Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение мутагенного и токсического влияния соединений серебра и свинца на растительных тест-системах

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение мутагенного и токсического влияния соединений серебра и свинца на растительных тест-системах"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИ'ПГГ ОБЖЕЙ ГЕНЕТИКИ и*. К. К. ВАВИЛОВ Р.

на лоавах рукописи

РЕЗТОЕА Ника Васильевна

Ь'ДК 575.£24.45.044

ИЗУЧЕНИЕ МУТАГЕННОГО И ТОКСИЧЕСКОГО ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИИ СЕРЕБ??. И СВИНЦА НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ

03.00.1? - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степ-.ни кандидата йиологических наук

Рабата выполнена в Институте сбаай генетики им. ¥..¥.. Ь&ииг.авь ЙН СССР

НЙЬ'ЧННИ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор Б.А. й'евченкс ООИЦИР.ЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологически наук A.M. Серебряный кандидат биологических наук И.А, Егоров БЕДУЙйЗ ОРГйНИЗйЦИЯ: Институт теоретической и .эксиериыенталь-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГйн АН СССР Автореферат разослан "______"__________________1951

ной биофизики Сг. Пцвино)

1592г.

.мин. на заседании специализированного ученого ПСИ $"'ститат8 ti&iitri ГвйеТИКИ ям. ' Я.и.

ЛГСГ1---------- ------------о iii Tufil-'illJ» +

ни Ыьг ми адресу. aucrfba u-^u^ sJi. J_yi2h;fH3. -

Ученый секретарь специализированного сонета кандидат биологических наук

Г. К. ПОЛШШЙ

0Б2АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Среди огромного количества загрязнителей окруяаюцей среды в последнее 10-летие наблюдается увеличение удельного веса соединений тяжелых металлов. Способность многих из них индуцировать генные и хромосомные мутации,' распространение на огромные расстояния от источникоз загрязнения, множественность путей поступления в организм ставят гх в разряд наиболее' опасных в мутагенном отношении биосферных загрязнителей. Поэтому контроль Зд состоянием окрукав-вей среды не может быть эффективным без учета мутагенной активности тяжелых металлов к их соединений.

Особую трудность в оценке мутагенной активности металлов представляет подбор тест-систем, пригодных для их оценки. В отличие от органических соединений, мутагенные свойства тяяелых металлов не обнаруживзится ь тестах с Микроорганизмами. Имеется весьма аг раниче'лное число данных по оценке мутагенной активности металлов ка рзститпл^ка:: 1 =:т-сксте«зх и я тестах с животными, причем полу ченные данные неадекватны. Также очень мало известно о механизмах мутагенного и канцерогенного действия металлов.

Изучение мутагенной активности металлов (особенно подозрпвае-мых на канцерогенность) даст возможность сделать хотя бы приблизительную оценку степени их генетической опасности для живых организмов. ■Использование серии тестов, регистрирующих различные типу генетических повреждений, позволяет выявить специфичность действия отдельных металлов и их смесей и сделать определенное заключение о механизме их действия. Изучение молекулярно-генетических механизмов действия отдельных металлов и их смесей, выявление концентрационных зависимостей их мутагенного влияния позволит разрабатывать биологически обоснованные ПДК, что способствует решению важнейяих проблем охраны окружающей среды.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Изучение и оценка генетической активности и токсичности соединений серебра и свинца, применяемых при активных

воздействиях на атмосферные процесса.на растительных тест-системах, Основными задачами исследования были:

1. Изучение меташазным методом в клетках ксревков Crépis capillaris L. кластогечного и токсического влиянии солей се-рейра и свинца и их смесей.

2. Исследование индукции соматических мутаций солями серебра и свинца в системе волосков тычиночных нитей традесканции.

3. Лучение на сое*прямых и обратных мутаций и митотического г.поссингосера, впаиваемых Есздействием металлов и их смесей а целью выявлений возмокной специфичности и механизмов их действия.

4. Сравнительный анализ генотоксическогс эффекта, вызываемого неорганическими соединениями серебра и свинца и супермутагенами на вышеуказанных растительных тест-системах для приблизительной количественной «качественной оценки этих металлов как мутагеноЕ.

5. Сравнительная оценке« пригоднтти и чувствительности растительных тест-систем для опредалвнип генетической активности тяжелых металлов.

НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые изучена генетическая активность растворимого и нерастворимого неорганических соединений серебра - металла. подозреваемого на канпр.рогенност&, на растительных тост-сйстекйх. Обнаружено, что эти соединения оолздаазт мутагенной активностью в наиболее низких концентрациях по сравнению с другими тяйсяыми иетйллгми. йсилелован гепптоксическй»\ аффект двух соединений свинца. Проведена сравнительная оценка мутагенности неорга-п-ичесних соединений cepeSpa к свинца относительно других тягелых металлов. Впервые изучена генетическая активность иодидов этих тя-аелых металлов. Они сказались более генотокгичными по сравнению с нитратами. Обнаруаено изучение мутагенного потенциала при сов-местиии воздействии двух металлов, что относится к очень малоисследованной области мутагенеза тяжелых металлов. Выявлен сине!-гизм в случае совместного Бездействия ксдидоб серебра и свинца и

антагонизм при взаимодействии нитратов этих иеталло*.

На основании полученных данных рассмотрены возможные молеку-лкрно-генетическиь механизмы генитоксического действия неорганических соединений серебра и свинца и их смесей.

