Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Аутолитические изменения липидов различных отделов и ультраструктур головного мозга крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аутолитические изменения липидов различных отделов и ультраструктур головного мозга крыс"

; г ;; ;м)!'(ч'кой государственный университет

I » У ¿5

Па правах рукописи

ИЛЬЯШКНКО Дмтриц Влрдпсляпопнч

ЛУIОЛИ1ИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЛИНИДОВ РАЗЛИЧНЫХ ОТДЕЛОВ И УЛЬТРАСТРУКТУР Г ОЛОВНОГО МОП А КРЫС

03.00.04 - Биохимия

ЛИТОГКФНРДТ днегертмш» яя соискание ученой скит»

кяканма ГП РИ'ЧНЧ НЧГГКИГ ПЯ\ "

Тверь. »995

Габота выполнена на кафедре биохимии государственного университета

и биотехнологии Тверско! о

11аучный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Грибанов Г.А.

()фициальные оппоненты; доктор биологических наук, профессор

Капитанов А.Б. кандидат медицинских наук Даымров М.М.

Ведущая организация:

Институт физиологии мы. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург

Зашита состоится " 18 " октября 1995 г. в_

на заседании диссертационного совега К 063.97.09 в Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70 "а", корп. 4, ауд. 34.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверскою государственного университета.

сентября 1995 г.

Ученый секрегарь диссертационного совета кандидат биологических наук, нпиент

Л.11. Нанкрушшш

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для метаболизма липидов мозга, как и друг их биохимических соединений, характерно сочетание процессов их синтеза и распада (Ansell О.В., Hawthorne J.N., 1964, Прохорова Н.И., 1979, Дин Р., 1981, Хухо Ф., 1990, Vance J.E. et al., 1991).

Одним из весьма широко распространенных биологических явлений, Где реакции распада превалируют над сиктстическ-нми япляется аугопю (автолиз). Если ранее в 60 - 70 годах текущего столетня под аутолизом понимали выработанное в процессе зпачнчшн свойство ^чо'тогпческих объектов разлагать гидролитическим путем собственные структуры разного уровня (Лушников Е.Ф., Шапиро Н.А., 1974), то в настоящее время, благодаря использовашпо новых современных методов биохим1пеского анализа, а также на основе многочисленных исследований аутентических процессов в различных органах, тканях и их ультраструктурах (Грибанов Г.А., 1977-1994, Ребров Л.Б,. Козеяьцев В.Л. и др., 1983, Мссрсон Ф.З., 1990) была выявлена некоторая односторонность имевшихся ранее представлений о биохимии аутглнза. На современном этапе аутолпз определяют как "выработанное п процессе эвотоцин свойство биологических объектов разлагать ферментативным и неферментатняным путем собственные структуры разного уровня с пренмущсстг :ннмм участием гндролазных, а также трансфераэных и других реакций биодмрадации и бнотрансформации их молекулярных компонентов" (Грибанов Г.А., 1986).

Однако, в отечественной и зарубежной литературе имеется крайне мяло сведений об аутолнтичесхом расивдс такого важного в структурном и функциональном отношении компонента центральной нервной системы, каким являются липиды. Вместе с тем, проведены многочисленные исследования, посвященные изучению поведения липидного компонента мозга при различных патологических состояниях (ишемия, гипоксия и др.), в которых установлена достаточно высокая лабильность ряда лшшдных фракций (Bazan N.C., Rodriguez de Turco E„ 1980, Гастева C.B., Райзе Т.Е., 1984, Замурцев О.Н., 1984, Путнлнна Ф.Е., Осадчая Л.М. и др., 1986,

llcroBCKiiü В.А., 1987, Moto A., Hiroshima Y. et al., 1989, Fisrum E., Charderbhan R. et al., 1990, Логинова М.П., Ассур M.B., Швец H.A., 1994). Лнпнды синаптнческих мембран мозга, как показано современными исследованиями, не только участвуют в передаче информации, но и служат уникальной матрицей для ее хранения (Бурлакова Е.Б. и др., 1990).

D связи с эти»« актуальность исследования определяется важной ролью аутолиза в деградации различных структур мозга, его липидного компонента при патологических состояниях н особенно в посмертном пергчде как на ранних, близких к клинической смерти, так и на более поздних этапах умирания.

Цель и задачи исследовании. Целью настоящей работы явилось изучение изменений липидои различных отделов и ультра структур головного мозга крыс в ходе посмертного аутолиза.

Основными задачами о или:

1. Изучение изменений содержания общих липидов, общих фосфолипидов головного мозга крыс при посмертном аутолизе в условиях in vitro на тканевом уровне (серое и белое вещество);

2. Исследование характера изменении основных групп эндогенных липидов серого и белого вещества мозга в динамике аутентического процесса in vitro;

3. Изучение изменений содержания общих липидов и общих фосфолипвдов в некоторых ультраструктурах головного мозга (синаптосомы, миелин, митохондрии) в ходе аутолиза как в условиях /л vitro, так и при нахождении мозга в трупе животного (НМТ);

4. Выяснение общих закономерностей и специфических особенностей аутолнтической деградации и трансформации основных групп эндогенных липидов в ультраструктурах мозга в условиях in vitro и НМТ.

Научная новизна. В работе впервые проведено комплексное сравнительное изучение изменений липндного компонента разнофункциональных тканевых и ультраструктур головного мозга крыс при различных моделях посмертного аутолиза (в условиях in vitro и при НМГ)- В результате

проведенных исследовании установлено, что уже на рашшх, близких к клинической смерти этапах посмертного ауголша (6 - 7 мин, 10 мнн, 40 мин) практически по всех изученных структурах мозга отметаются существенные изменения содержания ОЛ, ФЛ (см. список сокращении), и ряда липидиых фрикции (X, ТГ, СЖК, ФЭД, ФХ, ФК и др.). Показано, что с увеличением времени аутолнза (! и 4 ч) как на тканевом уровне, так к в ультраструктурах (миелин, митохондрии) наблюдается феномен "возврата" относительного содержания рьда липидиых фракции к своим неходиым значениям. Однако, через 21 i яутопнча вновь наблюдается усиление гидролитического распада липидон.

