Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ключевые компоненты системы микросомального окисления в сетчатке и коре головного мозга в норме и при экстремальных состояниях сетчатки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ключевые компоненты системы микросомального окисления в сетчатке и коре головного мозга в норме и при экстремальных состояниях сетчатки"

РГ6 ОД

2 9 £0?. ®

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ 11М. И.М.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

ШУШАКОВА

Неллп Давидонна

УДК 577.158 +617.735-002.156

КЛЮЧЕВЫЕ КОМПОНЕНТЫ СИСТЕМЫ МИКРОСОМАЛЬНОГО

ОКИСЛЕНИЯ В СЕТЧАТКЕ И КОРЕ ГОЛОВНОГО МОЗГА В НОРМЕ

И ПРИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЯХ СЕТЧАТКИ.

Специальность 03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Институте эволюционной физиологии и биохимии им И.М.Сеченова РАН.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Р.Н.Этингоф

Официальные оппоненты -

доктор биологических наук Н.Д.Ещенко

доктор биологических наук М.В.Савина

Ведущее учреждение - Военно-Медицинская

академия им.С.М.Кирова

Защита состоится 1995"г. в часов на заседании

Диссертационного совета К002.89.01 в Институте эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН 194223, Санкт-Петербург, проспект М.Тореза, 44.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭФиБ им. И.М.Сеченова РАН.

Автореферат разослан " $ 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного

совета, кандидат биологических наук Л.В.Зуева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Из различных субклеточных фракции сетчатки одной ич

аиченее изученных является фракция эндоплазматического ретикулума (31 IP), азьшаемая мпкросомальной фракцией (МФ). К важнейшим общим функциям ЭПР к аз'¡ичныч тканях организма относится микросомальное окисление (МО) - процесс кислительно-носскшовительных превращении множества эндогенных субстратов и сенибиоткоь, обеспечивающий, » частносш, усгранение токсичных для клегок LUicciii ч:догснно1 о н жзогениого происхождения (Guengerich,l99l). Этот процесс i:\tucc ¡вляется комплексом ферментов, получившим название мпкросомалышя онооксигеназа (Арчаков, 1975). Ключевыми ферментами системы МО являются

ДФН-тпохроч Р-450 редуктаза (НАДФН-Р-450 редуктаза) и сопряженный с ней июхром Р-450 (Р-450). Последний хорошо тучен и различных тканях, особенно в ечени: выявлено большое количество его изоформ, исследованы их природа, вопства н репляни« их индукции различными субстратами (Мишин и Ляхович, 1985; 'non ei al.. 1992). В МФ сетчшки, однако, Р-450 обнаружить не удалось, несмотря на аличпе в ней НАДФН-Р-450 редуктазы и ряда других компонентов системы МО Shichi, 1984). Таким образом, вопрос о ключевом компоненте этой системы -кцепторе восстановительных эквивалентов от НАДФН-Р-450 редуктазы,в сетчатке до астоящего времени остается открытым. Что касается системы МО в МФ коры оловного мозга (ткань, имеющая общее эмбриональное происхождение с сетчаткой и годная с ней по ряду биохимических признаков и черт метаболизма), то наличие -450 в ней показано, однако, лишь начиная с 6-7 недели постнатального развития îcnd et al., 1984). В то же время на ранних стадиях постнатального онтогенеза в .пличных отчетах i оловного мозга особенно высоко содержание негемового железа !ГЖ). В спя И! с ними данными представляет интерес ряд работ последних лет. в ошрыч покачано, что в мембранах ЭПР клеюк миокарда и печени прпсу I с т ву с ! елок, содержащий ПГЖ в }гел+ форме, который, подобно Р-450. является акцептором тектронов 01 НАДФН-Р-450 ред\кгазы Этот белок, получившим название М!Р uicro?oinal п оп protein) и наиболее подробно изученный в МФ миокарда, способен шмулнровагь окисление НАДФП микросочами (Minotti & Ikeda-Saito, 1991, ■imotti. î 402).

Одной in основных функций системы МО является устранение токсичных для рганизма веществ, поэтому ее роль особенно велика при экстремальных состояниях :тресс, гипоксия, ультразвуковое и радиационное поражение) (Шугалей и др., 1991; уляева и др..1994; Knott & Wills, ! 974; Mkrtchian & Andersson, 1990) и патологических роцессах рапичной этиологии (Ершова и др.. 1993; Trammel et а!.. 19S9. Sakai et I.,1992; К.ошо1Т, 1993). Во всех пнх случаях показана активация системы МО во ногнх тканях (печень, мозг, легкие и т.д.), проявляющаяся обычно в индукции азличных нзоформ Р-450 и в увеличении скорости реакций, осуществляемых этой истемой. Следует отметить, что все полученные к настоящему времени данные об ктнваппи системы МО относятся к достаточно хорошо изученному ее типу, когда лгочевмм компонентом системы является Р-450. По поводу же возможности ктивации при экстремальных состояниях и патологических процессах системы МО, в эсчав которой входит белок с НГЖ, пока ничего неизвестно.

Цели и задачи исследования. Основной целью работы являлась идентификация еизвестного компонента системы МО в сетчатке, выявление особенностей этой истемы в сетчатке и коре головного мозга и изучение возможных изменений в ней ри патологических процессах, обусловленных экстремальным воздействием света и азвитием наследственной дегенерации сетчатки (НДС). Соответственно, были оставлены следующие задачи.

1. Выделить, по возможности,очистить п идентифицировать компонент, который является акцептором электронов от НАДФН-Р-450 редуктазы в системе МО и сетчатке.

2. Изучить эффекты воздействия света различной интенсивности на систему МО сетчатки, используя в качестве тестов скорость окисления НАДФН микросомами и активность НАДФН-Р-450 редуктазы.

3. Сравнить содержание Р-450 и активность НАДФН-Р-450 редуктазы в микросомах коры мозга и, для сравнения, печени в разные периоды постнатального онтогенеза у здоровых и больных НДС крыс.

4. Определить содержание НГЖ и его окислительно-восстановительный статус в микросомах коры мозга и, для сравнения, печени в норме и при НДС у крыс в разные периоды постнатального развития.

5. В случае выявления существенных сдвигов в содержании НГЖ в тканях крыс с НДС, оценить у этих животных на разных стадиях постнатального онтогенеза параметры, определяющие содержание железа (ПОСЖ) в различных тканях организма: содержание и насыщенность железом трансферрина сыворотки крови, ферритина печени и уровень НГЖ в сыворотке крови.

