Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы

Гюлиханданова, Наталия Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы"

На правах рукописи

Гюлиханданова Наталия Евгеньевна

РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА В КЛЕТКАХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН и в ГОУ Санкт-Петербургский Государственный Политехнический Университет

Научный руководитель

Доктор биологических наук Надежда Васильевна Цымбаленко

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор,

Лауреат Государственной премии

Доктор биологических наук

Александр Дорофеевич Денисенко Лариса Николаевна Гринкевич

Ведущее научное учреждение: Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт МЗ РФ

Защита состоится «¿Ц » ноября 2004 г. в 14.00 на заседании Диссертационного совета Д001.022.03 при ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменоостровский пр., д. 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д.12.

Автореферат разослан «30 » сентября 2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д001.022.03 Доктор биологических наук, профессор

Л.В. Пучкова

toOHL

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Для полного развития интеллектуальных качеств каждого индивидуума необходимы различные условия, среди которых важнейшее место занимает сбалансированное питание. Медь входит в группу микроэлементов и является обязательным компонентом пищи, так как является частью активных центров купроэнзимов, участвующих в жизненно важных процессах (Karlin, 1999; Репа et al, 1999). Одновременно, ионы меди могут индуцировать образование гидроксильных радикалов, которые повреждают все типы биомолекул (Linder, 2001). Безопасный круговорот меди в клетках обеспечивает система белков (метаболическая система меди, МСМ), некоторые гены которой клонированы (Hujfman&O 'Halloran, 2001). При этом в клетке ионы меди всегда остаются координационно-связанными (Rae et al, 1999). Свободных ионов меди нет и в межклеточных пространствах. У млекопитающих почти 95% неклеточной меди связано с церулоплазмином (ЦП), полифункциональным медьсодержащим гликопротеином позвоночных, который, в частности, переносит ионы меди к клеткам негепатоцитарных рядов (Linder, 1998). Получены бесспорные доказательства, что экологическое и врожденное нарушение баланса меди оказывает негативное плейотропное действие на весь организм и является причиной многих заболеваний ЦНС (Prohaska, 2000; Lee J., et al, 2001; Hamza L, et al, 2001; Qian, et al, 2001; Rao, et al, 2002; Miyajima, et al, 2003).

У млекопитающих оптимальный уровень ионов меди для тканей эмбрионов и новорожденных обеспечивает МСМ самок с помощью внеклеточных переносчиков , меди. На это указывает то, что ее экспериментальны^ дефицит в диете беременных самок или генетические дефекты МСМ матери неизбежно ведут к развитию у плодов и новорожденных фатальных симптомов медьзависимых микроэлементозов (Prohaska, Bailey, 1994; Шавловский и др., 1996; Lee J., et al, 2001; Hamza I., et al, 2001). Нарушение баланса меди в период молочного вскармливания приводит к развитию различных заболеваний (Mason, 1979; Muller, et al, 1998; Coronado, et al, 2001). Эти факты указывают на существование практически не изученного природного механизма, контролирующего уровень меди в диете новорожденных.

Известно, что в клетках лактирующей молочной железы ионы меди включаются в синтезируемый ими церулоплазмин (ЦП), и секретируются в молоко (Пучкова и др., 1994; Jenkins, Hidiroglou, 1989; McArdle, Danks, 1988). Показано, что in vitro ионы меди, ассоциированные с ЦП крови, лучше усваиваются тканями эмбриона, чем ионы меди неорганических солей или комплекса с гистидином (Wooten, et al, 1996). У новорожденных крыс при эмбриональном типе метаболизма меди ЦП молока из желудочно-кишечного тракта переносится в кровоток без модификаций (Мокшина., 1998). Показано, что в первый месяц лактации, когда ^^e^uitMoro молока растет

БИБЛИОТЕКА I

7ЖА; 1

прогрессивно, содержание ЦП в нем снижается (Kiyosawa, J. et al, 1995; Wooten, et al, 1996; Пучкова и др., 1997). Можно думать, что контроль над содержанием меди в пище новорожденных в первые дни жизни осуществляется путем регуляции активности гена ЦП в клетках молочной железы {Пучкова др., 1997). От признания ЦП грудного молока как важного высоко специфического источника пищевой меди, к которому адаптирован метаболизм новорожденных и с которым, возможно, связано оптимальное развитие индивидуума, зависит стратегия вскармливания новорожденных, так как вскармливание молочными смесями, содержащими свободные ионы меди (.Пучкова и др., 1997; Lonnerdal, 1998), может влиять на оптимальное развитие индивидуума.

Цель исследования состояла в изучении экспрессии гена ЦП в клетках молочной железы в разные периоды ее развития. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Измерить содержание ЦП и ассоциированных с ним ионов меди в молоке разных сроков лактации у лабораторных крыс и человека.

2. In vivo и in vitro в клетках молочной железы методом полуколичественного ОТ-ПЦР анализа определить относительное содержание ЦП-мРНК для секреторной формы ЦП и ЦП, связанного с плазматической мембранной через гликозилфосфатидилинозитоловый якорь (GPI-ЦП). Методом высокочувствительного иммуноблоттинга проверить экспрессию гена ЦП на уровне образования белковых продуктов. Параллельно изучить экспрессию генов, участвующих в метаболическом включении ионов меди в растворимый ЦП (АТФаза Вильсона, АТР7В) и GPI-ЦП, (АТФаза Менкеса, АТР7А), а также гена Ctrl, высоко аффинного импортера меди.

3. С помощью компьютерных методов сравнить промоторные участки гена ЦП крысы и человека и выявить в них последовательности (цис-элементы) для связывания с транскрипционными факторами (ТФ), которые потенциально могут участвовать в регуляции экспрессии гена ЦП.

4. Осуществить экспериментальную проверку биологической роли некоторых выявленных i/мс-элгментов в регуляции активности гена ЦП в клетках молочной железы.

5. Сопоставить уровень изменения активности гена ЦП в клетках молочной железы человека с гариабельностью промоторной области гена ЦП

Научная новизна получешых результатов.

В работе показано, что i первые дни лактации ЦП молока является основным источником меди для новорожденных. Замена ЦП свободными ионами меди в диете товорожденных крыс вызывает в печени преждевременную смену :мбриояального типа метаболизма меди на взрослый тип.

Установлено, что между переменностью и лактацией в клетках молочной железы происходит смеш профиля экспрессии генов, участвующих в

переносе меди: во время беременности экспрессируется АТР7А и ОР1-ЦП, к началу периода лактации активируется ген АТР7В и индуцируется образование секреторной изоформы ЦП,

Сравнительный анализ промоторных областей гена ЦП крысы и человека выявил высокую степень гомологии исследуемых участков и сохранение числа, набора и взаимного расположения потенциальных сайтов связывания для специфических, в том числе гормон-зависимых и ткане специфических, транскрипционных факторов (ТФ). Выявлена возможная связь между уровнем экспрессии гена ЦП в клетках молочной железы человека и нарушение сайта связывания растворимого ядерного рецептора эстрогенов и сайта связывания ТФ С-ЕВРЬе1а, расположенных соответственно в положении - 1966 п.н, и -2260 п.н. от точки начала транскрипции.

Научно-практическая значимость результатов исследования в Полученные данные, свидетельствующие о пищевой ценности ионов меди, связанных с ЦП, могут служить основой при разработке состава молочных смесей, соответствующих по меди грудному молоку.

• Изучение экспрессии ряда генов, продукты которых являются участниками метаболизма меди, на целой ткани и индивидуальных культурах клеток, открывает возможность углубленного исследования механизмов поступления и распределения меди в молочной железе на всех этапах ее развития.

• Данные об участии сайта связывания растворимого ядерного рецептора эстрогенов и сайта связывания транскрипционного фактора C-EBPbeta в регуляции активности гена ЦП, потенциально могут служить тестами для выявления риска повышенного содержания меди в грудном молоке.

Основные положения, выносимые на защиту

• ЦП молока в период первых дней жизни является основным, регулируемым на генетическом уровне, источником пищевых ионов меди для новорожденных.

• Преимущественной молекулярной формой ЦП в течение беременности является ОР1-ЦП, а в период лактации - секреторный ЦП. В течение беременности перенос ионов меди в клетках молочной железы крысы преимущественно осуществляют АТФаза Менкеса, во время лактации -АТФаза Вильсона.

• 5 -регуляторные области гена ЦП крысы и человека содержат практически одинаковые сайты связывания для ТФ. Эксперименты, базирующиеся на этих данных, выявили сайты гормон-зависимой тканеспецифической регуляции экспрессии гена ЦП.

• Тканеспецифическая регуляция экспрессии гена ЦП может осуществляться посредством регуляторных взаимодействий "внутренних" последовательностей природного гена со специфическими ТФ УУ1.

• Существует потенциальная связь между нарушением сайтов связывания рецептора эстрогена (-2260 п.н.) и транскрипционного фактора С-ЕВРЬе1а и активностью гена ЦП в клетках молочной железы.

Апробация результатов работы

Результаты были доложены в форме устных и стендовых сообщений на: Второй Санкт-Петербургской Ассамблее молодых ученых и специалистов, 8 декабря 1997 г.; Международной конференции по медицине для молодых ученых, Люблин, Польша, 24-26 апреля 1998 г.; II Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Санкт-Петербург, 1-5 февраля 2000; 11-ой Европейской конференции молодых ученых по биологии и медицине, Берлин, Германия, 22-24 ноября, 2000 г.; 10-ом Международном Конгрессе по генетике человека, Вена, Австрия, 15-19 мая 2001 г.; III Съезде биохимического общества, Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 г.; 6-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века, Пущино, 20-24 мая 2002 г.; Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, Киев, Украина, 25-27 сентября, 2003 г.

Работа поддержана грантами РФФИ № 98-04-49846, № 03-04-48748, ФЦП «Интеграция» И0064, АО 13 7, "Университеты России» 991149, грантом РФФИ MAC № 02-04-07612, персональными грантами для студентов, аспирантов и молодых ученых Администрации Санкт-Петербурга 1998, 1999, 2001 гг.

Структура диссертации ,

Работа изложена на ' ^ страницах. Диссертация содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, список литературы, включающий $ Y отечественных и fILib зарубежных источников, выводы. Результаты иллюстрированы рисунками, представлены в /7 таблицах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы: образцы крови женщин и грудного молока, а также беспородные белые крысы; культивируемые линии клеток молочной железы НС11, LA7, 106; полноразмерная кДНК-ЦП крысы, предоставленная проф. Gitlin J.D. (Washington University School of Medicine), клонированная в плазмидах pCplg4 и pCP9B; олигонуклеотиды: ggctccgcggCCATCTTggcggct - консенсусный сайт для связывания белка YY1, atcacctgAGGTCAggagttcgag - участок из консенсуса Alu-повтора AUB для связывания с ядерными рецепторами, aagattcAGGTCATGACCTgaggaga для связывания рецептора тиреоидного гормона (TR), agcttcAGGTCAcaggAGGTCAgagag - для связывания TR, agcttcAGGGTCAgAGGTCAgagagct - для связывания с рецептором 9-цис-ретиноевой кислоты (RXR), agggtagGGTTCAccgaaAGTTCActc - для связывания с рецептором транс-ретиноевой кислоты (RAR). Все олигонуклеотиды были синтезированы фирмой "BioTeZ, Berlin-Buch" (ФРГ), их последовательности взяты из каталога фирмы Santa Cruz Biotechnology. Препарат ЦП крови человека (А610/28о - 0,046), произведенный в Институте

микробиологии им. Пастера МЗМП РФ; антитела к лактоферрину человека, предоставленные проф. Кокряковым В.Н. (НИИЭМ РАМН, СПб); моноклональные антитела к факторам YY1 и SP1 - фирмы "Santa Cruz Biotechnology", предоставлены член-корр. РАН, проф., Н.В. Томилиным (Институт цитологии РАН, СПб); вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, фирмы "Amersham" (Великобритания). В работе также использованы рестрикционные эндонуклеазы EcoRl и HindlII, панкреатическая РНКаза А, ДНКаза, ДНК-лигаза фага Т4, фрагмент Кленова ДИК-полимеразы 1, набор "Multiprime DNA labeling system" фирмы "Amersham" (Великобритания); агароза типа V, легкоплавкая агароза, агар, компоненты для среды культивирования бактериальных штаммов, реактивы для электрофорезов - фирм "Sigma" (США), "ISN, Flow" (Швеция), "Serva" (ФРГ); адьювант Фройнда - фирмы "Difco" (США); все неорганические соли - фирмы "Merck" (ФРГ); детекционная система ECL western blotting detection reagent фирмы Amersham; рентгеновская пленка Hyperfilm ECL фирмы Amersham; радиоактивные изотопы [or-32P]¿M.TP - АО "Изотоп" (Санкт-Петербург); ДНК-полимераза, Год-полимеразы (5.0 ед/мкл) фирмы "Хеликон" (Россия), реактивы для проведения ПЦР и ДНК-маркеры фирмы "АмплиСенс" (Россия); белковые маркеры для электрофореза (BioRad, США).

Снятое молоко (растворимая фракция) получали центрифугированием молока при 15000 об/мин в течение 30 мин, центрифуга К24. Содержание ЦП определяли методом количественного ракетного иммуноэлектрофореза в 1% агарозном геле по стандартной методике (Kroll, 1973). В качестве количественного стандарта использовали коммерческий препарат ЦП. Оксидазную активность определяли по методу Рэвина (Ravin, 1961). Относительное содержание лактоферрина в сыворотке молока измеряли методом Манчини. Концентрацию меди измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и Зеемановской коррекцией неселективного поглощения на спектрометре модели 4100ZL фирмы "Perkin-Elmer", США. Измерение в образцах снятого молока, сыворотки крови и СМЖ проводили без предварительной подготовки. Флотирующую и нерастворимую фракции молока предварительно лизировали в смеси 2% Тритона Х-100 и 5% ДДС. Органы взвешивали, высушивали до постоянного веса в вакууме над пятиокисью фосфора, сжигали в смеси хлорной и серной кислот с деионизованной водой в соотношениях 100:25:125 соответственно, остаток растворяли в деионизованной воде.