"Установлено, что в условиях нахождения мозга в трупе животного изменения липидов ультраструктур по срапнсншо с аутолнзом in vitro имеют как сходный, так и различный характер в зависимости от сроков аутолнза. Отмечено, что в условиях НМТ значительные перестройки Некоторых липидиых фракции происходят раньше, чем в условиях in vitro.

В работе проанализированы возможные пути метаболических взапмоотношедшН отдельных групп липидов на основе не только гидрсишзных, "о и грянсферазных, а также иных механизмов бнодеграданин и биогрансформации лннидного компонента г оловного мозга крыс в динамике аутолнза.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенные Исследования способствуют более глубокому пониманию мопекулярно-бнохнмическнх механизмов аутолнза и танатогенеза мозга, дополняют и расширяют представления.о роли и значении липидного компонента в процессах гибели тканевых и субклеточных структур мозга. Полученные экспериментальные данные открывают возможность^ поиска путей контроля и даже предупреждения развивающейся уже в раннем посмертном периоде дирадацни важнейших лшшдпых компонентов в различных отделах И структурах мозга.

Результаты исследовании могут быть полезными не только в области биохишш терминальных состояний, в том числе для корнн и практики ряда реанимационных мероприятий, но и иметь важное значите в оценке

молекудярио-биохимических параметров мозговой ткани и условиях ее консервации и трансплантации, а также в судебно-медицинских, геронтологических и палсобиохнмнческнх исследованиях.

В процессе работы был разработан метод быстрого и качественного получения образцов ткани мозга, а также модифицирован высокочувствительный способ анализа содержания РЛип. с помощью малахитового зеленого отечественного производства, по которым оформлено 2 рацпредложения и получены акты на внедрение в Тверской государственной медицинской академии. Разработанные методы' применяются также в учебной и научно-исследовательской работе студентов кафедры биохимии и биотехнологии Тверского государственного университета. Новые данные об особенностях биохимических перестроек линидов в различных структурах мозга используются автором при .фоаедешш занятий со студентами кафедры, выполнении ими курсовых и дипломных работ, связанных с изучением изменений лимидон мозга в ходе аутолта.

Апробация работы. Основные положения диссертации и отдельные фрагменты работы докладывались и обсуждались на научной конференции профессорско-преподавательского состава и сотрудников Тверского государственного университета. ~ Тверь., 1993; VI симпозиуме по биохимии липдцов. - Санкт-Петербург., 3 - 6 октября, 1994; научной конференции Тверской государственной медицинской академии "Современные вопросы диагностики и лечения". - Тверь.; 1994.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописною текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и списка литературы, включающего 159 источников, из которых 65 иностранных. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 14 рисунками и схемами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводились на беспородных белых крысах-самцах массой 170 - 250 г и на крысах-самцах линии Вистар массой 140 -160 г. Животных забивали деканитаинсй. Аутошгз тканевых срезов (серое н белое вещество) проводили п асептических условиях при Т = +37® Сив условиях 100% относительной влажности в течение 6 - 7 мин, 1 ч, 4 ч и 24 ч. Выделение субклеточных фракции мозга (синаптоомы, мпетш, митохондрии) проводили по общепринятым методикам (l) j Robertis Е., 1973, Прохорова И.И., 1982). Исследования по ауголизу ультраструктур проводились в 2-х вариантах: a) in \iiro н б) после нахождения мозга в теле умерщвленного животного. Полученные суспензии ультраструктур инкубировали в п ерильных плотно закрытых пробирках при Т = +37 °С в течение 10 мин, 40 мин, 4 и 24 ч. Во втором варианте головы животных оставляли в юовете при Ткомн. и извлекали мозг спустя 10 и 40 мин с последующим выделением субклеточных фракций.

Выбор указанных сроков обусловлен следующими причинами: а) 0 ч (1,5 - 2 мни после дскапнтацнн) - исходное состояние ткани мозга; б) 6 - 7 мин, 10 мин - предиола! аемое время клинической смерти; в) 40 мни, 1 и 4 ч - начальные этапы развития биологической смерти; г) 24 ч - развитие глубоких (как правило, необратимых) деструктивных процессов (Hei овскнй В.Л., 1987).

Экстракцшо общих лниидов из ткани мозга проводили по методу Фолча и др. (Folch j. et at., 1957), а из субклеточных фракций по методу Блайя и Даiicpn (Bügh Е., Dyer W., 1959). Содержание ОЛ и их фракций, ОФЛ и их отдельных представителей определяли экспрессными микро- и ультрамикрометодами с применением одномерной тонкослойной хроматографии на силнкагеле (Грибанов Г.А. и com., 1975 - 1977). Разделение фракций фосфолипндов субклеточных структур проводили модифицированным хроматографнчсскНм методом (Кейтс М., 1975, Молочкнна Е.М., 1992). Результаты обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдеита (Терентиев И.В., Ростова И.С., 1977).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ J. Характеристика и некоторые молекулярно-бнохимпческие механизмы аутолитнческих изменений общих лнпцдов и их отдельных фракций в тканях и ультраструктурах головного мозга крыс

Сводные данные об аутолитнческих изменениях OJ1 и их отдельных фракций в тканях (серое и белое вещество) и некоторых ультраструктурах (синаптосомы, миелин, митохондрии) головного мозга крыс в условиях in vitro и после нахождения мозга в трупе животного представлены в табл. I, 2 и на рас. 1-4.

Как видно из таблицы 1, на тканевом уровне содержание ОЛ в сером вещесгве претерпевало колебательные изменения возрастало через б - 7 мин аутолиза и снижалось через 1 и 4 ч инкубации. В белом веществе отмечено незначительное, но достоверное увеличение уровня ОЛ на всех сроках исследования.

