Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и исследование факторов элонгации и аминоацил-тРНК синтетаз из THERMUS THERMOPHILUS

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и исследование факторов элонгации и аминоацил-тРНК синтетаз из THERMUS THERMOPHILUS"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

РГБ од____

I 7 О КГ 1УУО На правах рукописи

УДК 577.217.535

ЖЕЛТОНОСОВА Юлия Михайловна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ ЭЛОНГАЦИИ И АМИНОАЦИЛ-тРНК СИНТЕТАЗ ИЗ ТНЕЙМиЗ ТНЕЯМОРН!Ш8

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва ■ 1996

Работа выполнена в Институте белка РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

кандидат биологических наук М. Б. ГАРБЕР

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук Г. Д. МИРОНОВА

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

кандидат химических наук Т. В. ДЕМИДКИНА

Институт молекулярной биологии им В. А. Энгелыардта РАН

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН Защита состоится * _ ¿X 1996 г. в ю часов на заседай!'

диссертационного совета Д.053.05.70 при Московском государственно университете имени М. В. Ломоносова по адресу : 119899 Москва, Воробьев горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультет

МГУ.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук

В. Н. Каграманов

\

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение механизма биосинтеза белка является одной из важнейших задач молекулярной биологии. Для детального понимания механизма работы белоксинтезирующего аппарата клетки необходимо знание структурной организации его компонентов. Единственный метод, позволяющий определить структуру крупных биополимеров с атомарным разрешением, это метод рентгеноструктурного анализа. В настоящее время наиболее перспективными для рентгенографических исследований являются белки и нуклеиновые кислоты из термофильных микроорганизмов, т.к. они обладают повышенной стабильностью и легче кристаллизуются, чем гомологичные им молекулы из мезофильных бактерий.

В Институте белка РАН работа по выделению, кристаллизации и структурным исследованиям компонентов аппарата трансляции из грамотрицательной экстремально термофильной эубактерии - Thermus themophilus ведется уже более 15 лет. В сотрудничестве с рядом криейллографических групп были определены с высоким разрешением пространственные структуры рибосомных белков L1 и S6, аспартил-тРНК-синтетазы. Данная диссертация посвящена разработке методов выделения и кристаллизации факторов элонгации и аминоацил-тРНК-синтетаз из Thermus themophilus для структурных исследований. Работа по определению пространственной структуры одного из важнейших компонентов белоксинтезирующей системы, фактора элонгации G (EF-G), велась в Институте белка в течение длительного времени. Недавно, при непосредственном участии диссертанта, структура фактора элонгации G была определена для двух форм этого белка: свободной от нуклеотида и в комплексе с GDP.

Цель работы - выделение, исследование и кристаллизация факторов элонгации и аминоацил-тРНК-синтетаз из Thermus ¡hemophilus.

Основные задачи работы: Разработка методов выделения и получение гомогенных препаратов факторов элонгации и некоторых аминоацил-тРНК-сшггета5. Выращивание кристаллов и получение тяжелоатомных изоморфных производных для структурных исследований EF-G и комплекса EF-G*GDP. Исследование и кристаллизация выделенных аминоацил-тРНК-сингетаз.

Научная новизна и практическая ценность работы: Наработан в препаративных количествах фактор элонгации G свободный от нуклеотида и в комплексе с GDP. Выращены крупные кристаллы EF-G и получены изоморфные производные этих кристаллов с соединениями платины, ртути и свинца. Нативные кристаллы и их тяжелоатомные изоморфные производные были использованы для определения пространственной структуры EF-G в двух формах. Разработаны методики выделения гати аминоацил-тРНК-синтетаз из Thermus thermopMus. Для треонил-тРНК-синтетазы определены молекулярная масса, субъединичное строение, коэффициент эксгинкции и N-концевая аминокислотная последовательность. Охарактеризованы кинетические

параметры реакции аминоацилирования для двух синтетаз: валиновой и треониновой. Получены кристаллы лейцил-тРНК-сшггетазы. Разработана методика выделения гомогенных препаратов факторов элонгации из Thermits thermophUus. Полученные нами препараты факторов элонгации и аминоацил-тРНК-синтетаз используются дня структурных и функциональных исследований в Институте белка РАН, Институте молекулярной биологии имени В.А.Энгельгардга РАН, Новосибирском Институте биоорганической химии РАН, Институте молекулярной и клеточной биологии (Страсбург, Франция), Уппсальском университете (Уппсала, Швеция).

Структура диссертации: Диссертация состоит из трех частей: 1) обзор литературы, 2) экспериментальная часть, 3) результаты и их обсуждение. Работа завершался выводами и списком цитируемой литературы ( ссылка). Работу

иллюстрируют рисунков и таблиц. Общий объем диссертации страниц.

Апробация работы и публикации. Результаты диссертации докладывались на Международной конференции "Аппарат трансляции" (Берлин, Германия, 1992), на пятой (Сан-Диего, США, 1993) и шестой (Хиросима, Япония, 1995) Международных конференциях "Кристаллизация биологических макромолекул", на первой российско-германской летней школе "In vitro системы" (Берлин, Германия, 1994), на Международной конференции "Структура и функция рибосом" (Виктория, Канада, 1995), на научных конференциях Института белка РАН (Пущино, 1994, 1995). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Обзор литературы посвящен, главным образом, исследованиям структуры факторов элонгации EF-G и EF-Tu в . различных функциональных состояниях. Приводятся также данные о других прокариотических рибосомозависимых ГТФазах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава I. Выделение и исследование факторов элонгации из Thermus thermophUus.

