Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение взаимодействия фактора елонгации трансляции 1альфа с эукариостическими аминоацил-тРНК синтетазами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение взаимодействия фактора елонгации трансляции 1альфа с эукариостическими аминоацил-тРНК синтетазами"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ Інститут молекулярної біології і генетики

Вивчення взаємодії фактора елонгації трансляції 1а з еукаріотичними аміноаціїл-тРНК синтетазами

03.00.03-молекулярна біологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ОД

УДК 577.152.611 577.217.535

Шалак В'ячеслав Федорович

Київ-1998

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор, академік НАН України Єльска Ганна Валентинівна,

ІМБіГ НАН України, зав. відділом

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Виноградова Руфіна Петрівна,

Київський Університет ім. Тараса Шевченка, кафедра біохімії, кандидат біологічних наук,

Харченко Ольга Володимирівна,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, старший науковий співробітник.

Провідна установа - Інститут біохімії ім.О.В.Палладіна

Захист відбудеться “42 ” Р1РО.&НЯ 1998 року о І2_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.86.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 252143, м.Київ-143, вул.Заболотного, 150

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Автореферат розісланий И Я 1998 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук

Лукаш Л.Л.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ ^ктуальпість проблеми Відомо, що як в прокаріотичних, так і в еукаріотичних клітинах, >сновні принципи процесу біосинтезу білка залишилися незмінними на протязі еволюції Weissbach et al.,1974, Moldave, 1985]. Однак, поряд з цим, виявлено суттєві відмінності гтрукгурної організації білок-синтезуючого апарату, особливо у вищих еукаріот. До таких зідмінностей можна віднести збільшення різноманітності та кількості факторів ініціації грансляції [Moldave, 1985, Pain, 1996], присутність стабільних високомолекулярних комплексів аміноацил-тРНК синтетаз [Mirande et al, 1982, Deutscher, 1984] та фактора їлонгації трансляції 1 (EF-1H, ValRS-EF-lH ) [Hattori et al., 1980, Motorin et al., 1988]. Іншою особливістю багатьох компонентів, що приймають участь в білковому синтезі є їх :порідненість до рибосомальної РНК [Ovchinnikov et al., 1978, Alzhanova et al., 1980], a гакож здатність взаємодіяти з цитоскелетним остовом еукаріотичної клітини [Howe et al., 1984, Mirande et a]., 1985]. Це надало підстави висунути гіпотезу про функціонування шарату трансляції вищих еукаріот, як високоорганізованої надмолекулярної структури, до є компаргменталізованою на полірибосомах [Spirin, 1978, Deutscher, 1984, Ryazanov et її., 1987].

Однією з потенційних переваг структурної компартменталізації є каналювання [“channeling”) метаболітів, що являє собою процес передачі субстрату від одного ферменту до іншого при здійсненні послідовних біохімічних реакцій на певному метаболічному шляху [Srere, 1987].

Передбачення, що каналювання субстратів в процесі білкового синтезу може мати ліспе in vivo, вперше було висловлено в роботі Спіріна [Spirin, 1988], а потім в роботі Зіварама та інш. [Sivaram et aL, 1990]. Далі ця гіпотеза отримала вагому експериментальну іідтримку при дослідженні активності апарату трансляції в клітинах вищих еукаріот в лмовах, що максимально зберігають їх інтактність [Negrutskii et al., 1991, 1992]. Сутність іапропонованого механізму каналювання полягає в тому, що аміноацил-тРНК предається їід аміноацил-тРНК синтетаз до фактора елонгації 1 і далі до рибосоми без дисоціації у шутрішнє середовище клітини. Це дає змогу забезпечити високу ефективність процесу, зникаючи сторонніх неспецифічних впливів, руйнування нестабільних проміжних сполук, і також шляхом узгодженої регуляції окремих стадій.

Однак необхідно зауважити, що дані, отримані в експериментах in vivo, показують шше загальну картину, але не дають достатньої інформації для визначення особливостей механізму каналювання аміноацил-тРНК на молекулярному рівні. Тому, беручи до уваги ипценаведене, актуальним є дослідження in vitro можливої взаємодії між окремими сомпонентами трансляційного апарату, що здійснюють послідовні реакції на цьому метаболічному шляху, а саме аміноацил-тРНК синтетазами та фактором елонгації 1а EF-la).

Мета та завдання дослідження Метою даної роботи є визначення принципової можливості взаємодії фактора елонгації трансляції 1а з еукаріотичними аміноацил-тРНК синтетазами, що передбачено гіпотезою каналювання аміноацил-тРНК в циклі елонгації білкового синтезу.

Для досягнення цієї мети необхідним було вирішення таких завданнь:

1. Розробити швидкий та ефективний метод очищення фактора елонгації трансляції ЕР-1а з печінки кроля та охарактеризувати його функціональну активність.

2. Виділити фенілаланіл-тРНК синтетазу з печінки кроля, як представника групи ферментів, які не входять до складу високомолекулярних комплексів.

3. Виділити мультиферментний комплекс, що складається з 9 аміноацил-тРНК синтетаз, та валіл-тРНК синтетазу (УаШБ), асоційовану з важкою формою фактора елонгації 1 (УаШЗ-ЕР-Ш). Для вирішення цього завдання оптимізувати метод одночасного паралельного очищення обох комплексів.

4. Застосовуючи метод стаціонарної кінетики, вивчити вплив ЕР- 1а*ООР(СТР) на каталітичну активність фенілаланіл-тРНК синтетази, деяких синтетаз у складі мультиферментного комплексу та валіл-тРНК синтетази.

Наукова новизна та практична пінність роботи В даній роботі представлено новий швидкий та ефективний метод очищення ЕР-1а з печінки кроля та охарактеризоване його функціональну активність.

Розроблено експрес-метод очищення фенілаланіл-тРНК синтетази та оптимізованс процедуру одночасного паралельного виділення мультиферментного комплексу та комплексу валіл-тРНК синтетази з ЕБ-ІН із печінки кроля.

Вперше показано стимулюючий вплив ЕР-1а»СОР та ЕР-1а*ОТР на каталітичну активність фенілаланіл-тРНК. синтетази в реакції аміноацилювання тРНК, а також ЕР-ІаЮИР - в реакції АТР-пірофосфатного обміну. Така функціональна взаємодія свідчиті на користь безпосередньої структурної взаємодії цих білків.