Для получения антител к ЦП использовали высокоочищенный препарат ЦП из крови крысы и человека. Для получения антител к АТР7А был использован синтетический пептид PI6 : 968ETYFPGYNRSISRTET983, для получения антител к АТР7В - пептид Р13:951QKYFPNPNKHISQ963. Пептиды синтезированы твердофазным методом с использованием 5ос-стратегии в

Лаборатории синтеза физиологически активных полимеров ИБС РАН (Санкт-Петербург). Пептиды конъюгировали с гемоцианином из гемолимфы камчатского краба и полученным конъюгатом иммунизировали кроликов по общепринятой схеме. Конъюгаты Р16 и Р13 с сукцинилированным бычьим сывороточным альбумином использовали как специфические антигены для тестирования антител к PI6 и Р13 соответственно.

Фракцию, обогащенную плазматическими мембранами, получали методом равновесной седиментации (Fleischer&Fleischer, 1975). Ядерные белки получали методом экстракции из высокоочищенной фракции ядер (Extact Preparation, 1986). Геномную ДНК выделяли из печени крысы, а также из лейкоцитов крови человека методами, описанными (Sambrook et al, 1991). Выделение тотальной РНК осуществляли с использованием RNAqueous™ Kit (Small scale phenol-free total RNA isolation kit), Ambion Inc., США или реагента TR1ZOL (TriPure Isolation Reagent, фирмы Boehringer Mannhaim, Германия) в полном соответствии с инструкциями производителей.

Гель-электрофорез ДНК и РНК, а также их перенос ДНК на мембрану осуществляли согласно стандартной методике. Для элюции фрагментов ДНК из агарозного геля разделяли фрагменты ДНК с помощью гель-электрофореза в 0.7% легкоплавкой агарозе и проводили элюирование фрагментов ДНК из зоны геля. Электрофоретический анализ ДНК проводили в 8% ПААГ на ТВЕ-буфере. Окрашивание образцов ДНК после проведения электрофореза в ПААГ осуществляли раствором нитрата серебра (Sambrook et al, 1991).

Для ПЦР в качестве матрицы использовали геномную ДНК печени крысы или геномную ДНК крови человека. ПЦР проводили в стандартных условиях (Sambrook et al, 1991) в 30 мкл смеси. Параметры проведения реакции для каждого отдельно взятого случая подбирали индивидуально с помощью компьютерной программы. Полученные продукты ПЦР анализировали с помощью гель-электрофореза в агарозном геле или в ПААГ. Обратную транскрипцию, сопряженную с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) проводили по методике (Sambrook et al, 1991). Параметры реакции в каждом отдельном случае подбирали с помощью компьютерной программы. Электрофоретический анализ ПЦР продуктов проводили в 1% агарозном геле.

Относительное содержанке (steady state уровень) изучаемых мРНК определяли по методу (Marone etal., 2001).

Электрофоретическое разделение белков и их молекулярно-весовой анализ проводили в 7.5% ПААГ с 0.1% SDS по методу Laemmli (Laemmli, 1970), Перенос белков из геля на нитроцеллюлозные мембраны осуществляли полусухим методом, Для визуализации комплексов антиген-антитело хемилюминесцентньм методом использовали набор «Amersham» (Великобритания). [32Р]ДНК-зонды получали с помощью реакции

статистического праймирования с использованием набора «Multiprime DNA labeling system» на матрице ЦП-кДНК (Sambrook et al, 1991). Southern-блот-гибридизацию проводили по стандартной методике (Sambrook et al., 1991). Идентификацию специфических комплексов ДНК с ЯФ проводили методом выявления изменения электрофоретической подвижности в геле (гель-шифт). Концентрацию белков определяли по методу Лоури. Содержание модифицированных аминокислот в белках сыворотки крови и цитозоле определяли с 2,4-динитрофенилгидразином (Tian et al, 1995).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Содержание ЦП и меди в молоке человека и крыс в течение лактации. На рисунке 1А показано, что содержание иммунореактивного ЦП в снятом грудном молоке к пятому дню после родов в среднем снижается примерно в три раза. При этом у одной пациентки содержание ЦП в молоке было существенно выше среднего значения, а у другой - оно практически не менялось. Изменения уровня ЦП в молоке протекают на фоне высокого содержания ЦП в крови, характерного для первых четырех месяцев постродового периода (101±7.89 мг/100 мл versus 38.7+3.54, мг/100 мл в норме). Концентрация меди, определенная в этих же пробах методом атомно-абсорбционной спектрометрии (Рис. 1.Б столбики 1 и 2), падает почти пропорционально снижению содержания ЦП.

После удаления ЦП в снятом молоке первого и пятого дней лактации (Рис, 1.Г, лунки 2 и 5) остается почти одинаковая концентрация ионов меди (Рис. З.Б, столбики 3 и 4). При этом концентрация меди, связанной с ЦП, падает резче, чем снижается концентрация ЦП (в пять и три раза, соответственно). После преципитации лактоферрина в растворимой части образцов как количество ЦП, так и концентрация меди не изменяются. Содержание лактоферрина, определенное методом Манчини, за первые пять дней лактации снижается на 15%. При этом концентрация железа в этих же образцах падает примерно на 40% (Рис. 1.Б). Представленные данные показывают, что ЦП молока, по крайней мере, в этот период жизни для новорожденных, является основным источником ионов меди. Это позволило предположить, что метаболизм меди новорожденных адаптирован к нему как пищевому источнику ионов меди.

Предположение было проверено на лабораторных животных, вскармливаемых коммерческой молочной смесью, содержащей свободные ионы меди. Для этого использовали лабораторных крыс, у которых точно установлено, что: 1) смена типов метаболизма меди происходит на 13 день жизни (Hurley et al, 1980), 2) в клетках молочной железы синтезируется ЦП, входящий в состав белков снятого молока (¡Тучкова и др., 1994) и 3) концентрация меди снижается в течение лактации (Keen et al, 1981). В предварительных опытах было изучено распределение меди во фракциях молока на разных сроках лактации.

25 50 75 100 125 250

мкг антител к ЦП

Рис. 1. Изменение концентрации иммунореактивного ЦП и связанной с ним меди в снятом молоке первые дни лактации.

A. Концентрация ЦП мг/100 мл в первый (1) и пятый (2) дни после родов, Р<0,005 по коэффициенту Стьюдента.

Б.Определение доли ионов меди, ассоциированных с ЦП: 1 - концентрация ионов меди в образцах' молока, мкг/л; 2 - то же, после полной преципитации ЦП; 3 - то же, после преципитации лактоферрина; 4 - концентрация ионов железа там же, мкг/л., нечетные Серые столбики- первый день после родов, черные - пятый.

B. Определение количества антител к ЦП, необходимое для его полной преципитации из образцов молока. 50 мкл снятого молока первого дня лактации десяти случайно выбранных женщин, смешивали, и к аликвотам полученной смеси (50 мкл) добавляли равный объем буфера А, содержащего разные количества антител к ЦП человека (25, 50, 75, 100, 125 и 250 мкг). После инкубации в течение ночи при +4°С смесь центрифугировали 15 мин при 10000 об/мин на микроцентрифуге фирмы «ЕЬМ1». В 20 мкл суперпатанта определяли содержание ЦП методом ракетного иммуноэлектрофореза.

Г. Содержание ЦП в образцах молока после инкубации с антителами к ЦП (250 мкг) или к лактоферрину (300 мкг): 1 и 4 - снятое молоко 1 и 5 дней после родов, соответственно; 2 и 5 - то же, после полной преципитации ЦП; 3 и 6 - то же, после преципитации лактоферрина.

Концентрация ЦП и меди в молоке крыс были измерены на 7-ой, 14-ый и 21-ый дни лактации. В опытах использована смесь равных объемов молока, взятого от одних и тех же трех самок. Данные, представленные в таблице 1, показывают, что концентрация меди в цельном молоке снижается примерно в 2 раза. В снятом молоке содержится около 25% меди, почти 50% меди обнаруживаются в осадке. Однако в сыворотке молока содержание ЦП (Рис. 2) и связанной с ним меди падает почти в 7 раз (Табл. 1). Доля ионов меди, связанная в молоке крысы с ЦП (18, 15.6 и 4.4% соответственно на 7-ой, 14-ый и 22-ой дни лактации), и плотность атомов меди в молекуле ЦП постепенно снижаются в течение лактации. Данные рисунка 2 также показывают, что некоторая часть ЦП содержится и в нерастворимой фракции молока (лунки 4 и 5, см. ниже).

Рис. 2. Иммуноэлектрофорез фракций молока крысы с антителами к ЦП.

1 - сыворотка крови крысы, разведенная в 4 раза, 10 мкд;

2 - снятое молоко 21 дня, 10 мкл; 3 - снятое молока 7 дня:, 10 мкл; 4, 5 - нерастворимая фракция молока (21 и 7 дней, соответственно), растворенная в 6% 808 до исходного объема, 10 мкл.

Таблица 1. Содержание ЦП и ионов меди в молоке крыс на

разных сроках лактации*

День после родов Концентрация меди, мкг/мл Концентрация ЦП в снятом молоке, мг/100 мл Атомов меди на 1 молекулу ЦП

в цельном молоке в снятом молоке после преципитации ЦП связанной с ЦП

7-й 2,10 0.150 0.380 11.3 7.1

14-й 1,53 0.150 0.240 6,4 7.5

22-й 1,12 0.150 0.050 1.8 5.8

* Приведены средние значения определений у трех крыс.

Приведенные данные показывают, что в молоке крыс, как и в молоке человека, снижение концентрации меди в течение лактации происходит благодаря снижению концентрации ЦП. С этим хорошо согласуется то, что у крыс, как и у человека, вся радиоактивная медь в растворимой фракции молока включается только в ЦП (McArdle, Danks, 1991; Donley et ah, 2002).

Изменение метаболизма меди у новорожденных крыс, вскармливаемых молочными смесями. Новорожденных крыс разных матерей объединяли и затем случайно разделяли на две группы. Одну группу возвращали самкам по 8 особей каждой (контрольная группа), а другую -выкармливали молочной смесью (опытная группа). Коммерческую молочную смесь, рекомендованную для новорожденных с первого дня жизни (1Чи1гПоп, Голландия), приготавливали так, чтобы концентрация белка в готовой смеси соответствовала концентрации общего белка в молоке крыс (20 мг/мл). В готовой смеси концентрация меди (Си(МОз)2) по данным прямого измерения соответствовала 970 мкг/л. Крыс опытной группы содержали при температуре, поддерживаемой примерно около 38°С в проветриваемых условиях. Кормление производили круглосуточно, в первые сутки жизни через каждый час, затем реже. Перед каждым кормлением тело обтирали стерильным оливковым маслом, способствовали освобождению кишечника и мочевого пузыря. В течение опыта производили регулярное взвешивание и вели наблюдение за развитием крыс обеих групп. В первый и последний дни опыта крыс взвешивали до и после каждого кормления и определяли средний объем потребленной смеси одним животным в сутки. Выживаемость крыс опытной группы составила 90%, в контрольной группе - 97%. Начиная с 4-го дня жизни, крысы опытной группы отставали в весе от крыс контрольной группы. К 8-му дню жизни разница в весе достигала 20%. Отлипание ушной раковины, подъем-поворот головы, вставание на конечности, передвижение, вращение хвостом, появление шерстного покрова у животных обеих групп происходило одновременно. В среднем в первые сутки жизни крысы опытной группы съедали по 0.4 мл смеси (0.24 мкг меди), к седьмым суткам -примерно по 4.0 мл смеси (2.4 мкг меди).

Данные суммированы в таблице 2. Концентрация меди в сыворотке 8-дневных крыс обеих групп пропорциональна уровню ЦП. Содержание меди в печени контрольных крыс с 5-го к 8-му дню жизни повышается. У крыс опытной группы содержание меди в печени к 5-ому дню жизни выше, но к 8-му дню жизни достоверно ниже, чем у крыс контрольной группы. Относительное содержание ЦП-мРНК в печени крыс опытной группы повышается почти в 2 раза. Содержание меди в мозгу этих же крыс не меняется, однако, к 8-ому дню эксперимента в СМЖ почти в 7 раз повышается концентрация меди и ЦП.

В целом, представленные дачные показывают, что ЦП молока является источником ионов меди, к которому адаптирован организм новорожденного. Это хорошо объясняет высокую, по сравнению с неорганическими солями меди, усвояемость ионов мещ, связанных с ЦП, эмбрионами и новорожденными млекопитающими (Жоо/ел ег а.1 1996). А также согласуется с данными о переносе нативногоЦП молока из желудочно-кишечного тракта новорожденных в кровоток (Пучюва и др., 1998).

Таблица 2. Влияние вскармливания молочными смесями _на метаболизм меди новорожденных крыс

ПОКАЗАТЕЛЬ Возраст, дни ТИП ПИТАНИЯ

Естественное вскармливание Искусственное вскармливание

Церулоплазмин (оксидазная активность, мг/100 мл) 5 8 12,22+4,3 (5)* 14,1+2,13 (б) 37,56+17,3 (6) 38,47+4,46 (6)§

Иммунореактивный церулоплазмин (мг/100 мл) 5 8 13,72+2,7 (7) 14,3+1,2 (6) 41,8+6,5 (6) 43,2+2,1 (7)§

Концентрация ионов меди в сыворотке крови (мкг/л**) 8 300 940

Атомов меди на 1 молекулу ЦП*** 8 4,5 4,5

Мкг меди в печени 5 8 3,34+0,69 (5) 4,58+0,04 (5) 5,46+3,35 (5) 1,91+1,20 (5)§

Мкг меди в мозге 5 8 1,94+0,57 (5) 1,71+0,40 (5) 1,69+0,53 (5) 1,72+0,61 (5)

Церулоплазмин в СМЖ, мг/100 мл**** 8 0,3 2,3

Концентрация меди в СМЖ (мкг/л) 8 15 85

Тотальная РНК (мг/г печени) ЦП-мРНК (мкг/мг тотальной РНК) 8 8 1,7 0,11 1,8 ОДЗ

Содержание карбонильных групп: Цитоплазма4" мозга, А37о/мг белка Цитоплазма печени, А370/МГ белка Сыворотка крови, А370/МЛ 7 7 7 0.131+0,02 (5) 0.093+0,01 0.155+0,01 0.101+0,013(5) 0.086+0,07 0.127+0,014

Масса тела, г# 5 8 9,2 11,8 8.7 9.4

* - количество животных в группе; ** - измерение проведено в смеси сывороток крови (5 мкл) каждого животного данной группы; *** - рассчитано на иммунореактивный ЦП; **** . измерение проведено в объединенных алшвотах (2-3 мкл) СМЖ от крыс данной группы, среднее из двух измерений; * - супернатант гомогената ткани после центрифугирования при 23000xg в течение 30 мин; #- средняя масса тела при рождении 6.4 г; § - Р<0,005 по коэффициенту Стъюдента. Часть представленных результатов приводится также в диссертациях Мокшиной C.B. и Жигулевой Э.А.

