Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфофункциональная характеристика печени мышей до и после перелома костей голени

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфофункциональная характеристика печени мышей до и после перелома костей голени"

На правах рукописи

Очеретнна Руфина Юрьевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ ДО И ПОСЛЕ ПЕРЕЛОМА КОСТЕЙ ГОЛЕНИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005548505

2.2 МАЙ 2314

АСТРАХАНЬ-2014

005548505

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Мкртчан Офелия Завеновна

Научный консультант: доктор биологических наук Стогов Максим Валерьевич

Официальные оппоненты:

Антонова Елена Ивановна, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова», научно-исследовательский центр фундаментальных и прикладных проблем биоэкологии и биотехнологии, директор

Соловьев Георгий Сергеевич, доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия», кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии, заведующий кафедрой

Ведущая организация Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет им А.И. Евдокимова»

Защита состоится 20 июня 2014 г. в 10.00 часов на заседании объединенного диссертационного совета ДМ 212.009.01 при ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет» по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1, ауд.101.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет», адрес сайта, на котором размещена диссертация и автореферат: http://www.asu.edu.ru

Автореферат разослан« $ » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Лозовский Александр Робертович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Организм животных и человека подвергается постоянному действию ряда повреждающих факторов различного генеза: биологических, химических и физических. Среди последних несомненное значение и актуальность имеет анализ влияния механической травмы организма на функциональную морфологию ряда органов и систем в организме. Особое значение в норме и патологии (эксперимент, клиническая медицина) имеет печень - жизненно важный полифункциональный орган.

В литературе немного сведений системного характера о функциональной морфологии печени при механической травме конечностей животных и человека. Известны работы (Верин В.К. с соавт., 2010; Лебедь М.Л. с соавт., 2006), посвященные анализу репаративных процессов в печени при моделировании повреждения костного скелета.

Механизмы ответных реакций, развивающихся в тканях травмированного сегмента конечности, изучены в достаточной степени с использованием различных методов исследования (Борисова И.В. с соавт., 2010; Силантьева Т.А. с соавт., 2011). Лишь в единичных работах исследованы структурные и/или функциональные изменения печени после травмы скелета (Лунева С. А.с соавт., 2005; Lopez-Hellin J. et al., 2005).

Степень разработанности темы. Нарушение функции печени при травме связывают с развитием гипоксии, нарушением кровообращения и, как следствие, с усилением эндотоксикоза (Верин В.К. с соавт., 2008; Лукьянова Е.С. с соавт., 2011). Выраженность этих изменений зависит от степени тяжести и характера травмы. При этом до настоящего времени отсутствует единая точка зрения о репаративной регенерации поврежденных тканей в восстановительном периоде (Duckworth A.D. et al., 2011).

Продолжается поиск эффективных средств для предупреждения и коррекции функциональных нарушений в организме после травмы (Garlick P.J., 2005). В ряде публикаций отмечаются положительные результаты применения различных биологических и фармакологических способов активации метаболических

процессов печени при заболеваниях опорно-двигательного аппарата (Шотяйапс! Е., 2006 с1 а!.; 81амтг8ка-Р1е1а В. & а1., 2012).

Таким образом, несмотря на многолетнее изучение репаративной регенерации костей скелета, особый интерес вызывает исследование морфофункциональных изменений печени в восстановительном периоде после травмы и поиск эффективных средств, влияющих на течение репаративного процесса. Наличие этих проблем обосновывает актуальность настоящей работы в плане развития фундаментальных аспектов биологии и медицины.

Цель работы - выявить структурные, морфометрические и функциональные изменения печени после механического повреждения костей голени и обосновать метаболическую коррекцию репаративного процесса с помощью аминокислотной смеси.

Задачи исследования:

1. Определить динамику структурных и морфометрических изменений сосудов и эпителиоцитов дольки печени у мышей в восстановительном периоде после перелома костей голени.

2. Исследовать динамику функциональных изменений печени у 'мышей в восстановительном периоде после перелома костей голени.

3. Выявить особенности структурных и функциональных нарушений печени в восстановительном периоде после перелома костей голени при моделировании острой печеночной недостаточности.

4. Провести сравнительный анализ структурных и функциональных изменений печени с накоплением минеральных и органических компонентов костной ткани в восстановительном периоде после перелома костей голени.

5. Оценить возможное протекторное действие аминокислотной смеси (в равном весовом соотношении лейцин, изолейцин, аргинин, метионин) на течение репаративного процесса.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование структурных и функциональных изменений печени мышей в восстановительном периоде после моделирования механической травмы конечности. Показано, что в

печени после перелома костей голени происходит активация репаративной регенерации гепатоцитов па фоне изменения морфометрических показателей структур печеночной дольки, нарушение органного кровотока и обусловленные этим изменения с проявлениями деструкции и дальнейшей активацией репаративного процесса.

Обнаружено, что изменяется химический состав костной ткани. Применение аминокислотной смеси оказывает протекторное действие на течение репаративного процесса в печени, это влияет на химический состав костной ткани при её репаративной регенерации у экспериментальных животных.

Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые сведения о морфофункциональных и функциональных изменениях печени, которые детализируют представления о развитии реактивных изменений органов при действии на организм повреждающих факторов. Результаты исследования печени на различных этапах восстановительного периода после перелома костей голени могут быть использованы при разработке способов оптимизации репаративного процесса. Использование аминокислотной смеси в восстановительном периоде после травмы может найти применение в травматологии и ортопедии, диетологии, гепатологии, терапии, токсикологии.

Методология и методы исследования. Работа выполнена на базе экспериментального и клинико-экспериментального лабораторных отделов ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России. На проведение экспериментального исследования получено разрешение комитета по этике при ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России. Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназию осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977) и требованиями инструкции №12/313 Министерства здравоохранения РСФСР «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник» от 06.01.73 г.

Мышам 1-й группы (п=36) моделировали перелом костей голени (ПГ), животным 2-й группы (п=36) - острую печеночную недостаточность (ОПН) интоксикацией четыреххлористым углеродом (ССЦ), в 3-й группе (п=36) на 3 сутки после моделирования ОПН животным моделировали ПГ. Животные 1-3-й групп в ходе эксперимента получали стандартный рацион питания сбалансированный по белку и углеводам (приказ № 1179 от 10.10.83 г. «Об утверждении нормативов затрат кормов лабораторных животных в учреждениях здравоохранения»). Мыши 4-й группы (п=36) после моделирования ПГ содержались на изокалорийном, обедненном белком рационе (ИКОБР). Животные 5-й группы (п=36) после моделирования ПГ также содержались на ИКОБР, но недостаток белка в пище у них компенсировали введением в рацион аминокислотной смеси (АС). Животные 6-й группы (п=36) после моделирования ОПН, содержались на ИКОБР с возмещением недостатка белка в пище АС. Животным 7-й группы (п=36) перелом костей голени моделировали на 3 сутки после интоксикации СС14, и в ходе эксперимента мыши содержались на ИКОБР с возмещением недостатка белка АС. В группу интактных животных (ИН) вошли мыши 2-х (п=14) и 3-х (п=12) месяцев постнатального развития. Животные 4-7-й групп получали ИКОБР при содержании перевариваемого протеина не более 0,88г/сутки, в котором источником белка служил пшеничный глиадин, неполноценный по содержанию аргинина, гистидина, метионина, лизина. В 5-7-й группах недостаток белка восполняли путем смешивания мучной массы со смесью аминокислот L-ряда: лейцин, изолейцин, аргинин, метионин (Sigma) в отношении 1:1:1:1 (патент РФ на изобретение № 2454227, Стогов М.В. с соавт., 2012), в количестве, равном суммарному содержанию аминного азота в стандартном рационе. Для питья животные получали дистиллированную воду в свободном доступе.

