Механизмы влияния ионов серебра на метаболизм меди млекопитающих

Ильичева, Екатерина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы влияния ионов серебра на метаболизм меди млекопитающих
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизмы влияния ионов серебра на метаболизм меди млекопитающих"

ИЛЬИЧЕВА Екатерина Юрьевна

МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ИОНОВ СЕРЕБРА НА МЕТАБОЛИЗМ МЕДИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2, \Ш 2014

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2014

005549001

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" СевероЗападного отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Цымбаленко Надежда Васильевна Официальные оппоненты:

Шпаков Александр Олегович, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук, заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии.

Дубинина Елена Ефимовна, доктор медицинских наук, профессор, Государственное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский психоневрологический институт, им. В.М. Бехтерева Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию", главный научный сотрудник отделения клинико-диагностических исследований.

Ведущее научное учреждение: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный университет".

Защита состоится «5» июня 2014 г. в 15.00 часов на заседании Диссертационного совета Д001.022.03 при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12) по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр. 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12) и на сайте http://www.iemrams.spb.ru/russian/dissov03.htm

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета:

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

У млекопитающих медь выполняет ряд функций. Она является структурным и энзиматическим кофактором жизненно важных купроэнзимов (Tapiero et al., 2003). От медь-опосредованного стимулирования эндотелиального фактора роста зависит процесс формирования сосудов (Easter et al., 2010). В макрофагах взрослых млекопитающих сигнальная система, в которой одним из звеньев является медь, участвует в ранних этапах формирования иммунного ответа (Gérard et al., 2010). Кроме того, медь участвует в регуляции клеточного цикла через индукцию апоптоза (Mufti et al., 2007), контролирует баланс между гликолизом и дыханием, изменение которого ведет к перепрограммированию нормального энергетического метаболизма на специфичный для опухолевых клеток (Gogvadze et al., 2010). При этом свойство меди связывать и активировать молекулярный кислород в неконтролируемых условиях может приводить к образованию активных форм кислорода, которые действуют на клетки подобно ионизирующему излучению (Armendariz et al., 2004). Безопасный перенос меди осуществляет высококонсервативная метаболическая система меди (МСМ) (Banci et al., 2010; Gupta, Lutsenko, 2009). MCM всех эукариотов сходны, они включают интегральные мембранные и растворимые цитозольные белки, кодируемые ортологичными генами. Белки МСМ транспортируют медь в состоянии окисления Cu(I) однонаправленно и последовательно при прямых белок-белковых взаимодействиях вниз по градиенту энергии связывания. В поддержании гомеостаза меди в целом организме ключевую роль играет печень.

Врожденные ошибки метаболизма меди, ее экологический избыток или недостаток приводят к развитию тяжелых заболеваний (нейродегенеративные заболевания, болезни сердечно-сосудистой системы, рак и др.) {Manso et al., 2011; Gaggelli et al., 2006).

Строение наружной электронной оболочки Cu(I) сходно с таковой у Ag(I) и их координационные свойства похожи (Коттон, Уилкинсон, 1969), поэтому медь-связывающие мотивы белков МСМ координируют и транспортируют Ag(I). Однако ни одного фермента, требующего для своей активности серебро, и ни одного физиологического процесса, зависящего от серебра, в живых организмах не обнаружено. В то же время использование серебра в хозяйственной деятельности человека постоянно растет, поэтому оно может стать фактором загрязнения окружающей среды. На это указывает то, что у морских млекопитающих его количество в печени увеличивается с возрастом. (Nielson, 1986; Saeki et al., 2001). Серебро, конкурируя с медью за транспортные белки, снижает биодоступность ионов меди (Pétris et al., 2003; Bertinato et al., 2010; Choi et al., 2006) и встраивается в активные центры купроэнзимов (Скворцов и др., 2010; Wilcoxert et al., 2011), что приводит к потере их активности.

Это делает актуальным и необходимым исследование влияния серебра на различные аспекты метаболизма меди у млекопитающих, что отражается в

интересе к этой проблеме ряда ведущих лабораторий мира (Barry et al., 2011; Ibricevic et al., 2010; Bertinato et al., 2010; Vest et al., 2013).

Цель работы

Изучение гомеодинамики меди у крыс, длительное время употреблявших корм, содержащий ионы серебра.

Задачи исследования

¡.Изучить влияние ионов серебра, в зависимости от начала Ag-диеты (1 кг стандартного корма содержит 50 мг хлорида серебра) и длительности ее применения, на показатели статуса меди в сыворотке крови (концентрация меди, содержание иммунореактивного церулоплазмина (ЦП), основного медь-транспортного белка, и (ферр)оксидазная активность). В клетках печени оценить (а) активность генов МСМ на уровне транскрипции и содержания иммунореактивных полипептидов медь-связывающих белков, а также (б) измерить активность купроэнзимов цитозоля печени и сыворотки крови. Сравнить распределение Си и Ag в организме крыс. Определить субклеточную локализацию серебра в клетках печени. На основе полученных данных выбрать такие группы крыс, у которых эффект Ag-диеты выражен наиболее отчетливо.

2. Провести сравнительный анализ влияния Ag-диеты на метаболизм меди у взрослых крыс, получавших серебро в течение месяца (Ag-A30 крысы), и взрослых крыс, получавших серебро в течение всей жизни (Ag-N180 крысы).

3. Из сыворотки Ag-A30 и Ag-N180 крыс с помощью метода ионообменной хроматографии получить частично очищенные препараты ЦП и сравнить их физико-химические свойства.

4. Изучить лектин-связывающие свойства и скорость секреции изоформ ЦП Ag-N180 крыс.

Научная новизна полученных результатов

Все полученные в работе результаты являются новыми. Получены данные, указывающие на существование альтернативного механизма, поддерживающего статус меди у лабораторных грызунов при длительном поступлении с пищей ионов серебра. Показано, что эффекты Ag-диеты зависят от ее длительности и периода онтогенеза животных. Так, у Ag-A30 крыс в сыворотке крови концентрация меди и (ферр)оксидазная активность значительно снижаются, содержание иммунореактивного ЦП и активность генов МСМ печени не меняются.

В сыворотке крови Ag-N180 крыс концентрация меди и (ферр)оксидазная активность, по сравнению с контролем, снижаются только в 2 раза, концентрация иммунореактивного ЦП не меняется. Активность генов, чьи белковые продукты участвуют в транспорте меди, снижается в печени. У Ag-N180 крыс сохраняется способность к репродукции, но количество крыс в пометах в 2 - 3 раза меньше по сравнению с контролем. ЦП Ag-N180 крыс по третичной структуре и ферментативной активности ближе к холо-ЦП, чем ЦП

Ag-A30 крыс. Однако ЦП Ag-N180 крыс отличается от холо-ЦП и ЦП Ag-A30 крыс своей аффинностью к DEAE-Сефарозе, скоростью секреции в кровоток и составом входящих в его структуру углеводных цепей.

Научно-практическое значение полученных результатов

Ag-крыс можно рассматривать как перспективную модель для фундаментальных исследований транспорта меди, механизмов ее распределения в организме и в клетках, а также молекулярных механизмов формирования активных центров ЦП. Данные, демонстрирующие эффекты поступления в организм лабораторных животных пищевого серебра, послужат основой для рассмотрения серебра как экологического фактора. Они могут быть ценными для выработки научно-обоснованных рекомендаций по снижению эффекта загрязнения окружающей среды серебром (употребление воды, обеззараженной обработкой серебром, использование белья, импрегнированного солями серебра, обеззараживание воды в бассейнах и т.п.).

Методология и методы исследования

Работа является экспериментальным исследованием, которое выполнено на лабораторных крысах с использованием методов биохимии и молекулярной биологии: ОТ-ПЦР анализ, иммуноблотинг, иммуноэлектрофорез, хроматография, измерение концентрации металлов, УФ-спектров поглощения, спектров кругового дихроизма, определение активности ферментов в геле и спектрофотометрически, выделение субклеточных фракций, исследование гистологических срезов, проведение физиологических тестов, пульс-мечение радиоактивными изотопами.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Получение ионов серебра только в первые 23 дня жизни (период молочного вскармливания) не влияет на показатели статуса меди, и смену эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый тип. У этих животных серебро переносится по тем же межорганным и внутриклеточным маршрутам, что и медь.

2. Содержание взрослых крыс на Ag-диете в течение примерно такого же времени (Ag-A30 крысы) приводит практически к исчезновению (ферр)оксидазной активности сыворотки крови и резкому снижению в ней концентрации меди. У Ag-A30 крыс атомы серебра селективно накапливаются в печени. В клетках печени они аккумулируются в митохондриях. Ионы серебра переносятся в цистернальное пространство мембран аппарата Гольджи и встраиваются в молекулу ЦП. Относительное содержание зрелых транскриптов генов МСМ не меняется.

распределяется между органеллами относительно равномерно, но его концентрация в цитозоле в несколько раз выше, по сравнению с Ag-A30 крысами. У Ag-N180 крыс в кровотоке циркулируют две мажорные формы ЦП, которые отличаются по сродству к ДЕАЕ-Сефарозе, лектин-связывающим свойствам, скорости секреции в кровоток. Одна из них синтезируется вне печени.

Степень достоверности и апробация результатов работы

Достоверность результатов обеспечена разнообразием и адекватностью применяемых методов, соответствующих цели и задачам исследования, а также показанной в работе воспроизводимостью результатов.

Результаты были доложены в форме устных и стендовых сообщений на: 38-й международной конференции по координационной химии (Иерусалим, Израиль, 2008), IV Съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), XII - XVI Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21 века». (Пущино, 20082012), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), ГУ Международном симпозиуме FESTEM «Микроэлементы и минералы в медицине и биологии» (Санкт-Петербург, 2010), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010). XI Международном симпозиуме «Металлы в биологии и медицине» (Кембридж, Великобритания, 2011), VIII Международной медной конференции «Медь в биологии» (Альгеро, Италия, 2012), XIII форуме молодых ученых европейской ассоциации биохимиков (Санкт-Петербург, 2013), IV Международном симпозиуме «Металломика» (Овьедо, Испания, 2013).

Личный вклад

Планирование работы, получение большей части экспериментальных результатов, их обработка и написание статей выполнены соискателем.