Проведена оценка пригодности различных растительных тест-систем для определена мутагенной активности низких концентраций тяжелых металлов на пснмере неорганических соединений серебра и свиниа и дана сравнительная оценка их чувствительности.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ: результаты работы имежт прогностическую ценность в реиении вопросов потенциальной генетической опасности соединений серебра'и свинца, применяемых пои активных во?цействиях на атмосферные процессы в качестве льдоо&разуЕких реагентов. Полученные данн::е пс оценке генотоксичности этих тяжелых ме!оллов могут быть использованы при составлении рекомендаций по .. ПдК серебра и свинца в воде и почве.

Предложены методы обработки сои, традескакиии и скерда. пригодные для обнаривеки; слияний низких доз тяяелг/х металлов. Ярег.-■зекенныз методики поименяетсз в 'Институте нефти и газа им.И.Н.Губкина в учебном процессе на факультете химической технологии и экологии по предмету 'Экологическая токсикология" (акт оо использовании предложения

АПР&БАЦ'Ий РА50ТК. Основные материалы диссертации доложены и обсуаденк на следувцих заседаниях и конференциях:

- Обяем геофизическом семинаре Высокогорного геофизического .института Госксмгидронета СССР (г," Нальчик, ноябрь 1986).

- Выездной сессии отделения АН СССР (г. Нальчик, 3-6 мая 1930;.

- Всеси^зном координационном совесании "Генетические последствия загрязнения окружающей среды'мутагенными факторами" (г.■Самарканд, октябрь 1390г.).

- ежегодной конференции по химическому мутагенезу в Институте химической физики (г. Москва, январь 1591г.;,

ОБЪЕМ РйБОТК, Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы. Общий объем диссертации 123 страни-

- fr -

as кавкнсписнаге текста, вклйчаа 7 рисункэв. 13 тасяии а список литература из 2'И наииеаовйни£.

Сийгашиг рагзтк

Ео Ввехении обосновывается гктзьльнасть тепы, ояргя&хххтс* цель и задачи исследования, научная новизна и практическая ценность работы.

I пепвой главе представлен анализ литератуо« по теме диссертации. От физико-химических свойств металла зависит его способность вступать в реакции с биологическими макромолекулами. чек MDEHC Объяснить ОСОббННОСТИ ЙГО ТОКСИЧНОСТИ. 5 1РЯЗИ с этим в данной главе подробно рассматриваются шизико-химические свойства серебра к свинца. Ь силу особенностей своих химических свойств серебро является едним.из наиболее токсичных металлjb. поскольку относится к группе мягких кислот по классификации Льииса и образует •".чвни ^юкчинаг' дешгягхсн с Ьи&язпгсескк psshssh лягакдавк. йлну серебра могут связываться с вслекудекн ДНК я чей -~кс игл.-.-

ется пптекииадькиа мутагеном. Поскольку сепвбро яил.««>тся весьма редким загрязнителем и концентрации его в скруааввей среде невелики, работ, ппсеааенннх иссдедсваниь его мутагенных и канцерогенных: сзойств очень мало. Соединения оесе&ра исследовали только вместе -юльиок группой соединений других иеталлов ка некоторых тест-системах, ~ работ, посвященных исследованию мутагенных свойств серебре почти нет. Ппзтоми-имающийСЕ сведения о мутагенной и канцерогенной активности серебра весьма отрывочны, хотя «ко отнесено к гриппе металлов, подозреваемых на кзкцерогенность, Cepeü— ¡i'-..является пстенциальнвч кат5геном. позтоми исследование его ге-чотсксичегкоге влияния на вксние организны лревставляет интерес.

3 связи с тем. что СБКнбС sejiaBt'.-ü ечея* ашроь* распространенным загоязнителе* и накопление е.гъ ь целом ряде районов у«? превысило допустимый уровень, исследование его токсичности и как-церегкнности проводится дагно и интенсивно. Вопрос о канцерогенной

влиянии свинца остается открыты«. Данные пс мутагенному близь»:? соединений свинца противоречивы. H растений они вызывав7, в осне?-иом нарувеняя аппарата веретена. В опытах с тивптными иаблкдантг-: увеличение числа аберраций хромосом, но однозначного вывода здесь сделать нельзя, да и применяемые концентрации были слишком высоки. Данные по мутагенному вякят.а на человека танле противоречивы. Таким образом свиной и его соединения требует дальнейших исследове-кий их мутагенной активности.

Если сведения с токсическом влиянии пои совместной воздействии нескольких металлов в литературе еее имевтск. хотя v очень отрывочные, то данные о взаимодействии металлов в процесс* мутагенеза почти полностью отсутствуют.' Вопрос о взаимном влиянии металлов на мутагенный пс~енцизл друг друга практически не «зуч?н. й поскольку в округзвяей среде, как правиле, имеет место комплексное загрязнение целым рядом различных металлов, многие из которых является мутагенами, сами по себе, то эта проблема становятся очень актуальной.

Бс второй главе зано описание использованных тест-систем и *етодо= обработки исследуемыми тягелыми металлами. Растения рекомендуется использовать в качестве первого этапа в системе определения возмо»ной генетической опасности различных загрязнителе;' окружающей спеды. Кроме таге, исследование мутагенного елизния загрязнителей окруяасвеЯ среды на растения' важно само по себе, поскольку растения являются ваннейней составной частьс биосферы, от которой зависит благополучие как' биосферы б целом, так и человека, как части биосоеры,

Мы использозали Crépis capiilaris L. для исследования возможных мутагенных свойств солей серебра и свинца. Воздуино-сухие семена замачивали в растворах солей этих металлов. Обработку производили в термостате при 2?°С в течение 42 часоЕ. Такая длительность обработки была избрана в связи с тем, что нас интересовал вопрос хронического влияния низких доз солей тяжелых металлсв, поскольку это более приблигено к тем условиям, которые могут иметь

- в

место в окруяаюаей среде. После обработки пряросжис семена тша-тельно пропивали и готовили временные давленные препаэатн пс общепринятой методике, ннализ аберраций хромосом проводили метафгз-ным методом.

