Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Множественые молекулярные формы церулоплазмина, синтезируемые печенью, и их роль в гомеостазе меди у крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Множественые молекулярные формы церулоплазмина, синтезируемые печенью, и их роль в гомеостазе меди у крыс"

^ -'о

На правах рукописи

V

АЛЕЙНИКОВА Татьяна Дмитриевна

МНОЖЕСТВЕННЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФОРМЫ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА, СИНТЕЗИРУЕМЫЕ ПЕЧЕНЬЮ, И ИХ РОЛЬ В ГОМЕОСТАЗЕ МЕДИ У КРЫС

Специальность — 03.00.04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН в Отделе молекулярной генетики (директор НИИЭМ РАМН академик Ткаченко Б. И.)

Научный руководитель: доктор биологических наук Пучкова Л. В.

Официальные оппоненты: д. б. н. Казакова Т. Б.,

д. м. н. Розенберг О. А.

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии РАН.

Защита диссертации состоится „ /¿Г и 1995 г.

в /3 часов на заседании Диссертационного Совета К 001.23.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при НИИ экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12).

Автореферат разослан « -/3 » ¿¡аЛ_1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук

Куликова О. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Медь относится к незаменимым компонентам пищи. Она необходима для нормальной жизнедеятельности клеток всех типов. Это обусловлено тем, что ионы меди являются кофакторами нескольких десятков ферментов, которые участвуют в таких жизненноважных процессах, как окислительное фосфорилирование, фотосинтез, посттрансляционное созревание пептидных гормонов, регулирующих деятельность центральной нервной системы у млекопитающих, формирование матрикса соединительной ткани у животных и клеточных стенок у растений, синтезе гемоглобина (Cousin, 1985; Brovwn et al., 1994). В то же время, как сильные нуклеофильные агенты, ионы меди при прямом контакте действуют повреждающе на все типы биомолекул.

Для контроля за поступлением, сохранением, распределением и экскрецией ионов меди у всех типов организмов существуют специфические метаболические системы, состоящие из белков, способных переносить ионы меди по каналам внутриклеточной и межклеточной коммуникаций через гидрофильные и гидрофобные компартменты организма. Дисбаланс этой системы, вызванный как врожденными дефектами белков, так и экологическими причинами, вызывает у человека и сельскохозяйственных животных медные микроэлементозы (Авцин и др. 1994). Многие из них могу г быть излечены при изменении количества меди в рационе.

Самые скромные подсчеты показывают, что в контроле баланса меди у человека участвуют более двадцати генов, которые экспрессируются в различные периоды онтогенеза. В настоящее время изучены лишь три белка, физиологическая роль которых ч метаболизме меди установлена. Это, в первую очередь, церулоплазмнн (ЦП) [К. Ф. 1.16.3.1, J, медьсодержащий гликопротеин альфа-2-глобулиновой фракции плазмы крови, который у млекопитающих выполняет роль универсального транспортёра меди. Известна. первичная структура молекулы ЦП (Takahasi et al., 1984), она совпадает с последовательностью выделенной из данных анализа последовательности нуклеотидов клонированного гена ЦП (Koshinsky et al., 1980). Установлено, что ген ЦП расположен на хромосоме 3 (Yang et al., 1986). Показано, что ЦП, циркулирующий в кровотоке, синтезируется исключительно в печени (В.С.Гайцхоки и др., 1991). Обнаружено, что ЦП присутствует в белках желчи (Verbina I.A. et. al., 1992), а его количество в ней отражает состояние метаболизма меди в организме (Iyengar et al., 1989, Puchkova et al., 1990).

ЦП передаёт ионы меди в клетки негепатоцитарного происхождения через специфический рецептор интернализующего типа (Harris, 1991; Пучкова и др., 1995). Изучена кинетика взаимодействия ЦП с его рецептором, определена молекулярная масса рецептора ЦП (Пучкоза и др., 1991. Frieden,

1

1993). Показано, что экспрессия гена этого белка регулируется по типу обратной связи (Сасика, 1995). Третьим известным белком, участником метаболизма меди, является металлотионеин, цитозольный белок, связывающий избыток ионов меди в клетках. Экспрессия гена металлотионеина в клетках различных организмов изучена на всех уровнях (Cousin, 1985). Кроме этого, клонированы гены двух белков, мутации в которых приводят к наследственным дефектам метаболизма меди (болезнь Менкеса и болезнь Вильсона).

Анализ литературных данных показывает, что сведения о молекулярно-генетическом механизме, регулирующем баланс меди, фрагментарны. Отсутствие их препятствует разработке н^чно обоснованной коррекции медных мнкроэлементозов.

В связи с изложенным выше представляется актуальным изучение центральной роли печени млекопитающих в поглощении, распределении и экскреции меди на молекулярном уровне.

Цель исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении экспрессии гена церулоплазмина, универсального транспортера меди млекопитающих на уровне белковых продуктов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи. I .Изучить динамику синтеза и секреции ЦП in vivo и in vitro у лабораторных крыс.

2.Установнть связь между образованием множественных самостоятельных молекулярных форм ЦП и периодом онтогенетического развития.

3.Исследовать молекуляр/но-генетический механизм образования множественных молекулярных форм ЦП на уровне экспрессии гена ЦП у эмбрионов и у взрослых крыс.

Научная новизна работы. На интактных крысах, крысах с катетеризированными желчным протоком н шейной артерией, изолированных гепатоцитах и срезах печеночной ткани в пульс-чейз экспериментах продемонстрировано, что в гепатоцитах синтезируются три самостоятельные формы ЦП: ЦП сыворотки крови, ЦП желчи и внутриклеточный ЦП.

Показано, что в эмбриональной печени синтезируется только ЦП сыворотки крови. Синтез ЦП желчи и внутриклеточного ЦП наступает примерно через 10 дней после рождения и совпадает по времени с переходом эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый тип.