Перелом костей голени моделировали путем механического повреждения сегмента конечности в верхней трети с медиальной поверхности (патент РФ № 2456927). Острую печеночную недостаточность - внутрибрюшинным введением 20% раствора СС14 на оливковом масле.

Из эксперимента животных выводили на 3, 7 и 28 сутки после перелома (кроме 2 и 6-й групп, которые выводились из эксперимента на 3, 6 и 31 сутки после введения СС14). Животных взвешивали индивидуально на электронных весах AND (Япония), определяли массу тела, печени, отношение массы печени к массе тела. Материалом исследования служили: печень, кости, сыворотка крови.

Морфологические и морфометрические методы исследования. Для гистологического исследования образцы левой боковой доли печени фиксировали в 10% нейтральном формалине, срезы окрашивали гематоксилином - эозином, по методу Ван-Гизон. На гистологических срезах определяли диаметр сосудов печени (центральных и междольковых вен, междольковых артерий, синусоидных капилляров, междольковых желчных протоков), с помощью объект-микрометра ОМ-ДТ7.216.009ПС и окулярной измерительной линейки (объектив х40). С помощью АПК «ДиаМорф-cito» (Россия, per. удостоверение МЗ РФ № 98/219137) оцифровывали поля зрения центральной, интермедиарной, периферической зон печеночной дольки (объектив х40). Используя программу для анализа изображений «ВидеоТесТ-Мастер 4,0» измеряли диаметр одноядерных форм гепатоцитов, определяли площадь сечения ядра и цитоплазмы, вычисляли ядерно-цитоплазматический индекс гепатоцитов (ЯЦИ), объем клетки и ядра согласно принципу М. Delesse (Автандилов Г.Г., 2002); процентное содержание двуядерных форм гепатоцитов в 3-х зонах печеночной дольки; митотический индекс гепатоцитов (на 1000, %о).

Биохимические методы исследования. Для биохимического исследования забирали образцы печени, крови, кости травмированного сегмента конечности.

Образцы кости высушивали в лиофильной сушке НЕТО LyoLab 3000 (Дания). Определяли содержание фосфата и кальция, используя наборы реагентов фирмы «Витал Диагностике» (РФ), оксипролина по реакции с реактивом Эрлиха, коллагена по концентрации оксипролина.

Активность АсАТ, АлАТ в супернатанте печени определяли унифицированным методом, используя наборы реагентов фирмы «Витал Диагностике». Концентрацию общего белка определяли по методу Лоури.

Содержание общих липидов печени находили гравиметрическим методом. Концентрацию общего белка, альбумина, мочевины (в супернатанте крови и гомогенате печени), глюкозы, общего кальция и активность аминотрансфераз в сыворотке крови определяли на биохимическом фотометре StatFax 1904+, Awareness (США, per. удостоверение ФСЗ № 2004/1258), используя наборы реагентов фирмы «Витал Диагностике» (РФ).

Статистические методы исследования. Результаты исследования обрабатывали методами непараметрической статистики, Значимость различий между двумя выборками оценивали с помощью W-критерия Вилкоксона для независимых выборок. Значимость межгрупповых различий определяли с помощью непараметрического критерия Крускала-Уоллиса, с последующим множественным сравнением с использованием критерия Данна.

Положения, выносимые на защиту:

1. В восстановительном периоде после перелома костей голени в печени мышей наблюдаются структурные и функциональные изменения, свидетельствующие о вовлечении органа в процесс адаптационных перестроек организма, определяющих характер репаративной регенерации кости поело нарушения ее целостности.

2. Применение аминокислотной смеси (лейцин, изолейцин, аргинин, метионин в равном весовом соотношении) оказывает протекторное действие на морфофункциональное состояние печени после травмы и на течение репаративного процесса в костной ткани.

Достоверность результатов исследования. Исследование выполнено на достаточном по объёму фактическом материале (278 самцов мышей линии СВА в возрасте 2-х месяцев постнатального развития), с использованием современных морфологических, морфометрических и биохимических методов исследования. С использованием АПК «ДиаМорф-cito» (Россия, per. удостоверение МЗ РФ № 98/219-137), программы для анализа изображений «ВидеоТесТ-Мастер 4,0». Полученные результаты анализированы с помощью адекватных статистических

методов, используя пакет анализа данных приложения «Microsoft Excel» и программу AtteStat 1.0.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 6 опубликованы в изданиях перечня ВАК Минобрнауки РФ, рекомендованного для публикации результатов диссертационных исследований, имеется патент РФ на изобретение (№ 2456927).

Апробация работы. Материалы диссертационного исследования доложены: на I и II съездах травматологов и ортопедов УрФО (Курган, 2008); на V международной конференции АСАМИ (Санкт-Петербург, 2008); на международной научно-практической конференции «Остеопороз и остеоартроз — проблема XXI века» (Курган, 2009); на I всероссийском конгрессе ASAMI (Курган, 2009); на международной конференции «Илизаровские чтения» (Курган, 2010; 2011; 2012); на международной научно-практической конференции «Физиологические механизмы адаптации человека» (Тюмень, 2010).

Объем и структура работы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, главы с описанием результатов собственного исследования, состоящей из двух разделов, заключения, выводов, списка литературы. Результаты представлены в виде 37 таблицы и 30 рисунков. Библиографический указатель включает 253 источников: из них 165 — отечественных, 88 - зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Структурные и функциональные изменения печени в восстановительном периоде после перелома костей голени. При светооптическом исследовании печени у животных после перелома костей голени (1-я группа) выявлены морфофункциональные изменения на всех сроках эксперимента в трех зонах печеночных долек. Обнаружены центральные, междольковые вены и синусоидные капилляры с разной степенью кровенаполнения. В синусоидных капиллярах наблюдался стаз крови. Лейкоцитарная инфильтрация,

расположенная перивенулярно, выявлена в центральных и периферических зонах долек печени. Гепатоциты имели многогранную, несколько округлую форму и четкие границы. Ядра с четкими границами, в них определялись 1 -2 ядрышка. В центральных и периферических зонах печеночных долек обнаружены гепатоциты со светлыми вакуолями. В крупных ядрах гепатоцитов этих зон выявлен гетерохроматин по периферии ядра. Отмечалось снижение относительной массы печени на 3 и 7 сутки эксперимента.