Вtojjoíí использованной тест-системой была традесканция. Обработку производили путем погружения соцветий в исследуемые раствора на 24 часа. Учет мутационных событий гповодили ъ течение 17 дней. Бали использованы два клона традесканции - 02 и 44'0.

Третьей тест-системой, ¿.спользованной для обнаругания кута-П'ннцу свойств серебра и свинца, была соя Glycine sax L.r.Heriii). ;Ъикая тест-пистема дает возможность определять специфичность мутагенов, поскольку с ее помошьв моккс дифференцировать типы хромосомных нарушений, вызываемых мутагенами, а именно - со-катическпи кроссинговер, хромосомные делеции, тпчксг<ые кутании и Hei-icxcsseHHß хромосом. Определение мутагенного действия ведется путем анализа я учета пятен, появляющихся на листьях. Обработку производили путем замачивания сеяян в растворах солей исследуемых металлов на 24 часа. Предварительно зэксчиыалй свивка а дистилгн-рс23н!!0й водй сроком до 2g 4cico¡í.

Для сравнительной оценки кутагеннсгс потенциала изучаемых тя-аелах металлов мы использовали водные растворы супермутагенов, в частности диэтилсульфата. Ь литературе в качеств« позитивного контроля рекомендуется использовать зтилметансульфонат или метил-иеганг-ульфонэт как наиболее активные супермутагены. Циэти.псульфат по своей активности равен или даже превосходит эти супермутагены. поэтому он был-использован в качестве позитивного контроля.

3 третьей главе приводятся результаты исследования мутагенного потенциала неорганических соединений серебра и свинца на растительных тест-системах. Были изучены мутагенные свойства двух соединений серебра - хорошо растворимого AefíOj и практически нерастворимого figl. figl использовали в виде насыщенного раствора. Иссдедо-

занными соединениями свинца были такие нитрат и иодид. Раствори— Б'

мость figl составляет 0,0035 «г/л, что соответствует 1,5-10 М,

растворимость РЬ^ составляет /ОС иг/л, что соответствуй 1,5м К.

В опыта* с Сгпр'.э саоШапг I. йрЯОт в концентрации ¿»К'*0 к оказывал -сильное токсическое влияние. Кончики корней темнели, делящихся клеток в них не было совсем, т.е. проростки практически

_ п

погибали. В концентрации 5 10 М йеНО^ не иказыеел никакого мута-грнкого влияния. Эта концентрация примерно соответствует ПДУ. гс

_ с

сэреОру в питьевой веде.Концентрация 1'Ю М ска-гНЕале мутагенное

— С

влияние. При повышении концентрации от 1 до 6«'0 ° 5! количество аберраций колебалось от 1,07. до 1,82, что в 12,5-22,5 разе лрева-иеет ;;онтроль. Дсзовой зависимости при повышении концентрации ДгНОа не прослеживается. 3 отпичиэ от литературных данных мы не нэг.пвс?-ли появления полиплоидны1' или анеуплоидных клеток, что явились йн доказательством нарииения аппарата зеретена. Несмотря на ослшзе количество просмотренных ыетафаз - свы^е 20 тысяч - мы не наэлида-ли изменения плоидности клеток. . Таким образом мутагенный э^аект нитрата серебрз проявляется в довольно узком диапазоне субтэкси-ческнх концентраций от Ю Н до'!0~ Я.

Насндейный раствор «¿1 оказывал славок мутагенное действие из проростки С.сар!11ап5. Процент аберраций повышался незначительно и составлял всагп лишь 0,242, хотя это повышение все-таки статистически значимо,. Таким ибразим практически нерастворимый ЯрТ оказывал мутагенное влияние в более низкой концентрации, чем растворимый ЙгКСх.

Если провести соавнение мутагенного действия серебра с- другими тяаелвми металлами, то следует отметить, что соединения серебра индуцирчзт хпомосомные аберрации в самых низких дозах.

- 5

во всех исследованных концентрациях от 5-10 М до

4*И не вызывал повышения числа хромосомных аберраций.Конценг-и

рация 4'10 М оказалась токсической. Что касается иодида свинца,то

концентрация, при которой наблюдался токсический эффект, била практически такая же. как и для нитрата свинца (3,8М0~Ч М). Но в ' субтоксических концентрациях РЬ!д оказывал мутагенное г-лиякие ка

- iü -

проростки C.capi 1 iarls в отличие от Pb(H0^> который такого влияния не оказывал ни в одной из изученных концентраций. Наибольший процент аЗерр&цкй -- 1,98% - набладался при концентрации РЫ^ 1.9i0~tJ Л. При говывении концентрации от 0,95 до 3,6*i0"4 М процент аберраций колебался от 0,Ш до 1.98%, что в 8,6-28,3 разе превывает контроль. В целом при изучении влияния различных концентраций иодида свинца на проростки C.capillaris прослеживается дсзовая зависимость. РЫ2, таксе как и flgNO^ проявляет мутагенную активность в дзкск диапазон субтпксических концентраций от i'lCf^ü до 3,8'Ю"1' К. Генотоксическнй эффект, вызыБаемый РЫ2. является дозоэависимым.

В результате исследования двух различных соединчний свинца, проведенных на приростках C.caplliaris 0ыло выявлено, что с точки зрения токсического влияния эти соли оказались очень сходными и отравление проростков наступало при одинаковых кониентрациях обоих соединений. Что se касается их мутагенного влияния, то результаты оказались разными. Нитрат не сказывал мутагенного действия в концентрациях buse токсических, , Еодид ае свинца ясссслзл мутагенное дййг.-riHf! а тях .же ьубтоксичепких концентрациях с дозозанисимым эффектом.