I. Выделение факторов элонгации из Thermus thermophilus.

Факторы элонгации из T.thermophüus были впервые выделены и охарактеризованы в 1978 году в Японии в лаборатории профессора Казиро (K.Arai et al., 1978, EurJ.Buxhem. 92,509; K.Arai et al., 1978, ibid. 521; S.Nakamura et al., 1978, ibid. 533). В Институте белка М.Гарбер и Л.Решетникова разработали модифицированную методику выделения фактора элонгации G (М.Б.Гарбер и Л.С.Решетникова, 1988, Биоорганическая химия 8, 1572). Эта процедура очистки включает ионообменную хроматографию на DEAE-Sepharose, гельфильтрацию на ультрогеле АсА-44 и адсорбционную хроматографию на гидроксиаппатиге. Однако выход гомогенного белка, пригодного дня выращивания больших одиночных кристаллов, необходимых для

рентгеноструктурного анализа, бьи слишком низким (4-5 мг из 1 кг биомассы). Дополнительная гидрофобная хроматография на Butyl-Toyopearl 6S0S (Toyo-Soda, Япония) позволила повысить выход высокоочищениого, хорошо кристаллизующегося EF-G до 40-50 мг. Часто EF-G элюируется с Butyl-Toyopearl 650S двумя или тремя пиками, которые по SDS-гельэлектрофорезу обладают практически одинаковой чистотой. Однако было замечено, что белок из разных пиков кристаллизуется неодинаково: обычно только одна из фракций пригодна для получения крупных кристаллов. Мы не проверяли, но есть некоторые основания предполагать, что хроматография на гидрофобной смоле может приводить к отделению гомогенной мономерной фракции белка от фракций, содержащих димерные и олигомерные формы.

Так как использование гидрофобной хроматографии оказалось успешным для выделения EF-G, мы решили применить подобную процедуру и для дополнительной очистки препаратов EF-Tu и комплекса EFTu*EF-Ts. Фактор элонгации Tu обычно выделяют по методике, предложенной Леберманом с соавт. (R.Leberman el al., 1980, Anal, Biochem. 104, 209): хроматография lia DEAE-Sepharose и затем гельфильтрация на улътрогеле АсА-44. Чистота EF-Tu, выделенного по такой методике, не превышает 9095% по SDS-гельэлектрофорезу. Дополнительная очистка на колонке с Butyl-Toyopearl позволила нам получить препарат Tu-фактора с чистотой более 98%. Особенно эффективным оказалось применение гидрофобной хроматографии для очистки EF-Tu*EF-Ts комплекса, т.к. предложенная ранее процедура выделения этого комплекса (K.Arai et al., 1978, Eur.J.Biochem. 92, 509) была сложной и сопровождалась большими потерями. Использование гидрофобной хроматографии позволяет упростить процедуру выделения EF-Tu*EF-Ts и получить значительные количества высокоочищениого препарата. Модифицированная нами методика выделения комплекса EF-Tu*EF-Ts состоит из четырех стадий: 1.- ионообменная хроматография на DEAE-Sepharose; 2.-гельфнльтрация на ультрогеле АсА-44; 3.- адсорбционная хроматография на гвдроксиаппатите; 4.- гидрофобная хроматография на Butyl-Toyopearl. Выделенные нами высокоочищенные препараты факторов элонгации из Themas thermophilus (рис. 1) использовались для функциональных и структурных исследований в нашем и других институтах.

Рис. 1. Анализ чистоты препаратов факторов элонгации из T.thermophihts методом SDS-гельэлектрофореза.

EF-G EF-Tu EFs-Tu*Ts

2. Получение фактора элонгации G в свободной от нуклеотида форме.

Известно, что EF-Tu из T.thermophäus и E.coli, выделенный в нативных условиях, находится в комплексе с ODР, a EF-G из E.coli, выделенный по стандартной методике, -в свободной от нуклеотида форме (Y.Kaziro, 1978, Biodtim.Biophys.Aaa 505, 95). Предполагалось, что EF-G из T.thermophäus также выделяется в свободной от нуклеотида форме (KArai et al., 1978, Eur.J.Biochem. 92, 509; KAral et al., 1978, ibid. 521; S.Nakamura et al., 1978, ibid. 533), однако анализ полученных нами препаратов фактора элонгации G из T.thermophäus методами тонкослойной хроматографии на PEI-целлюлозе и ионпарной хроматографии на колонке RP-Cie в системе HPLC показал, что выделенный нами EF-G находится в комплексе с GDP.

Для получения EF-G свободного от нуклеотида мы попытались применить методику, разработанную ранее доя освобождения EF-Tu от GDP (M.Seidler et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15, 9263). Для отделения нуклеотида белок хроматографировали на колонке с CM-Sepharose в присутствии 5 М мочевины. Однако эта процедура оказалась крайне неэффективной дм EF-G, т.к. потери белка в ходе хроматографии достигали 80%, кроме того, полученный таким способом препарат не кристаллизовался в найденных ранее условиях.

Успешным оказалось применение методики, разработанной ранее для получения свободной от нуклеотида формы другого GTP-связывакмцего белка, H-ras p21 (J.John et al., 1990, Biochemistry 29, 6058). í>ra методика была нами модифицирована с учетом свойств фактора элонгации G. Препарат EF-G обрабатывали щелочной фосфатазой при 45°С в течение 25 мин. и наносили на колонку с Butyl-Toyopearl 650S. В ходе хроматографии белок отделялся от щелочной фосфатазы и от гуанозина, образующегося в результате фосфатазной реакции. Из таких препаратов были получены кристаллЬ! EF-G, пригодные для рентгеноструктурного анализа.

На рисунке 2 представлен хроматографический анализ препаратов EF-G на колонке RP-Cie в системе HPLC. В качестве стандартов использовали GDP и гуанозин. Пик GDP в комплексе с G-фактором не соответствует пику свободного GDP (время задержки - 6,5 мин.) и выходит на 1,5 мин. позже (рис. 2 в, г). Обработка препарата щелочной фосфатазой приводит к исчезновению пика связанного с белком GDP и к появлению пика, соответствующего свободному гуанозину (время задержки - 3.2 мин.) (рис. 2 б, д). Анализ препаратов EF-G, обработанных щелочной фосфатазой и очищенных хроматографией на колонках с CM-Sepharose и Butyl-Toyopearl 650S, показал отсутствие GDP и гуанозина (рис. 2 а, е).

