Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние искусственного вскармливания на распределение меди в организме крыс с эмбриональным типом метаболизма меди

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние искусственного вскармливания на распределение меди в организме крыс с эмбриональным типом метаболизма меди"

•Ч Л

г ,'/■>

^ ^ На правах рукописи

040 /3 м<(Г

Жигулева Эвелина Александровна

ВЛИЯНИЕ ИСКУССТВЕННОГО ВСКАРМЛИВАНИЯ НА РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МЕДИ В ОРГАНИЗМЕ КРЫС С ЭМБРИОНАЛЬНЫМ ТИПОМ МЕТАБОЛИЗМА МЕДИ

03.00.04 - биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук Пучкова Л. В.

С.т ист-! 1ст«рбур| •

года г.

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики Научно-исследовательского ииституга экспериментальной медицины РАМН (директор - академик Б.И. Ткаченко)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Людмила Валентиновна Пучкова Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Александр Дорофеевич Денисенко доктор медицинских наук,

профессор Валерий Борисович Долго-Сабуров

Ведущее научное учреждение - Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. Академика И.П. Павлова .

Защита состоится "29" мая 2000 г. в ............. часов на заседании

Диссертационного совета по защите кандидатских диссертаций K001.23.0l при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН по адресу. 197376, Саикг-Петсрбург, ул. акад. Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН (по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акал. Павлова, д. 12.)

Автореферат разослан «28» апреля 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного

coneiaK001.23.01

доктор биологических паук

Куликова О.Г.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Ионы мели необходимы для жизнедеятельности всех организмов, так как входят в активные центры ферментов, контролирующих клеточное luxamie, фотосинтез, функционирование центральной нервной системы, формирование ;оедшштельной ткани, эритропозз и другие, жизненно важные процессы (Karlin, 1901). Эдиовременно медь является токсичным агентом для всех типов клеток (Mason, 1979). [¡езопасный круговорот меди осуществляет специальная система белков - метаболическая :истема меди (МСМ). У млекопитающих она состоит из двух взаимосвязанных полуавтономных тканеспецифических систем; МСМ гепатоцитов и МСМ клеток пегепатоцнтарпых рядов (непеченочпые клетки). МСМ печени осуществляет поглощение абсорбированной пищевой меди из кровотока, включение ее в церулоплазмин (ЦП, медьтранспортный гликопротеин плазмы крови), распределение в составе ЦП в организме и выведение меди через желчь. МСМ непеченочных клеток обеспечивает поглощение из кровотока ионов меди, транспортируемых ЦП, к выведение их в кровоток (Danks, et al., 1994; Пучкова и др., 1997; Linder, et al., 1998). В период эмбрионального развития и грудного вскармливания МСМ функционирует по эмбриональному типу, который характеризуется низким содержанием меди в крови, накоплением ее в печени и отсутствием экскреции меди п желчь. К окончанию периода грудного вскармливания происходит смена эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый тип. Это выражается в снижении содержания меди в печени, повышении ее концентрации в крови и формировании механизма выведения меди через желчь. При смене типов метаболизма меди значительные изменения в уровне содержания меди происходят также в мозгу. Так, у новорожденных концентрация меди в мозгу в несколько раз ниже, чем у взрослых (Mason, 1979). Молекулярно-генетический механизм, контролирующий смену типов метаболизма меди в онтогенезе, и тканеснецифическое функционирование МСМ не известен. 1) то же время нарушения работы системы, вызванные как генными мутациями, так и экологическими факторами, приводят к развитию тяжелых заболеваний, получивших название «медь-зависимые микроэлементозы» (Авиып и др., 1994). При этих заболеваниях в первую очередь поражаются мозг и печень. Особенно тяжелые нарушения функционирования этих органов вызывает дисбаланс ионов меди в рационе новорожденных в период молочного вскармливания (Muller, et al., 1998; Lonnerdal, 1998). Вероятно, это связано с тем, что в кишечнике новорожденных, в отличие от взрослых млекопитающих, отсутствует механизм, контролирующий уровень адсорбции пищевой меди (Harley, et al., 1980), Отсутствие собственного контроля над поступлением меди в оргаиизм обусловлено тем, что в течение грудного вскармливания практически единственным источником меди является ЦП молока (Мокшина, 1998), содержание которого регулируется на уровне экспрессии транскрипции в клетках молочной железы (Пучкова и др., 1994; Пучкова и др., 1997). Поэтому при вскармливании искусственными смесями новорожденные получают избыток пищевой меди, которая, к тому же, не «упакована» в белковую глобулу (Пучкова и др., 1997, Lonnerdal, 1998). По данным ВОЗ

число новорожденных, вскармливаемых искусственно с первых дней жизни, различным причинам (занятость матерен в общественном производстве, снижеь лактации из-за острого и хронического стресса, не соответствующего адаптациоши возможностям человека, токсичность молока, обусловленная обострением экологическ проблем, наркоманией, алкоголизмом, ВИЧ-ннфицированностью и т.д.) неуклонно раст В рамках обозначенной здесь проблемы сущесгвует ряд задач, решение котор актуально для сохранения здоровья новых поколений. Это, в первую очередь, изучен молекулярного механизма, обеспечивающего гомеостаз меди в период эмбриональнс развития и в течение грудного вскармливания, а также изучение мехашш контролирующего на генетическом уровне смену типов метаболизма меди. Помимо это) необходимо также исследовать влияние искусственного вскармливания на распределен меди в организме новорожденных и изучить влияние избытка пищевой меди на фенол В целом, эта позволит выработать научно-обоснованные рекомендации для добавлен меди в детские смеси и вплотную подойти к приготовлению смесей, соответствующ индивидуальным генотипическим особенностям МСМ. Представляемая работа являет первой, выполненной в рамках решения перечисленных актуальных задач. Цель исследования состояла в изучении у млекопитающих экспрессии основных retí МСМ при эмбриональном типе метаболизма меди и в исследовании взаимосвязи меж типом МСМ и пищевым источником ионов меди. Для достижения цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Изучить экспрессию генов МСМ в клетках желточного мешка (ЖМ) в течем посгимплантационного периода.

2. Изучить биосинтез ЦП в организме крыс при эмбриональном типе метаболизр меди и сопоставить распределение новосинтезированного ЦП и ЦП молока в органпз) новорожденных крыс.

3. Сравнить распределение меди в организме 8-дневных крыс, вскормлениь молоком матери или смесыо для искусственного вскармливания (СИВ).

Научная новизна полученных результатов. Выявлена активная роль Ж; млекотггающих в поддержании гомоосгаза меди в тканях эмбриона в течение acei посгимплантационного периода. Показано, 'по перенос меди между орг анизмом матери эмбрионом осуществляют клетки ЖМ, МСМ которого вкдючаег две поляр| секретнруемые молекулярные формы ЦП и две медьтранспортные АТРазы Р1 тип предположительно являющиеся продуктами иокусои болезни Менкеса и боле.-» Вильсона (А'П'7А и АГР7В, соответственно). И экспериментах типов «пульс-чейз» «чейз» in vivo продемонстрировано, что при эмбриональном типе метаболизма мад клегкн печени селективно связывают ЦП молока, но не ЦП, синтезирующийся в печен Сравнение препарата IЦ1, выделенного из сыворотки фетапьной крови, с ЦГ1 грудно! молока и ЦП крови взрослых показало, что ЦП, полученный из пуповннной крови, и физико-химическим свойствам сходен с ЦП грудного молока и отличается от ЦП кров взрослых Обнаружено, что при искусственном вскармливании содержание меди в ним новорожденных почти в 8 раз выше, чем при грудном вскармливании. У кры

«кормленных СИГ), рекомендованном детям с первого дня жизни, смена типов ¡етаболнзма меди происходит раньше, чем у крыс, вскормленных естественно, [яучно-практическая значимость результатов исследования. Результаты с следования расширяют представления об онтогенетической изменчивости МСМ шскопигающих, вносят вклад о понимание функционирования МСМ, специфичной для мбрнонального и периода молочного вскармливания, позволяют установить шзиологическую связь между типом метаболизма меди и источником пищевых ионов |едн. Представленные данные выявляют пищевую роль ЦП молока я устанавливают ричинно-слсдственную связь между источником ионов меди и типом метаболизма меди. Толученные результаты показывают, что избыток пищевой меди может влиять на уровень кспрессии генов МСМ в печени и мозге, и позволяют выработать научно-обоснованные «комендации для добавления меди в СИВ.