Научная новизна работы. Впервые из микросом сетчатки выделен и идентифицирован содержащий НГЖ компонент белковой природы, который является акцептором электронов от НАДФН-Р-450 редуктазы в системе МО этой ткани. Таким образом, установлено, что в тканях нервной системы имеются, по крайней мере,два типа систем МО, различающихся природой акцептора электронов от НАДФН-Р-450 редуктазы (Р-450 и белок, содержащий НГЖ). Впервые показана активация системы МО сетчатки при патологических процессах, возникающих в этой ткани как при эктремальном воздействии света, так и при развитии НДС у крыс.

Прослежены изменения в постнатальном онтогенезе в содержании и активности компонентов системы МО в сетчатке, коре мозга и печени у здоровых и больных НДС крыс. Выявлена различная динамика изменений соотношения содержания Р-450 и НГЖ в микросомах коры мозга и печени здоровых животных. У крыс с НДС обнаружены изменения изученных компонентов системы МО, которые можно четко разделить на две группы: неспецифические для МФ нервной ткани и специфические. К первой группе относится уменьшение содержания НГЖ на 30-60% в МФ коры мозга и печени на 20й день жнзни животных, которое четко коррелировало со значительным снижением ПОСЖ в этот период. К 45 дню постнатального онтогенеза изменения в содержании НГЖ у больных крыс по сравнению с контролем исчезали, одновременно происходила и нормализация ПОСЖ. Специфическими для нервной ткани на разных стадиях развития НДС оказались, в первую очередь, активация системы МО (увеличение активности НАДФН-Р-450 редуктазы в сетчатке, увеличение скорости окисления НАДФН микросомами коры мозга крыс с НДС и резкое повышение содержания в них Р-450) и увеличение активности мембраносвязанной формы глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы в МФ коры мозга больных животных. Таким образом, впервые показаны вовлечение компонентов системы МО нервной ткани в патологические процессы при развитии НДС и возможная роль иона железа в патогенезе заболевания.

Практическое значение. Полученные результаты в значительной мере расширяют представления о компонентах системы МО в нервной ткани и об изменениях ее состава в течение постнатального онтогенеза. Данные о вовлечении этой системы в процессы, протекающие в сетчатке при экстремальном воздействии света, а также о ткаиеспецифической активации системы МО в сетчатке и коре головного мозга крыс с НДС важны для понимания патогенеза данного заболевания и еще раз подтверждают,

10 НДС следует рассматривать как системное заболевание организма. Данные о (.'¡ком тмененни ПОСЖ в различных тканях организма у крыс с НДС до нарушения рнге.п.ной функции moivt оказаться полезными для разработки диагностического еета с целью выявления ранних стадий пигментного ретинита у людей. В целом отученные результаты представляют интерес для специалистов, работающих в о.тасп) изучения системы микросомального окисления, нейрохимиков. изучающих пияние нарушенного гомеостаза железа на функции ЦМС, а также для врачей-фтальмоло! ов.

Сфчкгура и объем лиссергашщ. Диссертационная работа состоит из введения, бзора литературы, экспериментально!! части (описание методик и изложение е!\тыа!ов исследования). обс\жденпя полученных результатов, выводов и списка итертуры (2 ID ссылок). Работа изложена на l'w' страницах машинописного гкета, включает 14 таблиц и 15 рисунков.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на: онференции "Свободнорздикальные механизмы церебральных патологий: еоретические и практические аспекты проблемы" (Москва, ноябрь-декабрь, 1993); V! Международном съезде офтальмологов (Москва, март, 1994); 10 Симпозиуме вроиейского нейрохимического общества (Иерусалим. Израиль, август, ¡994); VI !еждународном Симпозиуме по наследственным ретинальным дегенерациям Иерусалим, Израиль, ноябрь, 1994); заседании секции молекулярных основ эволюции ункций Института эволюционной физиологии и биохимии им.И.М.Сеченова РАН дань, 1995), I Конференции молодых физиологов и биохимиков России Биохимические н биофизические механизмы физиологических функций" (Ст-[етербург. сентябрь. 1995).

I 1о мtерим диссертации опубликовано 10 печатных работ.

"ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

МА 1Т.РИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы. Первая часть работы выполнена на тканях сетчатки и миокарда рунного рогатого скога. Объекчом исследования служила МФ. получаемая а »личными методами дифференциального центрифугирования в зависимости от цели \-спериментов (Minotti & Ikeda-Saito, 1991; Ravindranath et a!., 1990). МФ сетчатки олучалн из глаз, адаптированных к темноте (хранение глаз и все этапы получения 1Ф проводили в темноте или при красном свете), вскрываемых при обычном еиицении или подвергшихся длительной интенсивной засветке. В последнем случае iasa, находящиеся в ледяной бане,освещали лампой накаливания мощностью 75 Вт с исстояння 35 см в течение 2 часов.

Вторая часть исследования проведена на крысах чистой линии Campbell (самки и |мцы), страдающих НДС, в возрасте 20-90 дней. Контролем служили животные шит Wistar соответствующего пола и возраста. Всего в работе было использовано коло 1000 крыс. Исследования проводили на постмитохондриальном супернатанте ;гчагки, на МФ коры головного мозга, миокарда и печени, предварительно ерфузированной 0.9% раствором NaCI, а также на цельной крови и сыворотке крови ивотных. Для получения МФ применяли различные методы дифференциального енгрифугирования (Карузина и др., 1979; Nabeshima et al., 1981; Kimura & Yamasliita, ?72).

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ МО. Содержание Р-450 в 1Ф печени оценивали классическим методом (Omura & Sato, 1964) по СО-ифференциальному спектру; в МФ коры головного мозга - при помощи одифнкацин этого метода (Nabeshima et al., 1981), разработанной для препаратов с

низким содержанием Р-450 и высокой степенью примеси гемоглобина. Активное! НАДФИ-Р-450 редуктазь; определяли во всех случаях по методу (Strobe! ¿ Dignam,l978). НАДФН-оксидазную активность системы МО в МФ сетчатки бык; коры головного мозга и миокарда крыс оценивали спектральным методом (Miaotti i Di Genano,1990) по убыли НАДФН в пробе. Инкубационная смесь объемом 2 м. содержала 50мМ NaCI (рН=7.0) и исследуемую пробу микросомального белка (0.1-0. мг/мл). Реакцию запускали добавлением 0.25 мМ НАДФН.

Частичную очистку Ml Ра из МФ миокарда быка проводили п< модифицированному методу (Minotti & Ikeda-Saito, 199]). Буферные системы при это,* не применяли, чтобы исключить возможное взаимодействие их компонентов с НГЖ содержащимся в М1Ре. Все растворы готовили на деионизированной воде, чтоб! устранить влияние присутствующих в обычной дистиллированной воде ионов желез на результаты экспериментов. Процедура очистки включала следующие стадии.