Полученные таким способом препараты EF-G свободного от нуклеотвда используются в настоящее время для поисков условий кристаллизации EF-G в комплексе с нерасщепляемыми аналогами GTP (GMPPNP, GMPPCP, GTPyS).

Время, мин.

Рис.2 Хроматографический анализ препаратов EF-G на колонке RP-Cie в системе HPLC. Элюцию проводили буфером, содержащим 100 тМ фосфата калия, рН 6.5, 10 тМ тетрабутиламмониумбромида, 0.2 mM Na№, 5% ацетонитрила. а. - буфер: 32 тМ трис-HCI, рН 8.0, 200 mM (NÍI^SO-i, 0.5 тМ dtt, 0.5 тМ NaNj; б. - буфер + гуанозин; в. - буфер + GDP; г, - буфер + EF-G; д. - буфер + EF-G + щелочная фосфатаза; е. - буфер + EF-G после хроматографии на колонке с CM-Sepharose или Butyl-Toyopearl.

3. Кристаллизация и структурные исследования фактора элонгации G из T.thermophüus в двух формах: свободной от нуклеотида и в комгиексе с GDP.

Пригодные к рентгенострукгурному анализу кристаллы фактора элонгации G из T.thermophüus были получены Л.С.Решетниковой и М.Б.Гарбер в 1983 году (L.S.Reshetnikova and M.B.Garber, 1983, FEBS Lett. 154, 149). Эти кристаллы (рис. 3) принадлежат к ромбической системе, пространственная группа P2iP2iP2i. В рентгеновских лучах кристаллы дают равномерное поле отражений с пределом

разрешения 2.8 А (Уи-И-СЫ^ас^е й а!., 1983, ].МоШо1. 168, 449). Работа с этой кристаллической формой сопряжена с рядом трудностей. Эти кристаллы растут из белковых растворов с высокой концентрацией (25-30 мг/мл) при низкой ионной силе (20 шМ имидазол-НС!) и при добавлении каких-либо соединений к маточной жидкости трескаются или растворяются. Для замачивания таких кристаллов в растворах тяжелоатомных соединений их приходится сшивать в парах глютарового альдегида. Кристаллы плоские, и для получения достаточной толщины необходимо выращивать очень крупные кристаллы (где 1.5-2.0 мм в длину). Рост одного такого кристалла занимает более месяца.

Рис. 3. Кристалл фактора элонгации С из ТНетггш ЛегторШш. Кристаллизация велась методом диффузии паров в висящей капле при 4°С. Капли, содержащие 25-30 мг/мл белка, 20 шМ имвдазол-НС1, рН 7.8-8.0, 0.2 шМ спермин-НС1 и 0.4 тМ К^БСЧ уравновешивали против 10-20% МРБ.

В лаборатории структурного анализа Института белка РАН под руководством Ю.Н.Чиргадое данные кристаллы использовались для структурных исследований ЕР-С. В 1991 году была опубликована первая работа по кристаллической структуре ЕИ-в при низком разрешении (Ю.Н.Чиргадое и др., 1991, Доклады Академии Наук СССР 320, 2, 488). В этой работе была описана форма молекулы и сделаны предположения о числе доменов и локализации ОТР-связывающего центра. Основным препятствием для определения структуры на более высоком уровне являлось отсутствие высококачественных изоморфных тяжелоатомных производных. Свыше 40 различных соединений тяжелых металлов было испробовано, но практически ни один реагент не дал истинно изоморфных производных, что, повидимому, связано с высокой внутримолекулярной подвижностью белка. Нами бьи продолжен поиск изоморфных тяжелоатомных производных этих кристаллов, а также проведен поиск других условий

кристаллизации ЕИ-в с целью получения более прочных кристаллов, не требующих сшивания глютаровым альдегидом.

3.1. Поиск новых условий кристаллизации ЕР-О.

Для поисков условий кристаллизации использовался метод диффузии паров в висящей капле. Образование кристаллов из растворов бедка с концентрацией 10 мг/мл наблюдалось при использовании в качестве осадителей фосфата калия, цитрата натрия и сульфата аммония при 20°С (рис. 4). Однако полученные в этих условиях кристаллы были несовершенны и непригодны для рентгеноструктурного анализа. В дальнейшем улучшить качество этих кристаллов не удалось.

1.

'¿Г*

2.

V

Рис. 4. Кристаллы EF-G, полученные в присутствии: 1 - 1.5 М фосфата калия, рН 5.5; 2 - 1.25 М фосфата калия, рН 8.5-9.0; 3 - 1.2 М фосфата калия, рН 8.0, 2% MPD (2-метил,2,4-пентацдиол); 4 - 750 шМ цитрата натрия или сульфата аммония 40% насыщения, 50 тМ трис-HCl, рН 8.0, 2% MPD.

Поиск новых кристаллических форм EF-G проводился также путем модификации найденных ранее Л.С.Решетниковой и М.Б.Гарбер условий кристаллизации. Нами было обнаружено, что добавление в маточную жидкость 2-4% MPD позволяет получить менее хрупкие кристаллы. Такие кристаллы могут быть перенесены в капилляры без сшивания глютаровым альдегидом, если использовать 2530% MPD с 20 шМ имидазольным буфером, рН 7.8 в качестве стабилизирующего раствора. Новая кристаллическая форма была охарактеризована на пространственном детекторе (Siemens). Кристаллы принадлежат к той же пространственной группе, что и кристаллы, полученные Л.С.Решетниковой и М.Б.Гарбер, но по параметрам элементарной ячейки несколько отличаются. Эти кристаллы в рентгеновских лучах дают равномерное поле отражений, но, к сожалению, с низким пределом разрешения - 3.2 А.