Замена ЦП свободными ионами меди вызывает сдвиги в метаболизме меди печени и мозга. Возможно, что именно поэтому у детей, с раннего возраста вскармливаемых молочными смесями, наблюдают нарушение оптимального развития интеллекта (Rao et al, 2002).

Экспрессия генов, участвующих в транспорте меди, в клетках молочной железы на разных стадиях ее развития. Экспрессия генов ЦП, CTR1, АТФазы Менкеса, участвующей в переносе ионов меди к ЦП, синтезирующемуся в клетках негепатоцитарных рядов, и АТФазы Вильсона, которая осуществляет включение ионов меди в гепатоцитах, была изучена методами полуколичественного ОТ-ПЦР, позволяющего измерить «steady

Таблица 3. Характеристики праймеров для генов МСМ

и промоторных областей генов ЦП крысы и человека

Название Нуклеотидные последовательности праймеров (в каждой строке: верхний -прямой, нижний - обратный) Положение продуктов (п.н.) Длина продукте вПЦР ( П.Н.) Темп, отжи га (°С)

АТР7А крысы 5'CTACTTTCCCGGCTACAACAGA 3' 5'AGTCTCCCACCAGAAGTGAGTG 3' 2909 ->4476 1568 56

АТР7В крысы 5' ACTTTCCTAGCCCTAGCAAGCA 3' 5' AGATGCACTGCTCTTCATCCCT 3' 2854 4371 1524 58

ЦП крысы 5' AGTAAACAAAGTCACAACGAGGAA 3' 5' TCGTATTCCACTTATCACCAATTTA 3' 2830 —> 3202 398 57

G PI-ЦП крысы 5' AGTAAACAAAGTCACAACGAGGAA! 3' 5' CTCCTTGGTAGATATTTGGAATAAA 3' 2830 —*3252 436 57

Ctrl крысы 5' TGCCTATGACCTTCTACTTTGG 3' 5' ATGAAGATGAGCATGAGGAAG 3' 287 645 358 57

(З-актин крысы 5' GAAGATCCTGACCGAGCGTG 3' 5' AGCACTGTGTTGGCATAGAG 3' 570 ->896 326 57

Промотор ЦП крысы 5' ACTTGCTTGTTATACATAAGGATGC 3' 5' AACTATGCAAAAATAAAAGTGCACT 3' -1742 +48 1817 58

Праймеры на промоторную область гена ЦП человека

1 5' AGAACTTAACTGAATTGGAAAATAT 3' 5' TACATAAAAACAGAAAAATACCAAG 3' -162 —* +16 178 472

2 5' GAATTTACACAATGAATGGAAAAAG 3' 5' TTAAAGCAAATATTTTCCAATTCAG 3' -291 -> -153 138 49.5

3 5' CATTTCTCAGAACGTATCCCTGTCA 3' 5'GTGCCTTTTTCCATTCATTGTGTAA 3' -470 -v -287 183 52.5

4 5' TATAGACTGTACAGGTTTGTAGCCT 3' 5'AGCTTTTTACTACAGTCGTTCTTAA 3' -608 ->-445 163 49.6

5 5' TAAATGACAAACTGCATATGTGATG 3' 5' AGGCTATATGGTATACCTATTGCTC 3' -745 -581 164 48.4

6 5' AAATTCTTATTTTTGTTTACTTAAA 3' 5' AAATATGTTATTATAATCTTATGGG 3' -827 -> -715 152 45.2

7 5' TGAAGACAGGTTTAGTTATGGTTTG 3' 5' CTAGCATGCCAAATTTAAGTAAACA 3' -1031 —-854 177 48.7

8 5' AGCCATTTCATACTTTTAGACATAT 3' 5' AATAAACAAACCATAACTAAACCTG 3' -1187 -»■ -1025 162 47.6

9 5' TTTCTTCTATACCAATCTATTTCAA 3* 5' TGTTTTTAGTCAGGAAGTATATGTC 3' -1320 —> -1169 151 46.8

10 5' TGATGGTAGGTGTTTTGTTCTCTGC 3' 5' AGGCCACTTGTTGAAATAGATTGGT 3' -1465->-1310 155 52.4

11 5' ACTGAAGCTGGGCTGAAGTATCTTA 3' 5' ATACCGCAGAGAACAAAACACCTAC 3' -1641 -> -1460 181 51.5

12 5' TTAGTCCTTCGTCAGTCCTCTCAGT 3' 5' AGTAAGATACTTCAGCCCAGCTTCA 3' -1851 -1639 212 54.0

13 5' TGAGTGAAAAATGAAAAGCAAATGG 3' 5' CACTGAGAGGACTGACGAAGGACTA 3' -2055 -1850 201 56.0

14 5' TACACCATAAAACGTTCACAAGGGC 31 5' GCCATTTGCTTTTCATTTTTCACTC 3' -2294 -> -2054 249 54.6

15 5' CTAAGGCTCAGAGAATTCTCCCCAC 3' 5' GGGTTCCAGAATGTATGCATAGCAC 3' -2400 —► -2215 185 54.3

16 5' CCTCTGCTCCTTCTTGTCTAACCCC 3' 5' GAAGTGGGGAGAATTCTCTGAGCCT 3' -2966 -> -2397 569 57.2

17 5' TGTCCGATTGGTCATAGTCAGAGTG 3' 5' AGACTGGGGTTAGACAAGAAGGAGC 3' -3526 -2961 565 55.1

state» уровень исследуемых мРНК, и гиперчувствительного иммуноблоттинга.

Работа проводилась на ткани молочной железы крыс в разные сроки беременности и лактации, а также на культивируемых клетках молочной железы крысы различного происхождения. Последовательности использованных праймеров и условия синтеза приведены в таблице 3. По данным спектрофотометрического и электрофоретического анализа препараты РНК, использованные для синтеза кДНК, характеризовалась высокой чистотой (А2бо/28о составляло 1.8-1.9) и отсутствием продуктов деградации. На каждом препарате РНК трижды проводили ОТ-ПЦР анализ. Уровень ПЦР-продукта (3-актина служил одновременно и показателем прохождения ОТ-ПЦР и использовался в качестве величины для определения уровня мРНК. Продукты, образующиеся в ОТ-ПЦР подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле, гели окрашивали бромистым этидием, фотографировали, сканировали, денситометрировали и обрабатывали с помощью программы «Scion Image». Результаты денситометрии относили к таким же данным для (3-актина, полученным на этих же препаратах РНК в этих же опытах. Каждое определение проводили 3 раза в независимых экспериментах.

Steady state уровень мРНК, программирующих синтез белков, участвующих в транспорте меди, в молочной железе в разные периоды ее развития. Относительный уровень Ctrl-мРНК в течение беременности остается практически постоянным (Рис. 3). Однако в течение лактации относительное содержание Ctrl-мРНК падает почти в 2 раза. Во время беременности мРНК, программирующая синтез GPI-ЦП, является преимущественной изоформой продуктов гена ЦП. Образование мРНК для секреторного ЦП начинается только к концу беременности, повышается и падает в течение лактации. Благодаря этому соотношение ЦП-мРНК/мРНК GPI-ЦП в первые дни лактации повышается больше чем в 15 раз. Рассмотренные данные показывают, снижение содержания ЦП в молоке в течение лактации, показанное выше (Рис. 1), обусловлено снижением уровня ЦП-мРНК. При этом АТР7А в основном экспрессируется в течение беременности, а АТР7В в течение лактации.

Содержание иммунореактивных белков ЦП, АТФаз Вильсона и Менкеса во фракциях плазматических мембран молочной железы крысы во время беременности и лактации. Данные иммуноблоттинга, приведенные на рисунке 4, показывают, что иммунореактивные полипептиды ЦП, связанного с плазматической мембраной, присутствуют в клетках ткани молочной железы, как в течение беременности, так и во время лактации. АТР7А обнаруживается во фракции плазматических мембран преимущественно во время беременности,' напротив, экспрессия АТР7В связана с периодом лактации. Обобщая полученные данные, можно сказать, что в клетках молочной железы на разных стадиях развития происходит изменение

Беременность Лжгашя

10 14 21 1 10 20 дни

Cp-GPI

MiliiiimiiWgMMtiMWWMMiriii» iiimiiMHHi»>«iii iiaiimllm i

7al-7a2

7Ы-7Ь2 {3-actin

Рис. 3. Steady state уровень мРНК исследуемых генов в клетках молочной железы беременных и лактирующих крыс.

А. Протокол электрофоретического анализа продуктов ОТ-ПЦР; Б. Гистограмма распределения мРНК в клетках молочной железы на разных стадиях развития. По оси абсцисс: 10-20 дни - беременность, 1-20 дни лактация. По оси ординат: относительное содержание мРНК, условные единицы.

10 день 14 день 20 день 1 день беременность

Беременность Лактация

10 день 20 день

лактация

ЦП

АТР7В

Рис. 4. Иммуноблоттинг белков плазматических мембран молочной железы крысы с антителами к указанным бглкам.

АТР7А

НС11

ЦП ОР1-ЦП АТФаза Менхеса АТФшза Вмльсона

ЬА7Б ЬА7 10Ш 106

ЬА70

1_А7

Рис. 5. Экспрессия генов метаболической системы меди в культивируемых клетках молочной железы.

А. Протокол электрофоретического анализа продуктов ОТ-ПЦР;

Б. Гистограмма распределения мРНК в клеточных линиях. По оси абсцисс: клеточные линии. По оси ординат: относительное содержание мРНК, условные единицы. В - индукция 1,5% ВМЗО. В каждом случае индуктивный эффект DM.SC) контролировали по экспрессии гена бета-казеина.

активности и смена генов МСМ. В частности, секреторный ЦП и АТР7В экспрессируются только с началом лактации, тогда как ОР1-ЦП и АТР7А преимущественно экспрессируются в течение беременности.

Сопоставление уровня концентрации меди, содержания секреторного ЦП, его мРНК и СТШ-мРНК на разных сроках лактации показывает, что уровень мРНК импортера меди в клетки (СТЮ), ЦП, основного медьсодержащего белка молока, и концентрация меди изменяются согласованно. При этом пул меди, не ассоциированный с ЦП, не меняется в зависимости от уровня обеих мРНК.

Исследование экспрессии генов метаболизма меди на культивируемых клетках молочной железы. Исследования на целой ткани не могут дать ответ, в каких именно типах клеток происходит экспрессия исследуемых генов. Частично ответ на этот вопрос был получен в экспериментах на культивируемых клетках молочной железы различного происхождения, проведенных в рамках совместной работы с Институтом «Телетон», г. Милан. Клетки линии НС 11 получены из люминального эпителия молочной железы мыши на среднем сроке беременности. Эти клетки синтезируют белки молока после введения в среду культивирования гормонов. Клетки линии ЬА7 первично получены из карциномы эпителия, клетки линии 106 получены из аденокарциномы миоэпителия молочной железы крысы. В присутствии в среде роста ОМЗО и гормонов они синтезируют белки молока ч формируют альвеолоподобные структуры.

Электрофоретический анализ продуктов ОТ-ПЦР, проводившийся на >НК, выделенной из пролиферирующих НС 11 клеток, показал высокий уровень экспрессии ЦП и его мембранной формы. При этом уровень ОР1-ЦП мРНК в этих клетках достоверно выше уровня секреторной формы ЦП-мРНК. В то же время экспрессия генов АТФазы Менкеса и Вильсона в этих клетках нами не выявлена (Рис. 5). В клетках линий, полученных из аденокарцином, как индуцированных, так и неиндуцированных, активность гена ЦП выявить не удалось (Рис. 5). В этих же клетках нам не удалось выявить экспрессию и гена АТФазы Вильсона. В то же время, в неиндуцированных и индуцированных клетках линий ЬА7 и 106 обнаружен высокий уровень экспрессии гена АТФазы Менкеса. При этом индукция, вызванная БМБО, повышает уровень мРНК АТФазы Менкеса в клетках линии ЬАС7 и достоверно снижает в клетках линии 106,

В целом, полученные данные однозначно указывают на существование разных механизмов, регулирующих активность гена ЦП в клетках дифференцирующейся и лактирующей молочной железы на уровне транскрипции и процессинга (альтернативный сплайсинг).

Выявление потенциальных регуляторных последовательностей в гене ЦП крысы и человека. Поиск и оценка потенциальных регуляторных участков в гене ЦП, специфических /для клеток молочной железы, был

Таблица 4.

