Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль церулоплазмина молока как источника ионов меди для новорожденных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль церулоплазмина молока как источника ионов меди для новорожденных"

и

На правах рукописи

Мокшина Светлана Васильевна

РОЛЬ ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА МОЛОКА КАК ИСТОЧНИКА ИОНОВ МЕДИ ДЛЯ НОВОРОЖДЕННЫХ

03.00.04 - биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998 г.

-

российская академия медицинских наук

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор - академик Б.И. Ткаченко) и на кафедре экологии и инженерной защиты окружающей среды на химических предприятиях факультета технологии веществ и материалов Северо-Западного заочного политехнического института Министерства высшего и профессионального образования Российской Федерации (ректор - док. тех. наук, проф. В.В. Турецкий)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Людмила Валентиновна Пучкова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Александр Дорофеевич Денисенко

доктор медицинских наук, профессор Олег Александрович Розенберг

Ведущее научное учреждение - Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова

Защита состоится "21" декабря в.............часов на заседании Диссертационного

совета по защите кандидатских диссертаций К001.23.01 при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу: 193376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН (по адресу: 193376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12.)

Автореферат разослан 21 ноября 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета К001.23.01

доктор биологических наук

Куликова О.Г.

1. общая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Ионы меди входят в состав активных центров жизненно важных ферментов и необходимы млекопитающим в течение всего индивидуального развития. Конфликт между незаменимостью ионов меди для организма и их высокой токсичностью разрешается с помощью специальной системы белков, которые осуществляют перенос ионов меди по каналам межклеточной коммуникации, их транспорт через мембранные барьеры, распределение в клетках и экскрецию. Разнообразные генные мутации, нарушающие функционирование этих белков (врожденные ошибки метаболизма меди), приводят к избыточному накоплению ионов меди в клетках различных органов, или к дефициту ферментов, содержащих медь. Как дефицит, так избыток ионов меди, вызванные экологическими факторами, приводят к развитию заболеваний, которые фенотипически сходны с врожденными ошибками метаболизма меди. Доля этих (наследственных и приобретенных) заболеваний, которые получили название "медь-зависимые микроэлементозы", растет во всех странах мира. Особенно тяжелые нарушения функционирования печени, мозга и почек вызывает дисбаланс ионов меди в рационе новорожденных млекопитающих в период молочного вскармливания, когда еще сохраняется эмбриональный тип метаболизма меди, при котором медь не выводится из организма, а накапливается в печени. Молекулярно-генетические механизмы, контролирующие содержание меди в рационе новорожденного и смену типов метаболизма меди в онтогенезе, не известны. Реальные предпосылки для таких исследований созданы, в частности, работами Отдела молекулярной генетики НИИЭМ РАМН (Шавловский и др., 1994; Пучкова и др., 1994), в которых, с одной стороны, показано, что на всех этапах эмбрионального развития источником ионов меди для зародыша является церулоплазмин матери (ЦП, КФ 1.16.31.1, медьтранспортный гликопротеин крови). С другой - обнаружено, что в молоке (единственном естественном источнике ионов меди для новорожденного) содержится ЦП, который синтезируется в клетках молочной железы. Эти данные позволяют надеяться, что изучение роли ЦП молока как источника ионов меди для новорожденных будет способствовать пониманию особенностей эмбрионального типа метаболизма меди и открытию механизма, который обеспечивает контроль за уровнем меди в рационе новорожденного. В дальнейшем эти данные могут стать основой для научно-обоснованных рекомендаций по содержанию ионов меди и их молекулярной "упаковке" в молочных смесях для новорожденных.

ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ: 1) изучение соотношения содержания ЦП и ионов меди в молоке в разные сроки лактации; 2) сравнение физико-химических свойств двух тканеспецифических молекулярных форм ЦП: ЦП крови и ЦП молока; 3) изучение распределения пептидной части молекулы ЦП молока в организме крысят с эмбриональным и взрослым типами метаболизма меди.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: 1). Измерить энзиматическим и иммунологическим методам динамику содержания ЦП в молоке в течение первого месяца лактации, определи! концентрацию ионов меди в этих же образцах молока и оценить молярные соотношения Ц и меди в молоке одного срока лактации.

2). Сравнить препараты ЦП молока и крови по мол. массе, составу углеводных uenei элекгрофоретической подвижности, чувствительности к хелатирующим и денатурирующи агентам.

3). Изучить динамику распределения радиоиодированной пептидной части ЦП грудног молока в организме крысят. Параллельно у крысят тех же возрастов методо иммуноблотинга изучить тканеспецифический профиль экспрессии гена рецептора ЦП сопоставить данные полученные в обоих типах экспериментов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ, представленных в работе состоит в следующе) Получены доказательства, что все ионы меди в молоке первого месяца лактации входят состав тканеспецифического ЦП (ЦП молока). Содержание ЦП в молоке и, следователь™ ионов меди в рационе новорожденного, поддерживается постоянным снижением уровь экспрессии гена ЦП в клетках молочной железы по мере увеличения объема молок производимого ею (примерно 10 мкг на кг тела ребенка). Помимо этого показано, чт препарат ЦП молока содержит десиалированные формы ЦП, он чувствительнее, чем Ц крови, к хелатирующим агентам, но более устойчив к спонтанной протеолитическо деградации. В экспериментах типа "чейз", в которых использовали элекгрофорегическ чистый препарат [1251]ЦП грудного молока, продемонстрировано, что пептидная часть Щ введенного per os в желудочно-кишечный тракт крысят с эмбриональным типо метаболизма меди, без изменений переносится в кровоток, тканеспецифично распределяет! по органам, утрачивает ионы меди (переходит в форму апоЦП) и выделяется через желчь виде низкомолекулярных [1251]дериватов. У крысят со взрослым типом метаболизма мед [1251]ЦП молока расщепляется в пищеварительном тракте. Во фракции плазматическ» мембран, выделенных методом флотационного центрифугирования из клеток сердца, поче эритроцитов, легких и селезенки крысят, рецептор ЦП обнаружен при обоих тип! метаболизма меди. По данным иммуноблотинга экспрессия гена рецептора ЦП существен!; изменялась в зависимости от типа метаболизма меди только в трех органах. Так, пр эмбриональном типе метаболизма меди рЦП обнаружен в печени и в клетках слизистс желудка, но не найден в клетках мозга. После смены типа метаболизма меди, напроти содержание рецептора ЦП снижается в печени, он появляется на мембране клеток мозга и 1 выявляется в клетках слизистой желудка.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Теоретическое значение работы заключается расширении представлений о функционировании белков, поддерживающих баланс ион< меди у новорожденных, и особенностях тканеспецифической экспрессии их гено Установлена роль ЦП молока как единственного источника ионов меди ш

эворожденного. При этом выявлены три важных аспекта. Во-первых, содержание ионов еди в пище новорожденного строго контролируется путем регуляции активности гена ЦП клетках молочной железы матери, что косвенно, но убедительно, свидетельствует о 1жном значении баланса меди в рационе новорожденного. Во-вторых, ЦП молока на фоне «кого содержания ЦП в крови при эмбриональном типе метаболизма меди, выполняет >ль транспортера меди для клеток внепеченочных органов новорожденных. В-третьих, при >удном вскармливании молекулярно-клеточные механизмы предотвращают поступление энов меди из кровотока в клетки мозга. В целом результаты показывают, что в период эворожденносги метаболизм меди у млекопитающих адаптирован к получению ионов еди, связанных с молекулой ЦП молока. Полученная информация выявляет причинно-1едственную связь между сохранением эмбрионального типа метаболизма меди в течение олочного вскармливания и молекулярной формой ионов меди в пище новорожденного в ■от период. Это заставляет по-новому взглянуть на выбор стратегии вскармливания )ворожденных. Так, опираясь на полученные данные^ следует широко развернуть эопаганду в пользу грудного вскармливания детей, так как молочные смеси не 5еспечивают баланс ионов меди в рационе. С другой стороны, молоко матерей, у которых клетках молочной железы нарушены репрессия гена ЦП, или метаболическое включение знов меди в молекулу ЦП, может быть токсичным, как, например, молоко гомозиготных ышей линии toxic milk. Поэтому своевременно поднять вопрос об измерении содержания П и ионов меди в молоке женщин группы риска (различные хронические печеночные и урологические заболевания в семье). Необходимо также на уровне ВОЗ добиваться, чтобы (держание меди и их молекулярная "упаковка" в молочных смесях соответствовали |менению этих показателей в грудном молоке в течение лактации. Это составляет зактическое значение представляемого исследования.

ОРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследования доложены на: XXXIII Международном шгрессе физиологических наук в Санкт-Петербурге 30 июня- 5 июля 1997 г., Международной школе по биологии и медицине для молодых ученых (Берлин, октябрь *97), Первой медико-биологической конференции молодых ученых Санкт-Петербурга оябрь 1997), Второй Санкт-Петербургской ассамблеи молодых ученых и специалистов екабрь 1997), XIV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-етербург, май 1998), на Международном симпозиуме по структуре, стабильности и элдингу белков (Москва, июнь 1998 г.), Международной конференции "Рецепция и гутриклеточная сигнализация" (Пущино, сентябрь, 1998), на конференции молодых ученых >ссии с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической гдицины", (Москва, апрель, 1998, устное сообщение, отмечено премией), Международной >нференции по медицине для молодых ученых (Люблин, Польша, апрель 1998 г.), а также i научно-практических конференциях, посвященных проблемам экологии и здоровью

нового поколения и проходивших в Санкт-Петербурге под эгидой международн1 организаций ЮНЕСКО, МАНЕБ и ЭкоБалтика весной-летом 1998 г. положения, выносимые на защиту

1. Все ионы меди, содержащиеся в молоке в первый месяц лактации, входят в состав L молока.

