Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболическая система меди головного мозга крысы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболическая система меди головного мозга крысы"

На правах рукописи

□0306443Э

ПОВАЛИХИН Роман Геннадьевич

МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ СИСТЕМА МЕДИ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫСЫ

03.00.04 - биохимия 03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2007 г. 1 6 АВГ 2007

003064439

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН (Санкт-Петербург) и на кафедре общей физиологии Биолого-почвенного факультета ГОУ Санкт-Петербургский государственный университет

Научные руководители: доктор биологических наук,

доцент по биохимии Надежда Васильевна Цымбаленко

академик РАН, доктор биологических наук, профессор,

Александр Данилович Ноздрачев

Официальные оппоненты: Кокряков Владимир Николаевич,

руководитель Лаборатории общей патологии в Отделе общей патологии и патологической физиологии ГУ НИИЭМ РАМН доктор биологических наук, профессор

Гринкевич Лариса Николаевна,

ведущий научный сотрудник Института физиологии им И П Павлова РАН доктор биологических наук

Ведущее научное учреждение ГУ Научно-исследовательский институт Эволюционной физиологии и биохимии им И М Сеченова РАН

Защита диссертации состоится 20 сентября 2007 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д001 022 03 при ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН в конференц-зале ГУ НИИЭМ РАМН по адресу 197376 Санкт-Петербург, Каменноостровский пр , д 69/71

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины по адресу 197376, Санкт-Петербург, ул Академика Павлова, д 12

Автореферат разослан «_»_2007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета Д001 022 03 дбн, проф

Л В Пучкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Медь, после железа, является самым распространенным микроэлементом Она входит в активные центры купроэнзимов, которые у млекопитающих участвуют в окислительном фосфорилировании, детоксикации активных радикалов, синтезе коллагена и эластина, образовании окиси азота, нейромедиаторов и нейропептидов, а также контролируют двунаправленный перенос ионов железа через мембраны (Karlin, 1993, Torres, Wilson, 1999, De Freitas et al, 2003) Одновременно ионы меди являются высокотоксичными агентами, так как способны индуцировать образование радикалов, разрушающих все типы биомолекул (Linder, 2001) Безопасное поступление ионов меди в клетки, перенос их к местам образования купроэнзимов и выведение из клеток обеспечивает специальная система белков (метаболическая система меди, МСМ) (Репа et al, 1999)

В последние годы некоторые гены этой системы клонированы и изучены основные принципы ее работы Общий план организации МСМ прокариотов и эукариотов одинаков — она включает интегральные мембранные и растворимые цитозольные белки, гены этих систем ортологичны, их структура характеризуется высокой консервативностью, а функции сохраняются в эволюции В этой системе важную роль играют два семейства белков, участвующих в транспорте меди через мембраны родственные медьтранспортные АТФазы Р1 типа - АТФаза Менкеса (Atp7a) и АТФаза Вильсона (Atp7b) (Сох, Moore, 2002) и белки семейства CTR1, включающие высокоафинные импортеры меди (Sharp, 2003) К неклеточным компонентам МСМ млекопитающих может быть отнесена секреторная форма церулоплазмина (ЦП), медь содержащего гликопротеина сыворотки крови, которая, помимо транспорта меди, вместе с изоформой ЦП, связанной с клеточной мембраной через гликозил фосфатидил инозитоловый якорь (ГФИ-ЦП), участвует и в метаболизме железа (Patel et al, 2000 Fortna et al, 1999)

Перенос ионов меди белками этой системы к местам образования купроэнзимов происходит однонаправлено и последовательно при прямых белок-белковых взаимодействиях, благодаря которым в клетках нет свободных ионов меди (Rae et al, 1999) У млекопитающих баланс меди поддерживается согласованной работой тканеспецифических МСМ,

центральным звеном которых является МСМ печени Общее число участников МСМ у млекопитающих увеличивается за счет паралогичных генов, и МСМ клеток различных органов отличаются друг от друга комбинацией белков, входящих в эту систему, уровнем экспрессии кодирующих их генов и хронологией активации в течение развития (Пучкова, Платонова, 2003)

У человека мутации в генах МСМ являются причиной целого ряда тяжелых моногенных рецессивных наследственных заболеваний (болезнь Вильсона, болезнь Менкеса, ацерулоплазминемия) (Сох, Moore, 2002) Более того, гетерозиготное носительство мутаций в этих генах играет существенную роль в развитии нейродегенеративных болезней пожилого возраста (Johnson, 2001) Также показано, что болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и прионовые болезни тесно связаны с нарушением метаболизма меди и зависимого от него транспорта железа (Brown, 2003) К тому же даже незначительные нарушения метаболизма меди как экологичекого, так и наследственного характера, приводят к развитию нейродегенеративных заболеваний (Gaggelliet al, 2006)

Все это привлекает пристальное внимание к механизмам, обеспечивающим круговорот меди в мозгу, многие стороны которого остаются не понятыми Это в первую очередь касается регионспецифических особенностей метаболизма меди в мозгу, общей организации автономной системы поддержания баланса меди за гематоэнцефалическим барьером и связи между статусом меди отдела мозга и его физиологическими функциями

Цель работы - сравнительное изучение статуса меди и профиля экспрессии генов медьтранспортных белков в различных отделах головного мозга взрослых крыс

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи

1 Определить статус меди в различных отделах мозга (кора, гипофиз, мозжечок, миндалевидное тело, гипоталамус, гиппокамп и сосудистое сплетение) взрослой крысы

2 В отделах мозга крыс, взятых в рассмотрение, методом полуколичественного ОТ-ПЦР определить квазистационарную концентрацию мРНК, кодирующих медьтранспортные белки МСМ ЦП, ГФИ-ЦП, Atp7a, Atp7b и CTR1

3 Установить внутриклеточную локализацию белковых продуктов генов Ср, А1р7а и А1р7Ь в этих отделах мозга

4 Определить тип клеток нейрональной ткани, в которых экспрессируются изучаемые гены МСМ

Положения, выносимые па защиту:

1 Метаболическая система меди мозга состоит из ряда регионспецифических МСМ

2 МСМ различных отделов мозга отличаются профилем экспрессии генов, поддерживающих в них гомеостаз меди

3 Внутриклеточная локализация медьтранспортных белков отличается в различных отделах мозга

4 Нейроны, клетки глии и эпендимы отличаются набором белков МСМ, синтезирующихся в них

Научная новизна полученных результатов. В работе показано, что отделы мозга крысы отличаются друг от друга по содержанию меди и баланс меди в них поддерживается регионспецифическими МСМ На это указывает то, что 1) активность генов, участвующих в переносе меди, существенно отличается в разных отделах мозга, 2) в нейронах, глиальных клетках и клетках эпендимы экспрессируются разные комбинации белков, транспортирующих медь Полученные данные позволили разделить изучаемые отделы мозга по свойствам их МСМ на три группы 1. Отделы мозга, характеризующиеся глиальным индексом примерно 1 В этих отделах практически одинаковая концентрация меди и содержание Ог1-мРНК, ГФИ-ЦП-мРНК и А1р7а-мРНК В тоже время в них очень низкий уровень А1р7Ь-мРНК и не найдена ЦП-мРНК При этом в глиальных клетках экспрессируется ГФИ-ЦП-мРНК, а в нейронах - А1р7а-мРНК В эту группу входят кора, миндалевидное тело, мозжечок и гиппокамп

2 Отделы, характеризующиеся высокой концентрацией меди, выраженной активностью генов А1р7а и А1р7Ь, а также присутствием ЦП-мРНК В эту группу входят специализированные железы нейросекреции гипоталамус и гипофиз

3 Третья группа представлена одним отделом - сосудистым сплетением Этот отдел мозга практически не содержит ионов меди, но характеризуется

самым высоким содержанием мРНК всех изученных медьтранспортных белков

Научно-практическое значение полученных результатов. Данные о содержании и распределении ионов меди, а также об уровне и месте экспрессии изучаемых генов МСМ крысы в различных отделах мозга будут способствовать пониманию механизма, обеспечивающего баланс меди в мозгу млекопитающих Эти результаты при сопоставлении с регионспецифическими изменениями, наблюдаемыми при различных нейродегенеративных заболеваниях, могут помочь понять роль нарушений гомеостаза меди в развитии этих заболеваний

Апробация результатов работы. Результаты работы были доложены в форме устных и стендовых сообщений на 10-ом Международном Конгрессе по генетике человека, Вена, Австрия, 15-19 мая 2001 г, III Съезде биохимического общества России, Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 г, Конференции молодых ученых Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины-2002 Санкт-Петербург, 6-ой, 7-ой, 8-ой и 9-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века, Пущино-на-Оке, 2002 - 2005 г г, Международной Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, Киев, Украина, 25-27 сентября, 2003 г, на 12-ом Международном Конгрессе по генетике человека, Бирмингем, Великобритания, 2003 г, Пятом съезде российского общества медицинских генетиков, Уфа, май 2005г

По результатам диссертации опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах, которые входят в перечень изданий рекомендованных ВАК для публикации результатов, представляемых в диссертациях

Личный вклад соискателя. Соискатель принимал участие во всех экспериментах Получение субклеточных фракций, экстракция мРНК, электрофоретический анализ, иммуноблоттинг и подготовка образцов для измерения концентрации ионов меди проводились лично соискателем ОТ-ПЦР анализ проведен соискателем вместе с Платоновой Н А Иммуногистохимический анализ проведен совместно с Барабановой С В на базе Отдела общей паголожи и патологической физиологии ГУ НИИЭМ РАМН Измерение концеш рации меди проводилось в Санкт-Петербургском

