Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние различных экзогенных физико-химических факторов на аутолитические изменения липидного компонента головного мозга крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние различных экзогенных физико-химических факторов на аутолитические изменения липидного компонента головного мозга крыс"

о ^ ■

На правах рукописи

ГОЛОВКО Михаил Юрьевич

ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ЭКЗОГЕННЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА АУТОЛИТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЛИПИДНОГО КОМПОНЕНТА ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Тверь, 1998

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии Тверского государственного университета

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор,

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Капитанов А.Б. кандидат медицинских наук, Голубев В.П.

Защита состоится "3" февраля 1998 г. в 14.00

на заседании диссертационного совета К 063.97.09 в Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70 "а", корп. 5, ауд. 318.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета.

академик Петровской Академии наук и искусств, академик Международной Академии информатизации, Грибанов Г.А.

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет

Автореферат разослан

декабря 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

доцент

А.Н. Панкрушина

ВВЕДЕНИЕ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Одним из широко распространенных общебиологических явлений, при котором реакции распада преобладают над процессами биосинтеза, является аутолиз. В настоящее время ауголиз определяют как "выработанное в процессе эволюции свойство биологических объектов разлагать ферментативным и неферментативным путем собственные структуры разного уровня с преимущественным участием гидролазных, а также трансферазных и других реакций биодеградации и биотрансформации их молекулярных компонентов" [Грибанов Г.А., 1986]. Аутолиз сопровождает такие процессы, как внутриклеточное переваривание, иммунные реакции, атрофия и дистрофия, некроз, апоптоз, смерть организма и др. [Лушников Е.Ф., Шапиро H.A., 1974, Белоконева О.С. и др., 1993]. Однако, в литературе имеется немного сведений как об аутолитических изменениях липидов, которые являются важнейшими структурными и функциональными компонентами нервной системы [Бурлакова Е.Б., 1990, Ивков H.H., 1995, Kan Per .Т.Н. et al, 1996 и др.], так и о способах воздействия на аутолитический процесс, который (особенно посмертный) рядом авторов считается нерегулируемым [Лушников Е.Ф., Шапиро H.A., 1974]. Вместе с тем, многочисленные исследования биохимических изменений мозга при ишемии, гипоксии и других патологических состояниях выявили значительные перестройки ряда липид-ных фракций [Bazan N.C. et al, 1980, Грибанов Г.А., 1986, Deutsch J. et al, 1997], протекающие с участием различных механизмов. В их реализации принимают участие ферментные системы, активность которых модулируется разнообразными активаторами и ингибиторами [Брокерхоф X., Дженсен Р., 1978, Литвинко Н.М. и др. 1991, Bonventre J.V., 1997,]. К ним относятся бычий сывороточный альбумин (БСА), этилендиаминтетраацетат (ЭД'ГА), ионы Са2+, pH и др. Изучение влияния подобных факторов на аутолитичсские изменения липидного компонента головного мозга крыс и послужило предпосылкой для проведения настоящего исследования.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение характера воздействия некоторых экзогенных физико-химических факторов на аутолитическую деградацию липидного компонента ткани серого и белого вещества головного мозга крыс в условиях in vitro.

Основными задачами работы были:

1. Изучение влияния ионов Ca2t и ЗДТА на изменения содержания общих липидов (ОЛ), суммарных фосфолипидов (ОФЛ) и их основных ipynri серого и белого вещества головного мозга крыс при их аутолизе в условиях in vitro в среде стерильного физиологического раствора (ФУ1).

2. Исследование воздействия кислых, нейтральных и щелочных значе-

ний рН среды инкубации на аутолитические изменения содержания ОЛ, ОФЛ и их отдельных представителей серого и белого вещества головного мозга крыс in vitro (в среде стерильного ФР).

3. Изучение влияния БСА на изменения содержания О Л, ОФЛ и их основных представителей серого и белого вещества головного мозга крыс при аутолизе in vitro.

4. Сравнительный анализ действия изучаемых факторов на липидный компонент серого и белого вещества головного мозга крыс в условиях проведения аутолиза in vitro.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Проведено комплексное сравнительное изучение влияния БСА, ЭДТА, ионов Са2+, кислых, щелочных и нейтральных значений рН среды инкубации на изменения липидного компонента серого и белого вещества головного мозга крыс в динамике аутолиза in vitro в среде стерильного ФР. Дан анализ возможных механизмов метаболических перестроек отдельных групп липидов и путей воздействия на них изученных физико-химических факторов. При этом учитывалось участие различных механизмов деградации и биотрансформации липидного компонента головного мозга крыс в динамике аутолиза, степень участия которых в превращениях отдельных классов липидов серого и белого вещества мозга крыс была не однотипной.

Полученные результаты указывают на возможность частичного регулирования посмертных аутолитических процессов на примере липидного компонента тканей мозга. Исследованные физико-химических факторы оказывают неоднозначное влияние на отдельные классы липидов в различных структурах мозга и на разных сроках аутолиза, что предполагает возможность использования комплексного подхода для временной нормализации содержания некоторых классов липидов мозга при решении проблем реанимации, консервации и трансплантации нервной ткани. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Полученные данные вносят определенный вклад в понимание молекулярно-биохимических механизмов аутолиза и танатогенеза мозга, роли липидного компонента в процессах гибели клеток и тканевых структур головного мозга. Результаты исследований на предложенной модели аутолиза позволяют наметить пути поиска способов контроля и, возможно, замедления процессов деградации липидного компонента в умирающих структурах мозга, оценить характер влияния различных физико-химических факторов на эти процессы. Это может иметь важное значение как при проведении реанимационных, ре-биотизационных (под которыми понимают восстановление жизненных функций клеток и отдельных клеточных структур [Грибанов Г.А., 1986]), ре-паративных мероприятий в отношении мозга, его структур как в терминальных состояниях так и при консервации и трансплантации тканей мозга, в су-

дебно-медицинских, геронтологических исследованиях. Полученные результаты используются на кафедре биохимии ТвГУ и ТГМА при проведении занятий со студентами в курсах "Молекулярная патология" и "Биохимия специализированных тканей", подготовке курсовых и дипломных работ. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертационного исследования докладывались и обсуждались на научной конференции профессорско-преподавательского состава и сотрудников Тверского государственного уни-верситета.-Тверь.,1993;научной конференции, посвященной 25-летию Тверского государственного университета.-Тверь.,1996; межкафедральном заседании сотрудников ТвГУ.-1997.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 4 работы, 2 статьи находится в печати, подготовлено 2 рационализаторских предложения. ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 199 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и списка литературы, включающего 255 источников, из которых 162 иностранных. Работа иллюстрирована 35 таблицами, 25 рисунками и схемами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Опыты проводили на беспородных белых крысах-самцах массой 120140 г. Умерщвление животных осуществляли путем декапитации. Выделенные на холоду серое и белое вещество больших полушарий мозга животных мелко иссекали (размер частиц 0.5-1 мм). Ткань серого и белого вещества делили на 5 примерно равных частей для анализа на разных сроках аутолиза. Масса образцов составляла 20-30 мг. После взвешивания навески мозга с соблюдением асептики переносили в 1 мл инкубационной среды различного состава (ФР - 0.9% раствор Nad, ФР+Са21 (210"3М ), ФР+ЭДТА (10_3М), ФР+БСА(с массовой долей БСА 1%), буферный раствор с р114.51; 7.22; 8.95) и либо сразу экстрагировали липиды (0 ч), либо после инкубации в термостате при Т=+37°С в течение 10 мин, 1, 4, 24 ч [Грибанов Г.А. и др., 1993].