При изучении взаимодействия металлов были взяты низмие из

с

действувцих концентраций. Для нитрата серебра это i-10"° М, для ио-дйдз свинца - И. иодид серебра - насыщенный раствор. По-

скольку нитрат свинца ни в одной из субтоксических концентраций не оказывал мутагенного воздействия, ег.о концентрация была взята произвольно.

Насыщенный раствор Йд! сам по себе вызывал слабое, но достоверное увеличение числа-хромосомных аберраций. PbÍ2 в данной концентрации вызывал повывение числа хромосомных аберраций, но статистически незначимое, В случае взаимодействия наблюдалось взаимное усиление мутагенного потенциала этих металлов.

Совераеннс противополокные результаты были получены в. случяр взаимодействия нитратов этих металлов. Если figHOj в концентрации

10"6 X вызывал 1.0% аберраций хромосом, РЬСКО^З^ не оказывал никакого мутагенного влияния, то при их взаимодействии свинец полностью подавлял мутагенное влияние серебра и процент аберраций снимался до уровня контроля, т.е. в данном случае имеет место антагонизм при взаимодействии этих двух металлов в виде нитратов.

Таким обоазом в результате проведенных экспериментов выяснилось, что при взаимодействии серебра и свинца в виде иодидпг имеет место взаимное усиление их мутагенных свойств, а при взаимодействии зтих же металлов в виде нитратов, ■ наблюдается обратный эффект, когда сзинец полностью подавляет мутагенное действие серебра.

В качестве позитивного контроля были ззнтв раствори диз-

—р. я

тилСульфатз (ДЗС) сходной концентрации от 10 М до !0~° М. Во всех исслгдованных концентрациях ДЗС не вызывал повышения числа хромосомных аберраций по сразмеь.ч» с контролем, хотя вцемя обработки было вгсьна длительный - 42 часа. Получеякке накк результат не псстиворечат литерагурнык данный. ДЗС авлзетса своеобразный супег— кутаганок, выаывагвкк Оольиое ксл^есдво кутаций и пракгичгска кс влиявший на число хрокосоыных абарраций у растении, о дайне.« .гл-ле>-такяе проводится сравнение и с другими супермутагеканш С по литературный источникам). Если дать количественную оценку генотскси-ческого действия неорганических соединений серебра и свинца относительно органических супераутагвнпв, то их'мояно классифицировать как слабые мутагены.

Так»е проведено сравнение с мутагенным действием других тянч-лых металлов (но литературным источникам3. Среди везх тяяелих металлов серебро проявляет генетическую активность в самых низких концентрациях порядка 10"® К и да«е нияе (для йвП.что на 1-3 порядка ниве, чек ; ? других тяяелых иегаллов. Генетическая активность серебра хорошо согласуется с его высокой токсичностью, Сзинец (в виде иодида) имеет средний генотоксический потенциал, Если , рвеполоть изученные металлы в порядке убывания их евнотоксич-ности для растений.то получится следующий рад:йв>М1>Се1>РЬ'>Ва>А1 .

3 качестве еще одной растительной тест-системы для проверки

мутагенных свойств солей серебра и свинца была использована тра-

- 5

десканция клоны 02 и 4430. flgNOj в концентрации ди 2*10 M не вызывал повыыения уровня соматических мутаций у традесканции клона 02. При повыиении концентрации происходило повывение числа мутационных событий в 2-2,5 раза по сравнению с контролем. Дозозависимо-го эффекта, как и в опытах с C.capü'aris не наблюдалось. При повыиении концентрации figNOj с 3 до 6»10~^ К процент мутаций практически не изменялся. В тестах с традесканцией действуюиие концентрации оказались на порядок выае, чем в опытах с C.capillaris.

Насыщенный раствор Agi вызывал повышение уровня соматических мутаций в 2.5 раза по сравнению с контролем. Так что в опытах с традесканцией подтвердилась большая мутагенная активность Agi по сравнению с очень токсичным flgNO^.,

В экспериментах с клоном 02 мутагенное влияние РЬЬ проявилось

„о

только при высоких концентрациях порядка 1.5*10 ù M, что соответствует его растворимости - 700мг/л при 21°С. При этой концентрации наблюдалось двукратное увеличение числа соматических мутаций по сравнений с контролем. Токсического эффекта не наблюдалось ни s одной из исследованных концентраций.

■PbCNÛj^ вновь,как и в предыдущем случае, не оказывал никакого мутагеннрго влияния и в опытах с традесканцией клона 02.Исследованные концентрации были от 2 до 8*10~°й,что выие. чем для РЫ». Токсического эффекта ни в одной из исследованных концентраций' также не наблюдалось.

Результаты экспериментов по воздействию смеси солей серебра и сЕинца на традесканцию клона 02 хорошо согласуются с результатами, полученными с использованием C.capillaris. Для исследования мутагенного воздействия смеси иодидов свинца и серебра был взят насы-

-Ч

ценный раствор Agi и Pblg в концентрации 3,8-10 M.Pblg в этой концентрации не оказывал никакого мутагенного влияния на традесканцию клона 02. Agi вызывал повышение уровня соматических мутаций vr сравнении с контролем в 2,5 раза. Бри совместном воздействии этчх

двух солей мутагенный .эффект figl усиливался в 2,5 раза. Отличия между воздействием отдельных солей и их смеси статистически достоверны.