1пробацня результатов работы. Результаты исследования обсуждены на: 1-ой Медико-¡иологической конференции молодых ученых СПб (1997); Международной школе по ¡пологим и медицине для молодых ученых (Берлин, 1997); 2-ой Санкт-Петербургской лсамблее молодых ученых и специалистов (1997); научно-практических конференциях, госвященных проблемам экологии и здоровью нового поколения, проходивших в СПб юд эгидой международных организаций ЮНЕСКО, МАНЕБ и ЭкоБалтика весной-летом 998 г.; Международной конференции по медицине для молодых ученых (Люблин, 1998); сонференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные layxn н прогресс клинической медицины», посвященной 240-летню ММА им. ИМ. Сеченова (Москва, 1998); Международном Рабочем совещании по оптическим гехнологиям в биофизике и медицине (Саратов, 1999); 2-ом съезде ПОГиС, (СПб, 2000); 2-эм съезде медицинских генетиков (Курск, 2000); IV Международном симпозиуме (Биологически активные добавки к пище: XXI век» (СПб, 2000).

Опубликованы 2 статьи, получено положительное решение на выдачу патента на способ

приготовления молочной смеси.

Основные положении, пьшоснмьге ня защиту:

1. В течение всего постимплангационного периода ЖМ принимает активное участие а метаболизме меди зародыша.

2. Эмбриональный тин метаболизма меди адаптирован к ЦП как к источнику ионов иедн.

3. При вскармливании СИВ у новорожденных лабораторных грызунов изменяется распределение медк в организме.

Огруктури /шггерштш. Диссертация изложена па ....... страницах, состоит из глав:

инедонно, «Язнр лнюршуры, MBioptHuiij и метод«, речулмиты и обсуждение

Ш'СлидоппннИ, 'tiiKfiio'icutiy, iiuikvim, l'nOom содержит ......... рисунки, ....... '1Я(!лнн н

........OXUMM. Цитнр»"»м>........pllfilir ня русском И ннглийоком и1|,|квх.

2. МЛТЕРИЛЛМ И МКТОДЫ II работе использованы обриты грудной» молока, сыворотка пугюииштП кропи здоровых новорожденных, эмбрионы крыс разной! срока разшгтия, а также белые беспородные

крысы. В работе использованы раствор кристаллов ЦП человека, 140 мг/ (Абю\28о=0,0045), произведенный в Институте микробиологии и эпидемиологии ( Пастера, Санкт-Петербург (Россия), кроличьи антитела к препаратам ЦП человека крысы. Пептиды, соответствующие участку V6*ETYFPGYNRS1SRTET983 АТР7А (Р16) участку " 'QKVFPNPNKHISQM1 АТР7В (Р13), были синтезированы в Лаборатории К (ИВС РАН, СПб) твердофазным методом на носителе бензгидриламинополистироле использованием Boc/Bzl-етратегии и очищены методом обращено фазовой ВЭЖХ градиентном хроматографе фирмы «Waters», модель 600 (США). Аминокислотный cocí синтетических пептидов определен с помощью аминокислотного анализатора «Ami Acid Analyzer Т339М», фирмы «Mikrotechna», Чехия. Массы пептидов определе методом масс-спектроскопин на времяпролетном масе-рефлектоне с источником toi типа «Электроспрей», сконструированном в Институте аналитического прибореcrpoci РАН, СПб. Синтезированные лепгиды коныогировалн с гемоцианином камчатского кр< с помощью глютарового альдегида по методике, разработанной в Отделе молекулярн генетики МИИЭМ РАМН д.м.н. М.М. Шавловским, и конъюгат использовали i получения антитела. В работе также использованы N'.N'-иейраминидаза, пектины клещевины и проростков пшеницы, агароза тип V, реактивы для электрофореза, АТР, хлор-1-нафтол, орто-дианизидии, пара-фенилевдиамин и фенилметилсульфоиилфтор (ФМСФ) - фирмы "Sigma", США. Все неорганические соли - фирмы "Merck", Герман Нитроцеллюлозные мембраны, диаметр пор 0,45 мкм, - фирмы "Schleicher and Schií Германия. Вторые антитела, произведенные Институтом эпидемиологии и микробиолог им. Н.Ф. Гамалеи, Москва (Россия), и вторые антитела, конъюгированные с лероксидаз которые произведены в Институте вакцин и сывороток, Санкт-Петербург (Pocen Ia"l']í/ATP и [ml]Na произведены АО «Изотоп», Санкт-Петербург. Равномерно меченн [иС]ам1шокислоты (удельная активность 54 мКнУмЛ) - фирмы "Amersham", Англ [|'|С)г|1дролизат хлореллы (40 МБк/мл) фирмы "Изотоп" (Чехословакия). Рентгенова пленка фирмы "Fuji", Япония.

Снятое молоко (растворимая фракция) получали центрифугированием молока при 15С об/мин в течение 30 мин при 4°С, центрифуга К24. Общую оксидазную активно! определяли по методу Рэвина (1956). Содержание ЦП определяли мегодом ракели количественного иммуноэлекгрофореза (Laurel), 1967), в качестве стандарта использов.-электрофорегически чистый препарат ЦП. ЦП из феталыюй сыворотки получ; сочетанием методов ионообменной и аффинной хроматографии на колонках с JY3A сефарозой и пара-феннлендиамин-сефарозой 211, соответственно (Пучкова Л.В. и ¡ 1998). Выделение РНК из полирибосоиной фракции проводили по методу Rhoads (194 дот- и Northern-блот гибридицацию проводили по методу, описанному в руководстве клонированию генов (Маниатис и др. 1984). В качестве ДНК-зонда использовали кД ЦП крысы, предоставленную проф. Gitlin (Вашингтонский Университет, Сан-Лу США). Концентрацию меди измеряли методом агомно-абсорбционной спектралы спектрометрии с электротермической ионизацией и Зеемановской коррекц1 неселективного поглощения па спектрометре фирмы Perkin-Eliner Model 410(1

«посредственно в образцах молока, сыворотки крови и спинномозговой жидкости. Для пределения концентрации меди в тканях целые органы (печень и мозг) предварительно ысушивали до постоянного веса в вакууме над пятиокисмо фосфора. Высушенные ткани известным весом сжигали в смеси хлорной и серной кислот и деионизнрованиой воды в бъемных соотношениях 100:25:12S, соответственно.

'адиоактивность определяли на жидкостпо-сцитилляционном счетчике "RackBeta", Цвеция. Электрофорез в неденатурирующих условиях проводили в 7,5% юлиакриламидном геле (ПААГ) в прерывистой системе рН. Электрофорез в енатурирующих условиях - по методу Laemmli (1970). Гели высушивали и адиоавтографировали. Перенос осуществляли полусухим методом, иммунные комплексы ыявляли с помощью вторых антител, конъюгированных с пероксидазои хрена или адиоиоднрованных в присутствии хлорамина Т. Содержание общего белка в зависимости т задачи определяли биуретовым методом, по методу Лоури или по номограмме оотногнении поглощения Ашпю-

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Гасгоящая работа посвящена изучению роли источника меди для млекопитающих при мбриональном типе метаболизма меди Ранее было показано (Мокшина, 1998), что [рактически все ионы меди в грудном молоке включены в состав тканеспецифического ЦТ, который синтезируется в клетках молочной железы, а содержание меди в ежедневном анионе новорожденного регулируется путем кзменеиия активности гена ЦП в молочной <елезе. К тому же, у новорожденных крыс, сохраняющих эмбриональный тип (ехаболизма меди, ЦГ1 молока переносится из ЖКТ о кровоток и поглощается в первую (Чередь клетками печени, а затем к клетками других органов. На основании полученных анных было высказано предположение, что между источником меди для организма (ЦП свободные ионы меди) и типом метаболизма меди (эмбриональный и взрослый) ухцествует причинно-следственная связь. Она выражается в том, что при эмбриональном ипе метаболизма меди в кровоток поступает такая молекулярная форма ЦП, которая называется с клетками печени. Ее источником предположительно могут быть пезародышеиые ткани эмбриона (показано, 'по [П5ЦЦГ1 из кровотока матери не ереноыл-ся в ткани зародыша), а после рождения - молоко. У взрослых (после окончания ериода молочного вскармливания) необходимость в такой форме ЦП исчезает, так как вободные ионы меди после абсорбции в кишечнике, связавшись с r-истидином, или льбумином, сразу поступают s печень (Cousin, 1985), Если такое предположение верно,

0 в крови зародышей должна циркулировать молекулярная форма ЦГГ, сходная с ЦП юлока, а внезародышевыё ткани эмбриона должны синтезировать ЦП. В свою очередь о начимостн источника пищевой меди для новорожденных могли бы свидетельствовать зменения в метаболизме меди при избытке свободных ионов меди в рационе.

