Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболизм меди в мозгу крыс при различных состояниях организма

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболизм меди в мозгу крыс при различных состояниях организма"

На правах рукописи

ии^44В797

БАБИЧ Полина Сергеевна

МЕТАБОЛИЗМ МЕДИ В МОЗГУ КРЫС ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СОСТОЯНИЯХ ОРГАНИЗМА

03.00.04 — биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 ОПТ 2003

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2008

003448797

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики НИИ экспериментальной медицины (НИИЭМ РАМН), на кафедре биофизики физико-механического факультета Санкт-Петербургского Государственного политехнического университета (СПбГПУ) и на кафедре прикладной химии и микробиологии факультета Сельского и лесного хозяйства Хельсинскош Университета (Хельсинки, Финляндия)

Научный руководитель

Научный консультант

доктор биологических наук, профессор Людмила Валентиновна Пучкова

профессор Maija Mutanen (Helsinki University, Helsinki, Finland)

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Елена Ефимовна Дубинина

доктор медицинских наук, профессор Александр Дорофеевич Денисенко

Ведущее научное учреяедение Санкт-Петербургская

Государственная

химико-фармацевтическая академия

Защита состоится «30» октября 2008 г в 15 00 часов на заседании совета Д001 022 03 по защите докторских диссертаций при ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу. 197376 Санкт-Петербург, Каменноостровский пр, д 69/71

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИЭМ РАМН (197376 Санкт-Петербург, ул Академика Павлова, д 12)

Автореферат разослан « сентября 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, проф Пучкова Л В

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования Медь необходима для жизни всех организмов, так как участвует в осуществлении широкого круга клеточных процессов от образования трансмиттеров до синтеза гема Она входит в состав простетических групп ключевых ферментов, участвующих в окислительном фосфорилировании, формировании соединительной ткани, антиоксидантной защите, двунаправленном транспорте железа (Kar 1т, 1993) С другой стороны, ионы меди могут индуцировать образование активных форм кислорода, которые, действуя по механизму, сходному с ионизирующей радиацией, разрушают биополимеры (Linder; 2001) Поэтому в клетках всех типов существуют эволюционно консервативные системы для безопасного импорта, распределения и экскреции меди (Puig, Thiele, 2002) Любые, даже незначительные, сдвига в их работе, вызванные генетическими или JKUJIU1 ическими факторами, становятся причиной отдаленного развития тяжелых нейродегенерашвных заболеваний (Gaggelli et al, 2006) Системы носят органоспецифический характер и изменяются в течение онтогенеза (Пучкова, Платонова, 2004), они особенно уязвимы у новорожденных (Madsen, Gitlin, 2007, Penland, Prohaska, 2004, Prohaska et al, 2005)

В Отделе молекулярной генетики ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН было показано, что церулоплазмин (ЦП, мультимедная голубая оксидаза, выполняющая также роль донора меди для клеток негепатоцитарных рядов (Bielli, Cabbrese, 2002)), входящий в состав молока является регулируемым пищевым источником меди (Платонова и др, 1999, Платонова и др, 2004) Новорожденные, вскармливаемые молочными смесями, которые, как правило, обогащены солями меди, получают избыток свободных ионов меди (Пучкова и др, 1997, Lonnerdal, 2005) У новорожденных крыс, вскармливаемых молочными смесями, в печени происходит преждевременная смена эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый тип (Платонова и др, 2005, Platonova et al, 2007) Одновременно в СМЖ этих животных 7-кратно повышается концентрация меди и ЦП Показано, что m vitro ЦП в концентрации выше, чем она поддерживается в СМЖ, вызывает гибель нейронов В то же время для дифференцировки молодых нейронов требуется ЦП (Maltais et al, 2003) Вместе эти данные указывают на важность поддержания гомеостаза меди в мозгу в период новорожденносш Однако механизмы, контролирующие баланс меди в мозгу новорожденных, не изучены К тому же плохо понято воздействие сдвигов метаболизма меди в целом организме на сбалансированную функцию генов, обеспечивающих гомеостаз меди в мозгу Поэтому исследование связи между обменом меди в организме и экспрессией генов белков, обеспечивающих гомеостаз этого микроэлемента в мозгу, является актуальным

Цель работы заключалась в изучении ш vivo обмена меди в отделах мозга крыс при различных состояниях метаболизма меди

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи 1 Осуществить мониторинг распределения меди в отделах мозга крыс в течение онтогенеза Сравнить уровень активности генов медьтранспортных белков и купроэнзимов в отделах мозга новорожденных и взрослых крыс

2 Изучить влияние искусственного дефицита связанной с церулоплазмином меди в крови взрослых крыс, индуцированного кормлением солями серебра, на метаболизм меди в мозгу.

3 Исследовать влияние серебра, получаемого с кормом крысой-самкой с первого дня лактации, на метаболизм меди в печени и мозгу вскармливаемого ею потомства в течение первых десяти дней жизни

4 Определить основные параметры обмена меди в отделах мозга крыс с экспериментально индуцированным фибриллогенезом (модель болезни Альцгеймера, БА)

5 Сопоставить уровень экспрессии генов медьтранспортных белков в культивируемых клетках линии НС 11 до и после их малигнизации, провести аналогичные исследования на Арс^и мышах (Мш мыши)

В работе исследовали кору, мозжечок, гиппокамп, миндалевидное тело, гипофиз, гипоталамус и сосудистое сплетение Эти структуры мозга отличаются друг от друга по удельному содержанию меди, уровню и профилю экспрессии генов медьтранспортных белков (Платонова и др, 2005) В качестве маркеров состояния метаболизма меди в работе использованы концентрация меди, относительная активность генов медьтранспортных белков, а также секреторных и внутриклеточных купроэнзимов

Научная новизна полученных результатов. Все полученные данные - новые Показано, что особенностью метаболизма меди в мозгу крыс в период дифференцировки нейронов является высокий уровень мРНК, кодирующей секреторный ЦП Напротив, у взрослых животных преимущественной молекулярной формой является мРНК, кодирующая церулоплазмин, связанный с клеточной мембраной через гликозилфосфатидилинозитоловый якорь (ГФИ-ЦП) Так как обе мРНК образуются из общего транскрипта в ходе альтернативного сплайсинга, очевидно, что этот процесс строго регулируется в течение развития мозга Также показано, что в различные периоды онтогенеза, при широких, колебаниях концентрации меди и ЦП в крови, в СМЖ она поддерживается на постоянно низком уровне У крыс в течение развития в мозгу повышается концентрация меди В работе показано, что это повышение связано с увеличением содержания в них купроэнзимов

Продемонстрировано, что дефицит церулоплазминовой меди, искусственно вызванный добавлением в пишу AgCl, подавляет в мозгу экспрессию генов медьтранспортных белков, но мало влияет на формирование холо-купроэнзимов и концентрацию меди в клетках Впервые продемонстрировано, что ионы серебра, поступающие в организм новорожденных с молоком, всасываются из ЖКТ, поступают в кровь и накапливаются в печени Показано, что на всех этапах переноса, распределения и выведения атомы серебра остаются в обмениваемой форме Высказано предположение, что ион серебра(1), изоэлектронный меди(1), использует внеклеточные и внутриклеточные транспортеры последней Поэтому модель А§-крыс может оказаться удобной для изучения транспорта ионов меди и механизмов включения их в активные центры купроэнзимов, за которыми можно следить по серебру Именно этот раздел биологии меди плохо изучен, так как медь не имеет долгоживущих радиоактивных изотопов

Важные результаты получены на модели крыс с индуцированным фибриллогенезом (модель БА) Показано, что у опытных крыс в отделах мозга снижается концентрация меди и нарушается шмеостаз цинка При этом падает активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов Таким образом, нарушение метаболизма меди, наблюдаемое при нейродегенеративных заболеваниях, может быть следствием фибриллогенеза. До сих пор нарушения обмена меди рассматриваются как причина фибриллогенеза Возможно, что оба процесса имеют место при различных формах этих заболеваний В работе впервые продемонстрировано, что развивающиеся опухоли, нуждающиеся в меди de novo, как для клеточного роста, так и для ее васкуляризации, возможно, транс-активируют метаболическую систему меди в печени

Научно-практическое значение полученных результатов. Данные, получешгые и разделе, посвященном исследованию онтогенетических особенностей метаболизма меди в мозгу новорожденных, дополнительно указывают на возможное негативное влияние избытка меди, получаемого новорожденными при вскармливании их молочными смесями Данные о влиянии пищевого серебра на метаболизм меди в мозгу взрослых и новорожденных млекопитающих могут учитываться при разработке применения серебра в качестве агента, препятствующего метаболизму меди, при лечении нейродегенеративных и раковых заболевании К тому же, данные о локальной аккумуляции серебра в гипоталамо-гипофизарной системе и изменении в ней статуса железа и меди однозначно указывают на необходимость дополнительных исследований для получения научно-обоснованных рекомендаций по употреблению воды, обеззараженной обработкой серебром, особенно во время беременности и кормления Положения, выносимые на защиту

1 В течение первого месяца жизни в клетках нервной ткани головного мозга крыс происходит увеличение активности генов, кодирующих купроэнзимы В результате концентрация меди в мозгу повышается В клетках сосудистого сплетения в этот период жизни происходят изменения статуса меди, сходные с таковыми в печени

2 В мозгу в течение онтогенеза изменяется соотношение изоформ ЦП-мРНК, формирующихся путем альтернативного сплайсинга. У новорожденных образуется преимущественно мРНК секреторного ЦП, у взрослых - мРНК ГФИ-ЦП

3 Отсутствие церулоплазминовой меди в крови взрослых крыс, вызванное потреблением с кормом ионов серебра, индуцирует в мозгу подаштение экспрессии генов медьтранспортных белков и гена ЦП Относительный уровень экспрессии генов внутриклеточных купроэнзимов не меняется, но доля митохондриальной СОД1 увеличивается Через гематоэнцефалический барьер ионы серебра переносятся в незначительном количестве, однако, они избирательно аккумулируются в гипофизе и вызывают изменения в обмене меди, железа и цинка в гипоталамо-гипофизарной системе

4 Серебро, добавляемое в корм лактирующей самки, поступает в организм новорожденных, накапливается в печени в тех же компартментах, в которых аккумулируется медь и вызывает снижение оксидазной активности ЦП В мозгу этих животных интенсивность образования секреторного ЦП снижена

5 Фибриллогенез, вызванный прямым введением нейротоксического пептида в желудочки мозга крыс, провоцирует снижение концентрации меди и подавление активности генов медьтранспортных белков во всех рассмотренных отделах мозга, кроме сосудистого сплетения

6 Развитие опухолей в кишечнике у Min мышей активирует в печени экспрессию генов медьтранспортных белков, участвующих в изменении уровня ЦП в крови В опухолях повышается уровень активности только гена CTR1, белковый продукт которого участвует в импорте меди

Апробация результатов работы. Результаты работы доложены на Пущипской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (2005, 2006 и 2007 гт), на 17-ой Европейской конференции студентов и молодых ученых (Берлин, Германия, 2006), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, май, 2008), на международной конференции Европейской программы «Геном человека» (Барселона, Испания, 2008), на 38-ой международной конференции по координационной химии (Иерусалим, Израиль, 2008), а также на ежегодных собраниях «Неделя науки» в СПбГПУ Устное сообщение 2006 г в Пущино отмечено жюри как лучшее

Личный вклад соискателя. Соискатель участвовала в получении экспериментальных данных, их обработке, обсуждении и описании всех разделов работы Антитела к CTR1 получены аспирантами Кгатченко С А и Затуловским ЕА, измерение концентрации металлов произведено на Физико-механическом факультете ГОУ СПбГПУ Крысы с экспериментальным фибриллогенезом в мозгу получены в Отделе нейрофармакологаи ГУ НИИЭМ РАМН Данные о связи между неопластической трансформацией и метаболизмом меди получены соискателем в группе Dr Giorgio Merlo, ассистентаDulbecco Telethon Institute CNR. ITB,Милан, Италия, и в группе проф М Мутанен на кафедре биохимии питания, факультета сельского и лесного хозяйства, Университет Хельсинки, Финляндия Структура диссертации. Диссертация содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы, включающий 260 иностранных и 13 отечественных источников Она изложена на 142 страницах Результаты представлены в 7 таблицах и иллюстрированы 34 рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Лабораторные живогные и клеточные линии

В работе использованы крысы линии Вистар и белые беспородные крысы, полученные из питомника «Рапиолово»

1 Онтогенетическая модечь В качестве модели эмбрионального типа метаболизма меди были использованы новорожденные крысы

2 Крысы с дефищтои оксидазного ЦП в крови Самцы линии Вистар с массой тела около 250 г получали в течение 4-х недель корм, содержащий 50 мг AgCl ral кг массы тела крыс в сутки Корм и воду животные получали без ограничения О развитии дефицита меди судили по исчезновению оксидазной активности в сыворотке крови

3 Крысы с индуцированным фибргтогенезои (модель деменгщи альцгеймеровского типа, МДАТ) Самкам крыс линии Вистар массой 180 - 200 г в латеральный мозговой желудочек вводили 5 мкл водной взвеси, содержащей 15 мкг агрегированного пептида, который соответствует по

последова гелыюсти нейрогоксичсскому пептиду (З-амилоида ('"YEVHHQKLVFFAEDV1', "Sigma", США), на глубину 3,8 мм через операционное отверстие, сделанное над правым боковым желудочком в координатах А = 0,8, L = - 1,5 по атласу мозга крыш (Fijkova and Marbala, 1967) Крыс контрольной группы подвергали такой же операции, но в полость желудочка вводили по 5 мкл стерильной бидистиляированиои йоды В опытах использовали животных через 21 день после операции О pasBirnm у них МДАТ судили по появлению на гистологических препаратах выраженных нейрональиых повреждений и замедлению скорости выработки условного пищевого рефлекса (Stepatiav and Sapronov, 2005)

4 Мыши линии Арёы были предоставлены проф M Муганен в рамках работы да стипендии □МО Часть работы выполнена на клетках линии НС11, первично полученпых из эпителия молочной железы мышей на среднем сроке беременности (Merlo et aJ, 1995) Mai ериалы, использованные в работе

Реактивы для проведения электрофореза в полиакриламидном и агарозном гелях, сахароза, детергенты, реагенты для ферментативных реакций, смесь ингибиторов протеаз приобретены у фирмы «Sigma» США неорганические соти у фиршш «Meick», Германия, кислоты, щелочи и хлороформ - у фирмы «Векгон», Россия Реагенты доя проведения хемилюминесцснтного иммуноблотинга приобретены у фирмы «Amersham», Великобритания Для выделения тотальной РНК использован реактив "TRlzol Reagent", "Invitrogen" (Великобритания) Ферменты, буферные смеси, растворы солей и праймеры дая обратной транскрипции приобретены у фирмы «Амплисенс» (Москва) Реактив для определения концентрации белка по Брэдфорду, твердый Си-хелапгругощии агент Chekx-lOO и белковые маркеры для электрофореза произведены фирмой ' BioRad" (США), ДНК-маркеры - фирмой «Сибэнзим» (Новосибирск)

Антитела. Моновалентные поликлональные кроличьи антитела к ЦП сыворотки крови крысы получены к высокоочищенному препарату ЦП крысы Для получения антител к СГЯ1 был использован 15-членный пептид, по последовательности соответствующий участку "TMQPSHHHPTTSASH1' Пептид синтезирован ООО «НПФ Верта», СПб, Россия Кролики породы шиншилла иммунизированы копыопггом пептида с гемоцианином из гемолимфы камчатского краба по общепринятой схеме Специфичность антител проверена методом конкуренции с пептидом и по их связыванию P15/BSA Антитела к ишцеральдепщ-З-фосфат дегидрогеназе (ГЗФД), (5-актину и к полноразмерной рекомбинантной СОД1 приобретены у фирмы "Abeam", США

Методы исследования

Извлечение отделов моха крыс Крыс подвергали анестезии фенобарбиталом, бОмг/кг массы тела, проводили интракардиальную перфузию 50 мл теплого PBS, содержащего 10 Ед/мл гепарина Мозг помещали на охлажденную чашку Петри и иссекали отделы в соогвегствии с атласом (Mitro, Palkovits, 1981) Материал хранили при температуре-70 "С Забор спинномозговой жидкости (СМЖ) производили под эфирным наркозом из затылочной цистерны, в которую вводили полиэтиленовый капилляр, соединенный с микрошприцом системы Гамильтон Кровь собирали из шейных или хвостовых сосудов После образования сгустка сыворотку отделяли центрифугированием Растворимые белый из содержимого желудков экстрагировали следующим образом 100 мг содержимого желудка гомогенизировали в 200 мкл PBS, содержащего коктейль ингибиторов протеаз, гомогенат инкубировали на льду 30 мин, центрифугировали lOOOOxg 5 мин Для исследования использовали нддосадочную жидкость

Субклеточные фракции выделяли методом дифференциального и равновесного цешрифугирования, как описано ранее (Васин и др, 2005) Тотальную РНК изолировали с использованием реактива "TRlzol Reagent" в полном соответствии с инструкцией производителя Полученные препараты РНК (Аадаш= 1,9) по данным электрофореза в 1 % агарозном геле не содержали примесей ДНК и продуктов деградации РНК.