Таблица 1

Изменения содержания общих липидов серого и белого вещества головного мозга беспородных крыс при аутолизе в условиях in vitro ____________(вмг%),(а=4)_________________

jC^oku аутолиза Ткань мозга"""-—_ Q ч 6-7 мин 1 ч 4 ч 24 ч

Серое вещество М±ш 3302,0 ± 299,6 4150,0 ± 57,2* 2250,0 ± 87,0* 2532,5 ± 28,6" 3697,0 ± 153,8

Белое вещество • М ± m 5009,0 ± 218,0 6254,3 ± 107,8* 6759,0 ± 300,7 * 5591,8 ± 71,3* 6002,3 ± 225,0 *

Здесь и далее: звездочка - достоверные различия с контролем (0 ч) (р<0,05), п - число экспериментов:

При анализе результатов табл. 2 обращает на себя внимание тот факт, что уменьшение количества OJI субклеточных фракций головного мозга на всех изученных сроках посмертного аутолиза происходило лишь в синантосомах (в условиях in vitro и НМТ) и в миелине (in vitro). В митохондриях (НМТ) уровень ОЛ претерпевает колебательный характер изменений кто не меняется (in vitro). Вместе с тем, при НМТ выявлено принципиальное различие в характере изменений содержания ОЛ для митхплдрий и миелина нн ранних, близких к клинической смерш зтанах

R

ауюлиза. Fx ли в митохондриалъной фракции мозга количество ОЛ снижается уже через 10 мин, а затем возвращается к исходным значениям го в мнелипе в этих условиях уменьшение OJI отмечено лишь к 40 мим нахождения мозга в г олове умерщвленного деканигацнен животного.

Таблица 2

Изменения содержания общих линидоп ультраструктур головного мозг я крыс линии Вистар при аутолизс в условиях tn vitro и при нахождении

мозга в трупе животного (1ШТ) {вмкг/мл суспетии), (п = 3 - 4)

Условия и греки яутолиза Ультраструктуры мозга 0ч invilio НМТ

10 мин 40 мин 4 ч 24 ч 10 мин 40 мни

Синаптосомы Mim 1101,3 ± 53,1 762,3 ± S5,7 * 73«,3 ± 63,2* «12,7 ± 43,8* - 884,0 ± 36,7* 780,0 ± 46,0*

Миелин М ± m 1601,0 ± 40,6 1196,0 ± 41,7* 1057,0 ± 69,0* 825,3 ± 51,4* 908,3 ± 41,2* 1557,0 1 81,1 930,3 ± 46,9*

Мктохопдрин М±га 704,0 ± 73,2 563,0 ± 30,1 636,0 ± 32,6 727,7 ± 68,1 737,3 ± 78,2 448,7 ± 25,4* 692,7 ± 51,1

Увеличение содержания ОЛ в мозговой ткани может быть обусловлено несколькими причинами. В раггне, близкие к периоду клинической, смерти сроки яутолиза в структурах мозга еще частично

сохраняется синтетический потенциал, а также интенсифицируются гликолнтнчсские процессы (Гаевская М.С., 1963, Неговскин В.А., 1987) Возрастание содержания ОЛ в белом веществе, очевидно, связано и с уменьшением я нем относительного содержания холестерина на некоторых сроках пуголнзя, которое может приводит», к еннжешно ригидности ненрональных мембран, чго вызывает увеличение подвижности мембранных лнпндов и является одной из причин усиления их лкстрагируемости.

Снижение уровня ОЛ на более поздних сроках аутолизя, вероятно, связано с увеличением активности ряда липолтичепатх ферментов. Однако, механизмы, вызывающие колебательный режим изменении содержания ОЛ, одной из составляющих которою служит феномен "возврата" уровня ОТ к исходным значениям (серое вещество к 24 ч и митохондрии к 40 мин (НМТ)), ищут быть более сложными, обусловленными изменением соотношения отдельных линндиыч фракций

9

различных мозговых структур за счет траисацилазных и других реакции биотрансформации их липццного компонента (Грибанов Г.А., 1986).

Как видно из рис. 1 - 4, характер изменений относительного содержания отдельных шшидных фракций в изученных тканевых и ультраструктурах мозга при аутолизе имеет как сходные, так и во многих случаях различные черты. Практически все липидные фракции при умирании мозга претерпевают ряд существенных и часто разнонаправленных изменений своего относительного содержания в зависимости от сроков аутолиза и его модели.

В сером веществе мозга, где ФЛ меняются в колебательном режиме (рис. 1а), отмечено быстрое и достаточно резкое снижение содержания ФЛ уже через 6 - 7 мин аутолиза, т.е. в период предполагаемой клинической смерти. Однако, затем наблюдается возрастание относительной концентрации ФЛ, достигающей к 4 ч инкубации уровня, близкого к исходным значениям, а через 24 ч доля ФЛ вновь уменьшается.

60 I

б) белое вещество

сжк тг

Рис. 1. Изменения соотношения отдельных фракций липидов ткани серого (а) и белого (б) вещества головного мозга беспородных крыс при аутолизе, (п=4). По оси ординат - % от суммы фракций, по оси абсцисс - сроки аутолиза: I - 0 ч, 2 - 6-7 мин, 3 -1 ч, 4 - 4 ч, 3 - 24 ч.

Среди фракций, относительная концентрация которых при аутолизе снижается на всех его сроках, можно выделить ФЛ синаптосом (in vitro) (рис. 2а) и миелина (в условиях НМТ) (рис. 36). В остальных случаях содержание ФЛ снижается на более поздних сроках, увеличивается (в белом веществе (рис. 16)) или изменяется в колебательном режиме. Практически на всех сроках аутолиза в большинстве изученных структур происходит увеличение доли СЖК.

. Обнаруженный феномен "возврата" относительного содержания ФЛ к исходным значениям в динамике аутолнза проявляется не только в отношении этого класса липидов, но и других фракций. В сером и белом веществе это явление было ' характерно для X, II", то1Да как в митохондриях и миелине - для ОЛ, X, частично СЖК и ГГ. Подобные колебательные изменения относительного содержания некоторых лншшных фракций в динамике аутолнза 1п \iiro были обнаружены ранее и

и других органах, тканях и их ультраструкт;, рях (Грибанов Г.А., 1986).