Вперше було вивчено вплив ЕР-1а на активність деяких аміноацил-тРНК синтетаз, що входять до складу високомолекулярних комплексів. Продемонстровано ефекі стимуляції каталітичної активності валіл-тРНК синтетази, яка зв'язана з ЕР-1Н, фактором елонгації 1а в присутності вТР. Передбачається, що ЕР-Іа+вТР, прискорює швидкість-лімітуючу стадію реакції, якою в даному випадку є стадія дисоціаціі синтезованої валіл-тРНК з ферменту. Запропоновано модель взаємодії ЕР-1а та валіл-тРНК синтетази, згідно з якою Уа1-тРНК'/е1 передається від ферменту до факторг елонгації. Показано, що на відміну від валіл-тРНК синтетази, асоційованої з ЕР-1Н, так ферменти як лізші-, аспартіл-, ізолейцин- та метионіл-тРНК синтетази, що входять де складу мультиферментного комплексу, не змінюють свою каталітичну активність з присутності як ЕР-1а*ОИР, так і ЕР-1а*ОТР.

Результати роботи можуть бути використаними для подальшого детального вивчення неканонічних взаємодій між компонентами апарату трансляції, що мають місце в процесі каналювання субстратів в білковому синтезі, а також регуляції активності апарату білкового синтезу в клітинах вищих еукаріот.

основному плану науково-дослідних робіт відділу механізмів трансляції генетичної інформації Інституту молекулярної біології і генетики НАН України. Робота виконувалася також при пидтримці грантів № 5.2/130 "Компартменталізація як один з механізмів регуляції білкового синтезу" та № 5.4/61 “Неканонічні взаємодії компонентів білок-синтезуючого апарату вищих еукаріот” Управління Міннауки України у справах науки і технологій.

Особистий внесок злобувача. Дисертаційна робота була виконана під керівництвом доктора біологічних наук, професора Єльської Г.В., а також у тісному співробітництві з к.б.н. Негруцьким Б.С. та Будкевич Т.В., з якими автор має спільні публікації. Наведені в рукописі результати були отримані здобувачем особисто або за безпосередньої участі при виконанні експериментів.

літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів та їх обговорення, заключения, висновків та списку літератури, який включає 158 джерел. Робота викладена на 150 гторінках машинописного тексту і містить 30 рисунків та 3 таблиці.

Апробація роботи Матеріали дисертації доповідались на міжнародній конференції по структурі та функції рибосом (Вікторія, Канада, 1995), 16 міжнародній робочій нараді по тРНК (Вісконзін-Медісон, США, 1995) та 17 міжнародній робочій нараді по тРНК 'Чіба, Японія, 1997).

ПублікяпіТ За матеріалами дисертації опубліковано 6 робіт.

Для виділення препаратів білків та тРНК використовували печінку дорослих кролів. Препарати сумарної тРНК отримували шляхом прямої депротеінізації тканини фенолом з послідуючою хроматографією РНК на DEAE-целюлозі [Brungraber, 1962]. Часткове фракціонування препарату сумарної тРНК проводили за допомогою зисокоефекгивної рідинної хроматографії на колонці С4 (обернена фаза). В гкспериментах використовували також препарат сумарної тРНК з дріжджів (“Boehringer Mannheim”, Німеччина).

Гель-елекгрофорез білків в денатуруючих умовах проводили по методу [Laemmli,, 1970], концентрацію білків визначали по методу [Bradford, 1976].

Активність EF-la по реакції ОВР/і’ніООР та GDP/[3H]GTP обміну визначали в нкубаційній суміші в об'ємі 40 мкл, що містила: 40 mM тріс НС1 pH 7.5, 0.5 тМ ДТГ, 10

L, Дисертація відповідає

Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

шМ МбС12, 100 тМ КН4С1, 1 мг/мл БСА, 2-200 цМ [3Н]ЭОР або [3Н]ОТР (1500Сі/то1), 25% гліцерин. Останнім у суміш вносили ЕР-1а, кінцева концентрація якого становила

0.2-2 цМ. Реакцію проводили на протязі 5 хвилин при 37 °С, потім зупиняли додаванням 1 мл холодного буферного розчину у складі: 20 тМ тріс НС1 pH 7.5, 10 тМ М£С12, 100 тМ ІЧН4С1, 10 тМ р-меркаптоеганол, 0.1 мг/мл БСА. Розведені проби відразу наносили на нітроцелюлозні фільтри (діаметр пор 0.45 цм) і обережно промивали тричі по 1 мл такого ж буферного розчину.

Вплив ЕР-1а*ООР(ОТР) на каталітичну активність аміноацил-тРНК синтетаз визначали в 100 мкл інкубаційної суміші, що містила в кінцевій концентрації: 20 тМ імідазол-НСІ pH 7.5, 1 тМ ШТ, 5 тМ МяС12, 3 тМ АТР, 1 мг/мл БСА, 60 цМ [14С]-мічена амінокислота (50 Сі/тої), 12.5 тМ ІЧН4С1, 100 цМ СгТР або ОБР, 10% гліцерин, насичаючу кількість тРНК (концентрація по індивідуальній тРНК становила 3.5 цМ), каталітичну кількість ферменту (вказується окремо для кожного експерименту), 5-50 пкмоль ЕР-1а*ООР(ОТР) (також вказується). Реакцію проводили в такому порядку. ЕР-1а попередньо інкубували в 20 мкл суміші, що містила 20 тМ тріс НС1 pH 7.5, 0.5 тМ ОТТ, 10 тМ МіС12, 100 тМ ЫН4С1, 1 мг/мл БСА 25% гліцерин, 200 цМ ОПР або СТР,

0.4-4 (іМ ЕР-1а, протягом 5 хвилин при 37°С для переведення в вТР або в ОБР форму. Як контроль замість ЕР-1а в суміш для попередньої інкубації вносили буферний розчин, в якому він зберігався. Після попередньої інкубації 14 мкл цієї суміші відбирали і додавали до 14 мкл розчину ферменту, розведеного до необхідної концентрації, буферним розчином, що складався з 10 тМ тріс НС1 pH 7.5, 4 мг/мл БСА 10 тМ р-меркаптоетанолу, 20% гліцерину. Ферментативну реакцію розпочинали додаванням 25 мкл змішаних розчинів білків до 75 мкл інкубаційної суміші, що в кінцевому об'ємі (100 мкл) містила вищевказані компоненти. Інкубацію проводили при 25°С, проміжок часу інкубації вказується. Кінетичні експерименти проводили методом відбору проб.