Анализ лолирнбосомнон РНК печени крыс в разные периоды онтогенеза с помощью специфических молекулярных зондов позволил установить, ufo каждая из трех молекулярных форм ЦП транслируется с различных мРНК, которые, по-видимому, образуются в результате алыериатипното сплайсинга общего первичного транскрипта гена ЦП.

7

Научно-практическое значение исследования. Полученные данные дополняют сведения о роли ЦП в метаболизме меди. Показано, что в экскреций" меди значительную роль выполняет ЦП желчи, самостоятельная молекулярная форма ЦП, синтезируемая гепатоцитами. Результаты, представленные в работе, позволяют рассматривать множественные молекулярные формы ЦП как семейство белков, участвующих в переносе ионов меди в различных отделах организма. Данные об изменении содержания ЦП в желчи при контролируемом поступлении меди в организм могут быть использованы в качестве диагностической характеристики фенотипа метаболизма меди у пациентов.

Апробация работы. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в рецензируемых журналах. Результаты доложены на Первом Российском съезде медицинских генетиков, Москва, 14-16 декабря 1994 г.

Структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты и их обсуждение, Заключение, Выводы и Список цитируемой литературы.Работа изложена на страницах стандартного машинописного текста, содержит .М..схемы, ...J..таблицы, .12..рисунков. Список литературы включает ссылок, в том числе на английском языке.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе были использованы: крысы линии "Вистар", полученные из питомника Рапполово, плазмиды pCplg4 и рСр9В, предоставленные профессором G. Gitlin. Реактивы для электрофореза, нитроцеллюлозные фильтры, размер пор 23 мкм, HEPES, полиэтиленгликоль-6000 (ПЭГ), смесь белков маркеров - фирмы Serva. Неорганические соли - фирмы Merk. Коллагеназа тип V, тритон Х-100, агароза, гепарин, циклогексимид, бета-меркаптоэтанол, сахароза, додецилсульфат Na (ДДС-Na), гуанидинхлорид, трипсин, сефароза-2В, сефароза-4В, АТР, фосфокреатинкиназа, креатинфосфат - фирмы Sigma.

Радиоактивные изотопы получены: Na[125I] (30 мКи/мл), [,5$]-метиошш, [14С]-лейцин и [,2P]-dATP - из Российского Научного центра - "Прикладная химия", [|4С]-гидролиэат хлореллы, 1 мКи/мл - (Чехословакия), смесь [|4С]-аминокнслот,

54 мКи/мА (Amersham, Англия).

Для изучения секреции ЦП в кровоток и в желчь у крысы весом 300 г. были катетеризированы правая сонная артерия и общий желчный проток. Операцию проводили под общим наркозом. В качестве наркотика использовали оксибутират натрия. Оба катетера имели специальные заглушки. Крысе внутрибрюшинно вводили 1 мКи ["Sj-метионина и через определенные

3

интервалы времени отбирали по 50 мкл. крови. Желчь свободно изливалась в фиксированную пробирку, которую меняли каждые 30 мин. Объем потерянной жидкости возмещали путем медленного введения физиологического раствора через катетер в сонную артерию. Опыт продолжали 4 часа. Из дробных образцов крови получали сыворотку. К образцам желчи (в течение опыта желчеотделение происходило равномерно со скоростью примерно 0,8 мл/час; содержание белка в пробах также не изменялось в течение 4 часов и составляло около 1мг/мл), добавляли по 0,4 мл 40% раствора ПЭГ для очистки и концентрирования белковой фракции желчи. Осадок собирали центрифугированием, растворяли в 0,I мл 0,15 М NaCI до концентрации белка - 4 мг/мл.

Гепатоциты, использованные для изучения скорости синтеза и секреции ЦП, получали путем "расклеивания" печени на отдельные клетки с помощью коллагеназы, перфузируемой через изолированную печень. После отмывания гепатоциты суспендировали в растворе содержащем (мМ): NaCI-100, KCI-5,4, KH2PO4-IJO, NaiS04-0,70, MgCb-6H20-0,64, СаСЬ.6НгО-1,22 , HEPES-30,21, pH 7,4. Конечная концентрация клеток в суспензии составляла 200-300 мг сырого веса клеток в 1 мл среды. Жизнеспособность клеток контролировали с помощью трипанового синего.

Изолированные жизнеспособные (90-95%) гепатоциты инкубировали при 37°С в атмосфере 95%Ог-5%СОг и постоянном перемешивании. Инкубационная смесь .содержала 3 мл стандартной суспензии гепатоцитов, 120 мкл 1М глюкозы, 24 мкл аминокислотной смеси и 20 мкКи (|4С]-белкового гидролизата хлореллы. После инкубации клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость осветляли центрифугированием в ультрацентрифуге L2-50 (ротор Ti-50, 45000 об/мин, 2 часа). Иммунореактивный [ЫС]-ЦП осаждали с помощью антител к ЦП крысы (в качестве носителя использовали высокоочищенный препарат ЦП сыворотки крови). Иммунопреципитат промывали физиологическим раствором и анализировали методом электрофореза в полнакрипамидном геле (ПААГ) с ДДС-Na.

