова// Материалы конференции молодых ученых «Микроциркуляция человека в норме и патологии (экспериментальные и клинические аспекты) 26-27 февраля 2009 г. - Астрахань, 2009. - С.30-33.

3. Панкрашова Е.Ю. Морфологические изменения паренхимы печени при

хроническом воздействии сероводородсодержащего газа Астраханского месторождения / Л.И. Наумова, A.A. Осипов, Е.Ю. Панкратова // Морфология. - 2009. - № 4. - Том 136. - С. 105.

4. Панкрашова, Е.Ю. Иммуногистохимическая идентификация альфа-фе-топротеина при механических и токсических повреждениях печени в эксперименте / О.В. Мусатов, Е.Ю. Панкрашова, O.A. Луцева, A.B. Ко-ханов, Т.Ф. Макерова // Материалы конференции 86-й Итоговой Научно-практической конференции сотрудников академии, врачей города и области, Астрахань, 2009г - С. 71-72..

5. Панкрашова, Е.Ю. Альфа-фетопротеин и изоферментный спектр щелоч-

ных фосфотаз при механических и токсических повреждениях печени в условиях хронического эксперимента / О.В. Мусатов, A.B. Коханов, С.А. Зурнаджан, Е.Ю. Панкрашова, O.A. Луцева, P.A. Медведев // Астраханский медицинский журнал. - 2010. - Том 5. - №1. -С.203-205.

6. Панкрашова, Е.Ю. Морфологическая характеристика компонентов пече-

ни при действии природного газа / Е.Ю. Панкрашова, Л.И. Наумова, Т. А. Шишкина // «Бабу хине кие чтения в Орле» 1-2 июня 2011 г. Материалы 8-й Всероссийской научной конференции. - С.191-192.

7. Панкрашова, Е.Ю. Токсическое действие природного газа на структурные

компоненты печени / Л.И. Наумова, Е.Ю. Панкрашова, Т.А. Шишкина // Морфология. - 2011. - №5. - С. 103.

8. Панкратова, Е.Ю. Действие низких концентраций природного газа на

процессы сводонорадикального окисления в печени / Л.И. Наумова, Е.Ю. Панкратова, Т. А. Шишкина, И.Ю. Чекунова // Материалы II Международной научной конференции, посвятенпой 80-летию академика РАЕН, заслуженного работника высшей школы РФ, д.б.н., профессора Д.Л. Теплого, г. Астрахань, 2011г: - С. 169-171.

9. Панкратова, Е.Ю. Оценка морфологических изменений в печени при

воздействии стрессовых антропогенных факторов / Е.Ю. Панкратова, Л.И. Наумова, Т.А. Шишкина, И.Ю. Чекунова П Материалы II Международной научной конференции, посвященной 80-летию академика РАЕН, заслуженного работника высшей школы РФ, д.б.н., профессора Д.Л. Теплого, г. Астрахань, 2011г. - С.82-84.

10. Панкратова, Е.Ю. Особенности метаболических процессов в структурах печени при действии токсических веществ / Е.Ю. Панкратова// Материалы II Международной научной конференции, посвященной 80-летию академика РАЕН, заслуженного работника высшей школы РФ, д.б.н., профессора Д.Л. Теплого, г. Астрахань, 2011г. - С. 190-192.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗА

АОС - АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА

ACT - АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗА

АТФ - АДЕНОЗИНТРИФОСФАТ

А/Г - АЛЬБУМИНОВО-ГЛОБУЛИНОВЫЙ ИНДЕКС

ЛПВП - ЛИПОПРОТЕИДЫ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ

ЛПОНП - ЛИПОПРОТЕИДЫ ОЧЕНЬ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ

ЛПНП - ЛИПОПРОТЕИДЫ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ

окЛПНП - ОКИСЛЕННЫЕ ЛИПОПРОТЕИДЫ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ

МДА - МАЛОНОВЫЙ ДИАЛЬДЕГИД

МК - МОЛОЧНАЯ КАСЛОТА

МЦР - МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОЕ РУСЛО

ОХ - ОБЩИЙ ХОЛЕСТЕРИН

ПВК - ПИРОВИНОГРАДНАЯ КИСЛОТА

ПДК - ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ

ПК - ПИРУВАТКИНАЗА

ПОЛ - ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ

Т1' - ТРИ1ЛИЦЕРИДЫ

Подписано к печати 29.02.2012. Объем 1 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ № Н-44 Отпечатано в типографии «Триада» Астрахань, ул. Савушкина, 61 «А», тел 8(8512) 600029.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Панкрашова, Елена Юрьевна, Астрахань

61 12-3/1155

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «АСТРАХАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

На правах рукописи

ПАНКРАШОВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУР ПЕЧЕНИ В НОРМЕ И ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ ПРИРОДНЫМ СЕРОВОДОРОДСОДЕРЖАЩИМ ГАЗОМ АСТРАХАНСКОГО

МЕСТОРОЖДЕНИЯ (Экспериментальное исследование)

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Л.И. Наумова

Астрахань - 2012

СОДЕРЖАНИЕ:

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................5-

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................П.

1Л Современные представления о структурных компонентах печени..............................................................................................................И-

1.2 Функциональная гетерогенность структур печени...................21.

1.3 Дезинтоксикационная и барьерная функции печени в норме и при действии абиотических факторов внешней среды..............................28.

1.4 Некоторые аспекты токсического действия природного газа на организм..................................................................................33.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................39.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ................56.

3.1 Морфологическое исследование печени в норме и при хроническом ингаляционном воздействии сероводородсодержащим газом....................................................................................56.

3.2. Исследование гистохимических изменений в печени лабораторных животных при хроническом ингаляционном воздействии

сероводородсодержащим газом................................................71.

3.3. Морфофункциональная характеристика микроциркуляторного

русла печени в норме и при воздействии природным газом.............83.

3.4. Изменения биохимических показателей у крыс при хронической ингаляции сероводородсодержащим газом.....................................94.

3.4.1. Изменение липидного обмена при хронической ингаляции сероводородсодержащего газа....................................................94.

3.4.2. Состояние перекисного окисления липидов при хронической ингаляции сероводородсодержащего газа......................................99.

3.4.3. Изменение углеводного обмена при хронической ингаляции

сероводородсодержащего газа..................................................102.

3.4.4. Изменение белкового обмена при хронической ингаляции сероводородсодержащего газа..................................................104.

3.4.5. Изучение содержания трансаминаз в сыворотке крови в норме и при воздействии природным газом.............................................107.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ............110.

ВЫВОДЫ.............................................................................................121.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ...........................................................123.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................124.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - АЛАНИНАМИНОТРАНСФЕРАЗА

АОС - АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА

ACT - АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗА

АТФ - АДЕНОЗИНТРИФОСФАТ

А/Г - АЛЬБУМИНОВО-ГЛОБУЛИНОВЫЙ ИНДЕКС

ГАГ - ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНЫ

eNOS - ЭНДОТЕЛИАЛЬНАЯ NO-СИНТАЗА

ИЛ, IL - ИНТЕРЛЕЙКИН

ЛДГ - ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА

ЛПВП - ЛИПОПРОТЕИДЫ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ

ЛПОНП - ЛИПОПРОТЕИДЫ ОЧЕНЬ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ

ЛПНП - ЛИПОПРОТЕИДЫ НИЗКОЙ плотности

окЛПНП - ОКИСЛЕННЫЕ ЛИПОПРОТЕИДЫ НИЗКОЙ

ПЛОТНОСТИ

МДА - МАЛОНОВЫЙ ДИАЛЬДЕГИД

МК - МОЛОЧНАЯ КАСЛОТА

МЦР - МИКРОЦИРКУЛЯТОРНОЕ РУСЛО

NO-ОКСИД АЗОТА

ОХ - ОБЩИЙ ХОЛЕСТЕРИН

ПВК - ПИРОВИНОГРАДНАЯ КИСЛОТА

ПДК - ПРЕДЕЛЬНО ДОПУСТИМАЯ КОНЦЕНТРАЦИЯ

ПК - ПИРУВАТКИНАЗА

ПОЛ - ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ ТГ - ТРИГЛИЦЕРИДЫ

ФНО-а, TNF-a - ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ - АЛЬФА

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Печень является органом, участвующим в сосудистых, секреторных, синтетических и метаболических процессах, обеспечивающих связывание и обезвреживание токсических веществ эндогенного и экзогенного происхождения, в результате которых обеспечивается гомеостаз (Захлебаева В.В, 2007; Здорнова О.В, 2010; Neyrinck A.M. et al., 2004).