1 целях проверки выдвинутого предположения в настоящей работе изучены: (1) кспрессия генов МСМ в ЖМ; (2) свойства ЦП, выделенного из пуповинной крови, в равнении с ЦП, полученного из сыворотки взрослых люден и молока; (3) распределение овосиитезироваппого ЦГ! в организме крыс при эмбриональном типе метаболизма меди;

(4) влияние вскармливания СИВ (избыток свободных ионов меди) на распределение м у 8-дневных крыс. - - •--• -

3.1. Экспрессия генов МСМ в клетках ЖМ крыс. В первой части работы предполагалось выяснить роль ЖМ до формирова! эмбриональной печени в поступлении, распределении и выведении меди из тка: зародыша. Согласно нашей рабочей гипотезе на 11-й день эмбрионального развита клетках ЖМ экспрессируется ген Лц>7а (для связывания ионов меди, транспортируем ЦП), ген А1р7Ь (для включения ионов меди в ЦП и ее выведения) и ген ЦП. По • формирования печени роль ЖМ снижается. При этом в первую очередь прогресси! снижается активность гетА1р71>, так как в это время медь аккумулируется в зародыше] печени.

3.1.1. Выявление белковых продуктов гепт /\tp7a и Л1р7К В тканевых экстрактах 31 крыс методом иммуноблотпшга с помощью антител к синтетическим пептид соответствующим участкам АТР7А и АТР7В, обнаружено присугст: иммунореактивных полнпептидов АТР7А (рис. 1 а) и АТР7В (рис. 16). иммуноблотннге видно, что максимальные молекулярные массы полипептидов А'П'71 АТ1'7В примерно соответствуют 150 кДа. Одновременно па иммуноблотннге выявляю наборы иммунореактивных полипептидоа меньшего размера. Огчетливо видно, что молекулярно-весовой характеристике наборы полипептидов АТР7А и АТР7И различ то есть, специфичны для каждой из АТРаз. В следующих опытах электрофорезу в ПА/ ЯОЯ подвергали нефракционирозанные лизаты гомогенатов ЖМ на 11-й д эмбрионального развития. На радиоавтографах иммуноблотинга (рис. 1в) видно, чт< лизатах отсутствуют наборы низкомолекулярных иммунореактивных полипепти, АТР7А ч АТР7В, а молекулярные массы этих белков примерно соответству максимальным расчетным размерам (Уи1ре с( а!., 1993; Сох е1 а1., 1993). Результаты этой части работы, позволяют однозначно заключить, что в течи постимплаитацнонного периода, до и после формирования печени, в клетках 31 экспрессируются гены обеих медьтранспортных АТРаз. Продуктами их экспрес* являются полноразмериые молекулярные формы АТР7А и АТР7В.

3.1.2. Экспрессия гена ЦП в клетках ЖМ. Активность гена ЦП в клетках ЖМ 61 изучена па 11-й и 20-й дни эмбрионального развития. В опытах использовали фрагме! изолированных ЖМ и шгтакгаые ЖМ, содержащие зародыши, а также печень эмбрио] и взрослых крыс.

Об экспрессии гена ЦП иа ургтне трансляции судили по скорости синтеза ЦП в услов! сгационарного мечения в буфере А (10 мМ калий-фосфатного буфера, рН7.4, 0.15 №С1), содержащем 10 мМ глюкозы и 4 МЬк смеси [,4С]-амннокнслот в 1 мл. Ипкубац проводили в течение 3-х часов с постоянным встряхиванием при 37"С. Среду собирал! просветлили центрифугированием в течение 10 мин при 13000 об/мин микроцентрифуге фирмы «Весктап». ЖМ ополаскивали, гомогенизировали и гомогеката центрифугированием получали пиегмитоховдриальную фракцию. Из него и инкубационной среды с помощью аштпел кролика к ЦП крысы и антител осла

шмуноглобулинам кролика (2-е антитела) прецнлнтировали ЦП (Gaitskhoki et al,, 1981). Э скорости синтеза ЦП судили по относительному содержанию радиоактивности в шмунопреципитате к общей ТХУ-нерастворимой радиоактивности во фракции. Сказалось, что в условиях стационарного мечения доля ЦП, секретированного иодированными ЖМ на 11-й день эмбрионального развития, составляет 5,2%, а на 20-й jeiib - 3,1% (приведены средние значения трех независимых опытов, в которых уровень «специфической преципитации составлял менее 0,3%). Содержание [14С]ЦП в тканях КМ соответственно составило 0,1 и 0,12%. Результаты свидетельствуют о том, что :ннтезирующийся в ЖМ ЦП полностью секретируется и после секреции в условиях in >iiro не связывается с клетками ЖМ. Значительное, почти в 10 раз (1,1%), повышение юли [ИС]ЦП в ЖМ наблюдали а этих же условиях эксперимента, если использовали «поврежденные (содержащие зародыши) ЖМ на 11-й день эмбрионального развития. Цоля [|4С]ЦП в инкубационной среде в этих опытах составила 3,7%. В отдельной серии эпытов было показано, что изолированные зародыши этого срока развития не ;ннтезируют ЦП. Полученные результаты, таким образом, показывают, что клетки ЖМ :екретируют ЦП как к зародышу, так и к децидуальной оболочке.

Изучение перемещения ¡"СЩП. синтезированного я тетках ЖМ 1 ¡-дневных эмбрионов. 5ыдо предпринято на целых эмбрионах 11-го дня развития в экспериментах «пульс-чейз» гипа. Неповрежденные ЖМ с зародышами на 11-й день эмбрионального развития ннкубнровади в условиях биосинтеза бедка, как описано выше. Через 1 час среду избирали, зародыши ополаскивали от не включившихся меченых аминокислот и разделяли на две группы. Первую группу помещали в среду DMEM и продолжали инкубацию в течение двух часов. Зародыши второй группы а такой же среде оставляли на льду. Через два часа у зародышей обеих групп микрошприцом отбирали вмниотическую жидкость, отделяли ЖМ и освобождали зародыш. В полученных фракциях определяли »держание ЦП как процент от общей радиоактивности, белков в инкубационной среде, ЖМ, амниотической жидкости или в зародыше, соответственно (детали см. выше). Так как ЦП не синтезируется в тканях эмбриона на 11-й день развития, полученные данные этражают перемещение [|4СЩП, синтезированного клетками ЖМ, в эмбрионе (приведены средние значения 3 независимых опытов). Результаты показали, что в инкубационной :реде через 1 час мечения обнаруживается примерно б% [14С]ЦП, а через 2 часа «чейза» -2%. В тканях зародыша через 1 час выявляется 2,5% [МС]ЦП, а к концу эксперимента -примерно в 5 раз меньше (0,5%). В ЖМ на первом сроке эксперимента (1 час мечения) удержание ЦП составляет 0,13% и повышается до 0,57% к концу опыта. Видно, что [|4С]ЦП, синтезированный в клетках ЖМ и поступивший в ткани зародыша, перемещается затем в ткани ЖМ. Обмен меченым ЦП между ЖМ и зародышем происходит через амннотическую жидкость (2,7% и 4,4% [|4С]ЦП через 1 и 2 часа, соответственно). Для того чтобы уточнить действительно ли [14С]ЦП, секретируемыи клетками ЖМ в сторону зародыша, вновь возвращается в них, результаты этих же опытов были обработаны другим способом. В расчетах не учитывался ЦП, обнаруживаемый в инкубационной среде, так как он секретируется к децидуальной оболочке.

Радиоактивность ЦП, обнаруженного в амииотическон жидкости, в тканях зародыша ЖМ суммировали и принимали за 100%.* От этой величины вычисляли долю ЦП отдельных частях эмбриона. Расчеты выполнены для каждого срока эксперимен-Оказапось, что через час мечения в амниотнческой жидкости присутствует ~53% [НС]Ц в тканях зародыша - ~46%, а в ЖМ - около 1%. Через 2 ч "чейза" основное количест [МСЩП (примерно 78%) обнаруживается в амннатичеокой жидкости. Содержан меченого ЦП в тканях зародыша при этом падает почти в 4 раза (около 11%), а в клегк ЖМ повышается более чем в 10 раз.

Полученные данные показывают, что ЦП, секретируемый клетками ЖМ в амниотическ) жидкость, поступает в ткани зародыша, затем экскретируегся ими в аипиотичсск; жидкость. ЦП, освобожденный тканями зародыша, в отличие от новосшггезнрованно] поглощается клетками ЖМ.