Изучение внутриклеточной топографии биосинтеза ЦП in vivo проводили на белых беспородных крысах самцах весом 180-200 тр., которым внутрибрюшинно вводили |ыС]-лейцин из расчета 0,5 мКн на 100 гр. веса тела. Через 15 мин после введения [,4С]-лейцина внутрибрюшинно вводили немеченый ленцин в 500-кратном избытке по отношению к радиоактивному лейцину. После декапитации печень немедленно извлекали и охлаждали. Одну часть массы-'Печени использовали для выделения комплекса Гольджи, флотирующего в ступенчатом градиенте сахаррзы (Fleischer и Feischer, 1976), из остальной ткани выделяли субфракции полирибосом и мембран

Й

эндоплазматического ретикулума, а также цитозольную фракцию -супериатаит после центрифугирования гомогената печени при 100000g в течение (часа. Секреторные везикулы аппарата Гольджи выделяли \п печени крыс, которым для подавления экзоцитоза через катетер в желудок вводили раствор 10% этилового спирта (5% к весу тела) за 30 мин до начала опыта. Новосинтезированный ЦП иммунопреципитировали и иммунонрещтиип анализировали методом электрофореза в Г1ААГ с ДДС-Na.

В опытах по изучению скорости секреции ЦП in vitro извлеченную печень помещали в охлажденный раствор Хенкса, тромывали, тщательно измельчали ножницами, 400 мг ткани помещали в колбу, площадь дна которой составляла не менее 3 см2, добавляли инкубационную смесь-1, содержащую в 1 мл раствора Хенкса 10 мМ глюкозы, 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA), эквимолярную смесь аминокислот, не содержащую мстиошш, по 40 мкМ каждой аминокислоты и 50 мкКи pSJ-метионина. Общий обьем пробы составлял 1 мл. После инкубации смесь центрифугировали вновь 30 мин при 23000g, из осадка после гомогенизирования выделяли тотальную фракцию мембран.

Изучение синтеза ЦП в онтогенезе также проводили на самках белых беспородных крыс. Первым днем беременности считали день обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках. Животных умерщвляли дислокацией шейных позвонков. Зародышей извлекали из репродуктивного тракта, освобождали от всех зародышевых оболочек и помещали в охлажденный раствор Хенкса. Печень извлекали под бинокулярной лупой. Печень зародышей и их тела без печени измельчали ножницами, по 100 мг кашицы тканей помещали в 0,5 мл смеси-1. Срезы инкубировали 2 часа при 37°С с постоянным встряхиванием. После интгубации смесь центрифугировали 5 мин при 2000g. Супернатант сливали и снова центрифугировали 20 мин при 23000g. Полученный супернатант использовали для выявления секреторного ЦП. Из осадка выделяли мембранную фракцию. В осветленную инкубационную среду и мембранную фракцию добавляли тритон Х-100 и ДДС-Na до конечной концентрации 0,5% каждого. По 30 мкл образцов подвергали электрофорезу. Из оставшихся аликвот иммунопреципитировали новосинтезированный ЦП.

Тотальную полирибосомальную РНК из печени крысы выделяли по методу Rhoads. Для блот-гибридизации испольэовяли ЦП-кДНК. клонированную в плазмидах pCplg4 и рСр9В, коюрыс содержит последовательности комплементарные ЦП-мРНК крысы (соответственно нуклеотиды NN421-3715 и 7000). Фракционирование РНК денатурирующим электрофорезом в агарозном геле с формальдегидом, выделени1- плазмидной ДНК, ее расщепление рестрикционными эидонуклеазамн, фракционирование фрагментов электрофорезом в агарозном геле, их элгоцию, мечение [,гР| в

5

ДНК-полимеразной реакции с множественным» статистическими праймерами и блот-гибридизацию РНК-кДНК проводили в соответствии с методами, описанными в руководстве Sambrook и др., 1993. В опытах использовали фрагменты ЦП-кДНК длиной 2,1, 0,7 и 0,5 т.п.н., комплементарные различным сегментам охарактеризованной ЦП-мРНК крысы (Fleming и G.Gitlin, 1989г.).

Электрофорез проводили в 7,5% ПААГ в присутствии ДДС-Na (Laemmli, 1970). В качестве маркеров использовали белки с известной молекулярной массой: ЦП человека (130 кДа), BSA (68 кДа), овальбумин (43 кДа). химотрипсшюген (25 кДа) и цнтояром с (12,4 кДа). Гели окрашивали на белок или радиоавтографировали.

Иммуиоэлектрофорез проводили в Г/о геле агарозы, содержащем 100 мкг/мл моновалентных антител к ЦП крысы, ПЭГ (4 мг/мл) и 0,5%-ный тритон Х-100. В качестве буфера использовали трис-глицин-мединал-вероналовый буфер, рП 8,К, с ионной силой 0,8. Электрофорез проводили в течение ночи при 10 V на см пробега, затем гели отмывали, высушивали и окрашивали на белок, или специфическую оксндазную активность орто-дианизидином, или .. Эвторадиографировали. '

Полипептиды ЦП, связанные с мембранной фракцией клеток, выявляли методом радиоиммуноблотинга.

В сыворотке крысят разного срока жизни содержание ЦП определяли по оксидазной активности и методом количественного

иммуноэлектрофореза.

Сравненне молекулярной структуры секретируемого гепатоцитамн ЦГ1 и сывороточного ЦП проводили методом пептидных карт.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

С целью установления связи между органоспецифическон функцией печени в процессах поглощения, распределения и выведения меди в организме млекопитающих проводили изучение синтеза и секреции множественных молекулярных форм ЦП на целом организме крысы, изолированных гепатоцитах, тканевых срезах печени взрослых крыс и эмбрионах разного срока развития.

1. Синтез ЦП в печени in vivo.