Гель-электрофорез ПЦР-продукгов проводили в 1% агарозном геле, i-ели окрашивали бромистым этидием В качестве маркеров использовали ДНК-маркеры молекулярных весов длиной 250— 10000 п и фирмы «Сибэнзим», Новосибирск

Синтез кДНК проводили в реакции обратной транскрипции (ОТ) на тотальной РНК со случайными праймерами Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) на полученных кДНК использовали уникальные праймеры, подобранные по программе Gene Runner 3 0 Детали проведения анализа описаны ранее (Платонова и др, 2005)

Иммуноблотинг Электрофорез белков проводили в 10% или 8%-ном голиакриламидном геле (ПААГ) с или без додецилсульфата натрия (SDS) по методу Laemmli (1970) Перенос белков из ПААГ на шпроцеллюлозную мембрану осуществляли полусухим методом В качестве вторых ашител использовали антикроличьи (или антимьштиные) козьи гамма-иммуноглобулины, коньюгированные с пероксидазой хрена. Иммунные комплексы визуализировали хемилюминесцентным методом Количественный (ракетный) иммуноэлектрофорез. Концентрацию полипеггщдов ЦП определяли методом количественного иммуноэлекгрофореза, как подробно описано ранее (Платонова и др, 2005) Выявление ЦП окрашиванием геля орто-дианюидином, специфическим хромогенным агентом, проводили в соответствии с методом, предложенным Owen и Smith (1961) Определение активности СОД1 проводили в геле Активные зоны выявляли в соответствии с ранее описанным методом (Vives-Bauza et ai, 2007) Ихиерение концентрации металлов. Кусочки ткани взвешивали, гомогенизировали 1 4 в смеси 5% SDS и 5% NaOH, нагревали до потного растворения Во фракции градиента сахарозы добавляли по 100 мкл лизирующеи смеси и прогревали до полного растворения материала. Биологические жидкости использовали без подготовки Концентрацию металлов определяли методом агомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и зеемановской коррекцией неселективного поглощения на спектрометре фирмы «Perk.m-Elmer», Model 4100ZL, США Концентрацию белка определяли по методу Лоури или Брэдфорда. В качестве количественного стандарта использовали BSA Статистическую обработку данных проводили по программе ANOVA, значимыми различиями считали различия Р <0 05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения связи между обменом меди и экспрессией генов медьтранспортных белков в мозгу при различных состояниях метаболизма меди в организме был использован общий подход В тканях и биологических жидкостях определяли концентрацию меди и железа, транспорт которого связан с обменом меди В качестве контроля измеряли концентрацию цинка, метаболизм которого не сопряжен ни с обменом меди, ни с обменом железа Активность генов определяли методом полуколичественного ОТ-ПЦР анализа. В исследование были взяты гены медьтранспортных белков (CTR1, АТР7А и АТР7В), внеклеточные (ЦП и ГФИ-ЦП) и внутриклеточные купроэнзимы - СОД1 и СОХ ЦП рассматривается также и как универсальный донор меди для клеток негепатоцитарных рядов Д ля сравнения состояния антиоксидантной системы был определен также уровень экспрессии гена, кодирующего СОД2, марганец зависимую супероксидцисмутазу, локализованную только в матриксе митохондрий В ряде опытов измерена относительная концентрация зрелых транскриптов гена, кодирующего предшественник |3-амшюидного белка (АРР), который, возможно, осуществляет внеклеточное примембранное восстановление Cu(II) в Cu(I), необходимое для ее импорта в клетки О содержании белковых продуктов генов ЦП, CTR1 и СОД1 судили по данным полуколичественного иммуноблотинга. Данные о содержании белка СОД1 и ЦП сопоставлены с ферментативной активностью названных купроэнзимов

1. Онтогенетические изменения метаболизма меди в отделах мозга лабораторных крыс. Мониторинг постнатальных изменений метаболизма меди проведен в отделах мозга с относительно высоким (гипофиз и гипоталамус) и относительно низким (кора, мозжечок, миндалевидное тело, гиппокамп) уровнем обмена меди, а также в клетках эпендимы (сосудистое сплетение) Работа выполнена на 5-ти подгруппах крыс (в каждой не менее 5 животных), возраст которых соответствует различным типам метаболизма меди в печени Первую группу (новорожденные) составили животные с эмбриональным типом метаболизма меди (подгруппы 5- и 10-суточные крысы) Вторую группу (детский период) также составили две подгруппы 20- и 30-суточные животные В этом возрасте у крыс в печени уже произошла смена эмбрионального типа метаболизма меди, но ее концентрация в мозгу еще не достигла уровня, соответствующего взрослым животным Третью группу (взрослые) составили молодые половозрелые крысы (~120-суточные крысы)

11 Изменение концентрации меди в отделах мозга крыс в течение развития Результаты измерения концентрации меди в отделах мозга с 5-дневного возраста до 4-месячного суммированы в таблице 1 Они показывают, что в коре и гаппокампе происходит увеличение концентрации меди В миндалевидном теле она практически одинаковая на 5-е и 120-е сутки, но заметно увеличивается в течение первых 20 дней жизни, а затем снижается В мозжечке концентрация меди достоверно возрастает примерно в два раза.

Таблица 1 Изменение концентрации меди в отделах мозга крыс в течение развития

Отдел мозга Концентрация меди (ш /мг белка) в дни после рождения

5-ый 10-ый 20-ым 30-ый 120-ый

Первая группа Вторая группа Взрослые

Кора 216±613 25 9±151 327+859 245+1.56 24 9±3 01

Мозжечок Ш±114 25.5+0.51 23 7±117 25 3±102 323+356

Гиппокамп 243±07 210+049 35 2±352 281+252 328+321

Миндалина 105±12 32 0±81 30 7±7 27 18 9+1.56 118+051

Гипофиз 47 2+328 314±242 481±7 87 35 3+167 435+352

Гипоталамус 919±8 48 963+179 1034+779 420+205 556+081

*Сосудистое сплетение 42 4±7 69 1344+415 100 6±7.89 423+236 25+026

Приведены средние значения по измерениям у 5-ти крыс в каэвдой группе * Измерения проведены в группе из 8 крыс

Наименьшим изменениям подвергается содержание меди в гипофизе, однако, оно достоверно выше, чем в коре, гиппокампе, мозжечке и миндалевидном теле У новорожденных крыс самая высокая концентрация меди определяется в

гипоталамусе, но в нем она, в отличие от других отделов мозга, не повышается в течение развития, а, напротив, снижается почти в два раза

Самые заметные изменения в содержании меди в течение развития обнаружены в сосудистом сплетении Здесь концентрация меди при рождении почти в 20 раз выше, чем у взрослых, затем она повышается и начинает снижаться после 20-го дня жизни У взрослых удельное содержание меди в сосудистом сплетении самое низкое по сравнению с другими структурами мозга Эти изменения сходны с теми, которые имеют место в печени при эмбриональном типе метаболизма меди и его смене на взрослый тип Данные однозначно показывают, что в течение поетнатального развития в мозгу крыс происходят регион-специфические изменения содержания меди Они приводят к повышению концентрации меди в нервной ткани и ее снижению в клетках эпендимы

12 Внутриклеточное распределение меди в мозгу 10-дневных крыс Сравнительный анализ внутриклеточного распределения меди в моз(у и печени новорожденных и взрослых крыс был осуществлен следующим образом Постъядерные супернатанты гомогенатов, полученных из равных то весу кусочков печени и мозга 10- и 120-дневных крыс фракционировали в ступенчатом градиенте концентраций сахарозы Во фракциях градиента определяли содержание меди Количество меди, открываемой в органеллах, относили к ее общему содержанию Результаты показали, что у взрослых концентрация меди в мозгу выше, чем в печени (33 против 16 мкг/г сырой ткани) У новорожденных, напротив, концентрация меди в печени многократно, почти в 30 раз, превышает таковую в мозгу (700 против 23 мкг/г сырой ткани) Таким образом, в течение развития концентрация меди в печени падает (16 против 700 мкг/г сырой ткани), а в мозгу повышается (33 против 23 мкг/г сырой ткани) Эти результаты полностью совпадают с данными, известными по литературе Обобщенные данные по внутриклеточному распределению меди в печени и мозге в течение развития приведены в таблице 2 Они показывают, что в клетках печени новорожденных основная часть меди локализуется в цитозоле и во фракции внутриклеточных мембран, которую составляют микросомы, аппарат Гольджи и везикулы При переходе на взрослый тип метаболизма меди ее содержание в цитозоле снижается

Таблица 2 Распределение меди в клеточных кочпаргментах печени и мозга крыс в течение развития__

Клеточный Доля меди от ее общего содержания, %

комнартмент печень М()!Г

новорожденные взрослые новорожденные взрослые

Циюшшма 40 22 И 9

Внугриклетоп 1ые мембраны 38 37 50 46

Митохондрии 9 21 19 21

Лизосомы И 10 11 18

Пероксисомы 2 10 9 6

Основная часть меди выявляется во фракции внутриклеточных мембран Повышается и относительное содержание меди в митохондриях В клетках мозга 10-дневных и взрослых крыс медь распределяется одинаково и сходно с печенью

взрослых: основная часть меди присутствует во фракции внутриклеточных мембран и в митохондриях. Такой рисунок распределения хорошо объясняет известное участие этих клеточных компартмептов в метаболизме меди. Так, цитозоль и митохондрии являются местами локализации соответственно СОД1 и СОХ, основных клеточных купроэнзимов, а во фракции внутриклеточных мембран формируются такие купроэнзимы, как ЦП, ГФИ-ЦП, пептидилглицин а~ гидроксилирующая монооксигеназа, тирозиназа и допамин-Р-монооксигеназа. В лизосомах клеток мозга взрослых крыс по сравнению с 10-дневными крысами содержание меди выше. Возможно, это связано с накоплением в них нейромеланина. Таким образом, механизмов депонирования меди, подобных механизмам, существующим в печени новорожденных, в мозгу новорожденных кет, а наблюдаемое в онтогенезе повышение содержания меди в отделах мозга, за исключением сосудистого сплетения, вероятно, связано с активацией синтеза купроэнзимов в онтогенезе.

1.3. Экспрессия генов медыпранспортных белков в отделах мозга 10-дневных крыс. В работе определена квазистационарная концентрация мРНК, кодирующих ЦП, ГФИ-ЦП, СП11, АТР7А, АТР7В, АРР, СОД1, СОД2 и Сох4П (субъединица 4 изоформа 1 СОХ). Измерение проведено в отделах мозга крыс на 10-е и 120-е сутки жизни. В работе результаты представлены в виде гистограмм, рассчитанных по данным трехкратных измерений. В качестве внутреннего стандарта всегда использовали данные ОТ-ПЦР, полученные для (3-актина. Разница значений не составляла больше 10%. Для иллюстрации на рис. 1 приведены протоколы ОТ-ПЦР анализа экспрессии взятых в рассмотрение генов. Видно, что профиль экспрессии генов - органоспецифичен, а длины продуктов амплификации соответствуют предсказанным.

В D

Рис. 1. Примеры протоколов ОТ-ПЦР анализа А - электрофорез амплификатов, полученных на РНК, выделенных из мозга 10-дневных крыс: 1 - р-актин, 2 - ЦП, 3 - ГФИ-ЦП, 4 - CTR1, 5 -CTR2, 6 - маркеры. В - то же: 1 - АРР, 2 - СОД1, 3 - СОД2, 4 - Cox4il, 5 - маркеры. С - РНК изолирована из мозга 19-дневных эмбрионов: 1 - АТР7А. 2 - АТР7В, 3 - АРР, 4 - СОД1, 5 - СОД2, 6 - Cox4i 1,7- маркеры. D - РНК изолирована из печени взрослых крыс: 1 - ¡З-акган, 2 - мтЦП, 3 -АТР7А, 4 - АТР7В, 5 - CTR1,6-ЦП, 6- ГФИ-ЦП, 7 - АРР, 8 - маркеры. Дорожки считать слева направо.

Результаты измерений показали, что ген CTR1 экспрессируется во всех отделах взрослых и 10-суточных крыс У новорожденных относительное содержание CTR1-мРНК только в коре и мозжечке выше, чем у взрослых крыс В гипофизе активность этого гена у новорожденных и взрослых крыс не отличается В гиппокампе, миндалевидном теле и особенно в гипоталамусе и в сосудистом сплетении относительный уровень CTRl-мРНК у взрослых крыс выше Ген АРР также экспрессируется во всех отделах мозга крыс обеих групп Относительная концентрация АРР-мРНК выше у взрослых крыс Самым низким уровнем экспрессии гена АРР характеризуется кора. Во всех исследованных отделах мозга новорожденных крыс экспрессируются гены обеих Cu(I)-АТРаз, однако, активность гена АТР7В шоке активности гена АТР7А, а уровень экспрессии обоих генов у новорожденных ниже, чем у взрослых У новорожденных ген АТР7 А с наибольшей активностью экспрессируется в гипоталамусе, гиппокампе и в сосудистом сплетении, а активность гена АТР7В выше в гиппокампе и в сосудистом сплетении В целом, результаты позволяют считать, что в мозгу в постнатальный период развития активность генов медьтранспортных белков растет, а профиль Си-АТФаз изменяется

14 Изменения экспрессии гена церулоплазмииа в мозгу развивающихся крыс Существенные отличия обнаружены в экспрессии гена ЦП О ней судили по относительному содержанию изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга мРНК, кодирующей секреторный ЦП, и мРНК, программирующей синтез ГФИ-ЦП Полный протокол одного из этих опытов приведен на рисунке 2 (вкладка) Видно, что во всех исследуемых отделах мозга взрослых крыс преимущественной изоформой продукта транскрипции гена ЦП является мРНК, кодирующая ГФИ-ЦП, а у новорожденных — мРНК секреторного ЦП Исходя из того, что ЦП-мРНК и ГФИ-ЦП мРНК являются продуктами одного и того же гена, который активен только в клетках глии (Платонова и др, 2005), мы определили прямое соотношение этих мРНК Оказалось, что у новорожденных крыс в мозжечке, гиппокампе, миндалевидном теле и гипоталамусе обе изоформы образуются примерно в одинаковых количествах (соотношение ЦП-мРНК/ГФИ-ЦП мРНК колеблется около 1) В гипофизе и, особенно, в коре у 10-дневных крыс образование ЦП-мРНК существенно превышает образование ГФИ-ЦП мРНК У взрослых крыс во всех отделах, исключая гиппокамп, отношение ЦП-мРНК/ГФИ-ЦП мРНК ниже 1, что указывает на преимущественное образование в них ГФИ-ЦП мРНК Только в сосудистом сплетении и новорожденных, и взрослых крыс ГФИ-ЦП мРНК и ЦП-мРНК образуются примерно в равных соотношениях Полученные данные однозначно показывают, что уровень образования секреторного ЦП в нервных клетках у новорожденных крыс выше, чем у взрослых Напротив, формирование ГФИ-ЦП происходит значительно интенсивнее у взрослых Повышение концентрации меди в коре, гиппокампе и мозжечке в течение развития может быть прямо связано с увеличением уровня ГФИ-ЦП Об этом можно с уверенностью судить, так как в ходе перфузии ЦП удаляется, в то время как ГФИ-ЦП остается связанным с клеточной поверхностью В пользу этого предположения свидетельствует и тот факт, что в мозгу взрослых крыс, по данным

иммуногистохимического окрашивания, ГФИ-ЦП присутствует во всех клетках, выстилающих желудочки и в клетках глии {Платонова и др, 2005, Повалихин, 2007) В то же время мы не наблюдали окрашивания срезов мозга новорожденных антителами к ЦП при использовании той же техники (данные не приводятся)

15 Содержание меди и ЦП в СМЖ крыс в течение развития. В сыворотке крови и в образцах СМЖ, взятых у 8- и 14-суточных крыс, а также у взрослых половозрелых и лактирующих крыс, была измерена концентрация меди и ЦП методами атомно-абсорбционной спектрометрии и количественного иммуноэлектрофореза, соответственно Измерения показали, что концентрация ЦП у этих животных составляет 59, 81, 358 и 512 мг/л, а концентрация меди - 200,240, 700 и 1040 мкг/л, соответственно Во всех образцах крови на 1 молекулу ЦП приходится примерно 5-6 атомов меди Наблюдаемое низкое содержание ЦП и меди в крови новорожденных и его повышение в течение развития полностью соответствует данным литературы У всех исследованных животных концентрация меди в СМЖ оказалась одинаковой и равной примерно 15 мкг/л При этом содержание ЦП в СМЖ не зависит от его концентрационных колебаний в сыворотке крови и составляет около 3 мг/л, что почти в 100 раз меньше, чем в сыворотке взрослых крыс Иммунопреципитация ЦП из ликвора приводит к перемещению 97% меди в осадок Это означает, что практически все атомы меди, циркулирующие в СМЖ, ассоциированы с ЦП, молекула которого содержит около 10 атомов меди Обработка образцов ликвора смолой Chelex-100 удаляет примерно 35% ионов меди Следовательно, из 10 атомов меди, связанных с 1 молекулой ЦП, 3 - 4 атома связаны слабо

1 6 Изменения активности генов, кодирующих внутриклеточные купроэнзимы В тотальной фракции мРНК, изолированной из отделов мозга 10- и 120-дневных крыс, была определена относительная концентрация зрелых транскриптов генов, кодирующих СОД1, СОД2 и Cox4il Фермент СОД1 является основным цитозольным купроэнзимом, концентрация которого строго зависит от обмена меди (Suazo et al, 2008) Для него в качестве партнера по системе антиоксидантной защиты была использована СОД2 Для оценки экспрессии мультисубъединичного комплекса СОХ была выбрана изоформа 1 субъединицы 4 (Cox4il) Выбор определили следующие соображения Экспрессия гена Cox4il строго коррелирует со сборкой и функционированием зрелой СОХ, поэтому по уровню активности этого гена можно судить об активности СОХ в целом К тому же Cox4il экспрессируется в клетках мозга и печени (.Richter, Ludwig, 2003) Помимо этого, ядерный ген, кодирующий ее, в отличие от митохондриальных генов, содержит интроны, что позволяет адекватно использовать ОТ-ПЦР анализ Найдено, что гены СОД1, СОД2 и Cox4il экспрессируются во всех отделах мозга, но у новорожденных относительный уровень их активности ниже, чем у взрослых крыс

17 Распределение СОД1 в цитозолс и в межмембранном пространстве митохондрий мозга новорожденных и взрослых крыс В следующей серии опытов было определено сравнительное содержание белка СОД1 в печени и мозге новорожденных крыс, распределение его между цитозолем и межмембранным пространством митохондрий (МПМ) Опыты этой серии проводили на целом мозге

Для этого мозг измельчали ножницами, из кашицы отбирали весовые аликвоты, из которых получали субклеточные фракции. Образцы для электрофореза строго выравнивали по белку. Относительное содержание СОД1 определяли методом иммуноблотинга. Результаты представлены на рисунке 3. Они показывают, что содержание белка СОД1 в печени и взрослых, и новорожденных крыс в несколько раз выше, чем в мозгу. У новорожденных и в мозгу, и в печени содержание СОД1 ниже, чем у взрослых. Эти данные полностью согласуются с данными ОТ-П1ДР анализа. Обращает на себя внимание внутриклеточное распределение белка СОД 1 у новорожденных: в МГ1М и печени, и мозга СОД1 едва обнаруживается (рис. 3). Данные, приведенные на рисунке 4 (вкладка), показывают, что ферментативная активность цитозольной СОД1 из клеток мозга и печени, по положению в геле соответствует зоне, выявляемой антителами к СОД1. Это означает, что в мозгу соотношение апо-СОД1 и холо-СОД1 у взрослых и новорожденных не отличается.