В результате морфометрического исследования установлено увеличение диаметра центральных, междольковых вен и синусоидных капилляров при снижении диаметра междольковых артерий и междольковых желчных протоков через 3 суток после перелома костей голени (рис. 1).

Диаметр центральных вен (мкм)

Диаметр междольковых вен (мкм)

5.Й

40 3? ■ з"й ' ад 20

1 ............... «А

* п** 45

I..............................

I Н; я

________ 30

1.....рг --------- 15 -----1 2»

и 11(28) з

28 сутан

п и{28) 3

28 сутки

Диаметр Диаметр

междольковых артерий синусоидных капилляров

,<> „............................„....................<№ш) »■

В • Н1 ■ 5 ■

Диаметр междольковых желчных протоков

................................(мкм).....................................

« и(28) 3

и и(28) 3

Рисунок 1 - Изменение диаметра сосудов печеночной дольки мышей

в восстановительном периоде после перелома костей голени

Примечание. * значимые отличия от значений интактных животных при Р< 0,05. и группа интактных мышей, и (28) - группа интактных мышей через 28 суток

Морфометрические исследования гепатоцитов показали значимое увеличение объема клеток на 3 сутки после травмы в интермедиарных и периферических зонах печеночных долек, через 7 и 28 суток - снижение в центральных и периферических зонах (рис. 2).

Объем геаатедшов

(мкм3)

Объем ядер гепатощиов

(мкм3)

■ Центральная зона4

а Штермсдиарная

зона. ВДЬри фери чес кая »на

н 11(28) 3 7 2$ сумей

ЯЦИ гепатоцитов

II и (28) 3 7 — сути. Двуядерные формы гепатоцитов (%)

21--

11 И (28)

II и(28) 3

28 сутки

Рисунок 2 - Изменение морфометрических показателей гепатоцитов мышей

в восстановительном периоде после перелома костей голени

Примечание. * значимые отличия от значений интактных животных при Р< 0,05. и -группа интактных мышей, и (28) - группа интактных мышей через 28 суток

В интермедиарных зонах, напротив, отмечено повышение к концу эксперимента при сравнении с возрастной нормой. Аналогичная динамика выявлена при анализе объема ядер гепатоцитов. ЯЦИ гепатоцитов значимо снижался на 3 сутки после травмы в интермедиарных и периферических зонах, через 7 суток он возрастал в центральных и интермедиарных, и эта тенденция сохранялась через 28 суток (в периферических и центральных зонах). Динамика процентного содержания двуядерных форм гепатоцитов представлена на рис 2.

Митотический индекс гепатоцитов возрастал на 3 сутки, через 7 суток значимо снижался.

Структурные и функциональные изменения печени у мышей после перелома костей голени на фоне острой печеночной недостаточности. По результатам гистологического исследования печени животных после моделирования ОПН (2-я группа) с 3 суток эксперимента отмечено нарушение радиальной ориентации печеночных балок. Обнаружит лейкоцитарная инфильтрация вокруг центральных вен, неравномерное кровенаполнение сосудистой сети, стазы крови в центральных венах и синусоидных капиллярах. В центральных зонах печеночных долек выявлены гепатоциты без четких границ с пикнотичными ядрами, явлениями кариолизиса, очаги цитолиза. Морфофункциональные изменения печени наиболее выражены на 3 и б сутки эксперимента.

У животных с переломом костей голени на фоне ОПН (3-я группа), при сравнении со 2-й группой, лейкоцитарная инфильтрация обнаружена вокруг центральных и междольковых вен, к концу эксперимента и в интермедиарных зонах долек печени. Относительная масса печени значимо повышалась на 3 сутки после травмы и/или 6 сутки после интоксикации СС14.

По результатам исследования химического состава костной ткани на 28 сутки после травмы у мышей 1 -й группы выявлено увеличение содержания фосфата и суммарного содержания кальция и фосфата (табл. 1).

Таблица 1 - Химический состав кости травмированного сегмента конечности у мышей на 28-е сутки после перелома костей голени (Ме, мг/100 г ткани)

Группа Са Р К Са+Р Са+Р+К Са/Р Са+Р/К

Интактные 9,01 13,68 10,07 22,69 32,76 0,67 2,15

1-я (ПГ) 12,06 19,80*Л 14,91л 31,86*л 46,77*л 0,61 2,14л

2-я (ОПН") 3,59* 11,56 7,79* 15,15* 22,94* 0,31* 1,94

3-я (ПГ+ОПН) 8,08 9,50* 5,82* 17,58* 23,40* 0,85 3,02*

Примечание. # - 31-е сутки после моделирования ОПН. * - значимые отличия относительно интактных животных (Р<0,05). л - значимые отличия относительно животных 3-й группы (Р<0,05). Са - кальций, Р - фосфат, К - коллаген

У животных 2-й группы к концу эксперимента отмечалось снижение содержания кальция на 60% (Р<0,05), коллагена на 23 % (Р<0,05) и суммарного содержания кальция, фосфата и коллаген на 30 % (Р<0,05). У животных с

12

переломом костей голени на фоне ОПН (3-я группа) установлено снижение концентрации фосфата на 31 % (Р<0,05), коллагена на 42 % (Р<0,05) и суммарного содержания кальция и фосфата на 23 % (Р<0,05) относительно интактных животных, а также фосфата и коллагена относительно животных 2-й группы. Соотношение суммарного содержания кальция и фосфата к коллагену повышалось на 41 % (Р<0,05) относительно животных интактной и 1 -й групп.

Выявлено снижение содержания общих липидов печени мышей 1, 2 и 3-й групп.

Активность аминотрансфераз печени животных 1, 2 и 3-й групп к 3 суткам эксперимента повышалась относительно интактных животных: Ас AT на 17 %, 49 % и 40 % (Р<0,05); АлАТ на 34 %, 26 % и 14 % (Р<0,05) соответствующих групп. На последующих сроках активность АсАТ в этих группах сохранялась на одном уровне, а активность АлАТ печени планомерно возрастала у мышей 1 и 3-й групп до 28 суток эксперимента. У животных 1-й группы активность АлАТ повышалась на 11 % (Р<0,05) относительно мышей 3-й группы.

Содержание общего белка печени и сыворотки крови у мышей всех экспериментальных групп через 3 суток после перелома соответствовало норме. У мышей 3-й группы через 3 суток после травмы отмечено значимое снижение содержания общего белка печени и сыворотки крови относительно животных 1-й группы. Через 7 суток после травмы уровень общего белка печени и сыворотки крови значимо снижался, у животных с переломом на фоне ОПН, относительно показателей интактных животных.

Отмечено повышение содержания мочевины печени на 128 % (Р< 0,05) в 1-й группе через 3 суток после травмы относительно показателей животных интактных и 3-й группы. В 3-й группе содержание мочевины на этом сроке эксперимента снижалось на 46 % (Р< 0,05) при сравнении с интактными животными. На 7 сутки после травмы отмечалось снижение содержания этого метаболита до значений нормы у животных 1-й группы, к концу эксперимента значимое снижение относительно показателей интактной и 3-й групп.