Структура диссертации

Рукопись содержит «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы», включающий 246 иностранных и 18 отечественных источников. Диссертация изложена на 148 страницах. Результаты представлены в 4 табл. и иллюстрированы 46 рис.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы взрослые крысы линии Вистар и их потомство, родившееся в виварии НИИЭМ СЗО РАМН. Животные экспериментальных групп получали стандартный корм с добавкой ионов серебра (Ag-корм) в форме AgCl в среднем 50 мг на кг массы тела в день (Prybiletal, 1982).

Тотальную РНК изолировали с использованием реактива "TRIzol Reagent" (TriPure Isolation Reagent, Invitrogen). Концентрацию РНК измеряли спектрофотометрически.

Гель-электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 1.4% агарозном геле. Гели окрашивали этидий бромидом (Sambrook et al., 1989). Синтез кДНК в реакции обратной транскрипции (ОТ) проводили на тотальной РНК со случайными праймерами; ПЦР на полученной кДНК проводили со специфическими праймерами (Клотченко и др., 2008). Для полуколичественной характеристики экспрессии генов использовали соотношение между уровнем мРНК исследуемого гена и мРНК ß-актина (Marone et al., 2001). Выделение субклеточных фракций из гомогената клеток, приготовленного в буфере, содержащем 0,25 М сахарозу, 10 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 100 мМ KCl, 8 мМ MgCl2, 0,04% ß-меркаптоэтанол, смесь ингибиторов протеаз фирмы "Sigma" (США), проводили методом дифференциального или равновесного центрифугирования. Для получения растворимого содержимого желудка новорожденных навеску, взятую из полных желудков, ресуспендировали в двух объемах PBS, после инкубации в течение 30 мин при 0°С смесь центрифугировали в течение 10 мин и собирали супернатант для анализов. Очищенный препарат ЦП получали методом ионообменной хроматографии (Manolis & Сох, 1980). Для сравнительного анализа очищенных препаратов ЦП использовали круговой дихроизм и UV/vis спектрофотометрию. Гель-фильтрацию проводили на колонке (1.6 х 40 см) с Сефадексом G-75 (superfine; 10-40 мкм) в 20 мМ трис-HCl буфере, содержащем 5 мМ 2-меркаптоэтанол, pH 7,6. Электрофорез белков проводили в ПААГ в неденатурирующих условиях, или в присутствии 0.1% SDS по методу Laemmli. Перенос белков из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану и выявление специфических иммунных комплексов после гибридизации со вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой, осуществляли с помощью хемилюминесцентных проявителей. Концентрацию меди измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и зеемановской коррекцией неселективного поглощения на спектрометре ZEEnit 650Р "Analytik Jena" (Германия). Оксидазную, ферроксидазную и супероксиддисмутазную активности определяли в геле или спектрофотометрически окрашиванием специфических абиогенных субстратов. Концентрацию ЦП определяли методом количественного иммуноэлектрофореза. Общий заряд ЦП, лектин-связывающую способность и антигенную микрогетерогенность исследовали с помощью 20-иммуноэлектрофореза, 2D-иммуноаффинного электрофореза и перекрестного иммуноэлектрофореза, соответственно. Погруженность ферритина железом была исследована окрашиванием неденатурирующего ПААГ 2% ICtFe(CN)6 в 2% HCl. Концентрация гемоглобина была измерена с помощью реактива Драбкина. Определение радиоактивности проводили в сцинтилляционной жидкости, содержавшей 4 г РРО и 0.1 г РОРОР в 1 л толуола. Количество новосинтезированного церулоплазмина определяли как процент от общей радиоактивности. Для проведения гистологических исследований препараты мозга, печени, почек и селезенки окрашивали гематоксилином и эозином, эозином (на эозинофильные гранулоциты), по Перлсу на железо (III). Проверку присутствия в составе пигментных отложений серебра проводили при помощи последовательной обработки срезов растворами йода и тиосульфата натрия. Для определения лейкоцитарной формулы крови крыс фиксированные мазки крови высушивали, окрашивали азур-эозином по Романовскому и подсчитывали количество форменных элементов. Психоэмоциональное состояние животных оценивали с помощью физиологических тестов «Открытое поле» и «Условная реакция пассивного избегания». Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Статистическую обработку результатов проводили с применением SPSS 9.0. Изменения принимали значимыми при /?<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование влияния пищевых ионов серебра на метаболизм меди проводили на взрослых крысах (Ag-A), получавших Ag-кopм в течение месяца, и крысах, получавших Ag-кopм, начиная с первого дня жизни до 6-месячного возраста (Ag-N) (Рисунок 1).

Группа I контроль

Группа 2

Группа 3

Группа 4 Ag-N

Ав-АЗО

штт

возраст, дни

-1-1-1—

О 40 80 120 160 200

Рисунок 1. Группы животных, использованных в работе.

В - стандартная диета; ■ - Ag-диета. Вертикальные линии показывают возраст крыс, вовлеченных в опыты: 5, 20, 40, 180 дней.

1. Влияние хлорида серебра на метаболизм меди у Ag-A30 крыс

Полученные данные показывают, что у Ag-A30 крыс в сыворотке крови практически полностью исчезает оксидазная активность, в норме на 95% принадлежащая ЦП, концентрация меди падает в 10 раз, а содержание белка ЦП, определенное методом иммуноблотинга, не снижается (Таблица 1, см. вкладку). Иммунопреципитация ЦП из сывороток крови крыс показала, что серебро и медь в крови преимущественно входят в состав ЦП (Рисунок 2).

Для выяснения степени устойчивости изменений статуса меди у Ag-A30 крыс им однократно внутрибрюшинно или per os вводили 10 мкг CUSO4 5H2O на 1 г массы тела. Введение ионов меди вызывает повышение уровня оксидазного ЦП (Рисунок 3), которое наблюдается уже через 1 ч после введения соли меди, а через 4 ч оксидазная активность практически восстанавливается и остается на нормальном уровне в течение всего периода наблюдения (72 часа), несмотря на продолжающуюся Ag-диету. Сопоставление скорости восстановления оксидазной активности и появления новосинтезированного ЦП позволяет предположить, что медь, введенная Ag-A30 крысам, уже через несколько минут поступает в комплекс Гольджи, где встраивается в апо-ЦП и, возможно, в Ag-ЦП.

Си

1200

900 -

и И

зоо Н о

5000

4000 -

3000

s 2000 -

1000 -

□ контроль МАе

1 2 3

Рисунок 2. Концентрация меди и серебра, ассоциированных с ЦП в сыворотке

крови контрольных и Ag-A15 крыс. 1 - сыворотка, 2 - непреципитированная антителами к ЦП фракция, 3 - иммунопреципитат. 50 мкл сыворотки крови инкубировали с 500 мкл антител к ЦП (1 мг/мл) в течение ночи при 4 °С при постоянном перемешивании. Преципитат получали центрифугированием 10,000xg, 20 мин, осадок дважды промывали PBS, растворяли в 0.4 мл азотной кислоты. Приведены средние данные по двум экспериментам.

1 2 3 4 5 6

Рисунок 3. Восстановление оксидазной активности в сыворотке крови Ag-крыс

после однократного введения CuS04. А - Изменение оксидазной активности сыворотки крови Ag-крыс после введения C11SO4 per os (Г) или внутрибрюшинно (II). I и II: 1-контроль, 2-Ag-A30, 3-6-Ag-A30 через I час, 4, 24, 72 часа после введения C11SO4. Б - Количественная оценка оксидазной активности тех же образцов сыворотки крови (я=5). *: р<0,05

2. Исследование влияния хлорида серебра на метаболизм меди в течение постнатального периода развития

Для формирования групп крыс, получавших серебро с пищей с первого дня жизни, было проверено, поступает ли серебро в молоко крыс, и изменяется ли у новорожденных статус меди. Исследование было проведено на 10-дневных крысах, вскармливаемых самками, в корм которых с первого дня лактации добавляли А§С1 (Ag-N10-кpыcы). Результаты, представленные на рисунке 4, показывают, что у А§-Ш0 крыс серебро попадает в кровоток, аккумулируется преимущественно в печени и в незначительных количествах обнаруживается в мозге. При этом существенных изменений в концентрации меди не происходит. В это время серебро, как и медь, выводится с мочой. Содержание оксидазного ЦП Ag-N10-кpыc снижается, при этом уровень иммунореактивного ЦП не меняется. У Ag-caмoк также развивается дефицит меди, ассоциированный с ЦП: уровень оксидазного ЦП в крови снижается, но содержание иммунореактивных полипептидов ЦП не меняется. Данные показывают, что новорожденные, вскормленные Ag-caмкaми, получают ионы серебра.

На втором этапе были сформированы 4 группы крыс (Рисунок 1). Группа 1 включала крыс, которые родились в виварии НИИЭМ одновременно с крысами, взятыми в экспериментальные группы. Крыс группы 1 использовали в качестве контроля как крыс того же возраста, содержавшихся в тех же условиях. Группу 2 составили крысы, вскормленные самками, получавшими Ag-диeтy с первого дня лактации (Ag-caмки); в возрасте 23 дней крысы были переведены на стандартный корм (дефицит ионов меди только в период молочного вскармливания до месячного возраста). Группа 3 была образована из крыс, которых перевели на Ag-диeтy после окончания периода молочного вскармливания (дефицит меди после снижения концентрации меди в печени). Группа 4 была создана из крыс, которых вскармливали Ag-caмки и после этого их переводили на Ag-диeтy.

У животных всех четырех групп была прослежена динамика действия ионов серебра на оксидазную активность ЦП (Рисунок 5, см. вкладку). Полученные данные показывают, что по отношению к контрольной группе оксидазная активность крыс групп 3 и 4 была примерно в два раза ниже.

Измерения концентрации меди в органах крыс показали, что после перехода на взрослый тип метаболизма меди, ее концентрация в печени у животных всех групп резко падает и остается на низком уровне (Рисунок 6, см. вкладку). В мозге концентрация меди растет примерно до половозрелого возраста и одинакова у животных всех групп. Накопление серебра в течение всего эксперимента продолжается и в печени, и в мозге. Однако концентрация серебра в мозге в 10 раз меньше, чем в печени.

