Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тканеспецифический синтез рецептора церулоплазмина и его взаимодействие с церулоплазмином

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Тканеспецифический синтез рецептора церулоплазмина и его взаимодействие с церулоплазмином"

Р Г Б ОД

----- - ------- - -- ---- - ------- -------на правах рукописи----- --------------

САСИНА Людмила Константиновна

ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ РЕЦЕПТОРА ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА И ЕГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ЦЕРУЛОПЛАЗМИНОМ.

Специальность - 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (директор - академик Б.И. Ткаченко)

Научный руководитель:

доктор биологических наук Л.В.Пучкова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук , профессор В.П.Комов

кандидат биологических наук, вед. науч. сотр. А. П. Перевозчиков

Ведущая организация:

Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится" ХЗ* 1995 г.

в//ичасов на заседании Диссертационного Совета К.001.23.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при НИИ экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ РАМН (Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова, 12).

автореферат разослан 1995

г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета К.001.23.01 доктор биологических наук

О.Г.Куликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. Медь входит в состав ферментов, контролирующих __ такие __ жизненно ___важные „функции __ организма, __ как

окислительное фосфорилирование, синтез гормонов, формирование соединительной ткани, деятельность центральной нервной системы и многие другие (Brown et al. 1994). В то же время, ионы меди, являясь мощными окислителями, при прямом контакте повреждают все типы биомолекул. Поэтому многоклеточные организмы, в том числе и млекопитающие, должны на молекулярно-генетическом уровне решать вопросы, связанные как с упаковкой ионов меди в "безопасные оболочки", так и с их транспортировкой по межклеточным и внутриклеточным пространствам организма через мембранные барьеры клеток и внутриклеточных кемпзртментов. Нарушения работы любого звена в этом транспортном цикле, в зависимости от локализации поломки, приведет или к дефициту, или к накоплению токсических количеств меди в различных частях организма, что, по-видимому, является причиной разнообразных медьзависимых микроэлементозов, природа которых не ясна (Авцин и др., 1994).

Выяснение молекулярно-генетических основ таких заболеваний, и, следовательно, их лечение, может быть успешным только при полном знании кругооборота меди в организме. Однако, сведения о молекулярном механизме поступления, распределения и выведения меди в различных организмах и особенно у млекопитающих отрывочны.

Почти не вызывает сомнений, что универсальным транспортером меди по каналам межклеточных коммуникаций является медьсодержащий гликопротеин сыворотки крови - церулоплазмин (ЦП), белок, синтезирующийся в гепатоцитах (Ettinger, Darwish, 1986). К тому же, на поверхности некоторых клеток негепатоцитарного ряда обнаружен специфический рецептор ЦП (Harris, 1991 ). В то же время, о молекулярном механизме взаимодействия ЦП с его рецептором почти ничего не известно.

Изучение этого взаимодействия поможет понять механизм, обеспечивающий поступление ионов меди в клетку.

Целью данной работы является изучение молекулярного механизма взаимодействия ЦП со специфическим рецептором плазматических мембран и исследование клеточноспецифичной экспрессии гена рецептора ЦП в организме млекопитающих.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

1.Изучить связь между содержанием ЦП в среде роста и количеством рецептора ЦП на поверхности клеток, рост и функционирование которых в целом организме зависит от меди, доставляемой ЦП;

2. Проследить перемещение ЦП после его связывания с клеточной поверхностью;

3. Исследовать экспрессию гена рецептора ЦП в организме млекопитающих;

4.Сопоставить перемещение ЦП и импульсно-меченного рецептора ЦП в фибробластах и реконструировать в опытах на различных клеточных линиях межорганный маршрут пептидной части молекулы ЦП.