Экстракцию липидов проводили по методу Блайя и Дайера [Bligh Е., ])уег W., 1959]. Фракционирование ОЛ, количественное определение ОЛ, ОФЛ и их отдельных представителей определяли экспрессными микро- и ультрамикрометодами с применением одномерной микротонкослойной хроматографии на силикагеле ¡Грибанов Г.А. и соавт., 1975, 1980]. Разделение фракций фосфолипидов осуществляли с помощью микрогонкослойпой хроматографии в системе растворителей хлороформ-метанол-ледяная уксусная кислота-вода в соотношении 25:15:4:2 [Кейтс М., 1975, Молочкина Е.М.,

1992]. Результаты обрабатывали статистически с использованием критерия Стьюдента [Терентьев П.В., Ростова Н.С., 1977].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Влияние БСА, Са2+, ЭДТА, кислых, нейтральных и щелочных значений рН среды инкубации на аутолитичсские изменения общих ли-пидов и их отдельных представителей серого и белого вещества головного мозга крыс

Сводные данные об аутолитических изменениях ОЛ и их отдельных фракций при инкубации серого и белого вещества в среде ФР и при воздействии изученных физико-химических факторов представлены в табл.1 и на рис. 1-7.

Как видно из табл. 1, содержание общих липидов в ткани серого вещества при аутолнзе в среде ФР менялось в колебательном режиме: в первые 10 мин их количество незначительно возрастало, через 1 ч снижалось, а на поздних сроках проявлялась тенденция к возврату содержания ОЛ к исходному уровню. Количество ОЛ белого вещества в динамике аутолиза, напротив, прогрессивно снижалось.

Влияние экзогенных факторов на аутолитические перестройки ОЛ серого и белого вещества также имело различный, и часто противоположный характер: кислые и щелочные значения рН способствовали уменьшению уровня ОЛ в сером веществе, но замедляли их снижение в белом веществе. Однако, в случае применения некоторых веществ (БСА ЭДТА, буферного раствора с рН=7.22) ОЛ серого и белого вещества изменялись однотипно: скорость их уменьшения замедлялась. Представленные данные позволяют предположить наличие как принципиально различных, так и общих механизмов деградации липидов серого и белого вещества, путей их активации или угнетения при смерти мозга.

Основной причиной изменений содержания общих липидов при посмертном аутолизе может быть нарушение динамического равновесия между реакциями синтеза и распада различных липидов с участием эндог енных липаз и других ферментов. Снижение уровня ОЛ как в сером, так и в белом веществе при инкубации в условиях ФР (особенно в белом веществе), а также при аутолизе серого вещества с ионами Са2', в щелочных (на поздних сроках) и кислых средах ауголиза, возможно, является результатом активации различных эндогенных липаз (прежде всего фосфолипаз).

Некоторые факторы замедляли распад ОЛ серого вещества. К ним можно отнести ЭДТА, нейтральные значения среды инкубации, и, частично, альбумин, а для белого вещества - ЭДТА, альбумин, а также изменения рН ин-

Таблица 1

Влияние физико-химических факторов на динамику аутолити-ческих изменений содержания общих липидов серого и белого вещества головного мозга крыс (п=5-10, мг%вл вес).

Условия аутолиза Структура мозга: серое/ белое вещество Сроки аутолиза

0 мин 10 мин 1 ч 4 ч 24 ч

ФР "ВТ 4265.0± 102.7 4616. 2± 73.4* 3607.0* 66.6* 3841.2± 49.1* 4191.4* 73.0

белое М±ш 7573.0± 151.1 6202.1± 125.9* 5267.5± 123.0* 4737.3* 116.0* 4120.6* 161.6

БСА 1% сГие 4265.0± 102.7 4853.ß± 60. ьу 3427.1± 195.1* 4134.7* 95.5 * 3370.1* 166.6%

белое Mim 7573.0± 151.1 7306.6± 129.5 л 6244.6± 146.4 * 6206.1* 197.9 , 6244.6* 309.8%

Са2 + 2' 10" 3М 4265.0± 102.7 342'6.7± 83.9% 2803.7± 153.6% 4106. 4± 120.6 3200.2* 97.6%

белое М±т 7573.0± 151.1 5819.8± 110.1* 5097.6± 193.1* 5947.2* 118.2** 4715.3* 158. 6 А

ЭДТА 10"3М 4265.0± 102.7 4389.6± 187.7 4276.3± 95.5 * 4191.4* 107.7 * 3483.4* 97.6%

белое М±т 7573.0± 151.1 6414.5± 439. 3 6541.9± 125.9% 9345.6* 273.1% 9812.6* 267.6%

рН=4.51 ciSe 4265.0± 102.7 3313.2± 140.9% 3341.8* 117.0* 3509.6* 212.0* 3398.4* 120.4%

белое М±ш 7573.О1 151.1 9175.6± 230.4% 6541.9* 158.6% 7858.8* 152.7 * 8198.7* 548.7 *

рН=7.22 с1£е 4265.0± 102.7 5048.0± 851.9 4078.0± 131.9 А 3766.5* 97.6 3256.8* 70.5%

белое М±т 7573.0+151.1 7816.3± 80.8 * 5097.6* 273.1* 6499.4* 175.4%, 5055.1* 185.7%

рН=8.95 сР£е 4265.0t 102.7 4616.1± 73.4 3964.8* 298.4 2860.3* 146.8 * 2407.2* 120. 4%

белое М±т 7573.0± 151.1 6117.1± 209. 3 7395.б1 125.9 * 5734.8* 96.8* * 5395.0* 211.5%

Здесь и далее: *(звездочка вверху)-достоверные различия по сравнению с исходным значением (0 мин; р<0.05; п=5-10) ч

*(звездочка внизу)-достоверные различия по сравнению с соответствующим сроком аутолиза ткани в среде ФР (р<0.05; п=5-10).

кубации как в кислую, так и в щелочную сторону. Возможно, что эти факторы уменьшали активность липолитических ферментов (особенно, в отношении ФЛ и, частично, ЭХ).

Вместе с тем, при аутолизе серого вещества в среде ФР, содержащей альбумин, и при щелочных значениях среды инкубации в первые 10 мин отмечалось повышение количества ОЛ. Накопление ОЛ выявляется при аутолизе и белого вещества в среде, содержащей ЭДТА, а также на ранних сроках инкубации в кислой среде. Это может быть связано с тем, что в ранние периоды умирания (близкие к клинической смерти) в ткани мозга сохраняется синтетический потенциал в отношении СЖК, ТГ, ЭХ, ФЛ, а также интенсифицируются гликолитические процессы на фоне снижения активности ферментов ЦТК [Гаевская М.С, 1963, Лобов В.В. и др., 1991, Marris P.F. et al, 1993], что может способствовать увеличению содержания ОЛ. На более поздних сроках аутолиза белого вещества в кислой среде и в присутствии ЭДТА поддержание высокого уровня ОЛ, вероятно, связано со снижением активности некоторых липолитических ферментов. Вместе с тем, следует отметить, что возрастание содержания ОЛ в тканях мозга может быть и результатом увеличения экстрагируемости липидов, которая зависит как от величины pH и наличия ионов2-х валентных металлов в среде [Polch J. et al, 1957, Кейтс M., 1975, Финдлей Д.Б. и др., 1990], так и от физико-химического состояния липидов нейрональных мембран на некоторых сроках аутолиза, чему способствует, в частности, снижение доли X в мозговых структурах, вызывая, тем самым, увеличение подвижности мембранных липидов, что может являться одной из причин возрастания в экстрактах содержания некоторых фракций (ФЛ, ЭХ) [Ильяшенко Д.В., 1995].