2. ЦП молока отличается от ЦП крови по ряду физико-химических свойств.

3. При эмбриональном типе метаболизма меди ЦП молока из желудочно-кишечного трак переносится в кровоток новорожденного и избирательно поглощается различньн органами, которые освобождают его в кровоток в форме апо-ЦП.

структура и объем рукописи диссертации Работа изложена на страниц;

содержит Ж. рисунков, таблиц и состоит из следующих глав: Введение, Обз литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы. Спис цитированной литературы содержит .1.^.9.. источников на русском и английском языках. 2. материалы и методы исследования

В работе использованы 126 образцов грудного молока разного срока лактащ предоставленные здоровыми женщинами. Помимо этого работа выполнялась на бел] лабораторных беспородных крысятах различного возраста, которые родились в вивар НИИЭМ РАМН. В работе использованы раствор кристаллов ЦП человека, 140 мг/i (Абм\28о=0,0045), произведенный в Институте микробиологии и эпидемиологии им. Пасте] Санкт-Петербург (Россия) по технологии, разработанной в Отделе молекулярной генети НИИЭМ РАМН, Санкт-Петербург (Россия), кроличьи антитела к этому препарату I получены М.М. Шавловским (1974), и антитела к рецептору ЦП человека, выделенные охарактеризованные ранее Л.В. Пучковой и др. (1991). В работе также использованы N',1 нейраминидаза, агароза тип V, реактивы для электрофореза, АТР, уабаин, хромогенн! субстрат для пероксидазы, орто-дианизидин, пара-фенилендиамин фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) - фирмы "Sigma", США. Все неорганические сол фирмы "Merck", Германия. Нитроцеллюлозные мембраны, диаметр пор 0,45 мкм, - фир! "Schlicher and Schull", Германия. Вторые антитела, произведенные Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва (Россия), и вторые антите. конъюгированные с пероксидазой, которые произведены в Институте вакцин и сыворот< Санкт-Петербург (Россия). [I25I]Na (30 мКи/мл) получен из Российского Научного ценп "Прикладная химия", Санкт-Петербург. Рентгеновская пленка типа РМ производсп "Свема", Украина.

Измерение уровня ЦП проводили в снятом молоке - растворимая фракция моло которую получали центрифугированием 15000 об/мин в течение 30 мин. Общую оксидазн; активность определяли по методу Рэвина (1956). Содержание ЦП определяли в этих образцах методом ракетного количественного иммуноэлектрофореза человека (Laurell, 19< с антителами к ЦП крови, в качестве стандарта использовали коммерческий препарат Ц

концентрацию меди измеряли методом атомно-абсорбционной спектральной пектрометрии с электротермической атомизацией и Зеемановской коррекцией еселективного поглощения на спектрометре фирмы Perkin-Elmer Model 4100ZL. ЦП молока ыделяли из фракции снятого молока сочетанием методов ионообменной и аффинной роматографии на колонках с ДЭАЭ-сефарозой и пара-фенилендиамин-сефароза 2В, оответственно (Пучкова Л.В. и др., 1998).

крысятам различного возраста после голодания вводили per os [1г51]ЦП грудного молока удельная радиоактивность 1010е имп мин"1мкг"1). Введение производили с помощью ластичного зонда в расчете примерно 5 • 106 имп/мин на 1 г веса тела. В качестве балластных елков использовали фракцию снятого молока, истощенную хроматографией на ДЭАЭ-ефарозе (фракция не содержит ЦП). Объем вводимой порции, вместе с балластными елками, составлял примерно 0,15 мл. Через различные интервалы времени периферическую ровь собирали из сосудов шеи, органы взвешивали и определяли в них радиоактивность на сидкостно-сцинтилляционном счетчике "RackBeta", Швеция. Относительную способность ргана накапливать [1231]ЦП молока принимали как отношение радиоактивности (имп/мин) 1 г органа к введенной радиоактивности (имп/мин), приходящейся на 1 г веса тела. Спазматические мембраны выделяли из гомогената клеток, приготовленного в 10-кратном бьем 1 мМ раствора бикарбоната натрия, содержащего 0,1 мМ ФМСФ, рН7,5, по методу ievill&Kahn (1974). Нахождение фракции плазматических мембран устанавливали по богащению уабаин-чувствительной Na*,К*-активируемой Mg^-зависимой АТРазы, ермента-маркера плазматической мембраны. Мембраны эритроцитов выделяли после азрушения клеток гипотоническим шоком.

лектрофорез в не денатурирующих условиях проводили в 7,5% полиакриламидном геле 1ААГ) в прерывистой системе рН. Электрофорез в денатурирующих условиях - по методу aemlli (1970). Гели высушивали и радиоавтографировали. Перенос осуществляли олусухим методом. После связывания с антителами к рецептору ЦП человека иммунный эмплекс выявляли с помощью вторых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена ли [1251]радиоиодированных в присутствии хлорамина Т. Содержание общего белка, в 1висимости от задачи, определяли биуретовым методом, по методу Лоури или по эмограмме соотношений поглощения А260/280 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

астоящее исследование посвящено изучению роли ЦП грудного молока в метаболизме еди в различные периоды онтогенеза у млекопитающих и состоит из трех частей. Первая 1сть включает изучение содержания ЦП в молоке в течение первого месяца лактации, горая - содержит сведения о выделении высокоочищенного препарата ЦП молока и гзультаты сравнительного анализа его и ЦП крови. В третьем разделе главы представлены яультаты изучения распределения пептидной части [12!1]ЦП грудного молока в организме зысят с эмбриональным и взрослым типами метаболизма меди.

3.1. Изменение содержания ЦП и ионов меди в молоке в течение первого месяц| лактации. В 126 образцах снятого молока, главным образом первого месяца лактации были определены 1) оксидазная активность методом Рзвина, который основан на окислени! пара-фенилендиамина ионами меди, содержащимися в молоке, в том числе входящими молекулу ЦП и 2) содержание ЦП методом количественного ракетноп иммуноэлектрофореза. Было обнаружено, что содержание ЦП по данным оксидазно! активности снижается почти в 5 раз, а по данным ракетного иммуноэлектрофореза - более чем в 8 раз. Так как возможно, что снижение содержания ЦП является лишь результато! пропорционального снижения содержания общего белка в молоке, которое происходит пр его созревании (молозиво - переходное молоко - зрелое молоко), в каждом образце молок биуретовым методом был измерен общий белок и данные содержания ЦП был пересчитаны на мг общего белка. Результаты 96 определений, представленные на рис. 1 показывают, что доля оксидазного ЦП в составе белков сыворотки молока стремительн снижается в течение первой недели лактации. Через шесть, и более месяцев лактации, молоке обнаруживаются лишь следы оксидазной активности. Динамика изменени содержания иммунореактивного ЦП коррелирует со снижением оксидазного ЦП Данны позволяют считать, что в течение лактации, как результат снижения активности гена ЦП клетках молочной железы ((НШп е1 а1., 1991; Пучкова и др., 1994), в молоке избирательн снижается доля ЦП. При этом обращает на себя внимание, что содержание ЦП по данны оксидазной активности снижается медленнее, чем содержание иммунореактивного ЦП. Эт может возникать в результате перечисленных ниже, а также других, причин: 1) в молок ионы меди находятся не только в ЦП, 2) молекула ЦП молока содержит больше атоме меди, чем молекула ЦП крови (теоретически на поверхности глобулы ЦП содержатс семнадцать мест для связывания ионов меди); 3) ЦП молока иммунологически I-полностью идентичен ЦП крови, антитела к которому использованы в работе, поэтсл определяется не точное содержание белка ЦП, а некоторая относительная величина; < удельная оксидазная активность ЦП молока выше, чем соответствующая величина для Ц крови; 5) ЦП молока представляет собой смесь молекулярных форм ЦП, отличающихся др> от друга по иммунологическим свойствам и содержанию ионов меди на молекул соотношение между которыми меняется в течение лактации.

Часть выдвинутых предположений была проверена в следующих экспериментах. В( первых, оксидазная активность была измерена в образцах молока, которые бьи подвергнуты диализу против 500-кратного объема 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5, в течение ночи. Данные этого опыта показали, что диализ не влияет на оксидазну активность молока. Следовательно, в молоке все ионы меди связаны с высокомолекулярнс фракцией. Природа этой белковой фракции была установлена методом электрофоре образцов молока в 7,5% ПААГ в неденатурирующих условиях (рис. 2). На рис. видно, что молоке содержится белок, окрашивающийся, как и ЦП крови, хромогенным, специфичен

Рис. 1. Изменение содержания ЦП в молоке в течение лактации.

А- содержание ЦП по данным оксидазной активности, мкг/мг общего белка;

Б - содержание ЦП по данным количественного иммуноэлектрофореза, мкг/мг общего белка,

по оси абсцисс: время лактации, сутки, по оси ординат: содержание ЦП.

т т

Рис. 2. Электрофорез образцов молока в разные сроки лактации. Гель окрашен орто-дианизидином. А - дорожки 1-5: образцы молока 2-го, 3-го, 4-го, 5-го и 6-го дней лактации женщины Н., дорожка 6: сыворотка крови этой же женщины; Б - дорожки 8-12: образцы молока 2-го, 3-го, 4-го, 5-го и 6-го дней лактации женщины М., дорожка 13: сыворотка крови этой же женщины; В -дорожки 1 и 2: сыворотка крови и молоко на 3 день лактации женщины Р; дорожки 3-5: молоко женщины Т. 3-го, 2-го и 4-го дней лактации, соответственно; С -дорожки 2-5: образцы молока 5-го, 4-го, 3-го, 2-го дней лактации женщины У, соответственно, дорожка 1: сыворотка крови женщины У.