Научная новизна. В ходе работы установлено, что рецептор ЦП синтезируется только в клетках негепатоцитарного ряда, а количество его на клеточной поверхности регулируется по типу обратной связи уровнем ЦП в среде роста. Фибробласты интернализуют связанный с клеточной поверхностью ЦП, и, после трансклеточного переноса в составе мембранных везикул, освобождают его в культуральную среду. Выделяемый фибробластами ЦП приобретает способность связываться с клеточной поверхностью гепатоцитов, которые, интернализуют его и затем секретируют. В ходе трансклеточного переноса через гепатоциты ЦП значительно деградируется. Динамика и внутриклеточный маршрут 1251-ЦП и импульсно-меченого рецептора ЦП полностью совпадают. На основе полученных данных предлагается гипотетический молекулярный механизм, лежащий в основе межорганного транспорта ЦП и обсуждается возможный вариант взаимодействия между ЦП, рецептором ЦП и медьтранспортной АТР-азой Р1-типа, продуктом гена болезни Вильсона.

научно-практическое значение. Полученные в диссертации данные о клеточно-специфической экспрессии гена рецептора ЦП и регуляции его экспрессии по обратному типу могут быть использованы для описания новых нозологических форм медных микроэлементозов наследственного и приобретенного происхождения. К тому же, антитела к рецептору ЦП, полученные в ходе выполненной работы, являются диагностическим тестом для установления молекулярной природы специфических нарушений экспрессии гена рецептора ЦП.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Синтез рецептора ЦП носит тканеспецифический характер и зависит от содержания ЦП в среде роста клеток.

2. ЦП после связывания с рецептором клеточной поверхности фибробластов интернализуется, модифицируется и, после трансклеточного переноса, освобождается в культуральную среду. Выделяемый фибробластами ЦП приобретает способность связываться с поверхностью гепатоцитов, интернализуется, частично деградируется и вновь секретируется.

3. Межорганный маршрут молекул ЦП обеспечивает доставку меди к клеткам негепатоцитарного ряда и, возможно, выведение определенной ее части из организма через желчь.

Апробация диссертации. Результаты диссертации опубликованы в двух статьях и доложены на Первом Российском съезде медицинских генетиков, Москва, 14-16 декабря 1994 г., что отражено в материалах съезда.

Структура диссертации. Диссертация изложена на страницах, состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы, использованные в работе, методы исследования, Результаты и их обсуждение, Заключение и Выводы. Список цитируемой литературы включает Z/^5 работьС Диссертация содержит 6 схем, 4 таблицы, 17 рисунков.

Материалы и методы исследования.

В работе были использованы следующие материалы: эритроцитарная масса человека, приобретенная на станции переливания крови № 1, г. Санкт-Петербург, электрофоретически чистый препарат ЦП человека, произведенный институтом эпидемиологии и микробиологии им. Луи Пастера МЗ России, культура фибробластов линии НТ-1080, первично полученная из фибросаркомы человека, конфлуентная культура кг.оток линии CV-1, первично полученная из почек зеленой мартышки и линия клеток OKP-GS, первично полученная из карциномы почки человека, предоставлены банком клеточных культур ЦИН РАН, клетки HepG2 из гепатобластомы человека предоставлены сотрудниками Отдела биохимии НИИЭМ РАМН, образцы крови здорового донора и больного сиалидозом-1, получены из клиники НИИЭМ РАМН.

Среда ДМЕМ для выращивания клеточных культур, эмбриональная сыворотка теленка и посуда для культивирования клеток - фирмы Flow Laboratories. Сефадекс G-25, сефароза 2В и ДЕАЕ-сефароза, ДЭАЭ-сефадекс А-50 и лектин из проростков пшеницы, коньюгированный с сефарозой 6МВ -фирмы Pharmacia, агароза тип V - фирмы Sigma Реактивы для электрофореза и конканавалин А из Canavalia ensiformis - фирмы Serva. Неорганические соли -- фирмы Merk. Вторые антитела получены из Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, РАМН.