Позднее нами было обнаружено, что добавление в кристаллизационную смесь мономсгилового эфира полиэтиленгликоля (MMEPEGsooo, Fluka) до 1-2% позволяет выращивать более крупные кристаллы. Эти кристаллы индентичны кристаллам, полученным Л.С.Решетниковой и М.Б.Гарбер, и их также приходится сшивать глютаровым альдегидом, но в присутствии MMEPEGsooo крупные кристаллы образуются за 1-2 недели из белкового раствора с концентрацией всего 10 мг/мл. Кристаллы, выращенные в присутствии MMEPEGsooo, оказались более совершенными, что позволило определить пространственную структуру EF-G-GDP с разрешением 2.4 А. Важно также, что в кристаллизационную смесь с MMEPEGsooo можно добавлять MgJ+до концентрации 10 тМ, что может оказаться существенным для получения кристаллов EF-G в GTP-форме.

3.2. Кристаллизация и структурные исследования EF-G в свободной от нуклеотида форме.

С 1991 года работа по определению пространственной структуры EF-G велась совместно с лабораторией Ю.Н.Чиргадзе и с кристаллографической группой под руководством профессора АЛильяса (Лундский университет, Швеция). Для продолжения исследований нами было выращено несколько партий крупных кристаллов в условиях, описанных ранее Л.С.Решетниковой и М.Б.Гарбер.

На базе полученных ранее в группе Чиргадзе результатов и новых высококачественных наборов дифракционных данных для нативных и четырех тяжелоатомных изоморфных производных кристаллов (таблица I, 1-4) в 1992 году удалось получить карты электронной плотности EF-G с разрешением 3.5 А. Структура самого крупного GTP-связывающего домена, составляющего около 25% молекулы, была решена благодаря совмещению его с хорошо изученным GTP-связывающим доменом EF-Tu (M.Kjeldgaard and J.Nyborg, 1992, JMol.Biol. Ill, 721). На основании имеющихся данных была построена модель, описывающая около половины молекулы EF-G. Решающее улучшение карт электронной плотности было достигнуто после подключения наборов дифракционных данных для тяжелоатомного производного на основе

триметилацетата свинца, собранных на синхротроне в Дарсберской лаборатории, и на пространственном детекторе в Лунде (табл. 1,5-6).

Табл. I. Тяжелоатомные изоморфные производные кристаллов, использованные для решения пространственной сгрутуры ЕР-в.

Тяжелоатомное соединение Условия замачивания Источник излучения Разрешение (А)

1. КзРЮЬ 0.1 шМ,7 дней СиКа 3.2

2. КгПСи 0.5 шМ, 2 дня СиКа 3.2

3. СНзНя-асе1а1е 2.5 тМ, Здня СиКа 3.0

4. ИаЯеОд 1 тМ, 1 день СиКа 4.0

5. (СНз)зРЬ-асе1а1е 20 тМ, 18 дней синхротрон 2.8

6. (СНз)зРЬ-асе1а1е 20 тМ, 18 дней СиКа 3.2

В 1994 году определение структуры ЕР-О без связанного нуклеотида было завершено с разрешением 2.8 А. На рис. 6 представлена пространственная структура ЕР-О.

Рис. 6. Структура ЕР-О.

3.3. Кристаллизация и структурные исследования EF-G в комплексе с GDP.

В описанных выше модифицированных условиях кристаллизации (при добавлении в кристаллизационную смесь MMEPEGjooo) нам недавно удалось получить крупные кристаллы комплекса EF-G с GDP. Структурные исследования комплекса проводились совместно с лабораторией профессора АЛильяса Дифракционные данные для таких кристаллов были собраны на синхротроне DESY (Гамбург) и структура EF-G в комплексе с GDP была решена методом молекулярного замещения с разрешением 2.4 А. Было проведено тщательное сравнение "пустой" и связаной с GDP молекул EFrG. В целом эти две формы очень похожи, хотя некоторые специфические изменения вблизи места связывания с GTP и в интерфейсе между доменами обнаружены.

Наиболее важное и интересное продолжение этой работы - определение структуры EF-G в GTP-связашюй форме, т.к. именно в этой форме EF-G связывается с рибосомой. В настоящее время нами ведется поиск условий кристаллизации комплексов EF-G с нерасщепляемыми аналогами GTP (GMPPNP, GMPPCP, GTPyS).

Глава II. Выделение и исследование аминоацил-тРНК-синтетаз из Thermus thermophtius.

1. Выделение аминоацил-тРНК-синтетаз.

Одним из важнейших этапов биосинтеза белка является аминоацилирование тРНК, катализируемое аминоацил-тРНК-синтетазами. Структурные исследования аминоацил-тРНК-синтетаз были начаты более 10 лет назад, но продвигались медленно из-за трудностей в получении высокоупорядоченных крупных кристаллов этих объектов. Наиболее перспективными для кристаллизации и рентгенографических исследований являются белки из термофильных микроорганизмов, т.к. они обладают повышенной стабильностью и легче кристаллизуются, чем гомологичные им молекулы из мезофильных бактерий и эукариот. Мы одними из первых приступили к выделению аминоацил-тРНК-синтетаз из экстремально-термофильной эубактерии T.thermophilus. Ранее в лаборатории профессора Миязавы (Токийский университет, Япония) и в Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР (Киев) были разработаны методики выделения глутамил- (M.Hara-Yokoyama et al., 1984, J.Biochem. 96, 1599), мегионил- (D.Kohda et al., 1987, J.BiolChem. 262, 558) и асп..ртил- (А.Д.Яремчук и др., 1989, Биополимеры и клетка 2, 102) тРНК-синтетаз из этого микроорганизма. Также были охарактеризованы валил- и изолейцил-тРНК-синтетазы (D.Kohda et al., 1984, FEBS Lett. 174, 20), но процедура очистки описана не бьиа. Мы приступили к выделению треонил-тРНК-синтетазы из T.thermophilus, чтобы использовать этот белок для кристаллизации и структурных исследований, т.к. попытки получить кристаллы треонил-тРНК-синтетазы из E.coli были безуспешными. Пространственная структура треонил-тРНК-синтетазы представляет большой интерес, т.к. было показано, что эта синтетаза не только аминоацилируегг тРНК, но и регулирует собственный синтез.