Вес, а также индекс «масса тела/масса органов» у крыс групп 3 и 4, по сравнению с их ровесниками из групп 1 и 2, не отличается.

Психоэмоциональное состояние исследуемых крыс оценивали с помощью физиологических тестов. В тесте «открытое поле» существенных различий в психо-эмоциональном состоянии животных, получавших с пищей серебро, по сравнению с контролем, не отмечено. Помимо этого, у всех крыс, не зависимо

03 ё 20(1

Си

1 160 контроль i

+ I £ ■ Ag 1

¡120 1

R 80 fe 1

Ж 40 SO < 0 J -Я 1

СЫЕОрОШ!

сыворотка

Рисунок 4. Транспорт и распределение меди и серебра в организме А§-Ш0

крыс.

Ось ординат: концентрация Си или Ag в сыворотке крови (мкг/100 мкл), печени и моче. (Данные получены совместно с Бабич П.С.).

от времени введения в рацион серебра, наблюдается полное воспроизведение условной реакции пассивного избегания (УРПИ), что свидетельствует о сохранении и воспроизведении их долговременной памятью выработанного навыка пассивного избегания.

Снижение показателей статуса меди у Ag-крыс групп 3 и 4 может происходить по одинаковому механизму, так как формирование взрослого типа метаболизма меди не исчерпывается снижением концентрации меди в печени на 13 день жизни. Повышение уровня оксидазного ЦП продолжается до 40 дня жизни (Рисунок 5, см. вкладку). Так как детали механизма смены типов метаболизма меди не известны, мы ограничили исследования работой только на крысах двух групп. Группу 1 составили контрольные крысы. Группу 2 -крысы, вскормленные Ag-самками, а затем в течение 6-ти месяцев получавшие Ag-корм (группа 4, Рисунок 1).

Для исследования уровня экспрессии генов, ассоциированных с метаболизмом меди, у Ag-N крыс в раннем постнатальном периоде развития в рассмотрение были взяты гены медь-связывающих и медьтранспортных белков, кодирующие: МТ1а (металлотионеин - низкомолекулярный, обогащенный цистеином белок, способный наряду со многими другими металлами, связывать Cu(I) и контролировать их гомеостаз), COMMD1 (цитозольный медь-связывающий белок, участвующий в экскреции меди), CTR1 и CTR2 (высоко и низко аффинные транспортеры Cu(I), соответственно), АТР7А и АТР7В (Cu(I)-транспортные АТРазы), CCS (Си(1)-шаперон для супероксиддисмутазы). Также проанализирована активность генов, кодирующих купроэнзимы: ЦП, СОД1 и изоформу 1 субъединицы IV комплекса ЦО (цитохром-с-оксидазы). В качестве сравнения измерена экспрессия гена СОД2, кодирующего митохондриальную Мп-СОД. Относительное количество зрелых транскриптов генов, взятых в рассмотрение, оценивали по данным полуколичественного ОТ-ПЦР анализа. Полученные данные показывают, что в печени 5- и 20-дневных Ag-крыс

активность исследуемых генов по сравнению с контролем не меняется. В печени 40-дневных Ag-кpыc происходит достоверное снижение уровня мРНК, кодирующих СТЯ2, АТР7В и СОММВ1 (Рисунок 7, А).

К 40-му дню жизни у Ag-кpыc (Рисунок 7, Б) не изменяется содержание иммунореактивных полипептидов СОД1 и МТ. При этом снижается содержание белков СОММП1 и СОХ1У в цитозоле и митохондриях, соответственно. Содержание ЦП в крови повышается примерно в 2 раза.

Анализ ферментативной активности купроэнзимов показал, что у Ag-N40 в два раза снижаются оксидазная и ферроксидазная активности церулоплазмина (Рисунок 8). Ферментативная активность СОД1 не меняется.

40 ДН

Рисунок 7. Экспрессия генов медь-транспортных белков и купроэнзимов. А - Сравнение транскрипционной активности исследуемых генов в печени контрольных и Ag-N крыс в раннем постнатальном периоде. *: р<0,05. Б - содержание иммунореактивных полипептидов На дорожках: 0,5 мкл сыворотки крови для анализа Ср, 80 мкг белка цитозоля для СОММБ1 и МТ и 30 мкг белка цитозоля и митохондрий для анализа СОД1 и СОХ IV, соответственно.

5 ДН

20 ДН

40 дн

оксидазная активность

ферроксидазная активность

СОД1 активность

'йЯШШЯШшШШШШШ '¿Ак-ш- »1

тт

контроль А$ контроль контроль А§

Рисунок 8. Ферментативная активность купроэнзимов контрольных и Ag-кpыc в раннем постнатальном периоде.

Таким образом, данные, полученные на крысах А§-Ы5, Ag-N20 и Ag-N40, показывают, что перенос серебра в организме новорожденных происходит по тем же путям, которые использует медь. При этом накопление серебра не приводит к дефициту меди в печени и мозге. В то же время, в сыворотке крови Ag-N40 крыс показатели статуса меди ниже в два раза, по сравнению с контролем.

3. Влияние длительной А§-диеты на метаболизм меди крыс

В этом разделе представлены данные, полученные на крысах, которые с момента рождения и далее в течение шести месяцев получали с пищей AgCl -А§-№80 крысы. Полученные данные сопоставлены с аналогичными данными, полученными на Ag-A30, или на контрольных крысах.

3.1. Показатели статуса меди у Ag-N180 крыс

У Ag-N180 крыс оксидазная активность ЦП в два раза ниже, чем у контрольных. Снижение ферроксидазной активности у крыс не было достоверным (р=0.06). По данным иммуноэлектрофореза, уровень иммунореактивных полипептидов ЦП не отличается от такового у контрольных и Ag-A30 крыс (Таблица 1, см. вкладку).

3.2. Локализация ионов серебра в организме А§-крыс

У Ag-N180 крыс распределение серебра между внутренними органами более равномерное, чем у Ag-A30 крыс, у которых серебро избирательно накапливается в печени (Рисунок 9, А). Распределение серебра в субклеточных фракциях печени Ас-крьтс показано на рисунке 9, Б. Видно, что в клетках печени Ag-A30 крыс серебро избирательно аккумулируется в митохондриях, тогда как у А§-№80-крыс оно почти равномерно распределено между ядрами, цитозолем и митохондриями и его количество в цитозоле увеличивается многократно.

□ Ад-АЗ О ■ Ае-№80

Я МТХ ВМ Ц

Рисунок 9. Распределение серебра в организме А§-крыс (и=.3).

А - Распределение серебра в организме Ag-кpыc. Б - Распределение серебра в клетках печени крыс. Ось абсцисс: Я — ядра; Мт - митохондрии; ВМ - внутренние мембраны; Ц - цитозоль.

Сравнительный анализ гистологических срезов головного мозга, печени, почек и селезенки между Ag-A30 и Ag-N180 крысами показал, что головной

мозг по структурной организации и развитию серого и белого вещества не отличается от нормы; почки также не имеют морфологических признаков патологии (данные не приводятся). В печени Ag-A30 животных патологических изменений не зарегистрировано (Рисунок 10, А, см. вкладку). В то же время в печени Ag-N180 крыс наблюдается выраженная пигментация стенки вен, проходящих в междольковой соединительной ткани (ветви воротной вены) и очаговые скопления черных гранул в макрофагах междольковой соединительной ткани (Рисунок 10, Б и В). После последовательной обработки срезов растворами йода и тиосульфата натрия обнаруженная пигментация исчезала, что свидетельствует о вероятном присутствии в стенке воротной вены преципитатов солей серебра и/или металлического серебра (Рисунок 10, Г).

Гистологические срезы селезенки Ag-A30 крыс (Рисунок 10, Д) не отличались от контрольных срезов (данные не приводятся). В красной пульпе определялось небольшое количество коричневого пигмента. Среди клеток встречались одиночные эозинофильные гранулоциты (как правило, на границе с белой пульпой) (Рисунок 10, Ж). При окраске по Перлсу в красной пульпе определялись многочисленные очаговые скопления железа. У Ag-N180 животных при сохранении больших скоплений железа увеличен объем белой пульпы, больше эозинофильных гранулоцитов и черно-коричневого пигмента по сравнению с контрольными животными (Рисунок 10, Е и 3).

Кроме того, у Ag-N180 животных под кожей выявлены многочисленные скопления темного инфильтрата (Рисунок 10, И и К).

Содержание гемоглобина в крови у животных обеих групп одинаково (Таблица 1, см. вкладку) и колеблется в пределах нормальных значений (Sharp, La Regina, 1998). Профиль лейкограммы крови, показывает, что у Ag-N180 крыс повышается количество эозинофилов, что согласуется с данными гистологического анализа. Эозинофилы, помимо основной, известной для них, про-аллергической / анти-аллергической функции, принимают участие во многих других процессах, и в представленной работе природа повышения их уровня у Ag-N180 не изучалась.

3.3. Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом меди, у

Ag-N180 крыс

Данные полуколичественного ОТ-ПЦР анализа, приведенные на рисунке 11 (см. вкладку), показывают, что в печени Ag-N180 крыс снижается уровень мРНК, программирующих синтез CTR1, CTR2, MTla, COMMD1, COX4Í1, CCS. Уровень экспрессии других исследованных генов достоверно не изменяется.

Эти данные согласуются с данными иммуноблотинга по выявлению соответствующих иммунореактивных полипептидов (Рисунок 12, А, см. вкладку). Уровень активности СОД1 в цитозоле клеток печени и мозга, а также митохондриях клеток мозга практически одинаков (Рисунок 12, Б, В и Г). Активность СОДЗ у Ag-N180-Kpbic в два раза выше, чем у контрольных (Таблица 1, см. вкладку). Не изменяется уровень нагруженности ферритина железом (Рисунок 12, Д).

3.4. Внутриклеточное распределение серебра в печени Ag-крыс

Для выявления белков, которые связывают серебро в цитозоле клеток печени Ag-N180 крыс, образцы цитозоля были фракционированы методом гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G75. Профили элюции (D280) материала из контрольных и Ag-N180 крыс были идентичными. Поэтому приводится только цитозоль контрольных крыс (Рисунок 13, А, см. вкладку). На хроматограмме 2 выявлены основных пика (I и II), небольшой пик III и пик IV, который теоретически не должен содержать белки, а только низкомолекулярные компоненты.