В работе использованы радиоизотопы: 1"l-Na, 30 mCi/ml ( Российский научный центр "Прикладная химия"), 14С-гидролизат хлореллы, 1 mCi/ml (Чехословакия), смесь 14С-аминокислот, 54 mC¡/mA (Amersham, Англия), нитроцеллюлозные фильтры, размер пор 23 мкм ( фирмы Serva, Германия). Клетки культивировали в монослое, для выращивания использовали среду-1: среда ДМЕМ, содержащая 10% сыворотку теленка, 0.03% глютамата и 50 мкг/мл гентамицина, и среду-2: среда-1 со сниженным содержанием ЦП. Для истощения по ЦП, содержащегося в эмбриональной сыворотке теленка в концентрации 3 мг%, проводили 60-минутную преинкубацию 10% раствора сыворотки в ростовой среде ДМЕМ с ДЭАЭ-сефарозой. После процедуры истощения методом иммуноблотинга полипептиды ЦП быка не обнаруживаются. При неспецифическом окрашивании гелей на белок разницы в электрофоретических профилях белков среды-1 и среды-2 не выявлялось.

Для изучения связывания и интернализации молекулы ЦП клетки инокулировали на пластиковые чашки различного, в зависимости от

требований эксперимента, диаметра в количестве 2х104 клеток/см2 поверхности и выращивали в 0,1 мл среды-1 на 1 см2 поверхности в течение суток при 37° С в атмосфере 5% СОг. Затем среду -1 сливали, клетки трижды ополаскивали солевым буфером (0,15М NaCI с 10 мМ Na, К, Pi - буфера, рН7,4) и добавляли 0.1 мл/см2 среды-2. Клетки росли еще 48 часов.

Связывание 1251-ЦП ( удельная радиоактивность-ЗхЮ6 имп'1/мин.мкг"1) с поверхностью клеток проводили при 0°С в течение 16 часов в среде ДМЕМ с 3% BSA в присутствии 125"1-ЦП ( 5x106 имп/мин в 1 мл среды ). Для изучения интернализации к клеткам, после процедуры связывания добавляли среду-1 и инкубировали их при 37°С. Для отделения ,251-ЦП, находящегося на клеточной поверхности, от интернализованного ЦП, клетки промывали холодным солевым раствором и инкубировали в 0,1 мл на см2 поверхности в растворе 50 мМ NaCI, 10 мМ HEPES, рН7,4, с 4 мг/мл декстрансульфата в течение 60 мин при 0°С. Радиоактивность 1251-ЦП, освобождаемая с клеточной поверхности декстрансульфатом, принималась как фракция ЦП, связанного с поверхностью клеток. Клетки ополаскивали и лизировали раствором 1М NaOH с 5% SDS. Радиоактивность 1251-ЦП, обнаруживаемая в клетках, принималась как интернализующая активность клеток. Количество 1251-ЦП, подвергающегося деградации, определяли по радиоактивности в низкомолекулярной фракции среды культивирования ( Tamita et al., 1987 ).

Поверхность клеток, культивируемых в монослое, рассчитывали как общую площадь элипсоида вращения по формуле 4л<г>2.

Выделение субклеточных фракций проводили методом

дифференциального центрифугирования. При центрифугировании гомогената клеток при 2000 об/мин в течение 5 мин получали осадок-1, главным образом содержащий ядра и плазматическую мембрану. Образовавшийся супернатант центрифугировали 20 мин при 18 000 об/мин. Получали осадок-2, содержащий митохондрии, лизосомы, пероксисомы и значительную часть эндоплазматической сети. Супернатант, включающий клеточный сок, свободные полирибосомы и разнообразные по функции, но небольшие по размеру мембранные везикулы, был третьей субклеточной фракцией -цитозоль. Клеточный гомогенат также фракционировали методом флотации в ступенчатом градиенте сахарозы ( Fleischer и Fleischer, 1969). Препарат ЦП из сывороток крови здорового донора и больного сиалидозом-1 получали методом ионообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-сефадексом А-50 (Захарова и др.,1984).