Ранее в Лаборатории биохимической генетики ИЭМ РАМН с помощью иодированных антител к ЦП и специфического кДНК-зонда (V.S. Gaitskhoki et al., 1980) было убедительно продемонстрировано, что ЦП в печени синтезируется исключи тепьно ни мембршюспязпнных лолирибосомах. Это свидетельствует о том, чго молекулы ЦП на ранних этапах трансляции попадают о мембранно-секрегорный путь клетки. В представленной в этом

6

разделе серии опытов проводили изучение динамики пространственного перемещения вновь синтезированного ЦП в субфракциях мембран транспортной сети клетки. С этой целью использовали прием пульс-чейз мечения ЦП in vivo. В нулевое время крысам вводили внутрибрюшинно 0,5 мл физиологического раствора, содержащего 1 мКи [|4С]-лейцина, животных убивали декапнтацией через 2, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60 и 90 мин после введения метки. Если время мечения превышало 5 мин после истечения этого срока, внутрибрюшинно вводили 1000-кратный избыток немеченого О.Ь-лепцина. Из печени выделяли субклеточные фракции: полирибосомы, шероховатый и гладкий ретикулум, комплекс Гольджи, цитозоль, секреторные везикулы. Новосинтезированный ЦП выделяли из солюбилизированных фракций иммунопреципитацией. Результаты этих опытов суммированы в таблице 1. Как видно из приведенных в таблице данных, радиоактивность ЦП во фракции мембр&носвязанных полирибосом достигает максимума через 5 мин после введения [|4С]-лейцина. Затем содержание [|4С]-ЦП в полирибосомной фракции быстро падает и через 10 мин снижается почти до нуля. К этому времени максимальное содержание [14С]-ЦП обнаруживается во фракции шероховатого ретикулума, а через 20 мин пик радиоактивного ЦП перемещается в гладкий ретикулум. В аппарате Гольджи меченый ЦП обнаруживается через 30 мин и еще через 10 мин здесь он достигает своего максимального содержания. В течение следующих 30 мин его содержание в комплексе Гольджи незначительно понижается, а затем резко падает. В кровотоке следовые количества [14С]-ЦГ1 обнаруживаются через 45 мин после введения [иС]-лейцина. Резкое увеличение содержания [,4С]-ЦП в сыворотке крови начинается через 90 мин после начала опыта, а его содержание достигает максимума через 120 мин. В последующие 3 часа удельная радиоактивность ЦП в крови практически не меняется. В цитозоле меченый ЦП обнаруживается одновременно с его появлением в кровотоке и его содержание в дальнейшем не меняется. Это, вероятно, свидетельствует о том, что источником ЦП в цнгозоле являются примеси крови, неизбежно присутствующие в гомогенате печени. То, что новосинтезированный ЦП на ранних сроках мечения не обнаруживается в цитозоле, дополнительно свидетельствует о его прочной связи с мембранами и/или внутримембранными пространствами. Динамика аккумулирования [|4С]-ЦП п индивидуальных фракциях показывает, что скорость внутриклеточного перемещения ЦП снижается по мере транспорта от полирибосом к комплексу Гольджи и далее п кровоток. Относительно высокое содержание [ИС]-ЦП в секреторных везикулах и задержка секреции новосинтезированного ЦП дают основание предположить наличие регуляторного механизма секреции ЦП. позволяющего

7

резко иоиышл1ь содержание ЦП в сыворотке, как это имеет место в раннем периоде реакции острой фазы.

Таблица 1.

Синтез и секреция ЦГ1 в печени крысы. ".....

Субклеточная фракция секреторного пути клетки Время появления максимального количества [|4С)-ЦП. мин Удельное содержание новосинтезирован ного ЦП. % Максимальная 1 молекулярная масса ЦП полипептнда Молекулярная масса протеолитичес-ких фрагментов ЦП, кДа

Мембраносвя- занные полирибосомы 5 1.2 120 80

Шерохоратын регнкулум 10 1.5 128-130 80 .

Гладкий решкулум 20 - 25 2.5- 1.5 128- 130 80; 65

Аппарат Гольджи 40 6.0 ' 132 80; 65

Секреторные везикулы 90 10 65

Цитозоль 120 0.7 130 65

Сыворотка крови 120 0.7 . _

Желчь' 120-300 0.5 130 80; 65

I) таблице представлены средние значения трех независимых измерении. (*) - данные одного опыт;).

Молекулярно-весопой анализ [14С]-ЦП, иммунопрецнпитированною из субклеточных фракций показал, что внутриклеточный [ЫС]-ЦП образует при спонтанном протеолизе полипептид с молекулярной массой -80 кДа, которого нег в секреторных везикулах и в новосинтезированном сывороточном ЦП. Полипептид ЦП с близкой молекулярной массой обнаружен при молекулярно-весовом анализе первичного продукта трансляции ЦП-мРНК в различных бесклеючных системах (С.Л. Пейфах и др., 1989) при использовании в качестве источника ЦП-мРНК тотальной полирибосомальной РНК, поли (А)'-РНК, поли (А)'-РНК, обогащенной ЦП-мРНК центрифугированием в градиенте сахарозы, высокоочищенной поли (А)'-мРНК и ЦП-мРНК, изолированной через ЦП-кДНК. Сопоставление этих результатов и данных, прииеленных в таблице I, показывает,

что внутриклеточные молекулярные формы ЦП, синтезированного в печени in vitro, не идент ичны сывороточному ЦП.

8

2. Динамика секреции новосинтезированного ЦП печенью крысы in vivo.

Так как гепатоциты секретируют продукты синтеза не только в кровь, но и полярно в желчь, мы предположили, что, возможно, 80 кДа-фратмент входит в состав ЦП, секретируемого в желчь. С целью проверки этого предположения у крысы весом 300 гр. были катетеризированы сонная артерия и желчный проток. После внутрибрюшинного введения ["SJ-метионина через каждые 30 мин в течение 4 часов отбирали аликвоты крови и желчи. Во фракциях определяли общую радиоактивность белка и долю иммунопреципитированного ["SJ-ЦП. Результаты этих опытов, представленные на рис. IА, показывают, что в желчь секретнруется иммунореактивный ["SJ-ЦП. Он обнаруживается только во фракциях желчи, собранных в интервале 0-60 мин после введения ["SJ-метионина. Скорость секреции ["SI-ЦП в кровоток значительно отстает от скорости секреции [3iSj-ЦП в желчь. Данные рис.1 А также указывают на то, что [35Б]-ЦП из крови не поступает в желчь и через 3 часа после его появления в кровотоке.

Представленные данные однозначно свидетельствуют, что в гепатоцитах имеет место независимая полярная секреция ЦП в кровь и в желчь. Разница между молекулярными формами новосинтезированных ЦП, секретируемых в кровь и в желчь, отчетливо проявляется при анализе их методом ракетного иммуноэлектрофореза (рис.1 В). Видно, что площадь пика, образуемого ЦП крови, которого в 20 раз больше, чем ЦП желчи, меньше, чем площадь пика, образуемая ЦП желчи. Следовательно, ЦП желчи и ЦП крови нммунологически не идентичны.

Молекулярно-песовой анализ [355]-ЦП, иммунопреципитированного из желчи, выявил наличие полипептида с молекулярной массой 200 и 80 кДа, обнаруживаемого в составе внутриклеточного ЦП (Табл.1). Этот факт дополнительно свидетельствует о несходстве в структурной организации молекул ЦП желчи и ЦП крови.

3. Синтез и секреция двух молекулярных форм ЦП in vitro.

Для получения независимых данных о возможности существования более, чем одной секреторной формы ЦП, синтезирующейся в печени в следующей серии опытов была использована переживающая культура изолированных гепатоцитов зрелой печени крысы. В предварительных опытах было показано, что полученные гепатоциты в течение трех часов инкубации п условиях оптимальных для синтеза белка сохраняют эту функцию. Молекулярно-весовой анализ меченого ЦП, секретируемого renai они гамм через 1 час и через 2 часа после начала инкубации, покачал, что через час в инкубационной среде обнаруживается только иммунореактивный полипептид ЦП с молекулярной массой ~200 кДа. Через 2 часа инкубации ЦП представлен

9

А

В

1 2

Рис. I. Секреция двух молекулярных иовосинтешрованных форм ЦП печенью крысы.

A. Динамика секреции [35Б]-ЦП в желчь (а) и в кровоток (б).

По оси.абсцисс: время отбора фракций желчи и крови из катетеризированных _ "сосудов (последовательные тридцатиминутные интервалы между отбором фракций). По оси ординат: X - нерастворимая в горячей ТХУ радиоактивность во фракциях,

(имп/мин)-10*

ось V - то же , (нмп/мин) 10'; ось Ъ - радиоактивность в ЦП-иммунопреципитатах, %Г Светлые столбики - общая радиоактивность, связанная с белковой фракцией; тёмные столбики - радиоактивность в ЦП-мйунопреципитатах.

B. Иммуноэлектрофорез ["Б]-белков желчи (I) и крови (2). Лунка 1 - 35 мкл желчи из фракции а (рис. 1Аа).

Лунка 2 - 15 мкл сыворотки крови из фракции Ь (рис. I. Аб).

полипептидами с молекулярной массой 200, 130, 65, 48 и 18 кДа. Причем накопление 200 кДа ЦП четко выражено.

Все полипептиды ЦП являются продуктами секреции, так как их

появление в среде эффективно предотвращается колхицином, ингибитором секреции, но не синтеза белка. Данные, полученные на катетеризированной крысе и изолированных гепатоцитах, были подтверждены результатами опытов пульс-чейз типа, проведенных на тканевых срезах печени. Срезы печени инкубировали в условиях, подходящих для синтеза белка в присутствии ['5S]-MeTHOHHHa. Затем мечение останавливали добавлением 500-кратного избытка немеченого метионина. Продолжали инкубацию 30 и 120 мин. После инкубации среду осветляли центрифугированием и иммунопреципитировали нз нее [»SI-ЦП. Результаты м ол е к у л я р н о - n е с о в о го анализа иммунопреципитированного ["SJ-ЦП показали, что гепатоциты в течение 30 мин инкубации секретируют [,SS]-Hn с максимальной молекулярной массой ~200 кДа. В наборе иммунореактивных полипептидов ЦГ1 присутствует 80 кДа фрагмент. ["SJ-ЦП с молекулярной массой 130 кДа, соответствующий сывороточному ЦП отсутствует. Через 2 часа инкубации содержание 130 кДа-ЦП значительно увеличивается, содержание ["SI-ЦП с молекулярной массой 200 кДа резко уменьшается. В это время происходит накопление 80 кДа полипептида. Наблюдаемые изменения в молекулярно-весовом составе фрагментов ЦП в зависимости от времени инкубации в этих" опытах могут быть следствием двух взаимоисключающих событий: 1-гепатоциты секретируют ЦП с молекулярной массой -200 кДа, из которого затем в инкубационной среде образуются два полипептида с молекулярной массой 130 и 80 кДа и 2-гепатоциты секретируют в инкубационную среду две молекулярные формы ЦП: через 30 мин инкубации секретируется ЦП желчи с молекулярной массой -200 кДа, из которого образуется при спонтанном прогеолте 80 кДа фрлмемт. Через 2 часа инкубации в среду выделяется сывороточный ЦП с молекулярной массой 130 кДа. Существенным возражением против первого соображения является то обстоятельство, что мРНК для ЦП крови крысы, первичная структура которой известна (Fleming, Gillin.1984), по длине своей транслируемой зоны не может кодировать предшественник ЦП с молекулярной массой 200 кДа. Поэтому второй вариант выглядит более обоснованным.

Таким образом, данные, полученные на изолированных гепатоцитах, сремх тканей печени и целом организме крысы показывают, что гепатоциты сшиыир^юг и секретируют полярно, в кровоток и в желчь, две молекулярные формы ЦП: сывороточный ЦП и ЦП желчи.

Синтез в гепатоцитах двух различных молекулярных форм ЦП наводит на мысль о существовании семейства церулоплазминов, участвующих в

П

обеспечении баланса меди в организме млекопитающих и позволяет предположить, что кроме секреторных форм ЦП существуют и внутриклеточные ЦП-подобные белки, которые не выявляются при низком уровне мечения. Такие белки могут быть обнаружены с помощью пульс-чейз экспериментов, в которых прослеживается динамика распределения иммунореактивных полипептидов ЦП во внеклеточном пространстве и в клетке. На рисунке 2 показаны результаты такого эксперимента. Видно, что в инкубационной среде меченый ЦП появляется только через 30 мин после начала синтеза. Среднее время синтеза полипептидной цепи ЦП, как установлено в опытах на гепатоцитах, составляет примерно 4 мин (Алейникова и др., 1987). Около 20 мин необходимо для внутриклеточного посттрансляционного созревания молекулярной формы ЦП, секретируемой гепатоцитами в желчь. Полярная секреция сывороточной формы меченого ЦП происходит с запаздыванием и начинается не ранее, чем через 60 мин после начала его синтеза и прекращается через 90 мин (рис, 1А). Таким образом, . динамика секреции ЦП in vitro полностью отражает суммарный процесс полярной секреции двух молекулярных форм ЦП, происходящий в печени in vivo (табл.1., рис. 1А). Данные, представленные на рис.2, также показывают, что после завершения секреции в мембранной фракции клеток печени остается новосинтезированный ЦП, который не секретируется полностью и через 120 мин после начала чейза. Эти данные могут свидетельствовать в пользу предположения о синтезе внутриклеточного ЦП-подобного белка. Анализ мембранной фракции методом иммуноэлектрофореза подтвердил это предположение.

4. Экспрессия гена ЦП у крыс на уровне белковых продуктов в эмбриогенезе и на ранних этапах постнатального развития.

Связь между синтезом различных молекулярных форм ЦП в гепатоцитах взрослой крысы с распределительной и экскреторной в отношении ионов меди функциями печени может быть выявлена при изучении профиля ЦП-подобных белков, синтезирующихся в разные периоды ранного онтогенеза, когда происходит смена эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый.

Изучение экспрессии гена ЦП в онтогенезе на уровне образования ■ белковых продуктов проводили на зародышах крысы, начиная с 9-го дня эмбриогенеза, и продолжали на новорожденных крысятах до достижения ими двухмесячного возраста. Так как иммунореактивный ЦП синтезируется не только в печени,_но и в других органах как зародыша (Gitlin, 1991), так и взрослой крысы (Гайцхокн и др., Í990), а секретируется в кровоток только клетками печени, по не другими органами (Пучкова н др., 1990), причем в

12

печени взрослой крысы, как показано выше, синтезируются две полярно секретируемые в кровоток и в желчь молекулярные формы ЦП, была выбрана следующая стратегия исследования.

Во-первых, определяли, с какого срока эмбриональною развития начинается синтез импульсно-меченого ЦП раздельно в теле зародыша и п фетальной печени.

Во-вторых, устанавливали тип выявляемых молекул ЦП, то есть определяли секретируется ли он клетками или остается связанным с ними. Дчя этого после инкубации тканей в условиях, оптимальных для синтеза белка в присутствии 1155]-мстионина, центрифутнрованием разделяли инкубационную среду и'ткань. Аликвоты каждой фракции анализировали методом ракетою иммуноэлектрофореза и определяли в них долю иммунопреципитируемото нопосинтезнрованного ЦП.

В-третьих, начиная с последнего дня внутриутробного развития и до двухмесячного возраста, определяли содержание ЦП в сыворотке крысят по методу Рэвнна и методом количественного иммуноэлектрофореза.

Результаты этих исследований суммированы в таблице 2. Видно, что синтез ЦП в недифференцированных клетках зародыша 9-го дня развития и в раннем периоде органогенеза, соответствующего 12-му дню эмбриогенеза, не происходит. Не синтезируется ЦП и в клетках зачатка, печени 12-ти дневного зародыша. Синтез ЦП в онтогенезе начинается примерно с 15-го дня антенатального периода. К этому моменту завершается формирование фетальной печени, в которой, как видно из данных таблицы, синтезируется только секретируемая форма ЦП. С зтото же срока развития начинается синтез нммунореактнвното ЦП срезами ткани тела )ародыша, не содержащею печень, причем молекулы ЦП не секретнруются в инкубационную среду, а остаются связанными с фракцией тотальных клеточных мембран. Такой профиль распределения тканеспецнфического синтеза ЦП в теле плода сохраняется вплоть до рождения. Детальное исследование распределения ЦП в клетках различных органов было выполнено на плодах 21-го дня развития. Наличие иммунорсактнвных полипептидов ЦП в мембранах комплекса Гольджи в клетках почек, сердца, мозга, мышц и мукозной оболочки кишечника проверяли методом иммуноблотинга с идентификацией иммуного комплекса с помощью ['"1]-белка А. Оказалось, что иммунореактнвный ЦП содержится в клетках всех исследованных органов кроме клеток кишечника. В аналошчных экспериментах на взрослых крысах было показано, что в мембранах аппарата Гольджи почек, мозга, сердца и мышц (но не в слизистой оболочке кишечника) присутствуют иммунореактнвные полипептиды ЦП.

„ . Таблица 1, Синге» иммунореакгавных полипептнаов ЦП в печени и тканях крысы в различные - -----------периоды онтогенеза.