Исследования функционального состояния структур гепатоцитов при воздействии токсических веществ в малых концентрациях представляет несомненный интерес, поскольку реакция печени на токсиканты определяет реактивность организма. Снижение функциональной способности печеночных клеток ведет к нарушению антитоксической функции печени (Суханова В.А., Думкина Г.З., 1975).

Ухудшение экологической ситуации в результате воздействия химических токсикантов является одним из факторов, определяющих изменение физиологических функций и процессов физиологической адаптации в человеческом организме и обуславливающих развитие широкого спектра заболеваний, в том числе печени (Забродский П.Ф., 1994; Боева О.И., 1998; Fleming L.E. et al., 1992). Уже в начальный период промышленно-профессиональной интоксикации изменяется состав и функции печеночных клеток, связанные с активной трансформацией в ней ксенобиотиков (Яковлева В.В. с соавт., 1995).

Нарастающие темпы научно-технического прогресса вызывают массу проблем в вопросах охраны окружающей среды, в профилактике и лечении экологически обусловленных заболеваний. Безотходные технологии химической, нефтеперерабатывающей и газовой промышленностей являются реальностью далекого будущего, а в настоящее время именно они возглавляют список самых вредных производств (Резаев А.А. с соавт., 1996,

Агаджанян H.A. с соавт., 2000, Трубников Г.А. с соавт., 2002, Кузьмина Л.П., 2008, Мадаева И.М. с соавт., 2009).

Астраханский газоперерабатывающий комплекс стал основным источником загрязнения атмосферы в Астраханской области за счет регулярного выброса продуктов переработки газа и его конденсата. В результате рабочие и жители прилежащих населенных территорий оказываются в зоне продолжительного воздействия

сероводородсодержащего газа, концентрация которого в окружающем воздухе чаще всего не превышает предельно допустимой. Распространенность патологии печени и желчевыводящих путей среди людей перечисленных категорий рассматривается многими исследователями как результат негативного влияния природного газа (Великанов Э.Б. с соавт., 1989, Орлов М.А., Давыдова Л. Д., 1991; Воробьева Т.Б. с соавт, 2000, Бучин В.Н. с соавт., 2007, Ломтева Т.Ф., 2002, Бучина

A.B., 2004, Пюрведжалова Э.Б., 2004).

Поражения печени при воздействиях малых доз органических и неорганических химических токсикантов, их сочетаний зачастую клинически протекает бессимптомно, создавая иллюзию медико-социального благополучия, затрудняя и осложняя диагностический процесс (Hodgson M.J. et al., 1991). В связи с этим проблема понимания структурно-функциональных изменений и последующей диагностики поражений печени малыми концентрациями природного газа Астраханского месторождения приобретает большое практическое значение.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: дать морфофункциональную

характеристику структурам печени в норме и при хроническом

ингаляционном воздействии природным газом Астраханского месторождения.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) Изучить структурную организацию печени крыс в норме и при хроническом ингаляционном воздействии природным газом Астраханского

месторождения в течение 120 суток.

2) Провести анализ метаболической функции печени путем изучения биохимической и гистохимической характеристики различных видов обменов (белкового, липидного, углеводного) в норме и при хроническом ингаляционном воздействии природным газом Астраханского

месторождения в течение 120 суток.

3) Оценить резервные возможности структур печени через 30 суток после окончания воздействия природным газом Астраханского месторождения.

4) Определить зависимость между морфофункциональными изменениями и активностью метаболических процессов в структурах печени крыс при хроническом ингаляционном воздействии природным газом Астраханского месторождения в течение 120 суток и в восстановительный период.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. Впервые исследована морфология структурных и метаболических изменений в печени в динамике в норме и на фоне хронического воздействия сероводородсодержащим газом в концентрации, не превышающей предельно допустимой.