для ЦП, субстратом - орто-дианизидином. Скорость миграции этого белка в электрическо поле связана со степенью зрелости молока. В молозиве вообще отсутствует зон соответствующая ЦП крови, однако, уже к 4-ому дню лактации в молоке появляется беле по скорости миграции полностью совпадающий с подвижностью ЦП крови Медленн мигрирующие зоны исчезают. На основании этих результатов можно заключить, что молоке нет других белков, кроме ЦП, обладающих оксидазной активностью. Низы скорость миграции ЦП в молозиве может иметь несколько объяснений. Возможно, что эт лишь эффект, наблюдаемый вследствие очень высокой концентрации белков и липидов молозиве. Нельзя исключить также, что в молозиве из-за нагруженности ионами мед изменяется общий заряд молекулы ЦП. Одно можно сказать с достоверностью - ЦП I связан в какие либо специфические комплексы в молоке, так как может бьггь очище методами ионообменной хроматографии (см. ниже). Определение концентрации ионов мел в молоке 3-го, 5-го и 20-го дней лактации (образцы молока получены у каждой из женщин три срока лактации, г. Каменец-Подольск, Украина) методом атомно-абсорбционнс спектрометрии и параллельное измерение оксидазной активности в этих образцах моло! позволили рассчитать содержание атомов меди в молекуле ЦП молока (табл. 1). Даннь демонстрируют, что общая концентрация ионов меди в молоке разных женщин уменьшаете пропорционально снижению ЦП, Расчеты, произведенные на основе полученных данньг показывают, что молекула ЦП незрелого молока содержит семь атомов меди. Результат хорошо согласуются с известными данными, что молекула ЦП крови содержит семь атоме меди, шесть из которых включены в 4 активных центра, а седьмой атом меди локализовг на поверхности глобулы ЦП и специфически связан с 426НЬ.

Табл. 1.

Изменение содержания ЦП и ионов меди в молоке в течение лактации.

День после начала лактации Содержание ЦП Концентрация меди, мкг/л Количество атом< меди в 1 молекуле ЦТ

оксидазная активность, мг/100 мл антигенная активность, мг/100 мл

3-й(10)* 12+5,8 10,9+4,8 311+116(7)* 6,9

5-й(10)* 8,0+4,7 7,3 5+0,5 173+50 (8)* 6,8

20-й (10)* 3,1+0,85 1,59+0,15 67+35 (7)* 5,8

* - количество измерений

1риведенные данные и расчеты показывают, что молоко первого месяца лактации содержит гоны меди и тканеспецифический ЦП в эквимолярных соотношениях. Это означает, что все юны меди в молоке первого месяца лактации ассоциированы с ЦП. Наиболее ущественным является то, что объем молока, потребляемого новорожденным, в первые 20 ,ней жизни увеличивается примерно в 6 раз. При этом содержание ЦП и, соответственно, онцентрация ионов меди снижается примерно на столько же. Благодаря этому юворожденный потребляет примерно одинаковое количество меди на кг веса тела (рис.3). Нот принцип грубо нарушается при искусственном вскармливании. На этом же рисунке :риведено количество ионов меди в пище новорожденного при питании смесями, екомендованными от нулевого возраста. Видно, что новорожденный получает шогократный избыток меди.

)сновным результатом этой части работы является выявление факта, что ЦП молока -динственный источник ионов меди в неонатальном периоде, который, к тому же, является )акгором, контролирующим содержание ионов меди в рационе новорожденного. .2. Выделение и сравнительная характеристика церулоплазминов молока и крови. 1з крови, взятой сразу после родов, и молока на 4-ый день лактации одной и той же ациентки были выделены частично (ДЭАЭ-связывающаяся фракция) очищенные [репараты ЦП грудного молока и ЦП сыворотки крови, которые использовали для равнительного изучения этих двух белков. В обоих препарата при электрофорезе в ПААГ в [еденатурирующих условиях церулоплазмины выявлялись при окрашивании орто-ианизидином как единственные, идентичные по подвижности, белковые зоны. 1сследование было проведено методом двумерного иммуноэлектрофореза с «пользованием хелатирующего агента и набора аффинных лектинов. Образец ЦП крови :ри анализе методом двумерного иммуноэлектрофореза с поликлональными юновалентными антителами к ЦП крови распределяется в виде почти гомогенного авноплечного пика (рис. 4 А). Фракция апо-ЦП, составляющая незначительную часть репарата ЦП крови и выявляемая при электрофорезе в ПААГ, лишь слегка изменяет еометрию авангардного плеча ЦП молока, в отличие от ЦП крови, при двумерном ммуноэлектрофорезе разделяется на три четко различимые зоны: основной пик X, бгоняющую зону У и плечо основного пика - зону 2, (рис. 4 В). В препарате ЦП крови осле обработки хелатирующим агентом появляется ЭДТА-индуцированная обгоняющая она - апо-ЦП. В препарате ЦП молока обработка ЭДТА не вызывает появления нового ика, но значительно увеличивает площадь пика У, при этом плечо Ъ проявляется тчетливее. Представленные данные демонстрируют молекулярную микрогетерогенность репарата ЦП молока, которая, возможно, частично обусловлена присутствием в нем голекул ЦП с разным количеством ионов меди, приходящихся на молекулу, и/или рисугствием в молекуле ЦП молока слабо ассоциированных атомов меди. В пользу редположения, что в ЦП молока атомы меди упакованы иначе, чем в ЦП крови,

Рис. 3. Гистограмма потребления ионов меди новорожденным в первые 20 дней жизни. А- при грудном вскармливании, В и С -при вскармливании молочными смесями. Ось X - возраст новорожденного, дни; ось Ъ -■ содержание меди, мкг.

В.

Л

У

л

Х V А

р А

«М

х

>—. .. I -

а*

' Л

Рис. 4 Молекулярная микрогетерогенность ЦП молока, выявляемая методом двумерного иммуноэлектрофореза .В - препарат ЦП молока, А - препарат ЦП крови. Панели: а - без обработки; в - обработка ЭДТА, с - ЛШТ; с! - Л ГШ*; е - обработка конканавалином А.

:видетельствует, с одной стороны, отсутствие в препарате ЦП молока апо-ЦП, а с другой -:го высокая чувствительность к ЭДТА. Следует также отметить, что процедура диализа не )лияет на иммуноэлектрофоретические профили обоих ЦП.

Для сравнительного анализа состава углеводных цепей обоих ЦП были использованы 1ектины из проростков пшеницы и семян канавалии. На рис, 4, видно, что профили ;вумерного иммуноэлектрофореза ЦП крови, как не связавшегося с JllllI, так и (ытесняемого из комплекса N-ацетилглюкозамином, не отличаются друг от друга. С сонканавалином А ЦП крови также взаимодействует как гомогенный препарат. После :вязывания с конканавалином А подвижность всего препарата ЦП крови значительно [амедляется. Напротив, ЦП молока обнаруживает значительную молекулярную ■ткрогетерогенность (рис. 4). Видно, что с ЛПП взаимодействует только плечо Z (об этом -южно судить по исчезновению зоны Z во фракции ЦП, не связавшегося с ЛПП). ЦП, :осредотачивающийся в зоне Z, также избирательно взаимодействует и с конканавалином А. ia рис. 4 видно, что после связывания с конканавалином А относительное положение зон X i Y не изменяется по сравнению с нативным ЦП молока, а плечо Z из лидирующего ггановится отстающим. Проведенные исследования позволяют заключить, что в препарате .Щ молока, содержатся несколько молекулярных форм ЦП, которые отличаются друг от ipyra по количеству ионов меди на молекулу и по составу углеводных цепей. Такие же >езультаты были получены на нефракционированных образцах крови и молока двух других кенщин. Это, с одной стороны, свидетельствует об универсальности наблюдаемой ■канеспецифической гетерогенности ЦП молока, а, с другой - свидетельствует о том, что все юлеку лярные формы ЦП молока связываются с ДЭАЭ-сефарозой. Возможно, что юлекулярная микрогетерогенность препарата ЦП молока связана с различными функциями, ;оторые выполняет ЦП молока в организме новорожденного, принимая участие в «егаболизме меди. Проверка этого предположения. В первую очередь, нуждается в 1ысокочищенном препарате ЦП молока, который может, после радиомечения, быть [спользован для изучения распределения в организме новорожденных.

Высокоочищенный препарат ЦП молока был выделен при сочетании методов юнообменной и аффинной хроматографии. Электрофоретический анализ выделенного [репарата ЦП молока показал, что он мигрирует как единственная зона, которая проявляет ксидазные свойства и связывается с антителами к ЦП крови (рис. 5). В этих же условиях ¡репарат ЦП крови мигрирует двумя зонами (рис. 5). Обе зоны связываются с антителами к Ц1 крови, но только одна проявляет оксидазные свойства. Зона мигрирующая с более ысокой скоростью является апо-ЦП (Puchkova et al., 1991). Обращает на себя внимание, что [П молока, мигрирует немного медленнее, чем ЦП крови (рис. 5). Ко-электрофорез ЦП голока и крови подтверждает это наблюдение. Известно, что асиалированный ЦП при лектрофорезе мигрирует медленнее, чем нативный ЦП. На рис. 5 видно, что после бработки обоих препаратов ЦП нейраминидазой их электрофоретическая подвижность

изменяется, и в большей степени у ЦП крови. Он мигрирует широкой диффузной зоно{| проявляющей тенденцию к отставанию от нативного ЦП. Полученные данны подтверждают результаты, полученные в опытах по связыванию ЦП молока с лектинами, ] позволяют заключить, что ЦП крови и молока отличаются друг от друга по количеств; остатков сиаловой кислоты в углеводных цепях.