Значимое снижение содержания мочевины сыворотки крови отмечено на 7 сутки после перелома у животных 1 и 3-й групп (на фоне высокого содержания мочевины печени).

Оценка эффективности применения аминокислотной смеси для восстановления структурных и функциональных характеристик печени после перелома костей голени. Проведен сравнительный анализ структурных и функциональных изменений печени животных, получавших стандартный, сбалансированный рацион питания (1-я группа), с показателями мышей, находившихся после перелома костей голени на ИКОБР (4-я группа) и животных, находившихся после ПГ на ИКОБР в котором недостаток белка восполняли тестируемой АС (5-я группа).

При исследовании печени животных, получавших ИКОБР (4-я группа) при сравнении с 1-й группой (контроль) через 3 суток после травмы обнаружена лейкоцитарная инфильтрация, носящая диффузный характер, в интермедиарных зонах печеночных долек. Через 7 суток эксперимента очагов лейкоцитарной инфильтрации не выявлено. Обнаружены группы гепатоцитов с нечеткими границами, светлой цитоплазмой вокруг ядра. К концу эксперимента лейкоцитарная инфильтрация отмечена в единичных печеночных дольках. Установлены группы гепатоцитов, у которых мембраны клеток и их ядер нечеткие. Ядра интенсивно окрашены, либо с явлениями кариолизиса. Очаги цитолиза распределялись мозаично в трех зонах печеночных долек.

Относительная масса печени снижалась относительно интактных животных, но повышалась относительно животных контрольной группы (1-й) на всех сроках эксперимента.

У животных 5-й группы, получавших с пищей АС на фоне ИКОБР при сравнении с животными 1 и 4-й групп на 3 сутки после перелома костей голени, лейкоцитарная инфильтрация выявлена в периферических зонах печеночных долек. Гепатоциты и их ядра имели четкие границы. В ядрах определялись 1-2 ядрышка. Выявлены гепатоциты с интенсивно гомогенно окрашенными ядрами, либо с гетерохроматином по периферии и светлой нуклеоплазмой в центре. Через

28 суток после травмы лейкоцитарная инфильтрация, носящая диффузный характер, обнаружена в трех зонах печеночных долек. Клетки, ядра и ядрышки имели четкие границы. В цитоплазме гепатоцитов наблюдались мелкие вакуоли со светлым содержимым. Ядра располагались в центре клеток с 1-2 ядрышками. Отмечены очаги цитолиза и лейкоцитарной инфильтрации в трех зонах печеночных долек. Относительная масса печени мышей 5-й группы на 3 и 7 сутки эксперимента повышалась относительно животных интактных, 1 и 4-й групп, а через 28 суток - относительно животных 4-й группы. К концу эксперимента этот показатель соответствовал возрастной норме.

По результатам морфометрического исследования у мышей, получавших с пищей АС на фоне ИКОБР (5-я группа), диаметр центральных и междольковых вен на всех сроках эксперимента, синусоидных капилляров и междольковых желчных протоков к 28 суткам после травмы соответствовал показателям нормы (рис. 3).

Диаметр Диаметр

центральных вей (мкм) междолькопыл вен (мкм)

т к., ... .А* * -Л.? ......... .......,--1

40 Т.......... ..... .........

л* Т I

1- 4- — — - ь ®

.......................,............. ..........................................5 30 1

3 7 сутки 3 7 2Н су1К||

•>►• 1-я гр.(ПГ)

— 4-я гр.ШГ+ИКОБР) —♦-5-я гр.(ПГ+ИКОБР+АС)

Рисунок 3 - Изменение диаметра сосудов печеночной дольки в

восстановительном периоде после перелома костей голени у мышей, получавших

изокалорийный обедненный белком рацион с возмещением недостатка белка

аминокислотной смесью

Примечание. * значимые отличия от значений интактных животных при Р< 0,05. и — группа интактных мышей, и (28) - группа интактных мышей через 28 суток. ПГ - перелом голени, ИКОБР - изокалорийный обедненный белком рацион, АС - аминокислотная смесь

Динамика изменений ЯЦИ, митотической активности и процентного содержания двуядерных форм гепатоцитов и представлена на рисунке 4.

4-я гр.(ПГ+ИКОБР)

-■■""-—■—-----ч----------------------------------------------------------- сутки

3..............................................................__.....__7....................................................................28.......................

" II ■•»•1-я гр.(ПГ)

— 4-я г р. (П Г+ ИКОБР) —»—5-я гр. (ПГ+ИКОБ+АС)

Двуядерные формы гепатоцитов {%)

28 емки

■ Центральная зона

иИггермедаарнаа ».и зова

0,1

■ Шриферическая ■юна

ЯЦИ гепатоцитов

28 СУТКИ

I 5-я грлГИ+ИКОБР+АС) Двуадерные формы геиатоцнтев <%) ЯЦИ гепатоцитов

Мтошческий индекс гепатоцитов (%о)

2Н сутки

и Щ2Я) 3 7 28 ОТО1

Рисунок 4 - Изменение морфометрических показателей гепатоцитов и митотической активности в восстановительном периоде после перелома костей голени у мышей, получавших изокалорийный обедненный белком рацион с возмещением недостатка белка аминокислотной смесью Примечание. См. рис. 3

Обнаружено значимое увеличение объема гепатоцитов на 3 и 7 сутки после перелома костей голени относительно животных интактных и 4-й группы, через 28 суток относительно показателей 1 и 4-й групп (центральной зоны дольки печени). Снижение объема гепатоцитов установлено к концу эксперимента в периферических зонах относительно интактных животных. Отмечено повышение объема ядер гепатоцитов на 3 и 28 сутки в центральных и периферических зонах, на 7 сутки в центральных зонах относительно интактной и 4-й групп.

Содержание общих липндов печени мышей всех экспериментальных групп снижалось на 3 сутки после травмы, к 7 суткам у мышей, получавших с пищей АС на фоне ИКОБР (5-я группа), соответствовало норме, но значимо повышалось относительно показателей 1 и 4-й групп. К концу эксперимента уровень общих липидов печени животных 4-й и контрольной групп снижался относительно интактных животных.

Содержание общего белка печени повышалось через 28 суток эксперимента относительно животных 1-й группы.

Содержание альбумина у мышей, получавших с пищей АС на фоне ИКОБР (5-я группа) соответствовало показателям нормы, значимо снижалось на 7 сутки после перелома в 1-й группе и 28 сутки в 4-й группе.

Активность аминотрансфераз (АлАТ и АсАТ) печени мышей, получавших с пищей АС на фоне ИКОБР (5-я группа) повышалась на 3 и 28 сутки эксперимента относительно интактных животных.