П

0

б, ПМТ

э* *

12 3 1 2 3

ФЛ X СЖК ТГ ЭХ ФЛ X СЖК тг эх

Рис. 2. Аутолнтические изменения соотношения отдельных фракции липидов в синаптосомах головног о мозга крыс линии Вистар в условиях in vitro (а) и НМТ (б), (п=3-4). По осп ординат - % о г суммы фракций, но оси абсцисс - сроки аутолнза : 1 - 0 ч, 2 -10 мин, 3 - 40 мни.

60

40

20

0

a) in vitro

■it

60

40

20

- 0

U

б) НМТ

У

JM.

12Э45 123

ФЛ ■ X сжк тг - ЭХ ФЛ X СЖК тг эх Рис. 3. Аутолнтические изменения соотношения отдельных фракции липидов в миелине головного мозга крыс линии Вистар в-условиях in vitro (а) и НМТ (б), (п=3-4). По оси ординат ■ % от суммы фракций, по оси абснисс - сроки аутолнза : 1 - 0 ч, 2 -10 мин, 3 - 40 мин, 4 - 4 ч, 5 - 24 ч.

Наблюдаемое в сером веществе и других структурах накопление ТГ и ЭХ свидетельствует о проявлении сложных метаболических отношений между ацнлеодержащими компонентами (ФЛ, ТГ, ЭХ) через общий пул СЖК и предполагает участие в аутолитической деградации липидов

мозговой ткани не только гндролазных, но и трансацилазных механизмов (Грибанов Г.А., 1979).

б) НМТ

„ ______________________________Лп rfn к

12545 1J3

ФЛ X СЖК ТГ ЭХ ФЛ X сжк тг эх

Ptic. 4. Аутолитические изменения соотношения отдельных фракций липидов в митохондриях головного мозга крыс линии Вистар в условиях in vitro (а) и НМТ (б), (п=3-4). По оси ординат - % от суммы фракций, по оси абсцисс - сроки аутолнза : 1 - 0 ч, 2 -10 мни, 3-40 мин, 4 - 4 ч, 5 - 24 ч.

Возрастание содержания ЭХ с параллельным снижением уровня X, ФЛ, ТГ может быть свя; но с тем, что в ряде структур мозга (белое вещество, митохондрии) активно протекают реакции эстерификацни X (Брокерхоф X., Дженсен Р., 1978), в которых используются СЖК, образующиеся, вероятно, при гидролизе ТГ, ФЛ. Вместе с тем, в поздние сроки в белом веществе мозга, миелине (in vitro) наблюдается выраженный гидролиз ЭХ с резким накоплением X и СЖК.

Таким образом, можно полагать, что при аутолизе в ранние, близкие к периоду клинической смери сроки в сером веществе головного мозга крыс активируются главным образом различные фосфолипазы, а в белом веществе - ТГ-липазы и холестеролэстеразы.

Анализируя изменения относительного содержания лигшдных фракций в ультраструктурах мозга (сннаптосомы, митохондрии, миелин) при аутолизе in vitro можно обнаружить в них проявление механизмов биодеградации и биотрансформации лигшдиого компонента, сходных с выявленными в тканях мозга. Уже на ранних сроках аутолнза in vitro (10 мин) происходит снижение относительного содержания ФЛ в синаптосомах (рис. 2а) н миелине (рис. За). Лигшдный компонент митохондрий более устойчив к аутолизу в условиях in vitro На ранних его сроках и основные превращения липидов происходят в них начиная с 40 мин инкубации (рис. 4а).

604020

"1*

-с!

ш

a) in vitro

ffiMI

6040 20

**

irfflfl О-

Эксперименты на беспородных крысах показали накопление в синаптосомах на поздних сроках аутолнза in vitro (24 ч) фракции ДГ при параллельном уменьшении доли ФЛ, но не ТГ (Грибанов Г.Л., Нльяшенко Д.В., 1994). Выявленные колебательные перестройки лннндных фракции, наблюдаемые в улмраструктузах мозга при аутолизе in vitro, свидетельствуют о наличии, особенно в мигохондриальной и миелиновой фракциях, не только гидролизных, но н транеащшазных механизмов деградации и биотрансформации их линидн то компонента.

Условия ИМТ в определенной .гтт ни видоизменяют характер аутолнтнчсскнх превращений линндов о субклеточных фракция* головного мозга крыс. Так, в синаптосомах мозга крыс линии Внстар (рис. 26), в отличие от модели in vitro, наибольшую устойчивость, особенно на ранних (10 мин) сроках аутолнза, проявляют фракции X, ЭХ н частично ФЛ. Вместе с тем, если увеличение доли СЖК в синаптосомальноЙ фракции при аутолизе in vitro связано с возрастанием в них фосфолипазной и холестеролэстсразной активности, то в условиях НМТ причиной накопления СЖК служит не только фосфолипазпая, но и ТГ-лииазная активность.

В отличие от спнантосомальной фракции в миелине (рис. 36) и п меньшей степени в митохондриях (рис. 46) головного мол а крыс в условиях нахождения мозга в трупе умерщвленного животного наблюдается более интенсивный распад ФЛ К снижение уровня X, сопровождаемые нарастанием доли СЖК и ГГ. .Это позволяет предположить, что при НМТ в миелине наиболее выражены гидрошпичсские механизмы деградации их лииидного компонента. Обращает на себя внимание факт увеличения на ранних 1фоках аутолнза как п условиях in vitro , так и IIMT практически во всех исследованных структурах мозга уровня ТГ. Гистохимический анализ подтверждает образование в деетруктирующсйся нервной ткани гранул ТГ (Маниня Л. Д., 1978).