Государственном Политехническом Университете Соискатель принимал участие в планировании экспериментов, обработке результатов, их анализе и в подготовке публикаций

Структура и объем диссертации. Диссертация построена по традиционной схеме и содержит разделы "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы", "Список

цитируемой литературы", включающий _ иностранных и _

отечественных источников Диссертация изложена на _ страницах

Результаты представлены в _ таблицах и иллюстрированы _

рисунками

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на белых беспородных крысах самцах весом 180-200 грамм, полученных из питомника "Рапполово", Ленинградская область Крыс содержали в условиях вивария в пластиковых клетках при температуре 22±2 °С, влажности 60-70% и естественном освещении Животные имели свободный доступ к воде и пище

Забор СМЖ у крыс производили из затылочной цистерны под эфирным наркозом

При выполнении работы использовали реактивы фирм "Sigma" (ферменты и субстраты), "Serva" (реактивы для электрофореза), "Merck" (соли), "Gibco/Invitrogen" (KIT для выделения PHK-TRIZOL), "Syntol" (праймеры), компьютерные программы "Oligo" для подбора праймеров, «Scion Image» для анализа ПЦР продуктов, «Видео Тест Мастер 4» - для обработки изображения срезов мозга

Выделение фракции, обогащенной фрагментами плазматической мембраны, мембран эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, митохондрий и субмитохондриальных фракций, а также лизосом и пероксисом осуществляли с помощью методов дифференциального и изопикнического ультрацентрифугирования Получение антител к ЦП и АТФазам Менкеса и Вильсона, иммуноэлектрофорез, электрофорез белков в ПААГ и иммуноблотинг, выделение тотальной клеточной РНК, синтез кДНК, ПЦР, электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле, электрофоретическое разделение белков, хемилюминесцентный

иммуноблотинг, иммуноэлектрофорез, а также спектрофотометрическое определение концентрации белков, нуклеиновых кислот и определение концентрации металлов методом атомно-абсорбционной спектроскопии осуществляли, как описано ранее (Васин и др, 2005, Платонова и др, 2004, Платонова и др 2005) Последовательности праймеров, использованных в работе, приведены в таблице 1 Статистическая обработка полученных данных проведена по методу Стьюдента

Таблица 1.

Характеристика праймеров, использованных для выявления зрелых транскриптов генов медьтранспортных белков.

прайме-ры для выявления мРНК Нуклеотидные последовательности праймеров Координаты (п.н ) Длина ПЦР-продукта (п н.) Темп Отж. (°С)

ЦП прям, обр 5'AGTAAACAAAGTCACAACGAGGAAT 3' 5'TCGTATTCCACTTATCACCAATTTA 3 ' 2830 3202 398 57

ГФИ-ЦП прям. обр 5'AGTAAACAAAGTCACAACGAGGAAT 3' 5' CTCCTTGGTAGATATTTGGAATААА 3' 2830 3252 436 57

7а1 прям 7а2 обр. 5'CTACTTTCCCGGCTACAACAGA 3' 5'AGTCTCCCACCAGAAGTGAGTG 3' 2909 4476 1568 56

7Ы прям. 7Ь2 обр. 7ЬЗ прям. 7Ь4 обр 5' ACTTTCCTAGCCCTAGCAAGCA 3' 5' AGATGCACTGCTCTTCATCCCT 3' 5* TGTGCGTCCTGTGTGTCTAACA 3' 5' TGCTTGCTAGGGCTAGGAAAGT 3' 2854 4371 1524 1385 56 58

Р-актин прям. обр. 5' GAAGATCCTGACCGAGCGTG3' 5' AGCACTGTGTTGGCATAGAG 3* 570 896 326 58

РЕЗУЛЬТАТЫ

В первой серии экспериментов было определено распределение меди в отделах мозга Выбор отделов мозга, в которых проведены измерения, определен следующими соображениями Кора, мозжечок, гиппокамп и миндалевидное тело взяты как отделы мозга, состоящие из различных типов нейронов Во внимание принималось также и то, что при прионовых болезнях основная часть измененного белка присутствует в мозжечке, а гистопатологические изменения при всех формах болезни Альцгеймера обнаруживаются главным образом в гиппокампе и миндалевидном теле

Гипофиз и гипоталамус взяты как нейросекреторные клетки, обогащенные медьсодержащими мозгоспецифическими ферментами - допамин-Р-гидроксилазой и пептидилглицин-а-амидатин монооксигеназой Сосудистое сплетение как отдел мозга, через который осуществляется выведение продуктов метаболизма клеток мозга

Во всех экспериментах по определению концентрации меди работали на мозге, перфузированном физиологическим раствором Мозг извлекали, помещали в чашку Петри, охлаждающуюся на льду, разделяли мозг на отделы, взвешивали, подготавливали для определения меди Полученные результаты обобщены в таблице 2 Вес мозга взрослых крыс, использованных в опытах, совпадает с таковым, приведенным в литературе, однако, общее содержание меди в целом мозге, определенное нами, несколько ниже величин, полученных на неперфузированном мозге (~5 5 мкг против ~6 2 мкг) Наблюдаемое расхождение хорошо объясняется присутствием в неперфузированном мозге меди, содержащейся в крови Результаты показывают, что концентрация меди практически одинакова в коре, мозжечке и гиппокампе В миндалевидном теле она примерно в 2 раза ниже, чем в этих отделах. Однако при выражении концентрации меди на 1 г сырого веса эта разница уменьшается Наибольшим содержанием меди характеризуются гипофиз и гипоталамус По-видимому, это связано с высоким содержанием в них специфических купроэнзимов

Таблица 2.

Распределение меди в отделах головного мозга взрослых крыс.

Отдел мозга Вес, г (мг**) мкг Си нг Си/мг белка мкг Си/г сырого веса**

Кора 0 72 ±0 018 1 98 ±0 012 24 92 ±3 01 2 75

Гиппокамп 0 77 ± 0 099 2 25 ±0 017 32 82 ± 8 48 2 92

Мозжечок 0 29 ± 0 034 0 79 ± 0 063 32 34 ±3 56 2 72

Гипоталамус **29 7 ± 5 74 021 ±0011 55 6±0 81 7 07

Гипофиз **24 2 ± 5 31 0 16 ±0 009 43 5 ± 3 52 661

Миндалевидное тело (пара) **42 0 ± 3 37 0 08 ± 0 003 11 75 ± 0 508 1 91

Сосудистое сплетение **2 83 ±0 16 0 001 ± 0 0001 2 46 ± 0 26 0 36

* Данные представлены на основе измерений в группе из пяти крыс, вес тела которых составлял 250 ± 33 6 г ** Рассчитано по средним значениям

Сосудистое сплетение - самый маленький из изучаемых в работе отделов мозга, его вес составляет примерно 1/600 часть от веса целого мозга, а обнаруживаемое здесь количество меди - это только 1/5000 часть от се общего количества. Это указывает на очень низкий уровень меди в сосудистом сплетении.

Представленные данные свидетельствуют о регионспецифическом распределении ионов меди но отделам мозга, что, вероятно, обусловлено различающимися функциями определенных частей мозга.

Экспрессия генов, участвующих в транспорте меди, в отделах головного

мозга крыс Экспрессия гена церулоплазмина.

Выявление транскриптоа гена ЦП методом ОТ-ПЦР. Для установления ткан ее пени фи чес к ого профиля распределения транскриптов разных изоформ ЦП использовали специфические праймеры (табл. 1), селективно выявляющие мРНК, программирующие синтез секреторного ЦП (ген Ср, №2387 по номенклатуре RGD, мРНК - NM_012532.1, белковый продукт -NP 036664.1} и ГФИ-ЦП (ген Ср, №2387 по номенклатуре RGD, мРНК -AF202115, белковый продукт - AAF34175). В качестве положительного контроля проводили амплификацию мРНК гена (i-актина, который принадлежит к группе генов «домашнего хозяйства» и экспрессируется во

Рис. I. Выявление steady state транскриптов гена ЦП в различных отделах Мозга крысы методом ОТ-11ЦР анализа.

А - положение праймеров, используемых для ПЦР, на матричных кДНК;

В - электрофор с грамма ПЦР-продуктов в агарозном геле после окрашивания бромистым этидисм; 1 - кора, 2 — гипофиз, 3 - мозжечок, 4 - миндалевидное тело, 5 -гипоталамус, 6 — гнппокамп, 7 -сосудистое сплетение

Данные 0Т-ПЦР анализа, приведенные на рисунке (Рис. 1, В), показывают, что в клетках мозга образуются обе изоформы ЦП-мРНК. При этом преимущественной молекулярной формой является ГФИ-ЦП мРНК, Во-первых, она образуется а большем числе структурных областей мозга (не найдена только в миндалевидном теле) и, во-вторых, ее относительное содержание во всех отделах мозга в несколько раз выше, чем содержание ЦП-мРНК.

Внутриклеточное распределение иммунореактивных полипептидов 11П.

По данным иммуноблоттинга во фракции плазматических мембран всех отделов мозга, кроме сосудистого сплетения и миндалевидного тела (в последнем транскрипты гена ЦП не найдены), присутствуют иммунореактивные полипептиды ЦП (Рис. 2, А). Мы не нашли ЦП на плазматической мембране клеток сосудистого сплетения, в которых самый высокий уровень ГФИ-ЦП мРНК. Возможно, что в этих клетках ГФИ-ЦП не достигает клеточной поверхности. Значение задержки ГФИ-ЦП в клетках сосудистого сплетения может стать яснее после установления биологической функции ГФИ-ЦП,

Внутриклеточные мембраны всех исследуемых отделов, в которых, как известно, осуществляются синтез, процессии! и экзоцитоз обеих форм ЦП, содержат иммунореактивные полипептиды ЦП (Рис. 2, В).