Уровень мочевины печени повышался на 49 % (Р< 0,05) в 4-й группе и 45 % (Р< 0,05) в 5-й группе через 3 суток после перелома костей голени, на 146 % в 4-й группе и 56 % (Р< 0,05) в 5-й группе через 7 суток после травмы при сравнении с интактными животными. У животных 4-й группы содержание мочевины оставалось высоким до конца эксперимента относительно животных интактных, 1 и 5-й групп. В группе животных, получавших с пищей АС на фоне ИКОБР (5-я группа) содержание мочевины печени снижалось к 28 суткам эксперимента, соответствовало значениям нормы. Высокие значения содержания

мочевины печени у мышей 4-й группы соответствовали повышенному уровню данного метаболита сыворотки крови.

По результатам исследования химического состава образцов костной ткани на 28 сутки после травмы у мышей, находившихся на ИКОБР (4-я группа) выявлено повышение минеральных компонентов и снижение коллагена (табл. 2). Соотношение минеральных компонентов в 27 раз превышало органическую составляющую кости, у животных контрольной группы это соотношение составляло 2,6:1.

Таблица 2 - Химический состав кости травмированного сегмента конечности у мышей на 28-е сутки после перелома ((Ме, мг/100г ткани)

Группа Са Р К Са+Р Са+Р+К Са/Р Са+Р/К

Интактные животные 9,01 13,68 10,07 22,69 32,76 0,67 2,15

1-я (ПГ) 12,06 19,80* 14,91 31,86* 46,77* 0,61 2,14

4-я (ПГ+ИКОБР) 15,70* 39,99*Л 3,62*А 55,69*л 59,31* 0,39* 15,3 8 *л

5-я (ПГ+ИКОБР+АС) 9,67 12,24л 12,42 21,91 34,33 0,79 1,76

Примечание: * - значимые отличия при сравнении с интактными животными (Р<0,05). Са-кальций, Р - фосфат, К - коллаген. л - значимые отличия относительно 1-й группы (контроль) (Р<0,05)

У животных 5-й группы уровень кальция и фосфата соответствовал значениям интактных животных, содержание коллагена - показателям группы контроля. К концу эксперимента у животных 4-й группы повышалось содержание минеральных, компонентов (с преобладанием фосфата) и снижался уровень коллагена при сравнении с показателями интактной и 1-й групп. У животных 5-й группы содержание неорганических и органических компонентов образцов костной ткани на 28 сутки после перелома снижалось относительно контроля (значимое по содержанию фосфата) и соответствовало уровню показателей интактных животных.

Оценка эффективности применения аминокислотной смеси в восстановительном периоде после перелома костей голени на фоне острой печеночной недостаточности. Проведен сравнительный анализ структурных и функциональных изменений печени у мышей четырех экспериментальных групп после моделирования ОПН. Значения показателей животных после интоксикации

ССЦ с последующим содержанием на изокалорийном, обедненном белком рационе с возмещением недостатка белка в пище за счет аминокислотной смеси (6-я группа) сравнивали с показателями мышей 2-й группы. Показатели 7-й группы, которым после интоксикации ССЦ на 3 сутки моделировали ПГ, и в ходе эксперимента возмещали недостаток белка в рационе (ИКОБР) аминокислотной смесью, сравнивали с показателями мышей 3-й группы.

При исследовании печени животных 6-й группы отмечено уменьшение очагов цитолиза в печени на всех сроках эксперимента. Выявлены гепатоциты с четкими границами плазмолеммы и кариолеммы. Обнаружены признаки регенерации с 3 суток эксперимента. Относительная масса печени значимо снижалась на 7 сутки эксперимента.

У животных 7-й группы отмечены признаки внутриклеточной регенерации гепатоцитов. Относительная масса печени значимо снижалась на 3 и 7 сутки после перелома относительно 3-й группы (контроль).

Содержание общих липидов печени животных 2, 3 и 6-й групп снижалось на всех сроках эксперимента (максимально во 2-й группе до 3,07 мг на 100 г ткани (Р<0,05)). У мышей 7-й группы значения этого метаболита соответствовали возрастной норме, но значимо повышались относительно животных 3-й группы.

Активность АсАТ печени животных всех опытных групп 2, 3, 6 и 7-й групп повышалась на 3 сутки эксперимента соответственно на 49 %, 40 %, 52 % и 72

% (Р< 0,05), на 7 сутки выявлено повышение активности АлАТ на 62%, 18%, 76 % и 41 % (Р< 0,05). У животных, получавших с пищей аминокислотную смесь (6 и 7-й групп) к концу эксперимента активность обеих аминотрансфераз соответствовала показателям интактных животных, в контрольных группах (2 и 3-й) оставалась значимо высокой на всех сроках восстановительного периода.

Содержание общего белка печени и сыворотки крови животных 6 и 7-й групп в течение эксперимента соответствовало показателям нормы.

У мышей 7-й группы содержание мочевины печени повышалось на 31 % (Р< 0,05) через 3 суток и на 27 % (Р< 0,05) через 7 суток после травмы.

В сыворотке крови значимо снижался уровень мочевины у мышей 6-й группы на 6 сутки эксперимента относительно интактных животных.

У мышей с ОПН, в рацион которых включена АС (6-я группа), в образце костной ткани поврежденного сегмента конечности увеличивалось содержание кальция на 137 % (Р< 0,05) и фосфата на 47 % (Р< 0,05) на фоне снижения коллагена на 37 % (Р< 0,05) через 6 суток эксперимента(табл. 3).

Таблица 3 - Химический состав кости травмированного сегмента конечности у мышей с ОПН на 28-е сутки после перелома костей голени (Ме, мг/100г ткани)

Группа Са Р К Са+Р Са+Р+К Са/Р Са+Р/К

Интактные животные 9,01 13,68 10,07 22,69 32,76 0,67 2,15

3-я (ПГ+ОПН1 8,08 9,50* 5,82* 17,58* 23,40* 0,85 3,02*

7-я ПГ+ОПН+ИКОБР+АС) 17,77л 20,14 12,90л 37,91 *л 50,81*л 0,88 2,93

Примечание: * - значимые отличия при сравнении с интактными животными (Р<0,05). Са -кальций, Р - фосфат, К - коллаген. л - значимые отличия относительно 3-й группы (контроль) (Р<0,05)

В 7-й группе уровень коллагена на 7 сутки после перелома соответствовал норме, содержание фосфата превышало показатели животных интактной и 3-й групп. У мышей 3-й группы на данном сроке содержание коллагена снижалось на 65 % (Р< 0,05). К концу эксперимента в 7-й группе отмечалось повышение, суммарного содержания кальция, фосфата и коллагена относительно интактных животных и 3-й группы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На всех сроках восстановительного периода после перелома костей голени наблюдаются структурные и функциональные изменения печени, свидетельствующие о вовлечении органа в процесс адаптационных перестроек организма, определяющих характер репаративной регенерации кости после нарушения ее целостности.

Восстановительные процессы в печени осуществляются за счет репаративной регенерации гепатоцитов периферических и центральных зон печеночных долек. Увеличивается процентное содержание двуядерных форм гепатоцитов, митотическая активность, повышается ЯЦИ гепатоцитов.

Структурные и функциональные нарушения печени сопровождаются изменением химического состава кости травмированного сегмента конечности. Снижается содержание коллагена, изменяется соотношение Са/Р.

При введении в рацион мышей аминокислотной смеси (лейцин, изолейцин, аргинин, метионин в равном весовом соотношении) диаметр центральных и междольковых вен, а также синусоидных капилляров соответствует контрольным показателям, внутриклеточный механизм регенерации сочетается с клеточным делением.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение аминокислотной смсси способствовало восстановлению метаболических нарушений печени, развивающихся в восстановительном периоде после перелома костей голени.

Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы. Полученные результаты открывают перспективы для дальнейшего исследования электронномикроскопических, иммунноцитохимических и метаболических показателей функциональной морфологии печени при моделировании механической травмы скелета на различных этапах индивидуального развития.

Выводы:

1. Механическая травма опорного скелета у мышей (перелом костей голени) вызывает ряд структурных изменений гепатоцитов и сосудов печеночной дольки: увеличение диаметра центральных вен на 43 % (Р< 0,05), междольковых вен и синусоидных капилляров на 17 % (Р< 0,05), повышение ядерно-цитоплазматического индекса, митотической активности, процентного содержания двуядерных форм гепатоцитов. Выявленные изменения указанных показателей различной направленности сохраняются на протяжении восстановительного периода.

2. Динамика изменений метаболических показателей: общих липидов, глюкозы, общего белка, альбумина, мочевины и аминотрансфераз носит фазовый характер. В восстановительном периоде после перелома костей голени в печени снижается содержание общих липидов на 38 % (Р< 0,05), увеличивается содержание

мочевины на 57 % (Р< 0,05), активности аспартатаминотрансферазы на 17 % и аланинаминотрансферазы на 34% (Р<0,05).

3. Острая печеночная недостаточность, индуцированная четырёххлористым углеродом, усиливает изменения структурных и функциональных показателей печени в восстановительном периоде после травмы.

4. Изменение структуры и функциональной активности печени после травмы на фоне острой печеночной недостаточности сопровождается снижением содержания минеральных и органических компонентов костной ткани.

5. Применение аминокислотной смеси в составе: лейцин, изолейцин, аргинин и метионин в равных весовых соотношениях у мышей после травмы (в том числе на фоне острой печеночной недостаточности), оказывало протекторное действие на течение репаративного процесса в печени.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ (15)

Статьи в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ (6)

1. Очеретина, Р.Ю. Морфологические особенности реакции гепатоцитов на травму костей голени: (экспериментальное исследование) / Р.Ю. Очеретина, М.В. Стогов // Вестник Тюменского государственного университета. -2010 - № 3 - С 96-103.

2. Стогов, М.В. Межорганная взаимосвязь субстратов энергообмена у мышей при скелетной травме / М.В. Стогов, С.Н. Лунева, Е.А. Ткачук, Р.Ю. Очеретина // Гений ортопедии. - 2010. - № 3. - С. 40-42.

3. Очеретина, Р.Ю. Морфометрические показатели гепатоцитов при травме костей голени: (экспериментальное исследование) / Р.Ю. Очеретина, М.В. Стогов // Вестник травматологии и ортопедии имени H.H. Приорова. - 2011. - № 3 - С 7678.

4. Очеретина, Р.Ю. Морфометрические параметры сосудов дольки печени у мышей в восстановительном периоде после травмы голени / Р.Ю Очеретина, О.З.

Мкртчан, М.В. Стогов//Морфология. - 2012. - Том 141, № 2. - С. 32-34.

5. Очеретина, Р.Ю., Стогов М.В. Функциональное состояние печени после перелома костей голени: (экспериментальное исследование) / Р.Ю. Очеретина, М.В. Стогов // Российский физиологический журнал имени И.М. Сеченова - 2013 - Том 99, № 12. - С. 1389-1396.

6. Очеретина, Р.Ю. Влияние аминокислотной смеси на морфометрические показатели сосудистых компонентов печени мышей линии СВА после экспериментального перелома костей голени / Р.Ю. Очеретина, М.В. Стогов, О.З. Мкртчан, В.Е. Высокогорский // Фундаментальные исследования. - 2013 - № 12 часть 2.- С. 289-292.

Патенты (1)

7. Патент 2456927 Российская Федерация. Способ биологической оценки остеоиндуциругощего эффекта белков плазмы крови / М.А. Ковинька, М.В. Стогов, Р.Ю. Очерстина, О.Л. Гребнева; заявление 13.10.2010; опубликовано 27.07.2012, Бюл. № 28.

Остальные (8)

8. Очеретина, Р.Ю. Морфометрические показатели гепатоцитов через трое суток после перелома костей голени / Р.Ю. Очеретина, М.В. Стогов // Травматология и ортопедия России, - 2008,- № 4, приложение - С. 99-100.

9. Очеретина, Р.Ю. Морфометрические показатели ядер гепатоцитов печени через трое суток после перелома костей голени / Р.Ю. Очеретина, М.В. Стогов // Российский конгресс А8АМ1: материалы. - Курган, 2009. - С. 107-108.

10. Стогов, В.М. Системное влияние перорального применения смеси аминокислот на обменные процессы в мышцах, костях и печени мышей в посттравматический период / М.В. Стогов, С.Н. Лунёва, А.Н. Накоскин, Р.Ю. Очеретина, Е.А. Ткачук // V съезд травматологов и ортопедов Армении с международным участием: материалы научно-практической конференции - Ереван-Цахкадзор, 2010. - С. 338339.

11. Очеретина, Р.Ю. Морфометрические изменения печени при травме костей голени у мышей: (экспериментальное исследование) / Р.Ю. Очеретина, М.В. Стогов // Илизаровские чтения: материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Курган, 2010. - С. 269-270.

12. Очеретина, Р.Ю. Влияние перелома костей голени на морфологические характеристики печени мышей / Р.Ю. Очеретина, М.В. Стогов // Илизаровские чтения: материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Курган, 2010.-С. 271-272.

13. Очеретина, Р.Ю. Сравнительный анализ количественных показателей печени на фоне перорального применения аминокислот при переломе костей голени / Р.Ю. Очеретина, М.В. Стогов // Физиологические механизмы адаптации человека: материалы международной научно-практической конференции - Тюмень, 2010. -С. 130-133.

14. Очеретина, Р.Ю. Реакции сосудов печеночного ацинуса в восстановительном периоде после перелома костей голени: (экспериментальное исследование) / Р-Ю. Очеретина, М.В. Стогов // Илизаровские чтения: материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Курган, 2011. - С. 496-497.

15. Очеретина, Р.Ю. Оценка состояния тканевых компонентов печеночного ацинуса в восстановительном периоде после травмы / Р.Ю. Очеретина, М.В. Стогов // Морфология. - 2011. - № 5. - С. 105.

