Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие эукариотических аминоацил-тРНК синтетаз с рибосомами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие эукариотических аминоацил-тРНК синтетаз с рибосомами"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

САНА САРА

УДК 677.217:337.32

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ АМИНОАЦИЛ—тРНК СИНТЕТАЗ С РИБОСОМАМИ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев - 1992

работа ВИ1ДДН0ЯП в отделе мвханавыов транодяцаа генотачеокой информации Института молекулярной йяолохии и генетики АН Украины

Научный руководите^:

чдан-коррвотждваг ¿Я Украшш, доктор биологических наук, профеосор ¿.В. Епъакая

Офшдшшша оппоненты:

доктор биологических ыаузс О.М. Цяатотов

каадидаг ¿лолстичемшх неук Т.Н. Г чонош

'Вэдукдя организация:

Институт биооргашгееоксШ химии е кефтоззшш АН Украины

Ёадата даоаертацаа оосгонхоя

1292 х.

в__ часов на заседании Спехдаалхшаровашюго оозата Д 016.11.01-

Ишздагута молекулярной йаодагнн ц гекемкЕ АН Украины по адраоу: 252148, Каав-143, ул. Байологаого, 150.

, 0 дксооргадаэй шало ознакомиться в байншгеко Инотнтута • тлсяулярной биологж а генетика АН Украшщ.

Автореферат разослан

" 9 ■■ &/7/геиЛ 19Э2 г>

Учений секретарь Спецшлгшроаонного совета

канд. (Засл. наук' А Л.Л. Лукаи

ОЩДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

¿уруяльчость проблемы. Аданоацил-тРНК синтотазы (АРСазы, Ш 6.1.1) играют ключэву» роль в экспрессии генома, катализируя вы-оокоспецифичкое ашшоацшшрованяе тРНХ (Киоелев а др., 1984). Эта ферменты являются однш из основных ввэнъов регуляции биосинтеза болка на уровне транолядии а вносят значительный вклад в обеспечение эффективности и высокой точности этого процеоса. АРСазы эу-кариотических организмов характеризуются рядом специфических черт. К ним следует отнести болаа выоокие значения молекулярных маоо по сравнению о прокариотичеокима аналогами, выраженные гидрофобные овойотва, высокое сродство к полианионам, функционирование в составе высокомолекулярных комплексов, ассоциацию о рибосомами л системой клеточных мембран (Mirande, 1991). Благодаря этим свойствам АРСазы в значительной мере обеспечивают компартменталиэацию белоксинтеаируицего ашхарата вукариотичеокой клетки.

К настоящему времени наименее изученным остается вопрос о взаимодействии еукариотических АРСаа о рибооомами. Выоказадо предположение о том, что аволвдиошю приобретенное сродство эукарио-тических. ферментов в рРНК служат для юс частичной компартментали-зации на полирибосомаг (Alshanova et al., I980j Spirin, AJtkho-8hin, 1985), a обратимое изменение этого ородотва монет изменять компартменгадизацшо АРСаа а таким образом регулировать скорость трансляции (Aiehanova et ai., 1982). Однако в настоящее время отсутствуют данные о непосредственном механизме синтетазно-рибо-сомного взаимодействия и его значонии. Определенную ясность в понимание такого взаимодействия может внести изучение АРСаз, -.ассоциированных с полнрабосомаыи при различных уровнях биосинтеза белка, а также влияния рибосом а их оубчаотиц на акгивнооть и свойства етих ферментов.

Uедь и задачи доследование. Учитывая актуальность вшлеизло-жешюй проблемы, целью настоящей работа явилось изучение характе ра взаимодействия эукариотическшс АРСаэ о рабосомаии.

В соответствии о поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить соотношение свободных и агрегированных фор« АРСаз при различных уровнях биосинтеза <5елка.

2. Изучить влияние рибосом и рибоеомных оубчаотиц на кинетические параметры реакции аминоацилирования тРНК.

3. Исследовать влияние рибосом а рибосошшх субчастиц на термастабшькосгь лейцил-тРЯК оинтетазы в составе высокомолекулярного комплекса.