Поля/тая секреции ЦП клетками ЖМ на 20-fi fk'tth эмбриональногоразвития Проверка способности клеток ЖМ на поздних сроках постнмплаитационного развит полярно секретировать ЦП была осуществлена на лоскутах ЖМ на 20-й де эмбрионального развития в опытах пульс-"чейз" типа. Лоскуты ЖМ освобождали прилегающих оболочек и закрепляли с помощью суровых ниток на пробирке ти "Eppendorf". Дно пробирки срезали, через образовавшееся отверстие добавля. инкубационную среду (200 мкл буфер А, содержащий 10 мМ глюкозы и 4 МБк сме [иС]-аминокислат). Герметично закрепленные на пробирке лоскугы ЖМ помещали пробирки большего диаметра, содержащие такое же количество инкубационной среды, половине случаев висцеральная сторона ЖМ была обращена внутрь пробирки ти "Eppendorf", в другой половике - наружу. Через 1 час инкубации при 37°С разделешн ЖМ как мембраной среды собирали, а в пробирки добавляли раствор Хенкса, содержащ] полный набор немеченых аминокислот. Инкубацию продолжали еще 2 часа. Сред собранные раздельно на всех сроках эксперимента, осветляли и во фракциях определи, радиоактивность общего белка и ЦП (детали см. выше). Опыт повторяли 4 раза. Д оценки статистической значимости средних значений для обеих групп применяли критерий Стьюдента. Результаты эгих опытов прямо продемонстрировали, что клет ЖМ секретируют ЦГГ как к децидуалыюй оболочке (8,2+1,3% и 3,7+1,7% через I и 2 ча эксперимента, соответственно), так и к зародышу (3,9+0,3% и 6,7+0,6% через 1 и 2 ча эксперимента, соответственно). При том в 1-й час опыта к децидуалышй оболоч секрстируется 70% синтезированного [!4С]1ДП. В последующие 2 часа - 30%. Напрот! доля [МС]ЦП, сскретируемого в сторону зародыша, в течение первого часа опы составляет 40%, а в течение 2-часовото "чейза" - 60%. Разница в характере динами секреции и градиент между секреторными формами ЦП, поддерживаемый Ж1 достоверны. Полученные данные однозначно свидетельствуют, что в клетках ЖМ протяжении посгимплантацнонного периода сшггезируются и полярно секрегируются д молекулярные формы ЦП: "быстрая", которая секрстируется в сторону децидуалык оболочки и "медленная", секретируемая в сторону зародыша.

8а

Рис. 1. Иммуноблоттинг мембранных белков клеток ЖМ;

антитела к: а - Р16 АТР7А; 6-Р13 АТР7В; 1 и 2 - ЖМ на И- и 20-й дни эмбрионального

развития, соответственно, с - иммуноблоттинг лизатов ЖМ на 11-й день эмбрионального развития;

3 - антитела к Р16 АТР7А,

4 - антитела к Р13 АТР7В; Стрелка показывает положение полноразмерной (132 кДа) полипептидной цепи ЦП крысы.

а и Ъ - окрашено 4-хлор-1-нафтолом; с - использованы [п 1]вторые аш-итела.

28S-*

18S—>

Рис. 2. ЫопЬегп-блот гибридизация полирибосомной РНК из печени крысы на 19-й день беременности (1), ЖМ (2) и печени зародышей (3) на 19-й день эмбрионального развития. В лунки внесено по 70 мкг полирибосомной РНК.

Относительное содержание и fxriuep ЦП-мРИК в клетках ЖМ, печени эмбриона на ! день эмбрионального развития и печени крьгсы на 20-й день беременности, б определены методом Northérn-бяот гибридизация с помощью ["Р]кДНК ЦП. Даш приведенные на рис. 2, показывают, что уровень экспрессии гена ЦП в клетках Ж\ сравнению с печенью плода к концу эмбрионального периода не отличается значнгел В обоих органах преимущественно содержится молекулярная форма ЦП-мРНК длишн т.н., которая программирует синтез ЦП сыворотки крови (Oitlin, 1989). В сос полирибосомной РНК печени взрослой крысы присутствуют еще две дополнитеан молекулярные формы ЦП-мРНК, описанные ранее (Цммбаленко, 1995). Видно, ч печени беременной крысы практически отсутствует молекулярная форма ЦП-м1-предположительно программирующая синтез ЦП желчи (4,1 т.н.), который обеспечи выведение избытка ионов меди, поступающей с пищей (Iyengar el al., 1989; Пуч» 1994). Можно допустить, что снижение содержания этой формы ЦП-мРНК беременности связано с повышением уровня ЦП в крови примерно в три ра: соответственно с ростом потребления меди. ЦП-мРНК длиной 4,1 т.н. присутству клетках ЖМ и не выявлена в клетках печени плода (рис. 2). Низкомолекулярная ф< ЦП-мРПК (длина 1,8 т.н.), предположительно, программирующая си внутриклеточного ЦП-подобного белка, отчетливо выявляется в составе РНК ne беременной крысы, но не обнаружена в эмбриональной печени и ЖМ. Результаты этой части работы, показывают, что клетки ЖМ в течение i постампла1ггациониого периода содержат МСМ, в которую вместе с АТР7А и AI также входят две полярно секретируемые молекулярные формы ЦП. Обнаруженная S частично сходна с МСМ печени взрослых млекопитающих. Особенностью, отличая ее от МСМ взрослой печени, является то, что, наряду с АТР7В, в нее входит и АТР7А В целом, полученные данные позволяют считать, что ЖМ и после формирос эмбриональной печени и активации гена ЦП продолжает синтезировать ЦП, koti секрегируетси к зародышу и, вероятно, является источником меди для Одновременно, на фоке прогрессивного аккумулирования меди в эмбриональной пе (-13 и ~31 мкг/r сырой ткани иа 19- и 22-й дни эмбрионального развития, соотвегсгв< ЖМ синтезирует и секретируег к децндуальной оболочке ЦП, который предположит« участвует в выведении меди.

3.2. Выделение и характеристика феталыюго ЦП человека. Представленные результаты и данные литературы об экспрессии гена ЦП в клетках * и плаценты (Scliilsky et а1., 1992; Thomas, Schreiher, 1989), хорошо согласуют предположением, что зародыш после формирования печени продолжает- использовал синтезированный инсзародышевымн тканями. Сравнительный анализ феталыюго I ЦП крови взрослого человека может способствовать как проверке этого лредполож зак и пониманию механизма, обеспечивающего гомеостаз меди в эмбриональном пер 3.2.1. Сраегштельная характеристика препарата ЦП, выделенного uj пупоеи крти. Элекфофоретически чистый препарат феталыюго ЦП был получен из nynoei кропи методами ионообменной и аффинной хроматографии (Пучкова и др., 1997). Н;

За.

га

! t \ '

* <.

Рис.3 Электрофорез препаратов ЦП, полученных из сыворотки взрослых людей и сыворотки пуловипной крови. а - электрофорез проводили d 7,5% ПААГ. J, 3 - ЦТ1 взрослых людей; 2, -I - феталышй ЦП; J, 2 - окрашено орто-дианизидином,

3, ■/ - иммуноблоттинг препаратов ЦП.

б - электрофорез в 7,5% ПААГ-0,1% SDS.

1 - ЦП взрослых людей, 2 -фетальный ЦП

а

Рис. 4. Двухмерный нммуноэлектрофорез препаратов ЦП из сыворотки крови взрослых людей (а) и из пуповинной крови (б). Препараты ЦП без обработки

(1); обработаны Хелекеом-100

(2); после связывания с избытком конканавалина А (3). В лунки вносили по 20 мкг ЦП. Стрелка - направление электрофореза

3 видно, что в отличие от ЦП сыворотки крови взрослого человека (ЦП получен г технологии, разработанной М.М. Шавловским) ЦП из пуповшшой крови не содеряо-быстро мигрирующей фракции ЦП, которая не обладает оксидазной активностью методом иммуноблотинга может быть идентифицирована как аио-ЦП. Параллельн полученные и хранившиеся в одинаковых условиях препараты феталыюго и взрослого Ц отличаются по чувствительности к спонтанной протеолитической деградации (рис. 3). II этим двум параметрам ЦП из луповинной крови сходен с ЦП грудного молока (Мокшин 1998).