В

Ю6 .

»I—

I 2

4 5 6 1

г í

Рис. 2. Иммуиоблогиш субклеточных фракции отделов мои и с антителами к ЦП крови крысы.

А - плазматическая мембрана: 1 кора. 2 гипофиз, 3 - мозжечок, 4 - миндалевидное тело, 5 гипоталамус, 6 гнлпокамп, 7 сосудистое сплетение; В внутриклеточные мембраны: 1 7, также, как А; Каждый образец содержал примерно 120 мкг белка. Стрелками обозначено положение белковых маркеров "Bio-Rad".

Как видно на рисунках 2 А и В, помимо полноразмерной мембранной формы ЦП, молекулярная масса которой по разным оценкам, колеблется от 122 до 140 кДа, выявляются еще два полипептида ЦП: 80 кДа в

плазматической мембране и 65 кДа в обеих мембранных фракциях. ЦП с молекулярной массой 80-84 кДа был обнаружен в, семенниках и в продуктах биосинтеза культивируемых клеток мозга и печени.

Иммупогистохимическое выявление клеток, содержащих иммунореактивные полипептиды ЦП. Иммуногистохимическое окрашивание срезов замороженного мозга показало, что ЦП ассоциирован с клетками макроглии и эпендимы (Рис. 3). ЦП отчетливо выявляется в клетках, выстилающих стенки третьего МОЗГОВОГО желудочка в области гипоталамуса (Рис. 3, А) и гйппокампа (Рис. 3, О).

е в-

; ■ *

р р-

Рис. Иммуногистохимическое выявление церулоплазмина мозге крыс. А - тела клеток эпендимы гипоталамуса; К - реснички тан и ци гон в области гйппокампа, С - отростки таницитов в области гйппокампа; [) - тела клеток эпендимы гйппокампа; Е - астроциты коры; Г капилляр, А'- Р гистологическое окрашивание проведено гематоксилином.

В таницитах ЦП присутствует как в телах клеток, так и в отростках и ресничках (Рис. 3, В и С). В коре головного мозга и в гипоталамусе антитела к ЦП локализуются в телах и отростках единичных астроцитов (Рис. 3, Е ). Иммунореактивный ЦП распределяется вдоль капилляра без образования свободных пространств (Рис. 3, Р). Такой характер распределения совпадает с тем, как астроциты, олигодендроциты и аейроглиальные клетки своими отростками покрывают поверхность капилляров, образуя гематоэнцефалический барьер. [ 1а плазматической мембране нейронов иммунореактЯвных пол и пептидов ЦП нет (Рис. 3). В целом, представленные данные позволяют заключить, что ГФИ-ЦП экспреессируется во всех типах

глиальных клеток, а также в клетках эпендимы, которые происходят из мезодермы и строго не относятся к нервной ткани

Выявление полипептидов ЦП в СМЖ ЦП в составе белков СМЖ выявляли после их разделения в ПААГ окрашиванием орто-дианизидином Показано, что в составе белков СМЖ присутствует ЦП, соответствующий оксидазному ЦП сыворотки крови по относительной электрофоретической подвижности и молекулярной массе По данным иммуноблотинга в ликворе, в отличие от сыворотки крови, нет форм ЦП с другой электрофоретической подвижностью (апо-ЦП) Уровень ЦП, по данным количественного иммуноэлектрофореза, в СМЖ практически одинаков у разных особей, а его концентрация почти в 100 раз ниже, чем в сыворотке крови (0,3 мг/100 мл против 38,5 + 5,9 мг/100мл) Концентрация общей меди в СМЖ составляет примерно 14 мкг/л После полной иммунопреципитации ЦП в СМЖ остается менее 4% ионов меди Обработка СМЖ твердым хелатирующим агентом Хелекс-100, специфично и высоко аффинно связывающим свободные ионы меди и ионы меди, слабо ассоциированные с ЦП, удаляет из СМЖ примерно 36% ионов меди (Табл 3) Расчеты, проведенные на основе этих измерений, показывают, что на 1 молекулу ЦП, циркулирующую в СМЖ, приходится примерно 9 атомов меди, из которых 3-4 связаны слабо Модель ЦП, построенная по данным рентгеноструктурного анализа, предусматривает, помимо 6 атомов, входящих в активные центры, присутствие еще трех слабо ассоциированных атомов меди, (2аЦвеуа с1 а1, 1996) Так как пептидная часть ЦП крови не преодолевает гематоэнцефалический барьер (Платонова и др, 2004), следует признать, что этот ЦП является продуктом трансляции клеток сосудистого сплетения и гипоталамуса Максимальное число слабо связанных атомов меди в 1 молекуле ЦП ликвора, по-видимому, может быть отнесено к тканеспецифическим свойствам этого ЦП,

Биологическая роль ЦП ликвора не установлена Можно предположить, что в клетках мозга ионы меди, освобождающиеся после катаболизма купроэнзимов, включаются в секреторный ЦП, который и переносит их в СМЖ Судьба ЦП, циркулирующего в СМЖ, не известна

Таблица 3.

Определение содержания меди, ассоциированной с церулоплазмином спинномозговой жидкости. _ _____

СМЖ* Си, мкг/л * * иммунореактив-ный ЦП, мг/100 мл Си, атомов на 1 молекулу ЦП

Без обработки 13 77 ±0 873 03 9

После инкубации с антителами к ЦП 0 53 ± 0 094 (3 8%) Не определяется -

После инкубации с Хелекс-100 8 87+ 1 189 03 5 7

* Все измерения проводили в одних и тех же образцах, каждый образец (300 мкл СМЖ) содержал равные объемы СМЖ, взятые у трех крыс, всего испытано три образца СМЖ (девять взрослых крыс) Измерения меди и ЦП проведено в сыворотках крови 5 взрослых крыс ** Колебания значений концентрации ЦП в образцах составляли не более 5%

Возможно, что он выводится через мозговые оболочки в кровоток и затем поглощается печенью, а медь, связанная с ним, удаляется через желчь Можно 'также допустить, что ионы меди, ассоциированные с ЦП ликвора, вновь утилизируются клетками мозга В этом случае, секреторный ЦП выполняет важную роль, которая состоит в перемещении ионов меди между компартментами мозга

Экспрессия генов медыпранспортных АТФаз

Выявление транскриптов генов АТФазы Менкеса н АТФазы Вильсона в отделах мозга крысы Для идентификации транскриптов гена АТФазы Менкеса (№2179 по номенклатуре RGD, мРНК - NM 052803 1, белковый продукт - NP_434690 1) использовали праймеры, выявляющие 5'- и 3'-участки полноразмерной мРНК Atp7a, а также две молекулярные формы мРНК, образующиеся в ходе альтернативного сплайсинга (табл 1) Данные, полученные в этих опытах, показали, что ген Atp7a экспрессируется в клетках всех изучаемых отделов мозга (Рис 4) С обеими парами праймеров были получены одинаковые результаты, показывающие, что in vivo в мозгу образуется только полноразмерная мРНК АТФазы Менкеса (Рис 4 приведены данные для праймеров 7al -7а2) Данные также демонстрируют, что активность гена Atp7a в разных отделах мозга существенно отличается

Она наибольшая в клетках гипоталамуса и сосудистого сплетения и наименьшая - в коре и миндалевидном теле.

А - электрофорез ПЦР-продуггов в 1% агарозном raie. 1 - кора, 2 - гипофиз, 3 -мозжечок, 4 — миндалевидное тело, 5 -гипоталамус, б - гиппокамп, 7 - сосудистое сплетение.

В - Относительное содержание ЛТР7А и АТР7В мРНК в отделах мозга. Столбики: заштрихованные - АТР7А, точками - АТР7В (7Ы-2), прозрачные - АТР7В (ЖМ). По оси абсцисс: I - кора, 2 - гипофиз, 3 -мозжечок, 4 - миндалевидное тело, 5 -гипоталамус, 6 - гиппокамп, 7 - сосудистое сплетение; по оси ординат: относительные единицы, рассчитанные к fi-акшн-мРНК во программе "Scion Image", Привслсны средние значения из 3-х независимых опытов, в которых среднее квадратичное отклонение составляло менее 10%.

Рис. 4. ОТ-ПЦР анализ тотальной РНК. выделенной ш разных отделов Мозга.

Для выявления транскриптов гена АТФазы Вильсона (№2180 по номенклатуре RGD, мРНК — NM012511.1, белковый продукт — NP 036643.1) использовали пары праймеров, с помощью которых можно обнаружить 5'- и 3'-области полноразмерной Atp7b-MPHK. С помощью праймеров 7в!-7в2 транскрипты гена Atp7b были найдены в сосудистом сплетении и гиппокампс. В остальных отделах мозга они или едва определялись (гипофиз и мозжечок), или совсем не определялись. Относительно высокий уровень присутствующей Atp7b-MPHK обнаружен только в гипоталамусе с помощью праймеров 7вЗ-7в4 (Рис, 4).