1 - Удаление из микросом не участвующего в МО пула НГЖ, связанного ферритином и гемосидерином, методами дифференциального центрифугирования i низкоскоростной кальциевой агрегации микросом (Kupfer & Levin, 1972).

2 -Экстракция MlPa из микросом без сопутствующей солюбилизации НАДФН-Р 450 редуктазы неионным детергентом Тритон N-101 в концентрации 0.1'/> iVInKpocoMbi после обработки детергентом ("тритоновые" микросомы), обладающи' высокой НАДФН-Р-450 редуктазной активностью и низкой скоростью окислени: НАДФН по сравнению с исходным препаратом, использовали как тестовый объек' при дальнейшей очистке MlPa из тритонового экстракта.

3 - Освобождение от ряда примесных белков путем их дробного осаждения и тритонового экстракта сульфатом аммония в концентрации 30% и 50% от насыщения

4 - Хроматография полученного белкового осадка на колонке с Sepharose 6В Фракции элюировали буфером PBS, содержащим 8.1мМ ЫагНР.!, 1.5 мМ КН2РО.1. 2.' мМ KCl, 138 мМ NaCI, рН=7.3, и оценивали в них содержание белка по поглощении света при длине волны 280 нм и содержание НПК (см.ниже). Отбирали фракции содержащие белок и железо, и проверяли их способность стимулировать окислени! НАДФН "тритоновыми" микросомами. Для этого к инкубационной смеси добавлял! аликвоты фракций по 0.5 мл и рассчитывали скорость окисления НАДФН, сравнива) ее затем со скоростью в пробах, которые вместо фракций содержали эквивалентно! количество буфера.

5 - Электрофоретическое разделение белков во фракциях, обладающи) способностью стимулировать окисление НАДФН и содержащих частично очищенньп препарат MlPa. Электрофорез проводили в пластине ПААГ в присутствии 0.17 додецилсульфата Na. В качестве свидетелей использовали бычий сывороточньн альбумин (67 кДа) и яичный альбумин (43 кДа).

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ, СОДЕРЖАЩИХ НГЖ. Обше< содержание НГЖ и Fe^/Fe-1* соотношение в сыворотке крови, микросомах препаратах MlPa из сердца и сетчатки быка и препаратах ферритина (Ф) из печет крыс определяли методом (Brumby & Massey, 1967), основанном на образованш окрашенного комплекса восстановленного железа с о-фенантролином. Дл} определения содержания трансферрина (ТФ) в сыворотке крови крыс проводил! электрофорез белков сыворотки (5 мкг белка из обьединенной сыворотки от £ животных одного пола и возраста) по методу (Welch & Skinner, 1989), использу; неденатурируюшуто буферную систему. В качестве свидетелей также использовал! бычий сывороточный и яичный альбумины. Гели затем окрашивали 0.1% Кумаса R-250 для выявления белковых полос, разрезали на полосы, соответствующт

зучаемым образцам сыворотки, и сканировали эти полосы при помощи специальной рис тики на спектрофотометре Зресогс! М-40 при длине волны 680 им. Содержание 'Ф в плазме крови оценивали по отношению площади соответствующего ему пика а денсшограмме к общей площади всех пиков, соответствующих 5 мкг белка ывороIки. Расчет насыщенности железом ТФ сыворотки крови крыс проводили, с\о:ы и) содержания НГЖ в аликвоте сыворотки крови, относя это содержание к оличеству ¡Ф (в мкмоля.ч) в лом же препарате. При этом полагали, что почти все 1ГЖ сыворотки крови связано с ТФ, так как пул НГЖ. не связанный с ТФ, крайне 1ал. и ^чшывади тог факт, что 1 молекула ТФ максимально свяшвает 2 иона железа НиеЬеп & Нтс11,1987).

Выделение и частичную очисткч (Ф) из печени крыс проводили по методу (Аговю I а1.,1978). Печень перфушровали раствором, содержащим 8.1мМ \;а:НР04, 1.5 мМ ^.НгРО-ь 2.7 мМ КО, 138 мМ ГмаС!, рН=8.3. Ткань гомогенизировали в 0.15 М тл^орс !\'аС! и центрифугировали гомогенат при 4500 й. Надосадочную жидкость рогревали при 1-70-80 11 С а хечение И! минут, затем охлаждали до 20 "С, доводили начение рН до 4.5 уксусной кислотой и оставляли на ночь при 1-+4 0 С. На иедуюший день суспензию центрифугировали при 2500g и в надосадочной жидкости роводили высаливание белков при помощи сульфата аммония в концентрации 50% т насыщения в течение 48 часов при 1=+4 "С. Пробы центрифугировали при 2500 й, олученный бурый осадок растворяли в денонсированной воде и проводили гльфильтрацию на колонке с БерЬагоэе 6В, уравновешенной ЮмМ Ыа-фосфатным уфером, рН=7.4. В полученных фракциях оценивали содержание общего белка и (ГЖ. Фракции с максимальным содержанием железа, представляющие собой астично очищенный препарат Ф, объединяли и проводили в них ■¡¿ы-рофорегическое разделение белков, используя неденатурирующую буферную ншеч> по методу (Са15Ппроо1а5 е1 а1., 1975), Полученные гели окрашивали двумя гюсобами: 0 I Кумлсси К-250 (для выявления белковых полос) и по методу (\Vray « I., ¡970), н основе которого лежит реакция образования берлинской лазури (для ыявления железа в белках). После обоих видов окрашивания производили •.-.чнирование полученных геле)! при помощи специальной приставки на текгрофотомегре Яресоп! М-40 при длине волны 680 нм.

П РОЧИЕ ОП РЕДЕЛ ЕНI IЯ.

Определение .. активности__мембраносвязанной формы глюкочо-6-фосфат

егидрогеназы (глюкозо-6-фосфат ДГ) проводили спектрофотометрическим методом •отита Л Уатаь1п1а.1972), регистрируя накопление НАДФН в среде инкубации.

Содержание белка определяли методом Лоури и др.(Ьо\Угу « а1.,1951), одпфицированным (МапуеП а а!., 1978).

Статистическую обработку результатов проводили по общепринятой методике, спользуя критерий Стьюдента для 0.05% уровня значимости (Рокитский,1961).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I.___Компоненты системы МО в сетчатке и их изменения при экстремальных

чстояниях .