Препараты феталыюго и взрослого ЦП были инкубированы в течение ночи при 4°С постоянном помешивании с конканавалином А и затем анализированы методо двумерного иммуноэлектрофореза. Данные, приведенные на рнс. 4, показывают, что Ц крови взрослых людей взаимодейстнует с конканавалином А как гомогенный препара Напротив, препарат феталыюго ЦП содержит значительное количество ЦП, 1 связывающегося с конканавалином А Косвенно это указывает на его способносл взаимодействовать с группоспецифическим рецептором для асиалогликопротеино который локализован па плазматической мембране гепатоцнтов. Данные двумерно! иммуноэлектрофореза отчетливо демонстрируют молекулярную микрогеггерогенносп препарата фетального ЦП и его большую чувствительность его к обработ! специфической Си-хелатирующей смолой Хелекс-100. По всем перечислении параметрам фетальный ЦП сходен с ЦП грудного молока (Мокгиина, 1998). 3.2.2. Содержание ЦП, концентрация меди и плотность атомов меди на мапеку/ ЦП в пуповишиш крови. Содержание ЦГ1 у рожениц исследуемой группы (п=10) г данным оксидазной активности и количественного иммуноэлектрофореза составш 94,6+18,1 мг%, что примерно в три раза выше среднего значения ЦП в крови взросль люден (35,5+3,5 мг%). Результаты хорошо согласуются с известными данными повышении уровня ЦП при беременности в среднем в 3 раза. Содержание ЦП в сыворот! пуповинной крови детей (п—10) этих же женщин колебалось от 7,0 мг% до 20,8 мх% и среднем составило 12,5+4,4 мг%, что также совпадает с данными о низком содержат ЦП у новорожденных. Содержание ЦП, определенное по оксидазной актизност коррелирует с содержанием ЦП в этих же образцах, по данным количественно! ракетого иммуноэлектрофореза.

Оксидазная активность в образцах сыворотки крови снижалась в зависимости от време! диализа против 500-кратного объема натрий-ацетатного буфера, рН5,5, содержавшего !( мМ ЭДТА. При этом через сутки в крови взрослых людей оксидазная активное снижалась примерно в 11 раз (8,6+0,37 мг%), а в фетальной сыворотке - почти в 25 р; (0,5НО, 18 мг%). Так как в фетальной сыворотке крови, как и в крови взрослого человек обнаруживается единственный белок, обладающий оксидазной активностью, мож] заключить, что в ходе диализа ионы меди теряет именно ЦП, а фетальный ЦП н[ воздействии ЭДТА теряет ионы меди леще, чем ЦП крови взрослого человека. В эте отношении он сходен с ЦП грудного молока (Мокшина, 1998). Обработка образце фетальной и взрослой сывороток крови Хелекс-100 показала, что ЦП взрослых лют

теряет примерно 1 атом меди на молекулу ЦГ1, а фетальный ЦП в тех же условиях, теряет два атома меди на молекулу ЦП. Помимо этого оказалось, тго платность атомов меди на молекулу ЦП в феталыюй сыворотке выше, чем в ЦП крови взрослых (7 и 5 атомов меди na 1 молекулу ЦП, соответственно). Это наблюдение полностью согласуется с данными японских исследователей (Okumura et al., 1998), которые показали, что у жеребягг в первые дни жизни в крови повышено соотношение: ионы меди/ЦП. Похоже, что фетальный ЦП по содержанию лабильных атомов меди более сходен с ЦП молока (7 атомов меди на 1 молекулу ЦП в молозиве), чем с ЦП крови взрослых людей.

Сходство фсталыюго ЦП с ЦП молока, возможно, объясняется тем, что в составе препарата феталыгого ЦП присутствует, помимо ЦП, синтезированного в печени плода и полностью сходного с ЦП крови взрослых крыс (Пучкова и др., 1994), также ЦП, который син тезирован внезародьнневыми тканями эмбриона. Вероятно, этот ЦП, как и ЦГ1 молока, выполняет функцию источника медн для печени эмбриона.

3.3. Биосинтез н распределение [14СЩП в организме крыс при эмбриональном типе

метаболизма меди.

Основная цель этой части работы состояла в изучении распределения собственного новосинтезированного ЦП в организме крыс при эмбриональном типе метаболизма меди. В экспериментах типа «пульс-ченз» in vivo использовали крыс 7-дневного возраста .(эмбриональный тип метаболизма меди). Биосинтез и распределение [ИС]ЦП были изучены в печени, легких, почках, мозге, сердце, сыворотке крови и в суммарной клеточной фракции крови. Выбор органов для изучения осуществляли из следующих соображений. Печень была выбрана как центральный орган МСМ при любом типе метаболизма меди. Мозг - как орган, в котором МСМ, подобно МСМ печени, подвергается онтогенетической изменчивости. По, если в печени при смене типов метаболизма меди происходит снижение содержания меди, то в мозгу, напротив, при переходе на взрослый тип метаболизма меди содержание последней повышается. Легкие были выбраны как орган, в клетках которого ген ЦП активируется к концу эмбрионального периода и экспрессируется только в первые дни жизни в течение адаптации к дыханию атмосферным кислородом (Gillin et а!., 1991). Сердце — как орган, который при обоих типах метаболизма меди поглощает ЦП из кровотока (Linder et al., 1975, Пучкова и др., 1997). Почки - как орган, в котором при взрослом типе метаболизма меди, как и в печенн, экспрессируются ген ЦП (Пучкова и др., 1990) и выявлена активность гена Atp7b (Сох et al., 1993). Экспрессия обоих генов в почках значительно ниже, чем в печени, но отчетливо превышает пороговые уровни регистрации. В период молочного вскармливания клетки печени, легких, почек, сердца, крови, но не мозга поглощают ЦП молока из кровотока (ГГучкова и др., 1999). Изучение биосинтеза ЦГ1 и/или поступления его из кровотока в выбранные органы может дать дополнительную информацию о механизме функционирования МСМ на уровне целого организма при эмбриональном типе метаболизма меди.

.?..?./. Кшкипте! Iflf в нргапише 7-Лневных крыс. Способность внутренних органов 7-дневных крыс синтезировать ЦП была изучена in vivo в условиях импульсного мечения.

Перед опытом крысят отсаживали от матери в обогреваемый проветриваемый ящик и подвергали голоданию в течение двух часов. Затем per ох вводили 0,4 мл физиологического раствора, содержащего 160 мкКн [14С]-гидролизата хлореллы. Через 7 мин крыс возвращали матери. Для исследования использовали только тех животных, которые сразу начинали сосать. Незамедлительное поступление молока гарантировала выполнение условий пульс-чейз мечення в этих опытах.

Через 90 мин после введения метки животных декапитировали и извлекали печень, мозг, легкие, сердце и почки. Временной интервал равный 90 мин выбран, так как это время необходимо для максимального накопления новосинтезироваиного ЦП в секреторных пузырьках (Пучкова и др., 1984). Одновременно оно недостаточно, чтобы клетки органов могли бы поглотить новосинтезированный ЦП из кровотока. К тому же, за это время новосннтезированный рецептор ЦП, который перекрестно реагирует с антителами к ЦП, достигает плазматической мембраны и не «загрязняет» цитоплазму (Сасина и др., 1998). Долю новосинтезированного ЦП в постмитохондриальных супернатантах гомогенатов органов определяли, как описано выше. Полученные данные показали, что в сердце ЦП не синтезируется. Максимальную долю от новосинтезированных белков ЦП составляет в мозгу (около 5%), минимальную - в почках (0.6%). В легких и почках доля ЦП от всех новосинтезированных белков почти одинаковая (примерно 2%). Однако при расчете «валового производства» ЦП (имп/мин в органе) и определении относительной скорости биосинтеза ЦП (импУмин на 1 г ткани органа) оказалось, что перечисленных органах ЦП синтезируется со скоростью, убывающей в ряду печень->мозг->легкие—»почки. 3.3.2. Динамика шшвлеиия /,4С/ЦП в кровотоке 7-дневных крыс. Как и в предыдущей серии опытов, голодающим крысятам per os вводили меченые аминокислоты и через разные интервалы времени из сосудов шеи собирали кровь в пробирки, смоченные цигратным буфером. Отделяли плазму крови и клетки, основную массу которых составляют эритроциты. В плазме и в отмытых «тенях» эритроцитов определяли долю [НС]ЦП (рис. 5Л). Преципитаты, полученные с помощью антител к ЦП, подвергали молекулярно-весовому анализу в 7,5% ПААГ-SDS. Гели высушивали и радиоавтографировали (рис. 5Б). Видно, что [,4С]Ц11 появляется в кровотоке через 60 мин после введения метки и в течение последующих 3 час эксперимента содержание его в плазме меняется мало. Полученные результаты полностью совпадают с данными о скорости секреции новосшгтезированного ЦП клетками печени взрослых крыс in vivo (Пучкова и др., 1978), культивируемыми гепатоцитами in vitro (Алейникова и др., 1987) и распределением [1251ЩП молока (Рис. 5С, Мокшнна, 1998). Меченый ЦП обнаруживается в составе белков, связанных с тенями эритроцитов, после 2-х часов эксперимента (рис. 5А). Однако специфически связавшийся с эритроцитами [МС]ЦП (не удаляется обработкой декстран сульфатом), выявляется не раньше, чем через 2 час после появление его в кровотоке (рис. 5Б) Вероятно, это время необходимо in vivo для достижения равновесия между меченым и немеченым ЦП, специфически связанными с мембраной эритрощггов.

|"С]ЦП

плазма крови

клетки крови

I 1-1—I—I—и- t—t— ) tf & ^

|'"|]ЦГ1

сыворотка крови

-I----1—

60 120 243

клетки крови

12. а.