Вплив ЕР-1а*ОЭР на реакцію АТР-РРі-обміну, що каталізує фенілаланіл-тРНК синтетаза, визначали в 100 мкл інкубаційної суміші, що містила такі компоненти: 100 тМ НЕРЕБ pH 7.5, 2.5 тМ АТР, 5 тМ МгС12, 1 тМ фенілаланін, 1 тМ РРі (100 Сі/тої), 1 мг/мл БСА, 0.5 тМ ОТТ, 10% гліцерин, каталітичну кількість ферменту та 5-50 пкмоль ЕР-Іа+ЄОР (вказується окремо). Реакцію ініціювали додаванням суміші ферменту та ЕР-1а або ферменту та буферного розчину зберігання фактора елонгації (контроль). Інкубацію зразків проводили 5 хвилин при 37°С, або як зазначено окремо.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Розроблення швидкого та ефективного методу очищення еукаріотнчиого фактора елонгації трансляції 1а. Експрес-метод виділення фенілаланіл-тРЛК синтетази, оптимізація методу паралельного виділення високомолекулярного комплексу АРСаз та валіл-тРНК еннтетази, зв'язаної з важкою формою фактора елонгації 1.

Очищення фактора елонгації трансляції 1а з печінки кролів проводили в три етапи: гельфільтрація постмітохондріального супернатанту на сефакрилі 8-400,

хроматографія на DEAE-целюлозі та на SP-сефарозі. Чистота отриманого препарату білка становила більш ніж 90%, вихід - 2-3 мг EF-la з 50-60 г печінки. Активність фактора елонгації була перевірена за допомогою трьох тестів, а саме: в реакції зв'язування [3H]GDP, за здатністю стимулювати зв'язування Phe-TPHK11' з полі(и)-програмованими 80S рибосомами та за здатністю стимулювати синтез полі[І4С]фенілаланіну на полі(и)-програмованих 80S рибосомах. За допомогою високоефективної рідинної хроматографії показано, що кожна молекула EF-la утримує одну молекулу GDP.

Розроблено експрес-метод виділення фенілаланіл-тРНК синтетази з печінки кролів, що складається з таких стадій: фракціонування постмітохондріального

супернатанту поліетиленгліколем, аніоно-(DЕАЕ-целюлоза) та катіоно-(фосфоцелюлоза) обмінні хроматоірафії. Специфічна активність отриманого ферменту становила 171 нмоль фенілаланіл-тРНК/хв./мг білка (37°С), чистота згідно електрофорезу в денатуруючих умовах - більш ніж 80%.

Виділення високоочищеного мультиферментного комплексу аміноацил-тРНК синтетаз (АРСаз) та валіл-тРНК синтетази, асоційованої з важкою формою фактора елонгації 1 (ValRS-EF-lH), проводили паралельно з одного вихідного матеріалу, за такою оптимізованою схемою: фракціонування постмітохондріального супернатанту

поліетиленгліколем, гельфільтрація на BioGel A5m, хроматографія на тРНК-сефарозі. Остаточне очищення мультиферментного комплексу проводили на гідроксиапатиті Macro-Prep ceramic НА, комплексу ValRS-EF-lH — на аніонообміннику Source Q. 16 мг мультиферментного комплексу та 2 мг ValRS-EF-lH може бути отримано з 660 грам печінки кролів. Специфічна активність метионіл-, лізил-, ізолейцил-, лейцил-, аспартіл-та валіл-тРНК синтетаз становила 20, 54, 15, 10, 21 та 70 нмоль аміноацил-тРНК/хв./мг білка (25°С), відповідно.

Спорідненість EF-la до GDP та GTP.

Стабільвість комплексів EF-la* GDP та EF-la» GTP.

EF-la, виділений з печінки кроля за розробленим нами методом, містить одну молекулу GDP на молекулу фактора і, таким чином, являє собою EF-la*GDP комплекс. Для подальшого вивчення впливу EF-la на каталітичну активність аміноацил-тРНК синтетаз було необхідним: а) визначити спорідненість EF-la до GTP, з метою оптимізації умов для переведення EF-la в GTP-зв'язану форму; б) через те, що EF-la є лабільним білком [Nagata et al., 1976], перевірити стабільність EF-la+GDP та EF-la*GTP під час інкубації з компонентами суміші для аміноацилювання тРНК.

Експерименти по обміну зв'язаного з EF-la [3H]GDP на вільні GDP та GTP показали, що виділений нами EF-la має однакову спорідненість, до гуанозинди- та трифосфату, що узгоджується з даними, незалежно отриманими різними групами дослідників для фактора елонгації, який було виділено іншими методами [Nagata et al.,

1977, Carvalho et al., 1984, Crechet et al., 1986]. Це дало нам можливість для утворення комплексу EF-la*GTP проводити реакцію прямого обміну GDP на GTP без додавання GTP-регенеруючої системи, яка звичайно використовується для переведення прокаріотичного фактора EF-Tu в GTP-зв'язану форму [Joshi et аі.,1986, Delaria et al., 1991], тому що останній має в 100 раз більшу спорідненість до GDP ніж до GTP. '

Для контролю ступеня утворення EF-la*GTP ми використовували інкубацію вихідного препарату фактора елонгації з [3H]GTP. Як відображено в Таблиці 1 при 300 кратному надлишку GTP (375 цМ) EF-la майже повністю переходить в комплекс з цим нуклеотидом. Концентрація взятого для реакції EF-la*GDP становила 1.25 цМ. Для порівняння в таблиці приведено значення кількості угворенного EF-la*GTP в присутності нуклеотид-обмінюючих факторів, а саме важкої форми фактора елонгаціїї.

Таблиця 1

Утворення EF-la*[3H]GTP комплексу при різних концентраціях [3H]GTP.