ратная новизна. В настоящей работе впервые детально изучено влияние рибосом и рибосошшх субчастиц на кинетические параметры реакции аминоаця лирования. Установлено, что рибосомы увеличивают каталитическую активность лейцал-тРНК оинтетазы в составе высо!сомолекулярного комплекса АРСаз из печени кроликов. Впервые показано, что такое влияние рибосом и рибосомных субчастиц частично связано с увеличением положительной кинетической кооператив-ности двух центров связывания тРНК лейцил-тРШ синтетазой в реакции аминоацшшрования.

Установлено, что АРСазы, ассоциированные с полирибосомада, более устойчивы к тепловой инактивации, чей свободные ферменты, а добавление рнбооом и ах субчастиц повышает термостабильность лойцил-тРЙС синтетазы в составе высокамолекулярного когдшекса.

На двух модельных системах показано, что при изменении уровня биосинтеза белка изменяется соотношение свободных и ассоциированных с полирибосомаыи АРСаз.

Теоретическая пешость работу. Полученные результаты расширяют наши представления о взаимодействии эукариотических АРСаз о рибосошли и свидетельствуют о стимулировании рибосомами каталитической активности АРСаз. Различия в активности и в свойствах свободных и ассоциированных с рибосомами АРСаз, а также изменение этого соотношения при изменении уровня а скорости биосинтеза белка в определенной каре могут свидетельствовать о возможности регуляции биосинтеза белка в еукариотаческих клетках путем изменения компартментализации АРСаз на рибосомах. Шесте о тш данные проведенных исследований могут быть полезными для разработка путей и средств нормализации белкового обмена в органах при некоторых патологических состояниях.

Аагобашя пабоук- Материалы диссертации докладывались на Международном симпозиума "Рефляция трансляции" (Рига, 1983); Международной конференции "Биосинтез белка" (Цущано, 1991).

Дубликат,. ш материалам диссертации опубликованы 2 статьи.

Шьем работу. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов е списка литературы (200 на-

.именований). Работа изложена на 102 страницах машинописного икота, содержит 7 таблиц и 9 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы В опытах использовали печень кроликов и молочную яелезу коров. Суммарные препараты тРИК из печени получала депротеинизада-ей гошгената ткани фонолой о последущей хроматографией РНК на ДйАЭ-цоллюлозе (Brungraber, 1962). Препараты АРСаз из пичони Кр0.1Шса выделяли по модифицированному методу Keller, Zamechnic (1956),. Для выделения высокомолекулярных комплексов АРСаз из печени кроликов использовали метод Deutscher (1974), основанный на мягкой гомогенизации ткани с последующей хроматографией гост-рабосомной фракции на сефадекое G-2CO. Активность АРСаз определяли по начальной скорости реакции а'лияоацшшрования тРШ£ / лэёцином при насьшшдах концентрациях: субстратов. Реакционная смесь в объеме 100 мкл содержала 100-150 мМ трис-нс1 (pH 7,8), 15 ьй KCl, 5 мМ MgCi2, 10 Ш AtB, 0,09 Ш /^С/лейцин, 100-150 шег суммарного препарата тРНК, 10-15 шсс белка высокомолекулярных комплексов АРСаз. Реакционную смесь инкубировали при 37 °С в течение а мин. Реакцию останавливали добавлением IO-кратного объема охлажденной 10 %-яой. Ш. Ооадки наносили на фильтры Whatman gf/c, прешзада 40-50 мл 5 $-но2 НУ, высушивала а определяли радиоактивность на сцинтилляционном очетчике в толуолового епдн-тиллятора.

Терыоинактивацию лейцил-тРНК синтетазы в составе высокомолекулярного .кошлекса АРСаз изучали при 42 °С. Константы торьгоинак-тивацииС^) определяли согласно Chuang, Beil (1972). Препараты суммарных рибосом ввделяпи по методике Vattstein et ai.(i963). Для освобождения АРСаз от рибосом последние промывали раствором, содершщш 0,5 Ы kci в течение 20 ш при 4 °с. Свободные от АРСаз рибосомы осаздали ульграцантрифугированием при 105 ООО s в течете 90. мин. tos- д боз-субчастицн рибооом из печени кроликов получала по методика, в основе которой леяшт схема Faivey, staecholin (1970). Экстракцию рибосошшх белков проводили по методу Shertcn, Vooi (1974). Седимбнтационныа анализ посгрибосом-ных экстрактов молочной келезы проводили в ультрацентрифуге "ар 65" (Германия), (ротор S5-40) ари 4 °С. Константы седиментации комплексов АРСаз определяли до методике Martin, Amss (1961). Кинетические константы рассчитывали по программе "Enzfitter".