132цЦ

I 1 -1 * J

i z з ч s s 9Ю Н a

Рис. 5. Динамика появления ['"'СЩ.П в кровотоке 7-дневных крыс.

A. Относительное содержание меченого ЦП в плазме и в клетках крови. По оси абсцисс - интервалы временн после введения меченых аминокислот, мин; по оси ординат -[14СЩП, .

B. Молекулярно-весозон анализ новосипгезированного ЦП, циркулирующего в кровотоке через 60, 100, 120, 180 и 240 мин, соответственно (дорожки 1 - 5) и связанною с клетками крови в эти же сроки эксперимента (дорожки 8 - 12). Стрелкой показано положение полноразмерной молекулы ЦП крысы (132 кД)

C. Распределение [,251]ЦП молока (Мокшнна, 1998).

.?..?..?. Распределение и/тосиимелироваиного ЦП в оргапише 7-дневных крыс. Поел введения смесн [''С|-меченых аминокислот голодающим крысятам одного помета чере разные интервалы времени извлекали печень, сердце, почки, легкие и мозг. I постмитохондриалыюм супернатанте гомогонатов органов определяли дол1 новосинтезнрованиого ЦП. Аликвоту (20 мкл) ностмитохопдриалыюго супернатант использовали для ракетного пммуноэлектрофореза. После электрофореза гел высушивали и радиоавтографирооали. И зависимости от локализации радиоактивных зо судили о синтезе или поступлении [ЫС]ЦГ1 Если через 1 месяц экспонирования геля рентгеновской пленке, радиоактивных цреципнтационных зон не выявляли, то, считал! что в данном органе ЦП не синтезируется или не поступаег в него из кровоток; Результаты представлены на рис. Ь, правая панель. Они сопоставлены со скоросты распределения ['"[ЩП молока, который, как показано нами ранее, при эмбрионально! типе метаболизма меди переносится из ЖКТ и кровоток, а затем специфично поглощаете различными органами (левая панель рис. 6, результаты приведены по диссертации С.Г Мокшнной, 1998). При построении рисунков левой панели учтено, чт повосинтезированный ЦП (х-х) появляется в кровотоке через час после введения метки, [,251|ЦП молока через 10 мин

Печень. Видно, что [ЫС]ЦП синтезируется в печени и его содержание в гепатоцита достигает максимума примерно через 1,5 часа после начала опыта. Чатем уровень [14СЩ1 снижается, что, очевидно, связано с его секрецией в кровоток Сравнение скорост секреции ЦП из клеток печени и динамики появления его в кровотоке (рис. 6 и 5Р соответственно) показывают, что ЦП к 150 мин эксперимента практически покндас клетки печени. К этому времени уровень новосинтезнрованиого ЦП в плазме кров достигает стационарного значения. Сопоставление кривых на рис. 5А и 6 позволяе заключить, что ноиосшттезпрованный ЦП сразу после секреции не связывается с клеткам печени. Напротив, ||251]Ц11 молока сразу после поступления в кровоток связывается клетками печени (рнс. 6, левая панель). На поздних сроках эксперимента клетки печен захватывают и [МСЩП, и ['"|]ЦП молока.

tV/Vi'A*- В клетках сердца синтез ЦП не происходит, меченый ЦП поглощается i кровотока. Динамика поступления 1'4(\|ЦП и [|2М]ЦП. молока в клетки сердца т кровотока (правая и левая панели рнс. 6) совпадают.

Цочкп, При изучении распределения ||г51|Ц11 молока в организме крыс было покачано, чт радиоактивность к почках, и отличие от других органов (сердце, стенки различны отделов Ж1СГ, глаза, поперечно-полосатые мышцы и др.), нарастает в течение все> эксперимента (Пучкова и др., 1999) Па основании данных о накоплении в мои радиоактивных низкомолекулярных дериватах ЦП было сделано заключение, что почк выводят не утилизируемые радпоиодиронаппые аминокислоты, образующиеся пр расщеплении ЦП в лизосомах гепатоцитоь. Данные, полученные в настоящей работе (рш (>, правая панель), демонстрируют, что и почки на фоне низкого синтеза собственного Ц1 поступает ЦП in кровотока, который освобождается на поздних сроках эксперимент Вероятно, что клетки почек освобождают в кровоток и |'г,1|ЦП молока, но :п

¡"сщп

2 1,5 1

0.S о

- i - i—i—t -—t- i í1 # к'?

сердце

—i-. i- i

i i ■ i - i i-i 8S388RBS?

Г25ццп

о.в 0,6 0,4 0,2 о

■__

10 30 60 120 243

сердце

Г.., ,

10 30 ео 120 240

of —'

10 30 ьо

JÍ--

•Г—f-

13а.

Рис. 6. Содержание поиоспнтезиронапнога ЦП и различных органах7-днепных крыс ь чеченце «пульс-чепз» ^кспсримснти in vivo.

Но оси jficuiicc - цремч мни; но оси ординат иршиш панель - 1|Ц11, леиая iiKiicjii. рпинридилснии | "||Ц11 молоки (Мокншип, I4U8J, ч--х - (мС-]1 у I после поинлсиня и кропстже

освобождение маскируется поступлением в почки радиоиодированных аминокислот и т выявляется в экспериментах, результаты которых приведены на левой панели рис. 1 Вероятно, что при эмбриональном типе метаболизма меди почки, как и при болезн Вильсона, участвуют в экскреции меди.

Легкие. Скорость синтеза ЦП в легких сопоставима с таковой в печени (рис, б). I поздних сроках опыта содержание меченого ЦГ1 в клетках легких повышается, чп вероятно, указывает на нх способность поглощать ЦП из кровотока. Данные с экспрессии гена ЦП на уровне синтеза белка в легких получены впервые. Они полносты совпадают с данными об активной экспрессии гена ЦП на уровне синтеза ЦП-мРНК легких в периоде новорожденное™ (Gitlin et al., 1991).

Мозг. В представленной работе впервые продемонстрировано, что ЦП синтезируется мозгу новорожденных млекопитающих (рис. 6). Ранее экспрессия гена ЦП в различнь отделах мозга взрослых грызунов была зарегистрирована на уровне транскрипции трансляции (Гайцхокн и др., 1991; Gitlin et al., 1996). Иммунологическими методами о обнаружен в спинномозговой жидкости (Пучкова и др., 1988) и выявлен в разных отделг головного мозга по ферментативной активности (Pribyl et а!., 1980). В опытах по изучению распределения [т1]ЦП молока в организме новорожденнь крысят было показано, что мозг не поглощает меченый ЦП, а мембраны клеток мозга i содержат рецептор ЦП. Данные, приведенные на правой панели рис. 9, показывают, 4i до конца эксперимента [|4С]ЦП не поступает в клетки мозга.

Данные этой части работы позволяют заключить, что при эмбриональном тит метаболизма меди 1) печень синтезирует ЦП, который по кровяному руслу доставляется клеткам различных органов; 2) клетки печени не поглощают новосекретированный ЦП;'. помимо печени, ген ЦП активно экспресснруется, по крайней мере, в клетках мозга легких; 4) клетки мозга не поглощают ЦП из кровотока.

3.4. Влияние искусственного вскармливания на распределение меди в организме

8-лневных крыс.

Представленные данные позволяют считать, что эмбриональный тип метаболизма ме; адаптирован к экзогенному ЦП как источнику ионов меди. Существенным да поддержания гомеостаза меди у новорожденных, по-видимому, является механиз] регулирующий содержание ЦП в молоке на уровне активности гена ЦП (Пучкова и д[ 1997). При производстве СИВ требования к содержанию и «упаковке» ионов меди i учитываются. Так, традиционным сырьем для получения СИВ служит коровье молок Концентрация меди в нем в 2-3 раза ниже, чем в женском. Поэтому в изготавливаемь СИВ добавляют медь в виде неорганических солей, солей уксусной или лимонной кисло а также в виде соединений меди с глюкозой. ВОЗ рекомендует, чтобы 1 л готовой СИ содержал 400-500 мкг меди. Рекомендация не учитывает, что содержание меди в грудне молоке в течение лактации снижается в несколько раз, а в первые недели жизни обм молока, потребляемого новорожденным, увеличивается прогрессивно. Использован! СИВ приводит к избытку меди в рационе новорожденного.