Внутриклеточное распределение иммунореактивных полипептидов Atp7a и Atp7b. Atp7a и Atp7b не имеют в клетках места постоянной локализации. Их иммунорсактивные полипептиды обнаруживаются в двух компартментах: в транс-сетн Гольджи и на плазматической мембране. Поэтому поиск иммунореактивных полипептидов Atp7a и Atp7b проводили во фракции, обогащенной плазматической мембраной, выделенной методом равновесного флотационного/седиментационного центрифугирования. Использованные для этой цели антитела были получены к пептидам, в обеих АТФазах

1 2 3 4 5 6 7 I5S* 7аГ-7а2

| Hi Ж Т t Щ ' ' 7Ы-1ьг

.™ьрСХ

^ □ fi-aciin

I 2 3 4 i 6 7

соответствующим нецитозольвой петле, прилегающей к трансмембранному домену. Молекулярная масса присутствующих на мембране имму нореакти вных полипептидов обеих АТФаз меньше их полноразмерных изоформ, имеющих массу около 150 кДа. Atp7a представлена 90-кДа полипептидом (Рис, 5). Примерно такой должна быть молекулярная масса изоформы Atp7a, у которой нет экзонов 3-15 (Harris et al., 1999), однако, соответствующая форму мРНК, как указано выше, найдена не была. Основным полипептидом Atp7b является 80-кДА полипептид.

Рис. 5. Иммуноблотинг Г)СЛКОВ плазматической мембраны разных отделав мозга с антителами к Atp7a и Atp7b

Дорожки н гелях: 1 - кора, 2 - гипофиз, 3 -мозжечок, 4 - Миндалевидное тело, 5 -гипоталамус, 6 - гиппокамп, 7 — сосудистое сплетение

В каждом образце содержалось 120 мкт белка. Стрелками показано положение маркеров («Да).

В параллельных опытах поиск иммунореактивных полипептидов Atp7a и Atp7b был осуществлен и во фракции внутриклеточных мембран, выделенных из всех отделов мозга. Результаты показали, что имму нореакти вные полипептиды АТФаз присутствуют в тех отделах мозга, в которых найдена соответствующая мРМК. Локализация полипептидов Atp7a и Atp7b на плазматической мембране убедительно свидетельствует об участии этих АТФаз в транспорте ионов меди в клетках мозга in vivo.

Иммуногистохимичеекое выявление клеток, содержащих имл i vi < чреактивн ы е полипептиды АТФазы Мепкеса и АТФазы Вильсона. Сведения о том, в каком типе нервных клеток экспрессируются Atp7a и Atp7b in vivo, как И в случае с ЦП, были получены нами с помощью иммуногистохимичеекого окрашивания срезов мозга, результаты которого приведены на рисунке 6. Видно, что Atp7a связана с нейронами (Рис. 6, A), a Atp7b - с клетками эпендимы, выстилающей желудочки (Рис. 6, В).

'.'■■it ■■ * ■ ' J.«á

г

-

-.и, *

■¿ * ' .. ■''» i. v/vv? -.' SÍ

Рнс.б.Иммунотсюхччические окрашивание: замороженных срезов мои а антителами к

А*['Фа1е Менкеса (А) и АТФазе Кильсона (В).

А - гипоталамус, нейроны нентрамедиально го ядра; В -гипоталамус, выстилающая

эпендима 3-го желудочка. А', В' -препараты окрашены

гематоксилином.

Выявленный нами факт, что Atp7a локализуется в нейронах, a Atp7b - в тех же клетках, в которых экспрессирустся и ген Ср, позволяет предположить, что in vivo в мозге Atp7b принимает участие в выведении ионов меди из клеток, в то время как Atp7a - в их поглощении (Цымбаленка к др.. 2000). Об аналогичном распределении АТФ-аз Менкеса и Вильсона между различными типами клеток н мозжечке сообщается в недавно опубликованной работе (Barnes et al.. 200$).

Экспрессия гена Ctrl

Об уронне экспрессии гена Ctrl (ген SLC31А /, №620059, по номенклатуре RGD, мРНК NM 133600.1, белковый продукт - NP_598284.1) в клетках мозга мы судили только по относительному содержанию его зрелых транскриптов, определенных с помощью ОТ-ПЦР анализа.

Результаты этого анализа приведены на рисунке 7, Они показывают, что steady state уровень Ctrl-мРНК практически одинаков во всех отделах мозга. Только в сосудистом сплетении относительное содержание Ctrl-мРНК примерно в 2 раза выше, чем в целом по мозгу. Для того, чтобы установить является ли концентрация меди в мозге взрослых крыс функцией активности гена Ctrl, как это показано для мышей с генотипом Ctrl'' (Lee et ai, 2001), логично сопоставить концентрацию меди (Си, нг/мг общего белка и Си, мкг/г сырого веса) и уровень активности гена в одних и тех же отделах мозга. Данные о содержании меди показывают, что в коре, мозжечке и гиппокампе

концентрация меди практически одинакова. В миндалевидном теле она примерно в 2 раза ниже, чем в этих отделах. Однако при выражении концентрации меди на 1 г сырого веса эта разница уменьшается. Наибольшим содержанием меди характеризуются гипофиз и гипоталамус. В сосудистом сплетении медь едва определяется (Табл. 2).

H.ii.

326 К.П.

Ctrl

1'нс. 7. Steady state уровень чРНК, программирующих синтез CTR1, определенный с помощью ОТ-ПЦР технологии.

null

1 2 3 4 5 6 7

А- электрофоре грамма Г1Ц Р-п ролу кто п и агарозном гене после окрашивания бромистый этидием;

В относительное содержание СП11-мРНК. Приведены средние значения из 3-х независимых опытов, в которых среднее квадратичное отклонение составляло менее 10%.

Обозначения: I - кора, 2 - гипофиз, 3 -мозжечок, 4 миндалевидное тело, 5 -гипоталамус, 6 - гиппокамп, 7 сосудистое сплетение;

Сопоставление этих данных с результатами, представленными на рисунке 7, демонстрирует полное отсутствие связи между содержанием меди и уровнем экспрессии гена Ctrl как в отделах мозга, содержащих в основном клетки нервной гкани, так и в сосудистом сплетении, клетки которого относятся к соединительной ткани. Так, в гипоталамусе и гипофизе, в которых содержится наибольшее количество меди, уровень Ctrl -мРНК практически такой же, как и н миндалевидном теле, концентрация меди в котором, в зависимости от метода расчета, в 3-5 раз ниже. Более того, в клетках сосудистого сплетения, где обнаруживаются лишь следы меди, выявлен самый высокий уровень Ctrl -мРНК,

К сожалению, из-за короткого периода полураспада (58,5 ч) самого долгоживущего (67ССи) радиоизотопа меди отсутствуют данные о in vivo поступлении и выведении ее в мозге (Dunn et al, 1991) Независимо от того выводится ли медь через гематоэнцефалический барьер, она должна выводится из нейронов после деградации купроэнзимов в лизосомах или протеосомах и поступать в них для возобновления пула купроэнзимов Всеобщий характер экспрессии гена Ctrl в мозге свидетельствует о роли этого белка в импорте меди у взрослых млекопитающих Как экскретируется катаболическая медь из клеток неизвестно Можно предположить, что она включается в ЦП, секретируемый в СМЖ Это хорошо согласуется с высоким уровнем ЦП-мРНК и Atp7b в гипоталамусе, обогащенном мозгоспецифическими купроэнзимами (пептидилглицин-а-амидагин монооксигеназой и допамин-р-гидроксилазой), и в сосудистом сплетении, через которое происходит выведение метаболитов из мозга

Выводы.

1 Отделы головного мозга взрослых крыс отличаются друг от друга по удельному содержанию меди наибольшей концентрацией меди характеризуются гипофиз и гипоталамус, наименьшей - сосудистое сплетение

2 В мозге взрослой крысы синтезируются секреторная и ассоциированная с плазматической мембраной изоформы церулоплазмина Секреторная изоформа церулоплазмина синтезируется главным образом в сосудистом сплетении и гипоталамусе Изоформа церулоплазмина, ассоциированная с плазматической мембраной, экспрессируется во всех отделах мозга

3 С геном церулоплазмина ко-экспрессируется ген медьтранспортной АТФазы Р1 типа (АТФаза Вильсона) Ген церулоплазмина экспрессируется только в клетках глии и эпендимы

4 В нейронах экспрессируется ген другой медьтранспортной АТФазы Р1 типа - АТФазы Менкеса

5 Во всех отделах мозга присутствуют зрелые транскрипты гена белка Ctrl, высокоафинного импортера меди

6. Метаболическая система меди головного мозга взрослых крыс состоит из регионспецифических метаболических систем, отличающихся друг от друга набором экспрессирующихся в них генов медьтранспортных белков

Публикации по теме диссертации

1 Puchkova L, Zhivulko T, Mishenko В , Zhiguleva E, Bichevaya N , Platonova N, Tsymbalenko N, Guohkhandanova N, Vasin A, Povalikhin R Copper nutrition and copper metabolism in rat newborn 2002 Metal ions in biology and medicine Vol 7 p 447-453

2 Платонова H A , Барабанова С В , Повалихин Р.Г , Цымбаленко Н В , Ноздрачев А Д, Пучкова J1 В Экспрессия АТФазы Менкеса и АТФазы Вильсона в различных отделах мозга взрослых крыс 2005 ДАН 401, 267270

3 Платонова Н А, Барабанова С В, Повалихин Р.Г, Н В Цымбаленко, М А Даниловский, О В Воронина, И И Дорохова, JI В Пучкова In vivo экспрессия медь-транспортных белков в отделах мозга крыс 2005 Извес РАН Сер биол №2, 108-120

4 Васин А В , Платонова Н А, Повалихин Р,Г., Клотченко С А , Самсонов С А, Цымбаленко Н В , Пучкова JIВ Митохондриальный церулоплазмин млекопитающих 2005 Молекулярная биология 39, 1 48 -60

5 Жигулева Э А Воронина О В Гюлиханданова Н Е Повалихин Р.Г Пучкова JIВ Изучение регуляции экспрессии гена церулоплазмина III Съезд биохимического общества России, Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 г с 287