Результаты и их обсуждение

Онот-ипшаияв' свободных а агрегиро^нто^^аш рвШтлг-тРНК ощэтади в ткани молочной железы ДРД ЕШтечвдк ЁШШШШШШШ Как ошечалось. вше, образование высокомолекулярных коынлек-сов АРСаа, а такие кошартмеиталазацак етих ферментов на полира-босоиах. uoiyr вносить определенный вклад о регуляцию биосшареза белка в вукариотичооких клетках (Еяьокал и др., IS90; spirin, аз-tkhozhin, 1985).

Для изучения вопроса о соотношении свободных и агрегированных форм АРСаз в клетках, характеризувдахзя разными уровнями биосинтеза белка, использовали молочную яелезу коров до первой лактации (железа телок) и в состоянии лактации.

Изввотш, что в ьшочкой яелезе при лактации интенсивность биосинтеза белка достигает исключительно высокого уровня, при отш синтезируются в основной два белка - казеиновый комплекс и ß -лшсюгдабулая, существенна отличающихся цо аййшокислотноку составу от белков ткани шгезя (itcKenazie, 1967). Вместе о этим установлена адаптация наборов тРЫК и АРОаэ Си в результате - фонда амиаоацид-тРЯК) к ашнокиодотному ооставу етих белков (ei'oka-уа et ai., 197^). В чаотнооти, при лактации уровень активности лейцил-тШК шнтетазы в гошгенато полочной гелезы увеличивается в 3 раза. Не исключено, что обнаруженное увеличение ферментативной активности овязано о изменением степени агрегирования АРСаэы в условиях синтеза в ткана качественно новых белков. Справедливость в того предположения была проверена при сравнении доли ш-ноацкл-тШК сонтетазных активностей ферментов, находящихся в свободном и ассоциированном состоянии в лактируицей молочной железе и железе телок. Так, быш определены ле&дал-, валил-, треонил- и фенилаланил-тРНК синтетазкые активности белковых фракций при гель-фильтрацаа па сефадексе g-200 пострнбоссмной надосадочной аидкооти гоыогенатов ткани молочной аелезы. Выбор етих ферментов бит обусловлен различиями в прочвооти асооциацаа их з составе комплекса (Киселев, 1984).

Как видно из табл. I, изученные ашшоацил-тРНК синтета?ы в случае лактируицей аелезы локализованы преимущественно во фракции высокомолекулярных комплексов АРСаз, в отличие от ферментов из

гелегы телок. Полученные доныне свидетельствуют о том, что в клетках о повышенной нптансивносгью биосинтеза белка АРСазы, вероятно, функционируют в основном в составе высокомолекулярных комплексов. „ „ т

Таблица I

Распределение активности {%) аминоацал-тРНК оантетаз между I и П фракциями при гель-фидьграцаи на сефадэксе а-гоо пострибосомных оупернатантов молочной хелозц

Аыиноацал-тРШС синтетаза

¡¡актирующая молочная железа

г&мючная геле за телок

I П I Л

Лейцал-тРНК

синтетаза 87 13 63 37

Фенилаланил-тРЕК

синтетаза 93 8 75 24

Трэоншх-тРНК

синтетаза 81 19 82 68

Валил-тРНК

синтетаза вв 12 84 16

д^яцдзд^. I фракция соответствует высокомолекулярному комплексу АРСаз; П-в основной свободный АРСазаы. Активность рассчитана как процент суммарной активноота пооташтоховдриалънсго сулер-натанта тканей.

Таблица 2

Распределение лейцил-гРЕК сиятетазной активности в экстрактах тканей молочной железы коров

Исследуемый орган Исследуемая фракция

4-108 10-208 20-358 Еибосамная фракция

Ыолочная нелеэа

телка 11,3 31,4 54,4 2,9

Лактирующая

молочная яелеза 2,1 15,0 73,4 9,5

Дрикочаиие. Активноогь рассчитана как процент суммарной активности постыитоховдриального оупернатанта тканей.