Известно, что препарат ЦП крови, дающий при нативном электрофорезе в ПАА1 единственную белковую зону, при электрофорезе в денатурирующих условиях образуе воспроизводимый набор полипептидов с молекулярной массой от полноразмерно] молекулы (132 кДа) до полипептида с молекулярной массой 19 кДа. Все полипептщц взаимодействуют с антителами к ЦП. Наборы образуемых полипептидов зависят от срока ] условий хранения препарата ЦП, а также различаются у разных видов млекопитающих, I данном исследовании препараты ЦП крови и молока, выделенные одновременно : хранившиеся в одинаковых условиях, были подвергнуты электрофорезу в ПААГ присутствии ДДС-№ и иммуноблотингу. На рис. 6 видно, что ЦП крови распадается на ря иммунореактивных полипептидов с молекулярной массой от 110 до 19 кДа. В тех ж условиях ЦП молока обнаруживает значительную устойчивость к протеолизу. Таи основным компонентом как свежевыделенного, так и хранившегося в течение месяц препарата ЦП молока, лишь часть молекул расщепляется на два полипептида молекулярной массой 110 и 19 кДа. Обнаруженные существенные структурные различи между ЦП крови и ЦП молока дополнительно поддерживают предположение об участии Ц1 молока в метаболизме меди у новорожденных млекопитающих в тот период, когд экскреция меди через желчь еще не началась.

Взятые вместе факты: синтез самостоятельной молекулярной формы ЦП в клетка молочной железы (Пучкова и др., 1994), снижение активности гена ЦП в молочной желез после начала лактации (Ш1т И а1., 1991), пропорциональное снижение содержания ЦП созревающем молоке с сохранением постоянного количества меди в рацион новорожденного, существенные тканеспецифические отличия в структуре ЦП молок убедительно свидетельствуют о ключевой роли ЦП молока в поддержании баланса меди новорожденных и возможном участии его во включении механизма смены типо метаболизма меди в онтогенезе. Частичная проверка этого предположения осуществлена следующей серии опытов.

3.3. Изучение распределения (1::1]ЦП грудного молока в организме крысят эмбриональным и взрослым типами метаболизма меди.

Электрофоретически чистый препарат ЦП молока был радиоиодирован и использован дл изучения распределения пептидной части ЦП в организме крысят различного возраста. 1 опытах использовали крысят 6-, 9-, 16-, 20- и 33-дневного возраста. Выбор возраста крыс* обусловлен следующими соображениями. Известно, что до 13 дня жизни крысята сохраняй: эмбриональный тип метаболизма меди. После 13 дня происходит интенсивное выведена

а b ta; b b a ; e j d e А В С

Рис.5, Сравнительный электрофорегический анализ препаратов ЦП молока и крови. А - гель окрашен на общий белок, В - иммуноблотинг препаратов ЦП; С - гель окрашен орто-дианизидином; а - ЦП крови; Ь - ЦП молока; с - в лунку помещены оба препарата ЦП, ё и е - ЦП молока и ЦП крови обработаны нейраминидазой

Рис. 6. Иммуноблотинг спонтанных протеолитических фрагментов ЦП крови (А) и ЦП молока (В)

1 2 3 4 5 к г а

№ ц щ

1

I 2

Рис. 7 Б. Электрофорез в присутствии ОБ-Ш

иммунопреципитата [,231]ЦП препарата [П51]ЦП грудного молока (1) и иммунопреципитата, выделенный из 50 мкл сыворотки 6-дневного

крысенка через 240 мин после введения [1251]ЦП. (2).

Рис.7 А. Протокол радиоавтографа нативного электрофореза образцов сыворотки 6- и 33 -дневных крыс после введения [12!1]ЦП грудного молока per os. Дорожки: 1 - препарат [1251]ЦП грудного молока, 2-6 - образцы сыворотки 6-дневных крысят через 10, 30, 60, 120 и 240 мин после введения меченого ЦП, 7 и 8 - образцы сыворотки 33-дневных крыс через 60 и 240 мин после введения [1251]ЦП.

и

ионов меди из печени, которое приводит к тому, что к 15 дню жизни уровень меди в печен: достигает значений, соответствующих взрослому типу метаболизма меди (Hurley, 1984). 1 печени 13-дневных крысят также обнаруживается и молекулярная форма ЦП-мРНК, котора предположительно программирует синтез ЦП желчи, обеспечивающий экскрецию меди и гепатоцитов. При этом содержание ЦП в кровотоке остается низким и не повышаете вплоть до 20 дня жизни (Пучкова и др., 1994; Цымбаленко и др., 1997). К концу первог месяца жизни содержание ЦП в крови достигает значений, соответствующих содержаню ЦП в кровотоке взрослых крыс.

Таким образом, 6-ой и 9-ый дни жизни выбраны как возраст, соответствующи эмбриональному типу метаболизма меди, 16-ый и 20-ый дни - как возраст, при которо] метаболизм меди имеет черты как эмбрионального, так и взрослого типов, а 33-дневны крысы были моделью взрослого типа метаболизма меди.

Животным после голодания per os вводили [1251]ЦП, к которому добавлял балластные белки. После введения [1251]ЦП через различные промежутки времени (10, 3( 60, 120 и 240 мин) в образцах сыворотки крови крысят определяли присутсгви радиоактивности нерастворимой в горячей трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Во все экспериментах нерастворимая в ТХУ радиоактивность определялась только в сыворотке 69-дневных крысят. К тому же в периферической крови 6- и 9-дневных крысят методо. ракетного иммуноэлектрофореза на всех сроках эксперимента обнаружен [1251]ЦП грудног молока. Электрофоретический анализ сыворотки периферической крови крысят до 13 дн жизни (рис. 7 А) показал, что 1) уже через 30 мин в кровотоке крысят обнаруживаете [1231]ЦП молока, 2) по электрофоретической подвижности он не отличается от [1251]ЦГ использованного для введения per os, 3) за последующие 30 мин значительного увеличен« [1251]ЦП в кровотоке крысят не происходит, 4) на поздних сроках эксперимента содержал» меченого ЦП молока в кровотоке увеличивается, к тому же появляется молекулярная фору ЦП, которая по электрофоретической подвижности совпадает с апо-ЦП. Результат! представленные на радиоавтографе рис. 7 Б, демонстрируют, что [1251]ЦП грудного молока через 4 ч после введения per os и циркуляции в организме крысенка сохраняет пептидну) часть молекулы почти не деградированной.

Таким образом, после формирования в онтогенезе системы выведения ионов мел через желчь, способность, или надобность, переносить ЦП молока в кровь утрачивается.

Полученные результаты позволяют рассматривать ЦП молока как источник ионе меди, адаптированный для эмбрионального типа метаболизма меди. Возможно также, hi ЦП молока, на фоне низкого содержания собственного ЦП в крови, являет« непосредственным транспортером ионов меди в клетки различных органе новорожденного. Это предположение поддерживает появление в кровотоке крысят am [1231]ЦП молока на поздних сроках опытов.

На основе измерения распределения радиоактивности вычислено удельное акопление [1251]ЦП в органах крысят через различные интервалы времени после введения 1251]ЦП молока per os. Результаты расчетов приведены в табл. 2. Следует отметить, что адиоактивность содержалась и в органах крысят старше 13 дня. Но, эти результаты в анном аспекте не рассматриваются, так как радиоактивность, выявляемая в органах, ринадлежит неметаболизируемым дериватам [|251]ЦП, о чем свидетельствует отсутствие ысокомолекулярных фрагментов ЦП в крови крысят в течение всего эксперимента.

Данные табл. 2, показывают, что, во-перьых, динамика накопления [1251]ЦП не вляется функцией веса органа и неодинаково изменяется в различных органах в ависимости от времени и, во-вторых, органы значительно отличаются друг от друга по пособности поглощать ЦП молока. На основании данных табл. 2, внутренние органы по ремени, которое необходимо для достижения в них максимального накопления [,251]ЦП, югут быть разделены на три группы

В первую группу входит стенка верхних отделов пищеварительного тракта и печень. I них на ранних сроках после введения меченого ЦП последовательно, в начале в 1ищеварительном тракте, а затем в печени, обнаруживается максимальное количество 'адиоактивностн, которая быстро снижается. Данные позволяют считать, что они обозначают путь ЦП молока в организме крысенка, через стенку желудка меченый ЦП юступает к печени, а затем в периферическую кровь,

1о внепеченочных органах, органах второй группы, ЦП молока максимально накапливается олько ко второму часу эксперимента. В эту группу входят клетки крови, почки, сердце, лаза, легкие, поперечно-полосатые мышцы, эпифизы трубчатых костей, стенка отделов келудочно-кишечного тракта и кожа. Содержание [12!1]ЦП в них снижается к 4-ому ч ксперимента. Поступление и освобождение меченого ЦП клетками внепеченочных |рганов по времени полностью совпадают с динамикой связывания, поглощения и освобождения [|251]ЦП крови человека в опытах на культивируемых фибробластах линии IT-1080 (Пучкова и др., 1997) В почках, легких и в коже содержание меченого ЦП не олько не снижается к концу эксперимента, но в почках и легких даже нарастает. Данные гитературы и собственные наблюдения позволяют предположить, что причины этому для :аждого из названных органов могут быть различными. Так, на поздних сроках ксперимента в моче обнаружена ТХУ-растворимая радиоактивность. Это показывает, что 1251]аминокислоты, которые не реутилизируются, могут выделяться через почки, чем, юзможно, и объясняется повышение радиоактивности в них на позднем сроке ксперимента. Повышенная потребность легких в ЦП, как антиоксиданте, по-видимому, вязана с периодом адаптации новорожденного к кислороду (Gitlin et al., 1989). Задержка ЦП | соединительной ткани кожи может быть объяснена тем, что ЦП связывается с дариксными белками соединительной ткани, в составе которых он обнаружен.