6 Повалихин Р, Платонова Н Изучение белков, обеспечивающих гомеостаз меди в головном мозге крыс в онтогенезе Пятая всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей, 21 апреля

2002 СПб С 200-201

7 Platonova N, Barabanova S Povalikhin R. Puchkova L Regional brain-specific localization of ceruloplasmin Международной Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, Киев, Украина, 25-27 сентября, 2003

8. N Platonova, R. Povalikhin, A Vasin, L Puchkova, Regional and cellular brain distribution of proteins supporting copper balance in mammalian, Abstract book of 12th International Congress of Human Genetics, Birminham, England,

2003 P542

9 Платонова Н А , Повалихин Р Г, Васин А В , Цымбаленко Н В , Пучкова Л В , Варианты совместной локализации белков, поддерживающих баланс меди, в клетках различных отделов мозга крыс, 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", 2003 С365

10 Пучкова Л В , Платонова Н А , Повалихин Р.Г , Васин А В , Живулько Т В, Цымбаленко Н В Экспрессия генов, ответственных за врожденные ошибки метаболизма меди, в отделах мозга взрослых и новорожденных крыс Материалы 5-го съезда Российского общества медицинских генетиков (часть II) 2005 Медицинская генетика 4, 6 256

11 Живулько Т В, Повалихин Р. Г, Бабич П С, Цымбаленко Н В Экспрессия медьтранспортных белков и распределение меди в мозгу крыс в течение онтогенеза Биология - наука XXI века 9-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 18-22 апреля 2005 года) Сборник тезисов, стр 22

Работа поддержана грантом РФФИ № 3-04-48748, грантом мэра Санкт-Петербурга № М01-2,6Д-570

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Повалихин, Роман Геннадьевич

1.1. Биологическая роль меди

1.2. Метаболическая система меди эукариот

1.3. Церулоплазмин. 16 1.3.1 Структурно-функциональная организация церулоплазмина

1.3.2. Основные функции церулоплазмина

1.3.3. Молекулярные формы церулоплазмина 23.

1.4. СТШ.

1.4.1. Структурно-функциональная организация СТШ

1.4.2. Основные функции СТШ и регуляция его экспрессии у 27 млекопитающих

1.5. Медьтранспортые АТФазы.

1.5.1. Структурно-функциональная организация АТФазы Менкеса 29 и АТФазы Вильсона

1.5.2. АТФаза Менкеса

1.5.3. АТФаза Вильсона

1.5.4. Внутриклеточная локализация медьтранспортых АТФаз

1.6. Метаболизм меди в мозгу

1.7. Морфо-функциональная характеристика исследуемых 43 отделов головного мозга крысы

Гиппокамп

Гипоталамус

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы, использованные в работе 50 Животные 50 Реактивы и биопрепараты

2.2. Методы, использованные в работе 51 Методы выделения и исследования белков 51 Получение антител 57 Методы выделения и исследования нуклеиновых кислот 59 Измерение концентрации меди

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Распределение меди в отделах мозга взрослых крыс

3.2. Экспрессия генов, участвующих в транспорте меди, в 64 отделах головного мозга крыс

3.2.1. Экспрессия гена церулоплазмина.

3.2.1.1. Выявление транскриптов гена церулоплазмина методом 66 полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией

3.2.1.2. Внутриклеточное распределение иммунореактивных 68 полипептидов церулоплазмина

3.2.1.3. Иммуногистохимическое выявление клеток, содержащих 72 иммунореактивные полипептиды церулоплазмина

3.2.1.4. Выявление полипептидов церулоплазмина в спинномозговой 74 жидкости

3.2.2. Экспрессия генов медьтранспортных АТФаз.

3.2.2.1. Выявление транскриптов генов АТФазы Менкеса и АТФазы 77 Вильсона в отделах мозга крысы

3.2.2.2. Внутриклеточное распределение иммунореактивных 80 полипептидов АТФазы Менкеса и АТФазы Вильсона

3.2.2.3. Иммуногистохимическое выявление клеток, содержащих 82 иммунореактивные полипептиды АТФазы Менкеса и АТФазы Вильсона

3.2.3. Экспрессия гена СТШ

3.3. Обзор регионспецифичных метаболических систем меди 86 мозга крысы

3.4. Атлас распределения активности генов медьтранспортных 93 белков в мозгу крысы

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Метаболическая система меди головного мозга крысы"

Актуальность исследования. Медь, после железа, является самым распространенным микроэлементом. Она входит в активные центры купроэнзимов, которые у млекопитающих участвуют в окислительном фосфорилировании, детоксикации активных радикалов, синтезе коллагена и эластина, образовании окиси азота, нейромедиаторов и нейропептидов, а также контролируют двунаправленный перенос ионов железа через мембраны (Karlin, 1993; Torres, Wilson, 1999; De Freitas et al, 2003). Одновременно ионы меди являются высокотоксичными агентами, так как способны индуцировать образование радикалов, разрушающих все типы биомолекул (Linder, 2001). Безопасное поступление ионов меди в клетки, перенос их к местам образования купроэнзимов и выведение из клеток обеспечивает специальная система белков (метаболическая система меди, МСМ) (Репа et al., 1999).

В последние годы некоторые гены этой системы клонированы и изучены основные принципы ее работы. Общий план организации МСМ прокариотов и эукариотов одинаков - она включает интегральные мембранные и растворимые цитозольные белки, гены этих систем ортологичны, их структура характеризуется высокой консервативностью, а функции сохраняются в эволюции. В этой системе важную роль играют два семейства белков, участвующих в транспорте меди через мембраны: родственные медьтранспортные АТФазы PI типа - АТФаза Менкеса (Atp7a) и АТФаза Вильсона (Atp7b) (Сох, Moore, 2002) и белки семейства CTR1, включающие высокоафинные импортеры меди (Sharp, 2003). К неклеточным компонентам МСМ млекопитающих может быть отнесена секреторная форма церулоплазмина (ЦП), медь содержащего гликопротеина сыворотки крови, которая, помимо транспорта меди, вместе с изоформой ЦП, связанной с клеточной мембраной через гликозил фосфатидил инозитоловый якорь (ГФИ-ЦП), участвует и в метаболизме железа (Patel et al., 2000: Fortna et al., 1999).

Перенос ионов меди белками этой системы к местам образования купроэнзимов происходит однонаправлено и последовательно при прямых белок-белковых взаимодействиях, благодаря которым в клетках нет свободных ионов меди (Rae et al., 1999). У млекопитающих баланс меди поддерживается согласованной работой тканеспецифических МСМ, центральным звеном которых является МСМ печени. Общее число участников МСМ у млекопитающих увеличивается за счет паралогичных генов, и МСМ клеток различных органов отличаются друг от друга комбинацией белков, входящих в эту систему, уровнем экспрессии кодирующих их генов и хронологией активации в течение развития (Пучкова, Платонова, 2003).

У человека мутации в генах МСМ являются причиной целого ряда тяжелых моногенных рецессивных наследственных заболеваний (болезнь Вильсона, болезнь Менкеса, ацерулоплазминемия) (Сох, Moore, 2002). Более того, гетерозиготное носительство мутаций в этих генах играет существенную роль в развитии нейродегенеративных болезней пожилого возраста (Johnson, 2001). Также показано, что болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и прионовые болезни тесно связаны с нарушением метаболизма меди и зависимого от него транспорта железа (Brown, 2003). К тому же даже незначительные нарушения метаболизма меди как экологичекого, так и наследственного характера, приводят к развитию нейродегенеративных заболеваний (Gaggelliet al, 2006).

Все это привлекает пристальное внимание к механизмам, обеспечивающим круговорот меди в мозгу, многие стороны которого остаются не понятыми. Это в первую очередь касается регионспецифических особенностей метаболизма меди в мозгу, общей организации автономной системы поддержания баланса меди за гематоэнцефалическим барьером и связи между статусом меди отдела мозга и возможными изменениями его физиологических функций вследствие нарушений гомеостаза меди в нем.

Цель работы - сравнительное изучение статуса меди и профиля экспрессии генов медьтранспортных белков в различных отделах головного мозга взрослых крыс.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Определить статус меди в различных отделах мозга (кора, гипофиз, мозжечок, миндалевидное тело, гипоталамус, гиппокамп и сосудистое сплетение) взрослой крысы.

2. В отделах мозга крыс, взятых в рассмотрение, методом полуколичественного ОТ-ПЦР определить квазистационарную концентрацию мРНК, кодирующих медьтранспортные белки МСМ: ЦП, ГФИ-ЦП, Atp7a, Atp7b и Ctrl.

3. Установить внутриклеточную локализацию белковых продуктов генов Ср, Atpla и Atplb в этих отделах мозга.

4. Определить тип клеток нейрональной ткани, в которых экспрессируются изучаемые гены МСМ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Метаболическая система меди мозга состоит из ряда регионспецифических МСМ.

2. МСМ различных отделов мозга отличаются профилем экспрессии генов, поддерживающих в них гомеостаз меди.

3. Внутриклеточная локализация медьтранспортных белков отличается в различных отделах мозга.

4. Нейроны, клетки глии и эпендимы отличаются набором белков МСМ, синтезирующихся в них.