Сравнительный анализ углеводных цепей ЦП проводили с помощью аффинных лектинов: коиканавалина А и лектина из проростков пшеницы (ЛПП).

Апиквоту ЦП, инкубированную с ЛПП-сефарозой, центрифугировали при 2000 об/мин. Супернатант собирали и обозначали как фракцию - (ЛПП)" .

Осадок дважды промывали физиологическим раствором и инкубировали с N-ацетилглкжозамином в течение 1 часа при комнатной температуре. Элюат отбирали после" центрифугирования - при 2000 об/мин.-5- - -мин и обозначали как фракцию - (ЛПП)*. Молекулярную гетерогенность выявляли стандартным методом двумерного иммуноэлектрофореза.

Выделение рецептора ЦП производили из свежей эритроцитарной массы доноров методом аффинной хроматографии (Barnes и Frieden. 1984) Препарат рецептора ЦП использовали для иммунизации кроликов породы Шиншилла. Иммунизацию проводили 4-кратным с двухнедельным интервалом внутрикожным введением зоны ПААГ, содержащей рецептор ЦП. Специфичность единственной белковой зоны поепарата рецептора ЦП подтверждалась данными лигандного связывания с ""(-ЦП (Пучкова и соав.,1991). На 10 день после 4-й иммунизации кровь собирали, из сыворотки ступенчатым высаливанием сульфатом аммония получали фракцию иммуноглобулинов, которую, после диализа, лиофилизировали.

Для иммунопреципитации субклеточные фракции ресуспендировали в солевом буфере, содержащем 1% тритона Х-100 и 0.5 % SDS и 10"4 фе-нилметилсульфонилфторид. Добавляли соответствующие антитела до конечной концентрации 0,1 мг/мл и инкубировали при 0°С в течение ночи, затем, в избытке по отношению к первым (50'1). добавляли вторые антитела. После инкубации при 37:С в течение 1 часа иммунопреципитат собирали центрифугированием и дважды промывали солевым буфером. В иммунопрецилитате определяли радиоактивность или анализировали их методом электрофореза

Электрофорез проводили в 7.5% ПААГ ( Маурер, 1974 ) Для молекулярно-весового анализа использовали метод электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (Laemmli. 1970). ЦП иодировали химическим способом с хлорамином Т. Содержание белка определяли по методу Лоури. Радиоактивность 14С и 1251 определяли в сцинтилляционном счетчике Racbeta ( LKB ). Флуорографию гелей для усиления сигнала радиоактивных изотопов углерода и серы проводили по следующей схеме. Гель после электрофореза вымачивали дважды по 15 мин в ледяной уксусной кислоте и 60 мин в ледяной уксусной кислоте, насыщенной 2,2-фенилметилоксазолом. Затем гель промывали в проточной воде до нейтрального pH, высушивали и авторадиографировали. Для усиления радиоактивного сигнала 1251 гели выдерживали в полиэтиленгликоле-6 000 до уменьшения площади примерно в 4 раза; затем высушивали и авторадиографировали.

Результаты исследования и их обсуждение.

Изучение взаимодействия ЦП человека с клеточной поверхностью проводили на конфлуентных культурах клеток линии CV-1. Как показывают

результаты на рис.1А, ,251-ЦП связывается с поверхностью клеток CV-1, культивируемых в монослое. Связывание носит насыщающий и высокоаффинный характер. Клетки, культивируемые на среде-2 с низким содержанием ЦП, сохраняют способность к высокоаффинному связыванию, характеризующемуся кинетикой насыщения. В то же время выращивание клеток на ЦП-дефицитной среде увеличивает их способность к связыванию ЦП почти в 2 раза. Графический анализ связывания ЦП в координатах Скэтчарда показал (рис.1 Б), что, независимо от условий культивирования, клетки CV-1 обнаруживают почти одинаковое сродство к ЦП ( Кд = 97 нМ и 65 нМ ЦП, соответственно, для среды-1 и среды-2 ). Однако, количество мест связывания для ЦП на поверхности клеток, экспоненциально растущих на среде-2, почти в 2 раза больше, чем на поверхности клеток, выращенных на среде-1, и составляют 110x10® и 1В0х103 на клетку, соответственно.