Локализация некоторых гумс-элементов, обнаруженных с помощью компьютерного анализа _ в последовательности, фланкирующей 5'-облаеть гена ЦП

Коровая последовательность г/ис-элемента Название ТФ, специфически связывающегося с г/ыс-элементом Положение первого нуклеотида, коровой последовательности цис-элемента

Сокращенное название Полное название Крыса Человек

Цис-элементы, обнаруженные к гомологичных областях промоторов гена ЦП человека и крысы (жирным шрифтом выделены коордянаты ц ис-эл е м е нт о в в областях гомологии)

tcgtaagGGTCag RORA1 ROR-related orphan receptor alpha 1 -19, -1303 -49, -336, -1685, -2273

gccttGTTTAtaaaat Freac-2 Fork head RElated ACtivator-2 -38, - 138,-876,-1102 -68, -889,-3886,-3075

CCAAAGT WAP Whey acidic protein -51, -512 -81

tcaATCAAgc CDP CCAAT displacement protein; cut homeodomain protein -55, -521,-1596 -85

taaaitgTGTCAa RORA2 ROR-related orphan receptor alpha 2 -64, -1112 -94

tatttgctGAAAGagact СЕВР C\EBP binding site, CCAAT/enhancer-binding protein - 79, - 525 -109, -439,-746

taaTGAAAttatt CHOP-C/EBPa]pha heterodimers of CHOP and C/EBPalpha -93 -123

ctTGACtacat API Activator protein 1 -239,-1188,-1328,-2987 - 256, - 1674, - 3001

cagagtttGTGTGctg AhR/Arnt Arnt; hypoxia-inducible factor -246, -3174 -263, -501,-2469,-3545

//ые-элементы негомологичных областей промоторов гена ЦП крысы и человека

nnCAGTTAnnmi PR Progesterone receptor - 372, - 1508 -950

ctatGTTTaaat HFH1 HNF-3 Homolog -396,-1114 -756,-1361,-3107,-3982

gaATGTa OCT1 Octamer binding factor 1 -436,-567,- 1025,-3890 -234,-789,-2300,-3458

tgtgTGTTtgtgt HNF-3B Hepatocite nuclear factor 3beta -517,-1173,-1641 -422,-1009,-1139,-1198

tgaggcTGACcctt ER Estrogen receptor - 623, - 1578, - 3456 -212,-358, -2260,-3775

gGTTAataaatgaag HNF2 Hepatic nuclear factor 2 -774,-2356 - 897, -1890

gacTGGCatcagagcagg NF1 Nuclear factor 1 -1103 - 1253, - 3450

ATGCAATTGTATAAA TSHB Thyrotropin beta subunit -1366

atcctGCCATttttttctag YY1 YY1 - 1501 - 1984

CCCCGTgg USF Upstream stimulating factor -1537,-2589 -867,-2340,-3789

осуществлен с помощью компьютерных и молекулярно-

биологических методов.

Сравнительный компьютерный анализ промоторных областей генов ЦП крысы и человека. Для компьютерного анализа потенциальных механизмов регуляции экспрессии гена ЦП использовали последовательность, содержащую 4000 н. промоторной области и экзон 1 (161 п.н.) гена ЦП крысы (сокр. Rat_Promoter.seq) и последовательность промоторного участка гена ЦП человека длиной 4000 п.н. и 1 экзон (192 п.н.) (сокр. HumanJPromoter.seq). Последовательности были эстрагированы из баз данных «Геном человека» и «Геном крысы», www.ncbi.nlm.nih.gov. Для сравнения 5'-регионов генов ЦП крысы и человека использовали программу BLAST 2sequences. Оказалось, что исследуемые промоторные области генов ЦП крысы и человека содержат 4 гомологичных участка приблизительно равной длины. Участки, содержащие экзон 1 и первые ~ 150 п.н. выше точки начала транскрипции идентичны на 77 %. Следующая консервативная последовательность гомологична на 83 % и имеет длину и у крысы и у человека 61 п.н. Третий консервативный участок длиной 43 п.н. идентичен на 89%, и последний, длиной 46 п.н. - на 77%.

Для поиска потенциальных сайтов связывания ТФ в описанных промоторных последовательностях гена ЦП крысы и человека были использованы программы, основывающиеся на сведениях базы данных TRANSFAC 6.0. (www.gene-regulation.conO. Поиск вели с помощью программ Matlnspector V2.2, Match Search У. 1.0., Alybaba 2.1 и программы Sitehunter, разработанной B.C. Бабичем (Институт Цитологии РАН). Данные компьютерного сканирования нуклеотидной последовательности 5'-региона гена ЦП обобщены в таблице 4. Особый интерес представляют последовательности, которые потенциально могут участвовать в регуляции экспрессии гена ЦП. Гомологичные участки этих областей генов ЦП крысы и человека содержат практически одинаковые сайты связывания для ТФ (Табл.

4).

Экспериментальный анализ 5'-региона гена ЦП крысы. Для

экспериментального изучения потенциальных механизмов, контролирующих активность гена ЦП крысы, участок промоторного региона был получен методом ПЦР (Табл. 3). Полученный ПЦР-продукт был использован для изучения способности специфических ТФ связываться с промоторным участком гена ЦП. В качестве меченого олигонуклеотида использовали двунитевой олигонуклеотид, содержащий участок консенсуса из Alu-повтора, участвующий в связывании с ядерными рецепторами (Mangelsdorf, 1995). Для изучения специфичности связывания в качестве конкурентов использовали немеченые двунитевые олигонуклеотиды, содержащие сайты для связывания ядерных рецепторов тиреоидного гормона (TRa и TRß), 9-цис-ретиноевой кислоты (RXR) и транс-ретиноевой кислоты (RAR). Показано (Рис. 6), что ЯФ печени взрослой крысы с меченым AUB образуют

12 3 4 5 6 ?

Рис. 6. Связывание ядерных факторов печени взрослой крысы с промоторным участком гена ЦП.

Связывание ядерных факторов печени взрослой крысы с [32P]AUB (дорожка 1) и вытеснение его из комплексов 4-х кратными избытками немеченых олигонуклеотидов, содержащих сайты для связывания TRa (дорожка 2), TRß (дорожка 3), RAR (дорожка 4), RXR (дорожка 5), немеченого AUB (дорожка 6) и 20-кратным избытком немеченого ПЦР-продукта (дорожка 7).

Рис. 7. Относительное содержание факторов УУ1 и 8Р1 в составе ядерных факторов из различных органов крысы.

На дорожки наносили по 30 мкг ЯФ из молочной железы крысы (1), печени новорожденных крыс (2) и печени взрослой крысы (3). Для идентификации ТФ использовали моноклональные антитела к ТФ УУ1 и БР1.

специфичный комплекс. Олигонуклеотиды, связывающие RXR, RAR и TRp эффективно конкурируют с ЯФ печени крысы за связывание с AUB. Видна способность амплификата 5'-участка гена ЦП конкурировать с AUB (Рис. 6, дорожка 7). Это указывает на то, что в составе ЯФ печени крысы присутствуют ТФ, специфически связывающиеся с промоторной областью гена ЦП. К этим факторам относятся ядерные рецепторы гиреоидного гормона и ретиноевой кислоты. Сходные данные (результаты не приводятся) были получены и при использовании ядерных белков, выделенных из печени новорожденных крыс и клеток молочной железы через 10 дней после родов.

Таким образом, независимо от уровня активности гена ЦП (высокая в клетках печени беременной крысы, низкая в клетках печени новорожденных, снижающаяся в клетках лактирующей молочной железы) в составе ядерных белков перечисленных клеток присутствуют ТФ, связывающиеся с цис-элементами в промоторной области.

Поиск потенциальных сайтов регуляции активности гена ЦП крысы во внутригенной области хромосомного гена. Компьютерный анализ экзонов гена ЦП показал, что в них известные цис-элементы отсутствуют. В интронах 1 (на расстоянии 1670 п.н. от начала интрона), 6 и 9 были найдены сайты связывания этого фактораYY1. При этом в интронах 6 и 9 выявлено по две коровых последовательности для YY1, в интроне 6 на расстоянии 362 и 589 п.н., а в интроне 9 - на расстоянии 1143 и 7932 п.н. от начала интрона. В последовательностях природного гена ЦП человека была выявлена только одна интронная последовательность для YY1 - в интроне 2 (371 п.н. от начала интрона). Благодаря наличию активаторного и репрессорного доменов, YY1 способен функционировать и в качестве репрессора, и в качестве активатора транскрипции одного и того же гена (Hariharan et al, 1991; Thomas, Seto, 1999). Показано, что YY1 взаимодействует с различными факторами, влияющими на транскрипцию (Shirvastava, Caíame, 1994).

Выявление иммунореактивных полипептидов YY1 в составе ЯФ печени взрослых, новорожденных крыс и молочной железы было проведено методом иммуноблотинга. В качестве отрицательного контроля по отношению к YY1 использовали антитела к Spl, сайты связывания для которого при компьютерном сканировании внутри гена обнаружено не было. Присутствие фактора YY1 обнаружено во всех тканеспецифических ЯФ (Рис. 7). Видно, что в печени новорожденных крысят содержится значительно меньшее количество YY1, чем в печени взрослой крысы. В ЯФ лактирующей молочной железы крысы обнаруживается сравнительно высокий уровень белка YY1, что хорошо согласуется с данными литературы, что в эпителиальных клетках молочной железы YY1 присутствует в качестве регулятора генов белков молока (Raught et al, 1994).

Выделение и клонирование внутреннего участка гена ЦП крысы. Для

идентификации участков гена ЦП, содержащихся в ЕсоЛГ-гидролизате

хромосомной ДНК крысы, фракционированном в агарозном геле, использовали [32Р]ЦП-кДНК. Идентифицированные фрагменты гена ЦП клонировали в плазмиде pTZ19 и индивидуальные клоны, содержащие последовательности гена ЦП, были отобраны методом скрининга на чашках с помощью [32РЗЦП-кДНК. Затем из отобранных клонов была получена плазмидная ДНК, которая была испытана на способность связывать ядерные белки из клеток молочной железы. Для этого ДНК разделяли в электрофорезом агарозном геле, затем ДНК переносили на нитроцеллюлозные фильтры и проводили связывание с ЯФ крысы, выделенными из печени, молочной железы и печени новорожденных. Комплексы связывали с антителами кроликов, иммунизированных тотальными препаратами ЯФ печени или молочной железы крысы, которые предварительно перекрестно Истощали на колонке с иммобилизованными ЯФ. Образовавшиеся «сэндвичи» визуализировали [1251]-вторыми антителами. В результате изолированы пять £со/г/-фрагментов хромосомной ДНК, предположительно содержащих последовательности гена ЦП, длиной ~ 4.5, 3.1, 2.3, 0.8 и 0.5 т.п.н. и связывающие ЯФ молочной железы. После еще одной процедуры Southern-блот гибридизации с [32Р]ЦП-кДНК для клонирования в векторе pTZ19 был выбран фрагмент размером 2.3 т ♦11»Н*9 к&к дающий самый сильный гибридизационный сигнал.

Чтобы установить, к какой части природного гена ЦП относится клонированный участок, была проведена гибридизация EcoRI-рестрикционных фрагментов рекомбинантной ДНК pTZ19 отдельно с центральным (2.1), 5'- (0.52) и 3'- (0.7 т.п.н.) участками кДНК-ЦП крысы. Видно (Рис. 8), что участок хромосомного гена ЦП 2.3 т.п.н. гибридизуется преимущественно с центральным фрагментом кДНК-ЦП, содержащим экзоны 5-10 этого гена. Клонированный фрагмент хромосомного гена 2.3 т.п.н, был использован для изучения специфичности связывания с ним фактора YY1.

Анализ взаимодействия ТФ с клонированным участком гена ЦП. В клонированном фрагменте хромосомного гена ЦП крысы был проведен поиск сайтов связывания для специфического фактора транскрипции YY1 методом прямого взаимодействия ДНК-белок и методом «гель-шифт» анализа. Для идентификации YY1 в комплексах клонированного фрагмента ДНК ЦП с тканеспецифическими ЯФ Есо&Л-гидролизат рекомбинантной pTZ19 электрофоретически разделяли в 0.8% агарозном геле и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Мембраны блокировали нейтральными белками 3% BLOTTO и проводили связывание ДНК соответственно с ЯФ молочной железы, печени взрослой крысы и печени новорожденных крысят (~2 мг) в том же растворе в течение ночи при 4°С. Затем фильтры отмывали и связывали с моноклональными антителами к Spl и YY1, соответственно, Иммунореактивные комплексы выявляли с помощью вторых антител, конъюгированных с пероксидазой, хемилюминесцентным методом (Рис. 9).

Г^.ЧМ

Л-'' /

<■2$ т.п. и.

Рис. 8. Радиоавтограф блот-гибридизации рекомбинантной

плазмидной ДНК с фрагментами кДНК гена ЦП крысы. Вверху приведена схема ЕсоШ-фрагментов полноразмерной ЦП-кДНК, которые после мечения использовали для

идентификации участка хромосомного гена ЦП.

В качестве

использовали

г32т

[32Р]5'-

4-23 т.гш.

зонда

фрагмент ЦП-кДНК (1), [^РЬентральный-фрашент ЦП-кДНК (2), [з2Р]3'-фрагмент ЦП-кДНК (3). Во все лунки внесено по 10 мкг рекомбинантной плазмидной ДНК, обработанной эндонуклеазой ЕсоШ.

I 2

Рис. 9. Выявление факторов УУ1 и 8р1 в комплексе 2,3 т.п.н. фрагмента ДНК-ЦП с ЯФ.

На дорожках: 1,4 - комплекс ДНК/ЯФ 2,3 т.п.н. молочной железы крысы, 2,5 - комплекс

ДНК/ЯФ печени новорожденных крысят, 3,6 - комплекс ДНК/ЯФ печени взрослой, Слева: взаимодействие с моноклональными антителами к ЙР1

Справа: взаимодействие с

моноклональными антителами к УУ1.

Рис. 10. Связывание ядерных факторов из различных органов крысы с [ Р]УУ1 и вытеснение его из комплексов гомологичным немеченым олигонуклеотидом и 2}3-ДНК.

1 - [32Р]УУ1; 2 - [32Р]УУ1 и ЯФ печени новорожденных крыс; 3 - [32Р]УУ1, ЯФ печени новорожденных крыс и 4-кратный избыток немеченого УУ1; 4 - [ Р]УУ1 и ЯФ печени взрослой крысы; 5 - [32Р]УУ1, ЯФ печени взрослой крысы и 4-кратный избыток немеченого УУ1; 6 - [32Р]УУ1, ЯФ печени взрослой крысы и 2-кратный избыток немеченой 2,3-ДНК; 7 - [32Р]УУ1 и ЯФ молочной железы крысы; 8 - [32Р]УУ1, ЯФ молочной железы крысы и 4-кратный избыток немеченого УУ1.

Представленные данные показывают, что среди ЯФ, связывающихся с внутренним участком хромосомного гена ЦП, транскрипционный фактор Spl отсутствует. В тоже время, белок YY1 in vitro прямо связывается с клонированным фрагментом природного гена ЦП.