Дана характеристика метаболическим процессам в норме и в зависимости от срока ингаляционного воздействия природным газом низкой концентрации.

Впервые дано морфологическое обоснование преобразованиям микроциркуляторного русла печени в норме и в зависимости от длительности воздействия сероводородсодержащим газом.

Изучены регенераторные и адаптивные возможности структур печени в

восстановительный период.

По результатам исследования проведена оценка и выявлена взаимосвязь между структурными и метаболическими показателями в зависимости от срока хронического ингаляционного воздействия природным газом в концентрации по сероводороду 3 мг/м .

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Работа носит фундаментальный характер и представляет динамическую морфофункциональную характеристику структурных элементов печени крыс в норме, на фоне длительного воздействия сероводородсодержащим газом, а также в восстановительный период. Полученные данные позволяют выявить особенности структурных и метаболических преобразований в зависимости от срока хронического эксперимента и продемонстрировать негативное влияние длительно действующего природного газа с допустимой концентрацией сероводорода на состояние структурных элементов печени. Практическая значимость работы заключается в том, что она позволяет значительно расширить существующие представления о механизмах развития экологически обусловленной патологии печени и подвести морфологическую базу для объяснения некоторых клинических и диагностических проявлений заболеваний печени. Разработанный комплексный подход дает возможность не только в деталях охарактеризовать гистологические и гистохимические изменения в структурах печени, но и представить общую картину взаимодействующих процессов.

Полученные данные внедрены для преподавания соответствующих разделов гистологии, патологической и нормальной физиологии, патологической анатомии, биохимии. Результаты исследования могут быть

использованы в написании монографий, руководств по гепатологии, токсикологии и патологической анатомии и служить в качестве методической основы для последующих исследований в этой области. Рекомендуется включать биохимические исследования крови для определения степени структурных и функциональных изменений печени при ее токсическом повреждении. Результаты исследования могут быть приняты во внимание при разработке нормативов предельно допустимых концентраций газа в производственных помещениях и санитарно-защитной зоне, прилегающей к газодобывающим и газоперерабатывающим предприятиям

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Степень структурных и метаболических изменений в печени зависит от длительности воздействия природным газом в предельно допустимой концентрации.

2. Длительное воздействие сероводородсодержащего газа в предельно допустимых концентрациях вызывает изменение биохимических показателей крови (общего белка, количества альбуминов, общего холестерина, липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), липопротеидов высокой плотности (ЛПВП), липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП), триглицеридов, молочной и пировиноградной кислоты, АЛТ и ACT) сопоставимых с динамикой метаболических процессов в структурах печени.

3. Длительное влияние природного газа в концентрации по сероводороду Змг/м3 вызывает стойкие гистологические изменения в печени, сохраняющиеся в течение месяца после прекращения его воздействия.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты работы доложены и обсуждены на конференциях:

«Микроциркуляция человека в норме и патологии (экспериментальные и клинические аспекты)», Астрахань, 26-27 февраля 2009.; на IV Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов, Саратов, 23 - 25 сентября 2009; на 86-й Итоговой Научно-практической конференции сотрудников академии, врачей города и области, Астрахань, 2009; на 7-ой Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины», Астрахань, 3-8 мая 2010; на конференции «Бабухинские чтения в Орле», Орел, 2011; на III Эмбриологическом симпозиуме Всероссийского научного медицинского общества анатомов, гистологов, эмбриологов «ЮГРА-ЭМБРИО-2011. Закономерности эмбрио-фетальных морфогенезов у человека и позвоночных животных», Ханты-Мансийск, 5-6 октября 2011, на II международной научной конференции, посвященной 80-летию академика РАЕН, заслуженного работника высшей школы РФ, д.б.н., профессора Д.Л. Теплого, Астрахань, 2011.

и

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные представления о структурных компонентах

печени

Роль печени в поддержании гомеостаза организма определяется ее участием в регуляции и осуществлении всех видов обмена. Помимо этого печень является центром химической переработки веществ, поступающих из пищеварительного тракта и образующихся в процессах метаболизма. Интерес патологов, физиологов, морфологов и биохимиков к роли печени в обменных и дезинтоксикационных процессах не угасает на протяжении последних десятилетий, о чем свидетельствует значительное число публикаций (Блюгер А.Ф., 1988; Вишневская Е.К., 1993; Бунятан Н.Д., 1999; Ban R., 2002; Abubakar М. G., 2003).

Разнообразие функций печени обусловлено особенностями ультраструктуры клеток, составляющих ее паренхиму и строму. В настоящее время существует три представления о структурных единицах печени: классическая и портальная дольки и ацинус. Эти модели созданы на основании изучения печени в различных условиях. Следует иметь в виду, что они не исключают одна другую, а отражают разнообразные стороны морфологии и функции печени (Хрущев Г.К., Бродский В.Я., 1961; Quintana А. et al., 1996). Все три вида структурно-функциональных единиц печени построены из клеток, образующих паренхиматозную (гепатоциты) и непаренхиматозную фракции. Последняя объединяет все типы клеток печени, за исключением гепатоцитов.

Гепатоцит - полигональная клетка с двумя полюсами: синусоидальным и билиарным, различающимися характером расположения органелл и функций (Серов В.В., Лапшин К.Н., 1988). Клеточная

поверхность гепатоцитов имеет базолатеральный компартмент, контактирующий с пространством Диссе, и соседними клетками; и апикальный компартмент обращенный в просвет желчных капилляров. Одним из отличий плазматической мембраны апикальной и базолатеральной поверхностей гепатоцитов, является неоднородность липидного и белкового состава, который сохраняется благодаря плотным контактам (Ihrke G. et al., 1993; Ihrke G. et al, 1998; Zegers M.M., Hoekstra D., 1998). Некоторые авторы выделяют еще и третью зону плазматической мембраны, боковую, - не участвующую в процессах секреции (Bender N.K. et al., 1998).

Мембрана данной клетки характеризуется высокой избирательностью переноса веществ из крови в гепатоцит и обратно (Калинин В.Ю., 2000). Цитоплазма богата ферментами цикла Кребса, пентозофосфатного цикла, гликолитическими, а также ферментами, участвующими в обмене аминокислот, синтезе белка, ДНК и РНК (Хазанов А.И., 1989; Подымова С.Д., 1998). В гепатоците обнаружено большое количество митохондрий, в которых одновременно с окислительным фосфорилированием осуществляется синтез основных ферментов дыхательной цепи, фосфолипидов и белков. Форма и расположение митохондрий в клетках печени разнообразны и также, по мнению исследователей, зависят от функционального состояния и местоположения клетки в дольке (Бреслер В.М. с соавт., 1969; Секамова С.М., Бекетова Т.П., 1975; Калашникова М.М., 2003).

В центролобулярных гепатоцитах крыс и мышей многочисленные митохондрии имеют вид нитей около 2-3 мкм в длину, нередко складывающихся в короткие цепочки. В гепатоцитах периферических отделов дольки большинство митохондрий имеет вид округлых образований

диаметром около 1-1,5 мкм с меньшим количеством крист (Анацкая О.В., 1989).

Цитоплазма гепатоцитов печени взрослых животных имеет сложное строение и разделена на компартменты в соответствии с выполняемыми функциями. Обнаруживается хорошо развитая эндоплазматическая сеть, играющая важную роль в качестве органеллы внутриклеточного транспорта. В шероховатом эндоплазматическом ретикулуме синтезируется значительное число белков, таких как альбумины, белки свертывающей системы крови (фибриноген и протромбин), плазмопротеины и другие глобулины. (Dallner J.W., De Pierre G., 1982). Еще одна важная функция этой органеллы - детоксикационная, основным компонентом которой является цитохром P-450-зависимая система монооксигеназ (Биленко М.В., 1989; Тризно H.H. с соавт., 1993).

В осуществлении функции дезинтоксикации немалую роль играют лизосомы, в которых определяется наличие таких ферментов, как кислая фосфотаза, катеп