Профили распределения меди на хроматограммах цитозоля печеночных клеток Ag-N180 и контрольных крыс не отличались (Рисунок 13, Б и В). Медь была выявлена во фракциях, соответствующих пикам I, II и III. Содержание меди в пике IV было чуть выше фонового уровня.

По данным иммуноблотинга материал пика I содержит ЦП (Рисунок 13, Б), что объясняется присутствием крови в печени. В пике I, как и в пике II, выявлена СОД активность (Рисунок 13, Б, вставка). В пике I она, по-видимому, принадлежит СОДЗ. Цитозольная СОД1 локализована в пике II. Самыми вероятными белками, представляющими пик П1, могут быть МТ. Они характеризуются молекулярной массой -10 кДа й высоким содержанием остатков цистеина, что хорошо согласуется с повышенным поглощением материала пика П1 при 254 нм.

В цитозоле Ag-N180 крыс серебро выявлено только в пике I (Рисунок 13, В). По-видимому, оно связано с ЦП. В пике II, где локализуется СОД1, серебро не выявлено. Пик III содержит медь и серебро, которые могут быть связанными с МТ. Иммунопреципитат цитозоля Ag-N180 крыс с антителами к МТ содержит медь и серебро (Рисунок 13, Г).

В пике IV содержание серебра, в отличие от меди, выше фона (Рисунок 13, В, вставка). Следует также отметить, что в этом пике выявляется неизвестный компонент, обладающий супероксиддисмутазной (или рибофлавин-окисляющей) активностью, а также выявляемый окрашиванием Кумасси R-250 после электрофореза в неденатурирующих условиях (Рисунок 13, Е и 3). В цитозоле контрольных крыс такого компонента выявлено не было (Рисунок 13, Д и Ж). Инкубация фракции #40 пика IV цитозоля Ag-N180 крыс с SDS и 2-меркаптоэтанолом при 95 °С приводит к ее распаду на компоненты, которые могут быть выявлены при окрашивании геля AgNOß (Рисунок 13, И).

Таким образом, в цитозоле клеток печени Ag-N180 крыс серебро связано с МТ и каким-то неизвестным компонентом(-ми), который проявляет СОД-подобную активность.

3.5. Сравнительная характеристика частично очищенных препаратов церулоплазмина из сыворотки крови Ag-A30 и Ag-N180 крыс

На хроматограммах сыворотки крови крыс обеих групп наибольшая часть сывороточной меди и практически все сывороточное серебро локализованы в одном пике (Рисунок 14, А и Б, см. вкладку). Этот пик соответствует фракции, содержащей ЦП.

Из сыворотки крови Ag-A30 и Ag-N180 крыс методом ионообменной хроматографии на DEAE-Сефарозе были получены препараты частично очищенного ЦП. По данным нативного электрофореза ЦП является основной фракцией этих препаратов (Рисунок 14, В (а) и Г (а)). Мажорная фракция ЦП из сыворотки Ag-A30 крыс элюировалась при концентрации NaCl 200 и 250 мМ. При этом профиль элюции совпадал с таковым для холо-ЦП из сыворотки контрольных крыс (Рисунок 14, В (б)). Большая часть ЦП из сыворотки Ag-N180 крыс элюировалась 100 и 150 мМ NaCl (Рисунок 14, Г (б)). В обоих препаратах методом иммуноблотинга выявлены две формы ЦП, отличающиеся по электрофоретической подвижности (Рисунок 14, В (б) и Г (б)), но имеющие одинаковую молекулярную массу (Рисунок 14, В (в) и Г (в)). Материал из основных фракций препаратов проявлял оксидазную и ферроксидазную активности (Рисунок 14, В (г, д) и Г (г, д)). ЦП обеих экспериментальных групп содержал медь и серебро. Общее содержание металла на молекулу ЦП составляло примерно 5-6 атомов. Однако содержание Ag в молекуле ЦП Ag-А30 было приблизительно в 3 раза выше, чем у Ag-N180 крыс (Рисунок 14, Д и

По результатам иммуноблотинга были отобраны пробы с самой высокой концентрацией ЦП: фракция 3 (Рисунок 14, В (в)) и фракция 1 (Рисунок 14, Г (в)). Они были использованы для исследований с помощью спектроскопии поглощения и кругового дихроизма (КД) (Рисунок 14 Ж и 3).

Препараты ЦП, полученные из сыворотки обеих групп Ag-крыс, характеризуются сильным снижением поглощения в полосе 610 нм и дублета в спектре КД в области 400-700 нм, характерных для меди спектрального типа I (голубой меди). Соотношение А6к/А28о в препарате ЦП Ag-N180 крыс составило 10% от соответствующего значения (0.045) для высокоочищенного ЦП, тем не менее, полоса поглощения 610 нм видна четко и имеет ту же характерную форму, что и полоса холо-ЦП. Соотношение Абн/А28о для препарата ЦП Ag-A30 крыс низкое и соответствует 1-3% от этого значения для холо-ЦП.

Спектр КД ЦП Ag-A30 в ближней ультрафиолетовой области сильно отличается от спектров холо-ЦП и напоминает спектры частично-денатурированных состояний ЦП (Noyer & Putnam, 1981). Спектр КД Ag-N180-ЦП напоминает спектр белка Ag-A30 крыс, однако слегка сдвинут в сторону спектра холо-ЦП. Тем не менее, невозможно смоделировать данный спектр линейной комбинацией спектров Ag-АЗО-ЦП и холо-ЦП, поэтому можно заключить, что ЦП Ag-N180 крыс не является смесью Ag-АЗО-ЦП с дополнительным количеством холо-ЦП, а представляет собой спектрально-различный объект. Спектры КД в дальней ультрафиолетовой области также

поддерживают это заключение. На основании анализа спектров видимого диапазона и ультрафиолетовой области следует признать, что фракции ЦП сыворотки Ag-A30 и Ag-N180 крыс содержат молекулы ЦП разной конформации. Препарат ЦП Ag-N180, очевидно, содержит большее количество молекул ЦП с правильно сформированным сайтом связывания меди типа I, что согласуется с увеличением содержания меди, а также оксидазной и ферроксидазной активностей в сыворотках Ag-N180 крыс.

3.6. Некоторые свойства ЦП, циркулирующего в кровотоке Ag-N180

крыс

С помощью различных модификаций иммуноэлектрофореза был проведен сравнительный анализ сывороток крови контрольных и Ag-N180 крыс по общему заряду, антигенной специфичности и составу олигосахаридных цепей.

20-иммуноэлектрофорез показал, что в агарозном геле ЦП контрольных и Ag-N180 крыс движется одной довольно широкой зоной, которая при связывании с антителами формирует почти равнобедренный треугольник (Рисунок 15, А и Б, см. вкладку). Однако лидирующее плечо пика формируемого ЦП Ag-N180 крыс не окрашивается о-дианизидином (Рисунок 15, А (б)).

Перекрестный иммуноэлектрофорез (Рисунок 15, В и Г) показал, что в сыворотке крови Ag-N180 крыс есть изоформа ЦП, не проявляющая оксидазной активности, по своим антигенным свойствам не полностью идентичная холо-ЦП (Рисунок 15, Г, лунки 1 и 2). Препарат ЦП, элюированный из сыворотки крови Ag-N180 крыс 100 мМ NaCl и обладающий оксидазной активностью, по антигенным свойствам наиболее близок к препарату холо-ЦП контрольных крыс (Рисунок 15, Г, лунки 3 и 4). ЦП, элюируемый 150 и 200 мМ NaCl, по антигенным свойствам отличается от ЦП этих же крыс, но элюируемой 100 мМ NaCl, и ЦП контрольных крыс (Рисунок 15, Г, лунки 5 и 6). Эти данные указывают на антигенную гетерогенность ЦП Ag-N180 крыс.

Для 20-иммуноаффинного электрофореза были использованы следующие лектины: конканавалин - (СопА), который специфичен к a-D-маннозил и a-D-гликозил группам, агглютинин зародыша пшеницы (WGA), который специфически связывается с И-ацетил-О-глюкозамином и сиаловой кислотой, а также фитогемагглютинин красной фасоли типа Р (PFP), который связывает олигосахаридные комплексы, содержащие галактозу, N-ацетилглюкозамин и маннозу.

Данные показывают, что электрофоретическая подвижность ЦП Ag-N180 крыс, который предварительно инкубировали с СопА, зависела от количественного соотношения между образцом сыворотки и СопА (Рисунок 15, Д и Е). Окрашивание гелей о-дианизидином и Кумасси R-250 не выявило различий, поэтому приводятся только данные окрашивания на белок. Они свидетельствуют в пользу того, что ЦП Ag-N180 крыс частично теряет остатки сиаловых кислот (Саенко и др., 1988). После инкубации с PFP ЦП контрольных крыс двигался медленнее по сравнению с ЦП Ag-N180 крыс (Рисунок 15, Ж и

3). Окрашивание гелей на белок выявляет гетерогенность олигосахаридных цепей в молекулах Ag-N180-LJIL Преинкубация сывороток с 20 мкг WGA показала гетерогенность ЦП контрольных крыс по отношению к этому лектину (Рисунок 15, К, a (al)). Видно, что минорная фракция неоксидазного ЦП имеет низкое сродство к WGA. Возможно, что это асиалированный ЦП. После связывания ЦП Ag-N180 крыс с WGA при электрофорезе в агарозном геле он распределяется в виде трех пиков (Рисунок 15, К, б (Р, pi и р2)), два из которых характеризуются более низким сродством к лектину. Интересно, что оксидазная и неоксидазные формы ЦП в сыворотке крови Ag-N180 крыс движутся в геле медленнее, чем ЦП контрольных животных. Эти результаты трудно интерпретировать (а) из-за отсутствия данных о полной структуре олигосахаридных цепей ЦП крыс, (б) из-за того, что лектины связываются больше, чем с одним сахаридом и (в) количественная теория взаимодействия гликан/лектин разработана не достаточно.

3.7. Скорость секреции [14С]ЦП в кровоток Ag-N180 крыс

Различия, обнаруженные в антигенных и лектин-связывающих свойствах ЦП Ag-N180 крыс, могут свидетельствовать о разном происхождении церулоплазминов, циркулирующих в кровотоке Ag-N180 крыс. У контрольных крыс [ИС]ЦП появляется в кровотоке через 40 мин и его количество достигает максимума через 90 мин (Рисунок 16, А, см. вкладку).

У Ag-N180 крыс иммунореактивный [14С]ЦП появляется в два этапа. Так, новосинтезированный ЦП обнаруживается в кровотоке уже через 10 мин после введения метки, а через час появляется новый пик меченого ЦП. По кривой динамики секреции он совпадает с ЦП контрольных крыс. То есть, у Ag-N180 крыс, наряду с ЦП, скорость синтеза и секреции которого совпадают с ЦП печени, также синтезируется быстро секретирующаяся форма.

Для того чтобы проверить, является ли быстро секретируемый ЦП продуктом печени, скорость секреции de novo синтезированного ЦП была изучена у Ag-N180 крыс с печенью, изолированной от кровотока. В сыворотке крови интактных крыс и крыс с печенью, изолированной от кровотока, [14С]белки появляются через 5 минут после введения меченых аминокислот (Рисунок 16, В). Однако общая радиоактивность сывороточных белков у крыс с печенью, изолированной от кровотока, примерно в 10 раз ниже, чем у интактных.

У контрольных крыс с изолированной от кровотока печенью новосинтезированный ЦП не появляется в кровотоке через 50 мин после введения меченых аминокислот (Рисунок 16, Б). В то же самое время у интактных крыс следы меченого ЦП появляются через 30 мин и его количество нарастает время-зависимо. У Ag-N180 крыс [14С]ЦП появляется уже через 10 мин (Рисунок 16, В).

Данные однозначно показывают, что у Ag-N180 крыс в крови циркулируют две формы ЦП: печеночного и не печеночного происхождения. Так как поступление крови от кишечника также изолировано, вторая форма ЦП не может быть продуктом клеток кишечника.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют о том, что у взрослых крыс (Ag-A30) Ag-диeтa вызывает избирательное накопление серебра в печени, что приводит к включению серебра в ЦП, тем самым создавая дефицит меди в сыворотке крови животных. У крыс, которые начали получать серебро с первого дня после рождения на фоне еще действующего в их организме эмбрионального типа метаболизма меди, индуцируются внепеченочный синтез и секреция ЦП, который обеспечивает потребности растущего организма в меди.

Полученные в работе данные отчетливо показывают, что серебро включается в ЦП и блокирует формирование функциональных активных центров. В то же время, серебро не включается в СОД1 (вероятнее всего, и в СОДЗ) и не влияет на его активность. Этот факт можно объяснить, если принять во внимание разницу между активными центрами этих купроэнзимов и концепцию жестких и мягких кислот и оснований (НБАВ-концепция Пирсона). В активных центрах обеих супероксиддисмутаз (таблица 2) атомы меди координируются только остатками гистидина, которые являются донорами электронов промежуточной жесткости и хорошими лигандами для Си(П). Однако, стабилизация ионов Ag(I), являющихся мягким акцептором, менее выгодна.

Таблица 2

Аминокислоты (аминокислотные остатки), участвующие в координации меди в активных центрах церулоплазмина, СОД1 и СОДЗ (по данным

Фермент PDB ГО Ион меди Аминокислоты - доноры радикалов, координирующих медь

СОД1, человек 1HL5 Си Н46, Н48, Н63 и Н120; тетраэдрическая геометрия

СОДЗ, человек 2JLP Си Н96 и Н98

ЦП*, человек 1KCW, 2J5W Си21 (голубой) Н276, С319, Н324

Си41 (голубой) Н637, С680, Н685

Си42 (лабильный) Э684

Си61 (голубой) Н975, С1021, Н1026

Си62 (лабильный) Н940, И1025

Си31 Н163, Н980, Н1020, [кислород)

Си32 Н103, Н161, Н1022, [кислород)

Си34 Н101, Н978, Н980, Гкислород!

*Церулоплазмин может содержать до 8 атомов меди, 2 из которых лабильны. Данные по сайтам связывания меди, представленные в таблице (аминокислотные остатки и нумерация атомов меди) соответствуют нумерации аминокислотных остатков в РБВ.

Тринуклеарный центр ЦП, являясь окислительно-восстановительным сайтом, также содержит только остатки гистидина. В то же время, молекула ЦП имеет 3 сайта голубой меди, каждый из них содержит ключевой остаток цистеина. Цистеин является мягким донором, который хорошо стабилизирует

как Си(1) так и Ag(I), что, в частности, используется Си(1)-шаперонами. Эффективный процесс передачи меди в состоянии Си(1) от шаперона в гистидиновый сайт, так или иначе, связан с окислением ее до Си(П). Однако, в случае А§(1) этот процесс не представляется возможным (Рисунок 17, см. вкладку). Таким образом, серебро не может быть вставлено в молекулы супероксиддисмутаз и, следовательно, эти купроэнзимы не инактивируются. Цистеинсодержащие сайты ЦП могут принять серебро, однако оно не может окислиться, что приводит к потере ферментативной активности ЦП.

ВЫВОДЫ

1. У взрослых крыс, получавших Ag-диeтy в течение месяца (Ag-A30 крысы), практически исчезает (ферр)оксидазная активность и резко падает концентрации меди в сыворотке крови. У Ag-A30 крыс серебро селективно накапливается в печени, в клетках печени оно аккумулируется в митохондриях. Ионы серебра достигают люминального пространства аппарата Гольджи и включаются в молекулу ЦП. Вследствие этого ЦП теряет (ферр)оксидазную активность, нарушается укладка его полипептидной цепи. Уровень зрелых транскриптов генов МСМ не меняется.

2. Ионы серебра, получаемые с молоком матери в первые 23 дня жизни, переносятся по тем же межорганным и внутриклеточным маршрутам, что и медь. Они накапливаются в печени, но не влияют на показатели метаболизма меди. Смена эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый тип у Ag-N23 крыс происходит так же, как и у контрольных крыс - на 13-й день жизни.

3. У крыс, получавших ионы серебра с первого дня жизни в течение 6 месяцев (Ag-N180 крысы), показатели статуса меди, по сравнению с контрольными крысами, снижаются только в 2 раза. Накопление серебра в клетках Ag-N180 крыс не превышает таковое у Ag-A30, но в межклеточных пространствах обнаруживаются включения серебра. В клетках печени Ag-N180 крыс серебро аккумулируется в цитозоле, где входит в состав металлотионеинов и неидентифицированного комплекса низкомолекулярных веществ. Относительный уровень экспрессии генов, ассоциированных с транспортом меди, достоверно снижается.

4. У Ag-N180 крыс в кровотоке циркулируют, по крайней мере, две изоформы ЦП, которые отличаются по сродству к ДЕАЕ-Сефарозе, лектин-связывающим свойствам, скорости секреции в кровоток. Одна из них не является белком печени.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Скворцов А.Н., Ильичева Е.Ю., Затуловский Е.А., Савельев А.Н., Цымбаленко Н.В., Шавловский М.М., Пучкова Л.В. Частичная характеристика церулоплазмина крысы,

выделенного из сыворотки крови животных, получавших с пищей соли серебра // Цитология. — 2010, — Т. 52, №11. — С. 70-76.

2. Ilyechova Е., Skvortsov A., Zatulovsky Е., Tsymbalenko N., Shavlovsky М., Broggini М., Puchkova L.Experimental switching of copper status in laboratory rodents // Journal of trace elements in medicine and biology. —2011. —V. 25, №1. —P. 27—35.

3. Ильичева Е.Ю., Бабич П.С., Баришполец В.В., Цымбаленко Н.В., Пучкова Л.В., Сапронов Н.С. Развитие лабораторных крыс, длительное время получавших с кормом соли серебра // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2012 — Т. 153, №3. —С. 359 —365.

4. Zatulovskiy Е., Skvortsov A, Rusconi P., Ilyechova Е, Babich P., Tsymbalenko N., Broggini М., Puchkova L. Serum depletion of holo-ceruloplasmin induced by silver ions in vivo reduces uptake of cisplatin // J. Inorg. Biochem. — 2012. — V. 116. —P. 88—96.

5. Zatulovskiy E.A., Skvortsov A.N., Tsymbalenko N.V., Babich P.S., Ilyechyova E.Yu., Shavlovsky M.M., Broggini M., Puchkova L.V. The model to study effects of blood serum copper deficiency on d-element metabolism in liver and brain of rodents // Abstract book of 38th International Conference on Coordination Chemistry (Jerusalem, Israel, July, 2008). - P. 310.

6. Затуловский E.A., Ильичева Е.Ю., Скворцов A.H., Самсонов С.А., Цымбаленко Н.В., Пучкова JI.B. Распределение микроэлементов и экспрессия генов Си-транспортных белков и купроэнзимов в печени мышей, получавших ионы Ag // Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая 2008 г., Новосибирск). - 2008 - С. 448.

7. Затуловский Е.А., Ильичева Е.Ю. Участие метаболической системы меди в поступлении ионов серебра в организм лабораторных мышей // Сборник тезисов 12-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (10-14 ноября 2008 г., Пущино-на-Оке). - 2008. - С. 87.

8. Самсонов С.А., Скворцов А.Н., Затуловский Е.А., Бабич П.С., Ильичева Е.Ю., Цымбаленко Н.В., Пучкова JI.B. Экспрессия гена CTR1, кодирующего высокоаффинный импортер меди, в органах крыс при различных состояниях обмена меди // Материалы Пятого съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС) (21-28 июня 2009, Москва). - 2009. - С. 88.

9. Ильичева Е.Ю., Затуловский Е.А. Онтогенетические изменения метаболизма меди в печени и мозге лабораторных грызунов // Сборник тезисов 13-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука 21 века» (28 сентября - 2 октября 2009 г., Пущино-на-Оке). - 2009. - С. 70.

10. Ильичева Е.Ю., Затуловский Е.А. Создание животной модели с восстанавливающимся статусом меди // Сборник тезисов 14-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука 21 века» (19-23 апреля 2010 г., Пущино-на-Оке). - 2010. - С. 27.