Период онтогенеза Возраст, дни ПЕЧЕНЬ ТЕЛО

Секреторный ЦП Внутрикле» Точный ЦП Секреторный ЦП Внутриклеточный ЦП

Антенатальное развитие 9 - - - -

12 - - - -

15 + - - +

16 + - - +

17 + - - +

20 + - ■ - . +

21 + - - +

Постнаталь-ное развитие 1 + -

4 + -

5 + -

11 + -

13 + +

17 + +

30 + +

Период онтогенеза Возраст, дни Органы крысы Секреторный ЦП Внутриклеточный ЦП

Антенатальное развитие 21 почка +

21 сердце - +

21 мозг - + 4

21 мышцы - +

21 печень + -

21 мукозная оболочка кишечника

Постнаталь-ное развитие 30 почка - +

30 сердце - +

30 мозг не исследован +

30 мышцы - +

30 печень + +

30 мукозная оболочка кишечника

"-" полипептиды ЦП не обнаружении

"+" полипептиды ЦП обнаружении --------

Наличие полипептидов ЦП в отдельных органах установлено методом иммуноблотинга.

В совокупности эти, и приведенные выше данные , показывают, что клетки различных органов млекопитающих в течение жизни синтезируют иммунореактивный белок, сходный с ЦП сыворотки по антигенным свойствам. В онтогенезе его синтез по времени сопряжен с началом синтеза сывороточного ЦП в печени плода.

Природа этих ЦН-нммунореактивных полипептидов не ясна. На основании факта, усыновленного нами ранее, чю молекулы ЦП и рецептора

14

ЦП содержат общие антнгеиные детерминанты (Пучкова и др., 1991), можно предположить, что выявляемые полипептиды являются фрагментами рецептора ЦП, синтез которого имеет место и в эмбриональных клетках негепатоцитарного ряда (Mercer et al., 1995).

Качественный спектр молекулярных форм ЦП, синтезируемых в геле новорожденных крысят, остается неизменным до 13-го дня жизни (табл, ?.). После этого в печени начинает синтезироваться ЦП-нодобный белок, который остается связанным с мембранной фракцией клеток печени и четко выявляется на радионммуноэлекгрофореграммах как самостоятельная антигенная молекулярная форма ЦП.

В сыворотке крысят с конца внутриутробного периода п до 19-го дня жизни содержание ЦП остается стабильно на шиком тройне (рнс.З.). Лишь после 19-го дня жизни, примерно соответствующего периоду окончания молочного вскармливания, уровень ЦП в крови начшые! резко расти и быстро достигает уровня, соответствующего содержанию ЦП в сыворотке взрослых крысят. Одновременное измерение содержания ЦП в сыворотке иммунологическим и энзнматнческим методами показало, что пул ЦП в кровотоке крыс в антенаюльном и постнатальном периодах состоит из однородных молекул. Однако, характер кривой, отражающей скорость секреции новосинтезированного ЦП печенью в опытах in vitro, не совпадает с кривой изменения содержания ЦП в кровотоке в тот же период жизни. Так, в антенатальном периоде развития щменение содержания ЦП в крови и повышение скорости секреции новоснюешрованного ЦП печенью, по-видимому. происходи!' синхронно, что обеспечивает создание фшиоло! ического для новорожденных уровня ЦП и кровоюке. Доля [,SS]-HI1 не меняется посде рождения почти до 10-ю дня жизни, а затем начинает плавно расти и к 30-му дню практически достигает уровня скорости синтеза ЦП у вфосдых живошых. Оги данные покатывают, что к 13-му дню печень новорожденных секрегнр>ег ЦП, который не появляется в кровотоке. Возможно, что примерно к 13-му дню жизни в печени крысы начинает симгешровагься ЦП желчи, синто и полярная секреция которых в желчь продемонстрирована нами в опытах in vivo на крысе с катетеризированными общим желчным протоком и шейной артерией.

Таким образом, индукция синтеза ЦП желчи и внутриклеточной молекулярной формы ЦП в печени крысы к 13-му дню жизни совпадают с вменением профиля распределения меди в организме животного. Полученные данные позволяют предположить, что к 13-му дню постнатального периода присходиi переключение фекпьного типа метаболизма меди на взрослый. Возможно, события связанные с чтим переключением, выражаются в индукции синтеза ЦП желчи и иесекре гмрусмою внутриклеточного ЦП.

15

Рис.2 Динамика секреции новосшипезираванного ЦП! срезами печет.

Стрелкой обозначено время начала чейза.

18 18 20" I

ЭО бОсут

Рис 3 Изменение скорости синтеза секретируемых форм ЦП в печени (1) и профиль

уровня ЦП в сыворотке (2) у крыс в онтогенезе.

По оси абсцисс: возраст'крыс, сутки;

разрыв - последний день внутриутробного развития:

По оси ординат: слева - содержание ЦП, мг/%;

справа - количество иммунопреципитированного ЦП. %.

5. Экспрессия гена ЦП на уровне полирибосомных РНК в различные периоды

онтогенеза.

Суммируя представленные в данной работе результаты, можно заключить, что в печени взрослых млекопитающих для осуществления контроля баланса меди на молекулярно-клеточном уровне синтезируются зри молекулярные формы ЦП: 1-ЦГ1 плазмы крови, в которой метаболически в процессе посттрансляционого созревания в мембранах шероховатого ретикулума происходит встраивание ионов меди, которые ЦП переносит но кровяному руслу к клеткам различных органов; 2-ЦП желчи - белок, синтезируемый и постоянно секретируемый в желчь, в который 'пакетируются' ионы меди, что предотвращает их реабсорбцню в тонком кишечнике, скорость секреции [и5]-ЦПвжелчь равна скорости выведения радиоактивной меди через желчь; 3-внутрнклеточный ЦП, который, возможно, участвует в акцепции ионов меди от ЦП и переносе их в различные компартмснты клетки, где происходит синтез или сборка медьсодержащих ферментов. Если это заключение верно, то, во-первых, во фракции полирнбосомной РНК из печени взрослой крысы должны присутствовать три самостоятельные молекулярные формы ЦП-мРНК, способные программировать трансляцию трех различных церулоплазминов. Во-вторых, профиль молекулярных форм ЦП-мРНК в эмбриональной печени должен отличаться от такового у взрослой крысы и соответствовать белковому продукту гена ЦП, образующегося в фетальнон

печени. ___

Таблица 3.