Далее на рис. 1-7 представлены данные о характере изменений отдельных липидных фракций при воздействии на аутолизирующееся серое и белое вещество головного мозга крыс различных физико-химических агентов.

При аутолизе серого вещества в среде стерильного ФР (рис. 1А) доля ФЛ уменьшалась с параллельным накоплением ДГ и СЖК. Содержание X и ЭХ менялось в реципрокном колебательном режиме с преобладанием реакций распада ЭХ начиная с 4ч аутолиза и далее.

При инкубации белого вещества в условиях ФР (рис. 1Б) содержание ФЛ, начиная с 1ч, уменьшалось в колебательном режиме, а количество СЖК увеличивалось с 1ч ау юлиза. Изменения относительной концентрации X и ЭХ имели колебательный реципрокный характер.

В присутствии БСЛ при инкубации серого вещееi ни (рис. 2А) содержание ФЛ значительно снижалось, начиная лишь с 1ч ауюли sa с параллельным увеличением СЖК. ДГ и ЭХ, а также ТГ на 24ч. Доля X снижалась к 4ч и 24ч инкубации.

5000-( 40ЛЮ-I заоо-2йОО-1000-6Й6-

.ытт,

1Й11

лохл-ЗйОО-20001000-аоо-

щ.

Рис. 1. Аутолитические изменения липидов серого (А) и белого (Б) вещества

головного мозга крыс в условиях ФР. Здесь и далее: 0, 10-мин, 1, 4, 24-ч аутолиза; по оси ординат - содержание

липидов в % от суммы фракций, х - достоверные различия по сравнению с исходным значением (0 мин, р<0.05; п=5-10)

(х) - достоверные различия по сравнению с соответствующим сроком аутолиза ткани в среде ФР (р<0.05; п=5-10).

В аутолизирующемся белом веществе в этих условиях (рис. 2Б) относительное количество ФЛ и ДГ уменьшалось уже на Юмин и далее с одновременным значительным накоплением ЭХ и менее выраженным - ТГ (в колебательном режиме). Относительное количество СЖК также увеличивалось, однако только с 1 ч инкубации. Содержание X снижалось в колебательном режиме.

В присутствии ионов кальция доля ФЛ в динамике аутолиза серого вещества головного мозга крыс (рис. ЗА) значительно уменьшалась уже в первые минуты инкубации с параллельным накоплением СЖК, а также ЭХ, ТГ и ДГ. При этом доля X снижалась. Для некоторых фракций также отмечен колебательный характер изменений (ЭХ).

итгП,

ьф ы

Й1

1

I

Рис. 2. Влияние БСА (1%) на ауголигические изменения липидов серого (А) и белого (Ь) вещества головного мозга крыс.

При инкубации белого вещества мозга I! этих условиях (рис. ЗБ) уровень

ФЛ также снижался с одновременным накоплением СЖК, но в меньшей степени по сравнению с серым веществом. Количество X и, в колебательном режиме, ДГ и ТГ увеличивалось в динамике аутолиза с одновременным снижением ЭХ.

Ш1

.....

Щ] Щ}

А' ах ж к _ом< я

Рис. 3. Динамика изменений содержания липидов серого (А) и белого (Б) вещества при аутолизе в присутствии экзогенных ионов Са2+ (210"3М).

При инкубации серого вещества в ФР, содержащем ЭДТА (рис. 4А), количество ФЛ в динамике аутолиза начинало незначительно снижаться с одновременным накоплением СЖК с Юмин, а ДГ - с 4ч инкубации. Доля X уменьшалась, начиная с 1ч аутолиза, а ЭХ менялась незначительно. Значительный рост количества СЖК отмечался лишь в поздние сроки аутолиза.

жаши

Рис. 4. Влияние ЭДТА (10" М) на характер аутентических изменений липидов серого (А) и белого (Б) вещества мозга крыс.

В аутолизирующемся белом веществе в этих условиях (рис. 4Б) уровень ФЛ снижался только к 24ч инкубации, тогда же выявлялось и некоторое нарастание СЖК. Количество X и ДГ увеличивалось (в колебательном режиме), а ЭХ и ТГ - снижалось.

При аутолизе серого вещества в среде с кислыми значениями рН (рис. 5А) количество ФЛ быстро снижалось, что сопровождалось значительным накоплением СЖК, ТГ и ДГ. Однако на более поздних сроках инкубации (4ч и 24ч) накопление ТГ и ДГ было менее выраженным. Изменения содержания X и ЭХ носили колебательный рсципрокпый характер, причем доля X снижалась, а ЭХ - увеличивалась.

В аутолизирующемся белом веществе при кислых значениях рН (рис. 5Б) количество ФЛ снижалось только к 4ч и 24ч аутолиза с одновременным накоплением СЖК. Доля X возрастала, а ЭХ - уменьшалась, начиная с Юмин инкубации. Изменения относительной концентрации ДГ и ТГ были незначительными.

X .СЖК ж Я .СЖК эх

Рис. 5. Аутолитические изменения липидов серого (А) и белого (Б) вещества в среде с рН=4.51.

Как видно из рис. 6А, при инкубации серого вещества при нейтральных значениях рН уровень ФЛ медленно снижался с параллельным накоплением СЖК. Значительных изменений количества других фракций (ДГ, ТГ, X и ЭХ) не отмечалось.

В белом веществе в этих условиях (рис. 6Б) содержание ФЛ увеличивалось к 4ч, и только через 24ч инкубации снижалось. К этому же сроку отмечалось и незначительное накопление СЖК. Содержание X, ЭХ и ТГ менялось в колебательном режиме, причем для X и ЭХ эта изменения носили реци-прокный характер. Доля ДГ в динамике аутолиза не изменялась.

При аутолизе серого вещества мозга крыс в буферном растворе с щелочными значениями рН (рис. 7А) количество ФЛ снижалось с одновременным значительным нарастанием ТГ и менее выраженным - ДГ (на Юмин аутолиза), а, начиная с 1ч, и СЖК. Содержание X уменьшалось, а ЭХ - увеличивалось.

асиоо- "70.00 60.0050.00 40.001 зооо 20Л0 10.00 ООО ___—-------- 70ХХЬ А Й 1 . ......................._

г

30.00

40.0030.00

1

1.......... ТП " | 1____...............т.__ 10.00 ...... ч' и -1 ж -----.....-5 Нагони ГЗЧТП Ш1 ТГ

оюс Т эх АГ . окх

Рис. 6. Влияние нейтральной (рН=7.22) среды инкубации на аутолитические изменения липидов серого (А) и белого (Б) вещеспш головного мозга крыс.

вещества мозга крыс в щелочной (рН=8.95) среде инкубации.

В аутолизирующемся белом веществе в этих условиях (рис. 7Б) уровень ФЛ снижался только на поздних сроках аутолиза с одновременным накоплением ТГ и менее выраженным - СЖК. Для ДГ выявлен колебательный характер их изменений. Количество X и ЭХ менялось незначительно.

Возможные молекулярно-биохимические механизмы аутолитиче-ских изменений содержания отдельных липидов мозга крыс в условиях воздействия различных физико-химических факторов.

Как видно из рис. 1-7, практически все липидные фракции серого и белого вещества головного мозга крыс при аутолизе претерпевали ряд существенных и часто разнонаправленных изменений своего относительного содержания в зависимости как от сроков аутолиза, так и от характера применяемых физико-химических факторов.

Обращает на себя внимание изменения ФЛ, содержание которых в динамике ауголиза либо оставалось неизменным (до 10 мин инкубации серого вещества в присутствии БСА и при рН7.22 и белого вещества в среде ФР, на ранних сроках аутолиза в присутствии ЭДТА, при рН=4.51, 7.22, 8.95) (рис. 1К, 2А, 4Б, 5Б, 6, 7Б), либо снижается. Как правило, уменьшение количества ФЛ сопровождалось накоплением продуктов их гидролиза (СЖК и ДГ), что свидетельствует об активации фосфолипаз типа Аь А2 или С.

Однако, часто изменения содержания ФЛ протекали параллельно колебаниям содержания ТГ и ЭХ без существенного нарастания СЖК, что может свидетельствовать о реализации трансацилазных реакций в системе ФЛ-ДГ-ТГ и ФЛ-Х-ЭХ как через общий пул СЖК [Грибанов Г.А., 1979], так и через КоА-производные жирных кислот [Грибанов Г.А., 1979, Howie A. et al, 1992,]. В литературе имеются данные, подтверждающие перенос остатков ЖК из ФЛ на ДГ с образованием ТГ и на X с образованием ЭХ [Грибанов Г. А., 1986].

В оишчис от перестроек суммарных ФЛ, изменения содержания X и ЭХ

носили реципрокный, а часто (при аутолизе серого вещества в среде ФР, при рН 4.51 и белого вещества в среде ФР, в присутствии БСА и при рН среды инкубации 7.22 и 8.95) (рис. 1, 2Б, 5А, 6Б, 7Б) и колебательный характер. Увеличение или уменьшение относительной доли ЭХ могут быть связаны либо с переносом остатков ЖК между холестерином и другими ацилсодер-жащими фракциями липидов (ФЛ, ТГ, ДГ) с помощью холестерол-О-ацилтрансфераз [Грибанов Г.А., 1979, Ко1ко М., 1996], либо с использованием пула СЖК при обращении холестеролэстеразных реакций [Брокерхоф X. и др., 1978].

Изменения количества ДГ и СЖК в большинстве случаев имели выраженную тенденцию к увеличению (рис. 1-7). Вероятно, их доля возрастала в связи с гидролитическим распадом ФЛ, ЭХ и, иногда, ТГ. Динамика изменений содержания ТГ зависела как от условий инкубации, так и от вида ткани головного мозга (рис. 1-7). При аутолизе серого вещества содержание ТГ ^Увеличивалось при воздействии всех изучаемых физико-химических факторов. При аутолизе белого вещества содержание ТГ снижалось в условиях ФР, в присутствии ЭДТА (рис. 1А, 4А); увеличивалось при воздействии Са2+ (2 10"3М), БСА и в щелочных условиях аутолиза (рис. 2А, ЗА, 7А); менялось в колебательном режиме при рН 7.22 и рН 4.51 (рис. 5 А, 6А). Изменения их количества можно оценивать или как результат изменения активности ТГ-липазных ферментов, наличие которых в головном мозге животных обнаружено многими исследователями [Брокерхоф X. и др., 1978], или как реализацию трансацилазных реакций между ацилсодержащими фракциями, возможность которых обсуждалась выше.

К факторам, усиливающим аутолитический распад основных представителей липидов серого и белого вещества, можно отнести ионы Са2+ и кислые значения рН среды инкубации (рис. 3, 5), причем для серого вещества в обоих случаях активировались как гидролитические, так и, возможно, трансаци-лазные механизмы перестроек лииидного компонента. В литературе имеются данные, подтверждающие наличие в мозге животных липаз, активируемых ионами Са2+ и кислыми значениями рН [Литвинко Н.М. и др., 1991, ВопуеШге .Т.1/. е( а1, 1997]. К факторам, защищающим липидный компонент серого и белого вещества от аутентической деградации в течение 24 часов инкубации, можно отнести ЭДТА, нейтральные и щелочные значения рП (рис. 4, 6, 7). Щелочные значения р11 среды инкубации (рис. 7) замедляли гидролитический распад ацилсодержащих фракций липидов на 10 мин, 1ч и 4ч инкубации, но усиливали трапсапилазные механизмы на всех сроках ау-толнза. В литературе имеются данные о значительной зависимости гмих процессов от величины рН [Брокерхоф X. и др., 1978]. Нейтральные значения (рП 7.22, рис. 6) способствовали стабилизации содержания всех липидных фракций серого и белого вещества, вероятно, вследствие ипгибирования кис-

лых липаз и ацилгрансфераз.

Наличие ЭДТА в среде инкубации серого вещества (рис. 4А) угнетало гидролитический распад ФЛ, возможно, в результате снижения активности Са2+-зависимых фосфолипаз, что показано многими исследователями [Сороковой В.И. и др., 1975, Литвинко Н.М. и др., 1991, Досон Р. и др., 1991]. Вполне вероятно, что при этом усиливается реализация и трансаци-лазных перемещений между ФЛ и ДГ с образованием ТГ и ЛФЛ без значительного накопления СЖК. В белом веществе ЭДТА защищал ФЛ от распада, не оказывая существенного воздействия на образование ТГ, но, вместе с тем способствовал реакциям распада ЭХ (рис. 4Б).

Экзогенный альбумин также предотвращал распад липидов серого вещества, но только до 4ч ауголиза (рис. 2А). Влияние БСА ,по всей видимости, объясняется его способностью связывать СЖК, ЛФЛ и ионы Са2+, [Вгс^егееп И. е1 а1, 1990, ВЬаппсНрай 8.Р. й а1, 1995], которые являются активаторами ряда эндогенных фосфолипаз [СЬаНГа V. ег а1, 1990, Литвинко Н.М. и др., 1991, МоЬп Н. е1 а1, 1992]. К 24ч БСА активировал распад ФЛ как по гидролитическим, так и по трансацилазным механизмам (в меньшей степени). При этом накапливались СЖК и ЭХ. Это может быть связано и с разрушением экзогенного альбумина эндогенными протеазами серого вещества. Вместе с тем, известно и активирующее действие БСА на некоторые внутриклеточные липазы [Брокерхоф X. и др., 1978]. В белом веществе БСА, напротив, способствовал снижению содержания ФЛ уже на 1 Омин без увеличения СЖК и ДГ (рис. 2Б), что может быть связано с усилением трансацилазных механизмов (в системе ФЛ-Х-ЭХ и ФЛ-ДГ-ТГ). Интересно отметить, что отдельные представители липидов (ФЛ, ТГ, ДГ и СЖК) белого вещества проявляли значительно большую стабильность, по сравнению с липидами серого вещества, как при аутолизе в среде ФР, так и при воздействии большинства исследованных факторов.

2. Сравнительная характеристика влиянии различных условий проведения ауголиза на изменения общих фосфолшшдов и их отдельных фракций в сером и белом веществе головного мозга крыс.

Результаты исследований влияния БСА, Са*", ЭДТА, кислых, нейтральных и щелочных значений рП среды инкубации на ауюлитические изменсия перестроек ряда липидов серого и белого вещества представлены в табл.2 и на рис.8-14.

Как видно из ;абл.2, содержание липидною фосфора в ткани серого и белого вещее(ва при инкубации в среде ФР уменьшалось, начиная с 1 ч аую-

Таблица 2

Влияние физико-химических факторов на динамику аутолити-ческих изменений содержания общих фосфолигшдов серого и белого вещества головного мозга крыс (п=5-10, Рлип мг%вл Вео).

Условия аутоли-за Структура мозга: серое/ белое вещество Сроки аутолиза

0 мин 10 мин 1 ч 4 ч 24 ч

ФР серое М-т 250.9± 3.4 255.2± 9.9 180.6± 6.9* 188.8± 5.6* 171.9* 5.5*

белое М±т 358.I1 4.8 345.8± 6.4 336.2± 7.5* 386.0± 12.2 355.8± 6.9

БСА серое М-т 250.9± 3.4 285.3± 3.4% 214.3± 6.1** 186.9± 7.9* 167.6± 4.6*

белое М±т 358.1± 4.8 386. 8± 8.2% 373.6± 2.1% 341.9± 8.6 * 292.6± 8.1**

Са2+ серое М-т 250.9± 3.4 152. 6± 2.8% 175.1± 3.4* 161.3± 4.3% 116.5± 11.4**

белое М±ш 358.1± 4.8 228.8± 4.2% 260.8± 4.1** 230.1± 14.9% 186.8± 14.0**

ЭДТА серое М5т 250. 9± 3.4 290.9± 5.1% 254.8± 5.6 * 251.1± 4.9 * 211.8± 12.9%

белое Mim 358.I1 4.8 355.0± 7.5 349. 4^ 4.5 361.6± 9.7 336.4± 8.9

рН=4.51 серое М?га 250.9± 3.4 221.1± 3.6% 213. 0± 2.6% 185.6± 18.4* 168.2~ 4.5*

белое М±га 358.1± 4.8 330.9± 7.5* 340.0± 5.4 300.8± 5.8% 329.7~ 5.0%

рН=7. 22 серое М?т 250.9± 3.4 251.1± 2.9 228. 6± 4-1% 235.0± 6.9 * 195.0± 10.2*

белое М±т 358.1± 4.8 370.0± 5.4 * 384.1± 9.5% 349.4± 6.9 А 342.8± 7.7

рН=8.95 серое М-т 250. 9± 3.4 190.0± 5.5% 157.6± 5.9* 156.5± 4.2% 146.4± 2-2%

белое М-т 358. 1t 4.8 325.1± 7.4 292. 6± 8.9% 241.9: 12.9% 235.5± 4-5%

Обозначения те же (табл.1)

лиза. Однако, при ауголизе белого вещества в этих условиях содержание Рлип. возвращалось к исходным значениям на поздних сроках (4 ч и 24 ч).

Основными причинами изменений содержания липидного фосфора, как и ОЛ, при посмертном аутолизе могут быть нарушения динамического равновесия между реакциями синтеза и распада ОФЛ. Снижение содержания макроэргических соединений (АТФ, ЦТФ и др.) в процессе аутолиза приводит к угнетению синтеза ФЛ [Lochner A. et al, 1989, Грибанов Г.А., 1979]. Параллельно этому, отмечается активация распада ФЛ с участием эндогеных фосфолипаз и других ферментов их биотрансформации [Грибанов Г. А., 1986, Akino M. et al, 1997, Bonventre J.V., 1997]. Другим возможным объяснением значительного уменьшения доли ФЛ в процессе аутолиза может быть увеличение содержания водорастворимых фракций липидов (ЛФЛ), что, естественно, влияегг на их экстрагируемость органическими растворителями [Кейтс М., 1975].

Как следует из приведенных выше данных, уменьшение количества Рлип. в значительно большей степени характерно для серого вещества, в сравнении с белым, что может быть связано с наличием существенных различий в содержании ферментов синтеза и распада в изученных мозговых структурах, а также разным фосфолипидным составом этих структур.

Как установлено нами, ионы Са2+, кислая и щелочная среды инкубации серого и белого вещества головного мозга крыс ускоряли процесс снижения уровня Рлип. (табл.2), начиная уже с 10 мин аутолиза, что связано, вероятно, с активацией эндогенных Са2+-зависимых, "кислых" (с pH оптимумом 4.5) и "щелочных" (с pH оптимумом 8-9.5) фосфолипаз [Литвинко Н.М. и др., 1991, Kanter J. et al, 1994 и др.]

Влияние ионов Ca2f и различных изменений pH может проявляться и через изменения физико-химического состояния липидного компонента мембран, что также, вероятно, оказывает существенное воздействие на скорость реакций распада и трансформации липидов.

ЭДТА и нейтральные значения среды инкубации предотвращали падение содержания Рлип. как в белом, гак и в сером веществе головного мозга крыс в динамике аутолиза (табл. 2). Вероятно, данные факгоры являются ингибиторами соответствующих фосфолипаз [Strosznajder J., 1989, Kanter J.N. et al, 1994 и др.].

БСА также замедлял деградацию фосфолипидного компонент, но только на ранних сроках аутлиза серого и белого вещества (табл. 2). Протекторные свойства БСА, возможно, определяются его способностью связывать СЖК, ЛФЛ и некоторые другие продукты распада липидов, [Джафаров Э.С., 1990. Досои Р. и др., 1991. Cha Mee-Kyung et al, 1996]. Однако, па поздних сроках аутолиза (4 ч, 24 ч ) чащи тою действия БСА не о1мсча.1ось. что можно объяснить как протеоличом экзогенного альбумина, так и наличием в

ткани мозга липаз, независимых от БСА [Литвинко Н.М. и др., 1991, К1ет ].

1995].

В определенных условиях (наличие в среде инкубации ЭДТА, альбумина, буфера с нейтральными значениями рН) на ранних сроках аутолиза (табл. 2) серого и белого вещества головного мозга крыс (10 мин и , реже, 1ч) наблюдалось увеличение содержания Рлип.. Вероятно, это связано с тем, что в ранние, близкие к периоду клинической смерти, сроки аутолиза в структурах мозга еще сохраняется синтетический потенциал, а также интенсифицируются гликолитические процессы. На фоне продолжающегося синтеза липидов перичисленные выше агенты замедляют процесс распада, результатом чего является повышение количества ФЛ. Нельзя исключить и трансацилазные механизмы образования ФЛ (в системах ТГ-ЛФЛ, ЭХ-ЛФЛ) [Грибанов Г.А., 1986] и увеличения экстрагируемости липидов [Ильяшенко Д.В., 1995].

На рис. 8-14 представлены данные о динамике изменений отдельных фосфолипидных фракций в ходе аутолиза серого и белого вещества головного мозга крыс при воздействии различных физико-химических факторов.

Так, при инкубации серого вещества головного мозга в условиях ФР (рис. 8А) содержание ФЭА и ФИ снижалось к 1ч аутолиза при этом доля ФС, ГЛФ и ЛФЛ увеличивалась. Уровень ФИ значительно возрастал на 4ч. К 24ч инкубации количество ФИ, ФС и ФЭА, ГЛФ возвращалось к начальным значениям, а доля ФК и ЛФЛ оставалась повышенной. Концентрация ПГФ снижалась только к 24ч. Холинсодержащие фракции (ФХ и СФМ) в динамике аутолиза не менялись.

ГЛФ СФЫ ФИ ФЭА ФК ГМ> СФи ФИ ФЭА ФК

ЛФЛ ФХ ФС ПГФ /Л»Л ФХ ФС ПГФ

Рис. 8. Характер изменений отдельных фосфолипидов серого (А) и белого (Б) вещества головного мозга крыс при аутолизе в среде ФР (обозначения см. рис. 1).

При ауюлизе белого вещества в среде ФР (рис. 8Б) содержание ГЛФ и, особенно. ЛФЛ н процессе аутолиза увеличивалось, СФМ - снижалось. Опю-сите.тьпая концентрация ФХ, ФИ, ФС, ФЭА и ФК изменялась в колебательном режиме, причем доля ФС и ФК увеличивалась к поздним срокам инку-

бации (4ч и 24ч), тогда как ФЭА, ФХ и ФИ, напротив, уменьшалась.

В присутствии БСА в аутолизирующемся сером веществе (рис. 9А) относительное количество большинства фракций изменялось в колебательном режиме. Содержание ГЛФ, ЛФЛ и ФК возрастало, а ФЭА уменьшалось. Концентрация ФХ существенно не менялась.

В аутолизирующемся белом веществе в этих условиях (рис. 9Б) содержание ФИ и ФХ снижалось в колебательном режиме на фоне прогрессивного нарастания ЛФЛ. Уровень ПГФ также увеличивался уже на первых минутах аутолиза. Изменения ФС и ФЭА носили реципрокный колебательный характер с увеличением ФС к 1 Омин и 4ч инкубации. Для СФМ существенных изменений выявлено не было.

Аутолиз серого вещества в среде, содержащей экзогенные ионы кальция (210"3М) (рис. 10А), способствует уменьшению количества ФХ и ФЭА (в колебательном режиме), с минимумом к Юмин и 4ч. Доля ФИ, СФМ, ФС и ПГФ также снижалась и достигала наименьших величин к концу 24 ч. Содержание ЛФЛ и ФК, напротив, начиная с Юмин инкубации прогрессивно увеличивалось. Для ГЛФ существенных изменений выявлено не было.

Рис. 9. Влияние БСА (1%) на аутолитические изменения фракций фосфоли-пидов серого (Л) и белого (Б) вещества головного мозга крыс.

При аутолизе белого вещества в этих условиях (рис. 10Б) содержание ГЛФ и ФИ снижалось, начиная с Юмин. Содержание ФХ уменьшалось в колебательном режиме с минимумом к Юмин и 24ч аутолиза. Количество ЛФЛ и ФК, напротив, прогрессивно увеличивалось с Юмин инкубации. Изменения ФЭА и ФС носили колебательный реципрокный характер, причем к Юмин относительная концентрация ФЭА увеличивалась, а через 24ч - снижалась. Уменьшение доли СФМ отмечались только на 24 ч инкубации. Существенных изменений содержания ПГФ выявлено не было.

В аутолизирующемся сером веществе головного мозга крыс в присутствии ЭДТА (рис. ПА) количество ФХ (на поздних сроках), ФК и ФС (на ранних сроках инкубации) прогрессивно увеличивалось. Доля ПГФ, ФЭА,СФМ

и ФИ снижалась. Колебательные изменения с уменьшением относительной концентрации выявлены для ГЛФ и ЛФЛ.

М* ФХ ФС пга АФА ФХ ФС ПГФ

Рис. 10. Динамика аутолитических изменений состава фосфолипидов серого (А) и белого (Б) вещества головного мозга крыс в среде, содержащей экзогенные ионы Са2+ (10"3М).

При инкубации белого вещества в среде, содержащей ЭДТА (рис. 11Б), относительное содержание большинства фракций ФЛ менялось незначительно, хотя отмечено прогрессивное снижение количества ГЛФ, начиная с Юмин инкубации, и увеличение содержания ФС к 1ч инкубации.

При аутолизе серого вещества мозга при кислых значениях рП среды инкубации (рис. 12А) количество ФЭА резко снизилось уже на первых минутах инкубации с параллельным значительным накоплением ЛФЛ и менее выраженным - ГЛФ и ФК. Относительная концентрация СФМ и ФИ увеличивалась в ранние сроки аутолиза. Доля ФС снижалась к Юмин и 24ч. Количество ФХ и ПГФ менялось в колебательном режиме.

Рис. 11. Характер аутолитических изменений представителей фосфолипидов серого (А) и белого (Б) вещества юловного мозга крыс при воздействии ЭДТА (2 1 О^М).

В ауголизирующемся белом веществе при кислых значениях рП (рис.

12Б) содержание ФЭА существенно снижалось со значительным накоплением ЛФЛ. Относительное содержание ФИ и ФС также уменьшалось (хотя и в колебательном режиме). Колебательные изменения возрастающего характера отмечены для ФХ, ГЛФ и ПГФ. Доля СФМ увеличивалась лишь на 4ч аутолиза.

Рис. 12. Влияние кислой (рН=4.51) среды инкубации на ауголитические изменения фосфолипидов серого (А) и белого (Б) вещества головного мозга крыс.

При инкубации серого вещества мозга при нейтральных значениях рН (рис. 13А) содержание ФЭА и ПГФ прогрессивно уменьшалось к 1ч и 4ч аутолиза, с параллельным увеличением содержания ФК и ФХ (в меньшей степени). Доля ФС уменьшалась только с 4ч, что сопровождалось увеличением ФИ (на 24 ч). Значительных изменений количества ФХ, ГЛФ и ЛФЛ не выявлялось.

Рис. 13. Динамика ауголитических перестроек отдельных фосфолипидов серою (А) и белою (Б) вещества головною мозга крыс в нейтральной (р!Г 1.22) среде инкубации.

В аутолизирующемся белом вещееiво » l>ihx условиях (рис. 13В) доля ФХ, а также ФЭА и ФИ (на 1ч и 24ч) уменьшалась, что сопровождалось увс-

личением количества СФМ, ФС, ГЛФ, ЛФЛ и ФК. Относительная концентрация ПГФ не изменялась.

ГМ> СФМ

ЛФЛ ФХ

ФЭЛ ФК

фс пгф

Рис. 14. Характер изменений фракционного состава фосфолипидов серого (А) и белого (Б) вещества головного мозга крыс при аутолизе в щелочной (рН=8.95) среде.

Щелочные значения рН среды аутолиза в сером веществе мозга (рис. 14А) вызывали значительное снижение содержания ФЭА с одновременным накоплением ФК и менее значительным - ГЛФ, ЛФЛ. Количество ФХ также увеличивалось (к 24ч), что сопровождалось уменьшением концентрации СФМ, уровень которых был выше исходного до 4ч икубации. Изменение доли ФИ, ФС и ПГФ имели менее выраженный колебательный характер.

В аутолизирующемся белом веществе в этих условиях (рис. 14Б) содержание основных фракций (ФС, ФИ и менее значительно ФХ, ФЭА) снижалось. Однако, параллельно прогрессивному уменьшению ФС, на 1ч и 4ч аутолиза уровень ФЭА возвращался к исходным значениям. При этом отмечено накопление ФК и, менее выраженное, ЛФЛ и ГЛФ. Содержание СФМ, ФХ и ПГФ менялось незначительно.

Возможные молекулнрно-биохимичсскне механизмы изменений отдельных представителей фосфолипидов серого и белого вещества головного мозга крыс в динамике аутолиза и влияние на них изученных физико-химических факторов.

Как следует из представленных выше данных (рис. 8-14), основным в изменениях количественного содержания отдельных фосфолипидных фракций серого и белого вещества головного мозга крыс можег являться их гидролиз фосфолипазами типа А, В, С и D с образованием ЛФЛ. ФК, ГЛФ и ДГ. Главным образом, по этому пути распадались ФЭА и ФС. что отмечалось и другими исследователями |Baker R.R. et al, 1991, Терновой В.A., 1993, Илья-шенко Д.В., 1995 и др.|. ФХ, ФИ и СФМ в ряде случаев проявляли относи-

тельно большую устойчивость. Необходимо отметить и относительную стабильность представителей ФЛ белого вещества по сравнению с серым веществом головного мозга крыс.

В аутолизирующемся в ФР сером и белом веществе (рис. 8) активировался распад как ФЭА, ФИ, так и ФС и ФХ (на ранних сроках аутолиза белого вещества), что сопровождалось накоплением ЛФЛ, ФК, и, в меньшей степени, ДГ и ГЛФ.

В присутствии БСА (рис. 9) усиливался распад ФС и ФЭА на 24 ч инкубации серого вещества (до ЛФЛ и ДГ), но замедлялся гидролиз ФХ ФИ и ПГФ в белом веществе. ЭДТА также снижал распад всех ФЛ до ФК и ЛФЛ белого вещества (рис. 11). Подобный эффект (но менее выраженный) ЭДТА оказывал и на ФИ и ФЭА серого вещества, но не на СФМ и ПГФ. Нейтральные условия инкубации сдерживали гидролитический распад фосфолипидов До ЛФЛ, но стимулировали образование ФК за счет ФЭА, ФС и, возможно, ПГФ в сером веществе преимущественно за счет ФХ - в белом веществе головного мозга крыс (рис. 13). В литературе имеются сведения, подтверждающие предпочтительный гидролиз ФХ фосфолипазой Б головного мозга крыс, оптимум действия которой находится в пределах рН=7,2 [СЬаШа V. е! а1, 1990].

Напротив, под влиянием ионов Са2+ как в сером, так и в белом веществе (рис. 10) усиливались реакции гидролиза ФЛ уже в первые Юмин инкубации, прежде всего в отношении ФХ и ФЭА, а также ФИ в белом веществе с образованием ЛФЛ и ФК, вероятно, за счет активации Са2+-зависимых фос-фолипаз типа А С и О, поскольку отмечено увеличение уровня СЖК, ДГ и ФК. В кислой среде инкубации серого и белого вещества значительно усиливался распад ФЭА и ФС до ЛФЛ и ГЛФ (рис. 12), а в щелочной среде - до ФК (рис. 14). При этом в белом веществе отмечалось также выраженное накопление ЛФЛ с параллельным снижением не только ФЭА и ФС, но и ФХ. Вероятно, в кислых условиях преимущественно активируются фосфолипазы типа А а в щелочной - типа П.

В аутолизирующейся ткани мозга, возможно, реализуются и трансфе-разные механизмы взаимных превращений в реципрокных парах и триадах ФС-ФЭА-ФХ, ФХ-СФМ, ФС-ФИ. На их возможность в условиях нарушенного энергообеспечения клеток и тканей указывает большое количество работ [Грибанов Г.А., 1979, Ноушв Я. е! а1, 1992 и др.]. В условиях ФР (рис. 8) в аутолизирующемся ссром и белом веществе головного мозга крыс, вероятно, реализовывались превращения между ФЭА и ФС, что может объяснить ре-ципрокный характер их изменений. Большинство изученных физико-химических факторов (за исключением ионов Са"' и, в меньшей степени, нейтральных и щелочных у словий инкубации белого вещее та) угнетали их (рис. 8-14). Возможно, что при аутолизе серого вещества в среде с ЭДТА и в

щелочных условиях (рис. 11, 14), а также белого вещества в ФР и кислой среде (рис. 8, 12) реализовались превращения СФМ в ФХ, что может служить одним из объяснений увеличения содержания ФХ в этих условиях. Вероятно, накопление ФХ связано и с трансформацией ФЭА в ФХ (при аутоли-зе серого вещества в щелочной среде и с ЭДТА (рис. 11, 14) и белого вещества в кислых условиях (рис. 12)) или сохранением синтетического потенциала на первых минутах инкубации ткани с параллельным угнетением фосфоли-пазной активности, что обсуждалось выше. В противоположность этому, в аутолизирующемся сером веществе в среде с кислыми значениями pH (рис. 12) и белом веществе в щелочных условиях (рис. 14), очевидно, происходило образование СФМ преимущественно за счет ФХ.

В ряде случаев (аутолиз серого вещества в ФР, в кислых и щелочных условиях (рис. 8, 12, 14)) отмечалось увеличение содержания ФИ. Возможно, это связано с образованием ФИ в цепи реакций превращений ФС [Грибанов Г.А., 1979], тем более, что количество ФС в этих условиях уменьшалось. Другим вероятным объяснением может служить увеличение экстрагируемо-сти ряда представителей ФИ.

Практически во всех вариантах экспериментального ауголиза (рис. 8-14) отмечалось накопление ГЛФ, что может быть не только результатом гидролитического распада ФЛ, но и продуктом реакций гликолиза, активация которых происходит в терминальных состояниях на ранних сроках умирания [Неговский В.А., 1986, George R. et al, 1992].

ВЫВОДЫ.

1. Содержание ОЛ в динамике аутолиза серого вещества головного мозга крыс in vitro в среде с ФР претерпевает колебательные изменения. БСА (в концентрации 1%) усиливает колебательный характер изменений ОЛ. ЭДТА (в концентрации 10"3М) предогвращаег снижение содержания ОЛ. Экзогенный Са2+ (в концентрации 2 10ЛМ), кислые (рН=4.51), щелочные (рН=8.95) и нейтральные (рН=7.22) значения pli среды инкубации способствуют снижению количества ОЛ в динамике ауголиза, но в разной степени.

2.В ходе аутолиза белого вещества головного мозга крыс в среде с ФР количество ОЛ прогрессивно снижается. Кислые, щелочные и нейтральные значения рП среды инкубации, a jaioice введение в физиологический раствор ЭДТА и БСА замедляют уменьшение ОЛ белого вещества. Наличие экзогенных ионов Са"+ не влияет на характер изменений ОЛ белого вещества в динамике аутолиза.

3.Уровень Рлиг, в ауголизируюшемся сером веществе при инкубации в среде с ФР снижается. ЭДТА БСА. кислые (до 4 и 24 ч аутолиза) и нейтральные (до 24 ч аутолиза) значения pH замедляют, а экзогенный Са2+ и ще-

лочные значения рН усиливают распад ОФЛ.

4.В белом веществе концентрация суммарных ФЛ в процессе аутолиза претерпевает незначительные колебательные изменения, которые замедляются при введении в среду инкубации ЭДТА. Экзогенный Ca2f, кислые и щелочные условия аутолиза способствуют снижению содержания ОФЛ. Нейтральные значения рН среды инкубации и введение БСА вызывают увеличение содержания ОФЛ на ранних сроках аутолиза (10 мин и 1 ч).

5.В аутолизирующемся сером веществе головного мозга крыс основными липидами, содержание которых снижается при всех изученных воздействиях, являются ФЛ, а также X (в среде с ЭДТА, БСА и при рН=8.95). При этом преимущественно накапливаются СЖК, ДГ (во всех вариантах экспериментального аутолиза),а также ТГ (в присутствии Са2+, ЭДТА, БСА и при рН=8.95, рН=4.51), ЭХ (при воздействии Са2+, БСА) и X (при рН=8.95). Другие липиды претерпевают колебательные изменения. Экзогенный Са2+ и кислая среда аутолиза усиливают снижение доли ФЛ и накопление ТГ, СЖК, ДГ, а в присутствии Са2+ - и ЭХ. Нейтральная среда, ЭДТА (на всех сроках), щелочная среда, БСА значительно замедляют изменения содержания ФЛ, СЖК, X и ЭХ.

6. При аутолизе белого вещества отмечается снижение содержания ФЛ (во всех вариантах аутолиза) с параллельным накоплением СЖК, а также ТГ (в присутствии БСА, Са2+ и при рН=8.95), ЭХ (в среде ФР и под влиянием БСА). ЭДТА, нейтральные, щелочные (на всех сроках) и кислые условия (на ранних сроках инкубации) замедляют распад ФЛ и накопление СЖК, а БСА и Са2+ ускоряют распад ФЛ. Содержание ЭХ снижается (с одновременным увеличением X) в присутствии Са2+, ЭДТА, при р1Г4.51 и 7.22. Напротив, БСА (на ранних сроках) способствует накоплению ЭХ.

7. Во всех вариантах экспериментального аутолиза серого вещества отмечено снижение доли ФЭА, и (за исключением воздействия ЭДТА) ФС. При этом увеличивается содержание ФК и ЛФЛ (кроме воздействия ЭДТА). Наличие ЭДТА и экзогенных ионов Са2+ в среде инкубации способствует снижению содержания СФМ, ПГФ, а также, в случае введения Са"1 - ФХ и ФИ. Содержание ФХ (кроме инкубационных сред, содержащих Са* и БСА) и СФМ (в кислых и щелочных условиях) увеличивается. При тгом ЭД'ГА предотвращает накопление ЛФЛ, а другие факторы способствуют увеличению ГЛФ (кроме кислых условий) и ЛФЛ (в условиях наличия экзогенного Са2+ и в кислой среде инкубации). Среди реципрокных пар наиболее явно выявляются взаимные превращения между ФС-ФЭАи ФХ-СФМ.

8. При аутолизе белого вещества в среде ФР на большинстве изученных сроков инкубации содержание реципрокных пар ФС-ФЭА и ФХ-СФМ меняется в колебательном режиме, доля ФИ уменьшается, а ЛФЛ. ГЛФ и ФК увеличивается. ЭДТА стабилизирует изменения ряда фракций ФЛ. БСА измсня-

ет характер отношений ФС и ФЭА в сторону образования ФЭА, а нейтральные и щелочные значения рН ингибируют их. При рН=7.22 и рН=8.95 увеличивается доля ФК в основном за счет снижения ФЭА, ФХ и ФИ. Экзогенный Са2+ активирует распад ФХ с образованием ЛФЛ и ФК. При кислых значениях рН преимущественно усиливается распад ФЭА с параллельным образованием, главным образом, ЛФЛ.

9. Полученные результаты указывают на то, что однозначная трактовка принципиальной невозможности регулирования посмертных аутолитических процессов на примере липидного компонента тканей мозга , по крайней мере на определенных стадиях, не является абсолютной. Отдельные классы липи-дов в сером и белом веществе головного мозга, на разных сроках и условиях аутолиза могут иметь различные механизмы изменений, что предполагает возможность комплексного подхода для временного поддержания их состава и количественного содержания при реанимации, консервации и трансплантации нервной ткани.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние фрагмента АКТГ^ю ("Semax") на динамику аутолитических изменений липидного компонента головного мозга крыс /Тезисы докладов научной конференции профессорско-преподавательского состава и сотрудников госбюджетных и хоздоговорных тем.- Тверь., 1993,- С. 123-125 (соавт. Грибанов Г.А., Ашмарин И.П., Ильяшенко Д.В., Луцкая П.В).

2. Влияние ионов кальция на аутолитические изменения липидов серого и белого вещества головного мозга крыс in vitro./ Ученые записки: Материалы научной конференции, посвященной 25-летию университета.- Тверь, 1996 - Т.З.- С. 48-49 (соавт. Грибанов Г.А., Ильяшенко Д.В.).

3. Изменения липидного компонента серого и белого вещества головного мозга крыс при воздействии ЭДТА в динамике посмертного аутолиза in vitro./ Ученые записки: Материалы научной конференции, посвященной 25-летию университета,- Тверь, 1996.- Т.З.- С. 50-51 (соавг. Грибанов Г.А., Ильяшенко Д.В.).

4.Определение активности силикагеля при разделении фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии./ Ученые записки: Материалы научной конференции, посвященной 25-летию университет а.Тверь, 1996,- Т.З.- С. 54-55 (соавт. Подгорный Г.Н., Слюсарь Н.П., Мазепов А.К.).

НАПРАВЛЕНЫ В ПЕЧА ТЬ

1. Влияние бычьего сывороточного альбумина на характер аутолитических изменений липидного компонента ткани серого и белого вещества головного мозга крыс in vitro.// Вопр. мед. химии, (соавт. Грибанов Г.А.).

2.Характер изменений фосфолипидов серого и белого вещества головно-

го мозга крыс при аутолизе в буферной среде с кислыми значениями pH./ Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии.Тверь, 1998.

РАЦИАНАЛИЗАТОРСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Способ элюирования липидов. Удостоверение на рационализаторское предложение N 1815, выданное 20.06.96 в Тверской государственной медицинской академии.

2. Способ мягкой активации силикагеля при МТСХ липидов. Удостоверение на рационализаторское предложение N 1817, выданное 20.06.96 в Тверской государственной медицинской академии.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

АТФ - аденозинтрифосфат,

Ацетил-КоА - ацилкоэнзим А,

БСА - бычий сывороточный альбумин,

вл.вес - влажный вес,

ГЛФ - глицерофосфат,

ДГ - диацилглицерины,

ЛФЛ - лизофосфолипиды,

ОЛ - общие липиды,

ОФЛ - общие фосфолипиды,

ПГФ - полиглицерофосфатиды,

Рлгат. - "липидный" фосфор,

СЖК - свободные (неэстерифицированные) жирные кислоты,

СФМ - сфингомиелины,

ТГ - триацилглицерины,

ФИ - фосфатидилинозиты,

ФК - фосфатидные кислоты,

ФЛ - фосфолипиды,

ФР - физиологический раствор,

ФРХ - фосфорилхолин,

ФС - фосфатидилсерины,

ФХ - фосфатидилхолины (лецишиы),

ФЭА - фосфатидилэтаноламины (кефалины),

X - холестерин,

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот,

ЦТФ - цитидинтрифоефат,

ЭД'ГА - этилендиамишетрауксусная кислота,

ЭХ - эстерифицированпый холесшрин (эфиры холестерина).

ПОДПИСАНО В ПЕЧАТЬ 22.12.97. УСЛ.ПЕЧ.Л. 1,65 УЧ.-ИЗД.Л. 1,3 5 ТИРАЖ 100 экз. ЗАКАЧ 4

РАЗМНОЖЕНО НА КСЕРОКСЕ ФИРМЫ ВОЛГЛ