Концентрація [^HJGTP, цМ Концентрація утвореного EF-la*[3H]GTP, цМ Ступінь переведення в GTP-зв'язану форму, %

125 0.96 76.8

250 1.06 84.8

375 1.16 92.8

125 цМ GTP + 11.6 пМ ValRS-EF-lH комплекс 1.14 91.2

Отже, нами було оптимізовано умови для переведення еукаріотичного фактора елонгації в GTP-форму. Однак, залишалось невизначеним наскільки утворений комплекс фактора з нуклеотидом буде стабільним протягом інкубації в суміші з компонентами, необхідними для реакції аміноацилювання тРНК, а також досить низькою концентрацією гліцерину (10%). Згідно з Рис.1 комплекси EF-la*[3H]GTP та EF-la*[3H]GDP залишаються стабільними на протязі принаймні 20 хвилин при 25°С в інкубаційній суміші, що містила: 20 шМ імідазол НС1 pH 7.5, 1 mM DTT, 5 тМ MgCl2, 10 тМ NH4C1,

50 тМ КС1, 1 мг/мл БСА, 3 тМ АТР, 10% гліцерин.

Рис.1. Стабільність комплексів EF-la*[3H]GTP{U) та EF-la*[3H]GDPO під час інкубації при 2J*C.

Комплекси утворювали як описано в Матеріалах та методах, потім розводили буферним розчином, який містив компоненти, необхідні для реакції аміноацилювання (вказано в тексті). Через певний проміжок часу аліквоти відбирали та наносили на нітроцелюлозні фільтри.

Час, хвилини

Таким чином, за даних умов інкубації обидва комплекси фактора елонгації не руйнуються і можуть бути використані при вивченні їх впливу на каталітичні властивості аміноацил-тРНК синтетаз.

Визначення впливу ЕГ-1а па каталітичну активність аміноацил-тРНК синтетаз.

Стимуляція активності фенілаланіл-тРНК синтетази у присутності ЕЕ-Іа'ЄОР та ЕР-Іа*СТР.

Першим об'єктом, який ми використали для вивчення взаємодії між аміноацил-гРНК синтетазами та Еїї-Іа була фенілаланіл-тРНК синтетаза (РЬеГ^). Цей фермент належить до групи так званих “вільних” АРСаз, які не були поки що знайдені в комплексі з іншими ферментами, однак вирізняється між ними завдяки своїй здатності асоціювати з рибосомами [РаіІІіег еі аі., 1984].

Як показано на Рис.2, як ЕР-1а*ОТР, так і ЕР-1а*СгВР впливає на каталітичну жгивність РЬеЯЗ, збільшуючи початкову швидкість реакції синтезу РЬе-тРНКИіе. Значення Уо в присутності фактора елонгації становить 2.42 ггкмоль РЬе-тРНКРЬс/хв., що принаймні в два рази більше, ніж для цього ферменту в контрольній інкубаційній :уміші (Уо =1.19 пкмоль/хв.). Слід зазначити, що стимулюючий ефект фактора елонгації :постерігався в оптимальних для РЬеЯБ умовах, тобто при насичуючих кількостях :убстратів (Матеріали та методи), а також 100 шМ концентрації КС1. Більш того, вплив ЕР- 1а на активність РЬеКБ зберігався однаковим в разі заміни гомологічної тРНК (з іечінки кроля) на тРНК з дріжджів.

Рис.2. Кінетика реакції утворення фенілаланіл-тРНК, що каталізує РкеЯВ, в присутності ЕР-1а*СТР та 100 цМ ЄТР (•), ЕР-1а*вОР та 100 (ЇМ ЄйР (■), 100 рМ вТР (О), 100 цМ СйР (□). Концентрація фенілаланіл-тРНК синтетази становила 0.5 пМ, ЕР-1а - 500 пМ. Як субстрат

використовували сумарну тРНК з печінки кроля (збагачення по тРНК^

-3%).

Час інкубації, хвилини

Як свідчить Рис.З, залежність початкової швидкості реакції синтезу РЬе-тРНКГЬс іід концентрації ЕР-1а в інкубаційній суміші має сигмоїдальний характер. При заміні іукаріотичного фактора елонгації його бактеріальним аналогом було визначено, що ЕР-Ти

не виявляє помітного стимулюючого ефекту, незважаючи на подібність його функції у білковому синтезі (Рис. 3).

Рис.З. Вплив різних конценртацій ЕЕ-1а (■) та ЕЕ-Ти (О) на початкову швидкість реакції утворення РЬе-тРНК?ке. Концентрація РЬеЯЗ становила 1.7 пМ. Як субстрат використовували сумарну тРНК з печінки кроля (збагачення по тРНКРІ1' - 3%). Реакцію проводили на протязі З хвилин при 25°С.

Необхідно відмітити, шо механізм реакції аміноацилювання (порядок приєднання субстратів та дисоціації продуктів, швидкість-лімітуючу стадію), яку каталізує фенілаланіл-тРНК синтетаза, детально було вивчено лише для прокаріотичних та дріжджових ферментів. Для фенілаланіл-тРНК синтетази з Е. соїі та з дріжджів було показано, що конформаційні зміни молекули ферменту при утворенні складноефірного зв'язку між фенілаланіном та тРНК, визначають швидкість загальної реакції [Fasiolo et al., 1978, Dibbelt et al., 1981, Baltzinger et al., 1982].

Як вже було зазначено вище, як EF-la*GDP, так і EF-la*GTP, в однаковій мірі збільшують початкову швидкість реакції, яку каталізує фенілаланіл-тРНК синтетаза (Рис.4). Це означає, що відбувається вплив фактора елонгації саме на швидкість-лімітуючу стадію роботи ферменту. Оскільки за оптимальних умов проведення реакції утворення складноефірного зв'язку між фенілаланіном та тРНК в активному центрі ферменту є найповільнішим, EF-la якимось чином може прискорювати цей процес. Сигмоїдальний характер кривої залежності початкової швидкості реакції, що каталізує PheRS (Рис.З), від концентрації EF-la, яка є типовою для алостеричної активації ферментів, свідчить на користь того, що, вплив EF-la на каталітичну активність фенілаланіл-тРНК синтетази відбувається через взаємодію двох білків.

Для подальшого вивчення феномену EF-la-опосередкованої стимуляції активності фенілаланіл-тРНК синтетази ми використовували реакцію АТР-РРгобміну. Загальновідомо, що на першій стадії ферментативної реакції аміноацилювання тРНК відбувається утворення зв'язаного з ферментом аміноациладенілату та пірофосфату. Для фенілаланіл-тРНК синтетази цю стадію можна записати таким чином:

Phe + ATP + PheRS ------*■ PheRS*(Phe~AMP) +PPS.