1 2 3 4 А Зё®* —' - т»вен»

в

Рис. 3. Выявление СОД] в субклеточных фракциях печени (сюлбцы 1 и 3) и мозга (столбцы 2 и 4) взрослых (столбцы 3 и 4) и новорожденных (столбцы 1 и 2) крыс методом иммуноблотинга. А -цитозодь, В - межмембранное пространство митохондрий. С - иммуноблотинг белков цитозоля с антителами к |3-актину.

2. Влияние дефицита оксидазного ЦП в крови на метаболизм меди в мозгу взрослых и новорожденных крыс. Для изучения влияния дефицита меди на экспрессию генов медьтранспортных белков и купроэнзимов в мозгу взрослых крыс был применен известный экспериментальный прием — добавление в корм солей серебра, снижающих содержание оксидазного ЦП и меди в сыворотке крови крыс (РгуЬИ еХ а1, 1981). Мы показали, что у крыс (А§-крысы), вскармливаемых в течение четырех недель ионами серебра (50 мг А§С1/кг массы тела), в крови циркулирует апо-ЦП, серебро накапливается в печени, метаболизм меди в печени не изменяется (Кпотченко и др., 2008). У А§-крыс, как показало измерение в целом мозге, концентрация серебра незначительно превышает фон. Чтобы установить, распределяется ли серебро в мозгу равномерно или аккумулируется локально, концентрация серебра была определена в отделах мозга А§-крыс. Параллельно в этих же образцах определяли концентрацию меди и железа, так как конкурентное поступление серебра может снижать уровень меди и образование медьсодержащих ферроксидаз (ЦП и ГФИ-ЦП), дефицит которых приводит к нарушению баланса железа в клетках. Также измеряли и концентрацию цинка, которая может служить в качестве контроля специфичности действия серебра. Результаты показали, что за время эксперимента ни в одном из отделов мозга, за исключением гипофиза (.Р<0.05), серебро не аккумулируется. Отклонения в концентрации меди и железа

А

5" Общий участок ГФИ-якорь .V

436 Ьр 398 Ьр

Рис. 2. Транскрипционная активность гена церулоплазмина в отделах мозга взрослых и новорожденных крыс. А - схема соответствия праймеров на кДНК ЦП, с помощью которых выявляли мРПК ГФИ-ЦП (вверху) и мРНК растворимого ЦП (внизу). Б - электрофорез продуктов ОТ-ПЦР, полученных на препаратах тотальной РНК, выделенной из различных отделов мозга взрослых (а) и новорожденных (б) крыс. В -электрофореграмма типичных препаратов РНК, использованных в работе. 1 - кора, 2 -мозжечок, 3 — гиппокамп, 4 - миндалевидное тело, 5 - гипофиз, 6 - гипоталамус, 7 -сосудистое сплетение. Ьр - пар оснований.

Рис. 4. Активность СОД1 в цитозоле мозга новорожденных (1) и взрослых (2) крыс.

А - окрашивание паи иа присутствие СОД1 иослс нагазного электрофореза, Е -вммуноблотянг тех же образцов с антителами к СОД1. 3 - шгеозоль печени взрослых крыс.

I 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6

Рис. 5. Содержание СОД1 в цитозоле отделов мозга контрольных (1 - 3) и Ag-кpыc (4 - 6)

но данным шшуиобиоашъ (А). 1 и 4 — кора, 2 а 5 - мозжечок, 3 а б - потоками. Нижний ряд - иммуноблотинг этих же образцов цитозоля с антителами к ГДЗФД. В -

активность СОД!, выявляемая в этих же образца;;. Вверху: активность СОД1, выявляемая в геле, внизу: иммуноблотинг этих же образцов с антителами к СОД1 после нативиого электрофореза б ПААГ. Обозначения, как на блоке А.

Рис. 6. Обнаружение СОД1 в межмембранном пространстве митохондрий методом

иммуноблотиша иослс электрофореза в ПААГ -а денатурирующих (А) и нашвных. (С) условиях, а также но ферментативной активности (В). 1 и 3 - кора, 2 и 4 - мозжечок. 1 и 2 - контрольные крысы, 3 и 4 — Ац-гфыеы

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 7. Влияние пищевого ссрсбра на окилдаАиую активность ЦП. А - i ÍAAi после электрофореза в нативных условиях окрашен ортжьдианизидином; 1 — сьшоротка крови контрольной самки; 2 - то же, Ag-самка. 3 и 4 - смеси равных объемов сывороток от трех ! 0-дневных крыс; 5 и б-то же, Ag(10)-Kpbicbi. На дорожку нанесено по 1 мкл сыворотки. 7 - смесь содержимого желудков трех Ag(l 0)-крыс (20 мют), 8 - то же, контроль. В -иммуноблотЕШГ с антителами к ЦП крысы. ! - сыворотка крови контрольной самки; 2 - го же, Ag-самка. 3 и 4 - смеси равных объемов сывороток от трех Ag(iO)-flHeBHbix крыс; 5 и 6- та же, ¡ О-днсеные крысы. На дорожку какесенс по 0.1 мкл сыворотки. 7 - смесь содержимого желудков трех Ag( 10)-крыс (5 мкл), 8 - то же, контроль

Рис.9. Относительное содержание CTRI-мРНК в плазматических мембранах печени (1,2.

5 6) н мочга (3,4. 7 я 8) контрольных (нечетные) » опытных крыс (четные). 1 - 4: новорожденные, 5-8: взрослые. Стрелкой показано положение в геле BSA.

1 2 3 4 5 6 7 8

mm ** * " * ^ Ш ^вяйй^ээзйэйэ®'

В "" ;

Рис. 10. Содержание (А) и активности (В) СОД1 в цитоплазме, выделенной из печени (1.2,

5 и 6) н мспга (3, 4. 7 и 8). контрольных (нечетные) и опытны?: крыс (четные). 1 - 4: новорожденные, 5 - 8; взрослые.

1 2 3 4 5 6

A «es» "япт **

1 2 3 4 5 6

Рис. 11. Выявление полипептидов СОД1 в цитозоле (слева) и в МПМ (справа). Слева: А -иммуноблотинг цитозоля, выделенного из коры, мозжечка и гиппокампа контрольных крыс (1-3) и с индуцированным фибриллогенезом (4-6). Вверху - антитела к СОД1, внизу - антитела к ГДЗФД. В: то же. вверху - гель окрашен на активность СОД1, внизу -иммуноблотинг с антителами к СОД1 после электрофореза в 10% ПААГ в неденатурирующих условиях. Справа: иммуноблотинг МПМ, выделенного из коры (1 и 3) и мозжечка (2 и 4) контрольных крыс (1 и 2) и крыс с МДАТ (3 и 4). Вверху: иммуноблотинг с антителами к СОД1 после электрофореза в ЗОЭ-ПААГ, в центре: активность СОД1, выявляемая в геле, внизу; иммуноблотинг с антителами к СОД1 после электрофореза в 10% ПААГ в неденатурирующих условиях.

3 4

1.8 1,6

1.4

1.2 | G контроль |

0,8 |вМ'т-мыши:

0,6

0,4

0,2

0 jlll

В

0,9 . 0,8 -j

0,6 0,5 О А 0,3 0,2 0,1

| □ wild-type в min-mice |

Г<№]-ЦП C7R1 АТР7А АТР7В

С

Рис. 12. Влияние опухолевого роста у Min мышей на метаболизм меди в печени. Л: содержание оксидазного ЦП в крови 70-дневных мышей; 1 - 5: Min мыши. 6-8: C57BL/6J мыши; 9 - образец крови крысы. Образцы по ! мкл сыворотки крови подвергнуты электрофорезу в 7.5% ПААГ, который затем окрашен орто-ттизидтюм.. В: результаты

обработаны с помощью программы "Scion Image". ( : экспрессия генов мсдьтршснортаых белков.

найдены только в гипогаламо-гииофизарной системе Так, концентрация меди достоверно снижается в гипоталамусе (в два раза), а в гипофизе содержание железа увеличивается в пять раз Концентрация цинка в гипофизе повышается в два раза

По данным ОТ-ПЦР анализа экспрессия генов медьтранспортных белков (CTR1, АТР7А и АТР7В), а также гена ЦП в о i делах мозга Ag-крыс почти полностью подавляется, гена АРР - существенно снижается При этом во всех отделах, включая 1инофиз и гипоталамус, steady state уровень мРНК, кодирующих СОД1, СОД2 и Cox4il, не меняется

У Ag-крыс содержание иммунореакгивных полипептидов СОД1 в цитозоле, полученном из клеток коры, мозжечка и гиппокампа, определенное методом иммуноблотинга, не меняется, как и активность этого фермента (рис 5, вкладка) Эти результаты хорошо согласую гея с данными ОТ-ПЦР ат га теза

В отличие от контрольных животных, у Ag-крыс в МПМ обнаруживается белок СОД1, демонстрирующий ферментативную активность (рис 6, вкладка)

Таким образом, дефицит церулоплазминовой меди в крови, к тому же практически полный в течение последней из четырех недель эксперимента, не влияет на содержание меди, жечеза и цинка в коре, мозжечке, гиппокампе и в миндалевидном теле взрослых крыс При зтом не меняется и уровень экспрессии генов внутриклеточных купроэнзимов Однако распределение СОД1 у Ag-крыс отличается от такового у контрольных крыс в то время как у контрольных крыс митохондриальная СОД1 едва определяется, у Ag-крыс она почти равномерно распределяется между цитозолем и митохондриями Возможно, что у Ag-животных ИСТОЧ1ШКОМ атомов меди для СОД1 становятся митохондрии, выполняющие роль депо меди у млекопитающих (Cobine et al 2006)

Обращают на себя внимание изменения концентрации меди, железа и цинка в гипоталамо-гипофизарной системе Они показывают, что снижение уровня образования ЦП в гипоталамусе, возможно, влияет на освобождение железа из клеток гипофиза Интересно, что именно в гипоталамусе взрослых крыс не только самая высокая концентрация меди (табл 1), но и самый высокий уровень экспрессии секреторного ЦП (рис 2, вкладка) и АТР7В В то же время в гипофизе уровень образования ГФИ-ЦП превышает таковой в других отделах мозга Локальное резкое повышение концентрации железа в гипофизе, позволяет считать, что ЦП, синтезирующийся в этой системе, играет важную роль в экспорте железа Понимание наблюдаемого эффекта требует дополнительных исследований

Полученные данные показывают, что полный дефицит церулоплазминовой меди приводит к потере активности генов медьтранспортных белков, при этом ни концентрация меди, ни активность внутриклеточных купроэнзимов не меняются Результаты позволяют предположить, что в клетках мозга существует система, сохраняющая ионы меди в условиях их общего дефицита и активность генов медьтранспортных белков регулируется поступлением меди в мозг 3 Влияние AgCl на метаболит меди в печени и мозгу крыс при эмбриональном типе метаболизма меди. Исследование проведено на печени и мозге 10-дневных крыс (обозначены - Ag(lO)-Kpbicbi), вскармливаемых самкой, в корм которой с первого дня после родов добавляли AgCl За эти 10 суток у взрослых Ag-крыс уровень оксидазного ЦП в крови снижается примерно в два раза.

В проведенном эксперименте центральными вопросами были

1) поступает ли серебро в клетки молочной железы лакгарующей крысы"?

2) поступает ли серебро в молоко?

3) если да, то, как оно распределяется в организме Ag(10)-кpыc9

4) изменяется ли метаболизм меди в печени и мозгу Ag(10)-кpыc';'

В качестве контроля использовали 10-дневных крыс, родившихся одновременно с крысами экспериментальной группы Масса тела Ag(10)-кpыc достигает 16 8±1 9 г (п=8) К этому же времени у контрольных животных она составляет 210±2 5 г (п=8) Разница в 25% оказалась незначимой Животные обеих групп не отличались по показателям физического развития (появление шерстного покрова, вставание, вращение хвостом, отлипание ушной раковины) В печени и мозгу этих крыс были определены концентрация и внутриклеточная локализация ионов серебра и меди, измерены относительное содержание зрелых транскриптов генов медьтранспортных белков и купроэнзимов, а также их белковых продуктов Исследование проводили на целом мозге Все измерения у 10-дневных крыс повторены дважды Каждый образец ткани, крови и мочи состоял из аликвот, взятых от трех животных Таким образом, данные для новорожденных являются средними значениями для шести животных В опыте участвовали только две взрослые крысы, взятые на 10-й день лактации контрольная и получавшая с кормом AgCl с первого дня после родов

Результаты, представленные на рисунке 7 (вкладка), показывают, что у вскармливающей самки, получавшей серебро в течение 10 дней, уровень оксидазного ЦП в крови снижается, а в кровотоке циркулирует неоксидазная форма ЦП У Ag-кpыc в крови появляется неоксидазная форма ЦП с большей подвижностью, чем холо-ЦП Заметно снижается оксидазная активность и в сыворотке крови Ag(10)-кpыc При этом уровень иммунореактивнош ЦП не меняется В экстрактах содержимого желудков у Ag(10)-кpыc, в отличие от контрольных 10-дневных крыс, оксидазный ЦП не обнаруживается В то же время в них присутствует белок ЦП В экстрактах содержимого желудков серебро выявляется в количестве почти в 40 раз превышающее фоновое Это означает, что серебро поступает в молочную железу и, не влияя на уровень экспрессии гена ЦП, блокирует встраивание атомов меди в активные центры ЦП молока Обращает на себя внимание тот факт, что в экстрактах содержимого желудков концентрация меди не снижается Таким образом, серебро с молоком поступает в ЖКТ новорожденных О том, всасывается ли оно из ЖКТ, судили по данным измерения его распределения в организме Результаты показали, что у Ag(10)-кpыc концентрация серебра в крови заметно выше фона, концентрация меди при этом не снижается Ag(10)-кpыcы аккумулируют серебро в печени примерно в 10 раз интенсивнее, чем в мозгу Однако накопление меди в печени, характерное для эмбрионального типа метаболизма меди, у Ag(10)-кpыc не нарушается у них, как и у контрольных 10-дневных крыс, концентрация меди в печени многократно превышает таковую у взрослых крыс Это указывает на то, что при эмбриональном типе метаболизма меди в клетках печени существует особый путь для ее накопления Ионы серебра не конкурируют с медью за транспорт по этому пути В мозгу содержание меди у Ag(10)-кpыc не меняется

Профили распределения меди и серебра в клегках печени А§(10)-крыс полностью совпадают (рис. 8). Оба элемента определяются в цитозоле, мембранах эндоплазматического ретикулума и в митохондриях. Данные ОТ-ПЦР анализа показали, что в печени А§(10)-крыс активность генов медьтранспоргных белков и купроэнзимов не меняется. В мозгу под действием пищевого серебра резко снижается относительная концентрация ЦП-мРНК. Уровень экспрессии других генов, взятых в рассмотрение, меняется мало. Это подтверждается и данными иммуноблотинга для СГО1 и СОД1 (рис. 9 и 10, вкладка).

Рис. 8. Распределение ионов серебра и меди в клеточных компратментах печени Ag(lü)-Kpbic. Посгьядерпый супернатант гомогената печени анализировали методом изопикнического центрифугирования в ступенчатом градиенте концентраций сахарозы (см. Методы). По оси абсцисс - номер фракции градиента; по оси ординат - концентрация Ag и Си, мкг/л.

Результаты этой части работы однозначно показывают, что атомы серебра абсорбируются в ЖКТ млекопитающих и переносятся по внеклеточным пространствам и внутри клетки по тому же пути, что и атомы меди. К тому же на всех этапах переноса во всех комлартментах организма атомы серебра «упакованы» в молекулы таким образом, что они остаются в обменной форме. Способность ионов серебра создавать дефицит меди в крови без существенных изменений синтеза купроэнзимов может быть использована как средство снижения уровня меди при нейродегенеративных заболеваниях и в качестве средства для подавления роста опухолей, которые нуждаются de novo в большем количестве меди, ассоциированной с ЦП, чем нормальные клетки (Cohen et al., 1979; Linder et al., 1979; Campbell ei al, 1981). Для разработки таких подходов необходимы дополнительные разносторонние исследования. В рамках такой задачи оценка метаболизма меди была проведена в мозгу крыс с индуцированным фибриллогенезом и у Min мышей.

3.3. Изменение метаболизма меди в мозгу крыс с экспериментально индуцированным фибриллогенезом. В этой части работы представлены результаты изучения уровня экспрессии генов медыранспортных белков у крыс с экспериментально вызванным фибриллогенезом, МДАТ, путем прямого введения в

2500

о

0 5 10 15 20 25 30

мозг нейротоксического пептида ß-амилоида (см раздел «Методы») В отделах мозга крыс с МДАТ была измерена концентрация меди, железа и цинка Результаты показали, что концентрация меди в коре, мозжечке и гиппокампе достоверно снижается Резкое снижение концентрации меди происходит в гипофизе и в гипоталамусе При этом концентрация железа в отделах мозга практически не меняется В то же время в сосудистом сплетении многократно увеличивается удельное содержание и меди, и железа Во всех отделах мозга, исключая миндалевидное тело и сосудистое сплетение, наблюдается значимое снижение концентрации цинка. Изменения концентрации ¿-элементов в мозгу крыс с МДАТ совпадают с изменениями их концентрации в отделах мозга пациентов с паталогоанатомически подтвержденным диагнозом Б А (Andraisi et al, 2000)

Экспрессия генов медьтранспортных белков у крыс с МДАТ претерпевает драматические изменения Так, ни в одном из исследуемых отделов мозга не удалось обнаружить мРНК, кодирующие ЦП, ГФИ-ЦП, АТР7А и АТР7В На низком уровне сохраняется активность генов CTR1 и АРР Анализ экспрессии этих генов был проведен и в печени этих животных Результаты показали, что введение нейротоксического пептида в мозг не влияет ни на профиль, ни на уровень экспрессии генов медьтранспортных белков в печени (Федотова u др, 2006)

За период проведения эксперимента (21 день) содержание СОД2-мРНК практически не меняется, количество зрелых транскриптов гена СОД1 снижается только в шппокампе Уровень Cox4il снижается равномерно по отделам Однако снижение мРНК купроэнзимов, в отличие от мРНК медьтранспортных белков, при индуцированном фибриллогенезе существенно менее значительное

В коре, мозжечке и шппокампе было измерено относительное содержание белка СОД1 и ее ферментативная активность (рис 11, вкладка) Представленные результаты демонстрируют, что в отделах мозга полипептиды СОД1 синтезируются, однако, уровень активности цитозольной СОД1 во всех исследованных отделах мозга снижен В МПМ, вьщеленном го митохондрий коры и мозжечка, активность СОД 1 выявлена (рис 11, вкладка)

Так как для болезни Альцгеймера характерным является снижение уровня ЦП и меди в мозгу (Klevay, 2008), можно предположить, что МДАТ является подходящей моделью для изучения определенных аспектов БА у человека 3.4. Изменение метаболизма меди в опухолях Для того чтобы оценить связь между обменом меди и опухолевым ростом, метаболизм меди был изучен у Мм мышей Мыши этой линии получены методом химического мутагенеза из линии C57BL/6J Изменения вызваны мутацией в гене А PC (adenomatosis ppliposis coli), кодирующем онкосупрессор, входящий в состав комплекса, формирование которого регулируется через Wnt-сигнальный путь Гомозиготы Аре1' не жизнеспособны У 100% гетерозигот (мыши Ареf101, Min мыши), выращенных на рационе, богатом жирами, на всем протяжении кишечного тракта развивается до 30 и более аденом Процесс начинается с 60-дневного возраста с роста аденом, на поздних сроках появляются аденокарциномы, но образование метастазов не отмечено Эти мыши живут примерно 120 дней Эксперименты проводили на образцах печени, стенки кишечника и аденомах, полученных от 70-дневных Min мышей. В качестве контроля использовали мышей линии C57BL/6J того же

возраста. В опыте участвовали 3 контрольные мыши и 6 Min мышей. I (П сыворотки крови выявляли в геле окрашиванием орто-дианизидином, проявившиеся зоны анализировали с помощью программы "Scion Image". Результаты показывают (рис. 12, А и В, вкладка), что у Min мышей содержание ЦП в крови увеличивается на 50% (Р<0.05). По данным ОТ-ПЦР анализа (рис. 12, С, вкладка) в печени Min мышей активность гена ЦП примерно в три раза выше, чем в печени контрольных мышей. Более того, относительная концентрация АТР7В-мРНК и СТШ-мРНК также достоверно выше. Помимо этого, в клетках печени Min мышей мы наблюдали экспрессию АТР7А и ГФИ-ЦП. Ген АТР7А в культивируемых гепатоцитах (линия HepG2) не экспрессируется, не образуется в них и ГФИ-форма ЦП-мРНК. При ОТ-ПЦР анализе РНК, полученной из ткани печени эти две мРНК, как правило, выявляются в небольших количествах. Это объясняют тем, что печень, помимо гепатоцитов, содержит клетки, экспрессирующие эти мРНК (например, купферовские клетки, клетки эндотелия). В нашем случае относительное количество мРНК ГФИ-ЦП и АТР7А, определяемое в печени Min мышей, нельзя отнести к загрязнению. В составе тотальной РНК, выделенной из клеток кишечного эндотелия и аденом, продуктов экспрессии генов ЦП и АТР7В не найдено. В некоторых препаратах выявлялись следы АТР7А. В то же время во всех этих тканях эффективно экспрессируются ген CTR1. При этом уровень экспрессии этого гена повышается в ряду дикий тип-»Мш мыши^аденомы (рис. 13). Представленные результаты позволяют считать, что Min мыши являются подходящей моделью для изучения механизмов, влияющих на активацию генов метаболизма меди в печени при росте опухолей различной локализации. Такие данные могут быть ценными для понимания транс-регуляции экспрессии гена ЦП и помогут понять феномен повышения содержания ЦП в крови млекопитающих

1,4 1,2 1

0.8

0,6

0,4

0,2

0

Ctrl

Рис. 13. Экспрессия гена CTR1 в клетках кишечника мышей. По оси абсцисс, относительные единицы.

при развитии опухолей и научно обоснованно использовать этот показатель в качестве биомаркера для оценки роста опухоли.

, о wild-type ID min-mice ■ аденомы

выводы

1 В мозгу крыс в течение развития происходят регион-специфические изменения распределения меди Параллельно происходит смена профилей экспрессируюшихся генов медьтранспортных белков у новорожденных из двух медьтранспортных АТФаз преимущественно экспрессируется АТФаза Менкеса, у взрослых в мозгу активируется ген, кодирующий АТФазу Вильсона Из двух сплайс-форм мРНК церулоплазмина у новорожденных преимущественно формируется мРНК, кодирующая секреторную форму ЦП, у взрослых - мРНК, кодирующая мембранную изоформу (ГФИ-ЦП) Это позволяет определить метаболизм меди в мозгу новорожденных как эмбриональный тип, смена которого на взрослый происходит в разных отделах мозга не одновременно

2 У Ag-кpыc наблюдается накопление серебра и изменение концентрации меди, железа и цинка только в гипоталамо-гипофизарной системе. На фоне дефицита церулоплазминовой меди в крови активность генов медьтранспортных белков в клетках мозга снижается, уровень экспрессии внутриклеточных купроэнзимов не меняется

3 У новорожденных крыс ионы серебра поступают в организм с молоком и аккумулируются в печени в тех же компартментах, где накапливается медь У животных снижается оксидазная активность ЦП крови, но не меняется уровень экспрессии гена этого белка в печени В мозгу относительная концентрация мРНК, кодирующей секреторный ЦП, падает

4 Фибриллогенез, индуцированный введением в мозг фрагмента нейротоксического пептида ^-амилоида, вызывает в клетках нервной ткани снижение концентрации меди и цинка При этом экспрессия генов медьтранспортных белков и купроэнзимов падает В печени экспрессия генов медьтранспортных белков и купроэнзимов у этих животных не меняется

5 Изменения метаболизма меди в сосудистом сплетении в течение развития отличаются от изменений в других рассмотренных отделах мозга и сходны с таковыми в печени при смене эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый У МДАТ-крыс в сосудистом сплетении не происходит снижения концентрации меди и цинка Отличия метаболизма меди в клетках сосудистого сплетения то сравнению с клетками нервной ткани, вероятно, связаны с мезенхимальным происхождением этого отдела

6 При дефиците меди в сыворотке крови ^-крысы) и нарушении обмена меди (МДАТ-крысы) цитозольная апо-СОД перемещается в митохондрии и переходит там в холо-форму При этом, по-видимому, в качестве источника меди используется митохондриальный пул меди

7 Рост аденом у мышей линии АрсМт сопровождается повышением уровня и изменением профиля экспрессии генов медьтранспортных белков в печени Повышается уровень экспрессии гена СТШ в тканях кишечника и аденомах

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 КлотченкоС А, ЦымбаленкоН В, Соловьев К. В, Скворцов А Н, Затуловский Е А, Бабич П С, Плато! юваН А, ШавловскшМ М, ПучковаЛ В, БроджшиМ Влияние ионов

серебра на метаболизм меди и экспрессию генов мсдьтранспоршых белков в печени крыс // Доклады Академии Паук, 418 (4) 549—552,2008

2 PlatonovaN, Scolti М, Babich Р, Bertoh G, Mento G, Meneghiru V, EgeoA, Zucchi 1 Merlo GR. TBX3, the gene mutated in ulnar-mammaiy syndrome, promotes growth of mammary epithelial cells via repression ofpl9ARF, independently of p53//Cell Tissue Res 328(2) 301-316,2007

3 ФедотоваЮ О, БабичП С, ПлатоноваHА, ЮютченкоСА, Цымбаченко Н В, ПучковаЛ В, Сапронов НС Экспрессия мсдьтранспоршых генов в мозге крыс при экспериментальной дсмецции альцгеймеровского типа // Доклады Академии Наук, 409 (4) 555— 558,2006

4 Бабич ПС., Цымбаченко НВ, Пучкова JIB Онтогенетические изменения активности генов медьтранспортных белков и купроэнзимов в отделах мозга крыс Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов 11-15 мая 2008 г, Новосибирск С 736

5 Цьшбаченко НВ, Клотненко С А, Затуловский ЕА Сквориов А И, Бабич П Г, Ulasposcndi М М, Пучкова Л В Влияние ионов Ag на метаболизм Си и синтез купроэнзимов у крыс Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов 11-15 мая 2008 г, Новосибирск С 510

6 Babwh. Р~, Platonova N, Tsymbalenko N, Puchkova L. Brain-region specific copper metabolism in rats with copper deficiency induced by Ag-юпь European Journal of Human Genetics, 2008, V 16, sup 2, pp 139-140 (EHG, conference, Baiselona, Spain, 2008)

7 Zatuhvshy EA, Shnrtsov A N Tsymbalenko N V, Babich PS, Ilyeichyova E Yu., Shavlovsky MM, Broggim M, Puchkova L V The model to study effects of blood serum copper deficiency on ¿-element metabolism in liver and brain of rodents Abstract book of 38"1 International Conference on Coordination Chemistry, Jerusalem, Israel, July, 2008, P 310

8 Бабич П С Пучкова Л В, Мутанен М Метаболизм меди в печени и эпителии кишечника у Mm-мышей до и после развития аденом Сборник материалов 12-и Путинской школы-конференции молодых ученых «Биологая — наука XXI века», 2007 Пущипо

9 Бабич П. С, ФедотоваЮ О, Клотченко С А, ПлатоноваН А Изменение метаболизма меди при экспериментальной деменции альцгеймеровского типа. Сборник материалов 10-й Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века», Пущино, 17—21 05 2006, с 65-66

10 Ilahich Р Fedotoi'a 10 Copper transporting genes expression in bran regions of the rats with experimental dementia of Alzheimer's type 17th European Students Conference, Berlin, Germany, October 8-12,2006, book of abstracts, p 4

Работа поддержана грантами РФФИ№03-04-48748 и №06-04-49786, III Итальянской правительственной программой соьместных научных программ Италия-Россия № I0-RB18, стипендией CIMO (Central for International Mobility, Финляндия) NTM-07^t748IWC10, а также грантами правительства Санкт-Петербурга (2007 и 2008 гг)

Polina S Babich

Summary of the PhD-thesis "Copper metabolism in the rat brain at the different states" (carried out at the Department of Molecular Genetics, Research Institute of the experimental medicine, and at the chair of Biophysics ot St.-Petersburg State Polytechnic University, St.-Petersburg, and at the Department of Applied Chemistry and Macrobiology in University of Helsinki, Helsinki, Finland)

Background. Copper is necessary for mammals at all developmental period, since it is present in the active centers of vitally important enzymes Simultaneously, copper ions have toxic effect because they initiate oxidation of various biomolecules Copper deficiency during development has a long-term effect on central nervous system activity, while excess of copper can lead to

severe diseases The planning of the work is based on our data which were obtained previously It was shown that concentrations of copper and ceruloplasmin (Cp) rise up to 7 times in cerebrospinal fluid (CSF) in rats fed with baby formula Others in vitro shown that cultured neurons loss iron ions and their membranes undergo the depolarization if medium Cp concentration is higher than it is in CSF It is possible that abnormalities in brain copper balance in newborns can be result in long term effects on central nervous system function However there are not clear data on copper metabolism in bran of the newborns as well as on connection between different states of organism and copper metabolism in brain

The present study aimed to clarify connection between physiological states and copper metabolism

The animal models The work is performed on the four animal models-

1) Newborn and adult rats - models of embryonic and adult types of copper metabolism,

2) Adult rats consumed AgCl with feeder during 4 weeks - model of copper deficiency in blood serum (Ag-rats), bonus model - newborn rats fed by milk from Ag-rat,

3) Rats with fibrillogcnesis induced by administration of the neurotoxic fragment of (¡-amiloid into ventricle of brain - model of dementia of Alzheimer's type (MDAT-rats),

4)ApcMl" mice - model of cancer development

Investigation was done for cortex, cerebellum, hippocampus, amygdaloidal body, hypophysis, hypothalamus, choroid plexus, liver, blood serum, and CSF

Methods Activity of gents was estimated by semiquantitative RT-PCR-analysis The copper transporting genes (CTR1, ATP7A, ATP7B, APP), extracellular cuproenzymes (Cp, GPI-Cp), and intracellular cuproenzymes (SOD1 and COX (Cox4il)) were analyzed Relative level of Cp, CTR1, and SOD1 proteins were estimated by immunoblotting analysis Enzymatic activity of Cp and SOD1 were measured by "in-gel" assay Cp concentration was fixed by rocket Immunoelectrophoresis Subcellular fractions, were isolated by equilibrium ultracentrifugation Mitochondrial intermembranous space was obtained using swelling-shnnkmg-freezing-thaw procedure Concentrations of Cu, Fe, Zn and Ag in tissues and fluids were measured by atomic absorptive spectrometry Data are expressed as means ±S D Statistical comparisons were made using Student's t-test Differences were considered significant at P<0 05 Results Copper concentration was measured in brain of 5-, 10-, 20-, 30-, and 120-day-old rats Each group contained 5 animals The data shown, that during this time copper concentration rises in cortex, cerebellum, and hippocampus, doesn't change in hypophysis, and reduces in hypothalamus Cu-transportmg gene profiles also had been changed during development So ATP7A has been expressing in brain of newborns mainly, and its expression level increases in adult brain Alternatively, ATP7B gene is much more active in brain of adult animals A splice-form mRNA of secretory Cp is typical for brain departments in newborns mainly On the contrary Cp-mRNA isoform coding GPI-Cp is prevalent for brain of adult rats Also during development the concentiation of the intracellular cuproenzymes increases in all brain regions Thus copper metabolism in brain of newborn rats is different with it in adult ones as well as copper metabolism in liver Perhaps, it could be definite as embryonic type of copper metabolism in brain

It is known that consuming of Ag salts with feeder results in drop of copper concentration in plasma, and simultaneously silver accumulates in liver Using this model we shown that Cp, CTR1, ATP7A/B genes expression are don't change m liver of Ag-rats In brain, silver is accumulated by hypothalamus-hypophysis system only Here copper concentration decreases, and iron increases Zinc concentration doesn't change Cu-transportmg genes activity is decreased in Ag-rats brain, but expression of Cu-enzymes genes doesn't change In next experiments the model "Dam-rat treated with AgCl feeds the newborns during 10 days" was used (Ag(lO)-rats) It was shown that Ag is transferred with milk into gastro-intestinal tract of newborns, absorbed, and accumulated by liver In liver of Ag(10)-rats silver distributes within the same compartments which accumulate Cu, exactly Besides these animals have low level of Cp oxidative activity in blood serum, but expression profile of Cp gene and copper transporting

genes weren't changed in liver of them In their brain, Cp gene activity is suppressed Expression of intracellular cuproenzymes didn't change

We found that concentration ot copper and zinc is decreased in MDAT-rats within all investigated regions of brain, excluding choroids plexus Expression of Cu-transportmg genes is decreased in the brain ot MDAT animals as well as Cu-eiuymcs expression In the same time expression of examined genes doesn't change in liver

When coppcr turnover is disturbance (Ag- and MDAT-rats), apo-SODl passes to mitochondria, and turns into holo-enzyme herein The same process described for yeast, where mitochondria maintain a pool of copper

It is well known that tumor growth is accompanied by blood Cp level increasing But data on nature of this phenomenon are absent However it could be suggest that tumor growth could be regulated by copper status in organism To carry out the approaches to check this assumption we studied copper transporting genes expression in ApcM'"-mice It was shown that the growing of adenomas entails the increasing of expression level of Cu-fr?ncpcrt¡ng genes (CTR1, ATF7B, and Cp) and activation of ATP7A gene in liver At the same time CTR1 expression increases for about 30% in non-malignant intestines and near up to 2 times in adenomas m Min-mice

Список сокращении, использованных в ickcic автореферата

АРР предшественник |3-амилоидного белка

АТР7А АТФаза Менкеса

АТР7В АТФаза Вильсона

СОХ ци гохром-с-оксидаза

CTR1 транспортер меди 1

Си-АТРазы медьтранспортные АТФазы

PBS солевой буфер

SDS додецил сульфат нафия

ТВЕ грис-боратлый буфер

ТЕ трис-ЭДТА буфер

ао аминокислотный остаток

АФК активные формы кислорода

ГФИ гликозилфосфатидил инозитоловый якорь

ЖКТ желудочно-кишечный тракт

МДАТ модель деменции альцгеймеровского типа

мпм межмембрапное пространство митохондрий

МТ металлотионеин

емж спинномозговая жидкость

СОД1 Си,гп-супероксидцисмутаза

СОД2 Мп-супероксидцисмутаза

цне центральная нервная система

ЦП церулоплазмин

Подписано в печать 19 09 08 Формат 60*84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ 95

Отпечатано с готового оригинал-макета ЗАО "Принт - Экспресс" 197101, С-Петербург, ул Большая Монетная, 5 лит А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бабич, Полина Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, использованных в тексте

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физико-химические и биологические свойства меди

1.2. Биологическая роль основных купроэнзимов 13 млекопитающих

1.3. Белки, транспортирующие медь

1.4. Поддержание баланса меди в целом организме 43 млекопитающих

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Лабораторные животные и животные модели, 52 использованные в работе

2.2. Материалы, использованные в работе

2.3. Методы исследования

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Онтогенетические изменения метаболизма меди в 64 отделах мозга лабораторных крыс

3.2. Влияние дефицита оксидазного ЦП в крови на 85 метаболизм меди в мозге взрослых и новорожденных

3.3. Изменение метаболизма меди в мозгу крыс с 102 экспериментально индуцированным фибриллогенезом

3.4. Изменение метаболизма меди в опухолях

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метаболизм меди в мозгу крыс при различных состояниях организма"

Актуальность исследования. Медь необходима для жизни всех организмов, так как участвует в осуществлении широкого круга клеточных процессов от образования трансмиттеров до синтеза гема. Она входит в состав простетических групп ключевых ферментов, участвующих в окислительном фосфорилировании, формировании соединительной ткани, антиоксидантной защите, двунаправленном транспорте железа {Karlin, 1993). С другой стороны, ионы меди могут индуцировать образование активных форм кислорода, которые, действуя по механизму, сходному с ионизирующей радиацией, разрушают биополимеры {binder, 2001). Поэтому в клетках всех типов существуют эвошоционно консервативные системы для безопасного импорта, распределения и экскреции меди (Puig, Thiele, 2002). Любые, даже незначительные, сдвиги в их работе, вызванные генетическими или экологическими факторами, становятся причиной отдаленного развития тяжелых нейродегенеративных заболеваний (Gaggelli et ai, 2006). Системы носят органоспецифический характер и изменяются в течение онтогенеза {Пучкова, Платонова, 2004), они особенно уязвимы у новорожденных {Madsen, Gitlin, 2007; Penland, Prohaska, 2004; Prohaska et al, 2005).

В Отделе молекулярной генетики ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН было показано, что церулоплазмин (ЦП, мультимедная голубая оксидаза, выполняющая также роль донора меди для клеток негепатоцитарных рядов {Bielli, Calabrese, 2002)), входящий в состав молока является регулируемым пищевым источником меди {Платонова и др., 1999; Платонова и др., 2004). Новорожденные, вскармливаемые молочными смесями, которые, как правило, обогащены солями меди, получают избыток свободных ионов меди {Пучкова и др., 1997; Lonnerdal, 2005). У новорожденных крыс, вскармливаемых молочными смесями, в печени происходит преждевременная смена эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый Tim {Платонова и др., 2005; Platonova et ai, 2007). Одновременно в СМЖ этих животных 7-кратно повышается концентрация меди и ЦП. Показано, что in vitro ЦП в концентрации выше, чем она в. поддерживается в СМЖ, вызывает гибель нейронов. В то же время для дифференцировки молодых нейронов требуется ЦП (Maltais et ai, 2003). Вместе эти данные указывают на важность поддержания гомеостаза меди в мозгу в период новорожденности. Однако механизмы, контролирующие баланс меди в мозгу новорожденных, не изучены. К тому же плохо понято воздействие сдвигов метаболизма меди в целом организме на сбалансированную функцию генов, обеспечивающих гомеостаз меди в мозгу. Поэтому исследование связи между обменом меди в организме и экспрессией генов белков, обеспечивающих гомеостаз этого микроэлемента в мозгу, является актуальным.

Цель работы заключалась в изучении in vivo обмена меди в отделах мозга крыс при различных состояниях метаболизма меди.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Осуществить мониторинг распределения меди в отделах мозга крыс в течение онтогенеза. Сравнить уровень активности генов медьтранспортных белков и купроэнзимов в отделах мозга новорожденных и взрослых крыс.

2. Изучить влияние искусственного дефицита связанной с церулоплазмином меди в крови взрослых крыс, индуцированного кормлением солями серебра, на метаболизм меди в мозгу.

3. Исследовать влияние серебра, получаемого с кормом крысой-самкой с первого дня лактации, на метаболизм меди в печени и мозгу вскармливаемого ею потомства в течение первых десяти дней жизни.

4. Определить основные параметры обмена меди в отделах мозга крыс с экспериментально индуцированным фибриллогенезом (модель болезни Альцгеймера, БА).

5. Сопоставить уровень экспрессии генов медьтранспортных белков в культивируемых клетках линии НС 11 до и после их малигнизации, провести аналогичные исследования на АрсМш мышах (Min мыши).

В работе исследовали кору, мозжечок, гиппокамп, миндалевидное тело, гипофиз, гипоталамус и сосудистое сплетение. Эти структуры мозга отличаются друг от друга по удельному содержанию меди, уровню и профилю экспрессии генов медьтранспортных белков {Платонова и др., 2005). В качестве маркеров состояния метаболизма меди в работе использованы концентрация меди, относительная активность генов медьтранспортных белков, а также секреторных и внутриклеточных купроэнзимов.

Научная новизна полученных результатов. Все полученные данные -новые. Показано, что особенностью метаболизма меди в мозгу крыс в период дифференцировки нейронов является высокий уровень мРНК, кодирующей секреторный ЦП. Напротив, у взрослых животных преимущественной молекулярной формой является мРНК, кодирующая церулоплазмин, связанный с клеточной мембраной через гликозилфосфатидилинозитоловый якорь (ГФИ-ЦП). Так как обе мРНК образуются из общего транскрипта в ходе альтернативного сплайсинга, очевидно, что этот процесс строго регулируется в течение развития мозга. Также показано, что в различные периоды онтогенеза, при широких колебаниях концентрации меди и ЦП в хфови, в СМЖ она поддерживается на постоянно низком уровне. У крыс в течение развития в мозгу повышается концентрация меди. В работе показано, что это повышение связано с увеличением содержания в них купроэнзимов.

Продемонстрировано, что дефицит церулоплазминовой меди, искусственно вызванный добавлением в пищу AgCl, подавляет в мозгу экспрессию генов медьтранспортных белков, но мало влияет на формирование холо-купроэнзимов и концентрацию меди в клетках. Впервые продемонстрировано, что ионы серебра, поступающие в организм новорожденных с молоком, всасываются из ЖКТ, поступают в кровь и накапливаются в печени. Показано, что на всех этапах переноса, распределения и выведения атомы серебра остаются в обмениваемой форме. Высказано предположение, что ион серебра(1), изоэлектронный меди(1), использует внеклеточные и внутриклеточные транспортеры последней. Поэтому модель Ag-крыс может оказаться удобной для изучения транспорта ионов меди и механизмов включения их в активные центры купроэнзимов, за которыми можно следить по серебру. Именно этот раздел биологии меди плохо изучен, так как медь не имеет долгоживущих радиоактивных изотопов.

Важные результаты получены на модели крыс с индуцированным фибриллогенезом (модель БА). Показано, что у опытных крыс в отделах мозга снижается концентрация меди и нарушается гомеостаз цинка. При этом падает активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов. Таким образом, нарушение метаболизма меди, наблюдаемое при нейродегенеративных заболеваниях, может быть следствием фибриллогенеза. До сих пор нарушения обмена меди рассматриваются как причина фибриллогенеза. Возможно, что оба процесса имеют место при различных формах этих заболеваний. В работе впервые продемонстрировано, что развивающиеся опухоли, нуждающиеся в меди de novo, как для клеточного роста, так и для ее васкуляризации, возможно, транс-актавируют метаболическую систему меди в печени.

Научно-практическое значение полученных результатов. Данные, полученные в разделе, посвященном исследованию онтогенетических особенностей метаболизма меди в мозгу новорожденных, дополнительно указывают на возможное негативное влияние избытка меди, получаемого новорожденными при вскармливании их молочными смесями. Данные о влиянии пищевого серебра на метаболизм меди в мозгу взрослых и новорожденных млекопитающих могут учитываться при разработке применения серебра в качестве агента, препятствующего метаболизму меди, при лечении нейродегенеративных и раковых заболеваний. К тому же, данные о локальной аккумуляции серебра в гипоталамо-гипофизарной системе и изменении в ней статуса железа и меди однозначно указывают на необходимость дополнительных исследований для получения научно-обоснованных рекомендаций по употреблению воды, обеззараженной обработкой серебром, особенно во время беременности и кормления. Положения, выносимые на защиту:

1. В течение первого месяца жизни в клетках нервной ткани головного мозга крыс происходит увеличение активности генов, кодирующих купроэнзимы.

В результате концентрация меди в мозгу повышается. В клетках сосудистого сплетения в этот период жизни происходят изменения статуса меди, сходные с таковыми в печени.

2. В мозгу в течение онтогенеза изменяется соотношение изоформ ЦП-мРНК, формирующихся путем альтернативного сплайсинга. У новорожденных образуется преимущественно мРНК секреторного ЦП, у взрослых — мРНК ГФИ-ЦП.

3. Отсутствие церулоплазминовой меди в крови взрослых крыс, вызванное потреблением с кормом ионов серебра, индуцирует в мозгу подавление экспрессии генов медьтранспортных белков и гена ЦП. Относительный уровень экспрессии генов внутриклеточных купроэнзимов не меняется, но доля митохондриальной СОД1 увеличивается. Через гематоэнцефалический барьер ионы серебра переносятся в незначительном количестве, однако, они избирательно аккумулируются в гипофизе и вызывают изменения в обмене меди, железа и цинка в гипоталамо-гипофизарной системе.

4. Серебро, добавляемое в корм лактирующей самки, поступает в организм новорожденных, накапливается в печени в тех же компартментах, в которых аккумулируется медь и вызывает снижение оксидазной активности ЦП. В мозгу этих животных интенсивность образования секреторного ЦП снижена.

5. Фибриллогенез, вызванный прямым введением нейротоксического пептида в желудочки мозга крыс, провоцирует снижение концентрации меди и подавление активности генов медьтранспортных белков во всех рассмотренных отделах мозга, кроме сосудистого сплетения.

6. Развитие опухолей в кишечнике у Min мышей активирует в печени экспрессию генов медьтранспортных белков, участвующих в изменении уровня ЦП в крови. В опухолях повышается уровень активности только гена CTR1, белковый продукт которого участвует в импорте меди.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бабич, Полина Сергеевна

выводы

1. В мозгу крыс в течение развития происходят регион-специфические изменения распределения меди. Параллельно происходит смена профилей экспрессирующихся генов медьтранспортных белков: у новорожденных из двух медьтранспоргных АТФаз преимущественно экспрессируется АТФаза Менкеса, у взрослых в мозгу активируется ген, кодирующий АТФазу Вильсона. Из двух сппайс-форм мРНК церулоплазмина у новорожденных преимущественно формируется мРНК, кодирующая секреторную форму ЦП, у взрослых - мРНК, кодирующая мембранную изоформу (ГФИ-ЦП). Это позволяет определить метаболизм меди в мозгу новорожденных как эмбриональный тип, смена которого на взрослый происходит в разных отделах мозга не одновременно.

2. У Ag-крыс наблюдается накопление серебра и изменение концентрации меди, железа и цинка только в гипоталамо-гипофизарной системе. На фоне дефицита церулоплазминовой меди в крови активность генов медьтранспортных белков в клетках мозга снижается, уровень экспрессии внутриклеточных купроэнзимов не меняется.

3. У новорожденных крыс ионы серебра поступают в организм с молоком и аккумулируются в печени в тех же компартментах, где накапливается медь. У животных снижается оксидазная активность ЦП крови, но не меняется уровень экспрессии гена этого белка в печени. В мозгу относительная концентрация мРНК, кодирующей секреторный ЦП, падает.

4. Фибриллогенез, индуцированный введением в мозг фрагмента нейротоксического пептида (3-амилоида, вызывает в клетках нервной ткани снижение концентрации меди и цинка. При этом экспрессия генов медьтранспортных белков и купроэнзимов падает. В печени экспрессия генов медьтранспортных белков и купроэнзимов у этих животных не меняется.

5. Изменения метаболизма меди в сосудистом сплетении в течение развития отличаются от изменений в других рассмотренных отделах мозга и сходны с таковыми в печени при смене эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый. У МДАТ-крыс в сосудистом сплетении не происходит снижения концентрации меди и цинка. Отличия метаболизма меди в клетках сосудистого сплетения по сравнению с клетками нервной ткани, вероятно, связаны с мезенхимальным происхождением этого отдела.

6. При дефиците меди в сыворотке крови (Ag-крысы) и нарушении обмена меди (МДАТ-крысы) цитозольная апо-СОД перемещается в митохондрии и переходит там в холо-форму. При этом, по-видимому, в качестве источника меди используется митохондриальный пул меди.

7. Рост аденом у мышей линии Арс^"1 сопровождается повышением уровня и изменением профиля экспрессии генов медьтранспортных белков в печени. Повышается уровень экспрессии гена CTR1 в тканях кишечника и аденомах.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ представленных в диссертации результатов исследования метаболизма меди в отделах мозга крыс при различных состояниях метаболизма меди позволяет выделить следующие положения. Во-первых, это онтогенетическое изменение соотношения изоформ ЦП-мРНК и мРНК ГФИ-ЦП, образующихся в ходе альтернативного сплайсинга. Биологическая роль церулоплазминов в мозгу окончательно не установлена. Принято считать, что ГФИ-ЦП участвует в освобождении железа как эктоферроксидаза, занятая в ансамбле ферритин/ферропортин 1/ферроксидаза, и в антиоксидантной защите. Растворимый ЦП как ферроксидаза в составе ансамбля ферроксидаза/трансферрин/рецептор трансферрина участвует в импорте ионов железа, а также в дифференцировке нейронов. В работе однозначно продемонстрировано, что у новорожденных крыс в клетках нервной ткани образуется главным образом секреторный ЦП, а у взрослых - связанный с клеточной поверхностью ГФИ-ЦП. Обе изоформы формируются в клетках глии, но не в нейронах. Несмотря на высокий уровень содержания изоформы ЦП-мРНК, кодирующей секреторный ЦП, концентрация белка ЦП, циркулирующего в СМЖ, во все периоды развития поддерживается на одинаково низком уровне. Биологический смысл такого соотношения, возможно, заключается в том, что дифференцирующиеся нейроны требуют присутствия повышенного содержания растворимого ЦП, который они связывают с помощью рецептора ЦП, локализованного на их плазматической мембране. Поэтому высокий уровень мРНК секреторного ЦП и экспрессия рецептора ЦП совпадают только в период новорожденности. Противоречие между высоким уровнем ЦП-мРНК в нервных клетках и низким уровнем ЦП в СМЖ, возможно, объясняется тем, что ЦП после секреции паракринно связывается с рецептором ЦП нейронов. Это, с одной стороны, обеспечивает нейроны церулоплазмином, а с другой — предотвращает повышение концентрации ЦП в СМЖ. Такой контроль важен, так как повышение уровня ЦП в среде культивирования дифференцированных нейронов индуцирует освобождение железа. Полученные данные хорошо согласуются с известной биологической ролью ЦП и ГФИ-ЦП в мозгу. Однако нельзя быть уверенным, что у этих ферроксидаз нет еще и других функций. Также нельзя быть уверенным, что ПЦР продукты, получаемые на ЦП-кДНК, не содержат другие, еще не идентифицированные изоформы мРНК, являющиеся продуктами этого же гена. Так, до идентификации ГФИ-ЦП для ОТ-ПЦР анализа использовали праймеры, не различающие эти формы мРНК. Другим примером является ЦП-мРНК крыс, кодирующая ЦП-подобный белок митохондриальной локализации, которая также может быть ошибочно выявлена как ЦП-мРНК.

В работе убедительно показано, что в течение развития метаболизм меди в сосудистом сплетении (клетки эпендимы) претерпевает те же изменения, что и в печени. К ним относятся 1) накопление меди и последующее снижение ее концентрации, 2) более высокий уровень экспрессии гена ЦП у взрослых животных, 3) повышение активности гена CTR1 у взрослых. Особенности метаболизма меди в сосудистом сплетении проявляются и в распределении меди, железа и цинка у крыс с искусственно вызванным фибриллогенезом. Здесь на фоне снижения концентрации меди и цинка в клетках нервной ткани, уровень содержания меди и железа повышается в несколько раз. На сосудистое сплетение как отдел, контролирующий гомеостаз меди в мозгу, уже обращали внимание. Наши данные дополняют эти представления.

Основная часть ЦП, циркулирующего в СМЖ является продуктом клеток сосудистого сплетения. Интересно, что в отличие от ЦП крови, ЦП ликвора содержит больше слабосвязанных атомов меди. Возможно, это отражает его донорно-транспортную функцию в мозге, однако, это пока только предположение, так как практически ничего неизвестно о способе доставки меди за гематоэнцефалический барьер. Получению этих данных препятствует отсутствие подходящих для экспериментов пульс-чейз типа радиоактивных изотопов меди. Убедительно показано лишь то, что ЦП ликвора продуцируется клетками мозга, ЦП крови является донором меди для этих клеток и пептидная часть молекулы ЦП крови не пересекает гематоэнцефалический барьер. Представленные в работе данные показывают, что повышение уровня ЦП в СМЖ новорожденных крыс, вскармливаемых молочными смесями, является серьезным нарушением гомеостаза меди в мозгу.

В работе однозначно показано, что у крыс в течение развития мозга происходит активация генов медьтранспортных белков, обеспечивающая увеличение транспорта меди в клетки. Этого требует развитие ЦНС, нуждающейся в повышении продукции АТР в ходе окислительного фосфорилирования, которое ведет к увеличению производства АФК, что индуцирует формирование антиоксидантной системы. В этой связи интересно, что вместе с повышением активности генов Cox4il и СОД1, увеличивается и активность гена СОД2.

У животных, получающих серебро с кормом, дефицит церулоплазминовой меди в крови за время эксперимента (4 недели) не приводит к снижению концентрации меди в мозгу. В то же время дефицит меди вызывает подавление экспрессии генов медьтранспортных белков, но не купроэнзимов. Это можно объяснить тем, что активность генов медьтранспортных белков регулируются ионами меди. Это свидетельствует и о том, что, в клетках мозга действует система рециклизации меди. На существование такой системы указывают функции и внутриклеточная локализация белков CTR2 и STEAP. Эти белки располагаются в лизосомах и осуществляют транспорт меди из лизосом в цитозоль. Важная роль в поддержании баланса меди в клетке, вероятно, принадлежит митохондриальному пулу ионов меди. При дефиците меди мы наблюдали перемещение СОД1 в межмембранное пространство митохондрий. Так как СОД1 и ее Си(1)-шаперон CCS поступают в митохондрии в апо-форме, а мы обнаруживали здесь активную СОД1, следовательно, в нейронах в условиях снижения транспорта меди в мозг для формирования купроэнзимов Г мобилизуется митохондриальиый пул меди. Можно отметить, что активность гена ЦП также подавляется при дефиците меди, это особенно отчетливо демонстрируют данные о влиянии серебра на метаболизм меди в мозгу новорожденных.

Результаты всех экспериментов, полученных и на взрослых, и на новорожденных крысах, в корм которых добавляли хлорид серебра, показывают, что ионы серебра в организме переносятся теми же транспортерами, какими переносятся ионы меди. Включается ли серебро в активные центры апо-купроэнзимов, остается не изученным. Можно только отметить, что активность СОД1 у Ag-животных меняется мало, в то время как активность ЦП и содержание в нем меди падают почти до нуля. Связано ли это с нарушением транспорта меди в цистернальное пространство аппарата Гольджи, или с замещением меди серебром в его активных центрах, предстоит изучить.

В серии опытов с Ag-крысами проявилась еще одна из сторон взаимодействия между гипофизом и гипоталамусом: эти два отдела мозга, образующие гипоталамо-гипофизарную систему, основной функцией которой является регуляция эндокринной системы, имеют взаимодействующие между собой метаболические системы меди. Это выражается в том, что аккумулирование серебра в гипофизе приводит к накоплению железа и цинка в этом отделе и к снижению концентрации меди в гипоталамусе. В других отделах мозга уровень содержания рассмотренных микроэлементов не изменяется. Мониторинг экспрессии генов медьтранспортных белков в отделах мозга продемонстрировал, что их активность, особенно генов АТР7В и ЦП, наибольшая в гипоталамусе и гипофизе. Ранее, почти 30 лет назад, было показано, что введение крысам эстрадиола повышает фенолоксидазную активность в гипофизе и гипоталамусе, а серебро подавляет эффект гормона. Эти наблюдения полностью согласуются с представленными данными. Биологический смысл этого взаимодействия предстоит изучить. Есть основания думать, что в этой системе гипофиз активно участвует и в регуляции баланса железа, так как у Ag-крыс только в этом отделе происходит накопление железа.

Искусственный фибриллогенез нарушает метаболизм меди в мозгу. Механизм, по которому происходит это нарушение, отличается от механизма снижения метаболизма меди, вызванного ионами серебра. На это указывают следующие факты: концентрация меди снижается во всех отделах мозга и активность внутриклеточных купроэнзимов также снижается. Полученные данные впервые обращают внимание на то, что к развитию нейродегенеративных заболеваний могут приводить не только нарушения метаболизма меди, но фибриллогенез может привести к нарушению ее транспорта.

Результаты представленные в трех разделах работы однозначно показывают, что гомеостаз меди в мозгу поддерживается с помощью автономной системы, но ее работа зависит от метаболизма меди в печени, контролирующем уровень церулоплазминовой меди в крови.

В работе также проанализированы изменения метаболизма меди в печени и аденомах кишечника Min мышей. Показано, что рост опухолей в кишечнике сопровождается стимуляцией синтеза сывороточного ЦП, который является донором меди для клеток негепатоцитарных рядов. Таким образом, подавление синтеза ЦП, например, солями серебра, предположительно может быть способом замедления роста опухолей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бабич, Полина Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Abboud S. Haile D.J. A novel mammalian iron-regulated protein involved in intracellular iron metabolism //J. Biol. Chem. 2000. 275, 26: 19906-19912.

2. Adlard P.A., Bush A.I. Metals and Alzheimer's disease // J. Alzheimers Dis. 2006. 10, 2-3: 145-163.

3. Andrasi E., Farkas E., Gawlik D., Rosick U., Bratter P. Brain Iron and Zinc Contents of German Patients with Alzheimer Disease // J. Alzheimers Dis. 2000. 2, 1:17-26.

4. Andrasi E., Farkas E., Scheibler H. Raffy A., Beztir L. Al, Zn, Cu, Mn and Fe levels in brain in Alzheimer's disease // Archiv. Geron. Geriat. 1995. 21, 1: 89-97.

5. Arredondo M., Nurnez M.T. Iron and copper metabolism // Mol. Aspec. Med. 2006,26,2:313-327

6. Askwith C., Eide D., Van Ho A., Bernard P.S., Li L., Davis-Kaplan S., Sipe D.M., Kaplan J. The Fet3p gene of S. cerevisiae encodes a multicopper oxidase required for ferrous iron uptake // Cell. 1994. 76, 2: 403-410.

7. Aslund F., Beckwith J. Bridge over troubled waters: sensing stress by disulfide bond formation // Cell. 1999. 96, 6: 751-753.

8. Attieh Z.K., Mukhopadhyay C.K., Seshadri V., Tripoulas N.A., Fox P.L. Ceruloplasmin ferroxidase activity stimulates cellular iron uptake by a trivalent cation-specific transport mechanism // J. Biol. Chem. 1999. 274, 2: 1116-1123.

9. Atwood C.S., Huang X., Moir R.D., Tanzi R.E., Bush A.I. Role of free radicals and metal ions in the pathogenesis of Alzheimer's disease // Met. Ions Biol. Syst. 1999. 36,2: 309-364.

10. Augustyniak A, Skrzydlewska E. Antioxidative abilities during aging // Post. Hig. Med. Dosw. 2004, 58, 2: 194-201.

11. Baldwin A. S. Control of oncogenesis and cancer therapy resistance by the transcription factor NF-kappaB // J. Clin. Investig. 2001. 107,2: 241-246.

12. Barnes G., Frieden E. Ceruloplasmin receptors of erytrocytes // Biochem. Biophys. Res. Cornmun., 125, 157-162,1984.

13. Barnham, K. J.; Masters, C. L.; Bush, A. I. Neurodegenerative diseases and oxidative stress //Nat. Rev. Drug Discovery. 2004. 3: 205-211.

14. Barr F.E. Melanin: the organizing molecule //Med. Hypotheses. 1983. 11, 1: 1-139.

15. Bartee M.Y., Lutsenko S. Hepatic copper-transporting ATPase ATP7B: function and inactivation at the molecular and cellular level // Biometals. 2007. 20, 3-4: 627-637.

16. Bianchini A., Musci G., Calabrese D. Inhibition of endotelial nitric-oxide synthase by ceruloplasmin // J. Biol. Chem. 1999. 274. 29: 20265-20270.

17. Biasio W., Chang Т., Mcintosh C. J., McDonald F. J. Identification of Murrl as a regulator of the human delta epithelial sodium channel // J. Biol. Chem. 2004. 279, 5: 5429-5434.

18. Bielli P., Calabrese L. Structure to function relationships in ceruloplasmin: a "moonlighting" protein // Cell Mol. Life Sci. 2002. 59,1433-1447.

19. Boillee S., Vande Velde C., Cleveland D.W. ALS: a disease of motor neurons and their normeuronal neighbors //Neuron. 2006. 52,1: 39-59.

20. Boll M.C., Sotelo J., Otero E., Alcaraz-Zubeldia M., Rios C. Reduced ferroxidase activity in the cerebrospinal fluid from patients with Parkinson's disease //Neurosci. Lett. 1999. 265, 3: 155-158

21. Bowen H.J.M., Environmental chemistry of the elements // Academic Press, London, 1979.

22. Brouwer M., Brouwer-Hoexum T. Interaction of copper-metallothionein from the American lobster, Homarus americanus, with glutathione // Arch. Biochem. Biophys. 1991, 290, 1: 207-213.

23. Brown N.M., Torres A.S., Doan P.E., O'Halloran T.V. Oxygen and the copper chaperone CCS regulate posttranslational activation of Cu,Znsuperoxide dismutase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. 101, 15: 5518-5523.

24. Bull P.C., Thomas G.R., Rommens J.M., Forbes J.R., Cox D.W. The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes gene//Nature Genet. 1993. 5, 2: 327-337.

25. Burstein E., Ganesh L., Dick R.D., van De Sluis В., Wilkinson J.C., Klomp L.W.J., Wijmenga C. Brewer G.J. Nabel C.J., Duckett C.S. A novel role for XIAP in copper homeostasis through regulation of MURR1 // EMBO J. 2004. 23, 1: 244-254.

26. Calderone V., Dolderer В., Hartmann H.-J., Echner H., Luchinat C., Del Bianco C. Mangani S., Weser U. The crystal structure of yeast copper thionein: The solution of a long-lasting enigma // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. 102,1:51-56.

27. Campbell C.H., Brown R., binder M.C. Circulating ceruloplasmin is an important source of copper for normal and malignant animal cells // Biochim. Biophys. Acta. 1981. 678, 1: 27-38.

28. Ceciliani F., Giordano A., Spagnolo V. The systemic reaction during inflammation: the acute-phase proteins // Prot. Pept. Lett. 2002, 9 3: 211223.

29. Сегра W. Varela-Nallar L., Reyes A.E., Minniti A.N., Inestrosa N.C. Is there a role for copper in neurodegenerative diseases? // Mol. Asp. Med. 2005.26,2:405-420.

30. Chelly J., Turner Z., Tonnesen Т., Petterson A., Ishikawa-Brush Y. Isolation of a candidate gene for Menkes disease that encodes a potential heavy metal binding protein//Nature Genet. 1993. 3,1: 14-19.

31. Chowrimootoo G.F.E., Andoh J., Seymour C.A. Cobbett C.; Goldsbrough, P. Phytochelatins and metallothioneins: roles in heavy metal detoxification and homeostasis // Annu. Rev. Plant. Biol. 2002. 53,1: 159-182.

32. Cobine P., Wickramasinghe W., Harrison M., Weber Т., Solioz M., Dameron C. The Enterocococus hirae copper chaperone CopZ delivers copper (I) to the Cop Y repressor // FEBS Lett. 1995. 445, 1: 27-30.

33. Cobine P.A., Pierrel F., Winge D.R. Copper trafficking to the mitochondrion and assembly of copper metalloenzymes // Biochim. Biophys. Acta. 2006. 1763, 2: 759-772.

34. Cohen D.I., Illowsky В., binder M.C. Altered copper absorption in tumor-bearing and estrogen-treated rats // Am. J. Physiol. 1979. 236, 3: E309-315.

35. Crowe A., Morgan E.H. The effects of iron loading and iron deficiency on the tissue uptake of 64Cu during development in the rat // Biochim. Biophys. Acta. 1996. 1291, 1: 53-59.

36. Culotta V.C., Yang M., O'Halloran T.V. Activation of superoxide dismutases: Putting the metal to the pedal // Biochim. Biophys. Acta. 2006. 1763, 7: 747-758.

37. Culotta V.C., Klomp L.W., Strain J., Casareno R.L., Krems В., Gitlin J.D. The copper chaperone for superoxide dismutase // J Biol Chem. 1997. 272, 38: 23469-23472.

38. Daimon M., Yamatani K., Igarashi M., Fukase N., Kawanami Т., Kato Т., Tominaga M., Sasaki H. Fine structure of the human ceruloplasmin gene // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. 208, 3: 1028-1035.

39. Danzeisen R., Ponnambalam S., Lea R.G., Page K., Gambling L., McArdle H.J. The effect of ceruloplasmin on iron release from placental (BeWo) cells; evidence for an endogenous Cu oxidase // Placenta. 2000. 21, 8: 805812.

40. Davis W., Chowrimootoo G.F.E., Seymour C.A. Defective biliary copper excretion in Wilson's disease: the role of caeruloplasmin // Eur. J. Clin. Invest. 1996. 26, 5: 893-901.

41. De Domenico I., McVey W.D., di Patti M.C.B., Jeong S.Y., David S., Musci G., Kaplan J. Ferroxidase activity is required for the stability of cell surface ferroportin in cells expressing GPI-ceruloplasmin // EMBO J. 2007. 26, 10: 2823-2831.

42. De Rienzo F., Gabdoulline R.R., Wade R.C., Sola M., Menziani M.C. Computational approaches to structural and functional analysis of plastocyanin and other blue copper proteins // Cell. Mol. Life Sci. 2004, 61, 10: 1123-1142.

43. Devereaux Q.L., Takahashi R., Salvesen G.S., Reed J.C. X-linked LAP is a direct inhibitor of cell-death proteases // Nature. 1997. 388: 300-304.

44. DiCarlo F.J. Copper-induced heart malformations in hamsters // Experientia. 1979. 35, 6: 827-828.

45. Dombovari J, Becker JS, Dietze HJ. Multielemental analysis in small amounts of environmental reference materials with inductively coupledplasma mass spectrometry // Fresenius J. Anal. Chem. 2000. 367, 5: 407413.

46. Double K.L. Functional effects of neuromelanin and synthetic melanin in model systems // J. Neural. Transm. 2006. 113, 6: 751-756.

47. Double K.L., Halliday G.M. New face of neuromelanin // J. Neural. Transm. Suppl. 2006. 70, 1: 119-123.

48. Dunn J.T. Iodine supplementation and the prevention of cretinism // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1993. 678, 2: 158-168.

49. Eipper B.A., Milgram S.L., Husten E.J., Yun X.-Y., Mains R.E. Peptidylglycine a-amidating monooxygenase: A multifunctional protein with catalytic, processing, and routing domains // Protein Sci. 1993. 2: 489-497.

50. E1-Yazlgl A., Al-Saleh I., Al-Mefty O. Concentrations of Ag, Al, Au, Bi, Cd, Cu, Pb, Sb, and Se in cerebrospinal fluid of patients with cerebral neoplasms // Clin. Chem. 1984. 30, 8: 1358-1360.

51. Ettinger M.J., Darwish H.M., Schmitt R.C. Mechanism of copper transport from plasma to hepatocytes // Fed. Proc. 1986. 45, 12: 2800-2804.

52. Ferm V.H., Hanlon D.P. Toxicity of copper salts in hamster embryonic development// Biol. Reprod. 1974. 11,1: 97-101.

53. Fifkova E., Marsala J. // Stereotaxic atlase for the cat, rabbit and rat. Praga, St. zdravnicke nakald. 1960. 105 p.

54. Finney L. A., O'Halloran Т. V. Transition metal speciation in the cell: insights from the chemistry of metal ion receptors // Science. 2003. 300, 931-936.

55. Fortna R.R., Watson H.A., Nyquist S.E. Glycosyl phosphatidylinositol-anchored ceruloplasmin is expressed by rat Sertoli cells and is concentrated in detergent-insoluble iembrane fractions // Biol. Reprod. 1999, 61,5: 10421049.

56. Fox J.H., Kama J.A., Lieberman G., Chopra R., Dorsey K., Chopra V., Volitakis I., Cherny R.A., Bush A.I., Hersch S. Mechanisms of copper ion mediated Huntington's disease progression // PLoS ONE. 2007. 2, 3: e334 (1-12).

57. Fox P.L., Mukhopadhyay С., Ehrenwald E. Structure, oxidant activity, and cardiovascular mechanisms of human ceruloplasmin // Life Sci. 1995. 56, 21: 1749-1758.

58. Frederickson C.J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons // Int. Rev. Neurobiol. 1989. 31,145-238.

59. Gacheru S.N., Trackman P.C., Shah M.A., O'Gara C.Y., Spacciapoli P., Greenaway F.T., Kagan H.M. Structural and catalytic properties of copper in lysyl oxidase // J. Biol. Chem. 1990. 265, 31, 4: 19022-19027.

60. Gaggelli E. Kozlowski H., Valensin D., Valensin G. Copper Homeostasis and Neurodegenerative Disorders (Alzheimer's, Prion, and Parkinson's Diseases and Amyotrophic Lateral Sclerosis) // Chem. Rev. 2006. 106, 1995-2044.

61. Gaitskhoki V.S., L'vov L.V., Puchkova L.V., Schwartzman A.L., Neifakh S.A. Highly purified ceruloplasmin messenger RNA from rat liver // Mol. Cel. Biochem. 1981. 35, 2: 171-182.

62. Ganz T. Molecular Control of Iron Transport // J. Am. Soc. Nephrol. 2007. 18, 2: 394-400.

63. Gerbasi V., Lutsenko S., Lewis E.J. A mutation in the ATP7B copper transporter causes reduced dopamine beta-hydroxylase and norepinephrine in mouse adrenal //Neurochem. Res. 2003. 28, 6: 867-873.

64. Ghosh, S., May, M. J., and Kopp, E. B. NF-kappa В and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses // Annu. Rev. Immunol. 1998. 16, 225-260.

65. Gitlin J.D. Transcriptional regulation of ceruloplasmin gene expression during inflammation // J. Biol. Chem. 1988. 263, 2: 6281-6287.

66. Gitschier J., B. Moffat D. Reilly W.I., Wood W.J. Fairbrother, Solution structure of the fourth metal-binding domain from the Menkes copper-transporting ATPase//Nat. Struct. Biol. 1998. 5,1: 47-54.

67. Gregoriadis G., Morell A.G., Sternlieb I., Scheinberg I.H. Catabolism of desialylated ceruloplasmin in the liver// J. Biol. Chem. 1970. 245, 21: 58335837.

68. Gybina A.A., Prohaska J.R. Increased rat brain cytochrome с correlates with degree of perinatal copper deficiency rather than apoptosis // J. Nutr. 2003. 133, 12: 3361-3368.

69. Ha C., Ryu J., Park C.B. Metal ions differentially influence the aggregation and deposition of Alzheimer's beta-amyloid on a solid template // Biochemistry. 2007. 46, 20: 6118-6125.

70. Hamanaka R., Kolino K., Segushi Т., Okamura A. Induction of Low density lipoprotein receptor and a transcription factor SP-1 by tumor necrosis factor in human microvascular endotelial cells // J. Biol. Chem. 1992. 267, 19: 13160-13165.

71. Hamer D. H. Metallothionein//Ann. Rev. Biochem. 1986. 55, 913-951.

72. Schaefer H.M., Klomp L.W., Gitlin J.D. Interaction of the copper chaperone

73. HAH1 with the Wilson disease protein is essential for copper homeostasis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. 96, 23: 13363-13368.

74. Han O., Kim E.Y. Colocalization of ferroportin-1 with hephaestin on the basolateral membrane of human intestinal absorptive cells // J. Cell. Biochem. 2007. 101,4: 1000-1010.

75. Hansel D.E., May V., Eipper B.A., Ronnett G.V. Pituitary adenylyl cyclase-activating peptides and <X-amidation in olfactory neurogenesis and neuronal survival in vitro II J. Neijrosci. 2001. 21, 13: 4625-4636.

76. Hanson S.R., Donley S.A., binder M.C. Transport of silver in virgin and lactating rats and relation to copper // J. Trace Elem. Med. Biol. 2001. 15, 2: 243-253.

77. Hardy R.M., Stevens J.B., Stowe C.M. Chronic progressive hepatitis in Bedlington terriers associated with elevated liver copper concentrations // Minnesota Veterinarian. 1975. 15, 1: 13-24.

78. Harris E.D. Cellular copper transport and metabolism // Annu. Rev. Nutr. 2000. 20, 291-310.

79. Harris E.D. Copper transport: an overview // Society Experim. Biol, and Medicine, 130-140, 1991.

80. Harris Z.L., Klomp L.W., Gitlin J.D. Aceruloplasminemia: an inherited neurodegenerative disease with impairment of iron homeostasis // Am. J. Clin. Nutr. 1998. 67(5 Suppl): 972S-977S, 1998.

81. Hartmann H.J., Weser U. Copper-thionein from fetal bovine liver // Biochim. Biophys. Acta. 1977, 491, 1: 211-222.1. ЛГ

82. Hartmann H. J., Morpurgo L., Desideri A., Rotilio G. Weser U. Reconstitiition of stellacyanin as a case of direct Cu(I) transfer between yeast copper thionein and 'blue' copper apoprotein // FEBS Lett. 1983. 152, 1: 94-96.

83. Huang T.T., Carlson E.J., Raineri I., Gillespie A.M., Kozy H., Epstein C.J. The use of transgenic and mutant mice to study oxygen free radical metabolism// Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999. 893,1: 95-112.

84. Huffman D.L., O'Halloran T.V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins // Annu. Rev. Biochem. 2001. 70: 677-701.

85. Jackson В., Harper S., Smith L., Flinn J. Elemental mapping and quantitative analysis of Cu, Zn, and Fe in rat brain section by laser ablation ICP-MS // Anal. Bioanal. Chem. 2006. 384, 3: 951-957.

86. Jalkanen S., Salmi M. Cell surface monoamine oxidases: enzymes in search of a function//EMBO J. 2003. 20, 15: 3893-3901.

87. Jeong S.Y., David S. Age-related changes in iron homeostasis and cell death in the cerebellum of ceruloplasmin-deficient mice // J. Neurosci. 2006. 26, 38: 9810-9819.

88. Jeong S.Y., David S. Glycosylphosphatidylinositol-anchored ceruloplasmin is required for iron efflux from cells in the central nervous system // J. Biol. Chem. 2003. 278, 29: 27144-27148.

89. Johnson P.M., Faulk W.P. Immunological studies of human placentae: identification and distribution of proteins in immature chorionic villi // Immunology. 1978. 34, 6: 1027-1035.

90. Juan S.H., Guo J.H., Aust S.D. Loading of iron into recombinant rat liver ferritin heteropolymers by ceruloplasmin // Arch. Biochem. Biophys. 1997. 341,2: 280-286.

91. Kampfenkel K, Kushnir S, Babiychuk E, Inze D, Van Montagu M. Molecular characterization of a putative Arabidopsis thaliana copper transporter and its yeast homologue // J. Biol. Chem. 1995. 270, 47: 2847928486.

92. Kang Y.J. Metallothionein redox cycle and function // Exp. Biol. Med. 2006. 231,9: 1459-1467.

93. Keen K.L., Uriu-Hare J.Y., Hawk S.N., Jankowski M.A., Daston J.P., Kwik-Uribe K.L., Rucker R.B. Effect of copper deficiency on prenatal development and pregnancy outcome // Am. J. Clin. Nutr. 1998. 67, 5: 1003S-1011S.

94. Kelly E.J., Palmiter R.D. A murine model of Menkes disease reveals a physiological function of metallothionein // Nat. Genet. 1996. 13, 2: 219222.

95. Khan J.Y., Black S.M. Developmental changes in murine brain antioxidant enzymes // Pediatr. Res. 2003. 54, 1: 77-82.

96. Kim I.G., Park S.Y, Kim K.C., Yum J.J. Thiol-linked peroxidase activity of human ceruloplasmin // FEBS Lett. 1998. 431, 3: 473-475.

97. Kimmel С., Generoso W., Thomas R., Bakashi K. A new frontier in understanding mechanisms of developmental abnormalities // Toxicol. Appl. Pharm. 1993,119,2: 159-165.

98. Klevay L.M. Alzheimer's disease as copper deficiency // Med. Hypoth. 2008.70,4:802-807.

99. Klinman J.P. The Copper-Enzyme Family of Dopamine (3-Monooxygenase and Peptidylglycine a-Hydroxylating Monooxygenase: Resolving the chemical pathway for substrate hydroxylation // J. Biol. Chem. 2006. 281, 6: 3013-3016.

100. Klomp A.E.M., Tops B.B.J., Van Den Berg I.E.T., Berger R., Klomp L.W.J. Biochemical characterization and subcellular localization of human copper transporter 1 (hCTRl) //Biochem. J. 2002. 364, Pt 2: 497-505.

101. Klomp L.W., Farhangrazi Z.S., Dugan L.L, Culotta V., Gitlin J.D. Ceruloplasmin gene expression in the murine central nervous system // J. Clin. Invest. 1996. 98, 1: 207-215.

102. Knutson M.D. Steap proteins: implications for iron and copper metabolism//Nutrition Rev. 2007. 65, 7: 335-340.

103. Kollros P.R., Dick R.D., Brewer G.J. Correction of cerebrospinal fluid copper in Menkes kinky hair disease // Pediatr. Neurol. 1991. 7, 4: 305-307.

104. Koscliinsky M.L., Chow B.K.-C., Schwartz J., Hamerton J.L., MacGillivray R.T.A. Isolation and characterization of a processed gene for human ceruloplasmin //Biochemistry, 26, 7760-7767, 1987.

105. Kozma M., Ferke A. Trace element localization and changes in zinc and copper concentrations during postnatal development of the rat CNS // Acta Histochem. 1979. 65, 1: 219 227.

106. Kuo Y.-M., Gybina A.A. Pyatskowit J.W., Gitschier J., Prohaska J.R. Copper transport protein (Ctrl) levels in mice are tissue specific and dependent on copper status // J. Nutr. 2006. 136, 1: 21-26.

107. Lamb A.L., Wernimont A.K., Pufahl R.A., Culotta V.C., O'Halloran T.V., Rosenzweig A.C. Crystal structure of the copper chaperone for superoxide dismutase // Nat. Struct. Biol. 1999. 6, 3: 724-729.

108. Lee J., Petris M.J., Thiele D.J. Characterization of mouse embryonic cells deficient in the Ctrl high affinity copper transporter. Identification of a Ctrl-independent copper transport system // J. Biol. Chem. 2002. 277, 43: 4025340259.

109. Lee S.H., Lancey R., Montaser A., Madani N., Linder M.C. Ceruloplasmin and copper transport during the latter part of gestation in the rat // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1993. 203, 4: 428-439.

110. Lin S.J., Culotta V.C. The ATX1 gene of Saccharomyces cerevisiae encodes a small metal homeostasis factor that protects cells against reactive oxygen toxicity//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. 92. 9: 3784-3788.

111. Linder M.C. Biochemistry and molecular biology of copper in mammals. In: Massoro E.J. (ed.) Handbook of copper pharmacology and toxicology. Humana Press, Totowa NJ, 2002.

112. Linder M.C., Bryant R.R., Lim S., Scott L.E., Moor J.E. Ceruloplasmin elevation and synthesis in rats with transplantable tumors // Enzyme. 1979. 24, 2: 85-95.

113. Linder M.C., Hazerh-Azam M. Copper biochemistry and molecular biology // Am. J. Clin. Nutr. 1996. 63, 5: 797S-811S.

114. Linnane A.W., Kios M., Vitetta L. The essential requirement for superoxide radical and nitric oxide formation for normal physiological function and healthy aging // Mitochondrion. 2007. 7,1-2: 1-5.

115. Liu N., Lo L.S., Askary S.H., Jones L., Kidane T.Z., Nguyen T.T., Goforth J., Chu Y.H., Vivas E., Tsai M., Westbrook Т., Linder M.C. Transcuprein is a macroglobulin regulated by copper and iron availability // J. Nutr. Biochem. 2007. PMID: 17363239.

116. Lonnerdal B. Trace element transport in the mammary gland // Annu. Rev. Nutr. 2007. 27, 165-177.

117. Lovell M.A., Robertson J.D., Teesdale W.J., Campbell J.L., Markesbery W.R. Copper, iron and zinc in Alzheimer's disease senile plaques // J. Neurol. Sci. 1998.158, 1: 47-52.

118. Lowiy O.H., Rosebrough N.Y., Fair A.L., Randall R.I. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. 193, 1: 265.

119. Lund PA, Brown NL. Role of the merT and merP gene products of transposon Tn501 in the induction and expression of resistance to mercuric ions // Gene. 1987. 52, 2-3: 207-214.m

120. Lutsenko S., Cooper M.J. Localization of the Wilson's disease protein product to mitochondria I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. 95, 11: 60046009.

121. Lutsenko S., Kaplan J.H. Organization of P-type ATPases: significance of structural diversity//Biochemistry. 1995.34,48: 15607-15613.

122. Lutsenko S., LeShane E.S., Shinde U. Biochemical basis of regulation of human copper-transporting ATPases // Arch. Biochem. Biophys. 2007. 463, 1: 134-148.

123. Lutsenko S., Tsivkovskii R., Walker J.M. Functional properties of the human copper-transporting ATPase ATP7B (the Wilson's disease) and regulation by metallochaperone Atoxl // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2003. 986, 1: 204-211.

124. Madsen E., Gitlin J.D. Copper deficiency // Curr. Opin. Gastroenterol. 2007. 23: 187-192.

125. Manega O., Malatesta F., Ludwiga В., Drosou V. Interaction of cytochrome с with cytochrome oxidase: two different docking scenarios // Biochim. Biophys. Acta. 2004. 1655, 274- 281.

126. Mattson M.P., Meffert M.K. Roles for NF-kappaB in nerve cell survival, plasticity, and disease // Cell Death Differ. 2006. 13, 5: 852-860.

127. May P.M., Linder P.W., Williams D.R. Ambivalent effect of protein binding on computed distributions of metal ions complexed by ligands in blood plasma //Experientia. 1976. 32, 12: 1492-1494.

128. McArdle H.J., Danzeisen R., Fosset C., Gambling L. The role of the placenta in iron transfer from mother to fetus and the relationship between iron status and fetal outcome // BioMetals. 2003. 16, 1: 161-167.

129. Mendelsohn B.A. Yin C., Johnson S.L., Wilm T.P., Solnica-Krezel L., Gitlin J.D. Atp7a determines a hierarchy of copper metabolism essential for notochord development // Cell. Metab. 2006. 4,1:155-162.

130. Menkes J.H., Alter M., Steigleder G., Wekley D.R., Sung J.H. A sex-linked recessive disoder with retardation of growth, pecular hair and focal cerebral and cerebellar degeneration// Pediatrics. 1962. 29, 4: 764-779.

131. Mercer J.F.B., Livingston J., Hall В., Paynter J.A. Isolation of a partial candidate gene for Menkes disease by positional cloning // Nat. Genet. 1993. 3,1:20-25.

132. Merlo G.R., Basolo F., Fiore L., Duboc L., Hynes N.E. p53-dependent and p53-independent activation of apoptosis in mammary epithelial cells reveals a survival function of EGF and insulin // J. Cell Biol. 1995. 128, 6: 1185-1196.

133. Messerschmidt A., Huber R. The blue oxidases, ascorbate oxidase, laccase and ceruloplasmin. Modelling and structural relationships // Eur. J. Biochem. 1990,187, 2: 341-352.

134. Mitro A., Palkovits M. Morphology of the rat brain ventricles, ependima and periventricular structures // Academiai Kiado. Budapest. 1981.

135. Miyajima H., Takahashi Y., Kono S. Aceruloplasminemia, an inherited disorder of iron metabolism //BioMetals. 2003. 16, 1: 205-213.

136. Monty J.F., R.M. Llanos J.F. Mercer D.R. Copper exposure induces trafficking of the menkes protein in intestinal epithelium of ATP7A transgenic mice // J. Nutr. 2005. 135,12, 9: 2762-2766.

137. Moore SD, Chen MM, Cox DW. Cloning and mapping of murine superoxide dismutase copper chaperone (Ccsd) and mapping of the human ortholog// Cytogenet. Cell Genet. 2000. 88,1-2: 35-37.

138. Moos Т., Morgan E.H. The metabolic of neuronal iron and its pathogenic role in neurological diseases // Ann. N. Y. Acad. Sci. USA. 2004. 1012, 1: 14-26.

139. Morton M.S., Elwood P.C., Abernethy M. Trace elements in water and congenital malformations of the central nervous system in South Wales // Br. J. Prev. Soc. Med. 1976. 30,1: 36-39.

140. Mufti A.R., Burstein E. Duckett C.S. XIAP: cell death regulation meets copper homeostasis // Arch Biochem Biophys. 2007. 463, 2: 168-174.

141. Mukhopadyay C.K., Mazumder В., Lindley P.F., Fox P.L. Identification of the prooxidant site of human ceruloplasmin: a model for oxidative damage by copper bound to protein surfaces // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997.94, 8:11546-11551.

142. Muller M., Kersten S. Nutrigenomics: goals and strategies // Nature Rev. Genet. 2003. 4, 2: 315-322.

143. Muller Т., Muller W., Feichtinger H. Idiopathic copper toxicosis // Am. J. Clin. Nutr. 1998. 67, 6: 1082S-1086S.

144. Musci G., Fraterrigo T.Z.L., Calabrese L., McMillin D.R. On the lability and functional significance of the type 1 copper pool in ceruloplasmin // JBIC. 1999.4: 441-446.

145. Narindrasorasak S., Kulkami P., Deschamps P., She Y.-M., Sarkar B. Characterization and copper binding properties of human COMMD1 (MURR1)//Biochemistry. 2007. 46, 11: 3116-3128.

146. Nose Y., Kim B.-E., Thiele D.J. Ctrl drives intestinal copper absorption and is essential for growth, iron metabolism, and neonatal cardiac function // Cell Metab. 2006, 4, 1: 235-244.

147. Ohgami R.S., Campagna D.R., McDonald A., Fleming M.D. The Steap proteins are metalloreductases //Blood. 2006. 108: 1388-1394

148. Okamoto, Т.; Takeda, S.; Murayama, Y.; Ogata, E.; Nishimoto, I. Ligand-dependent G protein coupling function of amyloid transmembrane precursor//J. Biol. Chem. 1995. 270. 11: 4205-4209.

149. Opazo C., Barr'ia M.I., Ruiz F.H., Inestrosa N.C. Copper reduction by copper binding proteins and its relation to neurodegenerative diseases // BioMetals 16: 91-98, 2003.

150. Owen J.A., Smith H. Detection of ceruloplasmin after zone electrophoresis // Clin. Chim. Acta. 1961. 6, 2: 441-444.

151. Patel B.N., David S. A novel glycosylphosphatidylinositol-anchored form of ceruloplasmin is expressed by mammalian astrocytes // J. Biol. Chem., 272, 20185-20190,1997.

152. Pauly P.S., Harris D.A. Copper Stimulates Endocytosis of the Prion Protein // J. Biol. Chem. 1998. 273, 50: 33107-33110.

153. Pelkonen K.H., Heinonen-Tanski H., Hanninen O.O. Accumulation of silver from drinking water into cerebellum and musculus soleus in mice // Toxicology. 2003, 186, 1-2: 151-157.

154. Penland J.G., Prohaska J.R. Abnormal motor function persists following recovery from perinatal copper deficiency in rats // J. Nutr. 2004. 134, 8: 1984-1988.

155. Perry A.C., Jones R., Hall L. Isolation and characterization of a rat cDNA clone encoding a secreted superoxide dismutase reveals the epididymis to be a major site of its expression // Biochem. J. 1993. 293, Pt 1: 21-25.

156. Peterson C. W., Narula S. S., Armitage I. M. 3D solution structure of copper and silver-substituted yeast metallothioneins // FEBS Lett. 1996. 379, 1: 85-93.

157. Phinney A.L., Drisaldi В., Schmidt S.D., Lugowski S., Coronado V., Liang Y, Home P., Yang J., Sekoulidis J., Coomaraswamy J., Chisliti M.A., Cox D.W., Mathews P.M., Nixon R.A, Carlson G.A., St George-Hyslop P.,4ЬЪ

158. Westaway D. In vivo reduction of amyloid-P by a mutant copper transporter //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. 100, 24: 14193-14198.

159. Porter H. Neonatal hepatic mitochondrocuprein. 3. Solubilization of the copper and protein from mitochondria of newborn liver by reduction with mercaptoethanol 11 Biochim. Biophys. Acta. 1968. 154, 236-238.

160. Porter H., Sweeney M., Porter H. Neonatal hepatic mitochondrocuprein. II. Isolation of the copper-containing subtraction from mitochondria of newborn human liver// Arch. Biochem. Biophys. 1964, 104: 97-101.

161. Portnoy M.E., Schmidt P.J., Rogers R.S., Culotta V.C. Metal transporters that contribute copper to metallochaperons in Saccharomyces cerevisiae // Mol. Genet. Genomics. 2001. 265. 5: 873-882.

162. Pribyl Т., Jahodova J., Schreiber V. Partial inhibition of oestrogen-induced adenohypophyseal growth by silver nitrate // Horm. Res. 1980. 12, 5: 296-303.

163. Pribyl Т., Monakhov N.K., Vasilyev V.B., Shavlovsky M.M., Gorbunova V.N., Aleynikova T.D. Silver-containing ceruloplasmin without polyphenol oxidase activity in rat serum // Physiol. Bohemoslov. 1982. 31, 6: 569-571.

164. Pribyl Т., Schreiber V., Jahodova J. Polyphenol oxidase activity in the rat hypothalamus: stimulation after oestrogens and inhibition after the administration of silver//Physiol. Bohemoslov. 1981, 30, 6: 525-530.

165. Prohaska J.R. Long-term functional consequences of malnutrition during brain development: copper // Nutrition. 2000. 16, 7/8: 502-504.

166. Prohaska J.R., Baileyw W.R., Lear P.M. Copper deficiency alters rat peptidylglycine a-amidating monooxygenase activity//J. Nutr. 1995. 125,6: 1447-1454.

167. Prohaska J.R., Broderius M. Plasma peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase (РАМ) and ceruloplasmin are affected by age and copper status in rats and mice // Сотр. Biochem. Physiol. Biochem. Mol. Biol. 2006. 143, 3: 360-366.

168. Prohaska J.R., Gybina A.A., Broderius M., Brokate B. Peptidylglycine-alpha-amidating monooxygenase activity and protein are lower in copperdeficient rats and suckling copper-deficient mice // Arch. Biochem. Biophys. 2005.434,1:212-220.

169. Puig S., Thiele D.J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution// Curr. Opin. Chemic. Biol. 2002. 6, 2: 171-180.

170. Pyatskowit D.W., Prohaska J.R. Rodent brain and heart catecholamine levels are altered by different models of copper deficiency // Сотр. Biochem. Physiol. Toxicol. Pharmacol. 2007. 145, 2: 275-281.

171. Qian Z.M., Chang Y.Z., Leung G., Du J.R., Zhu L., Wang Q., Niu L., Xu Y.J., Yang L., Ho K.P. Ke Y. Expression of ferroportinl, hephaestin and ceruloplasmin in rat heart // Biochim. Biophys. Acta. 2007; 1772 (5):527-32.

172. Qiao D., Meyer K., Mundhenke C., Drew S.A., Friedl A. Heparan sulfate proteoglycans as regulators of fibroblast growth factor-2 signaling in brain endothelial cells II J. Biol. Chem. 2003. 278,18: 16045-16053.

173. Rao M.R., Hediger M.L., Levin R.J., Naficy A.B., Vile T. Effect of breastfeeding on cognitive development of infants born small for gestation age // Acta Paediatr. 2002. 91: 267-274.

174. Rees E. M., Thi D.J. Identification of a vacuole-associated metalloreductase and its role in Ctr2-mediated intracellular copper mobilization // J. Biol. Chem. 2007. 282 (30): 21629-21638.

175. Richardson D.R. Mysteries of the transferrin- transferrin receptor 1 interaction uncovered // Cell. 2004. 116, 2: 483-489.

176. Richter O.-M. H., Ludwig B. Cytochrome с oxidase structure, function, and physiology of redox-driven molecular machine // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2003.147: 47-74.

177. Riihimaki E.-S., Martinez J.M., Kloo L. Structural effects of Cu(II)-coordination in the octapeptide region of the human prion protein // Phys. Chem. Chem. Phys. 2008. 10, 12: 2488-2495.

178. Rogers J.M., Keen C.L., Hurley L.S. Zinc, copper, and manganese deficiencies in prenatal and neonatal development, with special reference to the central nervous system // Neurol. Neurobiol. 1985. 15, 1: 3-34.

179. Roy C.N., Enns C.A. Iron homeostasis: new tales from the crypt // Blood. 2000. 96,12:4020-4027.

180. Rucker R.B., Kosonen Т., Clegg M.S., Mitchell A.E., Rucker B.R., Uriu-Hare J.Y., Keen C.L. Copper, lysyl oxidase, and extracellular matrix protein cross-linking//Am. J. Clin. Nutr. 1998, 67, 996S-1002S.1.f

181. Rupp H., Weser U. Conversion of metallothionein into Cu-thionein, the possible low molecular weight form of neonatal hepatic mitochondrocuprein //FEBS Lett. 1974. 44, 3: 293-297.

182. Sabo, S. L.; Ikin, A. F.; Buxbaum, J. D.; Greengard, P. The Alzheimer amyloid precursor protein (APP) and FE65, an APP-binding protein, regulate cell movement // J. Cell Biol. 2001.153, 7:1403-1414.

183. Saeki K., Nakjimi M., Loughlin Т., Calkins D.C., Baba N., Kiyota M., Tatsukawa R. Accumulation of silver in the liver of three species of pinnipeds//Environ. Pollut. 2001. 112, 1: 19-/25.

184. Sargent P.J., Farnaud S., Evans R.W. Structure/function overview of proteins involved in iron storage and transport // Curr. Med. Chem. 2005. 12, 23: 2683-2693.

185. Sato M., Gitlin J.D. Mechanisms of copper incorporation during the biosynthesis of human ceruloplasmin // J. Biol. Chem. 1991. 266, 8: 51285134.

186. Sato M., Schilsky M.L. Stockert R.J., Morell A.G., Sternlieb I. Detection of Multiple Forms of Human Ceruloplasmin. A novel m, 200,000 form // J. Biol. Chem. 1990. 265, 5: 2533-2537.

187. Schneider B.D., Leibold E. A. Regulation of mammalian iron homeostasis // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. 2000. 3,4: 267-273.

188. Sharp P.A. Ctrl and its role in body copper homeostasis // Intern. J. Biochem. Cell Biol. 2003. 35, 2: 288-291.

189. Shinogi, M., Maeizumi, S. Effect of preinduction of metallothionein on tissue distribution of silver and hepatic lipid peroxidation // Biol. Pharm. Bull. 1993. 16, 372-374.

190. Sinani D., Adle D.J., Kim H.; Lee J. Distinct mechanisms for CTR1-mediated copper and cisplatin transport // J. Biol. Chem. 2007. doi/10.1074/jbc.M703973200.

191. Skinner M.K., Griswold M.D. Sertoli cells synthesize and secrete a ceruloplasmin-like protein//Biol. Reprod. 1983. 28, 5:1225-1229.

192. Smith J.L., Xiong S., Markesbery W.R., Lovell M.A. Altered expression of zinc transporters-4 and -6 in mild cognitive impairment, early and late Alzheimer's disease brain//Neurosci. 2006. 140, 3: 879-888.

193. Steegers-Theunissen R.P. Folate metabolism and neural tube defects: a review // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 1995. 61, 1: 39-48.

194. Stepanov I.I., Kuznetsova N.N., Klement'ev B.I., Sapronov N.S. Effect of intracerebralventricular administration of beta-amyloid on the dynamics of learning in purebred and mongrel rats // Neurosci. Behav. Physiol. 2007. 37, 6: 583-590.

195. Stillman M.J. Spectroscopic studies of copper and silver binding to metallothioneins //Metal-BasedDrugs. 1999. 6, 4-5: 277-290.

196. Stoltenberg, M., Juhl, S., Poulsen, E.H., Ernst, E., 1994. Autometallographic detection of silver in hypothalamic neurones of rats exposed to silver nitrate. J. Appl. Toxicol. 14, 275-/280.

197. Suttle Y.F., Jones D.J. 1989. Recent Developments in Trace Element Metabolism and Function: Trace Elements, Disease Resistance and Immune Responsiveness in Ruminants // J. Nutr. 119, 5: 1055-1061.

198. Tainer J.A., Getzoff E.D., Richardson J.S., Richardson D.C., 1983. Structure and mechanism of copper, zinc superoxide dismutase // Nature 306,284-287.

199. Tao, T. Y., Liu, F., Klomp, L., Wijmenga, C., and Gitlin, J. D. The copper toxicosis gene product Murrl directly interacts with the Wilson disease protein (2003) J. Biol. Chem. 278,41593-41596

200. Tapiero H., Townsend D.M., Tew K.D. Trace elements in human physiology and pathology. Copper // Biomed. Pharmacother. 2003, 57, 9: 386-398.

201. Turnlund J.R. Human whole-body copper metabolism // Am. J. Clin. Nutr. 1998. V. 67. P. 960S 964S.

202. Vanderwerf S.M., S. Lutsenko, The Wilson's disease protein expressed in Sf9 cells is phosphorylated // Biochem. Soc. Trans. 30 (4) (2002) 739-741.

203. Vargas E.J., Shoho A.R., Linder M.C. Copper transport in the Nagase analbuminemicrat//Am. J. Physiol. 1994, 267, Pt. 1, 2: G259-269.

204. Vasak M. Advances in metallothionein structure and functions // J Trace Elem Med Biol. 2005;19 (1):13-17.ibi

205. Vassiliev V., Harris Z.L., Zattac P. Ceruloplasmin in neurodegenerative diseases // Brain Res. Rev. 2005. 49, 3: 633 640.

206. Voskoboinik I., R. Fernando, N. Veldhuis, K.M. Hannan, N. Marmy-Conus, R.B. Pearson, J. Camakaris, Mutational analysis of the Menkes copper P-type ATPase (ATP7A). Biochem. Biophys. Res. Commun. 301 (2003) 2: 337-342.

207. Vulpe C., Levinson В., Whitney S., Packman S., Gitscher J. Isolation of a candidate gene for Menkes disease and evidence that it encodes a copper-transporting ATPase // Nature Genet., 3, 7-13,1993.

208. Vulpe C.D., Kuo Y.M., Murphy T.L., Cowley L., Askwith C., Libina N., Gitschier J., Anderson G.J. Hephaestin, a ceruloplasmin homologue implicated in intestinal iron transport, is defective in the sla mouse // Nat. Genet., 21(2):195-9,1999.

209. Vulpe C.D., Packman S. Cellular copper transport // Annu. Rev. Nutr. 1995, 15, 293-322.

210. Walravens P.A. Nutritional Importance of Copper and Zinc in Neonates and Infants // Clin. Chem. 1980, 26, 2: 185-189.

211. Wang R., Zhang L., Mateescu M.A., Nadeau R. Ceruloplasmin: an endogenous depolarizing factor in neurons? // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1995. 207, 2: 599-605.

212. Weisner В., Hartard C., Dieu C. CSF copper concentration: a new parameter for diagnosis and monitoring therapy of Wilson's disease with cerebral manifestation // J Neurol Sci. 1987 Jun;79(l-2):229-37.

213. Weiss K.C., Linder M.C. Copper transport in rats involving a new plasma protein // Am. J. Physiol. 1985, 249, Pt. 1,1: E77-88.

214. Weiss K.C., Linder M.C. Copper transport in rats involving a new plasma protein// Am. J. Physiol., 249: E327-333,1985.

215. Wessling-Resnick M. Iron transport // Annu. Rev. Nutr. 2000. 20:129151.

216. Westergard L., Christensen H.M., Harris D.A. The Cellular Prion Protein (PrPC): Its Physiological Function and Role in Disease // Biochim. Biophys. Acta. 2007.1772(6): 629-644.

217. Western blot analysis in patients with hypocaeruloplasminaemia // Q J1. Med 1997; 90,1: 197-202.

218. White A.R. Reyes R., Mercer J.F.B., Camakaris J., Zheng H., Bush A.I., Multhaup G., Beyreuther K., Masters C.L., Cappai R. Copper levels are increased in the cerebral cortex and liver of APP and APLP2 knockout mice // Brain Res. 1999, 842, 2: 439-444.

219. Wijmenga C. Klomp L.W.J. Molecular regulation of copper excretion in the liver // Proceedings of the Nutrition Society (2004), 63, 31-39

220. Wood C.M., Hogdtrand C., Galvez F., 1996. The physiology of waterborne silver toxicity in freshwater rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicol. 35, 93-109.

221. Wyman S.s Simpson R.J., McKie A.T., Sharp P.A. Dcytb (Cybrdl) functions as both a ferric and a cupric reductase in vitro // FEBS Letters 582 (2008)1901-1906.

222. Yamaguchi Y., Heiny M.E., Gitlin J.D. Isolation and characterization of human liver cDNA as a candidate gene for Wilson disease // Biochem. Biophys. Res. Commun., 197:271-7, 1993.

223. Yang F.} Freidrichs W.E., Cupples R.L., Bonifacio M.J., Sanford J. A., Horton W.A., Bowman B.H. Human ceruloplasmin. Tissue-specific expression of transcripts produced by alternative splicing // J. Biol. Chem. 1990. 265, 18: 10780-10785.

224. Yonkovich J., McKenndry R., Shi X., Zhu Z., Copper ion-sensing transcription factor Maclp post-translationally controls the degradation of its target gene product Ctrl // J. Biol. Chem. 2002. 277, 27: 23981-23984.

225. Yuan DS, Stearman R, Dancis A, Dunn T, Beeler T, Klausner RD. The MenkesAVilson disease gene homologue in yeast provides copper to aceruloplasmin-like oxidase required for iron uptake // Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 Mar 28;92(7):2632-6.

226. Zaitseva MEDLINE: Pubmed (MMDB Id: 5142 PDB Id: 1KCW).

227. Zecca L, Tampellini D, Gerlach M, Riederer P, Fariello RG, Sulzer D. Substantia nigra neuromelanin: structure;, synthesis, and molecular behaviour//Mol. Pathol. 2001, 54, 6: 414-418.

228. Дубинина E.E. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. Жизнь и смерть, созидание и разрушение, Из-во «Медицинская пресса», СПб, 2006, стр. 397.

229. Васин А.В., Клотченко С.А., Платонова Н.А., Цымбаленко Н.В., Бабич B.C., Пучкова JI.B. Идентификация изоформы мРНК церулоплазмина крысы, предположительно кодирующей белок митохондриальной локализации // Молек. биол. 2005. 39, 6: 933-944.

230. Жигулева Э.А., Мокшина С.В., Пучкова Л.В., Гайцхоки B.C. -Некоторые свойства фетального церулоплазмина человека // БЭБМ.1999,118, 10: 453-456.

231. Клотченко С.А., Цымбаленко Н.В., Соловьев К.В., Скворцов А.Н.,

232. Затуловский Е.А., Бабич П.С., Платонова Н.А., Шавловский М.М., Пучкова JI.B., Броджини М. Влияние ионов серебра на метаболизм меди и экспрессию генов медьтранспортных белков в печени крыс // ДАН РАН. 2008, 418,4: 549—552.

233. Платонова Н.А., Барабанова С.В., Повалихин Р.Г., Цымбаленко Н.В., Даниловский М.А., Воронина О.В., Дорохова И.И., Пучкова JI.B. In vivo экспрессия медьтранспортных белков в отделах мозга крыс // Известия РАН. Сер. Биол. 2005 (а), 2: 108 120.

234. Платонова Н.А., Жигулева Э.А., Цымбаленко Н.В., Мищенко Б.С., Васин А.В., Живулько Т.В., Пучкова JI.B. Возрастные особенности биосинтеза и распределения церулоплазмина в организме крыс // Онтогенез. 2004, 35, 3: 171-182.

235. Платонова Н. А., Барабанова С.В., Повалихин Р.Г., Цымбаленко Н.В., Ноздрачев А.Д., Пучкова JI.B. Экспрессия АТФазы Менкеса и АТФазы Вильсона в различных отделах мозга взрослых крыс // ДАН РАН. 2005(6), 401, 2: 267-270.

236. Пучкова Л.В., Платонова Н.А. Механизм, обеспечивающий гомеостаз меди у эукариотов, и его связь с транспортом железа // Успехи совр. биол. 2003,123,1: 41-58.

237. Пучкова Л.В., Алейникова ТД., Вербина И.А., Захарова Е.Т., Плисс М.Г., Гайцхоки B.C. Биосинтез двух молекулярных форм церулоплазмина в печени крысы и их полярная секреция в кровоток и в желчь//Биохимия. 1993, 58, 12:1893-1900.

238. Пучкова Л.В., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д., Захарова Е.Т., Гайцхоки B.C. Реконструирование пути межклеточного переноса пептидной части молекулы церулоплазмина в организме млекопитающих//Биохимия. 1997, 62, 7:817-825.

239. Шавловский М.М., Чеботарь Н.А., Конописцева Л.А., Захарова Е.Т., Качурин Л.М., Васильев В.Б., Гайцхоки B.C. Влияние церулоплазмина на эмбриотоксический эффект ионов серебра // Биохимия. 1994, 59, 8: 1164-1173.