связываясь с лидерпой областью своей матрицы (M.Springer et al., 1985, J.Mol.Biol. 185, 93). Определение пространственных структур комплексов этого белка с тРНК и лидерпой областью мРНК было бы существенным вкладом в изучение РНК-белковых взаимодействий. Нами была впервые выделена и совместно с лабораторией профессора Б.Эресманна (Страсбург, Франция) охарактеризована треонил-тРНК сшггетаза из T.thermophUus. Результаты этой работы были в дальнейшем использованы нашими французскими коллегами для клонирования гена треонил-тРНК-синтетазы из T.thermophihts и затем для кристаллизации этого белка. Нами было также очищено несколько других амииоацил-тРНК-синтетаз из T.thermophUus. Некоторые из выделенных белков были охарактеризованы, а лейцил-тРНК-синтетаза была закристаллизована.

1.1. Очистка треоиил-. зспартнл- и фснилаланил-тРНК-синтетаз.

Безрибосомный клеточный экстракт T.thermophihts хроматографировали на колонке с DEAE-Sepharose (рис. 7). Амииоацил-тРНК-синтетазы идентифицировали по активности, которую определяли по скорости образования соответствующих аминоацил-тРНК при 65°С с использованием [14С]меченных аминокислот. На рисунке 7 видно, что амичоацил-тРНК-синтетазы элюируются с колонки несколькими группами.

А 280

20-1

---- градиент

NaCl, M

г 0.3 г4

-2

-1

L0

Номера фракций

Рис. 7. Хроматография безрибосомного клеточного экстракта ТлЬегтарМиз на олонке с ВЕАЕ-БерЬагозе. Объем колонки - 450 мл; скорость элюции 200 мл/час; объем эракций - 20 мл. Элгопшо проводили б л линейного градиента концентрации ЫаС1 от 25 ;о 250 шМ в буфере, содержащем 20 шМ трис-НС1, рН 7.6, 10 шМ М£СЬ, 5 шМ 2-1еркаптоэтанола. 1 группа: Уа1Я.8, ЬеиЯв, НеЯБ, МеЧ^; 2 группа: АзрЛЭ, ИуЯЗ, ТИгИБ, •ЬеЯЗ; 3 группа : АвпЯЗ, ЬуэЯЗ.

Сводные данные об очистке синтетаз второй группы (треонил- (ГЬгЯЛ), аспартил- ^рЯЭ) и фенилаланил- (РЬеВ^) тРНК-синтетазы) представлены на рис. 8 и в табл. II. В предложенной нами методике ключевой стадией является хроматография на колонке с З-ЗерЬагозе. Большинство белков, присутствующих в препарате аминоацил-тРНК-синтетаз второй группы после хроматографии на ОЕАЕ-5ерЬагозе, не связываются с З-ЗерЬапме, а аминоацил-тРНК-синтетазы, поводимому, специфично связываются с сульфо-группами, что обеспечивает их высокую очистку в ходе этой хроматографии. На колонке с Б-ЗерЬагове удается также разделить ТИЛБ и АэрЯБ, что представляло ранее большую проблему из-за сходного поведения этих двух белков при хроматографии на различных носителях. При рН 6.5, проводимости не более 3 тБ и отсутствии ионов магния АзрЯБ не связывается с З-ЗерЬагоэе, а ТЬтИЭ и РЬеЛБ связываются и элюируются в одних и тех же фракциях.

Полное разделение РЬеЯЭ и ТЬгЯБ было получено с помощью гельфильтрации на колонке с ультрогелем АсА-44 (рис. 7).

А28О

РЬеНЭ

ТЬгйЗ

Рис. 7. Разделение РЬеЯв и ТЬгЯЗ гельфильтрацией на ультрогеле АсА-44. Колонка: 270 х 2.5 см; скорость: 30 мл/час; объем фракций: 10 мл; буфер: 20 шМ ЫазНРОЖНаРО.., рН 6.5, 50 шМ КС1.

........... 111 11 11 м | | 11 с | 111 1111 м I ч г

О 10 20 30 40

Номера фракций

Минорные примеси удалялись из препарата "ПиКв с помощью адсорбционной хроматографии на гидрохсиаппатите. Для окончательной очистки аспартил-тРНК-синтетазы были использованы гельфильтрация на ультрогеле АсА-44 и гидрофобная хроматография на Ви1у1-Тоуорсаг1.

Табл. II. Очистка 1реонил-тРНК-сшггетазы из I кг биомассы Т.ЛегторМш.

Стадия очистки Суммарное количество белка, мг Суммарная активность, единицы Специфическая активность, ед/мг Фактор очистки Выход белка, %

ОЕАЕ-ЗерЬагоэе 4608 29520 6.4 1 100

З-ЭерЬапие 210 20760 98.8 15 70.3

АсА-44 22 6969 316.8 50 23.6

Нуйгохуарп^е 17 6013 353.7 55 20.4

кОа

Э2.5 -67.0 -45.0 —

29.0т

21.012.56.5

12 34 5 6 7 891011

12 1314151617

Рис. 8. Анализ чистоты препаратов ТЬгЛЗ, НЬеЯЗ и АзрКг» на разных стадиях очистки методом БОЗ-гельэлекчрофореза. 1, 7, 13 - маркерные белки; 2-6 - очистка ТЬгЯЗ; 8-12 - очистка Аэр!^; 14-17 - очистка РЬеЯЗ; 2, 3, 8, 9, 14, 15 - препараты после хроматографии на ОЕАЕ-ЗсрЬагохе; 4, 16 - препарат после хроматографии на Б-верЬагозе, содержащий ТЬгЯЭ и РЬеКБ; 10 - препарарат АБр!^ после хроматографии на З-БерЬагозе; 5,. 11, 17 - ТЬгЯ8, АзрКБ и РЬеЯБ после гельфильтрации на ультрогеле АсА-44; 6 - ТИгИБ после хроматографии на гидроксиаппатите; 12 - АзрЯБ после, хроматографии на ВШу1-Тоуореаг1.

1.2. Очистка валил- и леЙцил-тРНК-синтетаз.