Принимая во внимание данные об отсутствии в МФ сетчатки Р-450, мы редположили, что акцептором электронов от НАДФН-Р-450 редуктазы в этой ткани ожет быть белок, содержащий НГЖ, подобно тому, как это имеет место в ткани нокарда. Соответственно, в первой части работы была предпринята попытка мделить и частично очистить компонент системы МО, сопряженный с НАДФН--450 редуктазой, по схеме, подобной вышеприведенной схеме для очистки М1Ра из 1Ф миокарда (стр.5). При этом в качестве маркеров этого компонента использовали

наличие в нем НГЖ и его способность стимулировать окисление ПАДФН "тритоновыми" микросомами сетчатки. В первой серии экспериментов был проведен подбор концентрации детергента, позволяющей экстрагировать из микросом компоненты, содержащие НГЖ, при минимальной сопутствующей солюбилизации НАДФН-Р-450 редуктазы. Оказалось,что минимальный выход НАДФН-Р-450 редуктазы в тритоновый экстракт имел место при концентрации детергента 0.05%. Применение более высоких концентраций Тгйоп N-101 (0.1%, 0.5%) увеличивало выход НГЖ из микросом, но также вызывало значительную сопутствующую солюбилизацию НАДФН-Р-450 редуктазы, которая в дальнейшем могла бы затруднять оценку способности препаратов стимулировать окисление НАДФН "тритоновыми" микросомами. Принимая во внимание результаты этой серии экспериментов, для дальнейших этапов очистки мы использовали тритоновый экстракт, полученный при применении 0.05% концентрации детергента.

Для того, чтобы ответить на вопрос, действительно ли НГЖ тритонового экстракта может быть акцептором электронов от НАДФН-Р-450 редуктазы, сравнивали содержание НГЖ и скорость окисления НАДФН в исходных и "тритоновых" микросомах, а также в тритоновом экстракте. При этом, чтобы учесть 30-35% потерю белка из микросом при их обработке детергентом и сделать корректным прямое сравнение препаратов, содержание НГЖ в последних выражали в виде соотношения НГЖ/редуктаза, а само окисление НАДФН измеряли в инкубационной смеси, содержащей фиксированное количество редуктазы - 1.5 ти/мл (за 1 и редуктазной активности принимали 1 мкмоль восстановленного цитохрома С/мл/мин), что соответствовало 0.180-0.200 мг белка для исходных микросом, 0.1200.130 мг белка для "тритоновых" микросом и 1.2-1.4 мл тритонового экстракта. Из результатов этой серии экспериментов (табл.1) следует, что скорость окисление НАДФН в препаратах была пропорциональна соотношению НГЖ/НАДФН-Р-450 редуктаза. Очевидно, что наибольшая скорость окисления НАДФН имела место в тритоновом экстракте, где это соотношение было максимальным. В "тритоновых' микросомах с частично удаленным НГЖ скорость окисления НАДФН была в 2 раза ниже, чем в исходных. Эти данные позволили нам заключить, что в тритоновом экстракте действительно содержится некий компонент, содержащий НГЖ и являющийся акцептором электронов от НАДФН-Р-450 редуктазы. Следует, однако, отметить, что доля НГЖ, связанного с этим компонентом по отношению к общему содержанию НГЖ в микросомах остается пока неясной.

Последним этапом очистки содержащего НГЖ компонента МФ сетчатки являлось хроматографическое разделение белков, полученных из тритонового экстракта (см.стр. 5).

Таблица 1. Окисление НАДФН препаратами с различным соотношением

НГЖ /НАДФН-Р- 450 редуктаза.

Препарат

НГЖ / НАДФН-Р-450

Окисление НАДФН (нмсш окисленного

Исходные микросомы "Тритоновые" микросомы Тритоновый экстракт

редуктаза (нмоль НГЖ/ти) ' 0Д4 ± 0.05 (п-1) 0.21 +0.02 (п=3) 2.18 + 0.28 (п=3)

НАДФН/мл/мин)

■тт±шоЩ......

1.6+ 0.05 (п=3) 16.54 ±0.98 (п=3)

Примечание." здесь и далее п - число опытов в серии.

Профили элюции белка и НГЖ представлены на рис. 1А. После этого фракции роверяди на их способное п> стимулировать окисление НАДФН "тритоновыми" шкросомами, добавляя в инкубационную сиесь, содержащую 0.05 мг белка мнкросом, тиквоты фракций по 0.5 мл. Оказалось, что фракции N 13-16 с высоким содержанием сслсча аиччлируюг окисление НАДФН "тритоновыми" микросомами в 2-3 раза, иди как фрлмти N 5 не оказывали подобного влияния (рис.IБ).

Для сравнения полученного нами белка с М1 Ром из миокарда мы провели чис¡ку М1Ра из микросом сердца быка по схеме (см.стр.5). При этом были получены есьма похожие профили элюции НГЖ и белка при гельфильграции препарата на олонке с ЗерЬагояе 6В. Номера фракций, обладающих способностью стимулировать •кис.а-нис НАДФН также совпадали. Полученные данные, по-видимому, являются освенным диказательспюм того, чн> содержащий НГЖ компонент из МФ сетчатки юдобен М1Ру из микросом сердца. Для проверки этого предположения была ¡ровс-депа серия экспериментов по реконструкции "тритоновых" микросом из шокарда и сетчатки с МЛРом и содержащим НГЖ компонентом МФ сетчатки. В шкубационную смесь, содержащую 0.05 мг микросомального белка добавляли 0.5 мл :астично очищенных препаратов МГРа из сердца или содержащего НГЖ компонента 13 сетчатки. Из представленных в табл.2, результатов этой серии экспериментов ледует, что как М1Р, так и содержащий НГЖ компонент МФ сетчатки обладали тимулирующим действием на окисление НАДФН " тритоновыми" микросомами етчаткн и сердца, что также, по-видимому, свидетельствует об их функциональном юдобии.

'аблица 2. Влияние частично очищенных препаратов М1Ра и НГЖ содержащего чпикжента МФ сетчатки на скорость окисления НАДФН "тритоновыми" шкросомами сетчатки и миокарда

Для сравнения молекулярных масс М1Ра и содержащего НГЖ компонента из МФ етчатки было проведено электрофоретическое разделение белков во фракциях N14 (с пжеимальным содержанием НГЖ и стимулирующим действием на окисление -1АДФН) в присутствии 0.1% додецилсульфата Ыа. Электрофореграмма представлена

1а рис.2.

Очевидно, что в обоих препаратах присутствует белок с молекулярной массой 66 :Да. что полностью соответствует молекулярной массе М1Ра из сердца быка, которая шла ранее точно установлена различными способами (МтоМ & lkeda-Saito, 1991). Гаки.ч образом, совокупность полученных данных позволяет считать, что в МФ :етчатке присутствует белок, подобный МИ'у, содержащий НГЖ, и заменяющий Р-450 ) качестве акцептора электронов от НАДФН-Р-450 редуктазы.