3.4.1. Содержание меди в рационе новорожденных при грудном и искусственном вскармливании было рассчитано по данными о содержании меди в СИВ и |рудном молоке разного срока лактации, Расчеты, о которых испол!«зовали средне статистические данные, приведенные в педиатрическом справочнике, показали, что ребенок в возрасте полугода ежесуточно с СИВ получает 500-600 мкг меди, то есть 70-90 мкг Си2'/! кг массы тела. При естественном вскармливании новорожденный ежесуточно получает примерно 10 мкг Сч21/на I кг веса тела. Таким образом, при вскармливании СИВ ребенок получает примерно 7-кратный избыток меди.

3.4.2. Распределение меди в СПИ и в рудном молоке. Ранее проведенный анализ (Пучкова и др., 1997) показал, что в электрофоретичсских паттернах белков СИВ не содержится ни одного пептида, окрашивающегося в присутствии орто-дианизнднна, специфического хромогешюго субстрата ферраокендаз. При этом во всех СИВ обнаружена единственная зона, окрашивающаяся пара-фенилендиамином, хромогенным субстратом оксидаз. В готовых для использования СИВ выявляется оксидазная активность, которая после диализа практически становится равной нулю. В идентичных условиях снижения оксидазной активности в образцах молока не происходит. Данные позволяют заключить, что в СИВ атомы меди, в лучшем случае, слабо ассоциирована с белками. Так как при эмбриональном типе метаболизма меди ЦП молока переносится нз желудочно-кишечного тракта в кровоток и специфически поглощается разными органами (Пучкова и др., 1999), следует считать, что при искусственном вскармливании новорожденный получает избыток ионов меди в нефизиологической «упаковке».

3.4.2. Распределение меди « организме крысят, вскармливаелшх СИП В опытах использовали белых беспородных крыс. Известно, что у лабораторных крыс, как и у человека, в молоке ноны меди упакованы в ЦП, а содержание медн снижается в течение перной недели лактации снижается примерно в 5 раз (Пучкова, 1994; 1.оппсгс1а1, 1998). Смесь приготавливали так, чтобы она была сбалансирована с молоком крыс но содержанию общего белка, при этом содержание меди в смеси составило 500 мкг/л. Выбранная молочная смесь содержит ноны меди в виде минеральных солей. В приготовленной смеси выявлялась оксидазная активность, которая после диализа в течение ночи против 500-кратного избытка буфера не определяется. Таким образом, при вскармливании смесью крысы будут получать избыток меди, «не упакованной» в ЦП. Новорожденных крыс от трех-четырех матерей (по 5-8 крысят в помете) объединяли и, для того, чтобы минимизировать влиянне генотипов, случайно разделяли на две равные группы. Одну группу возвращали матерям для естественного вскармливания (контрольная группа), а другую выкармливали искусственно до 8-го дня жизни (опытная группа). Крысят опытной группы содержали при температуре, поддерживаемой примерно около 38"С, в проветриваемых условиях. Кормление производили с помощью беличьей кисточки без ограничения примерно через каждый час круглосуточно. Перед каждым кормлением крысятам совершали туалет, который состоял н обтирании всего тела стерильным оливковым маслом и в освобождении кишечника и мочевого пузыря. В течение опыта

производили регулярное взвешивание и вели наблюдение за развитием крысят обс^

групп 11 конце опыта после декапитацни собирали кровьи извлекали органы. -------

Начиная с 3-го дня жизни, крысы опытной группы отставали в весе от крыс контрольно группы. Разница достигала 20% к 8-му дню. Отлипание ушной ракооины, подъем-поворс головы, вставание на конечности, передвижение, вращение хвостом, появление iiiepcriroi покрова и прорезывание зубов у крысят обеих групп происходило одновременно. Или епеиие держания ЦП и лшОи а кропи крысят при искусственном вскармливании. образцах сывороток крысят обеих групп (в каждой группе я=6) содержание ЦП был измерено по оксидазной активности и методом количественного иммуноэлектрофореза. сыворотке крови крысят опытной группы уровень оксидазной активности оказался почт в три раза выше, чем у крысят контрольной группы (38,47+4,46 и 14,1+2,13 мг/100 м соответственно, tj=4,9; р<(),001), а незначительно ниже, чем у взрослых крыс (48+4 мг/100 мл). Наблюдаемое повышение оксидазной активности может быть следствием кг индукции экспрессии гена ЦП в печени, так и увеличения плотности ионов меди i молекулу ЦП. Если при искусственном вскармливании ген ЦП в печени активируется у» к 8-ым сугкам, то в крови должно повышаться содержание иммунореактивного Ц1 Результаты определения количества иммунореактивного ЦП в крови крысят обеих труп показали, что у крысят опытной группы в кровотоке циркулирует в три раза бо.тьп иммунореактивных гюлипентидов ЦП, чем у крысят контрольной группы (lj =8,' p<0,(J01). На фоне повышения скорости синтеза ЦП плотность ионов меди на молекут ЦП практически не меняется и составляет примерно 5 атомов меди на молекулу ЦП. if щоталыит. имшрнбоа/ящаЬ PffK печени крыс опытной группы методом до' гибридизации с меченой кДМК ЦП крысы бь1ло измерено относительное содержание ЦГ мРНК. Результаты измерения показали, что число копий ЦП-мРНК в клетках печени крь опытной группы повышается примерно в 2 раза. Это позволяет считать, что избьпт ионов меди в рационе новорожденных влияет на экспрессию гена ЦП. Содержание меди в печени и м<п?у Н-Инениых крысят, нскормленных СИВ. Известно, "г индукции синтеза ЦП предшествует снижение содержания меди в печени, которое течение молочного вскармливания увеличивается в 10-50 раз (Ilarley et al., 198С Результаты измерения концентрации меди в печени крысят обеих групп показали, что к I ому дшо жизни содержание меди в печени крысят опытной i-руппы достоверно снижает! (4,581.0,04 II 1,9111,20 мкг/орган, соответственно, /j=2,22; р<0,05).

Известно, что у новорожденных млекопитающих содержание меди в мозге находится i шиком уровне Напротив, у взрослых млекопитающих мозг, нараннес печеныо, относил к органам, содержащим наибольшей количество меди. Содержание меди в мозге у крь обеих групп было одинаковым (l,7Ht),40 и 1,72 И),61 мкг/орган, соотве1ственно) и ноч! н 3 раза ниже, чем и печени (пес печени и мотга у 8-днеиных крыс примерно одинаков). Данные о содержании ЦП в лнкворе при эмбриональном тине метаболизма меди jniii'paiype отсутствуют. Колпчеито ЦП н ликиорс и крови одних к тех же крыс бьи определено по оксидазной и антигенной активности. Оказалось, что с 6-дневн01 (эмбриональный т ни метаболизма меди) до 4-месячного (взрослый тин метаболизма мед!

возраста на фоне повышения ЦП в кровотоке почти а 10 раз содержание ЦП в ликворе остается постоянным м незначительным (0,3 мг/100 мл). В то же время, у крысят, вскормленных СИП, уровень ЦП в спинномозговой жидкости повышается почти в 7 раз (2,1 мг/100 мл). Содержание меди пропорционально содержанию ЦП. В совокупности, представленные в згой части работы данные показывают, 'по избыток меди в рационе новорожденных вызывает более раннюю активацию гена ЦП в печени и ведет к преждевременному переходу на взрослый тип метаболизма мели.

4. ВЫ ВОД М

1. ЖМ крыс активно участвует » метаболизме меди зародыша. Клетки ЖМ содержат МСМ, которая включает две медьтраиспортпые АТРазы (АТРазу Менкеса и АТРазу Вильсона), а также две самостоятельные полярно секрегируемые (к зародышу и к децидуальной оболочке) молекулярные формы ЦП.

МСМ в ЖМ функционирует в течение всего пост имплантационного периода.

2. Клетки ЖМ продолжают синтезировать и секретировать ЦП к зародышу после формирования печени и активации гена 1Щ в ней.

На фоне прогрессивною накопления меди в печени эмбриона клетки ЖМ синтезируют ЦП, который предположительно участвует в выведении меди.