В разработанной нами методике очистки синтетаз 1 группы (УаШ5, ЬеиИ^, НеЯЗ, МеШв) ключевым этапом также является хроматография на Б-БерЬагозе (рис. 9). На этой стадии удается полностью разделить лейцил-, валил- и изолейцил-тРНК-синтетазы и значительно их очистить.

ЬеиЯЗ окончательно очищали гельфильтрацией на ультрогеле АсА-44. Большую трудность представляла очистка УаШБ. Большинство белков, присутствующих в препарате Уа1Я8 после хроматографии на З-БерЬагозе, отделялось с помощью гидрофобной хроматографии на ВШу1-Тоуореаг1. Но после трех этапов очистки препарат УаШБ содержал активность метионил-тРНК-синтетазы (\-tetRS). Эта две сшггегазы были разделены с помощью хроматографии на Кес^ерЬак^е. В присутствии 500 шМ КС1

2J -i

2,0-

1J -

1.0-

0J-

380

---- градиент

- профиль элюцин

x-i-x активность

KCl, mM

Lz

т >. V J \

11 i i ri i i У ¥ r i г| rr t 11 i i i T i | i

cptn x 10

Г50

"30

20

10

Номера фракций

Рис. 9. Хроматография УаЖБ, ЬеиЛБ и ЛсЯ5 на колонке с З-БерЬапме. Объем колонки - 450 мл; скорость элюции 60 мл/час; объем фракций - 10 мл. Элюцию проводили 2 л линейного градиента концентрации КС1 от 10 до 200 тМ в буфере, содержащем 15 шМ Мез-КОН, рН 5.6, 10 тМ КС1, 5 тМ 2-меркаптоэтанола.

MetRS прочно связывается с носителем, а ValRS не связывается и выходит при промыве колонки. Минорные примеси из препарата ValRS удалялись с помощью хроматографии на гидроксиаппзтите. Суммарные данные об очистке ValRS и LeuRS представлены на рис. 10 и в табл. III.

Табл. III. Очистка валил- и лейцил-тРНК-синтегаз из 500 г биомассы T.thermophüus.

Стадия очистки Суммарное Суммарная Специфическая Фактор Выход количество активность, активность, очистки белка, белка, мг единицы ед/мг %

Валил-тРНК-синтетаза

DEAE-Sepharose 3625 47459 13.1 1.0 100

S-Sepharose 138 22310 162 . 12.4 47

Butyl-Toyopearl 40 16642 416 31.7 35

Red-Sepharose и

Hydroxyapatite 12.5 10675 854 65.2 22

Лейцил-тРНК-синтсгаза

DEAE-Sepharose 3625 45919 12.7 1.0 100

S-Sepharose 180 35456 197 15.5 77

AcA-44 41 29362 716 56.4 64

л.

кОа

^___ -^уШьщЗР <а»

f

67.0 - w Щ^ЩВ* 45,0 —

29.0 —

кОа

mm

-да

12 3 4 5 I 2 34

Рис.-10. Анализ чистоты препаратов \'а!К8 и ЬсиЯБ на разных стадиях очистки методом ЗОЗ-гелъэлектрофореза. А. Препарат УаШ5 после хроматографии на колонке с: 2 - ОЕАЕ-ЗерЬагтее; 3 - З-ЗерЬагоае; 4 - Ви1у1-Тоуореаг1; 5 - Яеб-БерЬагозе и гидроксиаппатитом; 1 - маркерные белки. Б. Препарат ЬеиЯБ после хроматографии на колонке с: 2 - ПЕАЕ-ЗерЬаккс; 3 • Б-ЗерЬагозе; 4 - ультрогелем АсА-44; 1- маркерные эелки.

Предложенная нами схема очистки позволяет в течение двух недель получить шачителъные количества высокоактивных препаратов пяти синтетаз из ТЬегтиз 'кегторШиз.

2. Исследование треонил-тРНК-синтетазы из T.thermophihts.

2.1. Молекулярная масса и субъединичное строение ThrRS.

Молекулярная масса ThrRS из Т.themophilus была оценена с помощью SDS--ельэлектрофореза и гельфильтрации на ультрогеле АсА-44 в неденатурирующих условиях как 77 и 150 кД, соответственно. Полученные значения очень близки к >пределенным ранее для ThrRS из E.coU (H.Hennecke et al„ 1977, J.Bacterio!. 131, 943). Ha >сновании этих данных нами было предположено, что ThrRS из T.thermophihts, также как омологичная ThrRS из E.coli, имеет гомодимерную (аг) структуру. Коэффициент жстинкции ThrRS, равный 1.4 млхмг-'хсм-' при 280 пш, был определен по методу Зрэдфорда (M.Bradford, 1976, Anal.Biochem. 72, 248), с использованием бычьего ъшороточного альбумина и EF-G из T.thermophihts в качестве стандартов.

2.2. Определение N-концевой аминокислотной последовательности ThrRS из r.r hemophilus.

N-концевая аминокислотная последовательность ThrRS из T.thermophilus, гачиная с Metl до Asp4S (табл. IV), бьиа определена совместно с лабораторией [рофессора Б.Эресманна (Институт молекулярной и клеточной биологии, Страсбург,

Франция). Сравнительный анализ Ы-конпсвых аминокислотных последовательностей треонил-тРНК-синтетаз из разных организмов показал низкую гомологию между этими последовательностями, но позволил выявить нескольно высококонсервативных участков. Эти консервативные последовательности присутствуют в ТЬгЯБ из бактерий и дрожжей, несмотря на наличие дополнительного И-концсвого домена у эукариотической ТЬгЯБ. На основе определенной нами последовательности в лаборатории профессора Д.Мораса (Институт молекулярной и клеточной биологии, Страсбург, Франция) были синтезированы олигонуклеотидные праймеры для полимеразной цепной реакции и ген ТЬгЯЭ из ТлЬегторЫт был клонирован, ссквенирован и суперэкспрессирован в клетках Е.соК. Позднее в этой лаборатории были получены кристаллы ТЬЛБ, выделенной из суперпродуцентного штамма, и в настоящее время ведутся структурные исследования этого белка.

Табл. IV. Сравнение N-концевых аминокислотных последовательностей ThrRS из разных организмов. Гомологичные последовательности выделены жирным шрифтом. TrslBs и Trs2Bs: две ThrRS из Bacillus subtilis; TrsEc: ThrRS из Escherichia coli, TrsTt: ThrRS из Thermits thermophüns\ TrsSc: цитоплазматическая ThrRS из Saccharomyces cerevisiae.

TrsTt 1 ____MTVYLP DGKPLELPE. GATAKDVARA LGEGWERRAV GAIVDGTX,

TrslBs 1 MSDMVKITFP DGAVKEFAK. GTTTEDIAAS ISPGLKKKSX AGKLNGKE

Trs2Bs 1 MSKHVHIQLP DGQIQEYPK. GITIKEAAGS ISSSLQKKAA AGQVNGKL

TrsEc 1 ...MPVITLP DGSQRHYDH. AVSPMDVALD IGPGLAKACI AGRVHGEL

TrsSc 71 PRVPLKIVLK DGAVKEATSW ETTPMDIAKG ISKSLADRLC ISKVNGQL

consensus ------I-LP DG---EV-----T—D-A— I---L--------VNG-L

2.3. Определение кинетических констант аминоацияирования (РКА11* из Т.тНегторЫ1>и и Е.соН греонил-тРНК-синтетазой из Т.гИегторШив.

Мы ОПрСДСЛИЛИ ЗНЯЧСНИЯ Кт и кал треонил-тРНК-синтетаз из ТлкегторМш и Е.соН для (ЯКАТ,1Г из обеих бактерий (таблица V). Система ТЬгКЗ^КА11" из Е.соН изучалась при 37"С, из Т.ЛеппорШШ при 37°С и 70°С, гетерологичные системы при 37°С. Как показывает соотношение ЫКт, обе ThгRS аминоацилируют свои гомологичные 1КМАП" со сходной эффективностью при оптимальной температуре. ТИ^З из ТлЬеппорЬИия аминоацилирует обе изоакцепторные 1ККАТЬг из ТлНетторЫ'1ия с одинаковой эффективностью. В обоих случаях увеличение температуры с 37°С до 70°С увеличивает кем аминоацилирования примерно в 10 раз , при этом величина Кт не изменяется. Отличные результаты были получены в гетерологичных системах: ТЬгЯЭ из Е.соН аминоацилирует 1ЕЫАТЬг из Тл1гегторННи$ с той же эффективностью, что и гомологичную 1КЫАТ|1Г, тогда как ТИгИБ из ТлИегторМия аминоацилирует (ЯКАТ1" из Е.соН в 700 раз хуже, чем гомологичную. Низкая эффективность аминоацилирования обусловлена главным образом уменьшением км, а не увеличением Кт. Уменьшение км аминоацилирования 1ЯКАТ,|Г из Е.соН треонил-тРНК-синтетазой из ТлкегторМия может

)ыть связано с особенностями модификации НША из Е.соИ, которые мешают >бразованию продуктивного комплекса.

Табл. V. Кинетические константы амииоацшшрования tRNATI,r из Е.соИ и T.thermophilus гомологичной и гетерологичной ThrRS. F3 и F6 - фракции после ¡роматографии на BD-cclluIose, содержащие tRNAThr.

RNA™' ThrRS

T.thermophilus E.coli

Km (pM) A-„, (s->) kcal IKm (10« s-i M-1) К» (pM) kc,i (s-i) fccat / Km (106 S-! M-1)

T.thermophilus F3 0.037* 0.037** 0.037* -0.23** ! 6.2 0.085* 0.70* 8.23

T.thermophilus F6 0.060* 0.070** 0.026* 0.22** 0.43 3.1 H/O 0.52*

E.coti Thrj 0.14* 0.0002* 0.0014 0.050* 0.53* 10.6

* - определялось при 37°С; ** - определялось при 70°С; н/о - не определялось.

3. Исследование валил-тРНК-синтетазы из T.thermophilus.

Методами SDS-гельэлектрофореза и геяьфильтрации в неденатурирующих условиях были определены молекулярная масса и субъединичное строение ValRS из T.thermophilus. Валил-тРНК-синтетаза из T.thermophilus - мономерный белок с молекулярной массой около 95 кД. Было показано, что 70°С - оптимальная температура реакции аминоацилирования tRNAVsl из T.thermophilus гомологичной ValRS. Совместно с •. ' лабораторией О.И.Лаврик (Новосибирский Институт биоорганической химии РАН) были определены значения Ка и km валил-тРНК синтетазы для АТР, валина и tRNAVal из T.thermophilus (табл. VI).

Табл. VI. Кинетические параметры аминоацилирования tRNAVal валил-тРНК-синтетазой из T.thermophilus.

M feat, S">

ATP 3.40x10-3 1.8

валин 1.47x10-5 1.9

tRNAVsl 1.37x10-' 2.6

4. Кристаллизация лейиил-тРНК-синтетазм из Т.1ЬегторМт.

Кристаллы получены методом диффузии паров в висящей капле. Капли, содержащие белок с концентрацией 10 мг/мл и 500 мМ фосфата калия рН 5.0, уравновешивали против 1.2 М фосфата калия при 20°С. Добавление в кристаллизационную смесь ММЕРЕОзм до 1-2% является решающим фактором для

образования кристаллов. Максимальные размеры кристаллов составляли 20 мкм в диаметре и 70 мкм в длину (рис. 11). Эти кристаллы слишком малы для рентгеносгруктурного анализа. Продолжается работа по получению более крупных кристаллов.

1. Модифицирована разработанная ранее процедура очистки факторов элонгации из T.thermophilus, что позволяет получать препараты факторов с чистотой выше 98%.

2. Показано, что выделенный по стандартной методике EF-G из T.thermophilus находится в комплексе с GDP. Разработана методика выделения нуклеотид-свободного EF-G из T.thermophilus.