Молекулярные формы ЦП-мРНК, выявляемые в полирибосомах печени крысы.

Полирибосомная РНК печени [мР]ДНК-эонд Размер выявляемой мРНК. т.н.

Взрослые крысы Полноразмерная ЦП-кДНК 4.1 3.4 1.8

2.1 т.н. фрагмент 4.1 3.4 1.8

0.52 т.н. фрагмент 4.1 3.4

0.7 т.ч. фрагмент - 3.4 1.8

Эмбрионына 20-ыи день жизни Полноразмерная ЦП-кДНК 3.4 -

Опыты были проведены трижды и результаты полностью воспроизводились.

В связи с этими соображениями в заключительной серии экспериментов с помощью ЦП-кДПК было изучено сравнительное молекулярно-весовое распределение ЦП-мРНК в печени взрослой крысы и у эмбрионов. В опытах

17

использовали тотальную полисомную РНК без ее разделения на поли(А)* и полн(А)-фракции, так как исходили из предположения, что фракционирование РНК в жестких условиях хроматографии на олиго (<1Т)-целлюлозе молекулы мРНК с короткими поли (А)-трактами могут выделяться с фракцией рибосомапьных РНК. В качестве молекулярного зонда использовали полноразмерную ЦП-кДНК и различные ее фрагменты, как селективные зонды для выявления различий в структурах ЦП-мРНК. Данные блот-гибридизации полисомной РНК взрослой печени с различными ЦП-кДНК зондами суммированы в табл. 3. Результаты показывают, что, как полноразмерная ЦП-кДНК, так и все ее фрагменты выявляют каноническую молекулярную форму ЦП-мРНК (3,4 т.н.). Полноразмерная кДНК и фрагмент ЦП-кДНК длиной 2,1 т.н., соответствующий 5^концевой области ЦП-мРНК также выявляет три молекулярные формы ЦП-мРНК, содержащие 4,1, 3,4, 1,8 т.н. Короткий З'-концевой фрагмент, 0,52 т.н., выявляет только 2 молекулярно-весовые формы ЦП-мРНК. З'-концевой фрагмент не идентифицирует высокомолекулярную форму ЦП-мРНК.

Полученные данные позволяют предположить, что ЦП-мРНК образуется, в результате альтернативного сплайсинга общей пре-мРНК-первичного транскрипта гена ЦП, однако, для окончательного доказательства этого необходимо сравнительное изучение клонов кДНК-копий индивидуальных ЦП-мРНК.

Сравнение профилей радиоавтографов блот-гибридизации полирибосомной РНК из печени взрослой крысы и эмбриона показывает, что-в эмбриональной печени присутствует только каноническая молекулярная форма ЦП-мРНК крысы, содержащая 3,4 т.н. и программирующая синтез ЦП крови (табл. 3).

Представленные результаты убедительно свидетельствуют, что профиль синтезируемых в печени церулоплазминов в разные периоды онтогенеза, соответствует профилям ЦП-мРНК и взаимосвязан с метаболизмом меди. Возможно, что на молекулярном уровне с тремя формами ЦП, связаны три функции печени в метаболизме меди у взрослых млекопитающих: аккумулирование, распределение и экскреция ионов ^еди.

выводы.

1. В печени крысы синтезируются три самостоятельные молекулярные формы ЦП: ЦП крови, ЦП желчи и внутриклеточный ЦП.

2. Синтез сывороточного ЦП в онтогенезе совпадает с началом функционирования фетальной печени.

3. Синтез ЦП желчи и внутриклеточного ЦП начинается у новорожденных в конце лактационного периода и совпадает с началом выведения меди из организма.

4. Существует корреляция между множественными молекулярными формэми ЦП и молекулярной гетерогенностью мРПК-ЦП, присутствующими в полирмбосомах печени крысы, с одной стороны, и типом метаболизма меди, соответствующему периоду онтогенеза, с другой. Семейство молекул ЦП-мРНК. по-видимому, образуется в результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта гена ЦП, а регуляция альтернативною сплайсннга контролируется генами развития.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы: А Алейникова Т.Д., Васильев В.Б., Монахов Н.К., Шавловский М.М. Синтез и секреция церулоплазмина изолированными гепатоцитамн крысы. Биохимия, 1987, 52, 10: 1600-1607.

2. Пучкова Л.В., Алейникова Т.Д.. Вербина П.А., Захарова Е.Т., Плисс М.Г;, Гайцхоки B.C. Биосинтез двух молекулярных форм церулоплазмина в кровоток и в желчь. Биохимия, 1993. 58, 12: 1893-1901.

3. Пучкова Л.В., Алейникова Т.Д., Захарова П.Т., Конописцеиа Л.А., Цымбаленко П.В., Гайцхоки B.C. Регуляция и биосинтез молекулярных форм церулоплазмина в онтогенезе у крыс. Биохимия, 1994, 59, 9: 963-967.

4. Пучкова Л.В., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д., Гайцхоки B.C. Внутриклеточный церулоплазмин-подобный белок млекопитающих. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1994, №1, 83-85.

5. Сасина Л.К., Алейникова Т.Д., Шавловский М.М., Гайцхоки B.C., Пучкова Л.В. Регуляция вьгеокоаффинного связывания церулоплазмина человека с поверхностью плазматической мембраны клеток CV-1. Тезисы 1 Российского съезда медицинских генетиков, Москва, 14-16 декабря, часть 2, стр. 217, 1994.

6. Пучкова Л.В., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д. Предполагаемый механизм переноса ионов меди из крови в клетки через систему церулоплазмин-рецептор церулоплазмина. Там же, часть 1, стр. 47.

19

Тип. зак^тир.ЮО 8.П.1995г