11. Ильичева Е.Ю., Цымбаленко Н.В., Пучкова JI.B. Влияние пищевого серебра на метаболизм меди у млекопитающих // Материалы VI Съезда Российского общества Медицинских генетиков (15-18 мая 2010 г., Ростов-на-Дону). -2010. - С. 75

12. Zatulovsky Е., Ilyechova Е., Puchkova L, Tsymbalenko N., Babich P., Skvortsov A., Caiola E., Mazzoletti M., Broggini M. Influence of ceruloplasmin-associated copper deficiency on copper metabolism in mammals // Trace elements in medicine. Special issue. 4th International FESTEM Symposium on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology (June 9-12, 2010, St. Petersburg, Russia). - 2010. - Vol. 11, №2. - P. 32.

13. Ilyechova E., Skvortsov A., Zatulovsky E., Tsymbalenko N., Ruskoni P., Broggini M. Puchkova L. A single injection of copper sulphate restores oxidase activity in blood serum of mammals fed by fodder with silver ions // Trace elements in medicine. Special issue. 4th International FESTEM Symposium on Trace Elements and Minerals in Medicine and Biology (June 9-12,2010, St. Petersburg, Russia). - 2010. - Vol. 11, №2. - P. 24.

14. Пучкова Л.В., Ильичева Е.Ю., Цымбаленко Н.В., Баришполец В.В., Скворцов А.Н., Бабич П.С., Сапронов Н.С. Отдаленные последствия дефицита меди, спровоцированного ионами серебра // Материалы XXI Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова (19-25 сентября 2010, г. Калуга). - 2010. - С. 508.

15. Цымбаленко Н.В., Ильичева Е.Ю., Бабич П.С., Пучкова JI.B. Применение модели "Лактирующая самка - новорожденные" при изучении влияния пищевого серебра на метаболизм меди у крыс // Материалы XXI Съезда Физиологического общества им. И.П.Павлова (19-25 сентября 2010, г. Калуга). - 2010. - С. 665.

16. Ilyechova E.Y., Skvortsov A.N., Babich P.S., Zatulovskiy E.A., Vasilenko Yu.A., Petrova E.S., Korzhevskii D.E., Sapronov N.S., Tsymbalenko N.V., Puchkova L.V. In vivo model for studying the role of copper in the development of the skeletal system of mammals // 11th International Symposium on Metal ions in Biology and Medicine Metal ions in biology and medicine (20th-23rd June 2011, Cambridge, UK). - 2010. - P. 105.

17. Ильичева Е.Ю., Скворцов A.H., Петрова E.C., Коржевский Д.Э., Цымбаленко Н.В., Пучкова Л.В. Оценка возможности использования грызунов со сниженным статусом меди как модели ацерулоплазминемии — врожденной ошибки метаболизма железа //16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука 21 века» (16-21 апреля 2012 г., г. Пущино-на-Оке).-2012. - С. 176-177.

18. Ilyechova Е., Vasilenko Y., Skvortsov A., Tsymbalenko N., Puchkova L. Changes of expression of copper associated genes in adrenal glands during development // 8th International Copper Meeting "Copper in Biology" (30 September - 5 October, 2012, Alghero, Italy). - 2012. - P. 59.

19. Ilyechova E., Skvortsov A., Tsymbalenko N. Copper metabolism in mammals during long-term influence of silver ions // 13th Young Scientists Forum FEBS (3-6 July, 2013, Saint-Petersburg, Russia). - 2013. P.

20. Ilyechova E., Skvortsov A., Tsymbalenko N., Puchkova L. Influence of long-term ceruloplasmin-associated copper deficiency on copper metabolism in rats // 4th International Symposium on Metallomics (8-11 July, 2013, Oviedo, Spain). - 2013. - P. 153.

Работа поддержана грантами РФФИ 09-04-01165-а, 09-04-01406-а, 11-04-09445-моб_з, 12-04-09566-моб з, 12-04-31518 мол а

СОКРАЩЕНИЯ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ТЕКСТЕ АВТОРЕФЕРАТА

Ag-диета (Ag-корм) - стандартный корм, содержащий AgCl из расчета 50 мг/1 кг массы тела

Ag-животные - животные, получающие Ag-корм

Ag-A30 - взрослые животные, получающие Ag-корм в течение месяца

Ag-NS, 10, 20, 40, 180 - животные, получающие Ag-корм с рождения в течение 5, 10, 20, 40,

180 дней, соответственно FAAS - беспламенная атомная абсорбционная спектроскопия

PDB (Protein Data Bank) — база данных 3-D структур белков и нуклеиновых кислот

per os - перорально

МСМ - метаболическая система меди

МТ - металлотионеин

УРИИ - условная реакция пассивного избегания ЦО - цитохром-с-оксидаза ЦП - церулоплазмин

10 -

5 -

-♦-Группа 1 -■-Группа 2

1*тГруппа з -♦-Группа 4

возраст, дни

0 40 80 120 160 200

Рисунок 5. Изменение оксидазной активности у крыс групп 1 - 4 в течение

развития.

р<0.05 по сравнению с группой 1.

печень

Си

100

_ 80 я

- 60 я

1»

£ = 40

" 20 -0

2.5

= 2 ёз

з1'5

и 1

'0.5

-•- Группа 1 -•- Группа 2 -*- Группа 3 -»- Группа 4

100 _ 80 60

а8

40 80 120 160 возраст, дни

Си

40 80 120 160 возраст, дни

МОЗГ

Л8

40 80 120 160 возраст, дин

40 80 120 160 200 возраст, дни

Рисунок 6. Изменение содержания меди и серебра в печени и мозге развивающихся крыс.

: р<0.01 по сравнению с группой 1.

Таблица 1

Влияние А§-диеты на исследуемые биохимические и физиологические показатели у Ag-кpыc

Г руппы животных

Показатели Контроль

Ag-A30 Ag-N180

Сыворотка крови

[Си], мкг/Л (и=10) 1306±100 120±10 1 981 ±28

[Ав], мкг/Л (и=10) - 2050 ±210 1500 ±240

*[Ср] белок, мг/дЛ («=10) 65+7 58±5 60±8

**Оксидазная активность, 38.5 ±3.4 1.7±0.5 | 20.0 ± 0.7 |

мг/дЛ (и=10)

***Ферроксидазная активность, 0.70 ±0.16 0.02 ; 0.49 ±0.10

у.е. (/7=10)

СОДЗ активность, ед.а. (и=5) 68 ± 19 112 ±40 155 ±55

Гемоглобин, г/Л (и= 10) 172 ±21 168 + 15 175 ±30

Физиологические показатели

(«=11)

Возраст половой зрелости, дни 60-70 60-70 60-70

Плодовитость, число крысят в 10±2 0 3±1 1

помете

Жизнеспособное потомство 90% 0%**** 90%

Индекс масса тела/масса органа

Печень 32 ±5 НО 29 + 3

Мозг 32 ±5 но 29 + 7

Сердце 335+ 19 но 259 ± 17

Почки 149 ±9 но 132 ±7

Легкие 193 ±26 но 131 ±46

Селезенка 340 ± 26 но 272 ± 30

Тест "открытое поле"

-движение, секторов 29 ±2 но 30.0 ± 2.9

-вставание, раз 8.4 + 0.2 но 5.8 + 0.8

-обследованные норки, кол-во 2.9 ± 0.8 но 1.9 + 0.5

-груминг, раз 1.4 + 0.4 но 2.6 + 0.7

-дефекация, раз 1.6 ±0.2 но 0

Тест "УРПИ" 142 ± 10 но 180 ±9

* - определено методом ракетного иммуноэлектрофореза.

** - определено с помощью ла/и-фенилендиамина.

*** - колориметрическое измерение в геле.

**** - данные Шавловский и др., 1995. НО - не определяли

1 - изменения достоверны по сравнению с контролем

Рисунок 10. Сравнительный гистологический анализ срезов печени и селезенки

А§-А30 и Ag-N180 крыс. А, Б, Г - печень, стрелками обозначены стенки сосудов; В - печень, стрелками обозначены макрофаги; Д, Е, Ж, 3 селезенка; И и К - Инфильтраты в коже (обозначены стрелками). Пятна, не отмеченные стрелками - травмы после выщипывания шерсти (наблюдали у всех крыс этой группы, которых подвергли выщипыванию шерсти).

1.2 -

I 0.8 1

ь о

0.4

0.0

□ контроль

■ Аё

Рисунок 11. Транскрипционная активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов в печени контрольных и А§-крыс.

*: р<0,05.

К Аа К Ag

Рисунок 12. Относительное содержание и активность медьтранспортных белков

и купроэнзимов в клетках печени контрольных и Ag-Nl 80 крыс. А - иммуноблотинг церулоплазмина (1 мкл сыворотки крови на дорожку); СОХ1У в митохондриях (20 мкг белка на дорожку) и СОД1 в цитозоле (30 мкг белка на дорожку); СОММШ (40 мкг белка на дорожку) и МТ (50 мкг белка на дорожку) в цитозоле; Б, В, Г ферментативная активность СОД1 в цитозоле, митохондриях и в цитозоле, соответственно (100 мкг белка на дорожку); Д - содержание железа в ферритине (цитозоль печени, 150 мкг белка на дорожку).

IV номер пика

?" номер фра К ЦП II

1 - 100 кДа - 5(1 кДа ■ - 25 к Да СОД аю WB IIB1IOC1

В - 15кДа - 10 кДа 250

—- Э254 -1Ъ„ 200

к | 150

1 5 9 13 17 2] 25 29 33 37 номер фракции 5 13 14 41)

1 5 9 13 172125 29 33 3741 номер фракции

1» 1 *

Tfc 1 90 ] 1

Hi 60 ffl

1 5 9 13 1721 25 29 33 3741 45 номер фракции

5 13 14 1X21)22 25 273537

1 II III IV номер пика 5 1314 182022 252740 номер фракции

Рисунок 13. Распределение Си и в цитозоле печени контрольных и А§-1Ч180

крыс.

А - Профиль элюции белков цитозоля на колонке с Сефадексом С-75. Вставка - БОЭ-ПААГ электрофорез фракций. Б - Профиль распределения меди в цитозоле печени контрольных крыс. Вставка: иммуноблотинг с антителами к ЦП и СОД активность. В - Профиль распределения меди (синий) и серебра (красный) в цитозоле печени Ag-N180 крыс. Вставка: СОД активность и пик IV в увеличенном масштабе. Г - Содержание меди и серебра, ассоциированных с металлотионеином. □ - контрольные крысы, ш - Ag-N180 крысы. *: /?<0,05. Д, Е - Неденатурирующий электрофорез в 10% ПААГ фракций контрольных и Ag-N180 крыс, соответственно. Ж и 3 - Выявление ферментативной активности СОД в тех же фракциях. Ж - контроль, 3 - Ag-N180 крысы; И - Электрофорез в 12% БОБ-ПААГ фракций пика IV контрольных #37 (1, 2) и Ag-N180 #40 (3, 4) крыс. Образцы были инкубированы с БОБ и 2-МЕ в течение 5 минут при 95 °С (I, 3) или при комнатной температуре (2, 4).

Ag-A30

Ag-N 180

NiiCi, MM 1А,ЦГи]

NaCI. мМ 100 150 200 250 300

(AglfCu]

>м MO.ickv.IV | 0.6 0.9 0.8 0.9

ЦП 1

< <

номер фракции

300 ivi jjh ¡со

номер фракции

Рисунок 14. Характеристика частично очищенных препаратов церулоплазмина из сыворотки крови контрольных, Ag-A30 и Ag-N180 крыс. А и Б: Распределение меди и серебра в сыворотках крови Ag-A30 и Ag-N180 крыс, соответственно. В и Г: Характеристика хроматографических фракций церулоплазмина Ag-А30 и Ag-N 180 крыс, соответственно. 0 - ЦП контрольных крыс, 1-5 - Фракции Ag-ЦП, элюированные соответственно концентрациями NaCI, равными 100, 150, 200, 250 и 300 мМ. а - ПААГ после неденатурирующего электрофореза окрашен на общий белок; б -Иммуноблотинг с антителами к ЦП тех же фракций; в - То же, электрофорез проведен в денатурирующих условия;, гид- Оксидазная и феррокисдазная активности, соответственно, в ПААГ в неденатурирующих условиях). Д и Е - Молярные отношения концентраций меди и серебра в элюированных фракциях церулоплазмина. Ж и 3 - Спектры поглощения и кругового дихроизма фракций ЦП, соответственно. Красная линия — фракция 1 из сыворотки крови Ag-N 180 крыс; черная линия - фракция 3 из сыворотки крови Ag-A30; синяя линия - ЦП, выделенный из сыворотки крови контрольных крыс. Звездочки указывают пики следовых примесей гемоглобина.

б Л

А ,

И Л л

Д ж м а А | _ р/* к 4гр

Ж А аГ р а р

И аГ р/ а р

131

Р1

р/

К , «и! т

Рисунок 15. Некоторые свойства Ag-N180-ЦП.

А и Б - 20-иммуноэлектрофорез сывороток крови контрольных и А§-Ы180 крыс. Гели окрашены о-дианизидином (А), те же гели окрашены Кумасси 11-250 (Б), а - контрольные крысы, б - Ag-N180 крысы, в - совмещенные изображения. В и Г - Перекрестный иммуноэлектрофорез сывороток крови контрольных и А§-1М180 крыс. В середине - схема проведения перекрестного иммуноэлектрофореза. Образцы: 1 -1,5 мкл сыворотки контрольных крыс, 2-1,5 мкл сыворотки Ag-Nl 80-крыс, 3 - 0.05 мкл 250 мМ ЫаС1 фракции холо-ЦП, 4 - 1 мкл 100 мМ ЫаС1 фракции ЦП сыворотки Ag-N180-кpыc, 5 - 5 мкл 150 мМ №С1 фракции ЦП сыворотки 80-крыс, 6 - 5 мкл 200 мМ №С1 фракции ЦП сыворотки

Ag-Nl 80-крыс. Стрелки указывают зоны, окрашиваемые Кумасси 11-250. Д и К -20-иммуноаффинный электрофорез сывороток крови контрольных и Ag-N180 крыс. Греческие буквы обозначают зоны иммунопреципитации. Сыворотки крови предварительно инкубировали (Д) с 40 мкг СопА, (Е) 80 мкг СопА; (Ж и 3) со 120 мкг РИР; (И и К) с 20 мкг \\ЮА на 1 мкл сыворотки. Инкубацию проводили в течение 16 ч при +6 °С.

в | -!

^ - 2 40000 ; = £.

30000 3 = Й

I §• 20000

юооо

200

Рисунок 16. Секреция [14С]ЦП в кровоток контрольных и Ag-N180 крыс. А - Секреция [|4С]ЦП в кровоток контрольных и Ag-N180 крыс. Б - Секреция ['4С]ЦП у контрольных крыс после исключения печени от кровотока. 25 мкл сыворотки подвергали ракетному иммуноэлектрофорезу. а - регистрация зон преципитации по мутности, б -радиоафтограф того же геля. Лунки 1-3: печень исключена от кровотока, через 40, 50 и 60 минут после введения [558]метионина, соответственно. Лунки 4-8: интактные крысы, через 30, 40, 50, 60 и 75 минут после введения [358]метионина, соответственно. В - Секреция [14С]белков в кровоток контрольных крыс и крыс с печенью, изолированной от кровотока. Г - Секреция [14С]ЦП в кровоток Ag-N180 крыс с изолированной печенью.

-г. ®

♦ Ад'

с> Си"

+ Си*

ъ*) У "Р7А/В )

X АТОХ1

\ СОХ17 ^V сох

Сеги1ор1азтт

65Н МТ СОММ01

♦

Рисунок 17. Предполагаемый механизм вмешательства серебра в метаболизм

меди.

Подписано в печать 04.04.14 Формат 60x84'/i6 Цифровая Печ. л. 1.5 Тираж 100 Заказ 22/04 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ильичева, Екатерина Юрьевна, Санкт-Петербург

Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" СевероЗападного отделения Российской академии медицинских наук

04201 4эй6.л На правах рукописи

Ильичева Екатерина Юрьевна

МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ИОНОВ СЕРЕБРА НА МЕТАБОЛИЗМ МЕДИ

МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Н. В. Цымбаленко

Санкт-Петербург, 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................10

1.1. Биологическая роль меди.............................................................................10

1.2. Белки, участвующие в транспорте меди.....................................................13

1.3. Два типа метаболизма меди в организме млекопитающих......................28

1.4. Животные модели, используемые для изучения метаболизма меди.......33

1.5. Сравнение Си(1) и А§(1)................................................................................39

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................................................42

2.1. Оборудование................................................................................................42

2.2. Материалы.....................................................................................................43

2.3. Лабораторные животные..............................................................................44

2.4. Экспериментальные методы........................................................................45

2.4.1. Методы выделения препаратов белков и нуклеиновых кислот... 45

2.4.2. Методы исследования нуклеиновых кислот..................................48

2.4.3. Методы исследования белков..........................................................50

2.4.4. Аналитические методы....................................................................58

2.4.5. Методы гистологического анализа.................................................59

2.4.6. Физиологические тесты...................................................................59

2.4.7. Статистическая обработка результатов..........................................61

2.4.8. Компьютерные программы, использованные в работе................61

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.....................................................62

3.1. Влияние хлорида серебра на метаболизм меди у А§-А30 крыс..............63

3.2. Восстановление показателей статуса меди у А§-А30 крыс.....................65

3.3. Исследование влияния хлорида серебра на метаболизм меди в течение постнатального периода развития...............................................................69

3.4. Онтогенез зависимое влияние ионов серебра на метаболизм меди........77

3.5. Влияние длительной Ag-диeты на метаболизм меди крыс......................83

3.5.1. Показатели статуса меди у Ag-Nl80 крыс.....................................84

3.5.2. Локализация ионов серебра в организме Ag-кpыc........................85

3.5.3. Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом меди, у А&-N180 крыс..........................................................................................89

3.5.4. Внутриклеточное распределение серебра в печени Ag-крыс......91

3.5.5. Распределение серебра в сыворотке крови Ag-крыс....................96

3.5.6. Сравнительная характеристика частично очищенных препаратов церулоплазмина из сыворотки крови Ag-A30 и Ag-N180 крыс .. 98

3.5.7. Некоторые свойства ЦП, циркулирующего в кровотоке Ag-N180 крыс..................................................................................................102

3.5.8. Скорость секреции [14С]ЦП в кровоток Ag-N180 крыс..............106

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................................110

ВЫВОДЫ................................................................................................................120

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................................120

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................122

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень се разработанности

У млекопитающих медь выполняет ряд функций. Она является структурным и энзиматическим ко-фактором жизненно важных купроэнзимов (Tapiero et al, 2003). От медь-опосредованного стимулирования эндотелиального фактора роста зависит процесс формирования сосудов (Easter et al., 2010). В макрофагах взрослых млекопитающих сигнальная система, в которой одним из звеньев является медь, участвует в ранних этапах формирования иммунного ответа (Gérard et al, 2010). Кроме того, медь участвует в регуляции клеточного цикла через индукцию апоптоза (Mufti et al, 2007), контролирует баланс между гликолизом и дыханием, изменение которого ведет к перепрограммированию нормального энергетического метаболизма на специфичный для опухолевых клеток (Gogvadze et al, 2010). При этом свойство меди связывать и активировать молекулярный кислород, в неконтролируемых условиях может приводить к образованию активных форм кислорода, которые действуют на клетки подобно ионизирующему излучению (Armendariz et al, 2004). Безопасный перенос меди осуществляет высококонсервативная метаболическая система меди (МСМ) (Banci et al, 2010; Gupta, Lutsenko, 2009). МСМ всех эукариотов сходны, они включают интегральные мембранные и растворимые цитозольные белки, кодируемые ортологичными генами. Белки МСМ транспортируют медь в состоянии окисления Cu(I) однонаправленно и последовательно при прямых белок-белковых взаимодействиях вниз по градиенту энергии связывания. В поддержании гомеостаза меди в целом организме ключевую роль играет печень.

Врожденные ошибки метаболизма меди и ее экологический избыток или недостаток, приводят к развитию тяжелых заболеваний (нейродегенеративные заболевания пожилого возраста, болезни сердечно-сосудистой системы, рак и др.) (Manso et al, 2011; Gaggelli et al, 2006).