Отпечатано в ООО «Типография Дамми» г. Курган, ул. Гоголя, 16 тел.: (3522) 225-571,225-572 . pd@dammy.ru Тираж 100

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Очеретина, Руфина Юрьевна, Курган

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия»

имени академика Г.А. Илизарова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи 04201455978 .

Очеретина Руфина Юрьевна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ ДО И ПОСЛЕ ПЕРЕЛОМА КОСТЕЙ ГОЛЕНИ

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., проф. О.З. Мкртчан, научный консультант: д.б.н. М.В. Стогов

КУРГАН - 2014

я.

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................... 3

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................... 8

1.1. Роль структурных и функциональных особенностей печени в интеграции метаболических путей....................................................... 8

1.2. Структурные и функциональные изменения печени при действии повреждающих факторов.......................................... 17

1.3. Способы коррекции структурных и функциональных нарушений в печени при действии повреждающих факторов........ 23

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................. 26

2.1. Материал и структура исследования................................ 26

2.2. Методы исследования.................................................... 30

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ........... 34

3.1. Структурно - функциональные изменения печени в восстановительном периоде после перелома костей

голени........................................................................................... 34

3.1.1. Структурные изменения печени у мышей после

перелома костей голени............................................. 34

3.1.2. Структурные изменения печени у мышей после перелома костей голени на фоне острой печеночной недостаточности......................................................... 46

3.1.3. Функциональные изменения печени мышей после перелома костей голени.................................................. 56

3.2. Экспериментальное обоснование способа коррекции структурных и функциональных нарушений печени................. 61

3.2.1. Оценка эффективности применения аминокислотной смеси для восстановления структурных и функциональных характеристик печени после перелома костей голени........... 61

3.2.2. Оценка эффективности применения аминокислотной смеси в восстановительном периоде после перелома костей голени на фоне острой печеночной недостаточности............. 77

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.......................................................... 89

ВЫВОДЫ............................................................................. 100

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ

ОБОЗНАЧЕНИЙ................................................................... 101

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ТЕРМИНОВ............................... 102

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Функциональная морфология органных систем организма в настоящее время широко изучается как с фундаментальных общебиологических позиций на самых различных уровнях: популяционном, организменном, органном, тканевом, клеточном и цитогенетическом, так и в прикладном аспекте.

Организм животных и человека подвергается постоянному действию ряда повреждающих факторов различного генеза: биологических, химических и физических. Среди последних несомненное значение и актуальность имеет анализ влияния механической травмы организма на функциональную морфологию ряда органов и систем в организме. Особое значение в норме и в патологии (эксперимент, клиническая медицина) имеет печень - жизненно важный полифункциональный орган [9, 178, 181].

В литературе немного сведений системного характера о функциональной морфологии печени при механической травме конечностей животных и человека. Известны работы [45, 61], посвященные анализу репаративных процессов в печени при моделировании повреждения костного скелета.

Механизмы ответных реакций, развивающихся в тканях травмированного сегмента конечности, изучены в достаточной степени с использованием различных методов исследования [7, 14, 19, 51, 115]. Лишь в единичных работах исследованы структурные и/или функциональные изменения печени после травмы скелета [79, 99, 149].

Степень разработанности темы. Нарушение функции печени при травме связывают с развитием гипоксии, нарушением кровообращения и, как следствие, с усилением эндотоксикоза [20, 72]. Выраженность этих изменений зависит от степени тяжести и характера травмы. При этом до настоящего времени отсутствует единая точка зрения о репаративной регенерации поврежденных тканей в восстановительном периоде [192].

Продолжается поиск эффективных средств для предупреждения и коррекции функциональных нарушений в организме после' травмы [186, 193]. В ряде публикаций отмечаются положительные результаты применения различных биологических и фармакологических способов активации метаболических процессов печени при заболеваниях опорно-двигательного аппарата [180, 188, 236, 247].

Таким образом, несмотря на многолетнее изучение репаративной регенерации костей скелета, особый интерес вызывает исследование морфофункциональных изменений печени в восстановительном периоде после травмы и поиск эффективных средств, влияющих на течение репаративного процесса. Наличие этих проблем обосновывает актуальность настоящей работы в плане развития фундаментальных аспектов биологии и медицины.

Цель работы - выявить структурные, морфометрические и функциональные изменения печени после механического повреждения костей голени и обосновать метаболическую коррекцию репаративного процесса с помощью аминокислотной смеси.

Задачи исследования:

1. Определить динамику структурных и морфометрических изменений сосудов и эпителиоцитов дольки печени у мышей в восстановительном периоде после перелома костей голени.

2. Исследовать динамику функциональных изменений печени у мышей в восстановительном периоде после перелома костей голени.

3. Выявить особенности структурных и функциональных нарушений печени в восстановительном периоде после перелома костей голени при моделировании острой печеночной недостаточности.

4. Провести сравнительный анализ структурных и функциональных изменений печени с накоплением минеральных и органических компонентов костной ткани в восстановительном периоде после перелома костей голени.

5. Оценить возможное протекторное действие аминокислотной смеси (в равном весовом соотношении лейцин, изолейцин, аргинин, метионин) на течение

репаративного процесса.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование структурных и функциональных изменений печени мышей в восстановительном периоде после моделирования механической травмы конечности. Показано, что в печени после перелома костей голени происходит активация репаративной регенерации гепатоцитов на фоне изменения морфометрических показателей структур печеночной дольки, нарушение органного кровотока и обусловленные этим изменения с проявлениями деструкции и дальнейшей активацией репаративного процесса.

Обнаружено, что изменяется химический состав костной ткани. Применение аминокислотной смеси оказывает протекторное действие на течение репаративного процесса в печени, это влияет на химический состав костной ткани при её репаративной регенерации у экспериментальных животных.

Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые сведения о морфофункциональных и функциональных изменениях печени, которые детализируют представления о развитии реактивных изменений органов при действии на организм повреждающих факторов. Результаты исследования печени на различных этапах восстановительного периода после перелома костей голени могут быть использованы при разработке способов оптимизации репаративного процесса. Использование аминокислотной смеси в восстановительном периоде после травмы может найти применение в травматологии и ортопедии, диетологии, гепатологии, терапии, токсикологии.

Методология и методы исследования. Работа выполнена на базе экспериментального и клинико-экспериментального лабораторных отделов ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России. На проведение экспериментального исследования получено разрешение комитета по этике при ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России. Содержание животных, оперативные вмешательства и эвтаназия осуществлялись в соответствии с требованиями Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях

(Страсбург, 18 марта 1986 г., ЕТ8 № 123); «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 № 755); требованиями инструкции №12/313 Министерства здравоохранения РСФСР «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник» от 06.01.73 г.

Экспериментальное исследование проведено на лабораторных мышах-самцах линии СБА (278 животных). Формировали три экспериментальные модели на фоне различного рациона питания. Моделировали перелом костей голени путем механического повреждения сегмента конечности в верхней трети с медиальной поверхности (патент РФ № 2456927), перелом костей голени на фоне острой печеночной недостаточности, острую печеночную недостаточность внутрибрюшинным введением 20% раствора СС14 на оливковом масле.

Материалом исследования служили: печень, кости, сыворотка крови. В ходе выполнения исследования применялись морфологические и морфометрические, биохимические и статистические методы.

Положения, выносимые на защиту:

1. В восстановительном периоде после перелома костей голени в печени мышей наблюдаются структурные и функциональные изменения, свидетельствующие о вовлечении органа в процесс адаптационных перестроек организма, определяющих характер репаративной регенерации кости после нарушения ее целостности.

2. Применение аминокислотной смеси (лейцин, изолейцин, аргинин, метионин в равном весовом соотношении) оказывает протекторное действие на морфофункциональное состояние печени после травмы и на течение репаративного процесса в костной ткани.

Достоверность результатов исследования. Исследование выполнено на достаточном по объёму фактическом материале (278 самцов мышей линии СВА в возрасте 2-х месяцев постнатального развития), с использованием современных морфологических, морфометрических и биохимических методов исследования. С

использованием АПК «ДиаМорф-cito» (Россия, per. удостоверение МЗ РФ № 98/219-137), программы для анализа изображений «ВидеоТесТ-Мастер 4,0». Полученные результаты анализированы с помощью адекватных статистических методов, используя пакет анализа данных приложения «Microsoft Excel» и программу AtteStat 1.0.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 6 опубликованы в изданиях перечня ВАК Минобрнауки РФ, рекомендованного для публикации результатов диссертационных исследований, имеется патент РФ на изобретение (№ 2456927).

Апробация работы. Материалы диссертационного исследования доложены: на I и II съездах травматологов и ортопедов УрФО (Курган, 2008); на V международной конференции АСАМИ (Санкт-Петербург, 2008); на международной научно-практической конференции «Остеопороз и остеоартроз — проблема XXI века» (Курган, 2009); на I всероссийском конгрессе ASAMI (Курган, 2009); на международной конференции «Илизаровские чтения» (Курган, 2010; 2011; 2012); на международной научно-практической конференции «Физиологические механизмы адаптации человека» (Тюмень, 2010).

Объем и структура работы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, главы с описанием результатов собственного исследования, состоящей из двух разделов, заключения, выводов, списка литературы. Результаты представлены в виде 37 таблицы и 30 рисунков. Библиографический указатель включает 253 источников: из них 165 -отечественных, 88-зарубежных.

Диссертационное исследование выполнено по плану НИР ФГБУ «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава РФ (№ гос. регистрации 01201155766).

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В настоящее время сформировалось отчетливое представление о том, что после травмы любой этиологии в организме животных и человека происходят изменения на всех уровнях организации живой материи (популяционном, организменном, органном, тканевом, клеточном и цитогенетическом). При механической травме нарушается целостность тканей, метаболиты поступают в кровоток, влекут за собой изменения метаболизма [127, 143]. В восстановительном периоде после травмы особое значение имеет морфофункциональное состояние печени, в которой протекают сложные процессы обмена белков и аминокислот, липидов, углеводов, биологически активных веществ (гормонов, биогенных аминов и витаминов), микроэлементов, регуляция водного обмена [32, 143, 178]. Печень поддерживает постоянный состав крови (гомеостаз), обеспечивая синтез, накопление и выделение в кровь различных метаболитов, а также поглощение, трансформацию и экскрецию многих компонентов плазмы крови [61, 159]. Кроме того, важными функциями печени являются депонирующая, барьерная, экскреторная.

1.1. Роль структурных и функциональных особенностей печени в интеграции

метаболических путей

Печень - одна из наиболее крупных железистых органов позвоночных. Абсолютная и относительная масса печени подвержены значительным колебаниям в зависимости от вида, возраста и питания [63, 69, 157].

На основании филогенеза и онтогенеза структурно-функциональной единицей печени считается классическая печеночная долька, включающая железистую

паренхиму, расположенную вокруг центральной вены и по периферии окруженную прослойками междольковой соединительной ткани, содержащей печеночные триады. Эпителиальные клетки располагаются в виде анастомозирующих между собой печеночных балок, которые по толщине состоят из двух гепатоцитов, образующих желчные канальцы. Между балками располагаются особого вида капилляры - синусоиды. В печеночной дольке выделяют 3 зоны: центральная - примыкает к центральной вене (соответствует перивенулярной зоне ацинуса), периферическая окружает портальный тракт (соответствует перипортальной зоне ацинуса), интермедиарная (промежуточная) располагается между центральной и периферической зонами [29, 35, 119].

Гепатоциты находятся примерно в одинаковых условиях функционирования в пределах зоны дольки (ацинуса) [148]. Данные ряда авторов свидетельствуют о зависимости ультраструктуры гепатоцитов, их функциональной и регенераторной активности, чувствительности к гепатотропным ядам, от локализации в пределах зон ацинуса (дольки). Однако механизм этого явления остается до сих пор не выясненным [148, 250, 253].

Считается, что полного соответствия между зонами дольки и ацинуса нет. Вместе с тем, существование двух подходов при анализе морфофункциональных характеристик печени, в настоящее время, является достаточно обоснованным, облегчает понимание морфогенеза структурных нарушений печени при анализе различных зон функциональной организации печени.

Основной функциональной клеткой печени является гепатоцит. По данным современных исследований, гепатоцит представляет собой полигональную клетку, в которой выделяют два полюса - базальный (синусоидальный) и апикальный (билиарный), которые различаются характером расположения органелл и функций. Экзокринную секрецию гепатоцит выполняет через апикальный (билиарный) полюс, а эндокринную - через базальный (синусоидальный), обращенный в перисинусоидальное пространство Диссе.

Латеральной и контактной поверхностями гепатоциты соединяются друг с другом в составе печеночной балки [35].

По данным современных исследований, в процессе эволюции животных клеточный состав печени не менялся [9]. Отмечено изменение количественных показателей. Прослеживается тенденция к увеличению диаметра артериолы от рыб к млекопитающим [81]. Структура гепатоцитов имеет видовую специфичность по количественным показателям размеров ядер, строению ядрышкового аппарата, митохондрий, ГЭС, лизосом, по содержанию гликогена и липидов. Отмечен видоспецифический характер распределения в печени клеток Купфера, клеток Ито, однако не выявлено особенностей в локализации двуядерных форм гепатоцитов [9].

Известно, что у млекопитающих к моменту рождения дифференцировка печени в основном завершена, гепатоциты в постнатальном онтогенезе обладают низкой пролиферативной активностью. При отсутствии стимуляции роста у крыс гепатоциты делятся 1-2 раза в течение жизни [12, 93, 190, 248]. Характерным способом физиологической регенерации гепатоцитов у млекопитающих является полиплоидизация за счет ацитокинетических митозов, у птиц одноядерные полиплоидные гепатоциты, у эктотермных оба способа в равной мере [9]. У млекопитающих по мере развития и окончательного формирования печени происходит по