Как отмечалось виню, увеличение уровня биосинтеза белка в молочной келеве в период лактации сопровождается значительным увеличением активности лейцал-тЕШС синтетазы. Методом ультраденг-рифугированяя в градиенте плотности сахарозы (10-30 %) обнаружено,' что с началом лактации происходит практически полное шрерао-проделаши лейдал-тРЫК синтетазы из фракции свободных, форм фермента во фракцию высокомолекулярных комплексов (табл. 2). Необходимо отметить, что активность лейцил-тРНК синтетазы обнаруживается также и в рибосомной фракции. Как свидетельствуют данные табл. 2, 9,5 и 2,9 % дейцил-тРНК синтетазной активности безмитохоццри-альша экстрактов содераихся в рабосомных фракциях лактирущой молочной железы коров и железы телок соответственно, что также . может быть связана с увеличением интенсивности биосинтеза белка при изменении функционального состояния органа.

с коллшбосомами в ноше и поя экспериментальной таегдш мокама

Известно, что при экспериментальной ишемии миокарда (9Ш) имеет место нарушение биосинтеза белка как в самой сердечной мышце угасколюнас и др., 1989), так а в печени (Лекис и др., 1985). Причем показано, что в этом органе при указанной патологии существенно снижается уровень синтеза как общего белка, так и сывороточного альбушза (Лекис и др., 1985). Виесте с тем установлено, что в отличие от биологической активности тРНК активность АРСаз в экстрактах, печени кроликов значительно возрастает в первые сутки ЗШ (Дукошшичюо и др., 1983). Для выяснения вопроса, сопровождается ли нарушение биосинтеза бедка при ЗШ изменением ассоциации. втях.ферментов с рибосомами, была определена аминоадал-тРЩ синтвгазная активность во фракции полирабоссм печена кроликов в норме и через 12 ч после воопроизведешя ЗШ. Данные, приведенные в тс1л. а, свидетельствуют о том, что иа 13 исследованных АРСаз

с полирибосомами ассоциированы 8. Так, во фракции полирибо-оом не обнаружено активностей аланил-, глицил-, серад-, традтофа-нал- и тирозил-тРШ сантетаз. После воспроизведения ЗШ уменьшаются активности арташал-, глутадал-, лизид- и траонил-тРНК синте-таз, ассоциированных с полирибосомаш. Другие из изученных амино-ацпл-гРЩ синтетазных. активностей практически не изменяются.

Обнаруженное уменьшение аминоаци-тРНК синтетазных активно-

Таблица 3

Ашноацил-тРНК синтетазпые активности, ассоциированные о полирибосомаш печени кроликов,, в норме и через 12 ч после воспроизведения ЗИМ (усреднение по 6-8 опытам)

Аминокислотная специфичность

Активность (пмоль аминоацил-тРНК на I мг белка за I мин)

АРСазы Норма ЭШ

Аргинин 222+5 176+8

Глутаминовая кислота 86+7 51±3

Изолейцин 62+2 56+3*

Лейцин. 60+6 61+Пк

Лизин 209±7 134+8

йенилаланин. 220±24 212+18*

Треонин 21+2 14+2

Валин 223+24 226+16х

^Изменения, статистически недостоверные.

Таблица 4 ,

Аминоацил-тБШ сштетазше активности, ассоциированные о полирабосомами печени кроликов и освобожденные от полирибооом (усреднение по в опытам)

Аминокислотная

специфичность.

АРОазы

Активность (пмоль ашшоацил-тРНК на I мг белка за I мин)

В комплексе с полирибосомами

Освобояденныэ от полирибосог«

Аргинин

Глуташшовая

кислота

Изолейцин

Лейцин

Лизин

Фенилалашш

Треонин

Валин

222+5

86±7 6212 60+6 209±7 22С^24 21+2 223*24

225^19

27±3 5,310.4 25±2 2X5+8 234+6 46+5 256+20

ствй в пояирнбосшшй фракции, возлоеко, связано о частичной диссоциацией АРСаз из рибосом и перераспределением-их в цитоплазму. Именно посладаеа mo'ms быть одной из причин увеличения активности АРСаз в лосгрибооомвом экстракте печени кролика пра ЭШ (Иванов л др., 1989). Мояно также предположить, что изменение ассоциации АРСаз с полирибооомаш является одной из причин ошякашя скорости и уровня биосинтеза бзлса в печени при ЭШ.