Для проверки специфичности взаимодействия фактора YY1 с клонированным фрагментом был проведен гель-шифт анализ (Рис. 10). ЯФ, выделенные из клеток печени как взрослых, так и новорожденных крыс, а также из клеток лактирующей молочной железы, связываются с олигонуклеотидом, содержащим сайт для белка YY1 (дорожки: 4 и 5, 2 и 3, 8 и 7, соответственно). При этом немеченый гомологичный олигонуклеотид, взятый в качестве конкурента в 4-кратном избытке, во всех случаях вытесняет меченый олигонуклеотид из комплекса с ЯФ. Добавление в качестве конкурента 2-кратного избытка клонированного 2.3-фрагмента гена ЦП (учтена примерно 100-кратная разница в длине между меченым олигонуклеотидом и 2.3-фрагментом) приводит к заметному снижению радиоактивности в комплексе меченый олигонуклеотид/ЯФ из печени взрослой крысы (дорожка 6).

Таким образом, по крайней мере, один из сайтов для связывания белка YY1 в этом фрагменте природного гена ЦП крысы (2.3 т.п.н.) может быть функциональным. В ядерных экстрактах белков печени взрослой крысы содержится относительно больше белка YY1, чем во фракциях из молочной железы и "печени новорожденных крыс (дорожки: 4, 2 и 8, соответственно). Можно допустить, что фрагмент клонированного нами участка хромосомного гена ЦП включает в себя нуклеотидную последовательность интрона, содержащую сайт для связывания фактора YY1, который может участвовать в регуляции активности гена ЦП. Представленные данные демонстрируют потенциальную способность YY1 участвовать в регуляции активности гена ЦП человека и крысы. Так как YY1 присутствует в составе ЯФ и клеток печени взрослых крыс (ген ЦП активен) и в клетках молочной железы через 10 дней после родов (активность гена ЦП подавлена), можно предположить, что YY1 участвует в регуляции активности гена ЦП в ансамбле с другими ЯФ.

Анализ 5'-региона гена ЦП человека. Для выявления потенциальной роли регуляторных участков промоторной зоны гена ЦП в контроле уровня экспрессии этого гена в клетках молочной железы человека были применены следующие подходы: 1) анализ структуры 5 -региона гена ЦП человека длиной около 3500 п.н.; 2) сравнение изменения уровня ЦП в молоке в первые 5 дней лактации и структуры 5 -региона гена ЦП; 3) секвенирование и анализ последовательностей 5 -региона гена ЦП у пациенток с выявленным нарушением его структуры (генотип) и скорости падения концентрации ЦП в молоке (фенотип).

В качестве матриц для ПЦР использовали хромосомные ДНК, полученные из крови 41 роженицы. У 18 из этих пациенток был проведен

анализ содержания ЦП и меди в молоке на разных сроках лактации. Все полученные образцы ДНК проверяли электрофоретически в 0,8 % агарозном геле, чтобы удостовериться в нативности ДНК. В качестве праймеров использовали 17 пар олигонуклеотидов, комплементарных последовательностям 5'-участка гена ЦП человека (Табл. 3). Размеры семнадцати ПЦР-продуктов, представляющих последовательно амлифицированную ДНК 5'- участка гена ЦП, полученных на ДНК образца пациентки №1, по данным электрофореза, полностью совпадали с теоретически рассчитанными. Данные прямого секвенирования исследуемого участка ДНК пациентки №1 показали 99% совпадения с последовательностью, приведенной в базе данных. Этот образец ДНК служил стандартом. Некоторые фрагменты промоторной области гена ЦП, полученные на ДНК-матрицах разных образцов крови имеют существенные различия в размере продукта и изменения нуклеотидной последовательности (отсутствие продукта), выявляемые самым грубым методом. Наиболее консервативным является участок промотора гена ЦП человека, который находится вблизи экзона 1 (+16 - 608 п.н.) и область с координатами -1187—*- 854 п.н. Наибольшей вариабельностью отличаются области -1641 2397 п.н. , -1320 до -1169 п.н.; и -827 до -715 п.н. Таким образом, видно, что области прилежащие к структурной части гена ЦП играют более существенную роль в регуляции гена ЦП, чем удаленные.

Сопоставление содержания ЦП в молоке с выявленными при анализе ПЦР-продуктов изменениями в структуре исследуемого участка гена ЦП. У 18 пациенток данные ПЦР-анализа ДНК были сопоставлены с содержанием ЦП в исследуемых образцах молока. У пациентки №23 содержание ЦП в молоке по данным иммуноэлектрофореза не снижается к 5-му дню лактации, а у пациентки №31 - аномально высокое содержание ЦП в молоке (Рис. 11.А). У №23 не было выявлено очевидных нарушений в исследуемой области гена ЦП. У пациентки с сильно повышенным содержанием ЦП в молоке наблюдается заметное число возможных изменений последовательности гена в области праймеров 12 - 14, что соответствует области гена от -1460 до -2294 п.н. Так, продукт 13-ой пары праймеров отсутствует. Чтобы выяснить характер нарушений на рассматриваемом участке ДНК, который мы обозначили как "проблемный", была проведена ПЦР с использованием "комбинированных" пар праймеров, т.е. был взят прямой 14 праймер (14и) и обратный 12-й (121). Ожидаемый размер ПЦР продукта согласно базовой последовательности этого участка должен составлять 662 п.н. Электрофоретический анализ амплификата (Рис. 11.Б) показал, что ПЦР продукт 14U-121 на матрице ДНК крови образца №31 имеет длину больше примерно на 80-100 п.н. чем продукт ПЦР с тех же праймеров на матрице образца №1. Прямое секвенирование контрольного и "проблемного" участков было осуществлено в ООО «Хеликс», С.-Петербург. Последовательность нуклеотидов фрагмента, полученная при

Содержание ЦП в молоке, мкг/100 мл №23 №31

1 день 0,21 42,75

5 день 0,24 9,00

пр. 13 I 31

1000 П.Н.-700 п.н.-бООп.н,-500 п.н-

230 п.н.-

пр. 12-14 1 31

Рис. И. Сопоставление содержания ЦП в молоке с выявленными изменениями в структуре исследуемого участка гена ЦП.

А. Содержание ЦП в молоке у исследуемых пациенток Б. Электрофореграмма ПЦР-продуктов, полученных с помощью 13-той пары праймеров (пр. 13) и праймеров12-14 (пр. 12-14) на ДНК №1 и 31 (на рисунке -.1 и 31)

сйА А^1 ^^

14и|г ^

- 16 15 14

-2294

lseq - контроль -2294 31seq

-2233

23ве9

-3526

-1639

-1850

Рис. 12. Схема секвенирования участка промотора гена ЦП у пациенток с аномальным содержанием ЦП в молоке.

секвенировании контрольной ДНК lseq на 99% идентична последовательности Human_Promoter.seq из базы данных «Геном человека». При анализе последовательности ДНК №31 наблюдали повторяемые и воспроизводимые затруднения при автоматическом чтении секвенограмм (Рис. 12). Они заключались в том, что последовательности с праймера 14и ближайшие к сайту посадки праймера -90 н. не читались, а при секвенировании с 121 - соответственно были проблемы с прочтением участка 550 - 650 н. от сайта посадки 121 праймера. В результате для фрагмента ДНК 31seq удалось установить последовательность нуклеотидов, только начиная с положения - 2233 п.н. и до -1639 п.н. Выше положения -2233 находится вставочная последовательность из ~ 90 п.н., последовательность нуклеотидов в которой не удалось установить. Интересно, что именно на этом отрезке находится сайт связывания рецептора эстрогена, соседствующий с сайтом связывания белка YY1, которые идентифицированы при компьютерном анализе. ER, сайт связывания для рецептор эстрогена, имеет координаты -2267 - -2260 п.н., а сайт связывания для YY1 находится в положении -1994 - -1984 п.н. по гену ЦП.

Нарушения сайта для ER могут приводить к сбоям в гормон-зависимой регуляции экспрессии гена ЦП. Можно предположить, что наблюдаемый у этой пациентки высокий уровень ЦП в молоке является следствием разобщения близко расположенных сайтов YY1 и ER (Рис. 12),

У пациентки №23 была проанализирована вариабельная область от -1850 до - 3526 п.н. (23seq). Ее секвенирование как в прямом, так и в обратном направлениях показало существование однонуклеотидной замены в положении - 1966 п.н (Рис. 12). По данным компьютерного анализа, этот чуклеотид входит в состав коровой последовательности сайта связывания ТФ З-EBPbeta. Показано, что этот цис-элемент является одним из регуляторов )строфазного ответа и при взаимодействии с рецептором эстрогена участвует в репрессии инициации транскрипции гена IL-6. Известно, что ЦП входит в группу белков острой фазы, a IL-6 подавляет активность гена ЦП на уровне транскриции. Связь между выявленной однонуклеотидной заменой и нарушением регуляции активности гена ЦП в клетках молочной железы у этой пациентки нельзя исключить, однако, чтобы дать однозначное объяснение этому, необходимы дополнительные исследования.

ВЫВОДЫ

1. ЦП растворимой фракции молока является основным источником пищевых ионов меди в первые дни жизни новорожденных. В этот период в молоке резко падает концентрация меди, что связано только со снижением содержания ЦП, обусловленным селективным подавлением активности гена ЦП в клетках молочной железы,

2. В период после завершения беременности и началом лактации в клетках молочной железы происходит смена типа метаболизма меди,

которая выражается в том, что в течение беременности в

клетках молочной железы экспрессируется GPI-ЦП и АТР7А, а в период лактации секреторный ЦП и АТР7В.

3. 5-регуляторные области гена ЦП крысы и человека, как показал компьютерный анализ, содержат сайты для связывания одних и тех же ТФ, среди которых выявлены сайты гормон-зависимой регуляции экспрессии гена ЦП, а также сайты связывания тканеспецифических ТФ. Методом гель-шифт анализа подтверждено, что растворимые ядерные белки клеток лактирующей молочной железы содержат ТФ, специфически связывающиеся с сайтами гормон-зависимой регуляции.

4. Внутренний фрагмент природного гена ЦП крысы включает последовательности, взаимодействующие с фактором YY1, который выявлен в составе ЯФ, выделенных из печени и молочной железы взрослой крысы, а также из печени новорожденных крысят.

5. Возможно, существует связь между нарушением сайта связывания рецептора эстрогена (-2260 п.н.), а также расстоянием между этим сайтом и сайтом связывания YY1 (- 1984 п.н.) и активностью гена ЦП в клетках молочной железы в течение лактации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Н.Е. Гюлиханданова, Н.В. Цымбаленко, H.A. Платонова, B.C. Бабич, Л.В.* Пучкова. Изучение регуляции активности гена церулоплазмина у млекопитающих // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 37, 5: 553-558, 2004.

2. Л.В. Пучкова, Э.А. Жигулева, C.B. Мокшина, Л.К. Сасина, Н.В. Цымбаленко, H.A. Платонова, Н.Е. Гюлиханданова, Т.А. Свиридова, Б.С. Мищенко, B.C. Гайцхоки. Влияние искусственного вскармливания на распределение меди в организме 8-дневных крысят // Вопросы питания. № 1-2:15-18,2000 г.

3. Zhivulko T., Mishenko В., Zhiguleva Е., Bichevaya N., Platonova N., Tsymbalenko N., Gyulikhandanova N., Vasin A., Povalihin R. Puchkova L. Copper nutrition and copper metabolism in rat newborns // Metal ions in biology and medicine. Vol.7, eds. John Libbey Eurotext, Paris: 447-457, 2002.

4. Н.Е. Гюлиханданова. Выделение и характеристика тканеспецифических транскрипционных факторов, участвующих в регуляции экспрессии гена церулоплазмина // Труды победителей конкурса грантов 1998 года для студентов, аспирантов и молодых ученых Санкт-Петербурга, Направление «Биология»: Сборник трудов. - СПб: НИИХ СПбГУ: 70-71,1998.

5. Gyulikhandanova N. The studying of the mechanisms of ceruloplasmin gene expression in the mammalia during development // International Medical

Conference For Students and Young Doctors, Abstract Book,

Lublin, Poland, April 24-26, 1998.

6. Цымбаленко H.B., Жигулева Э.А., Гюлиханданова H.E., Повалихин Р.Г., Платонова Н.А., Свиридова Т.В., Сасина JI.K., Скворцова Н.Н., Мищенко Б.С., Гайцхоки B.C., Пучкова JI.B. Связь между уровнем экспрессии генов, поддерживающих гомеостаз меди, содержанием ионов меди в пище и типом метаболизма меди в раннем онтогенезе.// Материалы 2-го съезда медицинских генетиков, Курск, 16-19 мая 2000 г., с. 250-251.

7. Platonova N., Zhiguleva Е., Sviridova Т., Gyulikhandanova N., Povalihin R. Expression of the copper metabolic system genes whose the mutation lead to formation of the neurodegenerative diseases. 11-th European Students Conference at the Charite Berlin for Medical Students and Young Doctors. Abstract Book. November 22-24, 2000.

8. Пучкова JI.B., Цымбаленко H.B., Сасина Л.К., Жигулева Э.А., Повалихин Р.Г., Платонова Н.А., Свиридова Т.В., Гюлиханданова Н.Е., Бичевая Н.К, Мищенко Б.С., Гайцхоки B.C. Разработка подходов для создания физиологически адекватных медьсодержащих добавок в молочные смеси // Материалы IV Международного симпозиума «Биологические активные добавки к пище: XXI век», Санкт-Петербург, 22-24 мая 2000 г.

9. Gyulikhandanova N., Povalihin R. The importance of regulation ceruloplasmin gene expression in mammary gland cells for copper homeostasis in newborns // European Journal of Human Genetics, Abstract book of 10-th International Congress of Human Genetics, May 15 - 19, 2001, Vienna. Austria. 9 (Suppl.l): P0730, 2001: 242.

10.Гюлиханданова H.E., Косов M.H., Васин A.B., Повалихин Р.Г., Живулько Т.В., Жигулева Э.А., Платонова Н.А. Механизмы, обеспечивающие гомеостаз меди у крыс // 6-ая Пущинская школа -конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века», 20 - 24 мая 2002 г., Пущино, с. 72-73.

Н.Жигулева Э.А., Воронина О.В., Гюлиханданова Н.Е., Повалихин Р.Г., Пучкова JI.B. Изучение регуляции экспрессии гена церулоплазмина // III съезд биохимического общества, Тезисы научных докладов, 26.06 -1.07.2002, Санкт-Петербург, с.287.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать О&ЛООУ. Формат 60x84/16. Печать офсетная. Усл. печ. л /, У5 Тираж . Заказ 44$ •

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая, 29.