Увеличение способности клеток к связыванию 1251-ЦП происходило пропорционально времени культивирования клеток на среде-2. Оказалось что, ЦП крысы эффективно конкурирует с ЦП человека за места связывания на поверхности клеток CV-1. Эти данные свидетельствуют об отсутствии у млекопитающих строгой видовой специфичности взаимодействия ЦП с клеточной поверхностю.

Связывание, интернализация и деградация ЦП клетками CV-1 были измерены при 0-4°С и при 37°С. Оказалось, что ЦП-связывающая активность поверхности клеток не зависит от температуры и составляет примерно 105 молекул ЦП на клетку. В этом независимом измерении количества мест связывания ЦП на поверхности клетки, получена величина, которая совпадает с таковой, вычисленной графическим способом (рис 1). После 150 мин инкубации клеток в условиях интернализации (37°С) внутри обнаруживается почти в 3 раза больше ЦП, чем при 0°С (соответственно 8x104 и 3x10* молекул ЦП на клетку). В среде после инкубации клеток с радиоактивным ЦП при обеих температурах практически отсутствовали кислоторастворимые продукты деградации 1251-ЦП.

10 20 30 1.U

Рис.1. Связывание 1251-ЦП с поверхностью монослоя клеток линии CV-1 при 0°С (А) и графический анализ этого связывания по методу Скэтчарда {Б).

Клетки линии CV-1, 10* клеток, инокулированных в 0.2 мл среды-1. высевали в каждую из 24 ячеек многоячеечной чашки Петри. Через сутки в половине ячеек среду-1 заменяли средой-2 и культивировали все клетки еще 40 часов. Среду сливали, клетки ополаскивали солевым буфером и в каждую ячейку добавляли по 0,2 мл среды ДМЕМ, 3% BSA, и 1251-ЦП в количестве от 2 до 150 нг, соответственно. Для учета неспецифического связывания 1251-ЦП в ячейки добавляли 100-кратный избыток немеченого ЦП ( от 0,2 до 15 мкг в соответствующие ячейки ). Инкубацию проводили в течение ночи при 0°С. Культуральнуга среду собирали, осветляли центрифугированием 5 мин при 5000 об/мин и в аликвотах определяли количество несвязавшегося 1251-ЦП. Клетки тщательно отмывали 7-кратным ополаскиванием солевым буфером, а затем лизировали. В аликвотах определяли количество связавшегося ,251-ЦП. Клетки культивировали на среде-1 (•—•) или на среде-2 (•--•). По осям абсцисс; А - количество добавленного 1г51-ЦП, нг Б - количество связанного ЦП (фемтаграмм на 1 клетку). По осям ординат: А - количество связанного радиоактивного ЦП монослоем клеток в ячейке, нг; Б- отношение связанный ЦП/свободный ЦП, %.

Другие линии клеток негепатоцитарного ряда, а именно культуры клеток почек человека линии OKP-GS и фибробластов линии НТ-1080, также как и CV-1 клетки, связывают ЦП человека при О0С в насыщающих концентрациях и с высокой аффинностью. При 37°С происходит интерналиэация связанного 1251-ЦП. Количество мест связывания ЦП на поверхности этих клеток увеличивается более чем в 2 раза. Клетки линии SW 837, первично полученные из карциномы прямой кишки человека, не связывали 1251-ЦП.