Суммируя вышесказанное можно сделать вывод о том, что деградация лнпидов в аутолнзирукншкся ткпнсрых и субклеточных

структурах мозга имеет сложный, часто разнонаправленный характер, зависит от сроков аутолнза, его модели {in vitro или НМТ) и происходит с участием не только гидролитических, но и трансацилазных и иных механизмов бнотрансформацин липидного компонента, включая повторное (рециклическое) использование некоторых молекулярных компонентов (СЖК, X и др.),. главным образом, на этапах, где наблюдаегся феномен "возврата" относительного содержания ряда фракций к исходным значениям.

I. Характеристика и некоторые молекулярпо-бнохимнческне

механизмы аутолнтических изменений общих фосфолипидов и их отдельных фракций в тканях и ультраструктурах головного мозга крыс

Результаты проведенных исследований по изучению изменений содержания суммарных ФЛ и их отдельных фракций в тканях (серое и белое вещество) и некоторых ультраструктурах (синаптосомы, митохондрии, миелин) головного мозга крыс в ходе аутолнза in vitro и после нахождения мозга в трупе животного приведены в табл. 3,4 и на рис. 5-8.

Как видно из табл. 3, содержание общих фосфолипидов в ткани серого и белого вещества головного мозга крыс в динамике посмертного аутолнза претерпевает колебательные изменения. Вместе с тем, если в сером веществе при аутолизе чередуется снижение содержания ОФЛ с тенденцией "возврата" их концентрации к исходным значениям, то в белом веществе наблюдается достаточно резкое возрастание содержания ОФЛ к 1 ч инкубации, которое может объясняться, очевидно, теми же причинами, что и в случае увеличения количества ОЛ в мозговой-ткани при аутошпе (см. раздел I).

В отличие от ткани мозга во всех изученных улыраструктурах (синаптосомы, миелин, митохондрии) (табл. 4) при аутолизе происходит снижение концентрации ОФЛ. Однако, в условиях НМТ для ФЛ ультраструктур мозга характерным было уменьшение их содержанш уже на ранних сроках (10 мин И 40 мин), тогда как при аутолизе in vitro

количество ОФЛ снижается лишь на более поздних (начиная с 4 ч) этапах аутентической деструкции.

Таблица 3

Аутолитнческие изменения содержания общих фосфолииидон серого и бслоги вещества головного мозга крыс линии Внсгар в условиях in vino ______________________(вмг %), (п-4) ________________■ ____________

Оч 6-7 мин 1 ч 4 ч 24 ч

Ткань мозга —

Серое вещество 103,6 ± 95,5 ± 67,7 ± 82,2 ± 73,5 ±

М ± to 8.9 4,8 5,4* 3,2 4,6*

Белое вещество 153,Hi 163,4 ± 160,0 ± 166,5 ±

М±т 6,2 10,3 11,1* 7,4 6 8

Таблица 4

Аутолитнческие изменения содержания общих фосфолипидоп ультраструктур головного мозга крыс линии Вистар в условиях in vitro и при нахождении мозга в трупе животного (НМТ) (вмкг Ртт/мп суспетии),

Условия и" сроки аутолгоа "^льтраструк^" in vitro ИМТ

0 Ч 10 mihi 40 мин 4 ч 24 ч 10 unit 40 мин

тэд>и мозга

СшШГГОСОМН 3,2 ±0,2 2,9 t- 0,2 2,9 J 0,1 1,1 i - 2,7 t 2,4 ±

M .1 m 0,1* 0,1* 0,1

Миаши 4,5 t 0,2 4,6 ±0,2 4,Г i 0,2 2,9 i 2,6 i 3,4 t 3,0 fc

M ±m -0,1" 0J* о,Г 0,2*

Митохондрии Mira 2,1 t 0,2 2,0 i 0,1 1,8 ±0,2 1,4 ± 0,1* 1,1 ± 0,1- 1,5 ± 0,1* 1,7 i 0,1*

Основными причинами снижения количества общих фосфолипидов и

их отдельных фракций при посмертном аутолте могут был.: J) угнетение их синтеза, 2) активация распада с участием эндогенных фосфолигип и других ферментов (McKlown S.,1979, Грибанов Г.А., 1979, Тараиова Н.П., 1488, O'Neill г., Fowler П., 1091, J.inT.-A., LinT.-W. et al., 1992).

Из риг. 5 пидно, ч/о п «утилизирующихся тканях герою н бглого пещесгва головного мозга крыс более всего подвержены перестрой/гаи (чаще в сторону уменьшения их относительною содержании) основные мембранные фракции ФХ, ФТ\ п одновременным няряг/яннгч дичп I ЛФ,

ЛФЛ, ФК+ПГФ. Однако, изменения этих и рада других фракций носят, как прашшо, колебательный характер и отмечается феномен "возврата" их относительного содержания к исходным значениям, особенно к 1 ч и 4 ч

40

20-

а) серое вещество

J¡LшI

.с-ГП'К

40

20

1 2345

ГЛФ ЛФЛ ФС+СФМ ФХ

б) белое вещество

ФЭА ФК+ПГФ ФИ 1-

***

I___отгястСП«».

1 2 3 4 6

ГЛФ ЛФЛ ФС+СФМ ФХ ФЭА ФК+ПГФ ФИ Рис. 5. Изменения соотношения отдельных фракций фосфолнпццов в ткани серого (а) и белого (б) вещества головного мозга беспородных крыс при путолизе (11-4). По оси ординат - % от суммы фракций; по оси абсцисс -сроки аутолнза : 1 - 0 ч, 2 - 6-7 мни, 3 -1 ч, 4 - 4 ч, 5 - 24 ч.

аутолнза.

П ссром всщссгве мозга (рис. 5а) значительные изменения в составе фосфолипидного компонента наблюдаются уже в ранние (6-7 мин), близкие к периоду клинической смерти сроки аутолнза, тог да как в белом веществе (рнс. 56) распад ФЭА, ФХ и частично ФС+ СФМ с параллельным накоплением продуктов гидролиза ФЛ (ЛФЛ), а также ФК+ПГФ происходит в более поздние сроки (4 и 24 ч).