РНБ Русский фонд

2006-4 1915

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гюлиханданова, Наталия Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура молекулы ЦП

1.2. Структура и экспрессия гена ЦП

1.3. Биосинтез ЦП, встраивание меди и посттрансляционные 15 модификации

1.4. Тканеспецифические молекулярные формы ЦП и ЦП- 17 подобные белки

1.4.1 Тканеспецифические молекулярные формы ЦП

1.4.2. Мембраносвязанные формы ЦП

1.5. Изменения тканеспецифической активности гена ЦП в 23 онтогенезе

1.5.1. Эмбриональный тип метаболизма меди у млекопитающих

1.5.2. Взрослый тип метаболизма меди

1.6. Роль ЦП молока как источника ионов меди для 28 новорожденных

1.7. Церулоплазмин как многофункциональный белок

1.8. Церулоплазмин - "moonlighting" белок

1.9. Потенциальные механизмы регуляции экспрессии генов, 38 кодирующих "moonlighting" белки

1.9.1. Регуляция на уровне транскрипции

1.9.2. Альтернативная транскрипция

1.9.3. Альтернативный сплайсинг

1.9.4. Транс-сплайсинг

1.9.5. Альтернативное полиаденилирование

1.9.6. Регуляция на уровне трансляции

1.9.7. Альтернативные сайты инициации трансляции

ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы, использованные в работе

2.2. Методы, использованные в работе

2.2.1. Методы выделения препаратов белков и НК

2.2.2. Методы исследования НК

2.2.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.2.4. Методы исследования белков

2.2.5. Клонирование фрагмента хромосомного гена ЦП крысы

2.2.6. Методы анализа взаимодействия ДНК и белков

2.2.7. Аналитические методы

ЧАСТЬ 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Содержание ЦП и меди в молоке человека и крыс в течение лактации

3.1.1. Изменение концентрации ЦП и ионов меди в грудном 65 молоке в первые дни лактации

3.1.2. Содержание несвязанных с ЦП ионов меди в грудном 66 молоке

3.1.3. Содержание ЦП и связанной с ним меди в молоке 69 лабораторных крыс

3.1.4. Изменение активности гена ЦП у новорожденных крыс, 71 вскармливаемых молочными смесями

312. Экспрессия генов, участвующих в транспорте меди, в клетках молочной железы на разных стадиях ее развития

3.2.1. Содержание мРНК-транскриптов генов ЦП, Ctrl, АТФазы 76 Менкеса и АТФазы Вильсона в молочной железе в разные периоды развития

3.2.2. Содержание иммунореактивных белков ЦП, АТФаз 79 Вильсона и Менкеса во фракциях плазматических мембран молочной железы крысы во время беременности и лактации

3.2.3. Сопоставление уровня ЦП-мРНК и CTRl-мРНК в клетках 81 молочной железы с концентрацией ЦП и меди в молоке

3.2.4. Исследование экспрессии генов метаболизма меди на 82 культивируемых клетках молочной железы

3.3. Выявление потенциальных регуляторных последовательностей в гене ЦП крысы и человека

3.3.1. Поиск г/ис-элементов в 5'-регионе гена ЦП

3.3.2. Экспериментальный анализ 5'-региона гена ЦП крысы

3.3.3. Поиск потенциальных сайтов регуляции активности гена ЦП 97 крысы во внутригенной области хромосомного гена

3.3.4 Анализ 5'-региона гена ЦП человека

3.3.5. Сопоставление содержания ЦП в молоке с выявленными при 113 анализе ПЦР-продуктов изменениями в структуре промоторного участка гена ЦП

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы"

Актуальность исследования. Для полного развития интеллектуальных качеств- каждого- индивидуума* необходимы, различные условия, среди которых важнейшее место занимает сбалансированное питание. Медь входит в группу микроэлементов и является обязательным: компонентом пищи, так как является частью активных центров купроэнзимов, участвующих в жизненно важных процессах (Karlin, 1993; Репа et al:, 1999): Одновременно, ионы меди могут индуцировать образование гидроксильных радикалов, которые повреждают все типы биомолекул (binder; 2001). Безопасный круговорот меди в клетках обеспечивает система белков (метаболическая система меди, МСМ), некоторые гены которой клонированы (Huffman&O'Halloran, 2001). При этом в клетке ионы.меди всегда остаются координационно-связанными (Rae et al., 1999). Свободных ионов- меди нет и в межклеточных пространствах. У млекопитающих почти 95% неклеточной меди связано с церулоплазмином (ЦП), полифункциональным медьсодержащим гликопротеином позвоночных, который, в частности, переносит ионы меди к клеткам: негепатоцитарных рядов (binder et al., 1998). Получены бесспорные доказательства, что экологическое и врожденное нарушение баланса меди оказывает негативное плейотропное действие на весь организм и является причиной многих заболеваний ЦНС (Prohaska, 2000; Lee et al., 2001; Hamza et al., 2001; Qian et al., 1997; Rao et al., 2002; Miyajima, 2003).

У млекопитающих оптимальный уровень ионов меди для тканей эмбрионов и новорожденных обеспечивает МСМ самок с помощью внеклеточных переносчиков меди. На это указывает то, что ее экспериментальный дефицит в диете беременных самок или генетические дефекты МСМ матери неизбежно ведут к развитию у плодов и новорожденных фатальных симптомов медьзависимых микроэлементозов (Prohaska&Bailey, 1994; Shavlovski et al., 1995; Lee et al., 2001; Hamza et al.,

2001). Нарушение баланса меди в период молочного вскармливания приводит к развитию различных заболеваний (Mason, 1979; Muller&Muller, 1998; Coronado et al., 2001). Эти факты указывают на существование практически не изученного природного механизма, контролирующего уровень меди в диете новорожденных.

Известно, что в клетках лакгирующей молочной железы ионы меди включаются в синтезируемый ими церулоплазмин (ЦП), и секретируются в молоко (Пучкова и др., 1994; Jenkins&Hidiroglou, 1989; McArdle&Danks, 1991). Показано, что in vitro ионы меди, ассоциированные с ЦП крови, лучше i усваиваются тканями эмбриона, чем ионы меди неорганических солей или комплекса с гистидином (Wooten et al., 1996). У новорожденных крыс при эмбриональном типе метаболизма меди ЦП молока из желудочно-кишечного тракта переносится в кровоток без модификаций (Мокшина, 1998). Показано, что в первый месяц лактации, когда* объем потребляемого молока растет прогрессивно, содержание ЦП в нем снижается (Kiyosawa etal., 1995; Wooten, et al., 1996; Пучкова и др., 1997а). Можно думать, что контроль, над содержанием; меди в пище новорожденных в первые дни жизни осуществляется путем; регуляции активности гена ЦП в клетках молочной железы {Пучкова др., 1997а). От признания ЦП грудного молока как важного высоко специфического источника пищевой меди, к которому адаптирован метаболизм новорожденных и с которым, возможно, связано оптимальное развитие индивидуума, зависит стратегия вскармливания новорожденных, i так как вскармливание молочными смесями, содержащими свободные ионы меди (Пучкова и др., 1997а; Lonnerdal, 1998), может влиять на оптимальное развитие индивидуума.

Цель исследования состояла в изучении экспрессии гена ЦП в клетках молочной железы в разные периоды ее развития.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

2. In vivo и in vitro в клетках молочной железы методом полуколичественного ОТ-ПЦР анализа определить относительное содержание ЦП-мРНК для секреторной формы ЦП и ЦП, связанного с плазматической мембранной s через гликозилфосфатидилинозитоловый якорь (GPI-ЦП). Методом высокочувствительного иммуноблоттинга проверить экспрессию гена ЦП на уровне образования белковых продуктов. Параллельно изучить экспрессию генов, участвующих в метаболическом включении ионов меди в растворимый ЦП (АТФаза Вильсона, АТР7В) и GPI-ЦП, (АТФаза Менкеса, АТР7А), а также гена Ctrl, высоко аффинного импортера меди.

4. Осуществить экспериментальную проверку биологической роли некоторых выявленных z/wc-элементов в регуляции активности гена ЦП в клетках молочной железы.

5. Сопоставить уровень изменения активности гена ЦП в клетках молочной железы человека с вариабельностью промоторной области гена ЦП

Научная новизна полученных результатов.

В работе показано, что в первые дни лактации ЦП молока является основным источником меди для новорожденных. Замена ЦП свободными ионами меди в диете новорожденных крыс вызывает в печени преждевременную смену эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый тип.

Установлено, что между беременностью и лактацией в клетках молочной железы происходит смена профиля экспрессии генов, участвующих в переносе меди: во время беременности экспрессируется АТР7А и GPI-ЦП, к началу периода лактации активируется ген АТР7В и индуцируется образование секреторной изоформы ЦП.

Сравнительный анализ промоторных областей гена ЦП крысы и человека выявил высокую степень гомологии исследуемых участков и сохранение числа, набора и. взаимного расположения; потенциальных сайтов связывания для специфических, в < том числе гормон-зависимых и тканеспецифических, транскрипционных факторов (ТФ). Выявлена возможная связь между уровнем экспрессии гена- ЦП в клетках молочной железы человека и нарушение сайта связывания растворимого ядерного рецептора эстрогенов и сайта связывания ТФ C-EBPbeta, расположенных соответственно в положении - 1966 п.н. и -2260 п.н. от точки начала транскрипции.

Научно-практическая значимость результатов исследования

• Полученные данные, свидетельствующие о пищевой ценности ионов меди, связанных с ЦП, могут служить основой при разработке состава молочных смесей, соответствующих по меди грудному молоку.

Основные положения, выносимые на защиту

• Преимущественной молекулярной формой ЦП в течение беременности является GPI-ЦП, а в период лактации; - секреторный ЦП. В течение беременности перенос ионов меди в клетках молочной железы крысы преимущественно осуществляют АТФаза Менкеса, во время лактации -АТФаза Вильсона.

• Существует потенциальная связь между нарушением сайтов > связывания рецептора эстрогена (-2260 п.н.) и транскрипционного фактора C-EBPbeta и активностью гена ЦП в клетках молочной железы.

Апробация результатов работы

Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века, Пущино, 20-24 мая 2002 г.; Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, Киев, Украина, 25-27 сентября, 2003 г.

Работа поддержана грантами РФФИ № 98-04-49846, № 03-04-48748, ФЦП «Интеграция» И0064, АО 137, "Университеты России» 991149, грантом РФФИ MAC № 02-04-07612, персональными грантами для студентов, аспирантов и молодых ученых Администрации Санкт-Петербурга 1998, 1999, 2001 гг. ъ

ЧАСТЫ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В 1948 году шведские ученые Холмберг и Лоурелл выделили из сыворотки крови человека голубой белок, обладающий оксидазной активностью по отношению к ароматическим диаминам и катехоламинам. Он был назван церулоплазмином (ЦП), что буквально означает «голубая субстанция плазмы». Этот голубой белок стал предметом исследований, направленных на изучение его функций и молекулярной структуры, а также физических свойств связанных с ним ионов меди. Число, выявленных функций этого белка постоянно увеличивалось: роль в транспорте меди, гомеостазе железа, метаболизме биогенных аминов, в; реакции на оксидативный стресс. В 1952 г. было обнаружено снижение концентрации ЦП при болезни Вильсона. Было обнаружено, что > содержание ЦП; изменяется при некоторых заболеваниях, а наследственное отсутствие ЦП, ацерулоплазминемия, ведет к нарушению метаболизма железа. Оказалось, что с этим заболеванием близко ассоциированы; сахарный; диабет, дегенерация сетчатки и нейродегенерация. Однако биологическая роль ЦП до сих пор полностью не выяснена.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гюлиханданова, Наталия Евгеньевна

ВЫВОДЫ

2. В период после завершения беременности и началом лактации в клетках молочной железы происходит смена типа метаболизма меди, которая выражается в том, что в течение беременности в клетках молочной железы экспрессируется GPI-ЦП и АТР7А, а в период лактации секреторный ЦП и АТР7В.

3. 5 -регуляторные области гена ЦП крысы и человека, как показал компьютерный анализ, содержат сайты для связывания одних и тех же ТФ, среди которых выявлены сайты гормон-зависимой регуляции экспрессии гена ЦП, а также сайты связывания тканеспецифических ТФ. Методом гель-шифт анализа подтверждено, что растворимые ядерные белки клеток лактирующей молочной железы содержат ТФ, специфически связывающиеся с сайтами гормон-зависимой регуляции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гюлиханданова, Наталия Евгеньевна, Санкт-Петербург

1. Adkins Y., Zicker S.C., Lepine A., Lonnerdal B. Changes in nutrient and protein composition of cat milk during lactation // Am. J. Vet. Res., Apr, 58 (4): 370-5,1997;

2. Aldred A.R., Grimes A., Schreiber G., Mercer J.F. Rat ceruloplasmin. Molecular cloning and gene expression in liver, choroid plexus, yolk sac, placenta, and testis // J. Biol. Chem., 262: 2875-2878,1987;

3. Barnes G., Frieden E. Ceruloplasmin receptors of erytrocytes // Biochem. Biophys. Res. Commun., 125: 157-162,1984;

4. Bielli P., Calabrese L. Structure to function relatioships in ceruloplasmin: a "moonlighting" protein // CMLS, Cell. Mol. Life Sci., 59: 1413 1427, 2002;

5. Bingle C.D., Epstein O., Srai S.K.S., Gitlin J.D. Hepatic ceruloplasmin-gene expression during development in the guinea-pig: correlation with changes in hepatic copper metabolism // Biochem. J., 276: 771-775,1991;

6. Blumenthal T. Trans-splicing and polycistronic transcription in Caenorbabditis elegans//TIG, 11 (4), 1995;

7. Borjigin J., Payne A.S., Deng J., Li X., Wang MM, Ovodenko В., Gitlin J.D., Snyder S.H. A novel pineal night-specific ATPase encoded by the Wilson disease gene //The Journal of Neuroscience, 19(3):1018-1026,1999;

8. Bremner L. Absorption, transport and distribution of copper // Hunt Ciba Foundation Symp., 23-37,1980;

9. Brennan K.J., Matthews B.W. The helix-turn-helix DN A binding motif// J. Biol. Chem., 264: 1903-1906, 1989;

10. Brown D.R. Prion protein expression modulates neuronal copper content // Journal of Neurochemistry, 87: 377-385, 2003;