Таблица 2

Способность различных органов 6-дневных крысят накапливать [1251]ЦП молока.

ОРГАН Вес органа, г1' Относительная накопительная способность органа через различные интервалы времени, мин2'

10 30 60 120 240

Сыворотка крови 1,23' 0,1045 0,3051 0,7604 0,6358 0,5993

Клетки крови4' 1,2" 0,0036 0,0094 0,2710 0,3766 0,1360

Печень 0,28 0,3325 0,5807 0,1790 0,2093 0,1729

Почки 0,13 0,1565 0,1807 0,3198 0,4127 0,5516

Сердце 0,065 0,0472 0,1005 0,2427 0,2723 0,1599

Мозг 0,435 0,0080 0,0240 0,0773 0,08538 0,0259

Глаза 0,07 0,0243 0,0752 0,2564 0,3598 0,1799

Легкие 0,22 0,0685 0,1932 0.2154 0,2454 0,4561

Кожа 1,93 0,1425 0.1411 0,6640 1,0847 0,7087

Мышцы6' — 0,0798 0,2260 0,1435

Эпифиз костей6' — 0,1587 0,2558 0,2538

Стенка желудка 0,08 14,34 3,75 2,4 4,96 1,43

Стенка тонкого кишечника 0,2 1,73 1,77 1,08 1,35 0,23

Стенка толстого кишечника 0,15 1,16 0.57 0,97 2,19 0,3

11 - вес органов крысят одного возраста и помета отличался не более, чем на 3%, вес > дневных крысят, если в помете около 10 крысят, составляет при полноценной диете матер примерно 10 г; приведены средние данные из двух опытов;

2' - удельная относительная способность органа накапливать [12!1]ЦП молока: отношен! радиоактивности, имп/мин, в 1 г органа в данный интервал времени эксперимент отнесенное к радиоактивности, имп/мин, приходящейся на 1 г целого организма; " - удельный вес сыворотки крови принимали равным 1;

4) - радиоактивность, обнаруживаемую в сгустке после свертывания крови, принимали кг

радиоактивность, связанную с клетками крови,

!> - вес клеток крови принимали равным весу сыворотки;

6) - вычисления произвели по данным одного измерения, общий вес этих органе экспериментально не определяли.

[акопление радиоактивности в коже более стремительно, чем в других органах этой руппы. Возможно, это связано с тем, что меченый ЦП поступает к коже и с лимфотоком. В анных, приведенных в табл. 2, уровень меченого ЦП в сыворотке крови и в печени через 2 после введения меченого ЦП и до конца эксперимента находятся в равновесии. Это озволяет предположить, что выведение ЦП, освобождаемого клетками второй группы в ровоток, осуществляет печень.

В третью группу входит только один орган - мозг. На всех сроках опыта его пособность накапливать меченый ЦП была самой низкой и составляла меньше 10% от адиоактивности, циркулирующей в кровотоке К тому же и абсолютные значения адиоактивности, обнаруживаемой в мозгу были ниже, чем в других органах при том, что юзг - самый крупный внутренний орган. Похоже, что клетки мозга, или основная их масса, е поглощают [12з1]ЦП из кровотока, а радиоактивность, связанная с ним, принадлежит рови.

Широко признано, что ЦП транспортирует ионы меди в клетки негепатоцитарных ядов с участием видонеспецифичного рецептора эндоцитозного типа.

Для выявления рецептора ЦП в клеточных мембранах новорожденных крысят были спользовали антитела к рецептору ЦП, изолированному из мембран эритроцитов человека Пучкова и др., 1990). В предварительных опытах была изучена способность антител к ецептору ЦП человека взаимодействовать с рецептором ЦП крысы. Методом ммуноблотинга рецептор ЦП был обнаружен во всех негепатоцитарных клетках крысы. 1олекулярная масса выявляемых полипептидов примерно соответствовала 65 кДа, сковному фрагменту молекулы рецептора ЦП как человека, так и крысы.

Существенными результатами этой серии опытов являются следующие данные. Во-ервых, рецептор ЦП обнаружен в печени 6-дневных крысят (рис. 8). Это, дополнительно к анным, ранее полученным группой Mercer (1995), свидетельствует, что эмбриональная ечень в отношении метаболизма меди похожа на внепеченочные органы. В печени 20-невных крыс рецептор ЦП почти не выявляется. Результаты хорошо согласуются с звестными данными, что в печени взрослых крыс рецептор ЦП содержат только ндотелиальные клетки, доля которых в печени новорожденных существенно ниже, чем у зрослых (Kataoka et al., 1984). Во-вторых, продемонстрировано отсутствие рецептора ЦП, ли его низкая плотность, в мозгу 6-дневных крыс и появление его к 20-му дню жизни (рис. ). Можно предположить, что метаболизм меди в мозгу у новорожденных, по отношению к аковому в целом организме, имеет частично автономный характер. Это, вероятно, связано, одной стороны, с высокой потребностью в ионах меди для функционирования ентральной нервной системы, а, с другой, - с их высокой токсичностью и затруднениями ля межорганного переноса в связи с существованием гемато-энцефалитического барьера, ¡озможно, что именно поэтому любые, врожденные или приобретенные, нарушения [етаболизма меди в первую очередь сказываются на функционировании мозга.

В-третьих, обнаружена высокая плотность рецептора ЦП в клетках слизисто желудка у 6-дневных крысят и почти полное отсутствие его у крысят со взрослым типо! метаболизма меди (рис. 8). В клетках слизистой тонкого кишечника 6-дневных крыся присутствует незначительное, но обнаруживаемое, количество иммунореактивны полипептидов рецептора ЦП, в клетках слизистой толстого кишечника таких полипептидо; нами не выявлено. Отсутствие рецептора ЦП в клетках слизистой желудочно-кишечноп тракта у взрослых млекопитающих хорошо согласуется с механизмом выведения меди чере желчь, который предусматривает "упаковку" ионов меди в ЦП-подобный белок предотвращающий их реабсорбцию. Рецептор ЦП, присутствующий на поверхности клето: слизистой желудка у крысят с эмбриональным типом метаболизма меди, по-видимому обеспечивает эндоцигоз ЦП молока.

Данные, приведенные на рис. 8, хорошо согласуются с результатами изучени распределения меченого ЦП грудного молока в организме новорожденных крысят, которы суммированы в табл. 2 и иллюстрированы схемой на рис. 9. Присутствие рецептора ЦП который относится к рецепторам интернализирующего типа, на плазматической мембран почти всех клеток позволяет объяснить поступление ЦП молока в клетки различных органо с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Представленные данные позволяют считать, что для межорганного переноса Щ молока в организме крысенка используется не менее трех различных способов, которые вс относятся к эндоцитозному типу. Так, ЦП молока с относительно высокой скоростью (н более 10 мин) без модификаций переносится из желудка в кровоток. Перенос, возможно осуществляется с помощью трансцигоза, механизма, сходного со способом перенос секреторных форм иммуноглобулина А. Клетки внепеченочных органов поглощают Ц1 молока из кровотока, а затем, примерно через 2 ч, освобождают апо-ЦП. Наконец, н основании повторного увеличения радиоактивности в печени на поздних срока эксперимента и одновременного снижения относительного содержания ЦП молока сыворотке и появления [1251]дериватов ЦП в фекалиях, можно предположить, что печен новорожденных захватывает модифицированный ЦП молока, освобождаемый клеткам внутренних органов в кровоток, и расщепляет его в лизосомальном пространств гепатоцитов. При этом ионы меди, прочно связанные с ним, попав в клетки печеш накапливаются в них. Вероятно, часть их метаболически встраивается в синтезируемы печенью ЦП, и, таким образом, вновь вовлекается в круговорот меди. Из трех способо поступления и переноса ЦП в клетках, специфическим для ЦП молока может считатьс только перенос ЦП из просвета желудочно-кишечного тракта в кровоток. Два других, п всей видимости, характерны и для ЦП крови.

В целом, результаты исследования позволяют считать, что ЦП молока принимае непосредственное участие в метаболизме меди у млекопитающих в периоде молочног вскармливания. Представленные данные затрагивают вопросы, связанные с влияние

А Б

12 3 1231234 56

Рис. 8. Иммуноблотинг белков плазматической мембраны крыс разного возраста. А. 6-дневные крысята, Б: 20-дневные крысята, дорожки: 1- сердце, 2 - почки, 3 - печень, в лунке примерно по 300 мкг белка.

В: 1 и 2 - мозг, Зн-4 - слизистая желудка, 5 и б - лизат мембран эритроцитов; дорожки: /, 3 и 5 - 6-дневные крысята, дорожки: 2, 4 и 6 - 33-дневные крысы, в лунке примерно 100 мкг белка.

Рис. 9. Схема динамики распределения меченого ЦП грудного молока в организме крысят при эмбриональном типе метаболизма меди В скобках римскими цифрами ([-V) обозначены временные интервалы (10-240 мин, соответственно), в которые обнаружено максимальное удельное накопление радиоактивности в данном органе, см. табл. 2. Сплошными стрелками показан транспорт пептидной части молекулы ЦП от желудочно-кишечного тракта в межклеточные пространства организма и к органам. Пунктирные стрелки показывают транспорт радиоактивности от органов. А, БиВ- стенка желудка, тонкого и толстого кишечника, соответственно.