Противоположные результаты получены в случае совместного воздействия этих же металлов в виде нитратов. В этом случае мутагенный эффект нитрата серебра вновь полностью подавлялся, как и г случае с C.caoiliaris.

Таким образом при воздействии смеси серебра и свиниа е виде иодидов на традесканцию клона 02 наблидалось взаимное усиление мутагенного действия этих двух металлов. При взаимодействии этих ке металлов в виде нитратов, они проявляют антаг~низм и мутагенное вличние нитрата серебра полностью подавляется нитратом свиниз. £ обоих случаях концентрация солей серебра была на 2-4 порядка ниже, чем соединений свинца. Эти данные, полученные в экспериментах с традесканцией клона 02,полностью совпадают с результатами опытсь со скердой, только применявшиеся концентрации были несколько ныие в сличав с традесканцией.

Для сравнительной оценки мутагенного действия исследуемы/.

соединений тяжелых металлов в качестве позитивного контроля был

также использован ДЗС в концентрациях от до 50 Нремг и

-б

способ обработки были аналогичными. Низшие концентрации ДЗГ. - 10 -5

и 10 И не оказывали никакого мутагенного действия на традесканцию обоих клонов.S концентрации 10~°М ДЗС оказывал мутагенное действие на оба клона традесканции.

Также проведено сравнение и с другими супермутагенами - нит-розометилмочевиной (НИМi и этиленимином СЗИ). ЗУ вызывал повышение числа соматических мутаций в 2-3,5 раза в довольно узком диапазоне концентраций от 45.5 мМ до 11,6 мМ. НММ оказалась более активной. Процент мутаций при обработке этим супермутагеном в 10-15 раз превышал контроль, но действующие концентрации были также на 1-4 порядка выие, чем у солей серебра и свинца.

Таким образом,¿ели провести количественное сравнение действия супермутагенов и исследуемых тяжелых металлов, то следует отме-

тить, что наибольший мутагенный эффект оказывает НИМ. Зто соединение вызывает повыаекие частоты соматических мутаций'у традесканции клона 02 до 2,68%. Соединения тякелых металлов вызывают значительно меньший мутагенный эффект - 0,33%, но действующие концентрации для металлов значительно ниге. Исходя из этого исследуемые нами соединения тяжелых металлов конно отнести к группе слабых мутагенов по сравнении с супермутагенами.

Клон 02 оказался более чувствительным к воздействию наследованных соединений тягзлых металлов по сравнению с клоком 4430. Е случае яе воздействия органических супермутагенов, клон 4430 является более чувствительным, что соответствует икеюиимся литературным данним.

Третьей тест-систеиой. на которой ми испытывали мутагенный потенциал неорганических соеди"ений серебра и свинца, оыла соя. Зта тест-система была использована для выявления возможной специфичности действия соединений этих металлов. поскольку появление разного типа пятен на листьях зтрго растения обусловлено различными типами иутацчи и рекомсинзинй. Пек с£»зо>стгвл*Няя относительной чзстстя гозрастаккя отдельных, типов пятен, »аьн.е сделать ипреде-лгнные выводы а специфичности действия испытываемых мутагена*.

При исследовании мутагенных свойств соединений серебра.было выявлено, что АрМО» в концентрации выше 3»10"'" М токсичен. Его токсичность прогрессивно возрастает с увеличением концентрации, всхояесть при этом резко падает. Но следует отметить, что растения. виаившие после воздействия высоких доз АсК05, не имели видимых уродств, . они были только ослаблены, но точки роста не были повреяденн.

При воздействии всех напитанных концентраций ЙдНОд от 10*®й до

К наблвдалось приблизительно двукратное возрастание общего

числа пятен'на лист по сравнения с контролем. Причем «то воэраста-

— Ё

наступало быстро ухе при концентрации 5*10 " Ы,а затем далее иг

иэийнялоск Различи« 8 испытанных концантрациах, облашних инт;,

«й Б

генным действием,были письма значительными от 5-10 в к! до З'Ю

Более высокие концентрации были уме токсическими и поэтому мы иу не учитывали как мутагыные.

Б результате воздействия АеШЦ наблюдается пропорциональный рост всех типов пятен на лист, не сгмечается заметного роста или направленного изменения относительного числа какого-либо определенного типа пятен по срав' ению с другими и с контролем. Пропорции меяду различными типами пятен почти.не изменились. Только несколько увеличилось количество парных пятен, во рост этот невелик. По-видимому у этого соединения нет какой-либо специфичности действия.

При воздействии насыиенного раствора Яе1 на семена сои наблюдалось аналогичное приблизительно двукратное возрастание обаего числа пятен. 3 данном случае мы наблюдали только некоторый рост писяа пятен, обусловленных генными мутациями. Таким образом в результате этого воздействия такае наблкцается примерно пропорциональное увеличение количества всех типов пятен, что говорит ос-отсутствии какогс-либп специфического действия данного соединенна.

РЫ2 не был токсичен ни в одной из исследованных концентраций вплоть дс концентрации 1.5*10~3 М.что соответствует его растворимости. Мутагенные свойства этого соединения проявились только при этой вксокой концентрации, которая вызывала трехкратное возрастание числа пятен по сравнения с контролем. Все белее низкие концентрации оыли неактивны.