В следующей серии экспериментов мы попытались выяснить, как влияет юздействие света различной интенсивности на систему МО сетчатки. Для этого были 1ыделены МФ из сетчаток глаз, адаптированных к темноте, из глаз, вскрытых при

Увеличение скорости окисления НАДФН (в от контроля - 'гритоновые" микросомы без добавок)

"гритоновые" микросомы се1ча1ка миокард

270 +15 (п = 3) 350 +18 (п=3)

ЬМ1Г

+ НГЖ содержащий компонент МФ сетчатки 300 + 12 (и=3) 400+ 22 (п=3)

Рис. 1А. сетчатки

10 15

номера фракций

Профиль элюции белка и НГЖ при гельфильтрации препарата из Мс на колонке с ЗерИагоБе 6В.--белок;----НГЖ.

300

200

00

о

¡0 15

номера фракций

20

25

Рис. 1Б. Стимулирующее действие фракций, полученных при гельфильтрацн препарата из МФ сетчатки, на окисление НАДФН "тритоновыми" микросомам: сетчатки.

:'ис.2 "Электрофорез частично очищенных препаратов М1Р из МФ миокарда и белка, содержащею НГЖ, in VIФ сетчатки быка 1 - MIP миокарда (5 мкг белка); 2 -:одержаишй Ш"Ж белок сетчатки (2,5 мкг белка); 3 - содержащий НГЖ белок етчагки (5 мкг белка).

тбычном освещении и из 1лаз, подвергшихся длительной интенсивной засветке. В толученных мпкросомах определяли активность НАДФН-Р-450 редуктазы и скорость окисления НАДФН. Следует отметить, что при экстремальном воздействии света на :етчатку в последней наблюдаются глубокие поражения как внешних, так и шутренних слоев, сходные с таковыми, отмеченными при различных формах НДС Oi tumisu'ak & Winkler. 1994). По з тому представляло интерес также сравнить tKTituHocTb i 1ЛДФ11-P-450 редуктазы в постмитохондриальном супернатанте сетчатки ¡доровых крыс линии Wistar и больных НДС крыс на тех стадиях развития болезни, согда в сетчатке имеет место выраженная деструкция фоторецепторов (90 тней жизни). На основании полученных данных (рис.3) можно заключить, что при патологических процессах в сетчатке, обусловленных как экстремальным воздействием света, так и НДС, имеет место активация системы МО этой ткани, что плражается в увеличении активности НАДФН-Р-450 редуктазы и в увеличении скорости окисления НАДФН. По-видимому, активации является общим механизмом нвега системы МО на экстремальное состояние различных тканей, независимо от состава входящих в эту систему компонентов (Р-450 или содержащий НГЖ белок).

2. Компоненты системы МО в коре головного мозга и их изменения при развитии -ЩС у крыс.

Как было указано выше (стр.2), Р-450 в МФ коры головного мозга крыс тоявляется, начиная с 6-7 недели постнатального развития. Что же касается НАДФН-

окшлспш

я 250

НЛДФН

о

§ 200

е- |

% 150|

W С

Т О 3

Т О 3

сетчатка быков сетчатка

крыс

Рис.3 Активация системы МО сетчатки при экстремальных состояниях. Т - темнота; О - обычное освещение (дневной свет); 3 - интенсивная засветка. С - Campbell; W - Wistar.

Р-450 редуктазы, то в доступной литературе нам не удалось обнаружить данных об онтогенетической динамике ее активности в этой ткани. Кроме того, наш интерес к МФ коры головного мозга был обусловлен и тем, что при развитии НДС у крыс ряд метаболических нарушений, обнаруженных в сетчатке и пигментном эпителии глаза больных животных, проявлялся также и в коре головного мозга, в частности, в ее МФ (Ефимова, Этингоф, 1989). Поэтому во второй части работы мы перешли к изучению компонентов системы МО в коре мозга здоровых и больных НДС крыс.

В табл.3 представлены данные по активности НАДФН-Р-450 редуктазы и содержанию Р-450 в МФ коры головного мозга и, для сравнения, печени крыс линий Wistar и Campbell в разные периоды постнатального онтогенеза. Очевидно, что у здоровых животных активность НАДФН-Р-450 редуктазы значительно изменялась в онтогенезе в МФ обеих тканей, однако во все изученные сроки жизни была значительно ниже в коре головного мозга, чем в печени, что соответствует литературным данным (Anandatheerthavarada et al.,1992). Изменения активности фермента в микросомах коры головного мозга и печени в течение постнатального онтогенеза были подобны и обусловлены, по-видимому, периодом полового созревания животных.

У крыс с НДС как активность НАДФН-Р-450 редуктазы, так и характер ее изменений в онтогенезе не отличались от таковых у здоровых животных в МФ обеих тканей во все изученные сроки жизни.

Что касается содержания Р-450, то в МФ печени динамика этого показателя в онтогенезе была одинаковой у крыс обеих линий и полностью соответствовала литературным данным (Imaoka et al., 1991). В то же время, при изучении этого

И

Таблица 3. Активность НАДФН-Р-450 редуктазы к содержание Р-450 в МФ коры

юловиого мозга п печени крыс линий Wistar и Са''ф Ь е| 1р аз^юто возЕ^Н1 •________

Во фас Линия Активность НАДФН-Р-450 Содержание Р-450 (пкмоль/мг

г крыс крыс редуктазы (нмоль восст. цнтохрома белка)

[дин) С/мг белка/мин

кора мозга печень кора мозга печень

20 Wistar 6.7 + 0.2 93.8 ± 1.0 не обнаружен 590.0+ 40.0

(п=18) (n=6) (п=8)

Campbel' 6.2 + 0.1 78.9 + 3.3 не обнаружен 540.0 + 0.60

(n S 0) (n=6) (п=8)

45 Wistar 12.4+0.4 263.2 + 12.6 15.8 + 0.2 1040.0 + 80.0

(n=24) (n=6) (п=20) (п=8)

Campbell 15.1 ±0.6 .220.1 ± 10.2 37.3 т 1.0* 1 160.0 + 70.0

(n=l5) (n=6) (п=20) (п=8)

90 Wistar 7.7 + 0.2 75.0 + 4.5 17.5+0.1 1200.0 ± 100.0

(n=8) (n=6) (п=20) (п=8)

Campbell 6.6 + 0.3 75.4 + 1.4 81.3 + 1.6* 1250.0 + 90.0

(n=12) (n=6) (п=20) (п=8)

Примечание: здесь и далее * - различия достоверны для р < 0.05

юказателя и МФ коры головного мозга было обнаружено, что уже начиная с 45 дня к и з I i 11 у крыс с НДС отмечается резкое (в 2.3 раза) увеличение содержания Р-450 по .равнению со 1доропымн животными. Эта разница становилась еще более ¡ыраженнои (в 4.6 раза) к 90 дню жизни. На основании полученных данных можно ¡аключить, что у крыс линии Campbell на поздних стадиях развития болезни 1КП(ваш!я системы МО имеет место не только в сетчатке (рис.3), но и в коре -оловпого мозга, где она проявляется в виде резкого увеличения содержания Р-450. На Золее ранннх стадиях постнатального онтогенеза (20 день жизни) обнаружить Р-450 в МФ коры головного мозга животных обеих линий не удалось, что согласуется с титературными данными (стр.2). Однако активность НАДФН-Р-450 редуктазы в МФ соры головного мозга в этот период жизни была относительно высокой, что тозволяло предположить наличие альтернативного акцептора электронов от нее в ион ткани. Из данных литературы известно, что содержание НГЖ, которое .южет служить таким акцептором, в различных отделах мозга особенно высоко шенно на ранних стадиях постнатального онтогенеза (Taylor et ai., 1990), когда Р-450 i этой ткани еще нет. Для проверки этого предположения, а также для выяснения ¡опроса о том, имеет ли место активация системы МО в МФ коры головного мозга фыс с НДС уже на ранних стадиях развития болезни в следующей серии жепериментов изучали скорость окисления НАДФН микросомами коры мозга крыс типий Wistar и Campbell разного возраста (рис.4).

Очевидно, что микросомы коры головного мозга способны окислять НАДФН в этсутствии Р-450. Эти данные подтверждают предположение о том, что :одержащий(ие) НГЖ компонент(ы) МФ коры головного мозга, действительно может :лужить акцептором электронов от НАДФН-Р-450 редуктазы и, по-видимому, шменяет Р-450 в электрон переносящей цепи микросом в нервной ткани на ранних ггадиях постнатального онтогенеза. Из данных представленных на рисунке, следует также, что у больных животных на ранних стадиях постнатального онтогенеза (20

день жизни) имело место значительное (в 2.3 раза) увеличение скорости окисления НАДФН микросомами коры мозга. Таким образом, изменение активности системы МО в МФ коры головного мозга у крыс линии Campbell проявляется не только ни поздних (90 день жизни), но уже п на ранних (20 день жизни) стадиях развития НДС еще до нарушения зрительной функции. По мере дальнейшего развития животных различия в скорости окисления НАДФН микросомамп коры мозга крыс линиг Campbell и Wistar еще больше возрастали (3.7 раза), что, возможно, объясняется появлением к этому времени и большого количества Р-450 в этой фракции у больны* животных (табл.3). Констатируя феномен активации системы МО в сетчатке и кор1 головного мозга крыс при развитии НДС, следует, однако, подчеркнуть различные ее механизмы в этих тканях, по крайней мере на поздних стадиях постнатальногс развития. Так, в сетчатке больных крыс 90-дневного возраста было обнаружено

Рис.4 Окисление НАДФН микросомами коры головного мозга крыс линии Wistar и Campbell разного возраста.

Примечание: скорость окисления НАДФН микросомами коры мозга крыс линии Wistar составляла 2,51+0,2 и 3,50+0,23 нмоль/мг белка/мин на 20 и 90 день жизни, соответственно.

увеличение активности НАДФН-Р-450 редуктазы (рис.3), тогда как в коре головного мозга этих животных имело место резкое увеличение содержанияР-450 (табл.3). По-видимому, тот или иной механизм активации системы МО определяется целым рядом причин: природой и, соответственно, сродством акцептора электронов к НАДФН-Р-450 редуктазе, количественным соотношением этих компонентов, появлением в экстремальных условиях каких-либо регуляторов системы МО, способных избирательно активировать ее компоненты или индуцировать их синтез. В отношении

Р-450 в литературе имеется целый ряд данных такого рода (Porter & Coon, 1991; Fliasson et al.. 1990): что же касается возможного увеличения количества белка, содержащего НГЖ, при активации системы МО в сетчатке и коре головного мозга на ранних стадиях пост катального онтогенеза, то эт от вопрос остается пока открытым.

Следует специально отметить, что обнаруженные различия в скорости окисления ПЛДФН микросомами коры мозга здоровых и больных НДС крыс оказались спгпифичными именно для нервной ткани. Так, скорость окисления НЛДФП мнкросомами миокарда крыс линий Wistar и Campbell на 20й день жизни была одинаковой, составляя 24.1 i 4.1 (п=5) и 21.3 + 3.5 (п=5) нмоль/мг белка/мин, oui гвегственно

Учитывая роль НГЖ в системе МО сетчатки и коры мозга на ранних стадиях пос1наталыюго онтот енеза, представлялось целесообразным оценить его общее содержание и соотношение его восстановленной и окисленной форм в МФ коры мозга ii, ллч сравнения, печени больных и здоровых животных на разных стадиях постнатального развития. Результаты »той серии экспериментов представлены в табл.4., где для наглядности приводятся также полученные ранее данные (Ефимова, Этингоф, 1989) по МФ коры мозга на 20й день жизни животных. Прежде всего обращает на себя внимание различная динамика изменения содержания НГЖ в МФ коры мозга и печени в течение постнатального онтогенеза у животных обеих линий. Так, в мнкросомах печени имело место значительное увеличение содержания НГЖ в онтогенезе. Что же касается МФ коры мозга, то на 90й день жизни нам удалось обнаружить в ней лишь следовые количества НГЖ как у здоровых, так и у больных НДС крыс.

Hi приведенных в таблице данных очевидно, что обнаруженное ранее снижение содержании НГЖ в МФ коры мозга больных крыс па ранних стадиях постнатального онтогенеза {Ефимова, Этингоф, 1989) оказалось неспецифичным для нервной ткани. Line более значительное снижение лого показателя обнаружено в МФ печени. В то же время специфичными для нервной ткани оказались изменения в окислительно-восстановительном статусе железа в этот период жизни животных: в то время как в МФ корт.! мозга больных крыс соотношение Ге2+/Fe1+ превышало норму в 10 раз. в микросомах печени соотношение Fe2+/Fe-l+ было очень близким у животных обеих

Таблица 4. Содержание НГЖ и Fe2+/Fe-,+ соотношение в микросомах коры мозга и печени крыс линий Wistar и Campbell разного возраста.