искусственного вскармливания, при котором в организм новорожденных поступает избытс свободных ионов меди, на распределение меди в организме новорожденных, а также v функционирование органов, страдающих в первую очередь при нарушениях метаболизм меди, то есть печени и мозга. Они позволяют высказать предположение, что нарушен! экспрессии гена ЦП в клетках молочной железы, приводящие как к дефициту, так и избытку меди в рационе новорожденного в период молочного вскармливания, могут бьп причиной развития различных заболеваний, как, например, изменения в метаболизме меди мышей гомозиготных носителей tx гена. 4. ВЫВОДЫ

1. Все ионы меди, содержащиеся в молоке в первый месяц лактации, входят в состав Ц молока, тканеспецифической самостоятельной молекулярной формы ЦП.

2. ЦП молока отличается от ЦП крови по составу углеводных цепей и чувствительности ЭДТА. Препарат ЦП молока микрогетерогенен и устойчив к спонтанной протеолитическо деградации.

3. При созревании молока (молозиво - переходное - зрелое) содержание ЦП в нем пада< обратно пропорционально увеличению объема молока, потребляемого новорожденны) Таким способом достигается поддержание количества меди в рационе новорожденного i постоянном уровне.

4. При эмбриональном типе метаболизма меди ЦП молока без модификаций переносится i желудочно-кишечного тракта в кровоток новорожденного и избирательно поглощаеп различными органами, которые освобождают его в кровоток в форме апо-ЦП.

5. При эмбриональном типе метаболизма меди клетки печени содержат рецептор ЦП способны поглощать ЦП молока сразу после поступления его в кровоток.

6. В раннем постнатальном периоде клетки мозга не поглощают ионы меди, поступающие составе ЦП молока в организм новорожденного.

7. Эмбриональный тип метаболизма меди адаптирован к ЦП молока как единственно» источнику ионов меди. Смена типов метаболизма меди у млекопитающих находится причинно-следственной связи с молекулярной формой ионов меди в пище.

5. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1). Пучкова Л.В., Захарова Е.Т., Алейникова Т.Д., Мокшина C.B., Цымбаленко Н.В., Сасш Л.К., Ширманова М.Р., Рогачева Н.П., Гайцхоки B.C. - Сравнительный анализ молекулярнс микрогетерогенности церулоплазмина крови и грудного молока человека. Биохимия, 199 62, №8, 1082-1085.

2). Пучкова Л.В., Алейникова Т.Д., Бичевая Н.К., Мокшина C.B., Платонова H.A., Сасш Л.К., Скворцова H.H., Цымбаленко Н.В., Чеботарь H.A., Гайцхоки B.C. - Сравнительнс изучение динамики перемещения пептидной части молекулы церулоплазмина молока организме крыс при эмбриональном и взрослом типах метаболизма меди. Онтогенез, 199 29, №6,457-465

езисы:

. Puchkova L., Sasina L., Aleinikova Т., Zakharova E., Tsymbalenko N., Platonova N., Mokshina ., Shavlovski M., Gaitskhoki V. In vitro reconstitution of ceruloplasmin traffic in mammalian body. КХШ International Congress of Physiological Sciences, Sanct-Petersburg, June 1997, P. 492.

. Mokshina S.V. The role of milk ceruloplasmin in the copper metabolism during rat development, nternational Medical Conference Charity, P. 29, October, Berlin, 1997.

. Мокшина C.B. Изменение распределения [Ш1]ЦП молока в организме крысят в ависимости от их периода развития. Первая медико-биологическая конференция молодых ченых Санкт-Петербурга, с.51, ноябрь, 1997.

. Мокшина С.В, Выделение элекгрофоретически чистого препарата ЦП из грудного юлока. Первая медико-биологическая конференция молодых ученых Санкт-Петербурга, .51-52, ноябрь, 1997.

. Жигулева Э.А., Гюлиханданова Н.Е., Мокшина С.В., Платонова Н А., Ширманова М.Р., [кименко Ю.Б. Избыток ионов меди в диете новорожденных при искусственном скармливании молочными смесями, продающимися в Санкт-Петербурге. Вторая Санкт-[етербургская ассамблея молодых ученых и специалистов, с. 9, декабрь, 1997,

. Мокшина С.В, Платонова Н.А. Динамика распределения пептидной части молекулы ЦП юлока в организме крысят в различные периоды неонатального развития. Конференция юлодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс линической медицины", Москва, апрель, 1998. Материалы Конференции, с. 43-44 (устное □общение, отмечено премией).

. Mokshina S. The role of milk ceruloplasmin as the sole source of the copper for newborn, vtemational medical conference for students and young doctors, Lublin, Poland, April 24-26, 1998. Lbstract Book (Editor-in-Chief Jroslav J. Oleszczuk), p. 59.

. Mokshina S., Zhiguleva E., Platonova N., Gulikhandanova N. The copper ions content in diet of ewborns as an ecological factor. The 2nd International Young Environmental Forum Ecobaltica'98, t.-Petersburg, July 1998, P. 133.

. Пучкова JI B., Цымбаленко H.B., Сасина JI.K., Скворцова H.H., Мищенко Б.С., Мокшина :.В., Жигулева Э.А., Платонова Н.А., Гюлиханданова НЕ., Гайцхоки B.C. Фактор кологической безопасности новорожденных по содержанию ионов меди. МАНЭБ, научные гения "Белые ночи", июнь 1998, с. 180.

0. Пучкова Л В., Скворцова Н.Н., Мищенко Б.С., Цымбаленко Н.В., Сасина Л.К., Мокшина .В., Жигулева Э.А., Платонова Н.А., Власов Г.П., Гайцхоки B.C. Основные направления оздания безопасных молочных смесей для новорожденных по содержанию ионов меди. ЗНЕСКО, 5ая Международная конференция " Право на здоровье" (Ребенок в современном ире: права ребенка), мая 1998, Санкт-Петербург, с. 41.

1. Н.Н. Скворцова, Л.В. Пучкова, М.М. Шавловский, Л.К. Сасина, Г А. Платонова, С.В. 1окшина, А.Х. Мусолямов, Э.А. Жигулева, Н.А. Платонова, Г.П. Власов, Ц.А. Егоров, B.C. айцхоки. Установление участка молекулы церулоплазмина, взаимодействующего с [едьтранспортной АТРазой Менкеса. XIV Менделеевский съезд по общей и прикладной

химии. Санкт-Петербург, 1998. Рефераты докладов и сообщений, М., 1998, №4 (Хими живого) с. 144.

12. L.V. Puchkova, NN. Skvortzova, М.М. Shavlovski, L.K. Sasina, G.A. Platonova, S.\ Mokshina, A. Kh. Musolyamov, E.A Zhiguleva, N.A. Platonova, G.P. Vlasov, Ts.A Egorov, V.S Gaitskhoki. The interaction of the ceruloplasmin receptor and putative copper transporting ATPas encoded by Menkes disease gene. International symposium "Protein structure, stabilyti and folding Fundamental and medical aspects. Moscow, Russia, June 22-26. Book of Program and Abstracts ONTI PNC, Pushino, 1998, p. 198 (poster)

13. JIB. Пучкова, JI.K. Сасина, Цымбаленко H.B., Н А. Платонова, C.B. Мокшина, Ц/4 Егоров, А.Х. Мусолямов, Гюлиханданова Н.Е., B.C. Гайцхоки.

Экспрессия гена рецептора церулоплазмина и его роль в метаболизме меди. Международна конференция "Рецепция и внутриклеточная сигнализация", 21-25 сентября, 1998, Пущине Тезисы докладов, с. 162-165 (устное сообщение).

Работа поддержана грантами РФФИ № 98-04-49790 и № 98-04-49846, Программой "Гено: человека" (грант № 74-98), межвузовской научной программой "Университеты России фундаментальные исследования" (№ 1316), Программой ГКНТ "Приоритетные направлени генетики" (№ 1-232), грантом Совета поддержки "Ведущие научные школы России" (№96 15-97742).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мокшина, Светлана Васильевна

Часть 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическая роль меди.

1.1.1. Медьсодержащие ферменты и их роль в клеточных процессах.

1.1.2. Содержание и распределение меди в организме человека.

1.1.3. Содержание меди в пище как экологический фактор.

1.2. Молекулярно-генетические механизмы поддержания баланса меди у млекопитающих.

1.3. Растворимые белки межклеточного пространства, входящие в состав МСМ.

1.3.1. Семейство церулоплазминов и

1.3.1.1. ЦП крови

1.3.1.2. ЦП желчи - Д/

1.3.1.3. ЦП груд но го молока

1.4. Интегральные белки мембран МСМ, обеспечивающие перенос ионов меди через клеточные барьеры.

1.4.1. Мембранные насосы: семейство АТРаз Р1-типа.

1.4.1.1. АТР-аза Менкеса

1.4.1.2. АТР-аза Вильсона. /

1.4.2. Специфический рецептор ЦП

1.5. Цитозольные медьтранспортные белки системы МСМ

1.6. Транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов МСМ

1.7. Общая организация тканеспецифического распределения меди и организме млекопитающих при взрослом и эмбриональном типах метаболизма меди.