Научная новизна полученных результатов. В работе показано, что отделы мозга крысы отличаются друг от друга по содержанию меди и баланс меди в них поддерживается регионспецифическими МСМ. На это указывает то, что: 1) активность генов, участвующих в переносе меди, существенно отличается в разных отделах мозга; 2) в нейронах, глиальных клетках и клетках эпендимы экспрессируются разные комбинации белков, транспортирующих медь. Полученные данные позволили разделить изучаемые отделы мозга по свойствам их МСМ на три группы:

1. Отделы мозга, характеризующиеся глиальным индексом примерно 1. В этих отделах практически одинаковая концентрация меди и содержание Ctrl -мРНК, ГФИ-ЦП-мРНК и Atp7a-MPHK. В тоже время в них очень низкий уровень Atp7b-MPHK и не найдена ЦП-мРНК. При этом в глиальных клетках экспрессируется ГФИ-ЦП-мРНК, а в нейронах - Atp7a-MPHK. В эту группу входят кора, миндалевидное тело, мозжечок и гиппокамп.

2. Отделы, характеризующиеся высокой концентрацией меди, выраженной активностью генов Atp7a и Atp7b, а также присутствием ЦП-мРНК. В эту группу входят специализированные железы нейросекреции: гипоталамус и гипофиз.

3. Третья группа представлена одним отделом - сосудистым сплетением. Этот отдел мозга практически не содержит ионов меди, но характеризуется самым высоким содержанием мРНК всех изученных медьтранспортных белков.

Научно-практическое значение полученных результатов. Данные о содержании и распределении ионов меди, а также об уровне и месте экспрессии изучаемых генов МСМ крысы в различных отделах мозга будут способствовать пониманию механизма, обеспечивающего баланс меди в мозгу млекопитающих. Эти результаты при сопоставлении с регионспецифическими изменениями, наблюдаемыми при различных нейродегенеративных заболеваниях, могут помочь понять роль нарушений гомеостаза меди в развитии этих заболеваний.

Апробация результатов работы. Результаты работы были доложены в форме устных и стендовых сообщений на: 10-ом Международном Конгрессе по генетике человека, Вена, Австрия, 15-19 мая 2001 г.; III Съезде биохимического общества России, Санкт-Петербург, 26 июня - 1 июля 2002 г.; Конференции молодых ученых: Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины-2002. Санкт-Петербург; 6-ой, 7-ой, 8-ой и 9-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века, Пущино-на-Оке, 2002 - 2005 г.г.; Международной Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, Киев, Украина, 25-27 сентября, 2003 г.; на 12-ом Международном Конгрессе по генетике человека, Бирмингем, Великобритания, 2003 г.; Пятом съезде российского общества медицинских генетиков, Уфа, май 2005г.

По результатам диссертации опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах, которые входят в перечень изданий, рекомендованных ВАК для публикации результатов, представляемых в диссертациях.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Повалихин, Роман Геннадьевич

Выводы

1. Отделы головного мозга взрослых крыс отличаются друг от друга по удельному содержанию меди: наибольшей концентрацией меди характеризуются гипофиз и гипоталамус, наименьшей - сосудистое сплетение.

2. В мозге взрослой крысы синтезируются секреторная и ассоциированная с плазматической мембраной изоформы церулоплазмина. Секреторная изоформа церулоплазмина синтезируется главным образом в сосудистом сплетении и гипоталамусе. Изоформа церулоплазмина, ассоциированная с плазматической мембраной, экспрессируется во всех отделах мозга.

3. С геном церулоплазмина ко-экспрессируется ген Atp7b, медьтранспортной АТФазы Р1 типа, гомологичный АТФазе Вильсона человека. Оба гена экспрессируется преимущественно в клетках глии и эпендимы.

4. В нейронах экспрессируется ген другой медьтранспортной АТФазы Р1 типа - Atp7a, гомологичный АТФазе Менкеса.

5. Во всех отделах мозга присутствуют зрелые транскрипты гена белка Ctrl, высокоафинного импортера меди.

6. Метаболическая система меди головного мозга взрослых крыс состоит из регионспецифических метаболических систем, отличающихся друг от друга набором экспрессирующихся в них генов медьтранспортных белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Повалихин, Роман Геннадьевич, Санкт-Петербург

1. Ackland M.L., Cornish Е.J., Paynter J.A., Grimes A., Michalczyk A.,

2. Mercer J.F. Expression of Menkes disease gene in mammary carcinoma cells

3. Biochem. J. 328:237-243,1997.

4. Askwith C., Kaplan J. Iron and copper transport in yeast and relevance to human disease // TIBS. 23:135-138, 1998.

5. Barnes G., Frieden E. Ceruloplasmin receptors of erytrocytes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 125: 157-162,1984.

6. Barnes G., Tsivkovskij N., Tsivkovskaja N., Luttsenko S., The copper transporting ATPase, Menkes and Wilson disease proteins have distinct roles in adult and developing cerebellum // J. Biol. Chem. 280, 10:46404645.

7. Bielli P., Calabrese L. Structure to function relationships in ceruloplasmin: a "moonlighting" protein // CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 59: 1413- 1427,2002.

8. Bishop G., Robinson S. The amyloid paradox: amyloid-beta-metal complexes can be neurotoxic and neuroprotective // Brain Hathol. 14:44852, 2004.

9. Boll M.C., Sotelo J., Otero E. et al. Reduced ferroxidase activity in the cerebrospinal fluid from patients with PParkinson's disease // Neurosci. Lett. 265: 155-158,1999.

10. Borjigin J., Payne A.S., Deng J., Li X., Wang M.M. Ovodenko В., Gitlin J.D., SnyderS.H. //J. Neurosci. 19,3: 1018-1026, 1999.

11. Brown D.R. Prion protein expression modulates neuronal copper content //J. Neurochem. 87:77-385, 2003.

12. Cha J.S., Cooksey D.A. Copper resistance in Pseudomonas syringae mediated by periplasmic and outer membrane proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88:8915-8919, 1991.

13. Chelly J., Turner Z, Tonnesen T„ Petterson A., Ishikawa-Brush Y. Isolation of a candidate gene for Menkes disease that encodes a potential heavy metal binding protein // Nature genetics. 3:14-19, 1993.

14. Cox D. W., Moore S.D. Copper Transporting P-Type ATPases and Human Disease //Journal ofBioenergetics and Biomembranes. 34:333-338, 2002.

15. Daimon M., YamataniK., IgarashiM., FukaseN., Kawanami T., Kato T., Sasaki H. Fine structure of human ceruloplasmin gene // Biochem. Biophys. Res. Commun. 208:1028-1035,1995.

16. De Freitas J., Wintz H., Hyoung Kim J., Poynton H., Fox T., Vulpe C., Yest, a model organism for iron and copper metabolism in rats: a compartmental model. //Am. J. Physiol. 261 :E115-E125. 1991

17. Dobbing J., Sands J. Vulnerability of developing brain. IX. The effect of nutritional growth retardation on the timing of the brain growth-spurt // Biol. Neonate. 19: 363-378, 1971.

18. Fleming R.E., Gitlin J.D. Primary structure of rat ceruloplasmin and analisis of tissue specific gene expression during development // J.Biol.Chem. 265,13:7701-7709, 1990.

19. Frieden E. Caeruloplasmin: a multi-functional metalloprotein of vertebrate plasma. In: Biological roles of copper // Excepta Medica. 93124, 1980.

20. Gregoriadis G., Morell A.G., Sternlieb L., Scheinberg I.H. Catabolism of desialylated ceruloplasmin in the liver// J. Biol. Chem. 245: 5833-5837, 1970.

21. Harris E.D. Cellular copper transport and metabolism // Annu. Rev. Nutr. 20:291,2000.31 .Harris E.D. Copper transport: an overview. // Society Experim. Biol, and1. Medic. 130-140,1991.

22. Harris E.D., Reddy M.C., Qian Y., Tiffany-Castiglioni E., Majumdar S., Nelson J. Multiple forms of the Menkes Cu-ATPase // Adv. Exp. Med. Biol. 448: 39-51, 1999.

23. Harris Z.L., Takahashi Y., Miyajima H, Serizawa M., MacGillivray R., Gitlin J.D. Aceruloplaminemia: molecular characterization of this disoder of iron metabolism // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 2539-2543, 1995.

24. Harrison M.D., Dameron C.T. Molecular mechanisms of copper metabolism and the role of the Menkes disease protein // J. Biochem. Mol. Toxicol. 13(2):93-106, 1999.

25. Harrison M.D., Meier. S., Dameron C.T. Characterisation of copper binding to the second sub-domain of the Menkes protein ATPase (MNKln) // Bochem. Biophis. Acta. 24,1453(2): 254-260, 1999.

26. Harlow J., Lane H., Using antibodies: A laboratory manual. // Portable protocol N3. Cold Spring Harbor Laboratory Press. USA. 1999.

27. Holmberg C.G. On the presence of a laccase-like enzyme in serum and its relation to the copper in serum // Acta. Physiol. Scand. 8: 227-229, 1944.

28. Holmberg C.G., Laurell C.B. Investigations in serum copper II // Acta. Chem. Scand. 2:550-556, 1948.41 .House E, Collingwood J, Khan A, Korchazkina O, Berthon G, Exley

29. Aluminum, iron, zinc and copper influence the in vitro formation of amyloid fibrils of Abeta42 in a manner which may have consequences for metal chelation therapy in Alzheimer's disease. // J Alzheimers Dis. Jun;6(3):291-301,2004.

30. Huffman D.L., O'Halloran T.V. Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins // Annu. Rev. Biochem. 70: 677 -701,2001.

31. Hung I.H., Susuki M., Yamaguchi Y., Yuan D.S., Klausner R.D., Gitlin J.D. Biochemical characterization of the Wilson disease protein and functional expression in the yeast Sacromices cerevisiae. // j.Biol. Chem. 22.272 (34):21461-21466, 1997.