Представленные в этом разделе результаты показывают, что клетки почек и фибробласты, как и другие клетки негепатоцитарного ряда (Harris, 1991), содержат на поверхности специфический рецептор ЦП. Взаимодействие ЦП с рецептором этих клеток характеризуется высоким сродством. Размер Кд, полученный в наших опытах, соответствует диапазону величин Кд для клеток других органов и тканей млекопитающих (Harris, 1991). Максимальная ЦП-связывающая способность фибробластов, выращенных в полной среде, составляет примерно 100103 молекул ЦП на клетку. Средняя плотность рецепторов на мкм2 клеточной поверхности фибробластов составляет около 20 молекул. Для эритроцитов эта величина равна примерно 1 молекуле рецептора на 1 мкм2 поверхности. Разница в содержании рецептора ЦП на поверхности различных клеток, по-видимому, отражает особенности функционирования дифферинцированных клеток и может варьировать в широких пределах. Концентрация рецепторов в различных клетках изменяется от 0,7 пмоль/мг белка в сердце эмбриона цыпленка до 280 000 пмоль/мг белка в гранулоцитах человека (Harris, 1991).Тканеспецифические особенности метаболизма меди, по-видимому, проявляются также в отсутствии рецептора ЦП в клетках линии SW 837.

Принципиально новыми данными о взаимодействии ЦП с рецептором являются, во-первых, увеличение количества мест высокоаффинного связывания ЦП на поверхности клеток при снижении уровня ЦП в среде роста. Они позволяют заключить, что регуляция количества рецепторов ЦП на поверхности клеток осуществляется по типу обратной связи, как это происходит для рецепторов интернализирующего класса, например, рецептора трансферрина, или рецептора аполипопротеинов низкой плотности. Второе наблюдение состоит в том, что молекула ЦП не подвергается заметной деградации и после 2,5 часов интернализации.

Изучение передвижения ЦП в клетках человека было предпринято на линии фибробластов НТ-1080. Так как при культивировании клеток НТ-1080 в среде с низким содержанием ЦП в течение 40 часов количество 1251-ЦП, связывающегося с клеточной поверхностью значительно увеличивается, последующие опыты проводили на фибробластах с индуцированным содержанием рецептора ЦП.

Детальное изучение динамики интернализации ,251-ЦП в фибробластах показало (рис.2А.а), что молекулы ЦП. связавшиеся с экстрацеллюлярной поверхностью фибробластов. остаются -доступными __ для _ конкурентного вытеснения декстрансульфатом в течение 90 мин. после смены температуры связывания (0°С) на температуру интернализации (37°С). В следующие временные интервалы пептидная часть молекулы ЦП обнаруживается внутри клетки, но не на ее поверхности. При этом прослеживается тенденция к уменьшению содержания 1261-ЦП в клетке. Так. через 2.5 часа инкубации при 37°С в клетке обнаруживаеся лишь незначительное количество радиоактивных пептидов ЦП (рис. 2А,в). Представленные данные показывают, что пептидная часть молекулы 1251-ЦП значительное время находится внутри клетки. При этом она не претерпевает изменений в размере.

Анализ среды культивирования фибробластов, предпринятый с целью обнаружения в ней 1251-ЦП, показал, что через 150 мин. после начала интернализации в среде обнаруживается основная часть ЦП, связавшегося с поверхностью фибробластов, а затем перенесенного внутрь клеток ( рис.2В). Через 180 мин. завершается перенос меченого ЦП через внутриклеточное пространство с клеточной поверхности в среду инкубации.

По крайней мере, два обстоятельства обращают на себя внимание в результатах, представленных на рис.2А Это. во-первых, отсутствие повторного связывания выделенного в среду 1251-ЦП с клеточной поверхностью фибробластов, что выражается в отсутствии 1251-ЦП в декстрансульфатной фракции через 2 часа инкубации при 37сС. и. во-вторых, - незначительная деградация полипептидной цепи ЦП в течение внутриклеточного переноса,

Последующий анализ 1251-ЦП. подвергшегося трансклеточному переносу, методом электрофореза в ПААГ показал. что электрофоретические свойства молекулы ЦП практически не изменились. После трансклеточного переноса полипептидная цепь ЦП остается глобулой с тем же суммарным зарядом, что и нативный ЦП ( рис. 2С ).