Для спостереження за цим процесом до інкубаційної суміші додають АТР, фенілаланін, [32Р]РРі і вимірюють початкову швидкість включення [32Р]РРі в АТР.

Як показано на Рис. 4, кінетика утворення [32Р)АТР в реакції, яку каталізує PheRS, у відсутності та присутності EF-la*GDP є різною.

Рис.4. Кінетика реакції АТР-РРі обміну, що каталізує фенілаланіл-тРНК

синтетаза, у відсутності (□) та присутності (Ш) EF-la. Лінія з символами (•) позначає власну активність EF-la в реакції АТР-РР; обміну. Концентрація PheRS становила 5nM, EF-la - 300 пМ. Реакцію

проводили при 37°С.

Час, хвилини

Фактор елонгації підвищує швидкість ізотопного обміну приблизно в 1.5 рази, при цьому власна здатність каталізувати уворення [32Р1АТР є відсутньою. Одним із пояснень такого ефекту ЕР-1а може бути те, що, впливаючи на конформаційну рухливість активних центрів РЬеНЯ, фактор елонгації може підвищувати швидкість утворення аміноациладенілатного комплексу, що і призводить в кінцевому результаті до збільшення швидкості зворотньої реакції.

Сигмоїдальний характер кривої, яка описує залежність початкової швидкості АТР-РР,-

обміну від концентрації доданого ЕР-1а, (Рис.5) також свідчить на користь прямої взаємодії між двома білками.

Рис.5. Вплив різних концентрацій ЕР-1а на початкову швидкість реакції АТР-РРі обміну, що каталізує фенілаланіл-тРНК синтетаза.

Концентрація РЬеНБ становила 5 пМ. Реакцію проводили 3 хвилини при 37°С. Пунктирна лінія показує активність ферменту у відсутності фактора елонгації

EF-la даваного, пкмгш^ІООмкл

Таким чином, експерименти по ATP-PPj-обміну, показують, що вплив EF-la на активність фенілаланіл-тРНК синтетази, відбувається вже на стадії активації фенілаланіну, яка не потребує присутності тРНК. Це підтверджує припущення про те, що стимуляція каталітичної активності цього ферменту, ймовірніше за все, є наслідком білок-білкової взаємодії з фактором елонгації. Однак детальний механізм впливу EF-la на конформаційну рухливість активних центрів фенілаланіл-тРНК синтетази поки що залишається нерозкритим і потребує більш детального вивчення.

Необхідно відмітити що, отримані результати не дають можливості розглядати феномен факторзалежної активації фенілаланіл-тРНК синтетази з точки зору моделі каналювання аміноацил-тРНК в циклі елонгації білкового синтезу. Так як стадією, що лімітує швидкість реакції утворення РЬе-тРНК, не є дисоціація цього продукту з ферменту, ми не можемо оцінити чи відбувається вивільнення фенілаланіл-тРНК з фенілаланіл-тРНК синтетази безпосередньо у розчин, чи все ж таки має місце її перенесення на фактор елонгації.

Стимуляція активності валіл-тРНК синтетази, зв'язаної з EF-1H, у присутності EF-la та GTP.

Згідно з гіпотезою каналювання аміноацил-тРНК в циклі елонгації білкового синтезу ValRS-EF-lH може розглядатись як найбільш “досконале” структурне утворення, компоненти якого здатні здійснювати послідовні біохімчні реакці на даному метаболічному шляху. Цей гетеротипний комплекс містить валіл-тРНК сичтетазу (ValRS), білкові фактори (EF-1PyS), які каталізують GDP/GTP обмін, та EF-la, що у GTP-зв'язаній формі здатен акцептувати аміноацил-тРНК і переносити її до рибосоми.

Вплив EF-la на каталітичну активність валіл-тРНК синтетази визначали як описано в Матеріалах та методах в умовах низької іонної сили в інкубаційній суміші. Як свідчить Рис.бА, початкова швидкість реакції утворення Val-TPHKVal підвищувалась лише в присутності EF-la та GTP (V0 = 2 пкмоль/хв.), тоді як в контрольній інкубаційній суміші, в присутності GTP, V0 дорівнювала 1 пкмоль/хв.. EF-la*GDP як 1 вільна GDP не викликали підвищення каталітичної активності валіл-тРНК синтетази, V0 становила 1.2 пкмоль/хв. та 0.9 пкмоль/хв. відповідно (Рис.бА). Такий ефект стимуляції ValRS спотерігався лише при використанні гомологічної тРНК як субстрату. При використанні тРНК з дріжджів ми не спостерігали значного впливу EF-la, як в присутності GTP, так і GDP, на початкову швидкість реакції, що каталізує валіл-тРНК синтетаза (Рис.бБ). Цікаво, що при порівнянні двох експериментів (Рис.бА та 6Б) видно, що активність ValRS в присутності гомологічної тРНК більш ніж в два рази менша, ніж з тРНК з дріжджів за однакових умов проведення реакції (V0 = 1 та 2.5 пкмоль/хв., відповідно).

Час, хвилини Час, хвилини

Рис.6. Кінетика реакції утворення VaI-mPHKy"‘, що каталізує валіл-тРНК синтетаза в складі важкої форми фактора елонгації 1, в присутності EF-la та 100/tM GTP (•), EF-la та lOOfiM GDP (Ш), ЮОцМ GTP (О), ІООцМ GDP (□). Концентрація VaIRS-EF-lH становила 0.32 nM, концентрація EF-la - 500 пМ. Рис.бА - як субстрат використовували частково фракціоновану сумарну тРНК з печінки кроля (збагачення по тРНКУаІ- 30%), Рис.бБ - сумарну тРНК дріжджів (збагачення по тРНКУа1 - 3%).

Таким чином, гомологічна тРНК в умовах низької концентрації моновалентних катіонів в інкубаційній суміші виступає як “специфічний інгібітор” валіл-тРНК синтетази, при аміноацилюванні якої фермент робить меншу кількість каталітичних оборотів, ніж з негомалогічною тРНК.

Як свідчить наступний експеримент (Рис.7) різниця початкової швидкості аміноацилювання гомологічної тРНК та тРНК з дріжджів зменшується при підвищенні

концентрації КС1 в інкубаційній суміші.