При воздействии РЫ^ происходило з основном увеличение коли чества пятен, обусловленных обратными гбнными мутациями, что хоро-яо заметнб по изменении пропорций относительного возрастания частота разных типов пятен,

РЫКО^ во всех исследованных концентрациях от 10М до 10~2 К никакого мутагенного влиянии ие оказывал. Концентрации выше 5*10~^й были токсичными. Наблюдалось сниаение всхояести пои концентрации 10 М и вырагенный тератогенный эффект.Почти у всех проростков самядоли нз были, вынесены на поверхность, что говорит о поврендении подсемядольного колена, Йо многих случаях были поврен-

денк точки роста и растения начинали ветвиться-на уровне двух первых простых листьав. Таяяе найлкдалось срастание листьев у первого сливного листа.При Концентрации 5 й снижения всхомести не было, чо растения бгли с выравешшми вывеперечисленными уродствами, аозтсиу зту дозу мы такае сочли токсической. Повышения же уровня соматических мутаций не было.

В опытах с разными соединениями свинца мы вновь сталкиваемся с тем же самым явлением, которое было атаеченс в опытах с С.сарН-¡аг:5 и градесканцией.РЬЬ сказывает мутагенное влияние по крайней хоть в одной концентрации. Нитрат ае свикца и в Солее высоких концентрациях никакого мутагенного действия не оказывает.

При исследовании влияния смеси нитратов серебра к свинца вновь наблюдался антагонизм. Если нитрат серебра в концентрации 2*10"^ вызывал двукратное повышение уровня ссмлтическлх мутаций на гостьях сои. то при совместном действии с нитратом свинца этот зф-фэкт полностью снимался. При совместном воздействии ИОДИДОЕ этих двух металлов не наблюдалось взаимного усиления их мутагенного потенциала. которое оыло отмечено £ опытах п С.сапШ^г!? и тра-вкг.кпнниед.

Для сравнительной оценки мутагенного действия исследуемых металлов в качестве позитивного контроля бал взят ДЗС в концентраци--Ц -3

ях от 10 И до 10 X.Никакого токсического влияния в исследованных концентрациях это соединение не оказывало. Концентрация 10 Н была неэффективной, а при концентрации 10~° К происходило возрастание абсолютного числа почти всех типов пятен, но наиболее заметно возрастало количество пятен, обусловленных течковыыи мутациями. Количество парных пятен, причиной которых является соматический кроссинговер. возрастало в значительно меньшей степени. Отссда исано сделать вывод, что ДЗС вызывает в основном точковне мутации, что хороио согласуется с литературными данными.

5ыл проведен сравнительный анализ и с действием других супермутагенов - Зй и ШШ. Зй также вызывал заметный рост числа пятен, обусловленных точковыми мутациями. Совсем не было парных пятен'.

Хорошо г.росленивается направленный рост опоеделенного пятен при воздействии RMM. На фоне общего возрастания количества всех типов пят^н чоровп заметно направленнов изменение абсолвтнпго и относительного числа желтых пязен на светло-зеленых листьях и

светло-зеленых пятен на темно-зеленых листьях. Поскольку анзлог;:ч-

«

ного возрастания числа дру.их типов пятен нл происходил^.', то kssho сделать вывод, что НЙМ s основной вызывает делеаии хромосом.

Такин образок кз анализа относительного числа различных типов пятен на листьях сои видно, что супермутагены, в отличие от тяжелых металлов, обладают спеииоическим действием. /33С и ЭИ вызывая: в основном точковые мутации; НЫМ - делении хромосомного материале. Исследованные соединения металлов вызывают пронгрииональний рост числа всех типов пяте", следовательно никакой специфичности дййствия в это» случае не наблюдается.

Супермутагены оказывают значительно более сильное мутагенкс» влияние. В результате их воздействия уровень соматических иjtshhh в 4-20 раз лревыкает контроль. Тявелае металлы вызызаят только приблизительно двукратное повышение числа соматических мутаций пс. сравнению с. контролем. Следовательно мы вновь конем охарактеризовать их как слабые мутагены. Что яв касается эффективных концентраций. то РЫ2 оказывает мутагенное влияние примерно в такой яе концентрации, как и супермутагены. Соединения не ccpeipa индуииру-ет соматически? иутаг.ии в концентрациях на 1-4 порядка иеньших, чем супермутагены.

Обси'ядвние результатов. Было изучено мутагенное влияние серебра в виде двух его соединений - хоростс растворимого нитрата к практически нерастворимого иодида, применяемого при активных воздействиях на атмосферные процессы. Эти два соединения серебра оказались мутагенами и их мутагенные свойства проявились на всех использованных тест-системах. figN'Q^ проявляет мутагенные свойства в довольно узком диапазоне субтскеических концентраций: i-6'10~c M для C.capiilaris: 5-30*10"^ M для сои и 2-7»1С"® M для традесканции. В случае с Agi мутагенные свойства проявляет его напыленный раст-

вор. Растворимость figl составляет í,5»1С-0К, а поскольку клетки растений поглоиаюг вещества е растворенном состоянии, тс по всей рерсятног.тк именно эта концентрация и Рунет действующей для see?: использованных растений. Таким образом получается, чте действующие концентрации нитрата серебра на два порядка бwe. чем иодида. Объяснить это различие моено разным поведением зтих двух солей в водных раствооау. Нитрат серебра б водных растворах легко распадается на кони и константа устойчивости у зтего соединения очень мала líK - -С,03. Иодид se серебра на ионы практически не распадается, .'бйазованиб-молекулы Agí происходит за счет оеакции координирования и связь »«раду í!p+ и I" в данной молекула координационная. Константа устойчивости данного соединения высока - igK - 6.58. Следовательно это соединение серебра поступает в клетки растений в биде молеку.f, а не ионов, как flgHOg .

Для серебра типичны реакции комплексоооразования. У иона йд+ имеются разнообразные' возможности для образования гибридных орби-Талей и, следовательно, различных типов комплексных соединений г. :.v.нейной ксорликгцией. 3-«т вин координации мовет осивествляться олаголара небольшой разности ъ гнерги«. заполненной 4й-ер.-нтзл? :: свободней внкшней 55-србитали и образованию гибридных ás-орбита-лей. Молекула f;gl тзкве мозет вступать б реакции комплексообразо-ваняя. поскольку координационное число fig равно 2.

5 связи с тем. что серебре оказалось мутагеном не только, б тестах с культурами тканей млекопитающих, но и в тестах с высаими растениями, что было выявлено в накей оаботе. интересно рассмотреть возможные механизмы его мутагенного действия.

5 силу особенностей своих химических свойств, серебро является потенциальным мутагеном. Оно мовет непосредственно взаимодействовать с молекулами ДНК. Способность прямо связызаться с ДНК является неотъемлемым свойством канцерогенных металлов.Для того, чтобы, в клетках живых организмов ионы металлов могли вступать в прямое взаимодействие с ДНК, необходимы два условия: первое -доставка их к ДНК. л второе - реакция с ДНК, В общем нет достаток-

ной вероятности, чтс металлы лействавт этим пчтек. поскольку. чт(<-ок оыть наставленным к ДНК. соединение должно быть дипсеильныв. Ионы металлов, как правиле, гидрофильны, но они могцт стать липг-фйльинми пси хелативованми v. таким пут«!« легко проникать * ;:Н;., ;;узнствует tic-ш.'; ряд свидетельств, что серебро легко псьв^сгаг.т:; холатиоованив поскольку оно индуцирует синтез ^еталлотионеикгв i животных и актохелатиноБ у растений Так ApNO* индуцирует сиктя:-¿итохелзтинов з кцльтупь клеток пастенкй в кониентоаиик C'íC"" К. Зти соединения связываит иона металлов путем их коосдиниров~.ни:-: ; атомам." евин. Таким образов ионы еввебрг лыко хялатярщт zs ц сьт достаточно стабильны. «тоОн' проникнуть через клеточные мекорзкЕ i-попасть внутрь клетку..

Вторым условием для псямого взаимодействия с ДКК является тс. что эти хелаты деляны быть достаточно нестабильными, чтоик е«ен,,гь свой лиганд. когда снавутся в непосредственной близости возле ДНК. Относительная стабильность связей flgT с неметаллами изменяюсь ь слелуящг* перя^ка; H?S>G. Следоват?гънп кенн серебра в данной случае могут сменить свой лиганд, поскольку в вптохелатинах и мэтая-латионеинах они координированы с атомами серы, а в молекулах ДНК они могут соединяться с атомами азоте. Таким образок прямое взаимодействие ионов серебра с ДНК в аивых клетках вполне возкеано.

Крим? прямого влияния на ДНК серебро может вызывать мутации и в результате непрямого действия, а опосредованно через индукцкз свободных кислородных рэликалор и перекисей и путем влияния ка ?ермекты. Установлено, что серебро оказывает влияние на метаболизм меди и селена. Сзлек входит в состав вавнейвих энзимов, сникавших концентрацию активных кислородных радикалов внутри , клетки. Медь аходит в состаг фгриентов дыхательного цикл-:, а нарушение 5>того цикла TaKie приводит к накоплению свсбодннх перекисни* радикалов внутри клетки.

Другим возможный путем непрямого влияния серебра является егс способность влиять ка активность ферментов, участвующих в процессах репликации и репарации ДНК.

Таким образом серебро кокет оказывать мутагенное влияние как в результате прямого, так и непрямого влияния на ДНК. Исходя из результатов опытов г соей, в которых не было обнарукено какой-либо специфичности действия изучаемых металлов, можно сделать еыбод. что наиболее вероятным механизмом действия соединений серебра является второй путь, а именно непрямое влияние на ДНК. Причем это непрямое влияние идут скорее всего «еркз накопление свободных ле-секисных радикалов. Свободные радикала вызывают ;азоывы цепей ДНК. П-'.д'ьерадением этого в некоторой степени могут слукить результаты эпытое г С.cap illarîs. где основным типом аберраций были делеции чг;г.кпсг.м.

Ионы свинца в силу своих физико-химических особенностей очень реакци'онноспособны и легко вступают в реакции г взанейвими биомо-лекулаии. Данные по мутагенному и канцерогенному влиянию свинца -Чень противоречивы, но тем не менее имеьтся челый ряд свидетельств его мутагенной активности. Полученные нами результаты пс мутагенному действию ■ двух соединений свинца на высиих растениях также проткворечивц. PLU на гсех "ест-скстгйг?: про-

«С

явил «утиггк;::;с свсйстел и субтокскческкх "спцентрзцня.х. t> скерда

-5 -ч

мутагенными были концентрации от 5,5*10 К до 3,8*10 И (зт* концентрация уае была токсической). Для традесканции клона 02 и для соя мутагенной была концентрация 1.5*1С ° М.Более низкие концентрации не оказывали мутагенного действия.

PikKQj^ не проявил мутагенного влияния ни на ' одной

тест-систем? ни в одной из испытанных концентраций вплоть до

-'I

токсической, юксическими концентрациями для скердк были 4*10 К.

дл; сои - 5* 1С"*3 Н.для традесканции ни одна из испытанных концентра--X

ций вплоть до 8*10 Я не была токсической.

5 экспериментах с соединениями свинца мы вновь сталкиваемся с тем se явлением, что и в случае с серебром, Иодиды имеют больвий мутагенный потенциал, чек нитраты, а нитрат свинца вообще на проявил мутагенных свойств. По-видимому это объясняется такае различным поведением этих двух солей б растворах. PbiNG^B водных раст-

ворах полностью распадается на ионы, 1дК = 0.7. РЫ. на иокк в

растворах почти не распадается, IдК = 4,1. В данной молекуле вновь 2+

меаду РЬ и I существует.ня ионная,а координационная связь.Следовательно -поглоааться клетками растении РЬЬ будет в виде молекул. о не ионов.