3. Наработан в препаративных количествах фактор элонгации G свободный от нуклеотида и в комплексе с GDP. Выращенны крупные кристаллы EF-G и получены изоморфные производные этих кристаллов с соединениями платины, ртути и свинца. При непосредственном участии диссертанта структура фактора элонгации G была определена для двух форм этого белка: свободной от нуклеотида и в комплексе с GDP.

4. Разработана методика препаративного выделения треонил-, аспартил-, фенилаланил-, валил- и лейцил-тРНК-синтетаз из T.thermophilus. Получены гомогенные препараты этих синтетаз.

5. Определены 45 аминокислот N-концевой последовательности треонил-тРНК-сиитетазы из T.thermophilus. Показано, что в этой области находится несколько высококоисервативных участков.

6. Определены кинетические константы амииоацилирования tRNATbr из E.coli и T.thermophilus треонил-тРНК-сшпетазами из E.coli и T.thermophilus. Показано, что треонил-тРНК-синтетаза из E.coli аминоацилируег гомологичную и гегерологичную tRNAT>» с одинаковой эффективностью, а треонил-тРНК-синтетаза из T.thermophilus аминоацилируег tRNATht из E.coli в 700 раз хуже гомологичной.

7. Определены значения ¡Cm и kcat валил-тРНК-синтегтазы из T.thermophilus для АТР, валина и tRNAv«i из T.thermophilus.

8. Закристаллизована лейцил-тРНК-синтетаза из T.thermophilus.

Рис. 11. Кристалл лсйцил-тРНК-синтетазы из T.thermophilus.

ВЫВОДЫ.

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. М. Б. Гарбер, Ю. М. Жеэггоносова, А. Айверсон, А. Лильяс. (1994). Новые сристаллические формы фактора элонгации G из экстремального термофила Thermos hemophilus. Доклады Академии Наук, 336 (2), 252-253.

2. 1. Zheltonosova, Е. Melnikova, М. Garber, J. Reinbolt, D. Kern, В. Ehresmann, С. Shresmann. (1994). Threonyl-tRNA synthetase from Thermits themophilus: purification and юте structural and kinetic properties. Biochimie, 16,71-76.

3. A. Aevarsson, E. Brazhnikov, M. Garber, J. Zheltonosova, Yu. Chirgadze, S. Al-iCaradaghi, L. A. Svensson and A. Liljas. (1994). Three-dimensional structure of the ribosomal :ranslocase: elongation factor G from Thermus themophilus. EMBO J., 13, 3669-3677.

4. A. Liljas, A. Aevarsson, S. Al-Karadaghi, M. Garber, J. Zheltonosova, E. Brazhnikov. (1995). Crystallographic studies of elongation factor G. Biochem.Cell Bio!., 73, 1209-1216.'

5. S. Al-Karadaghi, A. Aevarsson, M. Garber, J. Zheltonosova, A. Liljas. (1996). The ¡tructure of elongation factor G in complex with GDP: conformational flexibility and nucleotide »change. Structure, 4, 555-565.

6. M. Garber, N. Davydova, I. Eliseikina, N. Fomenkova, O. Gryaznova, I. Sryshkovskaya, N. Nevskaya, S. Nikonov, A. Rak, S. Sedelnikova, A. Serganov, D. Shcherbakov, S. Tishchenko, J. Zheltonosova, A. Liljas, A. Aevarsson, S. Al-Karadaghi. '1996). Crystallization and structural studies of components of the protein-synthesizing system тот Thermus thermophilus. J. Cryst. Growth,

7. M. Garber, S. Agalarov, I. Eliseikina, E. Melnikova, S. Sedelnikova, O. Shikaeva, t'u. Zheltonosova. Purification and crystallization of aminoacyl-tRNA synthetases, elongation "actors and ribosomal proteins from Thermus thermophilus. Abstract book. International Conference on The Translational Apparatus (in memoriam of H.G. Wittmann). Berlin, Dctober 31st-November 5th, 1992, p.41.

8. E. Brazhnikov, Yu. Chirgadze, M. Garber, I. Eliseikina, N. Fomenkova, N. 4evskaya, S.- Nikonov, S. Sedelnikova, A. Zdanov, Yu. Zheltonosova. Crystallographic malysis of proteins involved in protein synthesis. Abstract book. International Conference on The Translational Apparatus (in memoriam of H.G. Wittmann). Berlin, October 31st-4ovember 5th, 1992, p.91.

9. M. Garber, E. Brazhnikov, Yu. Chirgadze, I. Eliseikina, N. Fomenkova, N. '•Jevskaja, S. Nikonov, S. Sedelnikova, J. Zheltonosova, A. Aevarsson, C. Briand, A. Liljas, M. Lindahl, A. Svensson. Crystallographic studies of proteins involved in protein synthesis. Abstract book of the Fifth International Conference on Crystallization of Biological Macromolecules. San-Diego, California (U.S.A.), August 8-13, 1993, p. 22.

10. J. Zheltonosova, O. Drozd, M. Garber. Purification and crystallization of iminoacyl-tRNA synthetases from Thermus thermophilus. Abstract book. First German-Russian Summerschool on In vitro Systems. Berlin, September 28-30, 1994, p. 24.

11. M. Garber, N. Davydova, I. Eliseikina, N. Foraenkova, O. Gryaznova, I. Gryshkovskaya, N. Nevskaya, S. Nikonov, A. Rak, S. Sedelnikova, A. Serganov, D. Shcherbakov, S. Tishchenko, J. Zheltonosova, A. Liljas, A. Aevarsson, S. Al-Karadaghi. Crystallization and structural studies of components of the protein-synthesizing system from Thermus themophilus. Collected abstracts, ICCBM-6, Hiroshima (Japan), November 12-17, 1995, p. 164.

30.08.96 r. 3a«.7I92P. Tup.IPO aK3. yea.nett.g. 1,25.

OrneqaTEHO Ha poTanpHwre b OHTH FIHIi PAH