Концентрація КСІ, тМ

Рис.7. Залежність початкової швидкості реакції, що каталізує валіл-тРНК синтетаза, у присутності гомологічної тРНК та тРНК з дріжджів при різних концентраціях КСІ в інкубаційній суміші. Концентрація УаШБ-ЕР-ІН комплексу становила 0.5 пМ, тРНКУи1 (гомологічної та дріжджової) - 3.5 цМ. Сумарна тРНК з дріжджів мала збагачення по тРНКУа1 3%, частково фракціонована сумарна тРНК з печінки кроля - 30%. Реакцію проводили 10 хвилин при 25°С.

При оптимальній концентрації моновалентних катіонів (150 mM КСІ) ефекгивнісп аміноацилювання обох видів тРНК “комплексною” валіл-тРНК синтетазою є однаковок (kcat=1.05 сек"1). Все це дає підстави припустити, що за умов низької іонної сили і і присутності гомологічної тРНК, стадія дисоціація синтезованої Уа1-тРНКУій з фермент) починає лімітувати загальну швидкість каталітичної реакції. Дане припущення можні пояснити тим, що гомологічна тРНК має більшу спорідненість до ферменту, ніж тРНК дріжджів, що і обумовлює її більш повільну дисоціацію після приєднанії* амінокислотного залишку. При оптимальній концентрації КСІ та незначна різниця ) спорідненості обох тРНК до ферменту може зникати завдяки іонній силі, що екрануе додаткові сайти взаємодії між валіл-тРНК синтетазою та її гомологічною тРНК.

Каталітичний механізм функціонування валіл-тРНК синтетази детально булс описано для ферменту з дріжджів [Kern et al., 1981]. В цій роботі показано, що стадія, як лімітує швидкість реакції, що каталізує ValRS, може змінюватись в залежності від іонно: сили в інкубаційній суміші. У відсутності КСІ саме дисоціація валіл-тРНК з фермент) стає найповільнішим процесом, що і визначає швидкість загальної реакції [Кет et al., 1981].

Отже, приймаючи до уваги викладене вище, можна зробити висновок, що прі низькій іонній силі в інкубаційній суміші стадія, яка лімітує швидкість реакції аміноацилювання гомологічної тРНК валіл-тРНК синтетазою, є дисоціація Val-TPHKVal: ферменту. Зважаючи на це, ефект стимуляції активності валіл-тРНК синтетази EF-la*GTP можна пояснити тим, що фактор елонгації зв'язує синтезовану Уа1-тРНКУа1, прискорюючи її дисоціацію з ферменту.

Незважаючи на те, що прокаріотичний фактор елонгації також має спорідненісті до еукаріотичних аміноацил-тРНК, присутність EF-Tu*GTP, навіть у більш високії концентрації в інкубаційній суміші (2000 пМ), ніж EF-la, не впливає на каталітичн) активність “комплексної” валіл-тРНК синтетази. Ймовірно, для того щоб здійснювалосі перенесення синтезованої Уа1-тРНКУа1 від ферменту до EF-Tu»GTP, необхідне зв'язування останього з субодиницями EF-1H, які б орієнтували прокаріотичний факгоц елонгації в положення, необхідне для взаємодії з валіл-тРНК синтетазою.

Отже, приймаючи до уваги вшцевикладене, механізм взаємодії EF-la та валіл-тРНК синтетази, можна проілюструвати за допомогою такої моделі (Рис.8). EF-la*GDI зв'язується з р та 5 субодиницями EF-1H, після обміну GDP на GTP, фактор еяонгацї орієнтується певним чином відносно активного центру валіл-тРНК синтетази. Пісж завершення каталітичного акту ферментом, акцептгорне стебло тРНК з приедаю» валіном вивільняється з активного центру, однак повної дисоціації Уа1-тРНКУа1 н« відбувається [Кеглі et аі., 1981]. Фактор елонгації зв'язує звільнене акцепторне стебло Уаі-

тРНКУаІ, що призводить до прискорення ії дисоціації з ферменту. Утворений потрійний комплекс втрачає спорідненість до р та 5 субодиниць і вивільняється у розчин .

GDP

Рис.8. Схематичне зображення взаємодії фактора елонгації 1а та валіл-тРНК синтетази.

Для ілюстрації була використана модель структурної організації комплексу валіл-тРНК синтетази з важкою формою фактора елонгації 1 (Вес ег аі., 1994).

Таким чином, можна зробити висновок, що таке структурне з'єднання валіл-тРНК синтетази та важкої форми фактора елонгації 1 сприяє перенесенню аміноацил-тРНК “з рук в руки” від ферменту до ЕР- 1а, підтверджуючи гіпотезу каналювання субстратів у циклі елонгації білкового синтезу.

Вплив ЕР-1а*СОР(СТР) на активність деяких аміноацил-тРНК синтетаз у складі

Відомо, що комплекс, який містить в своєму складі дев'ять аміноацил-тРНК синтетаз, каталізує паралельні біохімічні реакції на відміну від інших мультиферменгних комплексів, які здійснюють послідовні реакції в певних метаболічних процесах [Srere, 1987]. Передбачається, що існування такого комплексу аміноацил-тРНК синтетаз в клітинах вищих еукаріот може забезпечувати структурну основу для спрямованого перенесення аміноацил-тРНК від ферментів до фактора елонгації EF-1 [Reed et al, 1994].

Вплив EF-la«GTP та EF-la*GDP на активність деяких синтетаз у складі мультиферментного комплексу, зокрема лізші-, аспартіл-, метионіл-, та ізолейцил-тРНК синтетаз, перевіряли в таких же умовах, що були використані в експериментах з валіл-тРНК синтетазою (інкубаційна суміш з низькою іонною силою). Як свідчить Рис.9, EF-la*GTP також як і EF-la*GDP в незначній мірі збільшує початкову швидкість реакції, яку каталізує лізил-тРНК синтетаза, в присутності гомологічної тРНК. Необхідно відмітити, що при проведенні реакції довше ніж 15 хвилин, спостерігається поява різниці в ході кінетичних кривих, отриманих у присутності EF-la*GTP та EF-la*GDP (Рис.9).

мультиферментного комплексу.