Одним из возмо/дных механизмов изменения ассоциации АРСаз с рибосомами может быть модификация этих фарызнтов, в частности, фосфоршшрование (Sraugh, Pendergaat, I9S6), ЧТО ПРИВОДИТ К 338-меневгш ИХ ородства К высокшолэкулярноа РШ (Byazanov et al., 1987), которая, по возй видимости, принимает участие в связывании АРСаз с рибосомами.

Цель» следующей серии опытов явилось выяснение вопроса, влияет ли ассоциация АРСаз с полирибосомаиа на активность формантов. Как видно из табл. 4, во фракции балчоз, освобожденных от солири-босом, активность ферментов, специфичных к глуташновой кислоте, изолейдану, лейцину, значительно низе, чем у соответствующих ферментов, ассоциированных о полирибосомами, что моезт свидетельствовать о стимуляции последними активности этих АРСаз.

Взаимодействие лейцил-тРНК оактвтазн. ассоциированной в высокомолекулярный комплекс, о рибосомами

Пра анализе щюдвдущих исследований возник вопрос, являются ли существенными для каталитической активности АРСаз их взаимодействия о рибосомами г их субъодишщами. Исследования била проведены на лейцал-тРНК синтетаза, входящей в состав высокомолекулярного комплекса АРСаз, который, по вмещайся сведениям, vivo ассоциировав о рибосомами.

IIa рис.1 представдоны графика зависимости активности лей-цил-гРШ! синее газы, ассоциированной в высокомолекулярный комшгеко АРСаз, от концентрации рибосошых eos -субчастиц или eos-рибоооы. Эндогенная лейцал-тРНК сантетазваа активность использованных рабосошшх субчастиц на правышала при атом 3 % активности вносимого фермэнта.

Как видно из рисунка, лейцил-iPHK сиптетаза активируется в цриоутотвав как рибосом, так в их оубчаотиц. Бычий сывороточный альбумин (БСА) не сказывал подобного влияния на лейцил-тРЩ{ син-гетазу, что исключает несвещфическое огабшшзирупцеа действие рибосомЕьк субчастиц 2 рибосом. Кроме того, установлено отсутог-

о гз

£ 600 о

ш

СО

Л

о м

0/к • 0,6 1,2 1,6

Концентрация рибосом и БСА, мкМ

Pao. I. Влияние аоз -рибосом (I), eos- (2), адз- (3) субчастиц рибосом а БСА (4) аа актнвнооть лейпдя-тРШС синтетааы печена кроликов

вне активирующего, аффекта смеси рРШС а рибосомнызс белков, что свидетельствует о необходимости наивной структуры рабосомных. субчастпц а рибосом дня стщуляциа лейцал-тРЯК синтотазы.

Высказан рад предаолоавпай по поводу увеличения активности эукариотичзских АРСаз при добавлении рабоосм. К их числу относятся необходимость, оинтатазно-рибооошого взаккодействля дяя поддержания АРСаз В активной аокформацш (Carias et al., 1978; Уа-kubQwakl, 1979)} оинтетазна-рабосошое взаимодействие ускоряем использование АТР в реакции аминоацшшрования тРНК, а такее, возможно, рибосомы нкактивируют азгабатора АРСаз (Graf, 1979). Однако, вероятно, гш один аз праддоввнких механизмов во является универсальным а зависит от реальных "событий", которые происходят в клетке.

арсоширрванной в вноокомол&кудяряый комплекс, с тЩ в присутствии табосом и щбосомкых субчаотип

В качестве наиболее общей характеристики сродства тШйР®1* аминоацил-тВНК синтетазе из различных объектов используют значения констант Шхаэлиса - Мэнтен (K-,j) в реакции аминоаодлирования •тРНК. Для определения К^ был приманен классический подход, заключающийся в измерении начальных скоростей реакции (г. е. при глубине превращений да 5 %) и построении графика зависимости i/v от I//S/:

С и JáL + ,;

v у v

тах шах

где /s/ - концентрация субстрата тРНК; v - начальная скорость, реакции амшоацилирования тРНК; vmax - максимальная скорость реакции (Медаер, 1980; Коршш-Боуден, 1979) - Зависимость, i/v от I//S/ графически изображается прямой, которая отсекает на оои IA отрезок, равный Vvmax, и на оси i//s/ отрезок, равный (график Лайнуиаэра-Берка).

• Начальную скорость реакции аманоацилирования тРНсС определяли, варьируя концентрацию тРНК в пределах 5-40 ыкг, при насыщающих концентрациях других субстратов реакции.