32. Juan S.H., GuoJ.H., Aust S.D. Loading of iron into recombinant rat liver ferritin heteropolymers by ceruloplasmin // Arch. Biochem. Biophys. 15, 341(2): 280-6,1997. Al.Karlin K.D. Metalloenzymes, structural motif, and inorganic models //

33. Klomp L. W., Farhangrazi Z.S., Dugan L.L, Culotta V., Gitlin J.D. Ceruloplasmin gene expression in the murine central nervous system // J. Clin. Invest. 98, 207-215, 1996.

34. Kroll I. A manual of quantitative immuno-electrophoresis. Ed. by N.H. Axelsen, J.Kroll, B.Weeke. Oslo-Bergen-Troms: Universitet Storlaget. 1973.

35. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 227: 680-685, 1970.

36. Lee J., Pena M.M., Nose Y., Thiele D.J. Biochemical characterization of the human copper transporter Ctrl //J. Biol. Chem. 277:4380-4387, 2002.

37. Lee J., Prohaska J.R., Dagenais S.L., Glover T.W., Thiele D.J. Isolation of a murine copper transporter gene, tissue specific expression and functional complementation of a yeast copper transport mutant // Gene 254:87-96,2000.

38. Lee J., Prohaska J.R., Dagenais S.L., Essential role of mammalian copper transporter CTR1 in copper homeostasis and embryonic development // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98:6842-^847, 2001.

39. Li. Y., Togashi Y., Sato S., Emato T., Kang J-H., Takeichi N., Kobayashi H. Sponyenious hepatic copper accumulation in long-evans cinamone rats with hereditary hepatitis//J.Clin. Invest. 87,1858-1861, 1991.

40. Linder M.C. Copper and genomic stability in mammals // Mut. Res. 475 :141-152, 2001.

41. Linder M.C., Wooten L., Cerveza P., et al. Copper transport // Am. J. Clin. Nutr. 67: 965S -971S. 1998.

42. L0 Y.W., Day C.P., Hung M.C. Cancer-specific gene therapy // Adv.Genet., 54: 235-55,2005.62 .Lockhart P.J., Mercer J.F.B. Cloning and expression analysis of the sheep ceruloplasmin cDNA // Gene. 236: 251-257, 1999.

43. Lovell M.A., Robertson J.D., Teesdale W.J., et al.// J. Neurol. Sci. 158: 47-52, 1998.

44. Lutsenko S., Efremov R.G., Tsivkovskii R., Walker J.M. Human copper-transporting ATPase ATP7B (the Wilson's disease protein): biochemical properties and regulation // J. Bioener. Biomemb. 34(5):351-362,2002.

45. Lutsenko S., Kaplan J.H. Organization of P-type ATPases: significance of structural diversity//Biochemistry. 5,34(48): 15607-13, 1995.

46. L'vovskaia E.I., Gavriliuk T.A., Mokhova S.V. In vitro effect of BITO preparation, ceruloplasmin, transferrin, and essentiale on the intensity of lipid peroxidation during thermal injury // Vopr. Med. Khim. 42(2): 125127,1996.

47. Mason. K.E. A conspectus of research on copper metabolism and requirements of man. //J. Nutr. 109(11): 1979-2066, 1979.

48. Marone M., Mozzetti S., De Ritis D., Pierelli L., Scambia G. Semiquantitative RT-PCR analysis to assess the expression levels of multiple transcripts from the same sample // Biol. Proced. Online 3(1): 19-25,2001.

49. Mercer J.F.B., Livingston J., Hall B., Paynter J.A. Isolation of a partial candidate gene for Menkes disease by positional cloning // Nat. Genet. 3(l):20-25, 1993.lA.Mertz W. Trace elements // Science. 211:315-319,1985.

50. Messerschmidt A., Huber R. The blue oxidases, ascorbat oxidase, laccase and ceruloplasmin // Eur. J. Biochem. 187:341-352, 1990.

51. Mitro A., Palkovits M. Morphology of the rat brain ventricles, ependima and periventricular structures // Academiai Kiado. Budapest. 1981.

52. Miyajima H. Aceruloplasminemia, an iron metabolic disorder // Neuropathology. 23: 345-350, 2003.

53. Molina J.A., Jimenez-Jimenez F.J., Aguilar M.V. et al. Cerebrospinal fluid levels of transition metals in patients with Alzheimer's disease // J. Neural. Transm. 105: 479-488, 1998.

54. Mittal B., Doroudchi M.M., JeongS.Y. et. al. Expression of a membrane-bound form of the ferroxidase ceruloplasmin by leptomeningeal cells // Glia. 41:337-346, 2003.

55. Muniz M., Morsomme P., Riezman H. Protein sorting upon exit from the endoplasmic reticulum. // Cell. 104:313-320,2001.

56. Muramatsu T. Yamada M. Miura T. Sakai Y. Suzuki T. Serikawa, R.E.,

57. TanziK., Matsumoto K. Wilson's disease gene is homologous to its causing abnormal copper transport in Long-Evans cinnamon rats // Gastroenterology, 107:1189-1192,1994.

58. S4.Musci G., Fraterrigo T.Z.L., Calabrese L., McMillin D.R. On the lability and functional significance of the type 1 copper pool in ceruloplasmin // JBIC 4: 441-446, 1999.

59. Okamoto N., Wada S., Oga 71, Kawabata Y., Baba Y, Habu D., Takeda Z., Wada Y. Hereditary ceruloplasmin deficiency with hemosiderosis // Hum. Genet. 97 (6):755-8, 1996.

60. Olivares M., Uauy R. Copper as an essential nutrient // Am. J. Clin. Nutr. 63(5):791S-6S, 1996.91 .Owen C.A. Wilson's disease: The Etiology, Clinical aspects and Treatment of inhereted copper to toxicosis. // Noges publications. 539, 1981.

61. Patel B.N., Dunn R.J., David S. Alternative RNA splicing generates a glycosylphosphatidylinositol-anchored form of ceruloplasmin in mammalian brain. // Ibid. 275: 4305-4310, 2000.

62. Patel B.N., David S. A novel glycosylphosphatidylinositol-anchored form of ceruloplasmin is expressed by mammalian astrocytes // J. Biol. Chem., 272:20185-20190,1997

63. PatelB.N., Dunn R.J., JeongS.Y. etal. Ceruloplasmin regulates iron levels in the CNS and prevents free radical injury // J. Neurosci. V. 2. P. 6578-6586,2002.

64. Penland J.G., Prohaska J.R. Abnormal motor function persists following recovery from prenatal copper deficiency in rats // J. Nutr. 134: 1984 -1988, 2004.

65. Puchkova L.V., Gaitskhoki V.S., Monakhov N.K., Timchenko L.T., Neifakh S.A. Preproceruloplasmin is a primary product of cell-free translation of ceruloplasmin messenger RNA // Mol. Cell. Biochem. 35, 1:159-169, 1981.

66. Puchkova L., Zhivulko T., Mishenko B. et al. Copper nutrition andcopper metabolism in rat newborns // Metal ions in biology and medicine. Paris: John Libbey Eurotext. 7: 447 457, 2002.

67. Puig S., Thiele D.J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution // Curr. Opin. Chem. Biol. 6:171-180,2002.

68. Phung L., Ajlani G., Haselcorn R. P-type ATPase from the cianobacterium Synechococcus 7942 related to the human Menkes and Wilson disease gene product // Proc.Nat. acad. Sci. USA. 91:9651-9654, 1994.

69. Pyle A.M. //Ribozymes: a distinct class of metalloenzymes. // Science. 261:709-714, 1993.

70. Qi M., Byers P.H. Constitutive skipping of alternatively spliced exon 10 in the ATP7A gene abolishes Golgi localization of the Menkes protein and produces the occipital horn syndrome // Hum. Mol. Genet. 7(3):465-469,1998.

71. Rao M.R., Hediger M.L., Levin R.J., Naficy A.B., Vik T. Effect of breastfeeding on cognitive development of infants born small for gestation age //Act. Pediatr. 91 (3): 267-274,2002.

72. Reilly C.A., Aust S.D. Iron loading into ferritin by an intracellular ferroxidase//Arch. Biochem. Biophys. 1,359(l):69-76, 1998.

73. Rossi L, De Martino A, Marchese E., Piccirili S, et al.

74. Neurodegeneration in the animal model of Menkes' disease involves Bcl-2-linked apoptosis. //Neuroscience. 103. N.l : 181-188, 2001.

75. Ryan T.P., T.A. Grover, S.D. Aust. Rat ceruloplasmin: resistance to proteolysis and kinetic comparison with human ceruloplasmin // Arch. Biochem. Biophys.293: 1-8, 1992.

76. Ryden L. Ceruloplasmin is a single peptide chain // Eur. J. Biochem. 26:380-386,1972.

77. Saenko E.L., Yaropolov A.I. // Biochem. Int. 20:215-225, 1990.

78. Safaei R. II Role of copper transporters in the uptake and efflux of platinum containing drugs. Cancer Letters. 234: 34-39, 2006

79. Saito T., Hoch T., Fujimura M., Saito K. Age-dependent and region-specific differences in the distribution of trace elements in 7 regions of Long-Evans Cinnaman (LEC) rats with hereditary abnormal copper metabolism // Brain Res. 695: 240-244, 1995.

80. Salzer J., Lovejoy L., Under M.C., Rosen C. Ran-2, a glial lineage marker, is a GPI-anchored form of ceruloplasmin // J. Neurosci. Res. 54: 147-157, 1998.