Час, хвилини

Рис.9. Кінетика реакції утворення лізил-тРНК, що каталізує лізил-тРНК синтетаза, в присутності EF-Ja*GTP та 100 цМ GTP (•), EF-la*GDP та 100 цМ GDP (■), 100 цМ GTP (О) та 100 /іМ GDP (□). Концентрація мультиферментного комплексу АРСаз становила 0.137 nM, EF-la - 500 пМ. Як субстрат використовували частково фракціоновану сумарну тРНК з печінки кроля (збагачення по TPHKLys- 12%)

Це можна пояснити тим, що після такого проміжку часу інкубації починає збільшуватись швидкість розпаду синтезованої аміноацил-тРНК [Оеіагіа М аі, 1991], що і проявляється у відхиленні кінетичного графіку від лінійного напрямку. Отже, подовження лінійної ділянки кінетичної кривої у присутності ЕР-ІаЮТР може бути наслідком утворення потрійного комплексу з аміноацил-тРНК, що захищає останню від спонтанного деацилювання. Такий же ефект, хоч і в дещо меншій мірі, спотерігається у присутності ЕР-1а*ООР, що також може відбуватися за рахунок формування неканонічного комплексу аміноацил-тРНК*ЕР-1 а* Р.

При використанні в реакції тРНК з дріжджів, замість гомологічної тРНК, ми також не спостерігали достовірної відмінності початкової швидкості реакції, що каталізує лізил-тРНК синтетаза, як у присутності так і у відсутності фактора елонгації. Проте і в даному випадку як ЕР-1а*ООР, так і ЕР-1а*СгТР захищали ЬуБ-тРНК1*5 від розпаду на проміжку часу інкубації довше ніж 20 хвилин.

Аналогічні експерименти було проведено з аспартіл-, метионіл- та ізолейцил-тРНК синтетазами в складі мультиферментного комплексу. Зведені результати представлено на Рис. 10. Початкова швидкість роботи всіх ферментів достовірно не підвищувалась у присутності як ЕР-1а*ОТР, так і ЕР-1а*СШР. Відсутність впливу фактора елонгації на каталітичну активність АРСаз у складі мультиферментного комплексу може свідчити про конформаційну стабільність цих ферментів та/або про стеричні обмеження, обумовлені структурою комплексу, що перешкоджають взаємодії з ЕР-1а.

Таким чином, отримані результати дозволяють лише констатувати відсутність впливу фактора елонгації на функціональну активність досліджених ферментів, однак не підтверджуюють і, в той же час, не заперечують ймовірності існування структурної взаємодії між цими білками.

Рис.10. Початкова швидкість реакцій, що каталізують аміноацил-тРНК синтетази у складі высокомолекулярного комплексу у відсутності (1) та присутності ЕР-1а*СОР (2) та ЕР-1а*СТР (3). Концентрація мультиферментного

комплексу АРСаз становила: для

експериментів з /\spRS, та МеіЯБ - 0.136 пМ, ЬухЯБ - 0.687 пМ, І1еЯ5 - 1.4 пМ. Концентрація ЕР-1а у всіх експериментах становила 500 пМ. Як субстрат використовували частково фракціоновану або сумарну тРНК з печінки кроля 7%, тРНКЬу" - 12%, тРНКПе - 3,5 %).

Приймаючи до уваги те, що р, у та 6 субодиниці фактора елонгації трансляції 1 гакож можуть відігравати важливу роль у забезпеченні каналювання аміноацил-тРНК в 5ілковому синтезі, вивчення структурної та функціональної взаємодії ЕР-1Н та ЕР-1а з “комплексними” та “вільними” аміноацил-тРНК синтетазами буде ‘ логічним продовженням з'ясуваїшя детального механізму функціонування складноорганізованого міарату трансляції вищих еукаріот.

Висновки.

1. В дисертаційній роботі досліджено функціональну взаємодію фактора елонгації трансляції 1а з еукаріотичними аміноацил-тРНК синтетазами. Отримані результати свідчать на користь гіпотези каналювання аміноацил-тРНК в циклі елонгації білкового синтезу, а також вказують на різноманітність взаємодії між ЕР-1а та різними аміноацил-тРНК синтетазами, що може мати значення для регуляції функціонування апарату трансляції вищих еукаріот.

2. Розроблено швидкий та ефективний метод очищення фактора елонгації трансляції 1а з печінки кроля та охарактеризовано його функціональну активність. Визначено, що виділений за запропонованим нами методом ЕР-1а, містить одну молекулу ОБР на молекулу фактора. Розроблено експрес-метод препаративного виділення фенілаланіл-тРНК синтетази, оптимізовано процедуру одночасного виділення мультферментного комплексу, що містить дев'ять аміноацил-тРНК синтетаз, та валіл-тРНК синтетази у комплексі з важкою формою фактора елонгації 1 з печінки кроля.

о.о-м -їда,- ........

123 123 123 123

А>рІ£ ШЮ ІуЖБ ІІеКБ [збагачення по тРНКАзр-16%, тРНКМя -

3. Вперше показано, що як EF-la+GDP, так і EF-la*GTP збільшує каталітичну активність індивідуальної фенілаланіл-тРНК синтетази, при цьому стимулюючий вплив фактора елонгації було виявлено як в загальній реакції, так і на стадії активації амінокислоти. Передбачається, що стимуляція каталітичної активності цього ферменту відбувається за рахунок білок-білкової взаємодії з EF-la.

4. Вперше продемонстровано ефект збільшення початкової швидкості реакції, що каталізує валіл-тРНК синтетаза у комплексі з EF-1H, в присутності EF-la та GTP. Передбачається, що за певних умов проведення реакції, дисоціація продукту з ферменту стає швидкість-лімітуючою стадією. Запропоновано механізм взаємодії фактора елонгації la та валіл-тРНК синтетази, відповідно до якого EF-la*GTP зв'язує синтезовану валіл-тРНК, прискорюючи її дисоціацію з ферменту.

5. Показано, що як EF-la*GDP, так і EF-la*GTP, не впливають на каталітичну активність аспартіл-, лізил-, метионіл- та ізолейцил-тРНК синтетаз, які входять до складу високомолекулярного комплексу.

ПЕРЕЛІК РОБІТ, ЩО ОПУБЛІКОВАНІ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ.

1. Г.В. Турковская, В.Ф. Шалак, К.В. Семенихин, Б.С. Негруцкий. Экспресс-метод выделения фенилаланил-тРНК синтетазы из печени кролика // Биополимеры и клетка-1994.-Т. 10, 24-27.