Часть 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Методы исследования

2.3. Аналитические методы

Часть 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изменение содержания ЦП и ионов меди в молоке в течение первого месяца лактации

3.2. Выделение и сравнительная характеристика церулоплазминов молока и крови

3.3. Изучение распределения [125Г]ЦП грудного молока в организме крысят с эмбриональным и взрослым типами метаболизма меди

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль церулоплазмина молока как источника ионов меди для новорожденных"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Ионы меди входят в состав активных центров жизненно важных ферментов и необходимы млекопитающим в течение всего индивидуального развития. Конфликт между незаменимостью ионов меди для организма и их высокой токсичностью разрешается с помощью специальной системы белков, которые осуществляют перенос ионов меди по каналам межклеточной коммуникации, их транспорт через мембранные барьеры, распределение в клетках и экскрецию. Разнообразные генные мутации, нарушающие функционирование этих белков (врожденные ошибки метаболизма меди), приводят к избыточному накоплению ионов меди в клетках различных органов, или к дефициту ферментов, содержащих медь. Как дефицит, так и избыток ионов меди, вызванные экологическими факторами, приводят к развитию заболеваний, которые фенотипически сходны с врожденными ошибками метаболизма меди. Доля этих (наследственных и приобретенных) заболеваний, которые получили название "медь-зависимые микроэлсментозы", растет во всех странах мира. Особенно тяжелые нарушения функционирования печени, мозга и почек вызывает дисбаланс ионов меди в рационе новорожденных млекопитающих в период молочного вскармливания, когда еще сохраняется эмбриональный тип метаболизма меди, при котором медь не выводится из организма, а накапливается в печени. Молекулярно-генетические механизмы, контролирующие содержание меди в рационе новорожденного и смену типов метаболизма меди в онтогенезе, не известны. Реальные предпосылки для таких исследований созданы, в частности, работами Отдела молекулярной генетики НИИЭМ РАМН [20, 137], в которых, с одной стороны, показано, что на всех этапах эмбрионального развития источником ионов меди для зародыша является церулоплазмин матери (ЦП, КФ 1.16.31.1, медьтранспортный гликопротеин крови). С другой -обнаружено, что в молоке (единственном естественном источнике ионов меди для новорожденного) содержится ЦП, который синтезируется в клетках молочной железы. Эти данные позволяют надеяться, что изучение роли ЦП молока как источника ионов меди для новорожденных будет способствовать пониманию особенностей эмбрионального типа метаболизма меди и открытию механизма, который обеспечивает контроль за уровнем меди в рационе новорожденного. В дальнейшем эти данные могут стать основой для иаучно-обосиопанных рекомендаций по содержанию ионов меди и их молекулярной "упаковке" в молочных смесях для новорожденных.

ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ: I) изучение соотношения содержания ЦП и ионов меди в молоке в разные сроки лактации; 2) сравнение физико-химических свойств двух гканеспецифических молекулярных форм ЦП: ЦП крови и ЦП молока; 3) изучение распределения пептидной части молекулы ЦП молока в организме крысят с эмбриональным и взрослым типами метаболизма меди. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ: 1). Измерить энзиматическим и иммунологическим методами динамику содержания ЦП в молоке в течение первого месяца лактации, определить концентрацию ионов меди в этих же образцах молока и оценить молярные соотношения ЦП и меди в молоке одного срока пактации. 2). Сравнить препараты ЦП молока и крови по мол. массе, составу углеводных цепей, электрофорстичсской подвижности, чувствительности к хелатирующим и денатурирующим агентам. 3). Изучить динамику распределения радиоиодированной пептидной части ЦП грудного молока в организме крысят. Параллельно у крысят тех же зозрастов методом иммуноблотинга изучить тканеспецифический профиль экспрессии гена рецептора ЦП и сопоставить данные полученные в обоих типах экспериментов. НАУЧНАЯ НОВИЗНА РЕЗУЛЬТАТОВ, представленных в работе состоит в следующем. Получены доказательства, что rcc ионы меди в молоке первого месяца лактации входят в юстав тканеспецифического ЦП (ЦП молока). Содержание ЦП в молоке и, шедовательно, ионов меди в рационе новорожденного, поддерживается постоянным снижением уровня экспрессии гена ЦП в клетках молочной железы по мере увеличения >бъема молока, производимого ею (примерно 10 мкг на кг тела ребенка). Помимо этого юказано, что препарат ЦП молока содержит десиалированные формы ЦП, он чувствительнее, чем ЦП кропи, к хелатирующим агентам, но более устойчив к Фонтанной протеолитической деградации. В экспериментах типа "чейз", в которых юпользовали электрофоретически чистый препарат [1251]ЦП грудного молока, тродемонстрировано, что пептидная часть ЦП, введенного per as в желудочно-кишечный •ракт крысят с эмбриональным типом метаболизма меди, без изменений переносится в сровоток, тканеспецифично распределяется по органам, утрачивает ионы меди переходит в форму апоЦП) и выделяется через желчь в виде низкомолекулярных

1251]дериватов. У крысят со взрослым типом метаболизма меди [1251]ЦП молока расщепляется в пищеварительном тракте. Во фракции плазматических мембран, выделенных методом флотационного центрифугирования из клеток сердца, почек, эритроцитов, легких и селезенки крысят, рецептор ЦП обнаружен при обоих типах метаболизма меди. По данным иммуноблотинга экспрессия гена рецептора ЦП существенно изменялась в зависимости от типа метаболизма меди только в трех органах. Так, при эмбриональном типе метаболизма меди рЦП обнаружен в печени и в клетках слизистой желудка, но не найден в клетках мозга. После смены типа метаболизма меди, напротив, содержание рецептор» ЦП снижается в печени, он появляется на мембране клеток мозга и не выявляется в клетках слизистой желудка.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Теоретическое значение работы заключается в расширении представлений о функционировании белков, поддерживающих баланс ионов меди у новорожденных, и особенностях тканеспецифической экспрессии их генов. Установлена роль ЦП молока как единственного источника ионов меди для новорожденного. При этом выявлены три важных аспекта. Во-первых, содержание ионов меди в пище новорожденного строго контролируется путем регуляции активности гена ЦП в клетках молочной железы матери, что косвенно, но убедительно, свидетельствует о важном значении баланса меди в рационе новорожденного. Во-вторых, ЦП молока на фоне низкого содержания ЦП в крови при эмбриональном типе метаболизма меди, выполняет роль транспортера меди для клеток внепеченочных органов новорожденных. В-третьих, при грудном вскармливании молекулярно-клеггочные механизмы предотвращают поступление ионов меди из кровотока в клетки мозга. В целом результаты показывают, что в период новорожденности метаболизм меди у млекопитающих адаптирован к получению ионов меди, связанных с молекулой ЦП молока. Полученная информация выявляет причинно-следственную связь между сохранением эмбрионального типа метаболизма меди в течение молочного вскармливания и молекулярной формой ионов меди в пище новорожденного в этот период. Это заставляет по-новому взглянуть на выбор стратегии вскармливания новорожденных. Так, опираясь на полученные данные, следует широко развернуть тропаганду в пользу грудного вскармливания детей, так как молочные смеси не обеспечивают баланс ионов' меди в рационе. С другой стороны, молоко матерей, у которых в клетках молочной железы нарушены репрессия гена ЦП, или метаболическое включение ионов меди в молекулу ЦП, может быть токсичным, как, например, молоко гомозиготных мышей линии toxic milk. Поэтому своевременно поднять вопрос об измерении содержания ЦП и ионов меди в молоке женщин группы риска (различные хронические печеночные и неврологические заболевания в семье). Необходимо также на уровне ВОЗ добиваться, чтобы содержание меди и их молекулярная "упаковка" в молочных смесях соответствовали изменению этих показателей в грудном молоке в течение лактации. Это составляет практическое значение представляемого исследования. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследования доложены на: ХХХП1 Международном конгрессе физиологических наук в Санкт-Петербурге 30 июня- 5 июля 1997 г., Международной школе по биологии и медицине для молодых ученых (Берлин, октябрь 1997), Первой медико-биологической конференции молодых ученых Санкт-Петербурга (ноябрь 1997), Второй Санкт-Петербургской ассамблеи молодых ученых и специалистов (декабрь 1997), XIV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, май 1998), на Международном симпозиуме по структуре, стабильности и фолдингу белков (Москва, июнь 1998 г.), Международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, сентябрь, 1998), на конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", (Москва, апрель, 1998, устное сообщение, отмечено премией), Международной конференции по медицине для молодых ученых (Люблин, Польша, апрель 1998 г.), а также на научно-практических конференциях, посвященных проблемам экологии и здоровью нового поколения (ЮНЕСКО, МАНЕБ и ЭкоБалтика, 1998 г.) ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: 1. Все ионы меди, содержащиеся в молоке в первый месяц лактации, входят в состав ЦП молока. 2. ЦП молока отличается от ЦП крови по ряду физико-химических свойств. З.При эмбриональном типе метаболизма меди ЦП молока из желудочно-кишечного тракта переносится в кровоток новорожденного и избирательно поглощается различными органами, которые освобождают его в кровоток в })орме апо-ЦП.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Мокшина, Светлана Васильевна

выводы

1. Все ионы меди, содержащиеся в молоке в первый месяц лактации, входят в состав ЦП молока, тканеспецифической самостоятельной молекулярной формы ЦП.

2. ЦП молока отличается от ЦП крови по составу углеводных цепей и чувствительности к ЭДТА. Препарат ЦП молока микрогетерогенен и устойчив к спонтанной протеолитической деградации.

3. При созревании молока (молозиво - переходное - зрелое) содержание ЦП в нем падает обратно пропорционально увеличению объема молока, потребляемого новорожденным, Таким способом достигается поддержание количества меди в рационе новорожденного на постоянном уровне.

4. При эмбриональном типе метаболизма меди ЦП молока без модификаций переносится из желудочно-кишечного тракта в кровоток новорожденного и избирательно поглощается различными органами, которые освобождают его в кровоток в форме апо-ЦП.

5. При эмбриональном типе метаболизма меди клетки печени содержат рецептор ЦП и способны поглощать ЦП молока сразу после поступления его в кровоток.

6. В раннем постнатальном периоде клетки мозга не поглощают ионы меди, поступающие в составе ЦП молока в организм новорожденного.

7. Эмбриональный тип метаболизма меди адаптирован к ЦП молока как единственному источнику ионов меди. Смена типов метаболизма меди у млекопитающих находится в причинно-следственной связи с молекулярной формой ионов меди в пище.