В качестве параметра, характеризующего степень коодеративно-сти активных центров лейцал-тРНК еннтетазы, использовали коэффициент Хилла (%). Значение Кн соответствует наклону прямой, являющейся графический выражением зависимости ig /v/v -v/ от 1(5/8/ (график Хиляа). тах

Из данных, приведенных в табл. 5, следует, что добавление eos-рибосом и ах субчастиц приводит к увеличению к , что в определенной мера иоает свидетельствовать, об уввличвншкагагаги-ческой активности лейцшьтРНК синтетазы. В то ке время значение кая существенно снижается при добавлении в реакционную смесь eos -субчасгац и практически не изменяется при добавлении ^os-субчастиц и 803-рибосом. Возможно, присутствие бов-субчастиц повышает сродство лейцил-тРНК синтетазц к тРЩ.

Результаты определения значения коэффициента Хилла (табл. 5, рис. 2) указывают на шшжигельную кинетическую кооперативнооть двух центров связывания тРНК лейцил-тРНХ оштетазой в реакции ами-ноацалирования тРНК. Добавление рибосоа и их субчастиц приводит к

Рио. 2. Зависимость скорости реакции аминоацшшрования,

катализируемой лейцил-тРШС синтетазой, от концентрации тРНГ в координатах Хилла : а - без добавления рибосом; б - eos -рибосома; в - ч-os -оубчастяца рибосом; г - боБ-субчастида рибосом

Таблица 5

Влошне A-os-, eos -рябосомных оубчаотиц и eos-рабосом на кинетические параметры взаимодействия лейцид-тРБК оинхетааы с тРНК

Эффектор (нмоль на I мг как» %

белка аа £ мин) мкМ

Без рибосом 2,1 0,25 1,18

40S -оубчастица 4,6 0,27 1,45

60S -оубчастица 4.1 0,07 1,62

eos -рибосома 4,9 0,12 1,54

ккг£аз, рассчитана на I ыт бедка высокомолекулярного комплекса.

и 5 10 13 . 20

Концентрация пирофосфата, ыМ

Рио. 8. Иксибарование дейцид-тРНК синтетазы, ассоциированной в высокомолекулярный комплекс АРСаз, неорганический пиро-фосфагом: £ - 0,9 мкМ рибосомы; 2 - без добавления рибосом

увеличении положительной кооперативное™причем наибольший аффект наблвдается при добавлении 60S -рябоооыной оубчастицы. Мож-иа предположит!, что взаимодейотвие лойцил-тРИК синтетазы о рибосомой приводит к активации на ферменте второго центра "слабого" связывания тРНК, что сопровождается усилением положительной кооперативно ста активных центров лейцил-тШС синтетазы.

Одной из причин, обусловливающих стимулирующее действие рибосом на активность АРСаз, может быть ослабление (в их присутствий) воздействия некоторых ингибиторов реакции ашноацшшрования, одним из которых является неорганический nnpo$oo$ar(PPi) (Kuli et ai., 1969). Была исследована способность ppí ингибировагь реакцию аминоацилирования тРНК, катализируемую лейцил-тИ'К оннтэ-тазой, ассоциированной в высокомолекулярный хомплеко АРСаз. Как видно из- рис. 3, ингабирующий аффект рра наблвдался при белое высоких концентрациях, чем в исследованиях других авторов (Kuli, et al., 1969). По. всей видимости, это объясняется наличием в составе высошюлеиухчрных комплексов эндогенной неорганической пи-рофосфатазы (Исаков И др., 1284; Dignain, Deutscher, 1979).

Добавление рибосом в реакционнув смесь, содервдую практически. ш еншаот его шгибирующего влияния. В то дэ время присутствие ингибитора не уменьшает стимулирухвдого действия рибосом на активность фермента. Полученные данные свидетельствует о том, что стимулирующее действие рибосом в данном случав не связано со снятием ингибирующего влияния лирофосфата. Однако атот вопрос далек от окончательного, решения.

Влияние рибосом на тешостабильнооть. аминоашл-тРНК

На стабильность АРСаз в клетке может влиять их взаимодействие о компонентам! высокомолехулярных комплексов (Dang, 1982) а о рибосомами (Graf, 1976). Поэтому дальнейшие исследования была посвящены сравнительному изучении термоинактивацап ОЕободных а ассоциированных о поларябосомама АРСаз печена кроликов (табл. 6). Согласно данным табл. 6, АРСазы, выделенные в ассоциированном о полнрибооомада состоянии, более устойчивы к тепловой инактивации, чем свободные ферменты.

Дяя проверки специфичности стабилизирующего действия рибосом и их субчаотад била изучена термоинактивацая этого фэрмента в присутствии БСА, рРЫК и смеси рибосомных белков.

Таблица $

Теркояяактивацая аминоацил-тРНК оинтетаа, ассоциированных с аолирабосомами печени кроликов и освобожденных от полирибооом (усреднение но 4-6 опытам)

Аминокислотная " ~ ' к1> мин"1"

специфичность амииоацая-тРНК синтетаза Ассоциированные с полирибосомами. Освобоаденные от полирибосом

Аргинин 0,09±0,01 0,28±0,02

Лейцин 0,06±0,01 0.1С£0,01

Лизин 0,09*0,01 0,35+0,03

Валил 0,05+0,01 0,13+0,02

Как оказалось (табл. 7), БСА а рибосомные белки оказывают слабое протекторное воздействие, а рРШ практически не влияет на термостабильность фермента.

Таблица 7

Влияние рибосом, субчастиц рибосом, бычьего сывороточного альбумина, рибосошшх. белков и рЕНК на термостабильность лейцил-тРНК оинтетазы в составе высоксмсыш?улярного комплекса аманоацал-гРНК синтетаз из- печени кролика (усреднение по 4-6 опытам)

Зффекхор к,, мшГ1

0,16±0,01

803 -рибосома 0.04±0,01

608 -субчастица рибосом 0,06+0,01

403 -оубчастица рибосом 0,05+0,01

£СД 0,10+0,02

рРНК 0,13+0,03

Рибосомные белки 0,10+0,02

Можно предположить, что присутствие рибосом предотвращает конфорыациошше изменения АРСаз при термоинактивации, ведущие к потере ферментативной активности.

Детальному изучению этого вопроса будут посвящены дальнейшие исследования.

15 -ВЫВОДЫ

I* Установлено различие в соотношении свободных и ассоциированных с комплексами и полирибосомами ЛРСаэ при различных уровнях биосинтеза (Золка в эукариотических клетках:

а) содержание лейцол-тРЯК синтетаэы в составе высокомолекулярных комплексов выше в лактирующвй молочной железе, чем в железе телки;

б) с фракцией толирибосом в лакирующей молочной железе ассоциирована 9,5 % общей активности леЁцил-тРНК синтетазы лостми-тохондриального супернатанга, а в железе телки - 2,9

в) при Еиемил миокарда в печени кроликов уменьшается арги-нил-, гдутамил-, лизил- и треонил-тРНК синтетазные активности, ассоциированные с полирибосомаш, по сравнению с нормой.

2. Определено влияние рибосом и их-субчастиц на каталитическую актшзнооть АР Саз печени кроликов:

а) добавление 4os, 60S -субчастиц рибосом и eos -рибосом увеличивает значение ктт реакции амиюацилирования тРНК, катализируемой лейцил-тРНК синтетазой печени кроликов;

б) рибосомы и их субчастицы увеличивают положительную кинетическую кооперативность двух, центров связывания тРНК лейцал-тРНК синтетазой;

в) показано, что влияние рибосом на АРСазы не связано со снятием ингибирующего эффекта пирофосфата.

3. Установлено, что ферменты, выделенные в ассоциированном о полирибосомами состоянии, более устойчивы к тепловой инактивации, чем в свободной. Добавление рибосом а их субчастиц повышает тершстабидьность лейцшх-тРНК синтетазы в составе высокомолекулярного комплекса АР Саз печени кролика.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Взаимодействие эукариотических аминоацил-тРНК синтетаз о рибосомами / Сана Сара, Р.Ю. Шзурайтис, О.В. Харченко и др. // Биополимеры и клетка,- 1992.- I. 8, Л I.- С. I0I-I07.

2. Влияние рибосом на термостабпльнооть. аминоацвл-тРНК синтетаз печени кроликов / Сана Сара, Л.Л, Иванов, Г.В. З^рковская а др. // Биополимеры и клетка.- 1992.- Т. 8, Я 3.- 0. &-9.