11. Bull Р. С., Thomas G.R., Rommens J.M., Forbes J.R., Cox D.W. The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes gene // Nature Genet., 5: 327-337,1993;

12. Calabrese L., Muski G. Molecular properties of ceruloplasmin from different species. I I In: Multi-copper oxidases, Academic Press, N.-Y., 307-354,1997;

13. Ceciliani F., Giordano A., Spagnolo V. The systemic reaction during inflammation: the acute-phase proteins // Protein and Peptide Letters, 9 (3): 211, 2002;

14. Cerklewski F.L. Determination of a copper requirement to support gestation and lactation for the female albino rat //J. Nutr., 109 (9): 1529,1979;

15. Cerveza P.J., Mehrbod F., Cotton S.J. et al. Milk ceruloplasmin and its expression by mammary gland and liver in pigs //Arch. Biochem. Biophys., 373: 451—461, 2000;

16. Coronado V., Nanj'i M, Cox D. W. The Jackson toxic milk mouse as a model for copper loading // Mamm. Genome, Oct, 12(10): 793-795, 2001;

17. Cousin R.J. Absorption, transport, and hepatic metabolism of copper and zinc: special reference to metallothionein and ceruloplasmin // Physiol.Rev., 65 (2): 238-309,1985;

18. Cox D. W. Genes of the copper pathway // Am. J. Genet., 56: 828-834,1995;

19. Crampton R.F., Matthews D.M., Poisner R: Observations on the mechanism of absorption of copper by small intestine I I J. Physiol., 178: 11-126,1965;

20. Culotta V.C., Howard W.H., LiuX.F.H J. Biol. Chem., 269: 25295,1994;

21. Czaja M.J., Weiner F.R., Schwarzenberg S.J. et al. // J. Clin. Invest., 66: 1200-1205,1987;

22. Daimon M., Yamatani K., Igarashi M., Fukase N., Kawanami Т., Kato Т., Sasaki H. Fine structure of human ceruloplasmin gene // Biochem. Biophys. Res. Commun., 208: 1028-1035, 1995;

23. Donley S.A., Ilagan B.J., Rim H., binder M. C. Copper transport to mammary gland and milk during lactation in rats // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 283: E667-E675, 2002;

24. Ettinger M.J., Darwish H.M., Schmitt R.C. Mechanism of copper transport from plasma to hepatocytes // Fed.Proc., 45 (12):2800-2804,1986;

25. Extact Preparation //Cell, 47(5), 767-776,1986;

26. Fleming R.E., Gitlin J.D. Primary structure of rat ceruloplasmin and analisis of tissue specific gene expression during development // J.Biol.Chem., 265 (13):7701-7709,1990;

27. Fleming R.E., Gitlin J.D. Structural and functional analysis of 5'-flanking region of the rat ceruloplasmin gene // J. Of Biol. Chem., 267 (1,5): 479486,1992;

28. Fortna R.R., Watson H.A; Nyquist S.E. Glycosyl phosphatidylinositol-anchored ceruloplasmin is expressed by rat Sertoli cells and is concentrated in detergent-insoluble membrane fractions // Biol. Reprod., 61 (4):1042-9, 1999;

29. Frazer D M., Vulpe C., McKie A.T., Wilkins S.J., Trinder D., Cleghorn G.J., Anderson G. J. Cloning and gastrointestinal expression of rat hephaestin: relationship to other iron transport proteins I I Am. J. Physiol., 284 (4): 9, 2001;

30. Frieden E. Caeruloplasmin: a multi-functional metalloprotein of vertebrate plasma. In :Biological roles of copper// Excepta Medica, 93-124,1980;

31. Frydman M., Bonne-Tamir В., Farrer L.A., Conneally P.M., Magazanic A., Ashbel I., Goldwitch Z. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 82: 1819 1821, 1985;

32. Gaits khoki V.S., L'vov L.V., Puchkova L.V. et al Highly purified ceruloplasmin messenger RNA from rat liver // Mol. Cell. Biochem., 35: 171-182, 1981;

33. Gitlin J.D. Aceruloplasminemia // Pediatr Res., Sep., 44(3): 271 276, 1998;

34. Gitlin J.D. Transcriptional regulation of ceruloplasmin gene expression during inflammation //J. Biol. Chem., 263: 6281-6287,1988;

35. Hamza I., Faisst A., Prohaska J., Chen. J., Gruss P., Gitlin J.D. The matallochaperone Atoxl plays a critical role in perinatal copper homeostasis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 6848-6852, 2001;

36. Hariharan N., D. Kelly R., Perry P. Delta, a transcription factor that binds to downstream elements in several polymerase II promoters, is a functionally versatile zinc finger protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9799-9803,1991;

37. Harris E.D. Copper transport: an overview. // Society Experim. Biol, and Medicine, 130-140, 1991;

38. Harris Z.L., Takahashi Y., Miyajima H., Serizawa M, MacGillivray R., Gitlin J.D. Aceruloplaminemia: molecular characterization of this disoder of iron metabolism // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 2539-2543,1995;

39. Hennidhausen L., Robinson G. Signaling pathways in mammary gland development// Develpmental cell, 1 (10): 467-475, 2001;

40. Hesset R., Kosman D.J. Evidence for Cu(II) reduction as a component of copper uptake by Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem., 270 (1): 128134,1995;

41. Holmberg C.G. On the presence of a laccase-like enzyme in serum and its relation to the copper in serum // Acta. Physiol. Scand., 8: 227-229,1944;

42. Holmberg C.G., Laurell C.B. Investigations in serum copper II // Acta.Chem.Scand., 2:550-556,1948;

43. Huffman D.L., O'Halloran T.V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins //Annu. Rev. Biochem., 70: 677— 701, 2001;

44. Hurley L.S., Keen C.L., Lonnerdal B.O. Copper in fetal and neonatal development // Hunt Ciba Foundation Symp., 227-245,1980;

45. Janger J.L., Shimizu, Gitlin J.D. Tissue-specific synthesis of the ceruloplasmin by mamary glands of the rat //Biochem. J., 280 (3): 671-677, 1991;

46. Jeffery C.J. Moonlighting proteins // TiBS, 8-11,1999;

47. Jenkins K.J. Hidiroglou M. Tolerance of the calf for excess copper in milk replace//J. Dairy Sci., 72(1), 150-156,1989;

48. Juan S.H., Guo J.H., Aust S.D. Loading of iron into recombinant rat liver ferritin heteropolymers by ceruloplasmin // Arch. Biochem. Biophys., 15, 341(2): 280-6,1997;

49. Karlin K.D. Metalloenzymes, structural motif, and inorganic models // Science, 261, 701-707,1993;

50. Keen C.L., Hurley L.S. Developmental patterns of copper and zink concentrations in mouse liver and brain // J. Inorg. Biochem., 11: 269-277, 1979;

51. Keen C.L., Lonnerdal В., Clegg M., Hurley L.S. Developmental changes in composition of rat milk: trace elements, minerals, protein, carbohydrate and fat. // J. Nutr., lll(2):226-36,1981;

52. Kiyosawa /., Matsuyama J., Nyui S., Fukuda A. Ceruloplasmin concentration in human colostrum and mature milk // Biosci. Biotechnol. Biochem., 59 (4): 713-4,1995;

53. Klomp L.W., Farhangrazi Z.S., Dugan L.L, Culotta V., Gitlin J.D. Ceruloplasmin gene expression in the murine central nervous system // J. Clin. Invest., 98: 207-215, 1996;

54. Klug A., Schwabe J. W.R. Zinc fingers // FASEB Journal, 9: 597-604,1995;

55. Koschinsky M.L., Funk W.D., Van Oost B.A., MacGillivray R.T. Complete cDNA seguence of human preceruloplasmin //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5086-5090,1986;

56. Kroll I. A mannual of quantitative immuno-electrophoresis. Ed. by N.H. Axelsen, J.Kroll, B.Weeke // Oslo-Bergen-Troms: Universitet Storlaget, 1973;

57. Kunapuli S.P., Singh H., Singh P., Kumar A. Ceruloplasmin gene expression in human cancer cells //Life Sci. 40: 2225-2228,1987;

58. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 227: 680-685,1970;

59. Lee J., Prohaska J.R., Thiele D.J. Essential role for mammalian copper transporter Ctrl in copper homeostasis and embryonic development // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98,12: 6842-6847, 2001;

60. Linder MC. Copper and genomic stability in mammals // Mutation Res. V. 475 (1):141, 2001;

61. Lockhart P. J., Mercer J.F.B. Cloning and expression analysis of the sheep ceruloplasmin cDNA// Gene, 236: 251-257,1999;

62. Lonnerdal В. Copper nutrition during infancy and childhood // Am. J Clin. Nutr., 67: 1046S-1053S, 1998;

63. L'vovskaia E.I., Gavriliuk Т.А., Mokhova S.V. In vitro effect of BITO preparation,. ceruloplasmin, transferrin, and essentiale on the intensity of lipid peroxidation during thermal injury // Vopr. Med. Khim., 42(2):125-7, 1996;

64. Mangelsdorf D.J., C. Thummel, M. Beato, G. Schuttz, K. Umesono, B. Blumberg, P. Kastner, M. Mark, P. Chambon, R. M. Evans. The nuclear receptor superfamily: the second decade // Cell, 83: 835-839,1995;

65. Mangelsdorf D.J., Evans R.M. The RXR heterodimers and orphan receptors //Cell, 83: 841-850,1995;

66. Marone M, Mozzetti S., De Rids D., Pierelli L., Scambia G. Semiquantitative RT-PCR analysis to assess the expression levels of multiple transcripts from the same sample// Biol. Proced. Online, 3(1): 1925,2001;

67. Mas A., Sarkar Uptake of (67) Cu by isolated human trophoblast cell // Biophis. Res. Commun., 115: 123-128, 1992;

68. Mason K.E. A conspectus of research on copper metabolism and requirements of man //J.Nutr.,109 (ll):1979-2066,1979;

69. Masso-Welch P.A., Darcy K.M., Stangle-Castor N.C., Margot M. A Developmental Atlas of Rat Mammary Gland Histology // Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, 5 (2), 2000;

70. Mazumder В., Seshadri V., Fox P.L. Translational control by the 3'-UTR: the ends specify the means I I TRENDS in Biochemical Sciences, 28 (2), 2003;

71. McArdle H.J., Danks D.M. Secretion of copper 64 into breast milk following intravenous injection in a human subject //J. Trace Elements Exp. Med., 4: 81-84,1991;

72. Messerschmidt A., Huber R. The blue oxidases, ascorbat oxidase, laccase and ceruloplasmin//Eur. J. Biochem., 187: 341-352,1990;

73. Mitchell P.J., Tjian R. Transcriptional regulation in mammalian cells by sequence-specific DNA binding proteins // Science, 245: 371-378,1989;

74. Mittal В., Doroudchi М.М., Jeong S.Y., Patel. B.N., DavidS. Expression of a membrane-bound form of the ferroxidase ceruloplasmin by leptomeningeal cells // GLIA, 41: 337-346, 2003;

75. Miyajima H. Aceruloplasminemia, an iron metabolic disorder // Neuropathology, 23, 345-350, 2003;

76. Mukhopadyay C.K., Attien Z.K., Fox P.L. Role of ceruloplasmin in cellular iron uptake // Science, 279: 714-717,1998;

77. Mukhopadyay C.K., Mazumder В., Lindley P.F:, Fox P.L. Identification of the prooxidant site of human ceruloplasmin: a model for oxidative damage by copper bound to protein surfaces // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 11546-11551,1997;

78. Mukhopadyay C.K., Mazumder В., Fox PL. Role of hipoxia-inducible factor-1 in transcriptional activation of ceruloplasmin by iron defiviency // J. Biol. Chem., 275 (28): 21048-21054, july 14, 2000;

79. Muller Т., Muller W., Feichtinger H. Idiopatic copper toxicosis // Am. J. Clin. Nutr., 67: 1082S-1086S,1998;

80. Musci G., Fraterrigo T.Z.L., Calabrese L., McMillin D.R. On the lability and functional significance of the type 1 copper pool in ceruloplasmin // JBIC, 4: 441-446,1999;

81. Muski G., DiMarco S., Bonaccorsi di Patti M.C., Calabrese L. Interaction of nitric oxide with ceruloplasmin lacking an EPR-detectable type 2 copper // Biochemistry, 30: 9866-9872, 1991;

82. Okamoto N„ Wada S„ Oga Т., Kawabata Y., Baba Y., Habu D., Takeda Z., Wada Y. Hereditary ceruloplasmin deficiency with hemosiderosis // Hum. Genet., 97 (6):755-8,1996;

83. Olivares M., Uauy R. Copper as an essential nutrient I I Am. J. Clin. Nutr., 63 (5): 791S-6S, 1996;

84. Omoto E., Tavassoli M. Purification and partial characterization of ceruloplasmin receptors from rat liver endothelium I I Arch. Biochem. Biophys., 282 (1): 34-8,1990;

85. Owen C.A. Wilson's disease: The Etiology, Clinical aspects and Treatment of inhereted copper to toxicosis // N.N.: Noges publications, 1981,

86. Paparassioliou A.G. by ed. Transcription factors in eukaryotes // Springer-Verlay, Heidelberg, Germany, 1997;

87. Park K., Atchison M. Isolation of a candidate repressor/activator, NF-E1 (YY-1, delta), that binds to the immunoglobulin kappa 3' enhancer and the immunoglobulin heavy-chain mu El site // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(21): 9804 -9808,1991;

88. Patel B.N., David S. A novel glycosylphosphatidylinositol-anchored form of ceruloplasmin is expressed by mammalian astrocytes // J. Biol. Chem., 272: 20185-20190,1997;

89. Patel B.N., Dunn R.J., David S. Alternative RNA splicing generates a glycosylphosphatidylinositol-anchored form of ceruloplasmin in mammalian brain. // Ibid., 275: 4305-4310, 2000;

90. Репа М. О., Jaekwon, Thiele D.J. A Delicate Balance: Homeostatic Control of Copper Uptake and Distribution // J. Nutr., 129: 1251-1260,1999;

91. Prohaska J.R. Long-Term Functional Consequences of Malnutrition During Brain Development: Copper// Nutrition, 16: 502-504, 2000;

92. Prohaska J.R., Bailey W.R. Regional specificity in alterations of rat brain copper and catecholamines following perinatal copper deficiency // J. Neurochem, Oct., 63(4):1551-1557,1994;

93. Puchkova L., Zhivulko Т., Mishenko В. et all Copper nutrition and copper metabolism in rat newborns // Metal ions in biology and medicine. Paris: John Libbey Eurotext, 7: 447-457, 2002;

94. Puchkova L.V., Gaitskhoki V.S., Monakhov N.K., Timchenko L.T., Neifakh S.A. Preproceruloplasmin is a primary product of cell-free translation of ceruloplasmin messenger RNA // Mol. Cell. Biochem., 35 (1):159-169, 1981;

95. Qian Y., Tiffany-Castiglioni E., Harris E.D. A Menkes P-type ATPase involved in copper homeostasis in the central nervous system of rat // Mol. Brain Res., 48: 60-66,1997;

96. Rae T.D, Schmidt P.J., Pufahl R.A. et al., Undetectable intracellular free copper: the requirement of a copper chaperone for superoxide dismutase I I Science, 284: 805-808,1999;

97. Raju K.S., Alessandri G., Ziche M., Gullano P.M. Ceruloplasmin, copper ions, and angiogenesis //J. Natl. Cancer Inst., 69: 1183 — 1188,1982;

98. Rao M.R., Hediger M.L., Levin R.J., Naficy A.B., Vik T. Effect of breastfeeding on cognitive development of infants bom small for gestation age //Acta Pediatrica. 91 (3): 267-274, 2002;

99. Raught В., Khursheed В., Kazanshy A., Rosen J. YY1 represses beta-casein gene expression by preventing the formation of a lactation-associated complex // Mol. Cell. Biol., 14(3): 1752 1763,1994;

100. Ravin H.A. An improved calorimetric enzymatic assay of ceruloplasmin // J. Lab. Clin. Med., 58: 161-168, 1961;

101. Rayan A.K., Rosenfeld M.G. POU doamin family values: flexibility, partnership and developmental codes // Genes and Devel., 11: 1207-1225, 1997;

102. Reddy CM., Harris E.D. Multiple transcripts coding for the menkes gene: evidence for alternative splicing of Menkes mRNA // Biochem. J., 334: 7177,1998;

103. Reilly C.A., Aust S.D. Iron loading into ferritin by an intracellular ferroxidase//Arch. Biochem. Biophys., 1, 359(l):69-76, 1998;

104. Rhoads R.E. Ovalbumin messenger ribonucleic acid I I J. Biol. Chem., 255: 8088-8097,1975;

105. Ryan T.P., Grover T.A., Aust S.D. Rat ceruloplasmin: resistance to proteolysis and kinetic comparison with human ceruloplasmin // Arch. Biochem. Biophys., 293: 1-8, 1992;

106. Ryden L. Ceruloplasmin is a single peptide chain // Eur. J. Biochem., 26: 380-386,1972;

107. S.Salzer J., Lovejoy L., binder M.C., Rosen C. Ran-2, a glial lineage marker, is a GPI-anchored form of ceruloplasmin // J. Neurosci. Res., 54: 147 157, 1998;

108. Sambrook J., Fritch I.F., Maniatis T. Molecular cloning. Laboratory manual // N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press., 1991;

109. Sato M., Gitlin J.D. Mechanisms of copper incorporation during the biosynthesis of human ceruloplasmin // J. Biol. Chem., 266 (8): 5128-5134, 1991;

110. Schilsky M.L., Stockert R.J., Pollard R.J. Caeroplasmin biosynthesis by the human uterus // Biochem. J. 288: 657-661, 1992;

111. Schwartsman A.L., Gaitskhoki V.S., L'vov V.M., Nosikov V.V., Braga E.M., Frolova L.Y., Skobleva N.A., Kisselev L.L., Neifakh S.A. Complex molecular structure of the gene coding for rat ceruloplasmin // Gene, 11: 1-10,1980;

112. Seshadri V., Fox P.L., Mukhopadhyay C.K. Dual role of insulin in transcriptional regulation of the acute phase reactant ceruloplasmin // JBC Papers in Press, Published on May 23, as Manuscript M203610200, 2002;

113. Shi, L.-S., E. Seto, L. S. Chang, T. Shenk. Transcriptional repression by YY1, a human GLI-Kruppel-related protein, and relief of repression by adenovirus E1A protein // Cell, 67: 377-388,1991;

114. Shirvastava, A., K. Calame. An analysis of genes regulated by the multi-functiohal transcriptional regulator Yin Yang-1 // Nucleic Acid Res., 22: 5151-5155,1994;

115. Stevens M.D., DiSilvestro R.A., Harris E.D. Specific receptor for ceruloplasmin in membrane fragments from aortic and heart tissues // Biochemistry, 23: 261-266,1984;

116. TakahashiN., Ortel T.L., Putnam F.W. Single-chain structure of human ceruloplasmin: the complete amino acid sequence of the whole molecule // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 390-394, 1984;

117. Tavassoli M. Kishimoto Т., Kataoka M. // J Cell Biol., 102 (4): 1298,1986;

118. Theophilos M.B., Cox D.W., Mercer J.F. The toxic milk mouse is a murine model of Wilson disease // Hum. Mol. Genet., 5: 1619-1624,1996;

119. Thiele D.J. ACE1 regulates expression of the Saccharomyces cerevisiae metallothionein gene // Mol. Cell. Biol., 8 (7): 2745-2752,1988;

120. Thomas M. J:, Seto E. Unlocking the mechanisms of transcription factor YY1: are chromatin modifying enzymes the key? // Gene, 236: 197-208, 1999;

121. Tian L., Cai Q., Bowen R., Wei H. Effects of caloric restriction on age-related oxidative modifications of macromolecules and lymphocyte proliferation in rats // Free. Radic. Biol. Med., 19 (6): 859,1995;

122. Vasin A.V., Platonova N.A., Mistchenko B.S., Tcymbalenko N.V., Puchkova L. V. The application of computer methods for finding the role of the CP-like copper containing proteins in ferrous ion metabolism // SPIE Proceedings, 4707 (7): 323-332, 2002;

123. Verbina I.A., Puchkova L.V., Gaitskhoki VS., Neifakh S.A. Isolation and partial characterization of molecular forms of ceruloplasmin from human bile // FEBS Letters, 298:105-108,1992

124. Vulpe C.D., Kuo Y.M., Murphy T.L., Cowley L., Askwith C., Libina N., Gitschier J., Anderson G.J. Hephaestin, a ceruloplasmin homologue implicated in intestinal iron transport, is defective in the sla mouse I I Nat. Genet., 21(2): 195-9,1999;

125. Wang H., Koschinsky M., Hamerton J.L. Localization of processed gene for human ceruloplasmin to chromosome region 8q21.13-q23.1 by in situ hybridization // Cytogenet. Cell Genet., 47: 230-231,1988;

126. Weiss K.C., binder M.C. Copper transport in rats involving a new plasma protein // Am. J. Physiol., 249: E327-333, 1985;

127. Winge D.R. Copper-regulatory domain involved in gene expression // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 58; 165-195,1998;

128. Wingender, E., Chen, X., Hehl, R., Karas, H., Liebich, L, Matys, V., Meinhardt, Т., Prtifi, M; Reuter, L, F. Schacherer. TRANSFAC: an integrated system for gene expression regulation // Nucleic Acids Res. 28: 316-319, 2000;

129. WootenL., Shulze R.A., Lancey R.W. et al. Ceruloplasmin is found in milk and amniotic fluid and may have a nutritional role // J. Nutr. Biochem., 7: 632-639,1996;

130. Yang F., Freidrichs W.E., Cupples R.L., Bonifacio M.J., Sanford J. A., Horton W.A., Bowman B.H. Human ceruloplasmin. Tissue-specific expression of transcripts produced by alternative splicing // J. Biol. Chem. 265 (18): 10780-10785,1990;

131. Zaitseva, I., Zaitsev V., Card G., Moshkov К., Bax В., Ralph A., Lindley P. The nature of the copper centers in human ceruloplasmin // J. Biol. Inorg. Chem., 1 (l):15-22,1996;

132. Авцын А.П., Жаворонков А. А., Риги M.A., Строчкова Л.С. Микроэлементозы человека // М.: Медицина, 1991;

133. Б.Альберте, Д.Брей, Дж.Лъюис и др. Молекулярная биология клетки 2: 178-191 //М.:Мир,1994;

134. Васильев В.Б., Шавловский М.М., Нейфах С.А., Прозоровский В.А. Внутримолекулярная гомология церулоплазмина // Биоорг. химия 5: 1045-1052,1979;

135. Воронина О.В., Гайгрсоки B.C., Монахов Н.К., Пучковая Л.В., Щварцман А.Л. Молекулярные механизмы регулирования синтеза церулоплазмина под действием эстрадиола // Мол.биол., 15( I): 199-207,1981;

136. Гайгрсоки В. С., Воронина О.В., Денежкина В.В., Плисс М.Г., Пучкова Л.В., Шварцман А.Л., Нейфах С.А. Экспрессия гена церулоплазмина в различных органах крысы // Биохимия, 55 (5): 927-937, 1990;

137. Захарова Е.Т. Структурно-аналитическое исследование церулоплазмина белых крыс // Авт. канд. дис. ИЭМ, JL, 1985;

138. Калинин В.Л. Транскрипция и регуляции экспрессии генов. // Изд. СПбГТУ, Санкт-Петербург, 2001;

139. Карас X., Кель А.Э., Кель О.В., Колчанов Н.А., Вингендер Э. Интеграция знаний по транскрипционной регуляции генов эукариот на основе объединения баз данных TRANSFAC, TRRD и COMPEL // Мол. Биология, 31(4): 637-646, 1997;

140. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии // М., Высшая Школа, 1980;

141. Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // М.: Мир, 1984;

142. Мокшина С.В. Роль церулоплазмина молока как источника ионов меди для новорожденных // Канд. дис. ИЭМ, СПб, 1998;

143. Нейфах С. А., Васильев В.Б., Шавловский М.М. Строение, каталитические свойства и эволюция церулоплазмина и других голубых белков // Успехи биол. химии, 23: 102-124^ 1988;

144. Платонова Н.А., Жигулева Э.А., Цымбаленко Н.В., Мищенко Б.С., Васин А.В., Живулъко Т.В., Пучкова JI.B. Биосинтез и распределение церулоплазмина в организме крыс при эмбриональном типе метаболизма меди // Онтогенез, 35(5), 2004;

145. Пучкова JI.B., Алейникова Т.Д., Вербина И.А., Захарова Е.Т., Плисс М.Г., Гайгрсоки B.C. Биосинтез двух молекулярных форм церулоплазмина в печени крысы и их полярная секреция в кровоток и в желчь // Биохимия 58 (12): 1893-1900,1993;

146. Пучкова JI.B., Алейникова Т.Д., Захарова Е.Т., Цымбаленко Н.В., Конописцева JI.K, Гайгрсоки B.C. Экспрессия гена церулоплазмина в онтогенезе у крыс // Биохимия, 59 (9): 963-973, 19946;

147. Пучкова JI.B., Алейникова Т.Д., Захарова Е.Т., Цымбаленко Н.В., Ширманова М.Р., Гайгрсоки B.C. Содержание церулоплазмина какисточника меди в грудном молоке в разные сроки лактации // Вопросы питания, 4: 19-22,1997а;

148. Пучкова Л.В., Алейникова Т.Д., Цымбаленко Н.В., Захарова Е.Т., Конописцева JI.A., Чеботарь И.А., Гащхоки B.C. Биосинтез и секреция церулоплазмина клетками молочной железы в период лактации //Биохимия, 59 (2): 341-348, 1994а;

149. Пучкова Л.В., Вербина И.А., Гащхоки B.C., Нейфах С. А. Взаимодействие молекулярных форм церулоплазмина со специфическим рецептором мембран эритроцитов здоровых людей и больных гепатолентикулярной дегенерацией // Биохимия, 56 (12): 22612269, 1991а;

150. Пучкова Л.В., Вербина И.А., Денежкина В.В., Гащхоки B.C., Нейфах С.А. Молекулярные дефекты выведения меди через желчь у больных гепатолентикулярной дегенерацией // Биополимеры и клетка, 7 (3): 2430,1991;

151. Пучкова Л.В., Вербина НА., Денежкина В.В., Шавловский М.М., Гащхоки B.C., Нейфах С.А. Некоторые свойства рецептора церулоплазмина, выделенного из мембран; эритроцитов человека // Биохимия, 55 (12): 2182-2189,1990;

152. Пучкова JI.B., Платонова Н.А. Механизм, обеспечивающий гомеостаз меди у эукариотов, и его связь с транспортом железа // Успехи современной биологии, 123 (1): 41-58, 2003;

153. Пучкова JI.B., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д., Гайцхоки B.C. Внутриклеточный церулоплазминоподобный белок млекопитающих // Бюл. эксперим. биол. и мед., 1: 83-85, 1994;

154. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии // Изд. СПбГТУ, Санкт-Петербург, 1999;

155. Саминский Е.М. Трансляция генетического кода на рибосомах // Изд. СПбГТУ, Санкт-Петербург, 2000;

156. Сасина Л.К., Цымбаленко Н.В., Платонова НА., Пучкова Л.В., Воронина О.В., Гюлиханданова Н.Е., Гайцхоки B.C. Выделение и частичная характеристика клона кДНК рецептора церулоплазмина человека // Бюлл. эксп. биол. и мед, 129 (5): 578, 2000;

157. Сингер М., Берг П. Гены и геномы // М., Мир, 1998;

158. Справочник педиатра И под ред. Студеникина М.Я., JL: "Медицина", 1980;

159. Шварцман АЛ., Воронина О.В., Гайцхоки B.C., Паткин Е.Л. Экспрессия гена церулоплазмина в органах млекопитающих по данным гибридизационного анализа с комплементарными ДНК-зондами // Мол. биология, 3: 657-662,1990;

Информация о работе

Гюлиханданова, Наталия Евгеньевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гюлиханданова, Наталия Евгеньевна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гюлиханданова, Наталия Евгеньевна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гюлиханданова, Наталия Евгеньевна, Санкт-Петербург

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Регуляция экспрессии гена церулоплазмина в клетках молочной железы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия