Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Совместное участие рецептора церулоплазмина и медьтранспортной АТРазы, продукта гена болезни Менкеса, в связывании церулоплазмина
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Совместное участие рецептора церулоплазмина и медьтранспортной АТРазы, продукта гена болезни Менкеса, в связывании церулоплазмина"
На правах рукописи
р Г Г Л Д
Платонова Наталья Андреевна " "
2 о кл? 2;;03
СОВМЕСТНОЕ УЧАСТИЕ РЕЦЕПТОРА ЦЕРУЛОНЛЛЗМПНА И МЕДЬТРАНСПОРТНОЙ АГРаэы, ПРОДУКТА ГЕНА БОЛЕЗНИ МЕНКЕСА, В СВЯЗЫВАНИИ ЦЕРУЛОНЛЛЗМПНА
03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации ня соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2000 г.
Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики
Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор - академик Б.И. Ткаченко)
Научный руководитель:
доктор биологических наук Людмила Валентиновна Пучкова
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Вадим Петрович Комов
доктор медицинских наук, профессор Владислав Сергеевич Баранов
Ведущее научное учреждение - Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт МЗ РФ
Защита состоится "АО'мирта. в часов на заседании Диссертационного совета по защите кандидатских диссертаций К001.23.01 при Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН но адресу: 193376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН (по адресу: 193376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, д. 12).
Автореферат разослан февраля 2000 г. Ученый секретарь
диссертационного совета К001.23.01 доктор биологических наук
иС^и//' Куликова О.Г.
<у
вм-ц о Р -2,0
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Медь включена в активные центры нескольких десятков жизненно важных ферментов, контролирующих клеточное дыхание, фотосинтез, функционирование центральной нервной системы, формирование соединительной ткани, эрнтроиоэз и другие (Karlin, 1991). Одновременно она является токсичным агентом для всех типов клеток (Mason, 1979). Безопасный круговорот меди в организме млекопитающих осуществляет метаболическая система меди (МСМ). Она состоит из: а) переносчиков, растворимых белков, транспортирующих медь по гидрофильным компартментам организма и клеток, б) транспортеров (насосы и рецепторы), интегральных белков мембран, передающих медь через мембранные барьеры, и 3) регуляторов, факторов, контролирующих активность генов МСМ. Данные о функционировании МСМ на молекулярном уровне, о полном числе ее участников и механизме регуляции отсутствуют.
У млекопитающих МСМ состоит из двух полуавтономных взаимосвязанных тканеспецифических типов: МСМ гепатоцктов и МСМ клеток негепатоцитарных рядов (непеченочные клетки). Пищевая медь, адсорбированная из желудочно-кишечного тракта, в составе комплекса (His)jCu доставляется кровотоком в печень. Перенос ионов меди через плазматическую мембрану гепатоцитов осуществляет специфический транспортер. В гепатоцитах с помощью медьтранспортной АТРазы PI типа, предполагаемого продукта локуса болезни Вильсона (Atp7b), ионы меди метаболически включаются в церулоплазмин (ЦП, медьсодержащий гликопротеин) крови или в ЦП желчи. ЦП крови содержит 95% меди, обнаруживаемой в плазме крови. ЦП желчи секретируется в желудочно-кишечный тракт и вместе с ним выводится часть ионов меди (Verbina, et al., 1992; Пучкова и др., 1994; Seymoor, et al., 1995).
В непеченочных клетках гены ЦП и А1р7Ь не экспрессируются. Единственным источником ионов меди для них является ЦП крови (Linder, et al., 1998), который при передаче ионов меди высоко аффиино связывается со специфическим рецептором интернализирующего типа (Barnes&Frieden, 1984; Пучкова и др., 1990). Показано, что с клеточной поверхностью связывается только интактный ЦП, который после итернализации и пребывания в мембранных пузырьках клетки экскретируется. Освобожденный ЦП содержит меньше атомов меди и быстро выводится из кровотока в желчь через гепатоциты с помощью группоспецифического рецептора для асиалогликопротеинов (Пучкова и др., 1997; Сасина и др., 1998). Атомы меди, лабильно связанные с ЦП, в отличие от его пептидной части, передаются в цитозоль (Harris, 1991). Это свидетельствует о том, что помимо рецептора ЦП, в передаче меди может участвовать также и медьтранспортная АТРаза. Механизм передачи ионов меди в клетки от ЦП остается не известным.
ЦП относится к лолифунккиональиым белкам и одной из его физиологических функций является превращение апо-трансферрина в трансферрин (Cousin, 1985). Мутации в С-копцевом участке молекулы ЦП вызывают нарушение мобилизации железа из клеток. Таким образом, МСМ у млекопитающих тесно связана и с круговоротом железа. Генетические дефекты в МСМ приводят к дефициту или к избытку этих ионов в клетках различных органов, что, в свою очередь, становится причиной развития тяжелых заболеваний (болезнь Менкеса, болезнь Вильсона, детский цирроз, который индуцируется повышенным содержанием меди в пище новорожденных, некоторые типы гемосидероза, а также ряд нейродегенеративных болезней пожилого возраста). Распространенность названных болезней обусловливает актуальность исследования МСМ человека. Цель работы состояла в изучении структуры рецептора ЦП и механизма участия Atp7a в передаче ионов меди, связанных с ЦП.
Для достижения цели были поставлены и решены следующие основные задачи:
1. Методом иммуноскрининга с помощью антител к рецептору ЦП человека из экспрессионной библиотеки кДНК плаценты изолировать и охарактеризовать клон(ы), содержащие участки кДНК рецептора ЦП.
2. Твердофазным методом сшпезировать участки Atp7a, соответствующие нецитозольным петлям, которые, согласно предположению, взаимодействуют или не взаимодействуют с ЦП. Методом фут-принтинга и последующего частичного секвенирования картировать участки ЦП, связывающиеся с синтезированными фрагментами Atp7a. Изучить характер взаимодействия между ЦП и фрагментами Atp7a.
Научная новизна полученных результатов. Впервые получены данные о частичной структуре рецептора ЦП, основанные на анализе его кДНК, выделенной методом иммуноскрининга из экспрессионной библиотеки кДНК плаценты человека. Сравнение установленных последовательностей кДНК рецептора ЦП с базой данных ДНК GenBank по программе BLAST и трансляция их по программе DNASIS показало, что они имеют высокую степень гомологии с ЦП. Вычисленная последовательность фрагмента кДНК, прочитанная в обратном направлении, на 83% гомологична участку ЦП от 1,6Е до Е427. Она содержит 37 замен, 22 из которых - значимые. В рецепторе ЦГ1 сохраняется один из двух сайтов глнкозилирования и все лиганды, образующие мононуклеарный центр для меди типа I, имеющиеся в сравниваемом участке ЦП.
Другой фрагмент кДНК рецептора ЦП (прочитан в прямом направлении) на 76% гомологичен экзону 16 гена ЦП. Последовательность полностью транслируется только во второй рамке считывания. Вычисленная аминокислотная последовательность в базе данных GenBank не найдена. По данным анализа с помощью системы PC/GENE она содержит 1 участок в форме a-спирали из 16 аминокислотных остатков (а.о.) со свойствами трансмембранного домена, который является частью гидрофобного домена.
Методом белкового фут-принтинга установлено, что домен 6 ЦП специфически связывается с синтетическим фрагментом, соответствующим участку Е968-!^980 медьтранспортнон Л'ГРазы Менкеса, который входит в нецитозолъную петлю, прилегающую к медьтрансдуцирующему мембранному домену. Связывание носит насыщающий характер и высоко аффинно (Кл,1с— М).
Родство между рецептором ЦП и ЦП сохраняется в их антигенных свойствах: они перекрестно реагируют со специфическими антителами. Методом иммуноблотинга показано, что антитела к рецептору ЦП не взаимодействуют с доменом 6 молекулы ЦП, место которого, но данным анализа кДНК, занимает гидрофобный домен.
Научно-практическая значимость результатов исследования. Полученные данные вносят вклад в исследования генома человека, функционирование МСМ клеток негепатоцитарных рядов и связи между метаболизмом железа и меди. Данные о структуре фрагмента кДНК рецептора ЦП дают основания отнести рецептор ЦП к группе мембраносвязанных ЦП-подобных белков, которая включает ЦП-подобные мультимедные феррооксидазы, участвующие в переносе ионов железа в клетки. Функциональная связь между ЦП, который, помимо транспорта меди в клетки, осуществляет также мобилизацию внутриклеточного железа, и его специфическим рецептором указывает на возможное участие рецептора ЦП, совместно с ЦП, в метаболизме железа. Таким образом, данные исследования углубляют и детализируют существующие представления о связи между метаболизмом железа и меди, а также роли в ней ЦП и мембранных ЦП-подобных белков.
Представленные в работе доказательства участия синтетического фрагмента А(р7а в связывании ЦП объясняют механизм поступления ионов меди ЦП в цитозоль и подтверждают развиваемое рабочее предположение о координированном участии рецептора ЦП и А1р7а в передаче ионов меди через мембрану.
В целом, результаты исследования могут способствовать понимашпо молекулярных основ болезней, развивающихся вследствие нарушения работы МСМ.
Апробация результатов работы. Результаты исследования доложены на: П-ом Съезде Биохимического Общества Российской Академии Наук, Москва, 19-23 мая, 1997 г. (стендовое сообщение), ХХХШ Международном конгрессе физиологических наук, СПб, 30 июня - 5 июля 1997 г. (стендовое сообщение), 1-ой Медико-биологической конференции молодых ученых Санкт-Петербурга, СПб, 1719 ноября 1997 г. (устное сообщение), Международной конференции по медицине для молодых ученых, Люблин, Польша, 24-26 апреля, 1998 г. (стендовое сообщение), Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», посвященной 240-
летию ММА им. И.М. Сеченова, Москва, 26-30 апреля 1998 г. (устное сообщение), XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, СПб, 25-29 мая 1998 г. (стендовое сообщение), Международном симпозиуме по структуре, стабильности и фолдингу белков, Москва, 22-26 июня 1998 г. (стендовое сообщение), 25-ом юбилейной конференции ФЭБО, Копенгаген, Дания, 5-10 июля 1998 г. (устное сообщение), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 21-25 сентября, 1998 г. (устное сообщение), 10-ой Европейской конференции молодых ученых по биологии и медицине, Берлин, Германия, 20-24 октября, 1999 г. (устное сообщение), 2-ой съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, СПб, 1-5 февраля 2000г. (устное сообщение). В рецензируемых журналах по результатам работы опубликованы 3 статьи. Основные положения, выносимые на защиту
1. Рецептор ЦП является мембранным ЦП-подобным белком.
2. Участок Atp7a, соответствующий последовательности S68E- 980R нецитозолькой петли, прилегающей к мембранному домену, образующему медьтрансдуцирующий канал, специфически и высоко аффинно взаимодействует с доменом 6 зрелой молекулы ЦП.
3. ЦП, рецептор ЦП и Atp7a содержат родственные антигенные детерминанты. Структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах, состоит из глав; введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение исследований, заключение, выводы. Работа содержит 22 рисунка, 8 таблиц и 6 схем. Список литературы содержит 198 названий работ на русском и английском языках.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы. В работе использованы: свежая эритроцитарная масса человека (станция переливания крови №1, СПб); электрофоретически чистый препарат ЦП крови человека (Абюаво = 0.046), произведенный в Институте микробиологии им. Пастера МЗМП РФ по технологии, разработанной в Отделе молекулярной генетики НИИЭМ РАМН д.м.н. М.М. Шавловским; культура клеток фибробластов человека (линия НТ-1080, предоставлена банком клеточных культур Института цитологии РАН, СПб); клетки линии HepG2, (предоставлена Отделом биохимии НИИЭМ РАМН); кролики породы Шиншилла, полученные из питомника «Раплолово». Экспрессионная библиотека плаценты человека в векторе XgtH предоставлена проф. Н.В. Томилиным (Институт цитологии РАН, СПб). В работе использованы штаммы Е. coli Y1090 и DH5-a, плазмидный вектор pTZ19. Рестрикционные эндонуклеазы KcoRl и HindlH, панкреатическая РНКаза А, ДНКаза, ДНК-лигаза фага Т4, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 - фирмы «Amersham», Англия; агароза типа V, легкоплавкая агароза, агар, компоненты для среды культивирования микроорганизмов, реактивы для электрофореза - фирм «Sigma», США, «ISN Flow», ' Швеция, и «Sevva», Германия, сефароза 2В - фирмы
«Pliannacia», адыовант Фройнда - фирмы «Difco». Все неорганические соли -фирмы «Merck», Германия. Нитроцеллюлозныс мембраны, диаметр пор 0.45 мкм, мембраны тина «Immobilon» - фирмы «Schlicher and Scliuli», Германия; стеклофильтры GF/A - фирмы «Whatman», Англия. Вторые антитела, копъюгированные с пероксидазон, произведены в Институте вакцин и сывороток МЗМП РФ, СПб. Радиоактивные изотопы [a-"P]dATP, [а-"Р]с/АТР - АО «Изотоп», СПб. Рентгеновская пленка фирмы «Fuji», Япония. 2.2. Методы. Рецептор ЦП и антитела к нему получали как описано ранее (Пучкова н др., 1990). Пептиды, соответствующие различным участкам Atp7a, синтезированы в Лаборатории К» 4 ИБС РАН, СПб. Пептиды синтезировали твердофазным методом на носителе бензгидриламинополистироле с использованием BOC/Bzl-стратегии и очищали методом ОФ ВЭЖХ на градиентном хромато1рафе фирмы «Waters», модель 600 (США). Соответствие синтезированных пептидов заданным параметрам устанавливали путем определения их аминокислотного состава с помощью аминокислотного анализатора «Amino Acid Analyzer Т339М», фирмы «Mikrotechna», Чехия. Массы пептидов определяли методом масс-спектроскопии на масс-рефлектоне с источником ионов типа «Электроспрей» в ФИНЭПХФ РАН, СПб. Получение коньюгатов пептидов с гемоцианином камчатского краба проводили с помощью глутарового альдегида по методике, разработанной в Отделе молекулярной генетики НИИЭМ РАМН д.м.н. М.М. Шавловским. Коньюгаты пептидов с сукцинилированным BSA (бычий сывороточный альбумин) проводили по методике, разработанной Г. А. Панковой в Лаборатории № 4 ИВС РАН.
Связывание ЦП с пептидами в различных молярных соотношениях осуществлялось в течение 10 часов irpn 0°С, смесь обрабатывали 10 мин при комнатной температуре системой окисления, катализируемой металлом (СОКМ, 1 мМ FeS04, 20 мМ аскорбиновая кислота, 2 мМ ЭДТА и 1 мМ Н202 в буфере MOPS, рН 7.2). Реакцию останавливали добавлением 3-меркаптоэтанола до конечной концентрации 10 % или смесью 16% SDS и 8% (З-меркаптоэтанола в буфере для электрофореза (Heyduk&Heyduk, 1993). Полученные фрагменты анализировали методом электрофореза в ПААГ-SDS (Laemmli,1970) или в ступенчатом (10-16.5%) градиенте ПААГ-SDS в трициновой системе буферов с последующим переносом пептидов на мембраны типа «Immobilon». Пептиды также разделяли методом ОФ ВЭЖХ на колонке Aquapore RP-300 размером 4.6 х 220 мм («Applied Biosystems», США), в градиенте концентрации ацетонитрила (5-75%), растворенного в 0.1% трифторуксусной кислоте. Частичная аминокислотная последовательность в пептидах устанавливалась методом автоматического секвенирования по Эдману на пептидно-белковом секвенаторе в Лаборатории химии белка Института молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН, Москва.
Иммобилизацию пептида и аффинную мембранную хроматографию проводили в Лаборатории № 4 ИВС РАН. Синтезированный пептид был
иммобилизован (3.0 мкМ пептида на диск размером 25x2 мм2, объемом 1 мл, средний размер пор 800 нм) на макропористый диск монолитного типа (фиксирован в специально сконструированном картридже фирмы «Saulentechnik Knauer GmbH», Германия) на основе сшитого этилендиметакрилатом глицидилметакрилата методом радикальной сополимеризации (Tennikova, et at., 1993). Для проведения аффинной мембранной хроматографии была использована инструментальная система фирмы «LKB Bromma». Через диск адсорбировали растворы ЦП различной концентрации в элюирующем 0.01 М натрий-фосфатном буфере, pH 7.0, содержащим 0.15 М NaCl. После стадии промывки этим же буфером, осуществляли десорбцию ЦП, связанного с лигандом, 0.01 N HCl. Полученные результаты обрабатывали графическим методом. Константу диссоциации рассчитывали по линеаризированному уравнению Ленгмюра (Langlotz, et al„ 1992).
Иммуноблотинг белков проводили по методу Beisiegel et al., 1982. Для детекции иммунного ответа использовали «вторые» антитела козла к иммуноглобулинам кролика, коньюгированными с пероксидазой хрена.
Иммунологический скрининг экспрессионной библиотеки кДНК плаценты человека в векторе Xgtll, выделение ДНК фага Xgtll и плазмидной ДНК, субклонирование кДНК рецептора ЦП в плазмидный вектор pTZ19, Southern - и Northem-блотинг, спектрофотометрическое определение концентрации нуклеиновых кислот проводили по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984). Позитивные иммунологические ответы выявляли с помощью «вторых» антител козла к иммуноглобулинам кролика, коньюгированных с пероксидазой хрена, или радиоиодированных химическим методом. Препараты ДНК анализировали с помощью гель-электрофореза в 0.8% агарозе (Маниатис и др., 1984). Выделение полирйбосомиой РНК (прсРНК) осуществляли методом лизирования-переосаждения фракции полирибосом в эквнмолярной смеси 8.0 М LiCl-мочевина (Rhoads, 1975). Анализ полученного препарата РНК проводили методом гель-электрофореза в 1% агарозе в присутствии формальдегида (Маниатис и др., 1984). [32Р]ДНК-зонды получали с помощью реакции статистического праймирования с использованием набора «Multiprime DNA labeling system» фирмы «Amersham», Англия. ПЦР-анализ фаговой ДНК проводили в лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН с использованием набора фирмы «Gibco», Германия. Анализ первичной структуры ДНК проводили с использованием набора ofmol® DNA Sequencing System» фирмы «Promega», США.
Концентрацию меди измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и Зеемановской коррекцией неселективного поглощения на спектрометре фирмы «Perlon-Eimer», модель 4100ZL(CI1IA).
Компьютерный анализ нуклеотидиых и аминокислотных последовательностей проводили с помощью программы BLAST в базах данных
Genbank и SW1SSPROT. Транслирование нуклеотидных последовательностей осуществляли по программе DNASIS. Анализ аминокислотных последовательностей выполнен на кафедре биофизики СИбГГУ с помощью пакета программ PC/GENE и BlOh
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Вьшеленне кДНК рецептора ЦП и се частичная характеристика. Из
эритроцитарной массы человека был выделен электрофоретнчсски чистый препарат рецептора ЦП, к которому по данным ракетного иммуноэлектрофореза были получены специфические антитела. Антитела к рецептору ЦП выявляли единственный белок в составе плазматической мембраны фибробластов человека (Сасина и др., 1998) и были использованы для иммуноскрининга экспрессионной библиотеки кДНК плаценты человека в векторе Xgtl 1.
При первоначальном скрининге было выявлено 3 положительных иммунологических сигнала. Один из этих клонов был трижды реклонирован до соответствия количества фягоспецифических пятен количеству позитивных иммунологических ответов на мембране. В результате была получена фаговая культура, образующая бляшки, дающие иммунологический ответ по всему газону чашки. Длина цитоплазматического иммунореактивного полипептида составляла примерно 100 кДа. Максимальный размер ПЦР-продукта фаговой ДНК выделенного клона соответствовал примерно 3.15 т.п.н. ПЦР-фрагмент ДНК, содержащий 3.15 т.п.н., был элгоирован из агарозного геля и использован в качестве матрицы для приготовления [,2Р] ДНК-зонда. Northern-блотинг прсРНК из клеток HepG2 н плаценты человека с [32Р]ДНК-зондом выявил специфические транскрипты только в составе прсРНК плаценты, длина которых соответствовала 8.2 т.н. Полученные результаты полностью согласуются с данными, что ген рецептора ЦП не экспрессируется в клетках печени (Kataoka, et al., 1984).
EcoRI-гидролизат рекомбинантной фаговой ДНК был субклонирован в плазмидный вектор pTZ19. Из нескольких рекомбннантных клопов был выделен клон, pCpRl, который в составе плазмидного вектора pTZ19 содержал вставку длиной 2.3 т.п.н., предположительно являющейся фрагментом кДНК рецептора ЦП. Так как наиболее протяженные продукты ПЦР (>3т.п.н.) превышают размер переклонированной вставки, можно предположить, что внутри вставки клонированной кДНК содержится не менее одного сайта для рестрикционной эндонуклеазы EcoRl.
ДНК клона pCpRl была подвергнута секвенированню. Секвенирование проводилось в прямом и обратном направлении. На рис. 1 представлены схема положения секвенированных участков кДНК клонированной вставки и установленные нуклеотидные последовательности. Компьютерный анализ, проведенный с помощью программы BLAST в базе данных GenBank, показал, что обе последовательности имеют высокую степень гомологии с кДНК ЦП человека.
А: - 2300 п.н. -
|-1---1-1
фрагмент 2 (638 п«н«) фрагмент 1 (257 п*н.)
плечи
н
вектора 1-+77 И<—1
212 468 640
гомологичные |-1-1--1 |—| |-1
ЦП участки 4 экзон 5 экзон бэкзои 7экзон ¡5 экзон 16 экзон
78—>716 245^-235 2064-12
участки, не имеющие гомологии с ЦП н и
268<-246 234<-207
Б:
Фрагмент 1:
СОАСООССАТО/^ГГССТСОТТОТОАСТТТОТТТАСТТТСТСАОШТОАТСАОАОТАТОТАТТАТОТТАТСАТСТА.\ОТАССААОАТ
ТСАГГСТСАТСАААТАСТАОАААСААААОСОААААТСССАТТТТОСТГТТТАООАТТОААТАСТТТСАСАТАСАТТТСОСАСАТСА
ТССТАТАОСАСТТАСОАТСТАСТСАТСАОТОТАТАССАТОТАСОТАТСТСТСАСАСТАСТСТТСАТОСАТАТАТАТСАТАСТСАСТ
(ЗСАСТААТС
Фрагмент 2:
СТААТАСОАСТСАСТТАОШАААОСТАТОСАТОССТССАОСТСОАСТСТАОАООАТССССООТАСОААОСТСОЛ47ТСОТАСТСА
ТСТТСТСТСТСОТСОАТСААААТСТСАССТШТАТСТАОААОАТААСАТСААААССТТСТОСТСТСААССАОАОАААОТСОАТАА
АОАСААТСААОАСТТССАСОАААССААСАСОАТСТАСТСТАТАААТСОАТАТАСАТТТСОААСССТСССАОСОСТСТСОАТСТОТ
ОСАОААОАСАОАОТСААОТСОТАССТТТТТСООАТСОШААТСААОТТСАСОТССАТТСАССОСТСТТТСАТССТТСААОСССТО
АССАОСААОААСТАТСАТАСТОАААТААТСААССТОТТСССТСССАСТСТААТТСАТОТТТСТАТООТСЮСССАСААТССТСОАОТ
СТООАТОСТСАОТТСССАСААССТОААССАТСТОААА(КТООТТТССАСОССТТТТТССАСОТТСОТОАСТССААСААССССТСАС
СССАСОАСОЛТАТССААОАСАОАСАТОЮАОАСАТТАТТАСАТСОСТОССОАООАСАССАТТТОООАСТАТОСТССОТСТССЮАС
АСАСАССТТСАСТООАОАСААСТТААССАОТСТС<ЗО.ЛАСТОАТТСААС<ЗСТАТТТТТТОАОСААСОТОСТАСААОААТТССТС<ЗС
ТСТТАТАААААААТТСОТТТАТСОТОАОТО
Рис. 1. А. Схема расположения секвенированных участков кДНК в рСрШ. Вьщелены секвенированные последовательности. Б. Частичная нуклеотидная последовательность кДНК рСрШ. Курсивом показан ЕсоЩ сайт.
Фрагмент 2 включает 77 п.н., полиостью соответствующих плечу плазмиды, и 638 п.н. на 81% гомологичных участку с 4 но 7 экзон кДНК ЦП (табл. 1). По программе DNASIS последовательность транслируется в единственной рамке считывания (рис. 2, А). Вычисленная аминокислотная последовательность на 83% идентична последовательности ЦГ1 на участке IU,E - в который частично входят домены 2 и 3 ЦП. Замены в 63 кодонах не привели к замене аминокислот (табл.1). Измененными оказались 37 а.о., из которых 22 замены - значимые. Положение оставшихся 175 а.о. идентично в обеих полипептидных цепях. Сравниваемый участок ЦП содержит два сайта гликозилироваиия 358N и 397N. В рецепторе ЦП сохраняется только второй из них.
Аминокислоты, являющиеся лигандамн (295Н, 338С, 343Н и 348L) атома меди типа 1 мононуклеарного центра, который расположен в домене 2 ЦП, консервативны в рецепторе ЦП (рис. 2, А). Формальный анализ вторичной структуры фрагмента ЦП, в который входят а.о., создающие этот мононуклеарный центр, и гомологичного ему участка рецептора ЦП, выявил высокое сходство между ними (рис. 2, Б). Показано, что все известные мембранносвязанные ЦП-подобные ферроксидазы содержат центр связывания меди именно такого типа, а замена остатка лейцина в нем приводит к утрате ферроксидазных свойств (Askwith&Kaplan, 1999). В целом, данные позволяют предположить, что в рецепторе ЦП может сохраняться мононуклеарный медьсвязывающнй сайт, придающий рецептору ЦП феррооксидазные свойства.
Фрагмент 1, имеет участок, сходный на 76% экзону 16 ДНК ЦП (194 п.н.) и на 81% экзону 15 (10 п.н.). Его транслирование по программе DNAS1S выявило единственную аминокислотную последовательность, которая не имеет сходства с участком ЦП, кодируемым фрагментом кДНК, проявляющим гомологию с кДНК рецептора ЦП, и не имеет ни одного гомолога в базе данных. Эта новая аминокислотная последовательность по гидрофильной шкале Hoop и Woods содержит гидрофобный участок из 27 а.о. (рис. 3). В составе г идрофобного участка теоретически присутствует предсказанный но методу Rao и Argos (программа PC/GENE), трансмембранный домен из 16 а.о.
Полученные данные позволяют построить линейную карту полипептидной цепи рецептора ЦГ1 и предположительно локализовать на ней идентифицированные участки рецептора ЦП (рис. 4). Размер вставки кДНК рецептора ЦП в фаге Xgtl 1 составлял 3.15 т.н.н. Это достаточно, чтобы кодировать полипептидную цепь, состоящую примерно из 1050 а.о. При субклонировании вставки в плазмидяый вектор pTZ19 ее длина укорачивается на 850 п.н.. Секвенированне субклонированного участка кДНК рецептора ЦП, показало, что он не содержит ни старт-кодона, ни стоп-кодона. Поэтому нельзя исключить, что первоначально вставка содержит два EcoRl-сайта, которые фланкируют участок длиной 2.3. т.п.н. В этом случае переклонирование неизбежно приведет к утрате обоих маркирующих кодонов. Утраченный при переклонировании фрагмент кДНК
А 216 280
ЦП EFVVMFSVVDENFSWYllEDNIKTYCSEPEKVDICDNEDFQESNRMУSVNGУTFGSLPGLS^lCAEDR Рецептор ЦП
---О--------о----------♦----------------------0------------------
281 345
VKWYLFC24GNEVDVHSALFHGQALTSKHYЯTEIXra,FPATLIDVSMVAQNPGVV№SCQNШHI^
----------------------0---♦♦о*--------о-оо-------♦------------
346 I 1 410
AGÍ^AFFQV^EC^^SSKDNIRGKHVRHYYIAAEEIXWNYAPSGIDIFTKEЙLÍAPGSDSAVFFE
АС1^АГЕ0УЕБаЖР5РОВО10ОКНУКНУУ1ААЕЕТ1ТОУАРЗСТЛТГТСЕ|^ЗЬСЗОЗКУГГЕ ---------♦„---------------------------♦----
411 427
ОсттиюсвугааутаЕ
ОСАТЮ:ССЗУКК1вЬ8Е Б ---------офоф-
1 2
Рис. 2. А. Сравнение аминокислотных последовательностей ЦП и рецептора ЦП.Оттенены аминокислоты, которые являются лигандами атомов меди типа I мононуклеарного медьсвязывающего центра; (-) - идентичные аминокислоты, ♦ - гомологичные замены, (в) - значимые замены сайт гликозилирования. Б. Вычисленная вторичная структура 58 а.о., образующих мононуклеарный медьсвязывающего центр в домене 2 ЦП (1) и гомологичного ему участка в рецепторе ЦП (2).
Таблица 1.
Сравнение участка рецептора ЦП с гомологичным фрагментом ЦП
Параметр сравнения Рецептор ЦП ПреЦП
Длина сравниваемых участков 638 п. н. 638 п.н.
Локализация участка в кДНК 1-638 пл. в клоне рСрЯ1 Т - А, 4 - 7 экзоны 5' (-41); 3' (-65)
Число нуклеотидных замен 110 -
% идентичности 81.2 -
Число синонимических замен 63 -
Длина кодируемой цепи 212 а.о. 212 а^./^Е - Е427
Число аминокислотных замен 37 -
Число эквивалентных замен 15 -
Число значимых замен 22
Сайты гликозилирования 182Ы 35814; 397N
Медьсвязывающий центр 80Н; 123С;128Н;133Ь 295Н;338С;343Н;348Ь
А. 1 - 50
хрясоругеьяужуамьззкудозРЗЗотякккЕКР^ьрШЕУРнт
Рис. 3. А. Вычисленная аминокислотная последовательность фрагмента 1 рецептора ЦП.
Б. Гидропатический профиль последовательности. Положительные значения относятся к гидрофильным аминокислотам, отрицательные - к гидрофобным.