Основной причиной отмеченных изменений может быть повышение активности соответствующих эндогенных фосфолипаз, причем, в сером веществе эти процессы наиболее интенсивно протекают на ранних (6-7 мин) н на значительно более поздних (4 и 24 ч) сроках аутолнза, а в белом веществе активация фосфолипаз в отношении ФЭА, ФХ происходит фактически тол?,ко к 4 ч аутолнза.

Возрастание содержания ФХ в мозговой ткани к 4 и 24 ч инкубации в сером и к 1 ч в белом Веществе после предшествующего его снижения мож<л быть связано с возможной трансформацией части ФОЛ в ФХ. 1Ьи атом не отмечено накопления продуктов гидролиза (ЛФЛ, ГЛФ). Увеличение содержания ФС+СФМ » сером веществе мозга к 4 и 24 ч аушлнза происходит, вероятно, в результате образования рсципрокпой пари ФС~ФЭА. Известно, что для некоторых фракций фосфолинидов оси, пути их образования, не связанные прямо с затратой энергии » виде I (ТФ, АТФ. Это прежде всею отноаггея к ФС, СФМ, ФЭА и некоторым другим, которые могут образовываться в трансфертных реакциях с участие,«,! СОз, фосфорнлхолина, метальных трупп il lira ta F., Axelroil J., 1980, Lakher M., Wurtmen R., 1987, Соколова Г.М., 1991, Герасимова H.A., Емельянов H.A., 1991, Hovius R., Faber В. et al., 1992). Как било показано, в ряде органов, тканей н их ультраструктур в условиях аутолиза эти пути могут приобретать доминирующее значение (Грибанов Г.А., 1986).

Резкое повышение относи ильной концентрации ФК+ЛГФ, особенно в белом веществе, сопровождающееся снижением доли ФХ, Ф')А, может объясняться возрастанием активности в динамике аутолиза фосфшшшчи Д, участие которой в распаде фосфолинидов обнаружено в тканях мозга (Bazan N.C., 1983, Mohn 11., Chaiiia V., et ai., 1992).

Сопоставляя данные но изменению содержания ФЮШ'Ф и ГЛФ, можно предположить, что возможными причинами таких превращений служит не только гидролитический распад ФЛ, но.и другие реакции, в частности, ацнлнрование ГЛФ с образованием ФК и далее ПГФ (Грибанов Г.А., 1979, Мок Amy Y.P. et al., 1990). Возрастание содержания ГЛФ может быть также связано и с образованием его ira З-фЬсфоглшщхшиаою альдегида в результате усиления гликолнтическнх процессов в ходе посмертною аутолиза (особенно в первые б - 7 мин) в сером вещее те головного мозга крыс.

Отдельным аутолтирующимся сфуктурам мозга (рис. 6 - 8) свойственны не только сходные с тканевыми, но и оиредгче/шые специфические neper ройки их. фосфолиннлного компонент. Чяк, п

пшашосомлх иола беспородных крыс при аутолнзе in vitra, как было показало нами ранее (Грибанов Г'.А., Ильяшенко Д.В., 1994), обнаружена акгинацня гндролазпых механизмов распада ФЛ уже к 1 ч инкубации. Эти процессы сопровождаются повышением содержания продуктов деградации ФЛ - ЛФЛ, ГЛФ и СЖК, очевидно, за счет возрастания активности фосфолипаз Ai, Аз, С, а также фосфолипазы Д.

, Обращает на себя внимание то, что в аутолизирующихся сннаптосомах головного мозга крыс, как и при старении (Фролькнс B.D. и соавт., 1991) увеличивается содержание ЛФЛ, ФС и ФИ, а также значительно возрастает доля ФК. Эти данные свидетельствуют о возможном проявлении в ходе старения и при посмертном аутолнзе некоторого сходства в механизмах трансформации фосфолнпидного компонента синаптосом головного мозга крыс.

Результаты экспериментов по изучению изменений фосфолнпидного компонента синаптосом головного мозга крыс линии Вистар на ранних (10 и 40 мин) сроках ;.утолиза in vitro (рис. 6а) свидетельствуют о том, что на этих сроках наибольшая устойчивость отмечается для холннсодсржащих фракций (ФХ и СФМ), а также ЛФЛ. Снижение доли ФЭА и параллельное нарастание уровня ФС+ФИ, ГЛФ, а также Ф1< и Г1ГФ может свидетельствовать о проявлении в сннаптосомах при аутолнзе ш vitro не столько гндролазных, сколько сложных трансацнлазных механизмов, влияющих на перестройки фосфолнпидного компонента.

В условиях НМТ выявлено, что в синаптосомяльной фракции мозга крыс на ранних этапах аутолиза фосфолннидный компонент также проявляет относительную стабильность (рис. 66). Однако, обнаруженные изменения отдельных ФЛ (ФХ, СФМ, ФЭА) синаптосом при НМТ имеют, очевидно, в своей основе механизмы, существенно отличные от условий tri vitro. Так, накопление ФХ к 10 и 40 мин аутолиза может быть связано как с уменьшением доли СФМ на этих же сроках, так и с падением уровня ФЭА через 40 нин аутолиза, что сопровождается увеличением относительною количества ГЛФ. При этом, метаболические взаимоотношения между ФХ

и СФМ происходят, очевидно, с участием фосфорилхолина (ФХ *- ФРХ «-

СФМ) (Грибанов Г.А., 1979). Несмотря на относительную устойчивость 4030 4 a) in vitro

20100

40 30-] 20 10-,

-в'.еШ lUI li

12 3

глф лфл сфм фх фс>фи фэа пгф фк Рис. 6. Изменения содержания отдельных фракции фосфолипидов в сннаптосомах головною мозга крыс линии Внстар при аутолизе в условиях in vitro (а) и НМТ (б), (n-З). По оси ординат - % от суммы фракций; по оси абсцисс - сроки аутолнза : 1 - 0 ч, 2 -10 мин, 3 - 40 мин.

¡1 I 1 123

ГЛФ ЛФЛ СФМ ФХ ФС+ФИ ФЭА ПГФ ФК

б) НМТ

фосфолнпидного компонента синаптосом головного мозга крыс га ранних аутолитических сроках, даже небольшие колебания фосфолнпидного компонента мембран, как следует из данных литературы (Routtenberg А., 1987, Бурлакова Е.Ь , 1990), могут приводить к значительному изменению заряда мембран, а также других физико-химических свойств, и, как следствие, нарушению функционально-регуляторных характеристик синаптосомальных мембран в результате изменения в них липид-липидных и линнд-белковых взаимодействий.

Анализ изменений фосфолнпидного компонента других ультраструктур (миелин, митохондрии) (рис. 7, 8) мозга свидетельствует о том, что при аутолизе в условиях in vitro на ранних сроках в этих субклеточных фракциях (особенно в митохондриях) часто происходят

Gonce значительные изменения ФЛ, чем при нахождении мозга в трупе умерщвленного животного.

В миелине (яутолнз in vitro) при относительной стабильности фракций ФХ, ФС+ФИ наблюдается прогрессирующий распад ФЭА, сокровождаюшийся нарастанием доли ЛФЛ и ФК (рис. 7а). В условиях JIMT фракции ФХ и ФС+ФИ миелина также сохраняют устойчивость, но накопление ЛФЛ (а к 40 мин и ГЛФ) и снижение одной in наиболее устойчивых ФЛ фракции - СФМ происходит уже к 10 мин аутолиза (рис. 76).

123

ГЛФ ЛФЛ СФМ ФХ ФС+ФИ ФЭЛ ПГФ ФК Рис. 7. Изменения содержания отдельных фракций фосфоллнидоп в миелине головного мозга крыс линии Внсгар при аутолизе в условиях in vitro (а) и НМТ (б) (п=3). По осп ординат - % от суммы фракций: но оси абсцисс - сроки аутолиза.: 1 - 0 ч, 2 -10 мин, 3 - 40 мин, 4 - 4 ч, 5 - 24 ч.

В митохондриях мозга (рис. 8) в динамике аутолиза in \itro фосфолииидиыи компонент, особенно с увеличением времени инкубации, претерпевает разнообразные перестройки, связанные как с фосфолипазнымн механизмами, так и трансацнлазпыми реакциями бнотрянсформации отдельных фосфолннндных фракции (ФХ, ФС»ФН н ФЭЛ). Дня некоторых из них (ФХ, ФС» ФИ) наблюдалась пчшеннн« к "возврату" их относительною содержания к 4 ч ауто.чиза (рис. "а).

30 20 10 О

3020 10 0

a) in vitro

М

Пй:

1214 5

ГЛФ ЛФЛ СФМ. ФХ ФС*ФН Ф'З А ПГФ ФК

б) нмт

хО

ilii

123

ГЛФ ЛФЛ СФМ ФХ ФС+ФИ ФЭА ПГФ ФК .. Рис. 8. Изменения содержания отдельных фракций фосфолипидов в митохондриях головного мозга крыс линии Вистар при аутолизе в условиях in vitro (а) и НМТ (б), (n-З). По оси ординат - % от суммы фракций; по оси абсцисс - сроки аутолиза : I - 0 ч, 2 - 10 мин, 3 - 40 мии, 4 -4 ч, 5 - 24 ч.

В условиях НМТ в митохондриях мозга большинство фракций ФЛ не претерпевают существенных изменений (рис. 86). Накопление доли ЛФЛ, ФК и снижение ПГФ может свидетельствовать о возможном вступлении этих фракций в сложные метаболические взаимоотношения с участием ГЛФ (Грибанов 1.А., 1979. Некоторое нарастание ЛФЛ, возможно связано с тенденцией к уменьшению в митохондриях относительного содержания ФЭА и ФХ.

Суммируя изложенное, можно считать, что фосфолнииды изученных тканевых и ультраструктур мозга в динамике посмертного аутолиза претерпевают сложные метаболические перестройки, основу которых могут составлять как гидролазные (особенно выраженные на ранних и более поздних сроках аутолиза, а для субклеточных фракции, главным образом, в условиях in ritro), так и трансферазные реакции с тенденцией к "возврату" количественного содержания ряда фракций к их исходным значениям (чаще на промежуточных сроках - i и 4 ч). Вместе г тем,

возможно не только "переключение", но и параллельное участие этих механизмов в ходе аутолиза.

Все это позволяет считать, что фосфолнпндный компонент мозговых структур разного уровня в ходе посмертного аутолиза претерпевает разнообразные перестройки, степень выраженности которых зависит как от типа изученных структур головного мозга, так и модели аутолиза (in vitro или НМТ), его продолжительности. т

Не исключено, что выявленные изменения лииидов в сером, а также в белом веществе и, особенно, в синаптосомах и других (миелин, митохондрии) структурах головного мозга могут существенно влиять на проявление ими физиологических функций уже на ранних этапах аутолиза, что, вероятно, не может не отразиться на степени обратимости (в ходе реанимации или трансплантации мозговой ткани) процессов аутолитической деструкции мозговых структур разного уровня.

В связи с этим представляет интерес поиск биорегуляторов различной хим"ческой природы, способных видоизменять н даже предупреждать (приостанавливать) развивающуюся деградацию важнейших лнпидных компонентов в структурах мозга при его гибели. i

ВЫВОДЫ

1. .Содержание OJI в динамике посмертного аутолиза in vitro возрастает в белом веществе, претерпевает колебательные изменения в сером веществе, снижается в синаптосомах, миелине и не меняется *в митохондриях. В условиях нахождения мозга в трупе животного (НМТ) концентрация ОЛ уменьшается в синаптосомах, в миелине к 40 мин и митохондриях к 10 мин аутолиза.

2. Количество ОФЛ в ходе аутолиза in vitro возрастает через 1 ч инкубации в белом веществе, уменьшается в сером веществе, синаптосомах, миелине н митохондриях, но только к поздним срокам. В условиях НМТ наблюдается снижение ОФЛ во всех исследованных ультраструктурах уже на ранних этапах аутолиза.

3. Отмечено возрастание относительного содержания ФЛ в белом веществе, в остальных структурах в ходе аутолиза выявляется, главным

образом;'снижение, а в ряде случаев колебательные изменения уровня

ФЛ. Доля свободного холестерина в оолынннстве струю ур

/

уменьшается уже на ранних сроках аутолиза. Па поздних сроках концентрация X продолжает уменьшаться (кроме миелина) с параллельным увеличением на некоторых этапах доли ЭХ. Для ТГ характерно снижение их относительного содержания в белом вещееше (кроме-} ч), сннапюсомах (ИМТ), а в остальных случаях количество ТГ возрастает ипн претерпевает колебательные изменения. Доля СЖК в ходе ну гониаа, как правило, прогрессивно нарастает.

-4. Изменения отдельных фракций ФЛ серого и белого вещества в xwie аутолиза in vitro носят колебательный характер. В большинстве случаев в сером, а на поздних сроках и в белом веществе, снижается относительное содержание ФХ, ФЭА с параллельным нарастанием продуктов гидролиза, а также ФК+ПГФ. На поздних сроках в. сером веществе увеличивается количество ФС+СФМ и снижается ФИ, тогда как в белом вещееше происходит противоположные изменения эшх фракций.

г Во всех изученных ультраорукгурах мозга при ауголизс in vino снижается относительное количество ФЗА, а в митохондриях и ФХ, что сопровождается прогрессивным увеличением доли ЛФЛ, в ряде случаев ГЛФ, а также ФК и ПГФ. Фракция СФМ отличается стабильностью. В условиях НМТ распадаются в основном фракции ФЭА, СФМ. В митохондриях уменьшается доля ПГФ. В сшшптосомах увеличивается содержание ФХ и ГЛФ, в миелине и митохондриях накапливаются продукп>1 гидролиза ФЛ, а также ФК.

6. Изменения липндпого компонента в различных отделах и структурах головного мозга в ходе посмертного аутолиза могут иметь в своей основе пшролазные, трапсфераэные, а также иные механизмы биотрансформации липнлов, включая повторное (рецпкличсскос) использование некоюрых молекулярных компонентов (СЖК, X и др.). При этом п динамике аутчигшь кого процесса наблюдается как параллельное участие этих механизмов, так -и• своеобразное их

•"переключение", сопровождающееся феноменом "возврата" относительного содержания ряда фракций к их исходным значениям через I ч и 4 ч аутолиза.

7. Наличие сложного комплекса биохимических механизмов деградации лнпндов при посмертном ауголнзе дает возможность использования данных настоящего экспериментального подхода для объяснения , неоднотипности и разновременности нарушений, развивающихся в различных отделах и структурах мозга при его смерти.

СПИСОК ПУБЛИКЛ1Ц1Й ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Липиды серого и белого вещества головного мозга крыс при аутолизе //Попр. мед. химии. - 1993. - 39. - № 2. - С. 43-45. (Совместно с Грибановым Г.А.).

2. Новые данные о характере аутолитпчсскнк изменений лнпвдного компонента различных отделов и ультра структур головного мозга крыс /Л'сз. докл. нау ш. конф. профессорско-прсподав. состава и сотрудников госбюдж. и хоздогов. тем ТвГУ. - Тверь., 1993. - С. 123-125. (Совместно с Грибановым Г.А., Бурлаковой Е.Б., Гумаргалисвой К.З.).

3. Влияние фрагмента А1СГГ4ю ("Яетях") на динамику аутолитических тменений лнпидного компонента головного мозга крыс //Тез. докл. научн. конф. профессорско-прсподав. состава и сотрудников госбюдж. и хоздогов. тем ТвГУ. - Тверь., 1993. - С. 128-129. (Совместно, с Грибановым Г.Л., Ашмарнным И.П., Головко М.Ю., Луцкой Н.В.).

4. Лнпнды синвнгичсскнх мембран головного мозга крыс при аутолизе //Вопр. мед. химии. - 1994. - 40. - № 1. - С. 49-51. (Совместно с Грибановым Г.А., Бурлаковой Е.Б., Архиповой Г.В.).

5. Изменения фосфолипидов серого и белого вещества головного мозга крыс в динамике посмертного аутолиза //Вопр. мед. химии. - 1994. - 40. -№ 5. - С. 20-23. (Совместно с Грибановым Г.А.).

6. Лнииды митохондрий головного мозга крыс » динамике посмертного аутолиза //Материалы научн. конфер. ТГМА "Современные вопросы диагностики и лечения", - Тверь., 1994. - С. 38.

7. О различиях посмертной устойчивости сфиш омпелинов некоторых ультраструктур головного мозга крыс в зависимости от модели аутолиза //VI симпозиум но биохимии лппндов. - Санкт-Петербург., 3-6 окт. 1994., Тезисы докладов, Москва, 1995. - С. 29-30. (< Ччшестно с Грибановым Г.А.).

СПИСОК СЧЖРАЩГ.ППЙ, ИСПОЛЬЧУШЫХ П РЛГО'ГР АТФ - адеиозинтрнфосфа г, ГЛФ - глиперофосфаш, ДГ - д.шпил! лицернпы, ЛФЛ - лизофосфолнннды, ОЛ - общие линнды, ОФЛ - общие фосфолнпнды, ПГФ - полпглнцерофосфатиды, РП(1П - "лнпидный" фосфор,

СЖК - свободные шечетгрнфинщч'нанные) жирные кисло1Ы,

СФМ - сфингомиелины,

ТГ - зрнапшц лшнрины,

ФИ - фосфатилилинозты,

ФК - фосфатидные кнело'п I

ФЛ - фосфолнпнды,

ФЛаза - фосфолпняза,

ФС - фосфапшплссрины,

ФХ - фосфашдилхолнпьт (лепп'гины),

ФЗА - фосфвзннштпноиямпнп (кефалины),

X - холест ерин,

ЦТФ - нитплннтрпфосфат,

")Х • чсторифииироп.'шпый холестерин (зфпры холестерина).