Работа поддержана грантами РФФИ № 98-04-49790 и № 98-04-49846, Программой "Геном человека" (грант № 74-98), межвузовской научной программой "Университеты России - фундаментальные исследования" (№ 1316), Программой ГКНТ "Приоритетные направления генетики" (№ 1-232), грантом Совета поддержки "Ведущие научные школы России" (№96-15-97742). ш

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные данные позволяют считать, что тканеспецифический ЦП молока в раннем периоде онтогенеза является единственным источником ионов меди для новорожденных и является механизмом обеспечивающим баланс меди до формирования механизма экскреции ионов меди через желчь. Помимо этого круговорот меди в раннем онтогенезе адаптирован к получению ионов меди только в составе ЦП. Адаптация выражается в способности клеток слизистой верхних отделов желудочно-кишечного тракта с помощью специфического рецептора эндоцитозного типа перемещать ЦП молока в кровоток. Похоже, что ЦП молока непосредственно доставляет часть своих ионов меди к клеткам различных органов. Круговорот ЦП молока, по-видимому, завершается в печени, куда он доставляет прочносвязанные с его молекулой ионы меди, являясь причиной накопления их в этом органе в раннем периоде новорожденное™. На основании этих данных могут быть уточнены некоторые детали путей переноса ионов меди при эмбриональном типе метаболизма меди (срав. схему 3.2 со схемой 2 в разделе "Обзор литературы").

Полученные результаты указывают, что для новорожденных может быть очень важным, чтобы ионы меди были "упакованы" в молекулу ЦП, снижение содержания которого в молоке обеспечивает постоянный уровень потребления ионов меди в расчете на 1 кг веса тела ребенка. Данные обращают внимание также на то, что при искусственном вскармливании нарушается форма "упаковки" ионов меди и не соблюдается контроль за количеством ионов меди в рационе новорожденного. Таким образом, данные затрагивают вопросы, связанные с влиянием искусственного вскармливания, при котором в организм поступает избыток свободных ионов меди, на распределение меди в организме новорожденных, а также на функционирование органов, страдающих в первую очередь при нарушениях метаболизма меди, то есть печени и мозга. Они позволяют высказать предположение, что нарушение экспрессии гена ЦП в клетках молочной железы, приводящие как к дефициту, так и к избытку меди в рационе новорожденного в период молочного вскармливания, могут быть причиной развития различных заболеваний, как, например, изменения в метаболизме меди у мышей гомозиготных носителей tx гена (toxic milk) [74, 130].

Медь, упакованная в ЦП грудного молока 4 трансцитоз ЦП молока через слизистую желудочно-кишечного тракта 4 транспорт ЦП молока по кровотоку к печени и к другим органам передача Из426-Си)? выведение из клеток апоЦП молока

Схема 3.2. Круговорот меди у млекопитающих при эмбриональном типе метаболизма меди

По-видимому, необходимы специальные дополнительные исследования, направленные на изучение влияния молочных смесей на метаболизм меди в раннем онтогенезе, нарушения которого, весьма вероятно, могут бьггь причиной умственной ретардантности и хронических заболеваний печени и почек.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мокшина, Светлана Васильевна, Санкт-Петербург

1. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А. Микроэлементозы человека. М.: Медицина. 1991. 496 с.

2. Алейникова Т.Д., Васильев В.Б., Монахов Н.К., Шавловский М.М. Синтез и секреция церулоплазмина изолированными гепатоцитами крысы. Биохимия, 52, 10:1600-1607, 1987.

3. Баранов B.C., Шварцман А.Л., Горбунова В Н., Гайцхоки B.C. Применение специфических ДНК-зондов для картирования гена церулоплазмина на хромосомах крысы методом прямой гибридизации. Генетика, 21, 1:23-30, 1985.

4. Васильев В.Б., Шавловский М.М., Нейфах С.А., Прозоровский В.А. Внутримолекулярная гомология церулоплазмина. Биоорган.химия 5,1045-1052,1979.

5. Нейфах С. А. Молекулярные механизмы регулирования синтеза церулоплазмина под действием эстрад иол а. Мол. биол., 15, 199-207, 1981.

6. Гайцхоки B.C. Молекулярная гетерогенность наследственных болезней человека и проблемы генной терапии. Биополимеры и клетка, 6, 1: 31-46, 1990.

7. Пучкова Л.В., Алейникова Т.Д., Цымбаленко Н.В., Захарова Е.Т., КонописцеваЛ.А., Чеботарь Н А., Гайцхоки B.C. Биосинтез и секреция церулоплазмина клетками молочной железы в период лактации. Биохимия, 59,2:341-348,1994.m

8. Пучкова JIB., Вербина И.А., Гайцхоки B.C., Нейфах С.А. Взаимодействие молекулярных форм церулоплазмина со специфическим рецептором мембран эритроцитов здоровых людей и больных гепатолентикулярной дегенерацией. Биохимия, 56, 12: 2261-2269, 1991.

9. Саенко Е.Л. Басевич В.В., Ярополов А.И. Особенности взаимодействия церулоплазмина со специфическим рецептором эритроцитов человека. 53, 2:317-321, 1988.

10. Шварцман А.Л., Вахарловский В.Г., Гайцхоки B.C., Нейфах С.А. Молекулярная структура гена церулоплазмина человека и его экспрессия при мутации Вильсона-Коновалова. Докл. Акад. Наук СССР, 253,3:717-719,1981.

11. Шварцман А.Л., Воронина О.В., Гайцхоки B.C., Паткин Е Л. Экспрессия гена церулоплазмина в органах млекопитающих по данным гибридизационного анализа с комплементарными ДНК-зоидами.Мол. биол. 3, 657-662, 1990.

12. Askwith С., Kaplan J. Iron and copper transport in yeast and relevance to human disease. TIBS, 23, 135-138, 1998.

13. Barnes G., Frieden E. Ceruloplasmin receptors of erytrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 125:157-162,1984.

14. V Beck A.B. The copper content of the liver and blood of some vertebrates. Austral. J. Zool. 35, 8-18,1955.

15. Dawson C.R The Biochemistry of copper. (Peisach I, Aisen P., Blumberg W.E., eds), Academic Press,New York,305-337,1966.

16. Freedman J.H., Ciriolo M R., Peisach J. The role of glutathione in copper metabolism and toxicity. J. Biol. Chem.264:5598-5605,1989.

17. French J.H., Sherard E.S. Studies of the biochemical basis of kinky hair desease. (Abstract) Pediat.Res. 1,206,1967.

18. Gaitskhoki V S., L'vov V.M., Schwartzman A.L., Skobeleva N.A., Frolova L.Yu., Neifakh S.A. Identification of ceruloplasmin messenger RNA seqences in heterogeneous nuclear RNA from rat liver. Mol. Biol. Rep. 8,1:57-62,1981.

19. George A M., Reed V., Glenister P., Chelly J., Turner Z. et al. Analysis of mnk, the murine homologue of the locus for Menkes disease, in normal and mottled (mo) mice. Genomics 22, 27-35,1994.

20. Gitlin J.D. Transcriptional regulation of ceruloplasmin gene expression during inflammation. J.Biol.Chem.263,13:6281 -6287, 1988.

21. Hamanaka R., Kohno K., Segushi T., Okamura A. Induction of Low density lipoprotein receptor and a transcription factor SP-1 by tumor necrosis factor in human microvascular endotelial cells. J. Biol. Chem. 267, 19, 13160-13165, 1992.

22. Harris E D. Copper transport: an overview, Sociaty Experim. Biol.and Medicine, 130140,1991.

23. Hartter D.E., Barnea A. Brain tissue accumulates 67copper by two ligand-dependent saturat processes. A high affinity, low capacity and a low affinity, high capacity process J. Biol. Chem., 26 799-805, 1988.

24. Kiyosawa I., Matsuyama J., Nyui S., Fukuda A. Ceruloplasmin concentration in human colostrum and mature milk. Biosci. Biotech. Biochem., 59, 4, 713-714, 1995.

25. Li Y., Togashi Y, Sato S., Emato T., Kang J.-H., TakeichiN., Kobayashi H. Spontaneous hepatic copper accumulation in long-evans cinnamon rats with hereditary hepatitis. J. Clin. Invest. 87,1858-1861,1991.

26. Nutr., 109,11,1979-2066,1979. l'"J McArdle H.J., Danks D M. Secretion of copper 4 into breast milk following intravenouus injection in a human subject. J. Trace Elem. Exp. Med., 4, 81-84, 1991.

27. McArdle H.J., Guthrie J., Ackland M L., Danks D M. Albumin has no role in copper uptake by fibroblasts. J. inogran Biochem 31:123-131,1987.

28. U. Orena S.J., Go ode C. A., Linder M.C. Binding and uptake of copper from ceruloplasmin.

29. RydenL. Ceruloplasmin is a single peptide chain. Eur. J. Biochem. 26, 380-386, 1972.

30. Shokeir M.N.K., Shreffler D C. Cytochrome oxidase deficiency in Wilson's disease: asuggested ceruloplasmin function. Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 62, 867-872, 1969. Vi Smith C., Hager G.L. Transcriptional regulation of mammalian genes in vitro. J. Biol.

31. New York (Chapter 3, p 56-108), 1977. 1 Valentine J.S. Gralla E.B. I delivering copper inside yeast and human cells. Science, 278, 817-818, 1997.

32. Hf Verbina I.A., Puchkova I V., Gaitskhoki V.S., Neifakh S.A. Isolation and partial characterization of molecular forms of ceruloplasmin from human bile. FEBS Letters, 298, 105-108, 1992.

33. P Vulpe C, Levinson B, Whitney S, Packman S, Gitscher J. isolation of a candidate gene for

34. Menkes disease and evidence that it encodes a copper-transporting ATPase. Nature Genet., 3, 7-13, 1993.