рецептора ЦП (850 п.п.) способен кодировать полннепгид, состоящий примерно из 283 а.о. Вероятно, что из них около 216, включающие сигнальный пептид, приходятся на N-конец рецептора ЦП (если допустить, чго рецептор ЦП полностью гомологичен ЦП, как другие ЦП-подобные мембранносвязанные ферроксидазы). Оставшиеся -67 а.о., по-видимому, должны составлять ориентированный в цитозоль С-коиец, следующий за трансмембранпым доменом. В субклонированном фрагменте кДНК секвенированные участки разделены примерно 1.4 т.п.н., нуклеотидная последовательность которых не установлена. Их достаточно, чтобы кодировать около 470 а.о. Примерно столько же а.о. расположено в молекуле ЦП между 427Е и первой аминокислотой домена 6 (907V). Таким образом, молекула рецептора ЦП схематично может бьпъ представлена (рис. 4) в виде молекулы, близкой по длине молекуле ЦП, у которой на N-конце расположен протяженный участок высоко гомологичный, но не полностью идентичный, доменам с 1-5 ЦП, а на С-конце вместо домена 6 расположен гидрофобный пептид, содержащий трансмембранный домен. Представленные данные о структуре молекулы рецептора ЦП позволяют отнести его в одну группу с другими мембранными ЦП-подобными гликопротеинами. Эго семейство включает мультимедные феррооксидазы дрожжей и млекопитающих (Vulpe, et al.. 1999; Askwith&Kaplan, 1999; Reilly, 1998; Patel, et al., 1997). Рецептор ЦП структурно сходен с ЦП-подобными мембранными медьсодержащими феррооксидазами дрожжей и млекопитающих, функции которых тесно связаны с круговоротом железа. Сходство рецептора ЦП с этими белками указывает на возможную его роль в метаболизме железа.
3.2. Изучение взаимодействия ЦП с фрагментами Atp7a. Согласно модели Atp7a (рис. 5) в связывании с ЦП могут принимать участие нецитозольные участки белка. Твердофазным методом синтезирована последовательность Р16
('"ETYFPG YN RSIS RTET*"
), соответствующая участку нецитозолыюй петли Atp7a, которая расположена между 3 и 4 трансмсмбранными доменами и прилегает к мембранному домену, содержащему СРС-мотив и образующему медьтранедуцирующий канал. В качестве менее вероятного места связывания ЦП с Atp7a был выбран участок Р15 ("'FYIQAYKALKHKTAN745) нецитозолыюй петли между I и 2 трансмембраш1ыми доменами. Оба синтезированных пептида были испытаны на способность защищать молекулу ЦП от расщепления. Методом белкового фут-принтинга, используя систему окисления, катализируемую металлом (СОКМ), которая продуцирует радикалы, разрушающие белки, показано, что только у ЦП, инкубировавшегося с пептидом Р16 Atp7a, остается защищенным 19 кДа фрагмент (рис. 6). Видно, что количество защищенного пептида пропорционально количеству добавленного Р16. Прямое секвенирование защищенного участка, перенесенного на мембрану типа «Immobilon», установило последовательность аминокислот VFNPRRK.L, соответствующую участку домена 6 зрелого ЦП, начинающегося с 888V.
1050 а.о.
Рис. 4. Схема полипептидной цепи рецептора ЦП. Оттенены идентифицированные участки.
медьсвязывающий мононуклеарный центр, V - сайт гликозилирования.
нн,
^ 2 Фосфатазный домен-—,
Домен фосфорилирования /
Медьсвячывающие ___
сайты
>'• мембрана
Связывание ЛТР
С ООН
N
Р15 Р16 Трансдукция
Рис. 5. Модель Л|р7а [Уи1ре, е! а!.. 1993]
132кДа-> • ,' ' 1
- ; ' v ' .. ■ г - ■»".;..
mm ' ■ ! i -' i и
«г 1 ' ' 1 'уз *
43 кДа-)- , л 4 1
19 кДа-> ...... г
1 2 3 4 5 6 Рис. 6. Электрофорез продуктов расщеплеиия ЦП в 7.5 % ПААГ-SDS. Дорожки: 1 - спонтанные протеолитические фрагменты ЦП, образующиеся при обработке ЦП денатурирующими агентами; 2 - ЦП, обработанный СОКМ; 3 -смесь ЦП и Р15 (1:60), обработанная СОКМ; 4-6 - смесь ЦП и Р16 (1:30, 1:60 и 1:90, соответственно), обработанная СОКМ. Стрелкой отмечено положение маркеров.
А,-
в;>еыя, мял
Рио. 7. ОФ ВЭЖХ продуктов расщепления комплекса ЦП - Р16.
--продукты осадка, растворенного в 5.0 М гуаниднихлорнде,
........продукты супернатанто,
--- изменение концентрации ацетоннтрила в элюирующем буфере
ОФ ВЭЖХ продуктов расщепления комплекса ЦГ1-Р16 в соотношении 1:60 показала, что образовавшийся в процессе реакции осадок, который был растворен в 5 M гуанидин хлориде, представлен 9 пиками (рис. 7). Только в двух из них (пики 6 и 7) обнаружены полипептиды. Во фракции, соответствующей пику 7, обнаружен единственный полипептид с молекулярной массой 18.6 кДа. Во фракции, соответствующей пику 6, обнаружены три пепт ила: преимущественный, с Л/=18.6 кДа, и два пептида с молекулярной массой примерно 20 и 30 кДа, содержащиеся в следовых количествах. Пептид с М~18.6 кДа по данным секвенирования на N-конце содержит последовательность FLVFDENSW, которая соответствует фрагменту ЦП, начинающегося с а.о. 900 зрелого ЦП. При хроматографии супернатанта выявлен только одни пик, в котором обнаружен полипеитид с М= 1.5 кДа (рис. 7). Прямое секвенирование показало, что этот пептид содержит последовательность ETYFPGYN, которая соответствует Р16 Atp7a. Молекулярная масса полноразмерного интактного PI6 равна 1.9 кДа, после фут-приптинга она снижается примерно на 400 Да. По-видимому, в процессе радикального расщепления удаляются три С-концевых а.о., которые не участвуют в связывании с ЦП. Приблизительные расчеты площади хроматографических пиков защищенных фрагментов ЦП и Р16 (рис. 7) позволяют считать, что I молекула ЦП связывается с I молекулой Р16.
Приведенные данные показывают, что PI6 защищает от разрушения фраг мент домена 6 ЦП, который почти в 10 раз превышает его длину (остатки 9001046 зрелой молекулы ЦП). По данным рептгеноструктурного анализа (Zaitseva, et al., 1996) домен 6 в молекуле ЦП плотно упакован в Р-слои, устойчивые к действию различного рода расщепляющих полипептидную цепь агентам, и имеет единственную выступающую петлю, которая образована а.о. 900-945. Эта петля имеет форму helix-loop-helix, которая наиболее чувствительна к СОКМ. Вероятно, что 13-членная N-концевая последовательность PI6 Atp7a, взаимодействуя с этой петлей, в целом стабилизирует структуру домена 6. Поэтому в условиях данного опыта защищенным остается относительно автономный домен 6 ЦП.
В специальной серии опытов изучали влияние Р15 и Р16 на прочность связывания атомов меди, входящих в активные центры ЦП. ЦП связывали с Р15 или Р16, и затем комплекс обрабатывали твердым хелатирующим агентом Хслекс-100. После удаления Хелекса-100 определяли концентрацию меди. Результаты показали, что обработка Хелексом-100 как исходного препарата ЦП, так и комплексов Р15-ЦП и Р16-ЦП, приводит к удалению только двух атомов меди на I молекулу ЦП. По-видимому, 6 атомов меди, входящие в акгивпые центры, остаются связанными с ЦП. Это хорошо согласуется с наблюдениями, что ЦП, экскретируемый в желчь после освобождения из непечеиочных клеток, обладает оксидазной активностью (Verbina et al., 1992).
С помощью аффиной хроматографии на макропористом диске монолитного т ипа с иммобилизованным Р16 была определена константа диссоциации для
взаимодействия ЦП с Р16 (рис. 8). На рисунке видно, чго ЦП связывается с Р16 (рис. 8, Л). Форма изотермы адсорбции имеет насыщающий характер (рис. 8. fi). Графическое определение Кл1|с было проведено с использованием линеаризированного уравнения Ленгмюра. Экспериментально вычисленная К„„с для взаимодействия PI6 и ЦП равна 1.5-К)'' М. Приведенные данные позволяют заключить, что Р16 специфично и вмсокоаффинно связывается с петлей домена 6 ЦП. Возможно, in vivo это взаимодействие может приводить к передаче лабильных ионов меди ЦП в клетку.
АТРазы Р1 типа, к которым принадлежит Atp7a, широко распространены в природе и встречаются у организмов разных филогенетических ipyiiu. Все они высоко гомологичны между собой, что свидетельствует об их эволюционной консервативности. Поиск последовательностей, гомологичных Р15 и Р16 Atp7a, проведенный в базах данных GenBank и SW1SSPROT, выявил, что пептид Р15 находится в АТРазах многих организмов, а Р16 только в Atp7a тех организмов, которые используют ЦП в качестве источника ионов меди для непеченочных клеток, то есть у позвоночных. Вероятно, что участок АТРазы Менкеса, соответствующий Р16, можно отнести к функциональному специфическому экстрацеллюлярному домену Atp7a позвоночных.
3.3. Выявление иммуиого сходства между penenгорм ЦП, ЦП и Д(р7а.
Основанием для изучения иммунологического сходства между ЦП, рецептором ЦП и Atp7a, как участниками переноса меди в клетки, послужили следующие данные и соображения. Так, ранее было установлено, что антитела к ЦП и рецептору ЦП перекрестно взаимодействуют с этими белками (Пучкова и др., 1990). Природа этого иммунологического сходства стала ясной в результате сравнения двумерных пептидных карт ЦП и рецептора ЦП (Пучкова и др., 1990), а также установления частичной первичной структуры кДНК рецептора ЦП (данное исследование). К тому же, когда планировалась эта работа, появились данные клонирования Atp7a (Vulpe, et al., 1993), допускающие, что рецептор ЦП, о первичной структуре которого не было данных, и Atp7a являются одним и тем же белком. Для проверки такого предположения были синтезированы Р15 и Р16, к ним получены специфические антитела, которые использовали для определения идентичности электрофоретически чистого препарата рецептора ЦП и Atp7a. Иммунодот-анализ продемонстрировал, что антитела к Р15 и к Р16 соответственно специфичны к комплексам BSA-P15 и BSA-P16 (рис. 9, А и В: 1-3) и к гемоциашшу (рис. 9, А и В, 4). Они не взаимодействуют перекрестно между собой (рис. 9, А и В, 2-3). В то же время, с комплексом BSA-P16 связываются антитела к рецептору ЦП (рис. 9, А, 5), а с рецептором ЦП взаимодействуют антитела к Р16, но не к Р15 (рис. 9, А и В, 5). С лизатом фибробластов взаимодействуют все три типа антител (рис. 9, А-С, 6). Результаты полностью согласуются с данными о том, что в фибробластах одновременно экспрессируются гены рецептора ЦП и А1р7а. Напротив, с лизатом мембран эритроцитов (рис. 9, А-С, 8) взаимодействуют только антитела к Р16 и к
время, мин
В
1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
0,4 0,8 1,2 концентрация ЦП, мг/мл
1,6
у = 1,1324х + 0,2075 1,5 '
-0,50 0 0,5 1,0 1,5 концапрпция 1111 (с), мг/мл
Рис. 8. Изучение кинетики взаимодействия между ЦП и Р16 А1р7а. А: Хроматограмма ЦП на макропористом диске с иммобилизованным Р16. Скорость потока элюента при адсорбции и десорбции была постоянной и соответствовала 2 мл/мим.
Б: Изотерма адсорбции ЦП на диске с иммобилизованным Р16. Ч - количество ЦП, адсорбированного на диске мг/мл диска. В: Графическое определение К„„с для взаимодействия Р16 и ЦП.
i.
тж?
О ¡'I© ' 7 8
¡¡г» ' ' •■:;.'" *vJ" ...
. - : . <. ..... ' - t.'.' Рис. 9. Анализ специфичиости антител, полученных к фрагментам Atp7a. Столбцы: 1 - BSA, 4 мг/мл, 2 - В8А-Р16-коныогат, 4 мг/мл, 3 - BSA-P15-коньюгат 4 мг/мл, 4 - гемоциашш, 4 мг/мл, 5 - рецептор ЦП, 0.1 мг/мл, 6 - лизат клеток фибробластов, 30 мг/мл, 7- ЦП, 4 мг/мл, 8 - лизат мембран эритроцитов, 30 мг/мл. Строки: А —антитела к Р16, В - антитела к Р15, С - антитела к рецептору ЦП.
1 2
Г--?.
!*»»» <-130 Кда
v'.SvVj
Мз '¡;f
8
<-67 Кда
U'-ïm': fêtf
»7,1А / , 10 11
6 7
Рис. 10. Взаимодействие ЦП, рецептора ЦП и лизатов клеточных мембран с антителами к рецегггору ЦП, к Р16 и Р15.
1 - препарат ЦП, денатурированный в присутствии 2% SDS кипячением в течение 5 мин; + антитела к Р16: 2 - препарат ЦП, не подвергшийся тепловой обработке, + антитела к Р16; 3 - рецептор ЦП, 4 - рецептор ЦП + антитела к Р16, 5 - рецептор ЦП +антитела к Р15; 6- фибробласты + антитела к Р16, 7 - фибробласты +антитсла к Р15, 8 - фибробласты + антитела к рецептору ЦП; 9 - мембраны эритроцитов + антитела к Р16, 2 - мембраны эритроцитов + антитела к Р15, 3 - мембраны эритроцитов + антитела к рецептору ЦП.
\
рецептору ЦП, который получен из мембран эритроцитов. "Гак как антитела к Р16 перекрестно связываются с рецептором ЦП, можно заключить, что мембрана эритроцитов не содержит Atp7a. Как видно, ЦП, помимо взаимодействия с антителами к рецептору ЦП, связывается с антителами к Р16, но не к Р15 (рис. 9, Л-С, 7). Примечательно, что и ЦП, и рецептор ЦП взаимодействуют только с антителами, полученными к участку Atp7a, который функционально связан с метаболизмом меди. Более детальное изучение перекрестного взаимодействия специфичных антител с белками МСМ полностью подтвердило данные, представленные на рис. 9, для рецептора ЦП, лизата мембран эритроцитов и лнзата фибробластов (рис. 10, 3-11). В то же время денатурированные препараты ЦП не взаимодействуют с антителами к Р16, но сохраняют способность связываться с антителами к рецептору ЦП (рис. 10. 1-2). Сходство между участком Р16 и ЦП, возможно, ограничивается существованием на поверхности глобулы ЦП сходного с Р16 пространственного эпитопа.
Иммунологическое сходство рецепюра Ц11 и Р16, очевидно, является следствием структурной гомологии, возможно, существующей между этими белками и пока не выявленное. Возможно, что при установлении полной структуры рецептора ЦП такое сходство будет подтверждено. В пользу этого свидетельствуют данные, что белок FET3, ЦП-подобная мембранная ферроксидаза дрожжей, имеет гомологию не только с ЦП, но и с медьтранспортной АТРазой прокариот типа СорА, которая сходна с Atp7a.
На основании представленных данных степень родства между ЦП, рецептором ЦП и Atp7a может быть признана высокой, несомненной н физиологически значимой только для пары ЦП - рецептор ЦП. Так как для пар ЦП-Р16 и рецептор-Р16 данные получены на изолированных белках или их фрагментах, невозможно установить имеет ли это сходство функциональное значение. Нельзя исключить, что последовательность, сходная с Р16, в рецепторе ЦГ1 есть, но она расположена таким образом, что никогда не оказывается в одном компартменте с участком Atp7a, который соответствует Р16.
В целом результаты исследования позволяют считать, что рецептор ЦП и Atp7a принимают участие в переносе лабильных атомов меди ЦП в клетки негепатоцитарных рядов. Вероятно, что ЦП и рецептор ЦП являются родственными белками, возможно, имеющими общий предковый ген.
4. ВЫВОДЫ
1. Из экспрессионной библиотеки кДНК плаценты человека выделен клон, содержащий участок кДНК предполагаемого рецептора ЦП. Определение последовательности клонированного фрагмента кДНК рецептора ЦП выявило высокую гомологию рецептора ЦГ1 и ЦП. В рецепторе ЦП обнаружен гидрофобный участок, теоретически содержащий трансмембранный домен. Рецептор ЦП относится к семейству мембранных ЦП-подобных белков.
2. 16-членный пептид, соответствующий последовательности ""BTYKPGYNRSISRTET9" нсцнгозолыюй петли Atp7a, прилегающей к мембранному домену, образующему меды ране ду пирующий канал, специфично и вмсокоаффипно взаимодействует с доменом 6 зрелой молекулы ЦП.
3. ЦИ, рецептор ЦП и Atp7a содержат сходные антигенные детерминанты, что, возможно, отражает их совместное участие в транспорте меди в клетки негенатоцитарных рядов.
5.СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи:
1. Пучкова Л.В., Сасина ЯК., Цымбаленко НВ., Воронина О.В., Платонова Н А., Мокшина С В., Скворцова Н.Н, Власов Г.П., Егоров Ц.А., ГаГщхоки B.C. К предполагаемой роли рецептора церулоплазмина и медьтранспортной АТРазы Менкеса в метаболизме меди у млекопитающих. Молекулярная биология, 1999, 33, №2, 287-291.
2. Пучкова Л В., Алейникова Т.Д., Бичевая U.K., Мокшина С В., Платонова НА, Сасина. Л.К,, Скворцова Н.Н., Цымбаленко Н.В., Чеботарь Н А., Гайцхоки B.C. Сравнительное изучение динамики перемещения пептидной части молекулы церулоплазмина молока в организме крыс при эмбриональном и взрослом типе меди. Онтогенез, 1999, 30, №1 с 3139.
3 Цымбаленко Н.В., Мокшина С.В , Пучкова Л В., Платонова Н А., Сасина Л.К., Скворцова П Н, Мищенко Б.С., Егоров Ц.А, Гайцхоки B.C. Картирование участка церулоплазмина, взаимодействующего с медьтранспортной АТРазон Менкеса, Биоорганическая химия, 2000,26, № 1, 37-42. Тезисы:
1. Puchkova L , Sasina L, Aleinikova Т., Zakharova F.., Tsymbalenko N , Platonova N., Mokshina S., Shavlovskii M., Gaitskhoki V. In vitro reconsituting of ceruloplasmin traffic in mammalian body, ХХХШ International congress of physiological sciences, St.Peterburg, 30.0605.07.97, P003.08.
2. H.B. Цымбаленко, Н А. Платонова, Л.К Сасина, Э.Б. Диже, Л.В Пучкова, В С.Гайцхоки Выделение и предварительная характеристика кДНК рецегпора церулоплазмина из экспрессионной кДНК библиотеки плацешы человека 11-ой съезд Биохимического общества РАН, Пущнно, 19-23 мая 1997. Сборник тезисов стендовых сообщений, часть 2, 1997, с. 161-162.
3. Платонова НА. Выделение и частичная харакгернсгика кДНК рецептора церулоплазмина из экспрессионной кДНК библиотеки плаценты человека. 1-ая Медико-биологическая конференция молодых ученых Санкт-Петербурга, Санкт-Петербург, 17-19 ноября. Материалы конференции, 1997, с 61.
4. Платонова Н А. Изучение мембранных белков, участвующих в метаболизме меди. Конференция молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", посвященная 240-летию ММА им. ИМ. Сеченова, Москва, 27-30 апреля 1998 Материалы конференции, 1998, с 192.
5. Puchkova L., Sasina L., Tsymbalenko N.. Platonova N., Gaitskhoki V. Endocytotic type ceruloplasmin receptor from extrahepatic cells, 25-th Silver FEBS Meeting, Denmark, Copenhagen, 5-10.07.98, p. 131.
6. Пучкова Л.В., Сасина Л.К , Цымбаленко Н.В , Платонова Н.А., Мокшнпа С В., Егоров Ц.А., Мусалямов А.Х., Гюлиханданова Н Е., Гайцхоки B.C. Экспрессия гена рецептора церулоплазмина и его роль в метаболизме меди. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 21-25 сентября 1998. Тезисы докладов конференции, 1998, с.162-165.
7. Platonova N. The studying of the interaction between ceruloplasmin, receptor's cemloplasmin and ATP-ase Pl-type putative product of Menkes disease gene in mamalia copper metabolism. International medical conference for students and young doctors, Lublin, Poland, 24-26.04.98. Abstract book, 1998, p.12.
8. Puchkova L.V., Skvortzova N.N, Shavlovskii M M., Sasina L K., Platonova G A., Mokshina S.V., Musolyamov AKh, Zhiguleva E.A., Platonova N.A.,.Vlasov G.P., Egorov Ts.A., Gaitskhoki V S. The interaction of ceruloplasmin, ceruloplasmin receptor and putative copper-transporting ATPase encoded by Menkes disease gene. International symposium «Protein structure, stability and folding. Fundamental and Medical Aspects», Moscqw, Russia, 2226.06.98. Book of program & abstracts, 1998, p. 189.
9. Скворцова H.H., Пучкова Л.В., Шавловский MM., Сасипа Л.К., Платонова Г.А., Мокшина С В., Мусолямов А Х, Жигулева Э.А., Платонова Н А., Власов Г П., Егоров ЦА, Гайцхоки ВС. Установление участка молекулы церулоплазмина, взамодействующего с медьтранспортной АТРазон Менкеса. XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, Москва, 1998. Рефераты докладов и сообщений № 4, 1998, с. 144.
10 Platonova N., Gulikhandanova N. The role of ceruloplasmin receptor and Menkes ATPase in copper metabolism. 10-th European Students' Conference for students and young doctors, Berlin, 20-23.10, 1999. Abstract book, 1999, p.165
П.Платонова НА., Сасина Л.К., Цымбаленко Н В., Мищенко Б.С., Егоров Ц.А. Клонирование фрагмента кДНК рецептора церулоплазмина и изучение его роли в транспорте ионов меди. II-ой съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров,-Санкт-Петербург, 1-5 февраля 2000. Тезисы докладов съезда, 2000, с. 301-302.
Работа поддержана грантом РФФИ (№ 98-04-49790), Программой «Геном человека» (К» 74/99), межвузовской научной программой «Университеты России -фундаментальные исследования» (№ 1316), грантом Совета поддержки Ведущих научных школ России (К» 96-15-97742), ФЦП «Интеграция» (А-0137), персональными грантами 1995 г.(№ 153-24) и 1998 г. (Ms М98-2.6К-445) Правительства Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов и молодых ученых вузов Санкт-Петербурга по исследованиям в области гуманитарных, естественных, технических и медицинских наук.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Платонова, Наталья Андреевна
Введение
Часть 1. Обзор литературы
1.1. Биологическая роль меди
1.1.1. Роль ионов меди в клеточных процессах
1.1.2. Содержание и распределение меди в организме человека
1.1.3. Нарушения метаболизма меди
1.2. Метаболическая система меди (МСМ)
1.2.1. МСМ прокариотов
1.2.2. МСМ дрожжей
1.2.3. МСМ человека
1.2.3.1. Церулоплазмин (ЦП)
1.2.3.1.1. Строение ЦП
1.2.3.1.2. Структура гена ЦП и его экспрессия
1.2.3.1.3. Биосинтез и посттрансляционное созревание ЦП
1.2.3.1.4. Тканеспецифические молекулярные формы ЦП. Активность гена
ЦП в течение онтогенеза
1.2.3.1.5. Функции ЦП
1.2.3.2. Мембранные белки
1.2.3.2.1. Мембранные насосы
1.2.3.2.2. Трансмембранные рецепторы
1.2.3.3. Цитозольные медьтранспортные белки
1.2.3.4. Транскрипционные факторы, регулирующие экспрессию генов
1.3. Сходство мембранных белков МСМ различных видов
Часть 2. Материалы и методы
2.1. Материалы, использованные в работе
2.2. Методы исследования
2.2.1. Препараты белков и пептидов
2.2.1.1. Выделение рецептора ЦП и получение антител к нему
2.2.1.2. Синтез пептидов А1р7а и их коньюгация с белком
2.2.1.3. Связывание ЦП с пептидами и обработка комплекса системой окисления, катализируемой металлом (СОКМ)
2.2.1.4. Иммобилизация пептида Р16 на монолитный макропористый
2.2.1.5. Аффинная мембранная хроматография ЦП с Р16, иммобилизованным на монолитный макропористый диск
2.2.2. Клонирование кДНК рецептора ЦП
2.2.2.1. Иммунологический скрининг экспрессионной библиотеки кДНК плаценты человека в векторе Xgtl
2.2.2.2. Выделение ДНК фага Xgtl
2.2.2.3. Выделение плазмидной ДНК
2.2.2.4. Субклонирование фрагмента кДНК рецептор ЦП в плазмидном векторе pTZ
2.2.2.5. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля
2.2.2.6. Выделение полирибосомной РНК '
2.2.2.7. Получение [32Р]ДНК-зондов
2.2.2.8. Перенос РНК и ДНК на нитроцеллюлозные фильтры
2.2.2.9. Блот-гибридизация [32Р]ДНК-зонда с РНК или ДНК
2.3. Аналитические методы
2.3.1. Анализ белков 62 2.3.1.1. Секвенирование пептидов
2.3.2. Анализ нуклеиновых кислот
2.3.2.1. Электрофоретический анализ
2.3.2.2. Рестрикционный анализ ДНК
2.3.2.3. Спектрофотометрическое определение концентрации 63 нуклеиновых кислот
2.3.2.4. ПЦР ДНК фага ^gtl
2.3.2.5. Секвенирование кДНК рецептора ЦП
2.3.3. Измерение концентрации меди 64 Часть 3. Результаты и обсуждение
3.1. Выделение кДНК рецептора ЦП и ее частичная характеристика
3.1.1. Выделение рецептора ЦП из мембран эритроцитов человека и 65 характеристика антител к рецептору ЦП
3.1.2. Скрининг экспрессионной кДНК библиотеки плаценты человека
3.1.3. Анализ изолированного клона
3.1.4. Изучение профиля тканеспецифической экспрессии гена 71 рецептора ЦП
3.1.5. Анализ последовательности вставки кДНК рецептора ЦП
3.1.6. Общая характеристика рецептора ЦП
3.2. Изучение взаимодействия ЦП с фрагментами Atp7a
3.2.1. Выбор участков Atp7a для изучения связывания с ЦП
3.2.2. Тестирование пептидов Р16 и Р15 на способность связывания с 89 ЦП методом белкового фут-принтинга
3.2.3. Кинетическая характеристика взаимодействия ЦП с Р
3.2.4. Изучение действия обработки Хелекс-100 на атомы меди в 96 комплексах Р15-ЦП и Р16-ЦП
3.2.5. Встречаемость Р15 и Р16 в Р1-АТРазах разных организмов
3.2.6. Выявление структурного сходства между рецептором ЦП, ЦП и 101 Atp7a
Введение Диссертация по биологии, на тему "Совместное участие рецептора церулоплазмина и медьтранспортной АТРазы, продукта гена болезни Менкеса, в связывании церулоплазмина"
Актуальность исследования. Медь включена в активные центры нескольких десятков жизненно важных ферментов, контролирующих клеточное дыхание, фотосинтез, функционирование центральной нервной системы, формирование соединительной ткани, эритропоэз и другие [88]. Одновременно она является токсичным агентом для всех типов клеток [113]. Безопасный круговорот меди в организме млекопитающих осуществляет метаболическая система меди (МСМ). Она состоит из: а) переносчиков, растворимых белков, транспортирующих медь по гидрофильным компартментам организма и клеток, б) транспортеров (насосы и рецепторы), интегральных белков мембран, передающих медь через мембранные барьеры, и 3) регуляторов, факторов, контролирующих активность генов МСМ. Данные о функционировании МСМ на молекулярном уровне, о полном числе ее участников и механизме регуляции отсутствуют.
У млекопитающих МСМ состоит из двух полуавтономных взаимосвязанных тканеспецифических типов: МСМ гепатоцитов и МСМ клеток негепатоцитарных рядов (непеченочные клетки). Пищевая медь, адсорбированная из желудочно-кишечного тракта, в составе комплекса (His^Cu доставляется кровотоком в печень. Перенос ионов меди через плазматическую мембрану гепатоцитов осуществляет специфический транспортер. В гепатоцитах с помощью медьтранспортной АТРазы Р1 типа, предполагаемого продукта локуса болезни Вильсона (Atp7b), ионы меди метаболически включаются в церулоплазмин (ЦП, медьсодержащий гликопротеин) крови или в ЦП желчи. ЦП крови содержит 95% меди, обнаруживаемой в плазме крови. ЦП желчи секретируется в желудочно-кишечный тракт и вместе с ним выводится часть ионов меди [22, 163, 183].
В непеченочных клетках гены ЦП и Atp7b не экспрессируются. Единственным источником ионов меди для них является ЦП крови [107], который при передаче ионов меди высокоаффинно связывается со специфическим рецептором интернализирующего типа [20, 35]. Показано, что с клеточной поверхностью связывается только интактный ЦП, который после интернализации и пребывания в мембранных пузырьках клетки экскретируется. Освобожденный ЦП содержит меньше атомов меди и быстро выводится из кровотока в желчь через гепатоциты с помощью группоспецифического рецептора для асиалогликопротеинов [23, 25]. Атомы меди, лабильно связанные с ЦП, в отличие от его пептидной части, передаются в цитозоль [70]. Это свидетельствует о том, что помимо рецептора ЦП, в передаче меди может участвовать также и медьтранспортная АТРаза. Механизм передачи ионов меди в клетки от ЦП остается не известным.
ЦП относится к полифункциональным белкам и одной из его физиологических функций является превращение апо-трансферрина в трансферрин [49]. Мутации в С-концевом участке молекулы ЦП вызывают нарушение мобилизации железа из клеток. Таким образом, МСМ у млекопитающих тесно связана и с круговоротом железа. Генетические дефекты в МСМ приводят к дефициту или к избытку этих ионов в клетках различных органов, что, в свою очередь, становится причиной развития тяжелых заболеваний (болезнь Менкеса, болезнь Вильсона, детский цирроз, который индуцируется повышенным содержанием меди в пище новорожденных, некоторые типы гемосидероза, а также ряд нейродегенеративных болезней пожилого возраста). Распространенность названных болезней обусловливает актуальность исследования МСМ человека.
Цель работы состояла в изучении структуры рецептора ЦП и механизма участия Atp7a в передаче ионов меди, связанных с ЦП.
Для достижения цели были поставлены и решены следующие основные задачи:
1. Методом иммуноскрининга с помощью антител к рецептору ЦП человека из экспрессионной библиотеки кДНК плаценты изолировать и охарактеризовать клон(ы), содержащие участки кДНК рецептора ЦП.
2. Твердофазным методом синтезировать участки Atp7a, соответствующие нецитозольным петлям, которые, согласно предположению, взаимодействуют или не взаимодействуют с ЦП. Методом фут-принтинга и последующего частичного секвенирования картировать участки ЦП, связывающиеся с синтезированными фрагментами Atp7a. Изучить характер взаимодействия между ЦП и фрагментами Atp7a.
Научная новизна полученных результатов. Впервые получены данные о частичной структуре рецептора ЦП, основанные на анализе его кДНК, выделенной методом иммуноскрининга из экспрессионной библиотеки кДНК плаценты человека. Сравнение установленных последовательностей кДНК рецептора ЦП с базой данных ДНК GenBank по программе BLAST и трансляция их по программе DNASIS показало, что они имеют высокую степень гомологии с ЦП. Вычисленная последовательность фрагмента кДНК, прочитанная в обратном направлении, на 83% гомологична участку ЦП от 216Е до Е427. Она содержит 37 замен, 22 из которых - значимые. В рецепторе ЦП сохраняется один из двух сайтов гликозилирования и все лиганды, образующие мононуклеарный центр для меди типа I, имеющиеся в сравниваемом участке ЦП.
Другой фрагмент кДНК рецептора ЦП (прочитан в прямом направлении) на 76% гомологичен экзону 16 гена ЦП. Последовательность полностью транслируется только во второй рамке считывания. Вычисленная аминокислотная последовательность в базе данных GenBank не найдена. По данным анализа с помощью системы PC/GENE она содержит 1 участок в форме а-спирали из 16 аминокислотных остатков (а.о.) со свойствами трансмембранного домена, который является частью гидрофобного домена.
Методом белкового фут-принтинга установлено, что домен 6 ЦП специфически связывается с синтетическим фрагментом, соответствующим участку 968Е - 980R медьтранспортной АТРазы Менкеса, который входит в нецитозольную петлю, прилегающую к медьтрансдуцирующему мембранному домену. Связывание носит насыщающий характер и высоко аффинно (Кдис= 1.5-10"6 М).
Родство между рецептором ЦП и ЦП сохраняется в их антигенных свойствах: они перекрестно реагируют со специфическими антителами. Методом иммуноблотинга показано, что антитела к рецептору ЦП не взаимодействуют с доменом 6 молекулы ЦП, место которого, по данным анализа кДНК, занимает гидрофобный домен.
Научно-практическая значимость результатов исследования. Полученные данные вносят вклад в исследования генома человека, функционирование МСМ клеток негепатоцитарных рядов и связи между метаболизмом железа и меди. Данные о структуре фрагмента кДНК рецептора ЦП дают основания отнести рецептор ЦП к группе мембраносвязанных ЦП-подобных белков, которая включает ЦП-подобные мультимедные ферроксидазы, участвующие в переносе ионов железа в клетки. Функциональная связь между ЦП, который, помимо транспорта меди в клетки, осуществляет также мобилизацию внутриклеточного железа, и его специфическим рецептором указывает на возможное участие рецептора ЦП, совместно с ЦП, в метаболизме железа. Таким образом, данные исследования углубляют и детализируют существующие представления о связи между метаболизмом железа и меди, а также роли в ней ЦП и мембранных ЦП-подобных белков.
Представленные в работе доказательства участия синтетического фрагмента Atp7a в связывании ЦП объясняют механизм поступления ионов меди ЦП в цитозоль и подтверждают развиваемое рабочее предположение о координированном участии рецептора ЦП и Atp7a в передаче ионов меди через мембрану.
В целом, результаты исследования могут способствовать пониманию молекулярных основ болезней, развивающихся вследствие нарушения работы МСМ.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Рецептор ЦП является мембранным ЦП-подобным белком.
2. Участок Atp7a, соответствующий последовательности 9б8Е- 980R нецитозольной петли, прилегающей к мембранному домену, образующему медьтрансдуцирующий канал, специфически и высоко аффинно взаимодействует с доменом 6 зрелой молекулы ЦП.
3. ЦП, рецептор ЦП и Atp7a содержат родственные антигенные детерминанты.
Апробация результатов работы. Результаты исследования доложены на: 11-ом Съезде Биохимического Общества Российской Академии Наук, Москва, 19-23 мая, 1997 г. (стендовое сообщение), XXXIII Международном конгрессе физиологических наук, СПб, 30 июня - 5 июля 1997 г. (стендовое сообщение), 1-ой Медико-биологической конференции молодых ученых Санкт-Петербурга, СПб, 1719 ноября 1997 г. (устное сообщение), Международной конференции по медицине для молодых ученых, Люблин, Польша, 24-26 апреля, 1998 г. (стендовое сообщение), Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», посвященной 240-летию ММА им. И.М. Сеченова, Москва, 26-30 апреля 1998 г. (устное сообщение), XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии, СПб, 25-29 мая 1998 г. (стендовое сообщение), Международном симпозиуме по структуре, стабильности и фолдингу белков, Москва, 22-26 июня 1998 г. (стендовое сообщение), 25-ом юбилейной конференции ФЭБО, Копенгаген, Дания, 5-10 июля 1998 г. (устное сообщение), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 21-25 сентября, 1998 г. (устное сообщение), 10-ой Европейской конференции молодых ученых по биологии и медицине, Берлин, Германия, 20-24 октября, 1999 г. (устное сообщение), 2-ой съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, СПб, 1-5 февраля 2000г. (устное сообщение).
В рецензируемых журналах по результатам работы опубликованы 3 статьи.
Работа поддержана грантом РФФИ (№ 98-04-49790), Программой «Геном человека» (№ 74/99), межвузовской научной программой «Университеты России -фундаментальные исследования» (№ 1316), грантом Совета поддержки Ведущих научных школ России (№ 96-15-97742), ФЦП «Интеграция» (А-0137), персональными грантами 1995 г.(№ 153-24) и 1998 г. (№ М98-2.6К-445) Правительства Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов и молодых ученых вузов Санкт-Петербурга по исследованиям в области гуманитарных, естественных, технических и медицинских наук.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Платонова, Наталья Андреевна
выводы
1. Из экспрессионной библиотеки кДНК плаценты человека выделен клон, содержащий участок кДНК предполагаемого рецептора ЦП. Определение последовательности клонированного фрагмента кДНК рецептора ЦП выявило высокую гомологию рецептора ЦП и ЦП. В рецепторе ЦП обнаружен гидрофобный участок, теоретически содержащий трансмембранный домен. Рецептор ЦП относится к семейству мембранных ЦП-подобных белков.
2. 16-членный пептид, соответствующий последовательности 968ETYFPGYNRSISRTET983 нецитозольной петли А1р7а, прилегающей к мембранному домену, образующему медьтрансдуцирующий канал, специфично и высокоаффинно взаимодействует с доменом 6 зрелой молекулы ЦП.
3. ЦП, рецептор ЦП и Atp7a содержат сходные антигенные детерминанты, что, возможно, отражает их совместное участие в транспорте меди в клетки негепатоцитарных рядов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полученные данные позволяют сделать некоторые заключения о структуре предполагаемого рецептора ЦП, его родственности с другими ЦП-подобными белками и роли в метаболизме меди. Кроме этого результаты исследования могут быть использованы для объяснения механизма передачи меди через клеточные барьеры. Рассмотрению перечисленных положений посвящена заключительная часть представленной работы.
Успешное секвенирование клонированной ДНК однозначно показывает, что из экспрессионной библиотеки кДНК плаценты человека выделен индивидуальный клон, который содержит вставку кДНК предполагаемого рецептора ЦП. Размер вставки, если судить по длине максимального ПЦР-амплификата, соответствует 3.15 т.п.н. Последовательность нуклеотидов длиной 3.15 т.п.н. достаточна, чтобы кодировать полипептидную цепь, состоящую из 1050 а.о. (средняя масса а.о. равна 120 Да). Известно, что молекулярная масса зрелого рецептора ЦП человека, молекула которого состоит из одной полипептидной цепи, равна 130 кДа [20]. Примерно 3-5% из них приходится на углеводную часть [24, 131], следовательно, мол. масса полипептидной цепи составляет около 120 кДа. Это масса полипептидной цепи, содержащей примерно 1000 а.о. Теоретически она короче на 50 а.о., чем та, которую может кодировать вставка. Это означает, что вставка достаточна для кодирования пре-белка и необходимых некодирующих последовательностей на 5'-конце. Таким образом, формально вставка, содержащаяся в ДНК клонированного фага, может соответствовать полноразмерной полипептидной цепи пре-рецептора ЦП.
В то же время [32Р]ПЦР-продукт, использованный в качестве зонда, выявляет в составе тотальной прсРНК транскрипт длиной 8.2 т.н. Это указывает на то, что, если даже вставка 3.15 т.п.н. содержит всю кодирующую часть кДНК рецептора ЦП, она не является полноразмерной. Очевидно, кДНК рецептора ЦП содержит протяженный некодирующий район на 5'-конце. Каких либо закономерностей в активности генов в связи с присутствием, или отсутствием, протяженных нетранслируемых последовательностей в зрелых транскриптах не установлено. Белки МСМ по соотношению размеров кодирующих и некодирующих участков в кДНК можно отнести к двум группам. В первую группу входят ЦП, Fet3 и Heph (табл. 3.3). В кДНК этих белков отношение некодирующей части к кодирующей составляет 1.15, 1.24 и 1.29 для ЦП, Fet3 и Hehp, соответственно. Вторую группу составляют Atp7a, Atp7b и рецептор ЦП. В кДНК этих белках соотношение некодирующих частей к кодирующим составляет 1.82, 1.79 и 2.60, соответственно. Нельзя исключить, что отмеченный признак связан с пока не изученным механизмом координированного изменения активности различных групп генов МСМ.
При субклонировании вставки в плазмидный вектор pTZ19 ее длина укорачивается на 0.85 т.п.н. и соответствует 2.3 т.п.н. Это указывает на присутствие, по меньшей мере, одного EcoRl-сайта в кДНК рецептора ЦП. Секвенирование субклонированного участка кДНК рецептора ЦП, показало, что он не содержит ни старт-кодона, ни стоп-кодона. Так как кДНК синтезируется с 3'-конца мРНК, обоснованно предположить, что отсутствие стоп-кодона объясняется наличием EcoRl-еайта на 5'-конце ДНК. Нельзя исключить, что первоначально вставка содержит два EeoRl-сайта, которые фланкируют участок длиной 2.3. т.п.н. В этом случае переклонирование неизбежно приведет к утрате обоих маркирующих кодонов.
Частичное секвенирование субклонированного фрагмента обнаружило высокую степень гомологии между ЦП и его рецептором. Особенно эта гомология высока на уровне первичной структуры кДНК. Вычисленная аминокислотная последовательность одного из секвенированных фрагментов на 83% идентична последовательности ЦП на участке 216Е-427Е, в который входят частично домены 2 и 3. Она содержит 175 идентичных по значению и положению а. о. Измененными оказались 37 а. о, из которых 22 замены - значимые. Этого достаточно, чтобы белки не считались продуктами одного гена. Во фрагменте 2 рецептора ЦП содержатся сайт гликозилирования и медьевязывающий мононуклеарный центр, которые лежат к N-концу от трансмембранного домена и, по-видимому, ориентированы в экстрацеллюлярное пространство.
Фрагмент 1 обнаруживает 76%-ную гомологию с экзоном 16 гена ЦП, который кодирует N-концевой участок домена 6. Однако вычисленная по нему аминокислотная последовательность не найдена в базе данных и не имеет сходства с участком ЦП, который кодируется фрагментом кДНК, проявляющим гомологию с кДНК рецептора ЦП. Эта новая аминокислотная последовательность содержит гидрофобный домен, в составе которого теоретически присутствует трансмембранный домен.
В субклонированном фрагменте кДНК предполагаемого рецептора ЦП секвенированные участки разделены примерно 1.4 т.п.н., нуклеотидная последовательность которых не установлена. Их достаточно, чтобы кодировать примерно 470 а.о. Примерно столько же а.о. расположено в молекуле преЦП между 427Е и первой аминокислотой домена 6 (907V), проявляющим высокую степень гомологии с рецептором ЦП. Утраченный при переклонировании в вектор pTZ19 фрагмент кДНК рецептора ЦП способен кодировать полипептид, состоящий из 283 а.о. В работе получены данные, позволяющие предварительно построить линейную карту полипептидной цепи рецептора ЦП и предположительно локализовать на ней идентифицированные участки. Так, ранее было показано, что 1) наборы полных триптических гидролизатов ЦП и рецептора ЦП содержат группу идентичных пептидов, а в состав молекулы рецептора ЦП входят гидрофобные пептиды, не имеющие гомологов в ЦП (см. рис. 3.10), и 2) специфические антитела к ЦП и его рецептору взаимодействуют перекрестно. Известно, что при хранении молекула ЦП подвергается спонтанному специфическому протеолизу по границам функциональных доменов [4]. Данные иммуноблотинга ЦП с антителами к рецептору ЦП показывают, что домен 6 не взаимодействует с антителами к рецептору ЦП (рис. 3.20). Эти результаты подтверждают данные секвенирования и однозначно свидетельствуют, что в составе рецептора ЦП нет участка гомологичного домену 6 ЦП. Эти же данные дают основания предположить, что на N-конце рецептора ЦП расположен участок, гомологичный ЦП. Вероятно, что из 283 а.о. примерно 216, включающие сигнальный пептид, приходятся на N-конец рецептора ЦП. Оставшиеся 67 а.о., по-видимому, должны составлять ориентированный в цитозоль С-конец, следующий за трансмембранным доменом.
Таким образом, рецептор ЦП близок по длине молекуле ЦП, у которой на N-конце расположен протяженный участок высоко гомологичный, но не полностью идентичный, доменам 1-5 ЦП, а на С-конце вместо домена 6 расположен гидрофобный пептид, содержащий трансмембранный домен (рис. 3.21).
Данные позволяют включить рецептор ЦП в одно семейство с другими мембранными ЦП-подобными белками [33, 185]. Похоже, что Fet3, ЦП, его рецептор и Heph образуют эволюционный гомологичный ряд белков этого семейства (рис. 3.11). Сравнение структурной организации белков этого семейства с рецептором ЦП показывает, что он наиболее сходен с Heph, мультимедной оксидазой из клеток слизистой желудочно-кишечного тракта мышей, которая, подобно Fet3, участвует в транспорте железа в клетку [33, 185]. Рецептор ЦП, как и Heph, локализован на клеточной поверхности, и, по-видимому, его N-конец ориентирован в экстрацеллюлярное пространство. Похоже, что сходство ограничивается перечисленными признаками.
Рецептор ЦП и Heph отличаются профилем тканеспецифической экспрессии. Так, Heph экспрессируется только в клетках желудка, толстого и тонкого кишечника взрослых мышей. Напротив, рецептор ЦП, как показали наши исследования, экспрессируется практически во всех непеченочных органах, кроме желудочно-кишечного тракта взрослых млекопитающих, а у новорожденных экспрессируется в печени, ЖКТ, но не в мозгу [14]. Очевидно, что места тканеспецифической экспрессии гена рецептора ЦП связаны с получением меди от ЦП (внутренние органы, исключая печень, у взрослых получают медь от ЦП, а у новорожденных клетки ЖКТ и печень получают медь от ЦП молока). Отсутствие
Рис. 3.21. Схема полипептидной цепи рецептора ЦП. Выделены идентифицированные участки.
- медьсвязывающий мононуклеарный центр, Y - сайт гликозилирования. рецептора ЦП в клетках мозга новорожденных свидетельствует об автономной МСМ в клетках мозга. В целом результаты исследования показывают, что рецептор ЦП неразрывно связан с метаболизмом меди, в то время как Heph - с круговоротом железа.
Heph сохраняет все медьсвязывающие центры, имеющиеся в ЦП. Возможно, что у рецептора ЦП, помимо обнаруженного медьсвязывающего мононуклеарного центра, в не установленных участках сохраняется мононуклеарный центр, свойственный домену 4 ЦП. Однако рецептор ЦП точно не содержит тринуклеарный центр (домены 1 и 6 расположены по разные стороны мембраны, см. схему 1.3) и, по-видимому, один мононуклеарный центр, который образует домен 6.
Выявленные структурные отличия, возможно, связаны с разными функциями, выполняемыми этими бежами. Повторим, что Heph обеспечивает поступление ионов железа из просвета желудочно-кишечного тракта. В клетки непеченочных органов ионы железа доставляет трансферрин, а переносятся они с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза. Роль рецептора ЦП в метаболизме меди определена. Он специфично связывает ЦП, что подтверждено многочисленными данными [70]. Связывание ЦП с рецептором имеет физиологический смысл, так как плотность рецептора ЦП на поверхности клеток регулируется уровнем ЦП в среде культивирования. Доказано, что оно необходимо для передачи лабильных ионов меди ЦП в клетки и выведения прочно связанных атомов меди с ЦП через желчь [23].
Ограничивается ли роль рецептора ЦП только участием в метаболизме меди? Однозначного ответа на этот вопрос нет. Сходство рецептора ЦП с Heph и специфические отличия между ними, отмеченные выше, подталкивают к предположениям, которые пока не имеют экспериментальных доказательств, но могут приниматься во внимание при разработке рабочих гипотез для дальнейших исследований. По-видимому, рецептор ЦП непосредственно не участвует в транспорте железа, но метаболически связан с круговоротом железа. Так, существуют прямые генетические данные, доказывающие, что ЦП участвует в мобилизации ионов железа из клеток непеченочных органов. Механизм, с помощью которого ЦП, растворимый белок, циркулирующий в кровотоке, может стимулировать поток ионов железа из клетки, не объяснен. Возможно, что для осуществления этой функции ЦП должен связаться с рецептором клеточной поверхности. Но нельзя исключить, что после интернализации ЦП (или рецептор ЦП, или комплекс ЦП с рецептором), находясь в мембранных пузырьках внутри клетки, способствуют возникновению потока ионов железа из клетки. Проверка этих предположений может быть полезна при изучении механизмов, лежащих в основе накопления железа и гибели нейронов при некоторых нейродегенеративных заболеваниях, развивающихся на фоне нарушения метаболизма меди [72].
В работе представлены результаты, позволяющие обоснованно заключить, что ЦП способен связываться с пептидом Р16, соответствующим участку Atp7a, расположенному в нецитозольной петле, прилегающей к мембранному домену, содержащему СРС-мотив, который участвует в передаче ионов меди через мембрану. Так, Р16 в насыщающих концентрациях и высокоаффинно взаимодействует с ЦП. Взаимодействие происходит примерно в эквимолярных соотношениях. В связывании участвует 13-членная N-концевая последовательность Р16 и участок домена 6 с 900 по 945 а.о. ЦП, который образует структуру типа helix-loop-helix. Данные исследования являются веским доводом в пользу предположения, что Atp7a локализована на плазматической мембране. Дополнительно это подтверждают и данные компьютерного анализа известных Р1-АТРаз (табл. 3.5), которые показали, что этот участок Atp7a встречается только в клетках, использующих в качестве единственного источника ионов меди ЦП. На основании этих двух линий доказательств нецитозольную петлю между трансмембранными доменами 3 и 4 можно отнести к функциональному специфическому экстрацеллюлярному домену Atp7a позвоночных.
Утверждение находит поддержку в многочисленных биохимических и клинических данных об эффективности лечения болезни Менкеса комплексом (His)2Cu [157]. Болезнь Менкеса развивается вследствие мутаций в гене АТР7А. Больные рождаются со всеми признаками дефицита меди и погибают в первые месяцы жизни. Известно, что единственным источником меди в течение внутриутробного развития и в период молочного вскармливания является последовательно ЦП крови и ЦП молока матери [21, 14]. По-видимому, дефицит меди, по крайней мере в некоторых случаях, развивается вследствие нарушения связывания Atp7a с ЦП. По-видимому, комплекс (His)2Cu не нуждается в А1р7а и у больных болезнью Менкеса становится эффективным заместителем ЦП. Отмечено, что чем раньше начато лечение (His)2Cu, тем оно успешнее. Возможно, что успех лечения связан также с тем, что при нарушении доставки меди по пути ЦП-» Atp7a в клетках активируется ген, кодирующий переносчик меди, узнающий (His)2Cu. Этот ген (hCtr) экспрессируется в клетках печени взрослых млекопитающих [198].
В работе представлены данные о родстве между ЦП, рецептором ЦП и Atp7a. Степень родства между этими белками не одинакова. На основании полученных результатов она может быть признана высокой, несомненной и физиологически значимой только для пары ЦП - рецептор ЦП. Сходство между участком А1р7а и ЦП ограничивается существованием на поверхности глобулы ЦП сходного с Р16 пространственного эпитопа. Между рецептором ЦП и Р16, по-видимому, существует структурное сходство. Для пар ЦП-Р16 и рецептор-Р16 данные получены на изолированных белках или их фрагментах, поэтому невозможно установить, имеет ли это сходство физиологическое значение. Нельзя исключить, что последовательность, сходная с Р16, в рецепторе ЦП есть, но она расположена таким образом, что никогда не оказывается в одном компартменте с участком Atp7a, который соответствует Р16. Интересно, что в прокариотической медьтранспортной АТРазе Сор А, которая обеспечивает поступление ионов меди в клетки, выявлены последовательности гомологичные Fet3. Это согласуется с обнаруженным в работе сходством между Atp7a и рецептором ЦП.
11>Г
В целом данные работы позволяют сделать заключение, что перенос лабильных атомов меди от ЦП через плазматическую мембрану осуществляют рецептор ЦП и Atp7a. ЦП и рецептор ЦП являются родственными белками, возможно, имеющими общий предковый ген. В структуре рецептора ЦП и Atp7a, как и ЦП с Atp7a, не выявлено достаточного сходства, чтобы отнести их к одному семейству белков. Но они имеют гомологичные сайты, существование которых, возможно, обусловлено согласованным участием их в метаболизме меди и железа. Гипотетическая модель таких взаимоотношений показана на рис. 3.22. Высокоаффинное связывание ЦП со специфическим рецептором приводит к сближению ЦП с клеточной поверхностью, и это обеспечивает связывание домена 6 с центральным участком внеклеточной петли между мембранными доменами 3 и 4 в Atp7a (рис. 3.22, Б). Это взаимодействие приводит к переносу лабильных атомов меди от ЦП (самая высокая плотность которых приходится на 6-ой домен) на цистеины мотива СРС трансдуцирующего канала. Протяженный N-концевой гидрофильный домен Atp7a, содержащий 6 медьсвязывающих сайтов, постепенно насыщается атомами меди, которые он принимает из трансдуцирующего канала (рис. 3.22, В). После передачи лабильных атомов меди молекула ЦП интернализируется в комплексе с рецептором. В эндосомах происходит десиалирование ЦП. Затем асиало-ЦП с прочно связанными в активных центрах атомами меди, освобождается из клеток, поглощается с помощью группоспецифического рецептора для асилогликопротеинов гепатоцитами и выводится через желчь. Таким образом, роль рецептора ЦП также может состоять в регуляции поступления ионов меди в клетки. в
Рис. 3.22. Механизм переноса ионов меди, связанных с ЦП, в непеченочные клетки На модели цитозольные участки Atp7a помещены за плоскостью рисунка I-Atp7a, II-рецептор ЦП, III-ЦП.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Платонова, Наталья Андреевна, Санкт-Петербург
1. Авцын А.П., Жаворонков А.А., Риш М.А., Строчкова J1.C. Микроэлементозы человека. М.: Медицина. 1991. 496 с.
2. Алейникова Т.Д., Васильев В.Б., Монахов Н.К., Шавловский М.М. Синтез и секреция церулоплазмина изолированными гепатоцитами крысы // Биохимия, 52, 10:1600-1607,1987.
3. Васильев В.Б., Шавловский М.М., Нейфах С.А., Прозоровский В.А. Внутримолекулярная гомология церулоплазмина // Биоорг. химия 5, 1045-1052, 1979.
4. Вербина И.А., Пучкова Л.В. Выделение и характеристика белка, подобного церулоплазмину, из сыворотки больного гепатолентикулярной дегенерацией (болезнь Вильсона-Коновалова) // Докл. АН СССР. 283, 478-482, 1985.
5. Вернадский В.И. Биогеохимические очерки. Проблемы биогеохимии. М. Наука, 1980.
6. Гайцхоки B.C., Воронина О.В., Денежкина В.В., Плисс М.Г., Пучкова Л.В., Шварцман А.Л., Нейфах С.А. Экспрессия гена церулоплазмина в различных органах крысы // Биохимия, 55, 5:927-937, 1990.
7. Дарбре А., Практическая химия белка. М. Мир, 1989.
8. Захарова Е.Т. Структурно-аналитическое исследование церулоплазмина белых крыс. Авт. канд. дис. ИЭМ, Л., 1985.
9. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ./ Под ред. Д.Гловера.-М.:Мир, 1988, 538 с.
10. П.Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ./ Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж.-М.:Мир, 1984, 480 с.
11. Мокшина С.В. Роль церулоплазмина молока как источника ионов меди дляноворожденных. Канд. дне. ИЭМ, СПб, 1998.
12. Нейфах С.А., Васильев В.Б., Шавловский М.М. Строение, каталитические свойства и эволюция церулоплазмина и других голубых белков // Успехи биол. химии, 23 ,102-124, 1988.
13. Пучкова JT.B., Алейникова Т.Д., Захарова Е.Т., Цымбаленко Н.В., Конописцева Л.К., Гайцхоки B.C. Экспрессия гена церулоплазмина в онтогенезе у крыс // Биохимия, 59, 9:963-973, 1994.
14. Пучкова Л.В., Алейникова Т.Д., Цымбаленко Н.В., Захарова Е.Т., Конописцева Л.А., Чеботарь Н.А., Гайцхоки B.C. Биосинтез и секреция церулоплазмина клетками молочной железы в период лактации // Биохимия, 59, 2:341-348, 1994.
15. Пучкова Л.В., Алейникова ТД., Вербина И.А., Захарова Е.Т., Плисе М.Г., Гайцхоки B.C. Биосинтез двух молекулярных форм церулоплазмина в печени крысы и их полярная секреция в кровоток и в желчь // Биохимия. 58, 12:18931900, 1993.
16. Пучкова Л.В., Вербина И.А., Гайцхоки B.C., Нейфах С.А. Взаимодействие молекулярных форм церулоплазмина со специфическим рецептором мембран эритроцитов здоровых людей и больных гепатолентикулярной дегенерацией // Биохимия, 56, 12:2261-2269, 1991.
17. Пучкова Л.В., Вербина И.А., Денежкина В.В., Гайцхоки B.C., Нейфах С.А. Молекулярные дефекты выведения меди через желчь у больных гепатолентикулярной дегенерацией // Биополимеры и клетка, 7, 3:24-30, 1991.
18. Пучкова Л.В., Вербина И.А., Денежкина В.В., Шавловский М.М., Гайцхоки B.C., Нейфах С.А. Некоторые свойства рецептора церулоплазмина, выделенного из мембран эритроцитов человека//Биохимия, 55, 12:2182-2189, 1990.
19. Пучкова JI.B., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д., Гайцхоки B.C. Внутриклеточный церулоплазминоподобный белок млекопитающих // Бюл. эксперим. биол. и мед., 1, 83-85, 1994.
20. Пучкова Л.В., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д., Захарова Е.Т., Гайцхоки B.C. Реконструирование пути межклеточного переноса пептидной части молекулы церулоплазмина в организме млекопитающих // Биохимия, 62, 7:817-825, 1997.
21. Саенко Е.Л. Басевич В.В., Ярополов А.И. Особенности взаимодействия церулоплазмина со специфическим рецептором эритроцитов человека // Биохимия, 53, 2:317-321, 1988.
22. Сасина Л.К., Пучкова Л.В., Гайцхоки B.C. Изучение локализации и внутриклеточного перемещения новосинтезированного рецептора церулоплазмина в культивируемых фибробластах человека // Биохимия, 63, 10:1377-1384, 1998.
23. Шварцман А.Л., Вахарловский В.Г., Гайцхоки B.C., Нейфах С.А. Молекулярная структура гена церулоплазмина человека и его экспрессия при мутации Вильсона-Коновалова //Докл. Акад. Наук СССР, 253, 3:717-719,1981.
24. Шварцман А.Л., Воронина О.В., Гайцхоки B.C., Паткин Е.Л. Экспрессия гена церулоплазмина в органах млекопитающих по данным гибридизационного анализа с комплементарными ДНК-зондами // Мол. биология, 3, 657-662, 1990.
25. Ackland M.L., Cornish E.J., Paynter J.A., Grimes A., Michalczyk A., Mercer J.F. Expression of Menkes disease gene in mammary carcinoma cells // Biochem. J, 15,328(1):237-43, 1997.
26. Alcain F.J., Villalba J.M., Low H., Crane F.L., Navas P. Ceruloplasmin stimulates NADH oxidation of pig liver plasma membrane // Biochem Biophys Res Commun, 31, 186(2):951-5, 1992.
27. Askwith C., Kaplan J. Iron and copper transport in yeast and relevance to human disease // TIBS, 23, 135-138, 1998.
28. Askwith C., Kaplan J. Site- directed mutagenesis of the yeast multicopper oxidase Fet3p // J. Biol. Chem., 273, 35:22415-22419, 1998.
29. Askwith C., Eide D., Van Ho A., Bernard P.S., Li L., Davis-Kaplan S., Sipe D.M. and Kaplan J. The Fet3p gene of S. cerevisiae encodes a multicopper oxidase required for ferrous iron uptake // Cell, 76,403-410, 1994.
30. Atanasiu R.L., Stea D., Mateescu M.A., Vergely C., Dalloz F., Briot F., Maupoil V., Nadeau R., Rochette L. Direct evidence of caeruloplasmin antioxidant properties // Mol Cell Biochem., 189, (1-2): 127-35, 1998.
31. Barnes G., Frieden E. Ceruloplasmin receptors of erytrocytes // Biochem. Biophys. Res. Commun., 125, 157-162, 1984.
32. Beck A.B. The copper content of the liver and blood of some vertebrates // Austral. J. Zool., 35, 8-18,1955.
33. Betlin K.E., Cimato T.R., Ettinger M.J. Copper binding to mouse liver S-adenosylhomocysten hydrolase and the effects of copper on its levels // J. Biol. Chem., 270, 20703-20711, 1995.
34. Bezkorovainy A. Biochemistry of nonheme iron in man. I. Iron proteins and cellular iron metabolism // Clin Physiol Biochem., 7(1): 1-17, 1989.
35. Bianchini A., Musci G., Calabrese D. Inhibition of endotelial nitric-oxide synthase by ceruloplasmin // J.Biol. Chem., 274, 29:20265-20270, 1999.
36. Bingham M.J., Ong T.J., Summer K.H., Middleton R.B., McArdle H.J. Physiologic function of the Wilson disease gene product, ATP7B // Am. J Clin Nutr., 67(5 Suppl):982S-987S, 1998.
37. Bremner L. Absorption, transport and distribution of copper // Hunt Ciba Foundation Symp., 23-37, 1980.
38. Briand I.P., Muller M.H., Regenmortel F. Synthetic peptides as antiges. Pitfalls of conjugation methods // J. Immunol. Methods, 78, 59-69, 1985.
39. Bull P.C., Thomas G.R., Rommens J.M., Forbes J.R., Cox D.W. The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes gene //Nature Genet., 5, 327-337, 1993.
40. Calabrese L., Muski G. Molecular properties of ceruloplasmin from different species. In: Multi-copper oxidases, Academic Press, N.-Y., 307-354, 1977.
41. Casas C., Aldea M., Espinet C„ Gallego C., Gil R., Herrero E. The AFT1 transcriptional factor is differentially required for expression of high-affinity iron uptake genes in Saccharomyces cerevisiae//Yeast, 15; 13(7):621-37, 1997.
42. Chelly J., Turner Z., Tonnesen Т., Petterson A., Ishikawa-Brush Y. Isolation of a candidate gene for Menkes disease that encodes a potential heavy metal binding protein //Nature genetics, 3, 14-19, 1993.
43. Cobine P., Wickramasinghe W., Harrison M., Weber Т., Solioz M., Dameron C. The Enterocococus hirae copper chaperone CopZ delivers copper (I) to the Cop Y repressor//FEBS Letters, 445, 27-30, 1995. *
44. Cousin R.J. Absorption, transport, and hepatic metabolism of copper and zinc: special reference to metallothionein and ceruloplasmin // Physiol.Rev. 65, 2:238-309, 1985.
45. Cox D.W. Genes of the copper pathway // Am. J. Genet., 56, 828-834, 1995.
46. Daimon M., Yamatani K., Igarashi M., Fukase N., Kawanami Т., Kato Т., Sasaki H. Fine structure of human ceruloplasmin gene II Biochem. Biophys. Res. Commun., 208, 1028-1035, 1995.
47. Dean P., Shanlin F.U., Stocker R., Davies V. Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation//Biochem. J., 324, 1-18, 1997.
48. Dierick H.A., Adam A.N., Escara-Wilke J.F., Glover T.W. Immunocytochemicallocalization of the Menkes copper transport protein (ATP7A) to the trans-Golgi network//Hum. Mol. Genet.,6(3):409-16, 1997.
49. Eckersall P.D., Saini P.K., McComb C. The acute phase response of acid soluble glycoprotein, alpha(l)-acid glycoprotein, ceruloplasmin, haptoglobin and C-reactive protein, in the pig// Vet. Immunol. Immunopathol.,l;51 (3-4):377-85, 1996.
50. Elvehjem C.A., Steenbock H., Hart E.B. The effect of diet on the copper of milk // J. Biol. Chem., 83, 27-34, 1929.
51. Ettinger M.J., Darwish H.M., Schmitt R.C. Mechanism of copper transport from plasma to hepatocytes // Fed.Proc., 45,12:2800-2804, 1986.
52. Faller R.A., McArdle H.J., Camakaris J. Effects of metallothionein on the observed copper distribution in cell extracts // J.Inorganic Biochemistry, 49, 1:9-3, 1993.
53. Fleming R.E., Gitlin J.D. Primary structure of rat ceruloplasmin and analisis of tissue specific gene expression during development // J.Biol.Chem., 265, 13:77017709, 1990.
54. Forbes J.R., Cox D.W. Functional characterization of missense mutations in ATP7B: Wilson disease mutation or normal variant? // Am. J. Hum. Genet., 63(6): 1663-74, 1998,
55. Fortna R.R, Watson H.A, Nyquist S.E. Glycosyl phosphatidylinositol-anchored ceruloplasmin is expressed by rat Sertoli cells and is concentrated in detergent-insoluble membrane fractions // Biol. Reprod., 61(4): 1042-9, 1999.
56. Freedman J.H., Ciriolo M.R., Peisach J. The role of glutathione in copper metabolism and toxicity // J. Biol. Chem., 264, 5598-5605, 1989.
57. Frieden E. Perspectives on copper biochemistry // Clin. Physiol. Biochem., 4(1): 119, 1986.
58. Frieden E. Caeruloplasmin: a multi-functional metalloprotein of vertebrate plasma. In:Biological roles of copper // Excepta Medica, 93-124, 1980.
59. Frieden E. Isolation of the ceruloplasmin receptor from erythrocytes of the rat // Analyt. Biochem., 103, 1:113-118, 1993.
60. Frieden E. Metal ions in biological systems. Ed. H. Siegel. N. Y.; Basel: Marcel Deccer Inc., 13: 2-14, 1981
61. Gaitskhoki V.S., L'vov L.V., Puchkova L.V., Schwartzman A.L., Neifakh S.A. Highly purifid ceruloplasmin messenger RNA from rat liver // Mol. Cel. Biochem., 35:171-182, 1981.
62. Gitlin J.D. Transcriptional regulation of ceruloplasmin gene expression during inflammation//J. Biol. Chem., 263, 6281-6287, 1988.
63. Hamanaka R., Kohno K., Segushi Т., Okamura A. Induction of Low density lipoprotein receptor and a transcription factor SP-1 by tumor necrosis factor in human microvascular endotelial cells//J. Biol. Chem., 267, 19:13160-13165, 1992.
64. Harris E.D., Reddy M.C., Qian Y., Tiffany-Castiglioni E., Majumdar S„ Nelson J. Multiple forms of the Menkes Cu-ATPase //Adv. Exp. Med. Biol., 448, 39-51, 1999.
65. Harris E.D. Copper transport: an overview // Society Experim. Biol, and Medicine, 130-140, 1991.
66. Harris Z.L., Morita H., Gitlin J.D. The biology of human ceruloplasmin. In: Multi-copper oxidases, Academic Press, N.-Y., P. 285-303, 1977.
67. Harris Z.L., Takahashi Y., Miyajima H., Serizawa M., MacGillivray R., Gitlin J.D. Aceruloplaminemia: molecular characterization of this disoder of iron metabolism // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 2539-2543, 1995.
68. Harris Z.L., Klomp L.W., Gitlin J.D. Aceruloplasminemia: an inherited neurodegenerative disease with impairment of iron homeostasis // Am. J. Clin. Nutr., 67(5 Suppl):972S-977S, 1998.
69. Harrison M.D., Dameron C.T. Molecular mechanisms of copper metabolism and the role of the Menkes disease protein // J. Biochem. Mol. Toxicol., 13(2):93-106, 1999.
70. Harrison M.D., Meier S., Dameron C.T. Characterisation of copper binding to the second sub-domain of the Menkes protein ATPase (MNKr2) // Biochem. Biophys. Acta, 24, 1453(2):254-60, 1999.
71. Heyduk E., Heyduk T. //Biochemistry, 33, 9643-9650, 1994.
72. Hilton M., Spenser D.C., Ross P., Ramsey A., McArdle H.J. Characterisation of the copper uptake mechanism and isolation of the ceruloplasmin receptor/copper transporter in human placental vesicles // Biochem. Biophys. Acta, 1245:153-160, 1995
73. Holmberg C.G. On the presence of a laccase-like enzyme in serum and its relation to the copper in serum // Acta. Physiol. Scand. 8:227-229, 1944.
74. Holmberg C.G., Laurell C.B. Investigations in serum copper II // Acta.Chem.Scand. 2:550-556, 1948.
75. Hung I.H., Suzuki M., Yamaguchi Y„ Yuan D.S., Klausner R.D., Gitlin J.D. Biochemical characterization of the Wilson disease protein and functional expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae // J. Biol. Chem. 22,272(34):21461-6, 1997.
76. Hunter W.M. Greenwood F.C. Standardization of the chloramin-T method of protein iodination // Nature, 194, 495-496, 1962.
77. Hurley L.S., Keen C.L., Lonnerdal B.O. Copper in fetal and neonatal development // Hunt Ciba Foundation Symp., 227-245, 1980.
78. Iida M., Terada K., Sambongi Y., Wakabayashi Т., Miura N., Koyama K., Futai M., Sugiyama T. Analysis of functional domains of Wilson disease protein (ATP7B) in Saccharomyces cerevisiae // FEBS Letters, 29, 428(3):281-5, 1998.
79. Janger J.L., Shimizu, Gitlin J.D. Tissue-specific synthesis of the ceruloplasmin by mamary glands of the rat // Biochem. J., 280, 3:671-677, 1977.
80. Jensen P.Y., Bonander N., Horn N., Turner Z., Farver O. Expression, purification and copper-binding studies of the first metal-binding domain of Menkes protein // Eur. J. Biochem., 264(3):890-6,1999.
81. Juan S.H., Guo J.H., Aust S.D. Loading of iron into recombinant rat liver ferritin heteropolymers by ceruloplasmin// Arch. Biochem. Biophys., 15, 341(2):280-6, 1997.
82. Karlin K.D. Metalloenzymes, structural motif, and inorganic models // Science, 261, 701-707, 1993.
83. Kataoka M., Tavassoli M. Identification of ceruloplasmin receptors on the surface of human blood monocytes, granulocytes, and lymphocytes // Exp. Hematol., 13(8):806-10, 1985.
84. Kataoka M., Tavassoli M., Ceruloplasmin receptors in liver cell suspensions arelimited to the endothelium // Exper.Gell Res., 155, 2:232-240, 1984.
85. Kelly E.J., Palmiter R.D. A murine model of Menkes disease reveals a physiological function of metallothionein // Nat. Genet., 13 (2): 219-222,1996.
86. Kim I.G., Park S.Y, Kim K.C., Yum J.J. Thiol-linked peroxidase activity of human ceruloplasmin. FEBS Letters, 431, 473-475, 1998.
87. Kirby В., Danfs D., Legge G., Mercer J. Analysis of the distribution of Cu, Fe and Zn and other elements in brindled mouse kidney using a scanning proton microprobe // J. Inorganic Biochemistry, 71, 189-197, 1998.
88. Klomp L.W., Farhangrazi Z.S., Dugan L.L, Culotta V., Gitlin J.D. Ceruloplasmin gene expression in the murine central nervous system // J. Clin. Invest., 98, 207-215, 1996.
89. Klomp L.W., Lin S.-J., Yuan D.S, Klausner R.D., Culotta V., Gitlin J.D. Identification and functional expression of HAH1, a novel human gene involved in copper homeostasis // J. Biol. Chem., 272, 9221-9226, 1997.
90. Koschinsky M L., Chow B.K.-C., Schwartz J., Hamerton J.L., MacGillivray R.T.A. Isolation and characterization of a processed gene for human ceruloplasmin // Biochemistry, 26, 7760-7767, 1987.
91. Koschinsky M.L., Funk W.D., Van Oost B.A., MacGillivray R.T. Complete cDNA seguence of human preceruloplasmin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:5086-5090, 1986.
92. Kroll I. A mannual of quantitative immuno-electrophoresis. Ed. by N.H. Axelsen, J.Kroll, B.Weeke. Oslo-Bergen-Troms: Universitet Storlaget, 1973.
93. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature, 227,680-685,1970.
94. Langlotz P., K.H. Kroner, Surface-modified membranes as a matrix for protein purifacation//J. Chromatogr., 591,107, 1992.
95. Lee C.R., Nacht S., Lukens J.N., Cartwright G. Iron metabolism in copper deficient swine // J. Clin. Invest., 47, 2058-2069, 1968.
96. Lee S.H., Lancey R., Montaser A., Madani N., Linder M.C. Ceruloplasmin and copper transport during the latter part of gestation in the rat // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 203(4):428-39, 1993.
97. Li Y., Togashi Y., Sato S., Emato Т., Kang J.-H., Takeichi N., Kobayashi H. Spontaneous hepatic copper accumulation in long-evans cinnamon rats with hereditary hepatitis // J. Clin. Invest., 87, 1858-1861, 1991.
98. Lin S.-J., Pufahl, Dancis A., O'Halloran T.V., Culotta V. A role of the Saccharomyces cerevisiae ATX1 gene in copper trafficing and iron transport // J. Biol. Chem., 272, 9215-9220, 1997.
99. Linder M.C., Moor J.R. Plasma ceruloplasmin. Evidence for its presence in and other organs of the rat // Biochem. Biophys. Acta, 499, 3:329-336, 1977.
100. Linder M.C., Wooten L., Cerveza P., Cotton S„ Shulze R, Lomeli N. Copper transport//Am. J. Clin. Nutr., 67(5 Suppl):965S-971S, 1998.
101. Liu X.F., Supek F., Nelson N., Culota V.C. Negative control of heavy metal uptake by the Saccharomyces cerevisiae BSD2 gene // J. Biol. Chem., 272, 1176311769, 1997.
102. Lutsenko S., Kaplan J.H. Organization of P-type ATPases: significance of structural diversity//Biochemistry, 5, 34(48): 15607-13, 1995.
103. Lutsenko S., Cooper M.J. Localization of the Wilson's disease protein product to mitochondria//Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 26, 95(11): 6004-9, 1998.
104. L'vovskaia E.I., Gavriliuk T.A., Mokhova S.V. In vitro effect of BITO preparation, ceruloplasmin, transferrin, and essentiale on the intensity of lipid peroxidation during thermal injury // Vopr. Med. Khim., 42(2): 125-7, 1996.
105. Mason K.E. A conspectus of research on copper metabolism and requirements of man // J.Nutr., 109,11:1979-2066, 1979.
106. Menkes J.H., Alter M., Steigleder G., Wekley D.R., Sung J.H. A sex-linked recessive disoder with retardation of growth, pecular hair and focal cerebral and cerebellar degeneration // Pediatrics, 29, 764-79, 1962.
107. Mercer J.F., Grimes A., Ambrosini L., Lockhart P., Paynter J.A., Dierik H., Glover T.W. Mutations in the murine homologue of the Menkes gene in dappled and blotchy mice // Nat. Genet., 6, 374-378, 1994.
108. Mercer J.F.B., Livingston J., Hall В., Paynter J.A. Isolation of a partial candidate gene for Menkes disease by positional cloning // Nature Genetics, 3, 1:20-25, 1993.
109. Mercer J.F. Menkes syndrome and animal models // Am. J. Clin. Nutr, 67(5 Suppl): 1022S-1028S, 1998.
110. Mertz W. Trace elements // Science, 211,315-319, 1985.
111. Messerschmidt A., Huber R. The blue oxidases, ascorbat oxidase, laccase and ceruloplasmin//Eur. J. Biochem., 187:341-352, 1990.
112. Milne D.B. Copper intake and assessment of copper status // Am. J. Clin. Nutr., 67(5 Suppl): 1041S-1045S, 1988.
113. Mistilis S.P., Mearric P.T. The absorption of ionic, biliary, and plasma radiocopper in neonatal rats // Scand. J. Gastroenterol., 4:691-696, 1969.
114. Mukhopadyay C.K., Attien Z.K., Fox P.L. Role of ceruloplasmin in cellular iron uptake//Science, 279, 714-717, 1998.
115. Mukhopadyay C.K., Mazumder В., Lindley P.F., Fox P.L. Identification of the prooxidant site of human ceruloplasmin: a model for oxidative damage by copper bound to protein surfaces // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 11546-11551, 1997.
116. Muramatsu T. Yamada M. Miura T. Sakai Y. Suzuki T. Serikawa, R.E., Tanzi K., Matsumoto K. Wilson's disease gene is homologous to its causing abnormal copper transport in Long-Evans cinnamon rats // Gastroenterology, 107,1189-1192 1994.
117. Musci G., Fraterrigo T.Z., Calabrese L., McMillin D.R. On the liability and functional significance of the type 1 copper pool in ceruloplasmin // J. Biol. Inorg.1. Chem., 4(4):441-6, 1999.
118. Musci G., Di Marco S., Bellenchi G.C., Calabrese L. Reconstitution of ceruloplasmin by the Cu(I)-glutathione complex. Evidence for a role of Mg2+ and ATP // J. Biol. Chem., 26;271(4): 1972-8, 1996.
119. O'Halloran T.V. Transition metals in control of gene expression // Science, 261, 715-724, 1993.
120. Okamoto N. Wada S., Oga Т., Kawabata Y., Baba Y„ Habu D, Takeda Z„ Wada Y. Hereditary ceruloplasmin deficiency with hemosiderosis // Hum. Genet., 97(6):755-8, 1996.
121. Olivares M., Uauy R. Copper as an essential nutrient // Am. J. Clin. Nutr., 63(5):791S-6S, 1996.
122. Omoto E., Tavassoli M. Purification and partial characterization of ceruloplasmin receptors from rat liver endothelium // Arch. Biochem. Biophys., 282(l):34-8, 1990.
123. Orena S.J., Goode C.A., binder M.C. Binding and uptake of copper from ceruloplasmin// Biochem. Biophys. Res. Commun., 139:822-829, 1986.
124. Ortel T.L., N. Takahashi, F.W. Putnam. Structural model of human ceruloplasmin based on internal triplication, hydrophilic/hydrophobic character, and secondary structure of domains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4761-4765, 1984.
125. Owen C.A. Wilson's disease: The Etiology, Clinical aspects and Treatment of inhereted copper to toxicosis. N.N.: Noges publications. 1981. 539p.
126. Palida F.A., Ettinger M.J. Identification of proteins involved in intracellular copper metabolism//J.Biol. Chemistry, 266, 4586-4592, 1991.
127. Patel B.N., David S. A novel glycosylphosphatidylinositol-anchored form of ceruloplasmin is expressed by mammalian astrocytes // J. Biol. Chem., 272, 2018520190, 1997.
128. Payne, A.S.; Kelly, E.J.; Gitlin, J.D. Functional expression of the Wilson disease protein reveals mislocalization and impaired copper-dependent trafficking of the common H1069Q mutation // Proc. Nat. Acad. Sci., 95:10854-10859, 1998.
129. Paynter J.A., Grimes A., Lockhart P., Mercer J.F.B. Expression of the Menkes gene homologue in mouse tissues lack of effect of copper on the mRNA levels // FEBS Letters, 351, 186-190, 1994.
130. Petris M.J., Camakaris J., Greenough M., LaFontaine S., Mercer J.F.B. A C-terminal di-leucine is required for localization of the Menkes protein in the trans-Golgi network//Hum. Mol. Genet., 7(13):2063-71, 1998.
131. Petris M.J., Mercer J.F. The menkes protein (ATP7A; MNK) cycles via the plasma membrane both in basal and elevated extracellular copper using a C-terminal di-leucine endocytic signal//Hum. Mol. Genet., 8(11):2107-15, 1999.
132. Phung L.T., Ajlani G., Haselkorn R. P-type ATP-ase from the cyanobacterium synechococcus 7942 related to the human Menkes and Wilson disease gene products // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9651-9654, 1994.
133. Phung L.T., Ajlani G., Haselkorn R. P-type ATPase from the cyanobacterium Synechococcus 7942 related to the human Menkes and Wilson disease gene products. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (20):9651-9654, 1994.
134. Platonova G.A., Pankova G.A., ll'ma I.Ye., Vlasov G.P. and Tennikova T.B. Quantitative fast fraction of a pool of polyclonal antibodies by immunoaffinity membrane chromatography // J. Chromatogr. A, 852, 129-140, 1999.
135. Puchkova L.V., Gaitskhoki V.S., Monakhov N.K., Timchenko L.T., Neifakh S.A. Preproceruloplasmin is a primary product of cell-free translation of ceruloplasmin messenger RNA // Mol. Cell. Biochem., 35, 1:159-169, 1981.
136. Pyle A.M. Ribozmes: a distinct class of metalloenzymes // Science, 261, 709714, 1993.
137. Qi M., Byers P.H. Constitutive skipping of alternatively spliced exon 10 in the ATP7A gene abolishes Golgi localization of the Menkes protein and produces the occipital horn syndrome // Hum. Mol. Genet., 7(3):465-9, 1998.
138. Reddy C.M., Harris E.D. Multiple transcripts coding for the Menkes gene: evidence for alternative splicing of Menkes mRNA // Biochem. J., 334, 71-77, 1998.
139. Reilly C.A., Aust S.D. Iron loading into ferritin by an intracellular ferroxidase // Arch. Biochem. Biophys., 1, 359(l):69-76, 1998.
140. Reilly C.A., Sorlie M., Aust S.D. Evidence for a protein-protein complex during iron loading into ferritin by ceruloplasmin // Arch. Biochem. Biophys., 1;354(1):165-71, 1998.
141. Rhoads R.E Ovalbumin Messenger Ribonucleic Acid // J. Biol. Chem., 25:80888097, 1975
142. Royle N.J., Irwin D.M., Koschinsky M.L., MacGillivray R.T.A., Hamerton J.L. Human genes encoding prothrombin and ceruloplasmin map to llpll-ql2 and 3q21-24, respectively// Somat. Cell Molec. Genet. 13, 285-292, 1987.
143. Ryan T.P., T.A. Grover, S.D. Aust. Rat ceruloplasmin: resistance to proteolysis and kinetic comparison with human ceruloplasmin // Arch. Biochem. Biophys., 293: 18, 1992.
144. Ryden L. Ceruloplasmin is a single peptide chain // Eur. J. Biochem., 26, 380386, 1972.
145. Sarkar B. Treatment of Wilson and Menkes diseases // Chem. Rev., 99, 25351. У12544, 1999.
146. Sato M., Gitlin J.D. Mechanisms of copper incorporation during the biosynthesis of human ceruloplasmin // J. Biol. Chem., 266, 8, 5128-5134, 1991.
147. Schaefer M., Hopkins R.G., Failla M.L., Gitlin J.D. Hepatocyte-specific localization and copper-dependent trafficking of the Wilson's disease protein in the liver// Am. J. Physiol, 276(3 Pt 1):G639-46, 1999.
148. Schwartzman A.L., Gaitskhoki V.S., L'vov V.M., Nosikov V.V, Braga E.M, Frolova L.Yu., Skobeleva N.A., Kisselev L.L., Neifakh S.A. Complex molecular structure of the gene coding for rat ceruloplasmin // Gene, 11:1-10, 1980.
149. Seymoor M.M, Kojimahara N., Nakabayashi H., Shikata Т., Esumi M. Defective copper binding to apo-ceruloplasmin in a rat model and patients with Wilson's disease//Liver, 15, 135-142, 1995.
150. Silver S, Nucifora G, Phung L.T. Human Menkes X-chromosome disease and the staphylococcal cadmium-resistance ATPase: a remarkable similarity in protein sequences // Mol. Microbiol., 10 (1):7-12, 1993.
151. Smith C., Hager G.L. Transcriptional regulation of mammalian genes in vitro // J. Biol. Chem., 272, 27493-27496, 1997.
152. Srai S.K.S., Burroughs A.K, Epstein B.W.O. The ontogeny of liver copper metabolism in the Guinea Pig: clues to the etiology of Wilson's disease // Hepatology, 6,3:427-432,1986.
153. Stern R.V, Frieden E. Partial purification of the rat erythrocyte ceruloplasmin receptor monitored by an electrophoresis mobility shift assay // Anal. Biochem.,212(1):221-8, 1993.
154. Stevens M.D., DiSilvestro R.A., Harris E.D. Specific receptor for ceruloplasmin in membrane fragments from aortic and heart tissues // Biochemistry, 23,261-266,1984.
155. Strausak D„ La Fontaine S„ Hill J., Firth S.D., Lockhart P.J., Mercer J.F. The role of GMXCXXC metal binding sites in the copper-induced redistribution of the Menkes protein // J. Biol. Chem., 16, 274(16): 11170-7, 1999.
156. Sugio Y., Kuwano A., Miyoshi O., Yamada K., Niikawa N., Tsukahara M. Translocation t(X;21)(ql3.3; pi 1.1) in a girl with Menkes disease // Am. J. Med. Genet., 23, 79(3): 191-4, 1998.
157. Takahashi N., R.A. Bauman, T.L. Ortel, F.E. Dwulet, C.C. Wang, F.W. Putnam Internal triplication in the structure of human ceruloplasmin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:115-119, 1983.
158. Takahashi N., T.L. Ortel, F.W. Putnam Single-chain structure of human ceruloplasmin: the complete amino acid sequence of the whole molecule // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 390-394, 1984.
159. Tavassoli M. Trans Liver endothelium binds, transports, and desialates ceruloplasmin which is then recognized by galactosyl receptors of hepatocytes // Assoc. Am. Physicians, 98:370-7, 1985.
160. Tennikova T.B., Svec F. High-performance membrane chromatography: highly efficient separation method for proteinisin ion-exchange, hydrophobic interaction and reversed-phase modes // J. Chromatogr., 646,279-281, 1993.
161. Terada K., Schilsky M.L., Miura N., Sugiyama Т. ATP7B (WND) protein // Jnt. Biochem. Cell. Biol., 30(10): 1063-7, 1998.
162. Terada K., Aiba N., Yang X.L., Iida M., Nakai M., Miura N., Sugiyama T.
163. Biliary excretion of copper in LEC rat after introduction of copper transporting P-type ATPase, ATP7B // FEBS Letters, 1, 448(l):53-6, 1999.
164. Turner Z., Lund C., Tolshave J., Vural В., Tonnesen Т., Horn N. Identification of point mutations in 41 unrelated patients affected with Menkes disease // Am. J. Hum. Genet., 60 (1): 63-71, 1997.
165. Turner Z., Vural В., Tonnesen Т., Chelly J., Monaco A.P., Horn N. Characterization of the exon structure of the Menke disease gene using vectorette PCR // Genomics, 26 (3): 437-442, 1995.
166. Turner Z., Horn N. Menkes disease; Recent advances and new insights into copper metabolism // Anhals of Medicine, 28:121-129, 1996.
167. Underwood E.J. Trace element in human and animal nutriton, 4th. edn. Academic Press, New York (Chapter 3, p 56-108), 1977.
168. Valentine J.S. Gralla E.B. Delivering copper inside yeast and human cells // Science, 278, 817-818, 1997.
169. Verbina I.A., Puchkova L.V., Gaitskhoki V.S., Neifakh S.A. Isolation and partial characterization of molecular forms of ceruloplasmin from human bile // FEBS Letters, 298, 105-108, 1992.
170. Vulpe C., Levinson В., Whitney S., Packman S., Gitscher J. Isolation of a candidate gene for Menkes disease and evidence that it encodes a copper-transporting ATPase//Nature Genet., 3, 7-13, 1993. v
171. Vulpe C.D., Kuo Y.M., Murphy T.L., Cowley L., Askwith C., Libina N., Gitschier J., Anderson G.J. Hephaestin, a ceruloplasmin homologue implicated in intestinal iron transport, is defective in the sla mouse // Nat. Genet., 21(2): 195-9, 1999.
172. Wang H., Koschinsky M., Hamerton J.L. Localization of processed gene for human ceruloplasmin to chromosome region 8q21.13-q23.1 by in situ hybridization // Cytogenet. Cell Genet., 47, 230-231, 1988.
173. Weiss K.C., Linder M.C. Copper transport in rats involving a new plasma protein // Am. J. Physiol., 249: E327-333, 1985.
174. Wince D.R. Copper-regulatory domain involved in gene expression // Advances in Genetics. Academic Press, 165-195, 1998.
175. Yamaguchi Y., Heiny M.E., Gitlin J.D. Isolation and characterization of human liver cDNA as a candidate gene for Wilson disease // Biochem. Biophys. Res. Commun., 197:271-7, 1993.
176. Yang F., Freidrichs W.E., Cupples R.L., Bonifacio M.J., Sanford J. A., Horton W.A., Bowman B.H. Human ceruloplasmin. Tissue-specific expression of transcripts produced by alternative splicing//J. Biol. Chem. 265, 18:10780-10785, 1990.
177. Yang X.L., Miura N., Kawarada Y., Terada K., Petrukhin K., Gilliam Т., Sugiyama T. Two forms of Wilson disease protein produced by alternative splicing are localized in distinct cellular compartments // Biochem. J., 15,326 (Pt 3):897-902, 1997.
178. Yoshimizu Т., Omote H., Wakabayashi Т., Sambongi Y., Futai M. Essential Cys-Pro-Cys motif of Caenorhabditis elegans copper transport ATPase // Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(6): 1258-60, 1998.
179. Yuan D.S., Stearman R., Dancis A., Dunn Т., Beeler Т., Klausner R.D. The Menkes/Wilson disease gene homologue in yeast provides copper to a ceruloplasmin-like oxidase required for iron uptake // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 28,92(7):2632-6, 1998.
180. Zaitseva MEDLINE: Pubmed (MMDB Id: 5142 PDB Id: 1KCW).
181. Zaitseva, I., Zaitsev, V., Card, G., Moshkov, К., Bax, В., Ralph, A. and Lindley, P. The nature of the copper centers in human ceruloplasmin // J. Biol. Inorg. Chem., 1, 1:15-22, 1996.
182. Zhou В., Gitschier J. hCTRl: a human gene for copper uptake identified by complementation in yeast // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8, 94(14):7481-6, 1998.
-
Платонова, Наталья Андреевна
-
кандидата биологических наук
-
Санкт-Петербург, 2000
-
ВАК 03.00.04
- Характеристика взаимодействия Na/K-АТРазы и NMDA-рецептора в гранулярных клетках мозжечка
- Метаболическая система меди головного мозга крысы
- Тканеспецифический синтез рецептора церулоплазмина и его взаимодействие с церулоплазмином
- Механизм поступления цисплатина в клетки с участием системы транспорта меди
- Роль церулоплазмина молока как источника ионов меди для новорожденных