81. Sato M., Schilsky M.L. Stockert R.J., Morell A.G., Sternlieb I. Detection of Multiple Forms of Human Ceruloplasmin. A novel m, 200,000 form//J. Biol. Chem. 265, 5: 2533-2537, 1990,

82. Sato M, Gitlin J.D. Mechanisms of copper incorporation during the biosynthesis of human ceruloplasmin // J. Biol. Chem. 266,8: 5128-5134,

83. Sambrook J., Fritch I.F., Maniatis T. Molecular cloning. Laboratory manual // N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1991.

84. Schaefer M., Hopkins R.G., Failla M.L., Gitlin J.D. //Hepatocyte-specific localization and copper-dependent trafficking of the Wilson's disease protein in the liver. // Am. J. Physiol., 276(3 Pt 1):G 639-646, 1999.

85. Sharp P. A. Ctrl and its role in body copper homeostasis // Intern. J. Biochem. & Cell Biol. 35:288-291, 2003

86. Shim H., Harris Z. L.,Genetic defects in copper metabolism // J.Nutr., 133: 1527S-1531S, 2003

87. Srai S.K.S., Burroughs A.K., Epstein B.W.O. The ontogeny of liver copper metabolism in the Guinea Pig: clues to the aetiology of Wilson's disease // Hepatology. 6,3:427-432,1986.

88. Schlief. M.L., Craig A.M., Gitlin J.D. NMDA receptor activation mediates copper homeostasis in hippocampal neurons. // J. Neurosci. Jan 5;25(l):239-246,2005.

89. Stevesson T.,Ciccotosto G., Ma X-M, Mueller G., Mains R., Eipper B. Menkes protein contributes to the function of peptidilglycine-a-amidating monooxigenase. //Endocrinol. 144,1: 188-200,2003.

90. Sym C., Nadal C., Rigby S., Viles J. Copper Binding to the amyloids-(A) peptide associated with Alzheimer's disease // J.Biol.Chem. 279,18:18169-18177, 2004.

91. Takahashi N., Ortel T.L., Putnam F.W. Single-chain structure of human ceruloplasmin: the complete amino acid sequence of the whole molecule // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 390-394, 1984.

92. Tennant J., Stanfield M, Yamaji S., Srai S.K., Sharp P. Effects of copper on the expression of metal transporters in human intestinal Caco-2 cells// FEBS Letters. 527:239-244,2002.

93. Torres J., Wilson M.T. The reactions of copper proteins with nitric oxide//Biochem. Biophys. Acta. 1411:310-322, 1999.

94. Torsdottir G., Kristinsson J., Hreidasson S., Snaedal J., Johansson T., Copper, ceruloplasmin and superoide dismutase (SOD1) in patient with Down's symptome. // Pharmacol. Toxicol. 89: 320-325,2001.

95. Turner Z., Horn N. Menkes disease; Recent advances and new insights into copper metabolism. // Anhals of Medicine, 28:121-129, 1996

96. Turner Z., Vural B., Tonnesen T., Chelly J., Monaco A.P., Horn N. Characterization of the exon structure of the Menkes disease gene using vectorette PCR// Genomics. 26 (3): 437-442,1995.

97. Turnlund J.R. Human whole-body copper metabolism // Am. J. Clin. Nutr. 67: 960S-964S, 1998.

98. Terada K., Schilsky M.L., Miura N., Sugiyama T. ATP7B (WND) protein // Jnt. Biochem. Cell. Biol. 30(10): 1063-1067, 1998.

99. Voskoboinik I., Camakaris J. Menkes copper-translocating P-type ATPase (ATP7A): biochemical and cell biology properties, and role in Menkes disease // J. Bioener. Biomemb. 34(5): 363-371, 2002.

100. Vulpe C, Levinson B., Whitney S., Packman S., Gitscher J. Isolation of a candidate gene for Menkes disease and evidence that it encodes a copper-transporting ATPase // Nature Genet. 3:7-13,1993.

101. Waggoner D.J., Bartnikas T.B., Gitlin J.D., The role of copper in neurodegenerative disease //Neurobiol. Dis. 6(2):221-230, 1999.

102. Wittung-Stafshede P. Role of cofactors in protein folding of the blue-copper protein azurin // Inorg Chem. 43(25):7926-33, 2004.

103. Xu X, Pin S., Gathinji M., Fuchs R., Harris Z.L. Aceruloplasminemia: an inherited neurodegenerative disease with impairment of iron homeostasis. // Ann N Y Acad Sci. Mar;1012:299-305,2004.

104. Yamaguchi Y., Heiny M.E., Gitlin J.D. Isolation and characterization of human liver cDNA as a candidate gene for Wilson disease // Biochem. Biophys. Res. Commun. 197:271-7, 1993.

105. Yang F., Freidrichs W.E., Cupples R.L., Bonifacio M.J., Sanford J. A., Horton W.A., Bowman B.H. Human ceruloplasmin. Tissue-specific expression of transcripts produced by alternative splicing // J. Biol. Chem. 265 (18): 10780-10785,1990.

106. Zhou В., Gitscher J. hCtrl: a human gene for copper uptake identified by complementation in yeast // Proc Natl Acad Sci USA. 94:7481-7486,1997.

107. Zaitsev V.N., Zaitseva I., Papiz M., Lindley P.F. An X-ray crystal. ographic study of the binding sites of the azide inhibitor and organic substrates ceruloplasmin //J. Biol. Inorg. Chem. 4:579-587, 1999.

108. Zaitseva, I., Zaitsev V., Card G., Moshkov К., Bax В., Ralph A., Lindley P. The nature of the copper centers in human ceruloplasmin // J. Biol. Inorg. Chem. 1 (1): 15-22, 1996.

109. Авцын А.П., Жаворонков А.А. Микроэлементозы заболевания, обусловленные дефицитом, избытком и дисбалансом микроэлементов в организме человека и животных. // Экологиячеловека,- Т.2:41-49, 1994.

110. Бабский Е.Б., Зубков A.A., Косицкий Г.И., Ходоров Б.И. Физиология человека // изд «Медицина» М. 1966.

111. Васин A.B., Платонова H.A., Повалихин Р.Г., Клотченко С.А., Самсонов С.А., Цымбаленко Н.В., Пучкова JI.B. Митохондриальный церулоплазмин млекопитающих // Мол. Биол. 39, 1: 48 60, 2005.

112. Васильев В.Б., Шавловский М.М., Нейфах С.А., Прозоровский В.А. Внутримолекулярная гомология церулоплазмина // Биоорг. Химия. 5: 1045-1052, 1979.

113. Гайцхоки B.C., Воронина О.В., Денежкина В.В., Плисс М.Г., Пучкова Л.В., Шварцман A.JJ., Нейфах С.А. Экспрессия гена церулоплазмина в различных органах крысы // Биохимия. 55, 5:927937,1990.

114. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии // М., Высшая Школа, 1980.

115. Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. // М.: Мир, 1984.

116. Нейфах С.А., Васильев В.Б., Шавловский М.М. Строение, каталитические свойства и эволюция церулоплазмина и других голубых белков // Успехи биол. химии. 23: 102-124, 1988.

117. Ноздрачев А.Д., Баженов Ю.И., Баранникова И.А., Батуев A.C. и др. Начала физиологии //СПб изд. «Лань» 2002.

118. Ноздрачев А.Д., Поляков E.JI. Анатомия крысы: руководство для вузов.// СПб. Изд. «Лань» 2001.

119. Платонова H.A., Жигулева Э.А., Цымбаленко Н.В., и др. Биосинтез и распределение церулоплазмина в организме крыс при эмбриональном типе метаболизма меди // Онтогенез. Т. 35: 171182,2004.

120. Пучкова JI.B., Алейникова Т.Д., Цымбаленко Н.В. и др. Биосинтез и секреция церулоплазмина клетками молочной железы в период лактации //Биохимия. 59:341-348, 1994.

121. Пучкова JI.B., Алейникова ТД., Вербина И.А., Захарова Е.Т., Плисс М.Г., Гайгрсоки B.C. Биосинтез двух молекулярных форм церулоплазмина в печени крысы и их полярная секреция в кровоток и в желчь // Биохимия. 58,12:1893-1900, 1993.

122. Пучкова JI.B., Вербина И.А., Денежкина В.В., Гайцхоки B.C., Нейфах С.А. Молекулярные дефекты выведения меди через желчь у больных гепатолентикулярной дегенерацией // Биополимеры и клетка. 7,3:24-30, 1991.

123. Пучкова JI.B., Платонова H.A., Механизм, обеспечивающий гомеостаз меди у эукариотов, и его связь с транспортом железа // Усп. Совр. Биол. 123(1):41-58, 2003.

124. Пучкова JI.B., Сасина JI.K., Алейникова Т.Д., Гайцхоки B.C. Внутриклеточный церулоплазминоподобный белок млекопитающих. // Бюл. эксперим. биол. и мед. Т.1:83-85, 1994.

125. Шварцман A.JI., Вахарловский В.Г., Гайцхоки B.C., Нейфах С.А.

126. Молекулярная структура гена церулоплазмина человека и его экспрессия при мутации Вильсона-Коновалова // Докл. Акад. Наук СССР. 253,3:717-719, 1981.

127. Цымбаленко Н.В., Мокшина C.B., Пучкова JI.B., Платонова H.A. Идентификация участка церулоплазмина, взаимодействующего с медьтранспортной АТРазой Менкеса // Биоорг. Хим. Т. 26: 579-586, 2000.

128. Шварщан A.JI., Воронина О.В., Гайцхоки B.C., Паткин E.JI. Экспрессия гена церулоплазмина в органах млекопитающих по данным гибридизационного анализа с комплементарными ДНК-зондами // Мол. биология. 3:657-662, 1990.