2. B.S. Negrutskii, T.V. Budkevich, V.F. Shalak, G.V. Turkovskaya, A.V.El’skaya. Rabbit translation elongation factor la stimulates the activity of homologous aminoacyl-tRNA synthetase//FEBS Letters.-1996.-V.382, №l.-P.18-20

3. V.F. Shalak, T.V. Budkevich, B.S. Negrutskii, A.V.El’skaya. A fast and effective method for purification of elongation factor la from rabbit liver // Український біохімічний хурнал,-1997.-Т.69,№2,- С. 104-109.

4. B.S. Negrutskn, T.V. Budkevich, V.F. Shalak, G.V. Turkovskaya, A.V.El’skaya. Elongation factor la from rabbit liver stimulates homologous phenylalanyl-tRNA synthetase // Abstr. of 16th International tRNA Workshop, University of Wisconsin-Madison, USA.-1995.-P. 185.

5. A. El’skaya, B. Negrutskii, G. Turkovskaya, G.Ovcharenko, V. Shalak, Pal’chevskii, T.V. Budkevich. Specific Features of Higher Eukaryotic Translation Machinery // Abstr. of An International Conference on the Structure and Function of the Ribosome, Victoria, Canada. -1995.-P. 168

6. A.V. El’skaya, B.S. Negrutskii, Z.M. Petrushenko, A.S. Ladokhin, T.V. Budkevich, V.F, Shalak. A possible role of EF-la in tRNA channeling during protein biosynthesis in highei eukaryotes // Abstr. of 17th International tRNA Workshop,Kazusa Akademia Center, Japan. -1997.-P.8-6.

Шалак В.Ф. Вивчення взаємодії фактора елонгації трансляції 1 а з еукаріотнчннми міиоацил-тРНК синтетазами.-Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня андидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03. - молекулярна біологія. Інститут голекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 1998.

Досліджено вплив EF-la*GDP та EF-la*GTP на каталітичну активність зенілаланія-тРНК синтетази, валіл-тРНК синтетази у складі важкої форми фактора лонгації 1, а також лізил-, аспартіл-, метионіл-, ізолейцил-тРНК синтетаз у складі исокомолекулярного комплексу. Показано, що EF-la+GDP та EF-la*GTP в однаковій tipi збільшують початкову швидкість реакції, що каталізує PheRS, при цьому вплив фактора елонгації відбувається вже на стадії активації фенілаланіну, яка не потребує [рисутності тРНК. Встановлено, що EF-la*GTP збільшує початкову швидкість реакції, псу каталізує валіл-тРНК синтетаза у комплексі з EF-1H. Передбачається, що EF-la*GTP а рахунок утворення потрійного комплексу Val-TPHKVaI*EF-la*GTP прискорює стадію [исоціації синтезованої валіл-тРНК з ферменту.

Отримані результати підтверджують гіпотезу каналювання аміноацил-тРНК в циклі лонгації білкового синтезу, а також вказують на різноманітність взаємодії між EF-la та іізними аміноацил-тРНК синтетазами, що може мати значення для регуляції функціонування апарату трансляції вищих еукаріот.

Ключові слова: аміноацил-тРНК синтетази, еукаріотичний фактор елонгації рансляції 1, каналювання аміноацил-тРНК, білок-білкова взаємодія.

Шалак В.Ф. Изучение взаимодействия фактора елонгации трансляции la с эукариотическими аминоацил-тРНК синтетазами.-Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности ОЗ.ОО.ОЗ-модекулярная іиолошя. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1998.

Изучено влияние EF-la*GDP и EF-la*GTP на каталитическую активность ^енилаланил-тРНК синтетазы, валил-тРНК сюггетазы в составе тяжелой формы фактора элонгации 1, а также лизил-, аспартил-, метионил-, изолейцил-тРНК синтетаз в составе зысокомолекулярного комплекса. Показано, что EF-la«GDP и EF-la*GTP в одинаковой гтепени увеличивает начальную скорость реакции, которую катализирует PheRS, при этом влияние фактора элонгации наблюдается уже на этапе активации фенилаланина, тторая не требует присутствия тРНК. Установлено, что EF-la*GTP увеличивает тачальную скорость реакции, которую катализирует валил-тРНК сіштетаза, образующая комплекс с EF-1H. Предполагается, что EF-la*GTP за счет образования тройственного комплекса Val-TPHKVal*EF-la*GTP ускоряет стадию дисоциации синтезированой валил-гРНК с фермента.

Получение результаты подтверждают гипотезу каналирования аминоацил-тРНК в цикле элонгации белкового синтеза, а также указывают на разнообразие взаимодействия между EF-la и различными аминоацил-тРНК синтетазами, что может иметь значение для регуляции функционирования аппарата трансляции высших эукариот.

Ключевые слова: аминоацил-тРНК синтетазы, эукариотический фактор элонгации трансляции 1, каналирование аминоацил-тРНК, белок-белковое взаимодействие.

Shalak V.F. Study of interaction of translation elongation factor la with eukaryotic aminoacyl-tRNA synthetase.- Manuscript. Thesis for degree of Doctor of Philosophy (Ph.D.) in Biology, specialty 03.00.03-Molecular Biology.-Institute of Molecular Biology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1998.

The effect of EF-la*GDP and EF-la*GTP on the catalytic activity of phenylalanyl-tRNA synthetase, valyl-tRNA synthetase, present in the complex with EF-1H, lysyl-, aspartyl-, methionyl-, isoleucyl-tRNA synthetase, present in the high-molecular-weight complex, has beer investigated. Both EF-la*GDP and EF-la*OTP we shown to increase the initial rate oi reaction, catalyzed by phenylalanyl-tRNA synthetase. Moreover the effect of elongation factor is observed during of phenylalanine activation in the absence of tRNA. Initial rate of reaction catalyzed by valyl-tRNA synthetase is increased in the presence of EF-la*GTP. It has beer suggested, that formation ternary complex Val-tRNAVaI*EF-la*GTP influences dissociation oi Val-tRNAVal from the enzyme.

Results obtained support channeling of aminoacyl-tRNA in the protein biosynthesis anc point out the variety of interaction between EF-la and different aminoacyl-tRNA synthetases, which may be involved in regulation of the high eukaryotic translation apparatus.

Key words: aminoacyl-tRNA synthetases, eukaryotic translation elongation factor 1, channeling of aminoacyl-tRNA, protein-protein interaction.