Строение наружной электронной оболочки Cu(I) сходно с таковой у Ag(I) и их координационные свойства похожи (Коттон, Ушиашсон, 1969), поэтому медь-связывающие мотивы белков МСМ координируют и транспортируют Ag(I). Однако ни одного фермента, требующего для своей активности серебро, и ни одного физиологического процесса, зависящего от серебра, в живых организмах не обнаружено. В то же время использование серебра в хозяйственной деятельности человека постоянно растет, поэтому оно может стать фактором загрязнения окружающей среды. На это указывает то, что у морских млекопитающих его количество в печени увеличивается с возрастом. (Nielson, 1986; Клотченко и др., 2008; Zatulovsky et al., 2012; Saeki et al, 2001). Серебро, конкурируя с медью за транспортные белки, снижает биодоступность ионов меди {Pétris et al., 2003; Bertinato et al., 2010; Choi et al., 2006) и встраивается в активные центры купроэнзимов (Скворцов и др., 2010; Wilcoxen et al., 2011), что приводит к потере их активности.

Это делает актуальным и необходимым исследование влияния серебра на различные аспекты метаболизма меди у млекопитающих, что отражается в интересе к этой проблеме ряда ведущих лабораторий мира (Barry et al., 2011; Ibricevic et al., 2010; Bertinato et al., 2010; Vest et al., 2013).

Цель работы

Изучение гомеодинамики меди у крыс, длительное время употреблявших корм, содержащий ионы серебра.

Задачи исследования

1. Изучить влияние ионов серебра, в зависимости от начала Ag-диеты (1 кг стандартного корма содержит 50 мг хлорида серебра) и длительности ее применения, на показатели статуса меди в сыворотке крови (концентрация меди, содержание иммунореактивного церулоплазмина (ЦП), основного медь-транспортного белка, и (ферр)оксидазная активность). В клетках печени оценить (а) активность генов МСМ на уровне транскрипции и содержания

иммунореактивных полипептидов медь-связывающих белков, а также (б) измерить активность купроэнзимов цитозоля печени и сыворотки крови. Сравнить распределение Си и в организме крыс. Определить

субклеточную локализацию серебра в клетках печени. На основе полученных данных выбрать такие группы крыс, у которых эффект Ag-диeты выражен наиболее отчетливо.

2. Провести сравнительный анализ влияния Ag-диeты на метаболизм меди у взрослых крыс, получавших серебро в течение месяца (Ag-A30 крысы), и взрослых крыс, получавших серебро в течение всей жизни (Ag-N180 крысы).

4. Изучить лектин-связывающие свойства и скорость секреции изоформ ЦП Ag-N180 крыс.

Научная новизна полученных результатов

Все полученные в работе результаты являются новыми. Получены данные, указывающие на существование альтернативного механизма, поддерживающего статус меди у лабораторных грызунов при длительном поступлении с пищей ионов серебра. Показано, что эффекты Ag-диeты зависят от ее длительности и периода онтогенеза животных. Так, у Ag-A30 крыс в сыворотке крови концентрация меди и (ферр)оксидазная активность значительно снижаются, содержание иммунореактивного ЦП и активность генов МСМ печени не меняются.

третичной структуре и ферментативной активности ближе к холо-ЦП, чем ЦП Ag-A30 крыс. Однако ЦП А§-1Ч180 крыс отличается от холо-ЦП и ЦП А§-А30 крыс своей аффинностью к ЭЕАЕ-Сефарозе, скоростью секреции в кровоток и составом входящих в его структуру углеводных цепей.

Научно-ирактическое значение полученных результатов

Ag-кpыc можно рассматривать как перспективную модель для фундаментальных исследований транспорта меди, механизмов ее распределения в организме и в клетках, а также молекулярных механизмов формирования активных центров ЦП. Данные, демонстрирующие эффекты поступления в организм лабораторных животных пищевого серебра, послужат основой для рассмотрения серебра как экологического фактора. Они могут быть ценными для выработки научно-обоснованных рекомендаций по снижению эффекта загрязнения окружающей среды серебром (употребление воды, обеззараженной обработкой серебром, использование белья, импрегнированного солями серебра, обеззараживание воды в бассейнах и т.п.).

Методология и методы исследования

Основные положения, выносимые на защиту

3. У крыс, которых содержали на Ag-диете с первого дня жизни до 6-месячного возраста, к 40-му дню (измерения проведены на 5, 20, 40 и 180 дни жизни) концентрация меди и (ферр)оксидазная активность в сыворотке крови снижаются в 2 раза. У Ag-N180 крыс серебро почти равномерно распределяется между органами. В гепатоцитах Ag-N180 крыс серебро распределяется между органеллами относительно равномерно, но его концентрация в цитозоле в несколько раз выше, по сравнению с Ag-A30 крысами. У Ag-N180 крыс в кровотоке циркулируют две мажорные формы ЦП, которые отличаются по сродству к ДЕАЕ-Сефарозе, лектин-связывающим свойствам, скорости секреции в кровоток. Одна из них синтезируется вне печени.

Степень достоверности и апробация результатов работы

Результаты были доложены в форме устных и стендовых сообщений на: 38-й международной конференции по координационной химии (Иерусалим, Израиль, 2008), IV Съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), XII - XVI Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21 века». (Пущино, 2008-2012), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), IV Международном симпозиуме FESTEM «Микроэлементы и минералы в медицине и биологии» (Санкт-Петербург, 2010), XXI Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010). XI Международном симпозиуме «Металлы в биологии и медицине» (Кембридж, Великобритания, 2011), VIII Международной медной конференции «Медь в биологии» (Альгеро, Италия, 2012), XIII форуме молодых ученых европейской ассоциации биохимиков (Санкт-Петербург, 2013), IV Международном симпозиуме «Металломика» (Овьедо, Испания, 2013).

Работа поддержана грантами РФФИ 09-04-01165-а, 09-04-01406-а, 11-04-09445-моб_з, 12-04-09566-моб_з, 12-04-31518 мол_а

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Биологическая роль меди

Медь (в степенях окисления Cu(I) и Cu(II)) обнаружена практически во всех организмах (Слесарев, 2000). Она входит в состав активных центров ряда белков и используется в качестве кофакторов многими ферментами (Masón et al., 1979). Это связано с тем, что ионы меди легко переходят из одного валентного состояния в другое (Cu(I)<->Cu(II)), то есть могут служить как донорами, так и акцепторами электронов. Основная биологическая функция ионов меди состоит в переносе электронов к молекуле кислорода в окислительно-восстановительных реакциях (Lee et al., 2002). Так, например, медь-содержащая цитохром-с-оксидаза (цитохром ааз_ ЦО) связывает молекулярный кислород в процессе дыхания в митохондриях (Lee et al., 2002), а фенолаза (монофенолмонооксигеназа) катализирует гидроксилирование фенолов (Коттон, Уилкинсоп, 1969). Си2+/2п2+-супероксиддисмутаза (СОД) ускоряет реакцию разложения супероксид-иона. Этот фермент является важнейшим компонентом антиоксидантной системы, прерывающей цепные реакции, идущие по свободнорадикальному механизму (Слесарев, 2000). Продуктами таких реакций являются молекулы воды или перекиси водорода (Tumer et al., 1996). Именно поэтому, особенно важную роль ионы меди играют для аэробных организмов. Медь-содержащие ферроксидазы участвуют в транспорте ионов железа, которые являются основой таких фундаментальных клеточных процессов, как окислительное фосфорилирование, транспорт кислорода, формирование соединительной ткани и многих других (González-Mendoza et al., 2013; Kodama et al., 2012; Vashchenko, MacGillivray, 2013). Кроме того, получены прямые доказательства участия медь-содержащих оксидаз в метаболизме холестерина и глюкозы, в функционировании ЦНС, развитии мозга и многих других процессах (Ayton et al., 2013; Scheiber et al., 2014).

Дефицит меди приводит к нарушению перечисленных выше функций и, вследствие этого, к гибели организма, поэтому она относится к незаменимым микроэлементам (Olivares et al., 1996).

В то же время избыток свободных ионов меди приводит к каскаду окислительно-восстановительных реакций, ведущих к образованию токсичных для биомолекул активных форм кислорода: Cu+ + 02 Си2+ + Ог 02~ + "02~+2Н+ 02 + Н202 Н202 + 02"->02+0Н~ + ОН

Таким образом, свободная медь в клетке является высокотоксичной и опасной для всех типов биомолекул.

У человека врожденные или приобретенные нарушения метаболизма меди вызывают развитие множественных дефектов, обусловленных дефицитом медьсодержащих ферментов (анемии, дефекты сосудов, гипопигментация волос, изменения структуры костной ткани, нарушения деятельности ЦНС, нарушение обмена липидов и синтеза пептидных гормонов, болезни Менкеса и Вильсона, болезнь Альцгеймера, прионная болезнь, амиотрофический латеральный склероз (Mason et al., 1979)). Помимо роли ко-фактора ферментов, медь принимает участие в реализации сигнальных путей. Было продемонстрировано, что Х-сцепленный ингибитор апоптоза (XIAP, X-linked Inhibitor Apoptosis Protein), функция которого состоит в прямом связывании с каспазой-3 и ингибировании ее активности, содержит медь-связывающий мотив. При связывании меди с этим мотивом конформация XIAP изменяется таким образом, что он диссоциирует из комплекса с каспазой-3, которая активируется и индуцирует апоптоз (Mufti, 2007). Таким образом, уровень меди в клетке контролирует апоптоз. К тому же, XIAP содержит другой сайт, специфически взаимодействующий с цитозольным медь связывающим белком COMMD1, который участвует в выведении меди (Burstein et al., 2004). Связывание XIAP с COMMD1 приводит к убиквитинированию и дальнейшей протеасомной деградации последнего. Следовательно, XIAP также участвует в

поддержании баланса меди в клетке. С уровнем меди в клетке связана также активность убиквистически экспрессируемого транскрипционного

Информация о работе

Ильичева, Екатерина Юрьевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2014
ВАК 03.01.04

Диссертация

Механизмы влияния ионов серебра на метаболизм меди млекопитающих - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Механизмы влияния ионов серебра на метаболизм меди млекопитающих ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Механизмы влияния ионов серебра на метаболизм меди млекопитающих"

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ильичева, Екатерина Юрьевна, Санкт-Петербург

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Механизмы влияния ионов серебра на метаболизм меди млекопитающих
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия