Аутолитические изменения липидов различных отделов ультраструктур головного мозга крыс

Ильяшенко, Дмитрий Владиславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аутолитические изменения липидов различных отделов ультраструктур головного мозга крыс
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аутолитические изменения липидов различных отделов ультраструктур головного мозга крыс"

ТВЕРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

> ,

\ I

I ИЛЬЯШЕНКО Дмитрий Владиславович

аутолш нческие изменения липидов различных отделов и ультраструктур головного мозг а ктыс

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации нп соискание ученой степени ка1(ди;мтп: биологически* паук

Тпсрь. 1995

Гавота выполнена на кафедре биохимии и биогелнолоиш Тъсрсксм а государственного университета

I {аучный руководит «п.: доктор биологических наук, профессор

Грибанов Г.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Капитанов А.Б.

кандидат медицинских наук Дачиров М.М.

Ведущая органгоация:

Институт физиологии им. Ш1.Павлова РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится " 18 " октября 1995 г.ь со

на заседании диссертационного совета К 063.97.09 » Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70 "а", кори. 4, ауд. 34.

С диссертацией ыожно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета.

Автореферат разослан " _" сентябри 1995 г.

Учении секретарь диссертационного совега кандидат биологических наук,

ноиент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Для метаболизма липидов мозга, как и других биохимических соединений, характерно сочетание процессов их синтеза и распада (Aasell О.В., Hawthorne J.N., 1964, Прохорова Н.И., 1979, Дин Р., 1981, Хухо Ф., 1990, Vance J.E. et at., 1991).

Одним из весьма широко распространенных биологических явлений, 1де реакции распада превалируют над синтетическими является аутолнз (автолиз). Если ранее в 60 - 70 годах текущего столетия под ау то л том понимали выработанное в процессе эволюции свойство биологических объектов разлагать гидролитическим путем собственные структуры разного уровня (Лушннков Е.Ф., Шапиро Н.А., 1974), то в настоящее время, благодаря использованию новых современных методов биохимического анализа, а также на основе многочисленных исследований аутолнтических процессов в различных органах, тканях и их ультраструктурах (Грибанов Г.А., 1977-1994, Ребров Л.Б,. Козельцев В.Л. и др., 1983, Месрсон Ф.З., 1990) была выявлена некоторая односторонность имевшихся ранее представлений о биохимии аутглнза. На современном этапе аутолнз определяют как "выработанное в процессе эволюции свойство биологических объектов разлагать ферментативным и неферментатнвным путем собственные структуры разного уровня с преимущсстг ;нным участием гидролазных, а также трансферазных и других реакций биодегралации и бнотрансформации их молекулярных компонентов" (Грибанов Г.А., 1986).

Однако, в отечественной и зарубежной литературе имеется крайне мяло сведений об аутолитнческом распаде такого важного в структурном и функциональном отношении компонента центральной нервной системы, каким являются лнииды. Вместе с тем, проведены многочисленные исследования, посвященные изучению поведения липидного компонента мозга при различных патологических состояниях (ишемия, гипоксия и др.), в которых установлена достаточно высокая лабильность ряда липвдных фракций (Bazan N.C., Rodriguez de Turco E., 1980, Гастева C.B., Райзе Т.Е., 1984, Замурцев О.Н., 1984, Путнлина Ф.Е., Осадчая Л.М. и др., 1986,

Нсговский В.A., J987, Moto A.. Hiroshima Y. et al., I9S9, Fisrum E., Charderbhan R. et al. 1990, Логинова М.П., Ассур M.B., Швец H.A., 1994). Лнпнды синлптнческнх мембран мозга, как покачано современными исследованиями, не только участвуют в передаче информации, но и служат уникальной матрицей для ее хранения (Бурлакова Е.Б. и др., 1990).

В связи с этим актуальность исследования определяется важной ролью аутолиза в деградации различных структур мозга, его липидного компонента при патологических состояниях и особенно в посмертном перпде как на ранних, близких к клинической смерти, так и на более поздних этапах умирания.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение изменений липидов различных отделов и ультраструктур головного мозга крыс в ходе посмертного ау голиза.

Основными задачами оыли:

1. Изучение изменений содержания общих липидов, общих фосфолипидов головного мозга крыс при посмертном аутолнзе в условиях in vitro на тканевом уровне (серое и белое вещество);

2. Исследование характера изменений основных групп эндогенных липидов серого и белого вещества мозга в динамике аутолитического процесса in vitro;

3. Изучение изменений содержания общих липидов и общих фосфолипидов в некоторых ультраструктурах головного мозга (синаптосомы, миелин, митохондрии) в ходе аутолиза как в условиях in vitro, так и при нахождении мозга в трупе животного (НМТ);

4. Выяснение общих закономерностей и специфических особенностей аутолитической деградации и трансформации основных i pyrin эндогенных липидов в ультраструктурах мозга в условиях in vitro и НМТ.

Научная но.шзна. В работе впервые проведено комплексное сравнительное изучение изменений липидного компонента разнофункциопальных тканевых и ультраструктур головного мозга крыс при различных моделях посмертного аутолиза (в условиях in vitro и при НМ Г). В результате

проведенных исследований установлено, что уже на ранних, близких к клинической смерти этапах посмертного аутолиза (6-7 мин, 10 мин, 40 мин) практически по всех изученных структурах мозга отмечаются существенные изменения содержания ОЛ, ФЛ (см. список сокращений), и ряда липидных фракций (X, ТГ, СЖК, ФЭА, ФХ, ФК и др.). Показано, что с увеличением времени аутолиза (1 и 4 ч) как на тканевом уровне, так и в ультраструктурах (миелин, митохондрии) наблюдается феномен "возврата" относительного содержания ps-да лнпидных фракций к своим исходным значениям. Однако, через 24 ч аутолиза вновь наблюдается усиление гидролитического распада лниидов.

Установлено, что в условиях нахождения мозга в трупе животного изменения лнпндов ультраструктур по сравнению с аутолизом in vitro имеют как сходный, так и различный характер в зависимости от сроков аутолнза. Отмечено, что п условиях НМТ значительные перестройки некоторых лнпидных фракций происходят раньше, чем в условиях in vitro.

В работе проанализированы возможные пути метаболических взаимоотношений отдельных групп лнпндов на основе не только гидролазных, но и транеферазных, а тшсже иных механизмов биодеградацин и биотрансформацин лнпидного компонента головного Мозга крыс в динамике аутолиза.

Теоретическое н практическое значение работы. Проведенные исследования способствуют более глубокому пониманию молекулярно-бнохнмических механизмов аутолиза и танатогенеза мозга, дополняют и расширяют представления.о роли и значении липндного компонента в процессах гибели тканевых и субклеточных структур мозга. Полученные экспериментальные данные открывают возможность" поиска путей контроля и даже предупреждения развивающейся уже в раннем посмертном периоде дарадации важнейших липидных компонентов в различных отделах и структурах мозга.

Результаты исследований могут быть полезными не только в области биохимии терминальных состояний, в том числе для теории и практики ряда реанимационных мероприятий, но и иметь важное значение в оценке

молекулярпо-биохнмических параметров пол ииои ткани и условиях ее консервации и трансплантации, а также в судебно-медицинских, героптологнческнх и палеобиохиыических исследованиях.

В процессе работы был разработан метод быстрого и качественною получения образцов ткани мозга, а также модифицирован высокочувствительный способ анализа содержания Рлип. с помощью малахитового зеленого отечественного производства, по который оформлено 2 рацпредложения и получены акты на внедрение в Тверской государственной медицинской академии. Разработанные методы применяются также в учебной и научно-исследовательской работе студентов кафедры биохимии и биотехнологии Тверского государа венного университета. Новые данные об особенностях биохимических перестроек липндов в различных структурах мозга используются автором при лроведенни занятий со студентами кафедры, выполнении ими курсовых и дипломных работ, связанных с изучением изменений лнпидов мозга в ходе аутолиза.

Апробация работы. Основные положения диссертации и отдельные фрагменты работы докладывались и обсуждались на научной конференции профессорско-преподавательского состава и сотрудников Тверского государственного университета. - Тверь., 1993; VI симпозиуме по биохимии липидов. - Санкт-Петербург., 3 - 6 октября, 1994; научной конференции Тверской государственной медицинской академии "Современные вопросы диагностики Н лечения". - Тверь., 1994.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и списка литературы, включающего 159 источников, из которых 65 иностранных. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 14 рисунками и схемами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводились на беспородных белых крысах-самцах массой 170 - 250 г и на крысах-самцах линии Вистар массой 140 - 160 г. Животных забивали декапитацней. Аутолт тканевых срезов (серое и белое вещество) проводили в асептических условиях при Т = +37° Сив условиях 100% относительной влажности в течение 6 - 7 мин, I ч, 4 ч н 24 ч. Выделение субклеточных фракций мозга (синаптосомы, миелин, митохондрии) проводили по общепринятым методикам (Г>: Robertis Е., 1973, Прохорова Н.И., 1982). Исследования по аутолизу ультра структур проводились в 2-х вариантах: a) in \itro и б) после нахождения мозга в теле умерщвленного животного. Полученные суспензии ультраструктур инкубировали в стерильных плотно закрытых пробирках при Т = +37 °С в течение 10 мин, 40 мин, 4 и 24 ч. Во втором варианте головы животных оставляли в кювете при Trowt. и извлекали мозг спустя 10 и 40 мин с последующим выделением субклеточных фракций.

Выбор указанных сроков обусловлен следующими причинами: а) 0 ч (1,5-2 мин после дскапнтации) - исходное состояние ткани мозга; б) 6 - 7 мин, 10 мни - предполагаемое время клинической смерти; в) 40 мин, 1 и 4 ч - начальные этапы развития биологической смерти; г) 24 ч - развитие глубоких (как правило, необратимых) деструктивных процессов (Неговскнй В.А., 1987).

Экстракцию общих лннидов из ткани мозга проводили по методу Фолча и др. (Folch j. et at., 1957), а из субклеточных фракций по методу Блайя и Дайсра (Bligh Е., Dyer W., 1959). Содержание ОЛ и их фракций, ОФЛ и их отдельных представителей определяли экспрессными микро- и ультрамикрометодами с применением одномерной тонкослойной хроматографии на енлнкагеле (Грибанов г.а. и соавт., 1975 - 1977). Разделение фракций фосфолипидов субклеточных структур проводили модифицированным хроматографичсскйм методом (Кейтс М., 1975, Молочкина Е.М., 1992). Результаты обрабатывали статистически с использованием критерии Стьюдснта (Терсптьев П.В., Ростова U.C., 1977).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Характеристика и некоторые молекулярно-биохимические механизмы аутолитических изменений общих лишщов и их отдельных фракций в тканях и ультраструкгурах головного мозга крыс

Сводные данные об аутолитическнх изменениях ОЛ и их отдельных фракций в тканях (серое и белое вещество) и некоторых ультраструктурах (сннаптосомы, миелин, митохондрии) головного мозга крыс в условиях /я \iiro и после нахождения мозга в трупе животного представлены в табл. 1, 2 и на рис. 1 - 4.

Как видно из таблицы 1, на тканевом уровне содержание ОЛ в сером веществе претерпевало колебательные изменения возрастало через 6-7 мин аутолнза и снижалось 'нфез 1 и 4 ч инкубации. В белом веществе отмечено незначительное, но достоверное увеличение уровня О Л на всех сроках исследования.

Таблица I

Изменения содержания общих липидов серого и белог о вещества I оловного мозга беспородных крыс при аутолизе в условиях in vitro ________(вмг%),(п=4)_____

^CgOKH аутолнза

—— Оч 6-7 мин 1 ч 4 ч 24 ч

Ткань мотпР~—

Серое вещество 3302,0 ± 4150,0 ± 2250,0 ± 2532,5 ± 3697,0 ±

М±ш 299,6 57,2* 87,0* 28,6* 153,8

Белое вещество • 5009,0 ± 6254,3 ± 6759,0 ± 5591,8 ± 6002,3 ±

М ± m 218,0 107,8* 300,7 * 71,3* 225,0 *

Здесь и далее: звездочка - достоверные различия с контролем (0 ч) (р<0,05), п - число экспериментов.

При анализе результатов табл. 2 обращает на себя внимание тог факт, что уменьшение количества ОЛ субклеточных фракций головного мозга на всех изученных сроках посмертного аутолнза происходило лишь в синантосомах (в условиях in vitro и НМТ) и в миелине (in vitro). В митохондриях (I1MT) уровень ОЛ претерпевает колебательный характер изменений или не меняется (in vitro). Вместе с тем, при НМТ выявлено принципиальное различие в характере изменений содержания ОЛ для ми!пупнчрнп и миелина нн ранних, близких к клинической смерш чтянах

аутолиза. Earn в мнтохондриальнон фракции мозга количество OJi снижается уже через 10 мин, а затем возвращается к исходным значениям, го в миелине в этих условиях уменьшение OJ1 отмечено лишь к 40 мни нахождения мозга в голове умерщвленного дскапитанней животного.

Таблица 2

Изменения содержания общих лииидоп ультра структур головного мозга крыс линии Внстар при аутолнзе в условиях in vitro и при нахождении

мозга в трупе животного (НМТ) (в.тг/мл суспензии), (п = 3 - 4)

Условия и сроки аутолиза invitio НМТ

0ч 10 мин 40 мин 4 ч 24 ч 10 мни 40 мин

Ультраструк-

туры мозга

Синаптосомы 1101,3 + 762,3 ± 738,3 ± 612,7 ± - 884,0 ± 780,0 .+

М ± m 53,1 55,7 * 63,2* 43,8* 36,7* 46,0

Миелин 1601,0 ± 1196,0 ± 1057,0 ± 825,3 ± 908,3 ± 1557,0 ± 930,3 +

М ± m 40,6 42,7* 69,0* 51,4* 41,2* 81,1 46,9*

Митохондрии 704,0 ± 563,0 ± 636,0 ± 727,7 ± 737,3 ± 448,7 ± 692,7 ±

М±т 73,2 30,1 32,6 68,1 78,2 25,4*1 Я,1

Увеличение содержания OJ1 в мозговой ткани может быть обусловлено несколькими причинами. В раигне, близкие к периоду клинической, смерти сроки аутолиза в структурах мозга еще частично сохраняется синтетический потенциал, а также интенсифицируются гликолитичсские процессы (Гаевсквя М.С., 1963, Неговскин В.А., 1987). Возрастание содержания OJI в белом веществе, очевидно, связано и с уменьшением в нем относительного содержания холестерина на некоторых сроках аутолнза, которое может приводить к снижению ригидности неГфональных мембран; что вызывает увеличение подвижности мембранных липидов и является одной из причин усиления их экстрагируемое™.

Снижение уремия OJ1 на более поздних сроках аутолиза, вероятно, связано с увеличением активности ряда липолнтнческих ферментов. Однако, механизмы, вызывающие колебательный режим изменении содержания OJ1, одной из составляющих которого служит феномен "возврата'' уровня ОЧ к исходным значениям (серое вещество к 24 ч и митохондрии к 40 мин (НМТ)), могут быть более сложными, обусловленными изменением соотношения отдельных линндимх фракции

различных мозговых структур за счет трансацилазных и других реакний бнотрансформации их липидного компонента (Грибанов Г.А., 1986).

Как видно из рис. 1-4, характер изменений относительного содержания отдельных липидных фракций в изученных тканевых и ультраструктурах мозга при аутолизе имеет как сходные, так и во многих случаях различные черты. Практически все лишщные фракции при умирании мозга претерпевают ряд существенных и часто разнонаправленных изменений своего относительного содержания в завьсимости от сроков аутолиза и его модели.

В сером веществе мозга, где ФЛ меняются в колебательном режиме (рис. 1а), отмечено быстрое и достаточно резкое снижение содержания ФЛ уже через 6-7 мин аутолиза, Т.е. в период предполагаемой клинической смерти. Однако, затем наблюдается возрастание относительной концентрации ФЛ, достигающей к 4 ч инкубации уровня, близкого к исходным значениям, а через 24 ч доля ФЛ вновь уменьшается. "

б) белое вещество

сжк тг

50 40

ЭО-З 20 10 0

12345

ФЛ X СЖК 1Г эх Рис. 1. Изменения соотношения отдельных фракций липидов ткани серого (а) и белого (б) вещества головною мозга беспородных крыс при аутолизе, (п=4). По оси ординат - % от суммы фракций, по оси абсцисс - сроки аутолиза: I - 0 ч, 2 - 6-7 мин, 3 -1 ч, 4 - 4 ч, 3 - 24 ч.

Среди фракций, относительная концентрация которых при аутолизе снижается на всех его сроках, можно выделить ФЛ синаптосом (in vitro) (рис. 2а) и миелина (в условиях НМТ) (рис. 36). В остальных случаях содержание ФЛ снижается на более поздних сроках, увеличивается (в белом веществе (рис. 16)) или изменяется в колебательном режиме. Практически на всех сроках аутолиза в большинстве »пученных структур . происходит увеличение доли СЖК.

Обнаруженный феномен "возврата" относительного содержания ФЛ

к исходным значениям в динамике аутолиза проявляется не только в

отношении этого класса лниидов, но и других фракций. В сером и белом

веществе это явление было характерно' для X, ТГ, тогда как в

митохондриях и миелине - для ОЛ, X, частично СЖК и ГГ. Подобные

колебательные изменения относительного содержания некоторых

лнпндных фракций в динамике аутолиза 1п \itro были обнаружены ранее и

п других органах, тканях и их ультраструтурах (Грибанов Г.Л., 1986). 60-, 60 -

a) in vitro

б/ нмт

12 3 12 3

ФЛ X СЖК ТГ ЭХ ФЛ X СЖК ТГ эх

Рис. 2. Аутолнтическне изменения соотношения отдельных фракций лнпндов в синаптосомах головного мозга крыс линии Внстар в условиях in vitro (а) и НМТ (б), (п=3-4). По оси ординат - % от суммы фракций, но оси абсцисс - сроки аутолиза: 1 - 0 ч, 2 -10 мин, 3-40 мин.

гад

a) in vitro

¿i

AJffiL. о

б) нмт

12 3 4 5 123

ФЛ X СЖК ТГ - ЭХ ФЛ X СЖК ТГ эх

Рис. 3. Аутолитические изменения соотношения отдельных фракций лнпндов в миелине головного мозга крыс линии Вистар в-условиях in vitro (а) и НМТ (б), (п=3-4). По оси ординат - % от суммы фракций, по оси абсцисс - сроки аутолиза: I - 0 ч, 2 -10 мин, 3 - 40 мин, 4 - 4 ч, 5 - 24 ч.

Наблюдаемое в сером веществе и других структурах накопление ТГ и ЭХ свидетельствует о проявлении сложных метаболических отношений между ацнлеодержащнмн компонентами (ФЛ, ТГ, ЭХ) через общий пул СЖК и предполагает участие в иутолнтнчсскои деградации лнпндов

мозговой гкami не только гндролазных, но и хрансацнлазных механизмов (Грибанов Г.А., 1979).

eo-U'DL бо-

б) НМТ

X сжк тг

эх

Рис. 4. Аутолнтнческне изменения соотношения отдельных фракций липидов в митохондриях головного мозга крыс линии Висгар в условиях in vitro (а) и НМТ (б), (п=3-4). По оси ординат - % от суммы фракций, по оси абсцисс - сроки ауголнза: 1 - 0 ч, 2 -10 мин, 3-40 мин, 4 - 4 ч, 5 - 24 ч.

Возрастание содержания ЭХ с параллельным снижением уровня X, ФЛ, ТГ может быть свя: по с тем, что в ряде структур мозга (белое вещество, митохондрии) активно протекают реакции эстерификации X (Брокерхоф X., Дженсен Р., 1978), в которых используются СЖК, образующиеся, вероятно, при гидролизе ТГ, ФЛ. Вместе с тем, в поздние сроки в белом веществе мозга, миелине (in vitro) наблюдается выраженный гидролиз ЭХ с резким накоплением X и СЖК.

Таким образом, можно полагать, что при аутолизе в ранние, близкие к периоду клинической смер .и сроки в сером веществе головного мозга крыс активируются главным образом различные фосфолипазы, а в белом веществе - ТГ-липазы и холестеролэстеразы.

Анализируя изменения относительного содержания липидных фракций в ультраструктурах мозга (сннаптосомы, митохондрии, миелин) при аутолизе in vitro можно обнаружить в них проявление механизмов биодеградации и биотрансформации липидного компонента, сходных с выявленными в тканях мозга. Уже на ранних сроках аутолиза in vitro (10 мин) происходит снижение относительного содержания ФЛ в синаптосомах (рис. 2а) и миелине (рис. За). Липидный компонент митохондрии более устойчив к аутолизу в условиях in vitro на ранних его сроках и основные превращения липидов происходят в них начиная с 40 мин инкубации (рис. 4а).

Эксперименты на беспородных крысах показали накопление в синаптосомах на поздних сроках аутолиза in vitro (24 ч) фракции ДГ ирн параллельном уменьшении доли ФЛ, но не ТГ (Грибанов Г'.А., Ильяшенко Д.В., 1994). Выявленные колебательные перестройки линидпых фракций, наблюдаемые в ультраструктззах мозга при аутолизс in vitro, свидетельствуют о наличии, особенно в митохондриалыгои и мисзшнойои фракциях, не только гидролизных, но и трансацилазных механизмов деградации и биотрансформашш их лннйдтго компонента.

Условия НМТ в определенной стен ни видоизменяют характер аутолнтнчсскнх превращений липпдов в субклеточных фракциях головного мозга крыс. Так, в синаптосомах мозга крыс линии Внстар (рис. 26), в отличие от модели in vitro, наибольшую устойчивость, особенно на ранних (10 мин) сроках аутолиза, проявляют фракции X, ЭХ и частично ФЛ. Вместе с тем, если увеличение доли СЖК в синаптосомалыюй фракции при аутолизе in vitro связано с возрастанием в них фосфолпназной и холестсролэстеразной активности, то в условиях НМТ причиной накопления СЖК служит не только фосфолппа?пая, но и ТГ-липазная активность.

В отличие от синаптосомальной фракции в миелине (рис. 36) н в меньшей степени в митохондриях (рис. 46) головного мозга крыс в условиях нахождения мозга в трупе умерщвленного животного наблюдается более интенсивный распад ФЛ И снижение уровня X, сопровождаемые нарастанием доли СЖК и ТГ. Это позволяет предположить, что при JIMT в миелине наиболее выражены гидролитические механизмы деградации их липидного компонента. Обращает на себя внимание факт увеличения на ранних сроках аутолиза как в условиях in vitro , так и НМТ практически во всех исследованных структурах мозга уровня ТГ. Гистохимический анализ подтверждает образование в деструктирующейся нервной ткани гранул ТГ (Манина Д.Д., 1978).

Суммируя вышесказанное можно сделать вывод о том, что деградация липидоп в аутолизируюшихся тканевых и субклеточных

структурах мозга имеет сложный, часто разнонаправленный характер, зависит от сроков аутолнза, его модели (in vitro или НМТ) и происходит с участием не только гидролитических, но н трансацилазных и иных механизмов биотрансформацин лишщного компонента, включая повторное (рециклическое) использование некоторых молекулярных компонентой (СЖК, X и др.), главным образом, на этапах, где наблюдается феномен "возврата" относительного содержания ряда фракций к исходным значениям.

1. Характеристика и некоторые молекулярно-бнохимические

механизмы аутолитнческнх изменений общих фосфолипндов и их отдельных фракций в тканях и ультраструктурах головного мозга крыс

Результаты проведенных исследований по изучению изменений содержания суммарных ФЛ и их отдельных фракции в тканях (серое и белое вещество) и некоторых ультраструктурах (синаптосомы, митохондрии, миелин) головного мозга крыс в ходе аутолиза in vitro и после нахождения мозга в трупе животного приведены в табл. 3,4 и на рис. 5 - 8. .

Как видно из табл. 3, содержание общих фосфолипндов в ткани серого и белого вещества головного мозга крыс в динамике посмертного аутолиза претерпевает колебательные изменения. Вместе с тем, если в сером веществе при аутолизе чередуется снижение содержании ОФЛ с тенденцией "возврата" их концентрации к исходным значениям, то .в белом веществе наблюдается достаточно резкое возрастание содержания ОФЛ к 1 ч инкубации, которое может объясняться, очевидно, теми же причинами, что и в случае увеличения количества ОЛ в мозпшоГмкани при аутолизе (см. раздел 1).

В отличие от ткани мозга во всех изученных улыраструктурах (синаптосомы, миелин, митохондрии) (табл. 4) при аутолизе происходит снижение концентрации ОФЛ. Однако, в условиях НМТ для ФЛ ультраструктур мозга характерным было уменьшение их содержания уже на ранних сроках (10 мин и 40 мин), тогда как при ауюлнзе in vitro

количество ОФЛ снижается лишь на более поздних (начиная с 4 ч) этапах аутолш ической деструкции.

Таблица 3

Аутолитнческие изменения содержания общих фосфолипидов серого и белоги вещества головного мозга крыс линии Вистар в условиях in vitro __ (вмг %), (п = 4)

^Сцоки аутолиза

Оч 6-7 мин 1 ч 4 ч 24 ч

Ткань мозга -

Серое вещество 103,6 ± 95,5 ± 67,7 ± 82,2 ± 73,5 ±

М ±ш 8,9 4,8 5,4' 3,2 4,6*

Белое вещество 153,8 ± 163,4 ± 232,3 ± 160,0 ± 166,5 ±

М±т 6,2 10,3 U,г 7,4 6,8

Таблица 4

Аутолитичсскис изменения содержания общих фосфолипидов улырасгруктур головного мозга крыс линии Вистар в условиях in vitro и при нахождении мозга в трупе животного (I1MT) (вмкг Vma/мл суспензии),

_______ _______(п = 3 • 4)____________

Условия и сроки аутолиза in vitro нмт

0 ч 10 мин 40 МИН 4 ч 24 ч 10 мни 40 мин

Ультраструк-

туры мозга

Синаитосомы 3,2 ±0,2 2,9 ±0,2 2,9 ±0,1 1,1 ± - 2,7 ± 2,4 ±

М ± m ОД* 0,1* 0,1*

Миелин 4,5 ±0,2 4,6 ±0,2 4,1 ±0,2 2,9 ± 2,6 ± 3,4 ± 3,0 ±

М±ш 0,1' 0,1* 0,1* 0,2*

Митохондрии 2,1 ±0,2 2,0 ±0,1 1,8 ±0,2 1,4 ± 1,1 ± l,S ± 1,7 ±

Mira 0,1* 0,1* 0,1* 0,1*

Основными причинами снижения количества общих фосфолипидов и их отдельных фракций при посмертном аутошзе могут быть: 1) угнетение их синтеза, 2) активация распада с участием эндогенных фосфолиназ и других ферментов (McKlown S.,1979, Грибанов Г.А., 1979, Таранова П.П., 1488, O'Neill С., Fowler С., 1991, LmT.-A., LinT.-W. el al., 1992).

Из рис. 5 видно, чю в ауто) визирующихся тканях серого и белого вещества головного мо и а крыс более всего подвержены перестройка» (чаще в сторону уменьшения их относительного содержания) основные мембранные фракции ФХ, Ф">Л с одновременным нярастянпгч доли Т ЛФ,

ЛФЛ, ФК+ПГФ. Однако, изменения этих и ряда других фракций носяг, как правило, колебательный характер и отмечается феномен "возврата" их относительного содержания к исходным значениям, особенно к 1 ч и 4 ч 40

а) сср'ое вещество

*г

лй1

.т

1 23 4 5

ГЛФ ЛФЛ ФС+СФМ ФХ

б) белое вещество

* * г-, *Г

ФЭЛ ФК+ПГФ ФИ

12345

ГЛФ ЛФЛ ФС+СФМ ФХ ФЭЛ ФК+ПГФ ФИ Рис. 5. Изменения соотношения "отдельных фракций фосфолишщов в ткани серого (а) и белого (б) вещества головного мозга беспородных крыс при аутолизе (п- 4). Г1о оси ординат - % от суммы фракций; но оси абсцисс -сроки аутолнза : 1 - 0 ч, 2 - 6-7 мин, 3 - 1 ч, 4 - 4 ч, 5 - 24 ч.

аут от па.

II ссрон веществе мозга (рис. 5а) значительные изменения в составе фосфолитшиого компонента наблюдаются уже в ранние (6 - 7 мин), близкие к периоду клинической смерти сроки аутолнза, тогда как в белом веществе (рис. 56) распад ФЭА, ФХ н частично ФС+ СФМ с параллельным накоплением продуктов гидролиза ФЛ (ЛФЛ), а также ФК+ПГФ происходит в более поздние сроки (4 и 24 ч).

Основной причиной отмеченных изменении может быть повышение активности соответствующих эндогенных фосфолнпаз, причем, в сером веществе эти процессы наиболее интенсивно протекают на ранних (6-7 мин) и на значительно более поздних (4 и 24 ч) сроках аутолнза, а в белом веществе актиплцня фосфолнпаз в отношении ФЭЛ, ФХ происходит фгж шчески только к 4 ч аутолнза.

Возрастание содержания ФХ в мозговой гкани к 4 и 24 ч инкубации в сером и к 1 ч в белом веществе после предшествующего его снижения может быть связано с возможной трансформацией части ФЭЛ в ФХ. ГЬн этом не отмечет накопления продуктов гидролиза (ЛФЛ, ГЛФ). Увеличение содержания ФС+СФМ в сером веществе мозга к 4 и 24 ч ау тол inn происходит, вероятно, в результате образования рецнпрокной пары ФС-—ФЭА. Известно, что для некоторых фракций фосфолипидов есть нуш их образования, не связанные прямо г затратой энергии в виде ЦТФ, АТФ. Это прежде всего относится к ФС, СФМ, ФЭА и некоторым другим, которые могут образовываться в траисферазных реакциях с участием СОг, фосфорилхолина, метильных групп (Ilirata F., Axelrod J., 1980, Lakher M., Wurtman R., 1987, Соколова Г.П., 1991, Герасимова И.А., Емельянов H.A., 1991, Hovius R., Faber В. et al., 1992). Как было показано, в ряде органов, тканей и их ультраструктур в условиях аутолиза эти пути могут приобретать доминирующее значение (Грибанов Г.А., 1986).

Резкое повышение относительной концентрации ФК+Г1ГФ, особенно в белом веществе, сопровождающееся снижением доли ФХ, ФЭА, может объясняться возрастанием активности в динамике аутолиза фосфолипази Д, участие которой в распаде фосфолипидов обнаружено в тканях мозга (Bazan N.C., 1983, Mohn П., Chalifa V., et al., 1992).

Сопоставляя данные по изменению содержания ФК+ПГФ и ГЛФ, можно предположить, что возможными причинами таких превращений служит не только гидролитический распад ФЛ, но и другие реакции, в частности, ацилиронание ГЛФ с образованием ФК и далее ПГФ (Грибанов Г.А., 1979, Мок Amy Y.P. et al., 1990). Возрастание содержания ГЛФ может быть также связано и с образованием его из З-фосфопшперинопог о альдегида в результате усиления глнколитическнх 1троцессов в ходе посмертного аутолиза (особенно в первые 6-7 мин) в сером вещтие головного мозга крыс.

Отдельным аутолпзирующимся структурам мозга (рис. 6 - 8) свойственны не только сходные с тканевыми, но и определенные специфические перег ронки их фосфолииидното Компонента, в

синантосомах мозг а беспородных крыс при аутолизе in vilro, как было покачано /тми ранее (Грибанов I .A., Ильяшенко Д.В., 1994), обнаружена акпшацня гндролазных механизмов распада ФЛ уже к 1 ч инкубации. Эти процессы сопровождаются повышением содержания продуктов деградация ФЛ - ЛФЛ, ГЛФ и СЖК, очевидно, за счет возрастания активности фосфолипаз Ai, Аг, С, а также фосфолниазы Д.

, Обращает на себя внимание то, что в аутолнзирующихся синантосомах юловного мозга крыс, как и при старении (Фролькнс В.В. и соавт., 1991) увеличивается содержание ЛФЛ, ФС и ФЛ, а также значительно возрастает доля ФК. Эти данные свидетельствуют о возможном проявлении в ходе старения и при посмертном аутолизе некоторого сходства п механизмах трансформации фосфолнпидного компонента сннантосом головного мозга крыс.

Результаты экспериментов по изучению изменении фосфолнпидного компонента сннантосом головного мозга крыс линии Внстар на ранних (10 и 40 мин) сроках ;.утолнза in vitro (рис. 6а) свидетельствуют о том, что на этих сроках наибольшая устойчивость отмечается для холнпсодсржащих фракции (ФХ и СФМ), а также ЛФЛ. Снижение доли ФЭА и параллельное нарастание уровня ФС+ФИ, ГЛФ, а также Ф)< и ПГФ может свидетельствовать о проявлении в синантосомах при аутолизе in vitro не столько гндролазных, сколько сложных трансацилазных механизмов, влияющих на перестройки фосфолинидного компонента. ж

В условиях НМТ выявлено, что в синаптосомальной фракции мозга крыс на ранних этапах аутолиза фосфолннндный компонент также проявляет относительную стабильность (рис. 66). Однако, обнаруженные изменения отдельных ФЛ (ФХ, СФМ, ФЭА) сннантосом при НМТ имеют, очевидно, в своей основе механизмы, существенно отличные от условий in vitro. Гак, накопление ФХ к 10 и 40 мин аутолиза может быть связано как с уменьшением доли СФМ.на этих же сроках, так н с падением уровня ФЭА через 40 мин яуголшз, что сопровождается увеличением относительного количества ГЛФ. При этом, метаболические юлнмсотпошсиия между ФХ

и СФМ происходят, очевидно, с участием фосфорчлхолина (ФХ «- ФРХ <-

СФМ) (Грибанов Г.А., 1979). Несмотря на относительную устойчивость 40

302010

a) in vitro

jbSML

rliltlll

123

ГЛФ ЛФЛ СФМ ФХ ФС+ФИ ФЭА ПГФ ФК

40 30 20 10

еШ гяЛ

123

ГЛФ ЛФЛ СФМ ФХ ФС+ФИ ФЭА ПГФ ФК Рис. 6. Изменения содержания отдельных фракций фосфолипидов в синаптосомах головного мозга крыс линии Вистар при аутолизе в условиях in vitro (а) и НМТ (б), (п-3). По оси ординат - % от суммы фракций; по оси абсцисс - сроки аутолнза : 1 - 0 ч, 2 -10 мин, 3 - 40 мин.

фосфолнпидного компонента синаптосом головного мозга крыс на ранних аутолитических сроках, даже небольшие колебания фосфолнпидного компонента мембран, как следует из данных литературы (ЯоиПепЬе^ А., 1987, Бурлакова Е.В., 1990), могут приводить к значительному изменению заряда мембран, а также других физико-химических свойств, и, как следствие, нарушению функционально-регуляторных характеристик синаптосомальных мембран в результате изменения в них линид-липидных и линид-белковых взаимодействий.

Анализ изменений фосфолнпидного компонента других ультра структур (миелин, митохондрии) (рис. 7, 8) мозга свидетельствует о том, что при аутолтое в условиях т \itro на ранних сроках в этих субклеточных фракциях (особенно в митохондриях) часто происходят

более значительные изменения ФЛ, чем при нахождении мозга в трупе умерщвленного животного.

В миелине (яуголиз in vitro) при относительной стабшв.ностн фракций ФХ, ФС+ФИ наблюдается прогрессирующий распад ФЭА, согровождающинся нарастанием доли ЛФЛ и ФК (рис. 7а). В условиях НМТ фракции ФХ н ФС+ФИ миелина также сохраняют устойчивость, но накопление ЛФЛ (а к 40 мин и ГЛФ) н снижение одной из наиболее устойчивых ФЛ фракции - СФМ происходит уже к 10 мин аутолиза (рис. 76).

40 30 20 10 0

a) in vitro

СФМ ФХ ФС+ФИ ФЭА

б) НМТ

JLt

1 23

ГЛФ ЛФЛ СФМ ФХ ФС+ФИ ФЭА IIГФ ФК Рис. 7. Изменения содержания отдельных фракций фосфолипидов в миелине головною мозга крыс линии Dnciap при аутолнзе в условиях in vitro (а) и НМТ (б) (п=3). Но оси ординат - % от суммы фракций; но оси абсцисс - сроки аутолиза: 1 - 0 ч, 2 - 10 мин, 3 - 40 мин, 4 - 4 ч, 5 - 24 ч.

В митохондриях мозга (рис. 8) в динамике пуголнза in nito фосфолишщнми компонент, особенно с увеличением времени инкубации, претерпевает разнообразные перестройки, связанные как с фпсфолипазнымн механизмами, так и трансацшшзиыми реакциями биотрансформации отдельных фосфолинидпых фракций (ФХ, ФСМФИ и ФЭА). Дня некоторых из них (ФХ, ФО'ФИ) наблюдалась г.-пденци« к "возврату" их относительного содержания к 4 ч аутолтл (рис. "а).

">0

30 20 10 О

30 20 10 0

£М

1 2345

ГЛФ ЛФЛ

б) нмт

СФМ ФХ ФС+ФН ФЭА ПГФ ФК

lil . Llii

123

ГЛФ ЛФЛ СФМ ФХ ФС+ФИ ФЭК ПГФ ФК Рис. 8. Изменения содержания отдельных фракций фосфолннидов в митохондриях головного мозга крыс линии Вистар при аутолизе в условиях in vitro (а) и НМТ (б), (п^З). По оси ординат - % от суммы фракции; по оси абсцисс • сроки ауголнза : 1 - 0 ч, 2 - 10 мин, 3-40 мин, 4 -4 ч, 5 - 24 ч.

В условиях НМТ в митохондриях мозга большинство фракций ФЛ не претерпевают существенных изменений (рис. 86). Накопление доли ЛФЛ, ФК и снижение ПГФ может свидетельствовать о возможном вступлении этих фракций в сложные метаболические взаимоотношения с участием ГЛФ (Грибанов Г.А., 1979. Некоторое нарастание ЛФЛ, возможно связано с тенденцией к уменьшению в митохондриях относительного содержания ФЭА и ФХ.

Суммируя изложенное, можно считать, что фосфолипнды изученных тканевых и ультраструктур мозга в динамике посмертного аутолнза претерпевают сложные метаболические перестройки, основу которых могут составлять как гидролазные (особенно выраженные на ранних и более поздних сроках аутолпза, а для субклеточных фракций, главным образом, в условиях in ntro), так и трансферазные реакции с тенденцией к "возврату" количественно! о содержания ряда фракций к их исходным значениям (чате на промежуточных сроках - 1 и 4 ч). Вмепе г 1гм,

возможно не только "переключение", но и параллельное участие этих механизмов в ходе аутолнза.

Все это позволяет считать, что фосфолииидный компонент мозговых структур разного уровня в ходе посмертного аутолнза претерпевает разнообразные перестройки, степень выраженности которых зависит как от типа изученных структур головного мозга, так и модели аутолиза (in vitro или НМТ), его продолжительности.

Не исключено, что выявленные изменения лииидов в сером, а также в белом веществе и, особенно, в синаптосомах и других (миелин, митохондрии) структурах головного мозга могут существенно влиять на проявление ими физиологических функций уже на ранних этапах аутолиза, что, вероятно, не может не отразиться на степени обратимости (в ходе реанимации или трансплантации мозговой ткани) процессов аутолитическон деструкции мозговых структур разного уровня.

В связи с этим представляет интерес лоиск биорегуляторов различной хим-'ческон природы, способных видоизменять и даже предупреждать (приостанавливать) развивающуюся деградацию важнейших липидных компонентов в структурах мозга при его гибели. i

ВЫВОДЫ

1. . Содержание ОЛ в динамике посмертного аутолиза in vitro возрастает в

белом веществе, претерпевает колебательные изменения в сером веществе, снижается в ишаптосомах, миелине и не меняется *в митохондриях. В условиях нахождения мозга в трупе животного (НМТ) концентрация ОЛ уменьшается в синантосомах, в миелине к 40 мин и митохондриях к 10 мин аутолиза.

2. Количество ОФЛ в ходе аутолнза in vitro возрастает через 1 ч инкубации в белом веществе, уменьшается в сером веществе, синаптосомах, миелине и митохондриях, но только к поздним срокам. В условиях НМТ наблюдается снижение ОФЛ во всех исследованных ультраструктурах уже на ранних этапах аутолиза.

3. Отмечено возрастание относительного содержания ФЛ в белом веществе, в остальных структурах в ходе аутолиза выявляется, главным

образом,''снижение, а в ряде случаев колебательные изменения уровня

ФЛ. Доля свободного холестерина в иолышшстве структур

уменьшается уже на ранних сроках аутолнза. На поздних сроках концентрация X продолжает уменьшаться (кроме миелина) с параллельным увеличением на некоторых этапах доли ЭХ. Для ТГ характерно снижение их относительного содержания в белом веществе (кроме 4 ч), сшшптосомах (НМТ), а в остальных случаях количество ТГ возрастает или претерпевает колебательные изменения. Доля СЖК в ходе аутолнза, как правило, прогрессивно нарастает.

Г Изменения отдельных фракции ФЛ серого и белого вещества в ходе аутолнза in vitro носят колебательный характер. В большинстве случаев в сером, а на поздних сроках и в белом веществе, снижается относительное содержание ФХ, ФЭА с параллельным нарастанием продуктов гидролиза, а также ФК+ПГФ. На поздних сроках в сером веществе увеличивается количество ФС+-СФМ и снижается ФИ, тогда как в белом веществе происходят противоположные изменения этих фракций.

5. Во всех изученных ультраструктурах мозга при аугошпе in vitro снижается относительное количество ФЭА, а в митохондриях и ФХ, что сопровождается прогрессивным увеличением доли ЛФЛ, в ряде случаев ГЛФ, а также ФК и ПГФ. Фракция СФМ отличается стабильностью. В условиях НМТ распадаются в основном фракции ФЭА, СФМ. В митохондриях уменьшается доля ПГФ. В сннаптосомах увеличивается содержание ФХ и Г'ЛФ, в миелиие и митохондриях накапливаются продукты гидролиза ФЛ, а также ФК.

6. Изменения лииидного компонента в различных отделах н структурах головного мозга в ходе посмертного аутолнза могут иметь в своей основе гидролазные, трансферазные, а также иные механизмы биотрансформации линидов, включая повторное (рециклическое) использование некоторых молекулярных компонентов (СЖК, X и др.). При этом п динамике аутопитши .кого процесса набшодается как параллельное учяпие эшх механизмов, гак и своеобразное их

"переключение", сопровождающееся феноменом "возврата" относительного содержания ряда фракции к их исходным значениям через 1 ч и 4 ч аутолиза.

7. Наличие сложного комплекса биохимических механизмов деградации липидов при посмертном ауголизе дает возможность использования данных настоящего экспериментального подхода дня объяснения , пеоднотипностн и разновременности нарушений, развивающихся в различных отделах и структурах мозга при ею смерти.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Липидм серого и белого вещества головного мозга крыс при ауголизе //Воир. мед. химии. - 1993. - 39. - № 2. - С. 43-45. (Совместно с Грибановым Г.А.).

2. Новые данные о характере аутолитнческих изменений липвдного компонента различных отделов и ультраструктур головного мозга крыс /ТТез. докл. на) ш. конф. профессорско-прсподав. состава и сотрудников госбюдж. и хоздогов. тем ТвГУ. - Тверь., 1993. - С. 123-125. (Совместно с Грибановым Г.А., Бурлаковой Е.Б., Гумаргалнсвой К.З.).

3. Влияние фрагмента АКТГ4-10 ("Бетах") на динамику аутолитнческих изменений лнпидного компонента головною мозга крыс //Тез. докл. научи, конф. профессорско-прсподав. состава и сотрудников госбюдж. и хоздогов. тем ТвГУ. - Тверь., 1993. - С. 128-129. (Совместно, с Грибановым Г.А., Ашмарнным И.П., Головко М.Ю., Луцкой Н.В.).

4. Липнды сннаитичсскнх мембран головного мозга крыс при ауголизе //Воир. мед. химии. - 1994. - 40. - № I. - С. 49-51, (Совместно с Грибановым Г'.А., Бурлаковой Е.Б., Архнновой Г.В.).

5. Изменения фосфолипвдов серого и белого вещества головного мозга крыс в динамике посмертного аутолиза //Воир. мед. химии. - 1994. - 40. -№ 5. - С. 20-23. (Совместно с Грибановым Г.А.).

6. Лннилм митохондрий головного мозга крыс в динамике посмертного аутолиза //Материалы научн. конфер. ТГМА "Современные вопросы диагностики и лечения", - Тверь., 1994. - С. 38.

7. О различиях посмертной устойчивости сфингомнелинов некоторых ультраструктур головного мозга крыс в зависимости от модели аутолнза //VI симпозиум по биохимии липпдов. - Санкт-Петербург., 3-6 окт. 1994., Тезисы докладов, Москва, 1995. - С. 29-30. (Совместно с, Грибановым Г.А.).

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ АТФ - адепозинтрифосфат, ГЛФ - глииерофосч^аты, ДГ - длапилглинерпны, ЛФЛ - лнзофосфолппнды, OJ1 - общие линндм, ОФЛ - общие ф0С1[)0лнпиды, ПГФ - полипшцерофосфатиди, Рл„п - "липндный" фосфор,

СЖК - свободные (незстерифнпнрпванные) жирные кислош,

СФМ - сфпнгомнелины,

ТГ - триацилглпперины,

ФИ - фосфатнлилинознты,

ФК - фосфатидные кислоп i,

ФЛ - фосфолшшды,

ФЛаза - фосфолнпаза,

ФС - фосфатидплссрпны,

ФХ - фосфатпднлхолииы (лештшны),

ФЭА - фосфатиднлишюлгшиш ((кефалины),

X - холестерин,

1ГГФ - нитидинтрифосфа г,