Нсчраст Ткань Линия Содержание НГЖ (нмоль/мг белка) Fe:*/Fe'*

(дни) крыс Общее Fe:* Fe^

20 Кора мозга Wistar 10.55+1.09

3.55 + 0.16 7.00 + 0.52 5.77 + 0.55* 1.11+ 0.14*

28.93 + 3.71 12.14+1.96 10.89+ 2.14* 5.00 +1.08* следовые количества

0.51 5.20*

2.38 2.19

(n= 12) Campbell 6.88+1 03* Печень Wistar 41.07±3.75 (n=8) Campbell ! 5.89+2.50*

90 Кора мозга Wistar (n=12) Campbell

следовые количества

Печень Wistar 278.4+61.8 (n=8) Campbell 207.0+51.6

43.6+11.3 234.8+ 52.1 35.5+8.6 171.4+33.2

0.19 0.21

линий. Не было различий как в содержании НГЖ, так и в Fe2+/Fe-,+ соотношении в МФ печени между крысами с НДС и здоровыми животными и на более поздних стадиях постнатального развития.

Результаты этих серий экспериментов поставили перед нами два вопроса. Во-первых, чем могут быть обусловлены специфические для нервной ткани различия в степени восстановленности НГЖ МФ коры мозга больных и здоровых животных? И, во-вторых, в чем причина неспецпфических изменений, а именно падения уровня НГЖ в МФ фракциях изученных тканей на 20й день жизни у крыс с НДС?

Для того, чтобы попытаться ответить на первый вопрос в следующей серии экспериментов мы изучили активность мембраносвязанной формы глюкозо-6-фосфат ДГ в микросомах коры мозга и печени крыс линий Wislar и Campbell разного возраста (рис.5)

Как следует из представленных на рисунке данных, активность микросомальной глюкозо-6-фосфат ДГ существенно повышена в МФ коры мозга крыс линии Campbell по сравнению со здоровыми животными как на ранних (20 день), так и на более поздних (90 день) стадиях развития болезни. В то же время в микросомах печени активность фермента была одинаковой у животных обеих линий. Таким образом, можно полагать, что специфика изменений в нервной ткани при НДС связана не столько с изменениями в содержании НГЖ в МФ, сколько с изменениями в скорости образования восстановительных эквивалентов, которые, в отличие от изменений в содержании НГЖ микросом, сохранялись и на более поздних сроках постнатального онтогенеза (90й день жизни).

«моль НАДФН Mi1 Gerikti'мни

Рис.5 Активность мембраносвязанной формы глюкозо-6-фосфат ДГ в коре головногс мозга и печени крыс линий \Vistar и СатрЬеИ разного возраста.

Чтобы ответить на второй вопрос (о причинах снижения содержания Н1~Ж в МФ ори мола и печени больных крыс на 20й день жизни) представлялось важным

щенип. v здоровых и больных животных ПОСЖ (см.стр.3), а именно: содержание 1ГЖ в сыворотке крови, содержание и степень насыщенности железом основного кече »опереиосяте» о белка сыворотки крови - ТФ. а также содержание и степень псыщсиносги железом основного железодепонирующего белка организма - Ф печени.

Из представленных в габл.5 данных очевидно, что на 20й день жизни у крыс с ¡Д(" количество ТФ было снижено в 4.3 раза по сравнению с нормой, причем степень 1лсъ1ще[п10сти ТФ железом при этом повышалась в 2.3 раза. Одновременно со нпженисч уровня ТФ в сыворотке крови больных живошых также был резко снижен ровень ИГЖ (в 2 раза ниже нормы). Все обнаруженные различия исчезали уже к 45 1НЮ жизни животных.

! л блин и 5. Содержание ТФ и НГЖ в сыворотке крови и степень насыщенности

железом ТФ у крыс линий \Vistar и СатрЬеН разного возраста

}озраст Линия крыс Содержание ТФ Содержание НГЖ Степень насыщен-

крыс (м г/мл (нмоль/ мл ности железом ТФ (%

(дни) сыворотки) сыворотки) от максимальной)

20 Wistar (п=24) 4.30+0.40 32.83+0.71 29.0

Campbell 1.00+0.08* 16.60+1.42* 66.4

(п = 24)

j Wistar 4.20+0.50 26.43+0.18 25.0

(n = 24)

С ainpbcll 4.SOr„0.60 25.36+1.07 22.0

(п-24)

90 Wistar (n = 24) 2.60 + 0.09 18.75+0.54 2S.8

Campbell 2.60±0.07 17.14+1.43 26.4

(11=24)

В следующей серии экспериментов было изучено содержание Ф печени и степень го насыщенное;» железом у крыс линий Wistar и Campbell разного возраста. При роведении электрофоретического разделения белков в частично очищенных репаратах Ф (см. стр.6) было обнаружено (рис.6), что на 20й день жизни у крыс с 1ДС имело место значительное снижение содержания Ф печени, выявляемое при краске гелей как на белок, так и на железо. Как и в случае с ТФ эти различия счезали на более поздних стадиях постнатального онтогенеза. При расчете степени аеышенности железом Ф печени 20-дневных крыс Campbell оказалось, что она нижепа на 95"ч к 90м\ дню жизни различий в степени насыщенности Ф печени селезом между здоровыми и больными животными не было.

Подводя итог данным, полученным в этих сериях экспериментов, можно сделать ывод о том, что у крыс с НДС на ранних стадиях постнатального онтогенеза имели iecTO резкие нарушения ПОСЖ по сравнению с нормой. Эти нарушения, о-видимому, и являются причиной значительного снижения содержания НГЖ в МФ

Рис.6 . Электрофоретические денситограммы белков частично очищенных препаратов ферритина печени крыс линий Wistar и Campbell разного возраста

--Wistar;------Campbell. I, II - гели окрашены Кумасси R-250 (выявление

белковых полос); III, IV - гели окрашены КчРе(СЫ)б (выявление железа). 450 кДа -ферритин, 67 кДа - сывороточный альбумин.

коры мозга и печени в этот период жизни у больных животных. Что касается более поздних сроков постнатального развития, то в этот период, одновременно с нормализацией ПОСЖ, исчезали и различия в содержании НГЖ в МФ печени между здоровыми животными и крысами с НДС. Следует специально отметить, что изменения ПОСЖ у больных крыс в ранний период постнатального онтогенеза отражались, в первую очередь, на содержании НГЖ; так, содержание гемоглобина в крови крыс с НДС не отличалось от контроля за весь период наблюдений (20-90 дни).