3. Препарат фетального ЦГ1 отличается от препарата ЦП сыворотки крови взрослых людей и сходен с препаратом ЦП, выделенным из снятого грудного молока, по чувствительности к обработке ЭДТА и Хелекс-100, аффинности к конканавалину А, нлотности атомов меди на молекулу ЦП и устойчивости к специфической спонтанной протеолитическои деградации. Вероятно, препарат фетального ЦП включает молекулярную форму ЦП, которая синтезируется ннеззродышевыми тканями

2. При эмбриональном типе метаболизма меди, помимо печени, ЦП синтезируется в почках, легких н моле. Клетки сердца, почек, легких и крови, но не мозга связываются с ЦП, сшггезированным в печени и циркулирующим в кровотоке. Клетки печени не связываются с цовосекрегированным [ЫС]Ц11.

4. При эмбриональном типе метаболизма меди ее источником для клеток печени является экзогенный ЦП. При вскармливании молочными смесями новорожденные получают избыток меди, к тому же «не упакованной» в белковую оболочку ЦП.

5. У крыс, искармливаемых с первого дня жизни СИВ, к 8-му дню содержание ЦП в крови, по данным измерения оксидазной u sirntrcimoii активности, повышается примерно в 3 раза rio сравнению с контрольными крысами. Пропорционально увеличивается и концентрация меди в крови, плотность атомов меди на 1 молекулу ЦП не изменяется. Повышение содержания ЦП в крови полностью коррелирует с повышением активности гена ЦП в клетках печени на уровне транскрипции

Содержание меди в печени у искусственно вскармливаемых крыс достоверно снижается в два раза. Искусственное вскармливание не влияет па содержание медн в мозгу, но приводит к 7-кратному увеличению ЦП » спинномозговой жидкости.

5. СЛИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Жигулева Э.А., Мокшина С.В., Пучкова ЛИ , Гайцхоки B.C. - Некоторые свойст фетальиого церулоплазмнна человека. Бюллетень Экспериментальной Биологии Медицины, 1999, /2i,№10,453-456

2. Пучкова Л.В., Жи1улева Э.А., Мокшина С.В., Саснна Л.К., Цымбаленко H.I Платонова Н А., Гюлихандаиова Н Е., Свиридова Т.А., * Мищенко 1>.С, Гайцхоки В С Влияние искусственного вскармливания на распределение меди в организме 8-дневш крысят. Вопросы питания, 2000, №1/2, 27-32.

3 Пучкова Л.В., Алейникова Т.Д., Гайцхоки B.C., Жигулева Э.А., Мокшина С| Мищенко К.С., Сасина J1.K., Цымбаленко П.В. Способ приготовления молочной смеси д искусственного вскармливания новорожденных. Положительное решение о выда патента па изобретение №99118627/13 (019656) с приоритетом от 26 августа 1999 г. Тезисы:

4. Жигулева Э.А., Гюлихандаиова Н Е., Мокшина С.В., Платонова Н А., Ширианова M.I Якименко Ю Ь Избыток ионов меди в диете новорожденных при искусствен!« вскармливании молочными смесями, продающимися в Санкт-Петербурге. Вторая Сани Петербургская ассамблея молодых ученых и специалистов, с. 9, декабрь, 1997.

5. Mokshina S, Zhiguleva Е., I'latonova N., Gulikhandanova N. The copper ions content in d: of newborns as an ecological factor. The 2nd International Young Environmental Fori Ecobaltica'98, St.-Petersburg, July 1998,1'. 133.

6. Пучкова Л.II., Цымбаленко ll.B., Сасина Л.К., Скворцом НИ, Мищенко Б.< Мокшина С В., Жшулева Э.А., Платонова Н.А., Гюлихандаиова П.Е., Гайцхоки 11. Фактор экологической безопасности новорожденных по содержанию ионов мед МАНЭБ, научные чтения "Белые ночи", июнь 1998, с. 180.

7. Пучкова Л.В., Скворцова П Л., Мищенко Б.С., Цымбаленко Н.В., Сасина Л.1 Мокшина С.В., Жигулева Э.А., Платонова Н А , Власов Г.П., Гайцхоки B.C. Ochobhi направления создания безопасных молочных смесей для новорожденных по содержат! попов меди. ЮНЕСКО, 5ая Международная конференция " Право на здоровье" (Ребенок современном мире: права ребенка), мая 1998, Санкг-Петербург, с. 41.

8. 11.11. Скворцова, JI.B. Пучкова, М М. Шавловский, Л.К. Сасина, ГА. Платонова, С. Мокшина, А.Х. Мусолямов, ').А Жигулева, II.А. Платонова, Г.11 Власов, Ц.А. Егоре B.C. Гайцхоки Установление участка молекулы церулоплазмина, взаимодействующего медь'фанспортиой А'ГРазой Менкеса. XIV Менделеевский съезд по общей и прикладт химии. Санкт-Петербург, 1998. Рефераты докладов и сообщений, М., 1998, №4 (Хим живого) с 144.

9. I..V. I'uchkova, N.N. Skvortzova, M M. Shavlovski, L.K. Sasina, G.A. I'latonova, S. Mokshina, A. Kit. Musolyanov, E.A. Zhiguleva, N.A. I'latonova, G.P. Vlasov, Ts.A Egorc V.S. Gaitskhoki. The interaction of"the ceruloplasmin receptor and putative copper transports ATPase encoded by Menkes disease gene. International symposium "Protein structure, stabili

and folding. Fundamental and medical aspects. Moscow, Russia, June 22-26. liook of l'rogram

and Abstracta, OMÍ'l Í'NC, Pusbino, 1998, p. 198.

10. Boris Mishenko, Ludmila Puchkova, Evelina Zhiguleva, Tatyana Sviridova, Olga Bodrova, Román Povalikhin, Nadejda Tsymbaienko, Vladimir Gaitskhoki. Equipment to the measuremenI of the concentraron of coordinate-bound copper in milk-like dispersing [¡quid. Материалы Международного Рабочего совещания по оптическим технологами в биофизике и медицине. Саратов, 5-8 октября 1999 г.,

М. Пучкова Л.В., Жшулева О.Д., Мокшина СП., Внчевая Н.К., *Скворцова Н.Н., Свиридова Т.В., Повалихин Р.Г., Чеботарь П А. Изучение механизма, обеспечивающего гомеостаз меди в эмбриогенезе млекопитающих. Материалы 2-ш съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, С'анкт-Пегербург, 1-5 февраля 2000г.,

12. Пучкова Л.В., Жигулева Э. А., Свиридова Т В., Скворцова U.H., Сасина Л.К., ГаПцхоки В С. Экспрессия генов болезни Меикеса и Вильсона в клетках желточного мешка крыс в течение эмбриогенеза. Материалы 2-го съезда медицинских генетиков, Курск, 16-19 мая 2000 г.,

13. Цммбаленко Н.В., Жигулева З А., Гюлиханданова Н Е., Повалихин Р.Г., Платонова Н А., Свиридова Т.В., Сасина Л.К., Скворцова H.I f, Мищенко Б.С., Гайцхоки В.С., Пучкова Л.В. - Связь между уровнем экспрессии генов, поддерживающих гомеостаз меди, содержанием ионов меди в пище и типом метаболизма меди в раннем онтогенезе. Материалы 2-го съезда медицннскнх генетиков, Курск, 16-19 мая 2000 г.,

15. Пучкова Л.В., Цымбалеико НИ., Сасина Л.К., Жигулева Е.А., Повалихин Р.Г., Платонова П.А., Свиридова Г.В., Гюлиханданова 11.Е., Еичевая ПК., Мищенко К С., Гайцхоки В.С. - Разработка подходов для создания физиологически адекватных медьсодержащих добавок в молочные смеси. Материалы IV Международного симпозиума «Биологически активные добавки к пище: XXI век», Санкт-Петербург, 22-24 мая 2000 г..

Ptißoma поддержана грантами РФФИ № ЧН 01-49790 и М 98-04-4984&, Прогролиюй "¡'гном человека" (.•fiati/a .Vi' 74-98), Mt'-jutiyjotiCKoU научной программой "Униаерситеты России -фундаментальные пестования" (Mb 1JI6), Программой ¡'КИТ "Приоритетные /¡¿травлении генсними" (ЛЬ грантом Cotiemtt тнкк'ржкн "Недущие науи/ые шкпды России" (№96-15-

<Л742), грантом ФЦП «Интеграция» (АО!37).

Atttnop припасши {ttiUfuktfi/Htmh рукшъмнапелм* JlufiojHirtwpuu нронанмяьной Оич.'шнчпнхи tIAiit' им. Спина РАМИ <Ьш fit', ¡¡ирппону itt кинетрукгнинное обсуждении диа-е/тшцин Мокшшшй (19VH). «искаьишые им, uacmtetno Пыли испольмианы ори ра'цмСютке

пиша исследований настотцей работы. Автор также признателен руководителю Отдели оиохимни ШШЭМ РАМН д.ш А.;( Ценисенко за ушетне « обсуждении данной работы.