Если говопить о возмояных механизмах мутагенного яайствия свинца, то как и в случае с серебром, оно скорее всего непрямое, а опосредованное либо через индукция активных перекисных радикалов, либо через ингибиоование ферментов., участвующих в процессах репликации и репарации ДНК.

Исхода из полученных нами результатов следиет отметить больную генетическую активность иодидов серебра и свинца по соа»ненн.т с их нитратами. Еще одним возмоякым объяснением этого мовет оып, тот' факт, что кристаллическая решетка этих, соединений, особеннс иодкда серебра, почти полностью совпадает с кристаллической решеткой льда. Возможно этп в какой .то степени облегчает поступление-мельчайших кристаллов этих веществ, присутствующих в насыщенных . растворах во взвеаенном состоянии, внутрь клетки, а далее они уве становятся источником постоянного поступления ионов металлов.

Полученные нами результаты по взаимодействию серебра и свинца в виде разных неорганических солей в прпцессе мутагенеза такие неоднозначны. При совместном воздействии иодидов этих двух металлов их мутагенный потенциал усиливается. Зто япко проявилась на двух тзет-системах - скерде й традесканции. Б случае взаимодействий нитратов этих металлов, свинец полностью подавлял мутагенное влияние серебра. Причем эти результаты были аналогичными в экспериментах со всеми тремя тест-системами. Во всех случаях концентрация, серебра бала на 2-4 порядка ниже, чем свинца.' Оба соединения применялись одновременно.

Б случае совместного присутствия в растворе иодидов серебра и свинца формируются комплексные соединения РдЬ и РЫ , что следует из сопоставления сос-вететвующих констант устойчивости. Эти комплексные соединения по-видимому легче проникают внутрь клегки. Не-

- Il -

таллы в виде анионных комплексов легко передвигаются в растениях и обладают бо'льиим кластогенным потенциалом, Катионы «е металлов сами по себе малоподвиЕны. Сформироваввиеся комплексные соединения могут обладать сьоим собственным мутагенным потенциалом.

Нитраты серебра и свинца при совместном воздействии проявляют антагонизм. Вероятно в данном случае ионы этих металлов конкурируют друг с другом при поступлении - клетки за точки связывания с биомслекулами.

Что касается использованных тест-систем, то следует отметить, что наибольвей чувствительностью к мутагенному действию испытанных соединений оказалась скерда (Crépis capillaris L.). Для обнаруве-ния »утагенного-действия низких концентраций тянелых металлов время обработки следует увеличивать (В нашем случае до 42 часов).

Традесканция клона 02 такл. пригодна для обнарувения мутаген-лых свойств тявелых металлов в качестве зкспресс-кстода. В данном случае обработку следует производить путем погрувения соцветий в испытываемые растворы ' на 24 часа. Другие способы обработки неэффективны.

Сов ieiycine вах tL. ) Merill) такке moeho использовать в качестве тест-системы для обнаругения мутагенных свойств тяаелык металлов. Обработку следует производить путем замачивания семян в испытываемых растворах в течение 24 часов. Лучве провести предварительное намачивание семян в воде в течение 6-20 часов, чтобн в клетках гарантированно начался синтез ДНК.

ВЫВОДИ

1. Доказано, что серебро в виде двух исследованных солей,' является мутагеном. Его мутагенные свойства проявились в тестах с высвими растениями. По сравнению с другими тявелыми металлами оно является ' наиболее активным, так как его мутагенные свойства обнаруживаются уве при очень низких концентрациях.

2. Свинец является мутагеном, но его мутагенные свойства

от вида соединения. Так иодид свинца обладает мутагенным

текииалом. а его нитрат - нет.

, йерэстзооиные и плохо растворимые иодиды серебра и свинца об!

.падают болызив мутагенным потенциалом по сравнению и хоросо растворимыми нитратами. Это связано с , ем. что они поступай- б клетку в .зиде молекул, а не ионов, и могут формировать комплексные соединения.

4. Серебро и свинец обладают непгямым генотоксическим действием, что подтверждается как имевшимися литературными данными, так к полученными нами результатами,

5. С-ребрз и свинец являются слабыми мутагенами по сравнение > супермугагенамк, кл их'мутагенные свойства проявляются в очень низких концентрациях. Эт^ . необходимо учитывать пои оцени? последствий загрязнения окруваюией среды зтими металлами.

6. При совместном действии серебра и свинца могут проявляться как синергизм, так и антагонизм в зависиклсти от вида соединения.

7. Применявши гея растительные тест-системы пригодна для пбнари»:^-нйя мутагенного потенциала тяг-елых «еталлпр в низких концентрациях. Необходима только некоторая модификация спосопов овва-ботки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Реутова Н.В., Левченко В.Р. Мутагенное влияние солей серебра •и свинца. // Тез. докл. Всес. коорд. совещ. Москва-Самарканд, 1990. стр. 154-156.

2. Реутова-И.В., Шевченко В.А. Серебро как ¿озмошьый мутаген.//Генетика. 1991. 7. 2?, 7. стр.1280-1284. ■

3. Реутова Н.Р., Еевченко В.А. О мутагенном влиянии двух различных соединений свинца.//Генетика. 1991. Т.27. 7. стр.1275-1279.

4. Реутова Н.В., Шевченко В.й. Мутагенное действие неорганических соединений серебра и свинца на традесканция.//Генетика, (с печати).