Из данных литературы известно, что снижение уровня НГЖ в различных районах мозга в период раннего постнатального онтогенеза, обусловленное дефицитом железа в диете, приводит к необратимым нарушениям биохимических и физиологических процессов в центральной нервной системе (Youdim et al.,1989), которые не могут быть в дальнейшем скомпенсированы даже при нормализации ПОСЖ (Dallman et al., 1975). Такая ситуация, вероятно, и имеет место при развитии НДС у крыс. Активация же системы МО в сетчатке и коре головного мозга больных животных (увеличение активности НАДФН-Р-450 редуктазы в сетчатке, увеличение скорости окисления НАДФН и резкое повышение содержания Р-450 в МФ коры головного мозга) является, по-видимому, ответом этой системы на патологические процессы в нервной ткани при НДС.

выводы.

I. В цепи переноса электронен МФ сетчатки быка обнаружен новый компонент -Зелок. содержаний НГЖ и являющийся акцептором электронов от НАДФН-Р-450-тедуктазы. Белок выделен, частично очищен, его молекулярная масса составила 66 <Да. Показано, что система МО сетчатки, ключевыми компонентами которой •!1<л!1н)1ся выделенный белок и НАДФН-Р-450 редуктаза, активируется при патологических состояниях ткани, обусловленных экстремальным воздействием света 1 развитием НДС, что выражается в увеличении активности НАДФН-Р-450 редуктазы t возрастании скорости окислений ИАДФН.

Установлено, что онтогенетическая динамика активности НАДФН-Р-450 »сдукппы в постмитохондриалыюм супернатанте сетчатки, МФ коры головного .юзы и МФ печени крыс подобна. Активность фермеша возрастай! от 20ю к 45м> шю жизни в 1.5 - 2.5 раза,падая затем к 90му дню в 2 - 4 раза.

3 При развитии НДС у крыс выявлена специфическая для нервной ткани (юивация системы МО в коре головного мозга на ранних (20й день жизни) и поздних 90й день жизни) стадиях развития болезни (увеличение скорости окисления НАДФН; многократное увеличение содержания Р-450).

4. Установлено, что снижение содержания НГЖ в МФ коры головного мозга крыс : НДС на ранних стадиях развития болезни не является специфичным для нервной гкани, так как подобные изменения обнаружены и в МФ печени. В то же время ранее >бнаруженное резкое увеличение Fe2+/Fe-1+ соотношения в МФ коры головного мозга юльных крыс на 20й день жизни является специфичным для нервной ткани: подобных ■двнгов в МФ печени не выявлено.

5. В МФ коры мола больных крыс, в отличие от МФ печени, обнаружено /¡сличение на 30-40':п активности мембраносвязанной формы глкжозо-6-фосфат ДГ (.1 ранних (20й день жизни) и поздних (90м день жизни) стадиях развития болезни.

6 Y крыс с НДС на ранних (20й день жизни), но не на поздних стадиях развития >о.'кчнн обнаружены значительные изменения ПОСЖ, что выражается в •ущеетвенном снижении уровня НГЖ и содержания ТФ в сыворотке крови, а также в )сзком уменьшении содержания Ф печени и его насыщенности железом.

7. Совокупность полученных данных свидетельствует о гетерогенности состава ■омноиентов системы МО в нервной гкани и об активации этой системы при миологических процессах в сетчатке, обусловленных как экстремальным оздействием света, так и развитием НДС.

C1I1ICOK 11У1х1ИКАЦНН, ОТРАЖАЮЩИЙ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Шушакова Н.Д., Рычкова М.П., Ефимова М.Г. Активность НАДФН-ттитохром " редуктазы и альдозоредуктазы в ранний период постнатального онтогенеза в етчатке, коре головного мозга и печени здоровых и больных наследственной ^генерацией сетчатки крыс. Журн. эвол. биохим. физиол., 1993 , т.29, N2, с.90-94.

2. Ефимова М.Г.. Николаева Ю.А., Шушакова Н.Д. Индуцированный процесс lepcKUCHoro окисления липидов (ПОЛ) при наследственной дегенерации сетчатки НДС) у крыс: возможные причины его изменения в коре мозга и сетчатке в раннем остпатальном онтогенезе. - Тезисы. Конф. "Свободно-радикальные механизмы ;еребральных патологий: теоретические и практические аспекты проблемы". >юлл.экспер.биол. и мед., I994.T.CXV1I, N 2, с.206-207.

3. Шушакова Н.Д., Ефимова М.Г. Об изменениях цитохрома Р-450 и НАДФН-.итохром С редуктазы при наследственной дегенерации сетчатки у крыс, ¡юлл.экепер.биол. и мед., 1994, N3,c.259-262.

ib

4. Ефимова М.Г., Николаева Ю.А., Шушакова Н.Д. Изменение содержания и насыщенности железом трансферрина плазмы крови при наследственной дегенерации сетчатки у крыс. Бюлл. экспер.биол. и мед., 1994, N7, с.24-26.

5. R.N.Etingof, N.D.Shushakova, J.A.Kiyan, M.G.Yefimova. A possible role of iron ions in pathogenesis of hereditary degeneration of the retina in rats. Abstract of 10th Meeting of European Soc. for Neurochemistry. J. of Neurochemistry, V.63, Suppl.l, I994,S74,D.

6. Этингоф P.H., Ефимова М.Г.. Николаева Ю.А., Шушакова Н.Д. Новые подходы к изучению наследственной дистрофии сетчатки: метаболические сдвиги в коре мозга и изменения содержащих негемовое железо белков в раннем постиатальном онтогенезе у крыс (чистая линия Campbell). - Тезисы. (V Международный Съезд офтальмологов. Москва, март 1994, с.207.

7. Yefiniova M.G., Kiyan J.A., Shushakova N.D. Etingof R.N. Significant shifts in the activity and content of haem iron containing proteins (nitric oxide synthase and cytochrome P-450) and in microsomal non haem iron level and its redox state at hereditary degeneration of the retina in Campbell rats. Abstract of VI Int. Symp. on retinal degeneration, Jerusalem, Israel, 1994.

8. Шушакова Н.Д. Участие компонентов системы МО нервной ткани в патологическом процессе при экстремальной функциональной нагрузке и при генетическом поражении сетчатки. - Тезисы. I Конф. молодых физиологов и биохимиков России. "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций", Санкт-Петербург, сентябрь 1995.

9. Etingof R.N., Shushakova N.D., Yefimova M.G. Iron and hereditary degeneration of the retina. In "Retinal Degeneration II" (ed.by R.E.Anderson), Plenum Press, New York, 1995. Принято в печать.

10. Шушакова Н.Д. Новый белок системы микросомального окисления в сетчатке. Доклады Академии Наук России, 1995. Принято в печать.