На рис.2D представлены результаты, показывающие, что нативные молекулы 1251-ЦП не связываются с поверхностью гепатоцитов линии HepG2. Напротив, "51-ЦП после трансклеточного переноса через фибробласты очень эффективно поглощаеся гепатоцитами, интернализуется, а затем выделяется ими (рис.2Е). Уже через 30 мин. после начала инкубации при 37°С 1251-ЦП, связавшийся с клеточной поверхностью гепатоцитов. обнаруживается внутри клеток, а через 90 мин. значительные количества его оказываются в инкубационной среде, При этом накопления в клетках 1251-ЦП не происходит.

Таким образом, перенос ,251-ЦП через гепатоциты носит специфический характер. Это выражается во-первых, в том, что гепатоциты селективно связывают и поглощают только те молекулы ЦП, которые подверглись трансклеточному переносу через фибробласты, и, во-вторых, в том, что

а 1 2 з ¡t s i»

a "f •

-щ - i

)

'2345 Ь 723«

Рис.2. Клеточноспецифическое связывание ЦП.

АДинамика связывания и интернализации ,251-ЦП фибробластами линии НТ-1080. а - декстрансульфатная фракция; е - клеточные лизаты; 1,2,3,4,5 -время культивирования клеток при температуре интернализации. 30,60,90,120, и 150 мин, соответственно. Стрелкой показано положение BSA в геле.

B.Молекулярно-весовой анализ 1251-ЦП, освобождаемого фибробластами после интернализации. Клетки НТ-1080 после связывания с '251-ЦП отмыты и перенесены в условия интернализации, через 120 мин среда культивирования собрана и заменена свежей, процедура повторена дважды с 30 минутными интервалами. Электрофорез проводили в ПААГ-ДС-Na, стрелкой показано положение BSA в геле. 1 - аликвота среды, в которой проводили связывание 1251-ЦП с клетками НТ-1080; 2 - то же, через 120 мин после начала интернализации; 3 - то же, через 150 мин; 4 - то же, через 180 мин.

C.Электрофоретическая подвижность иодированного ЦП, освобождаемого фибробластами. Дорожки 1, 2 и 3 соответсвуют дорожкам 1, 2 и 4 в разделе рис. 2В. Стрелка показывет положение в геле нативного ЦП.

D.Отсутствие связывания и интернализации нативного 1251-ЦП клетками HepG2. 1 и 2 - декстрансульфатная фракция; 3 - аликвота среды, в которой проводилось связывание ,251-ЦП с клетками HepG2, 4 и 5 - клеточный лизат; 1 и 4 -клетки подвергались только процедуре связывания; 2 и 5 - через 120 мин культивирования в условия интернализации.

E.Клетки линии HepG2 связывают и интернализуют 1251-ЦП, освобожденный после трансклеточного переноса в фибробластах. 1, 2 и 3 -декстрансульфатная фракция после 30, 60 и 90 мин интернализации соответственно; 4, 5 и 6 - клеточный лизат; 7 и 8 - среда культивирования через 30 и 90 мин после начала интернализации.

динамика переноса через гепатоциты отличается от динамики переноса 1251-ЦП через фибробласты. В отличие от последней она не имеет 1ад-периода и может быть охарактеризована как 'Транзит бе; ~~гановки"

Молекулярно-весовой анализ ':51-ЦП, поглощенного и освобожденного в ростовую среду клетками линий НерС2. показывает (рис.2£), что в гепатоцитах ЦП подвергается значительной протеолитической деградации. На электрофореграммах он представлен, главным образом, полипептидами с молекулярной массой примерно 24 кДа Возможно,что при этом молекула ЦП еще остается единой глобулой, так как даже более глубокая протеолитическая деградация ЦП, вызванная длительным хранением его препаратов, не вызывает разрушения глобулы ЦП ( Ной.фах и др., 1232 ).

Представленные выше результаты отчетливо указывают на изменения в структуре молекул ЦП, освобождаемых в среду роста после трансклеточного переноса через фибробласты. Наиболее вероятной является версия, что молекула ЦП в фибробластах утрачивает остатки сиаловой кислоты. В пользу этого свидетельствуют следующие факты: асиало-ЦП эффективно поглощается гепатоцитами с помощью группо-специфического рецептора асиалогликопротеинов, и утрата остатков сиаловой кислоты является первым этапом ступенчатой протеолитической деградации гликопротеинов.

Прямой химический анализ "51-ЦП. освобожденного из фибробластов. затруднен вследствие его незначительного количества, с одной стороны, и уже имеющейся химической модификации (иодирование), с другой, Косвенным доказательством того, что ЦП в клетках негепатоцитарного ряда подвергается десиалированию, могут служить сравнительные данные о молекулярной микрогетерогенности ЦП, циркулирующего в кровотоке здорового донора и больного сиалидозом-1 - генетическим дефицитом лизосомальной нейраминидазы (Т^еШоуа е1 а1., 1987). По данным двумерного иммуноэлектрофореза гликопротеины альфа,-антитрипсин и орозомукоид, которые функционируют в кровотоке, у здорового и больного, не отличаются (данные не приводятся). Сравнительный анализ препаратов ЦП, частично очищенных методом ионнообменной хроматографии на колонке с ДЭАЭ-сефадексом, показал, что ЦП в сыворотке здорового донора распределяется в виде почти равноплечного пика X (рис.3). В препарате ЦП, выделенного из сыворотки больного сиалидозом-1 при анализе методом двумерного иммуноэлектрофореза на левом плече четко выявляется обгоняющая зона У. Обработка препаратов ЦП хелатирующим агентом, удаляющим из молекулы ЦП слабо ассоциированную медь, приводит к появлению быстро двигающегося пика У. В пике У ЦП больного сиалидозом-1 в зоне истощения образуется еще один преципитационный пик, которого нет у здорового донора (зона ¿Г). Эти данные однозначно указывают на относительно большую молекулярную микрогетерогенность ЦП больного сиалидозом-1. Оба препарата ЦП одинаково

Рис. 3. Сравнительный анализ методом двумерного иммуноэлектрофореза ЦП сыворотки здорового донора (А) и больного сиалидозом-1 (В)

1 - препарат ЦП, диализованный при 4°С в течение ночи против 0.05М №-ацетатного буфера, рН 5.5;

2 - то же, диализный буфер содержит 0.1М ЭДТА;

3 - (ЛПП)'-фракция ЦП.

взаимодействуют с конканавалином А (данные не приводятся). Не обнаружена разница во фракции обоих ЦП, не связывающихся с пектином из проростков

пшеницы" (данные также" не приводятся): Отчетливая - разница между ЦП----------

здорового и больного выявляется в составе фракции, связывающейся с пектином из проростков пшеницы. Видно, что при нарушении внутриклеточного десиалирования, которое имеет место у больного, препарат сывороточного ЦП более гетерогенен. Данные позволяют предположить, что наблюдаемая гетерогенность обусловлена присутствием молекулярных форм ЦП. передавших атомы меди в клетки негепатоцитарного ряда, но не потерявших сиаловые остатки во время трансклеточного переноса. Приведенные данные косвенно подтверждают, что ЦП попадает в клетки различных органов и затем высвобождается в кровоток. Во время нахождения в клетке молекула ЦП десиалируется.

Электрофоретически чистый препарат рецептора ЦП был использован для иммунизации кроликов с целью получения специфических антител. Ракетный иммуноэлектрофорез лизата мембран эритроцитов против антител к рецептору ЦП при высоких концентрациях как антител в геле, так и белка в образце, обнаружил единственную зону преципитации (рис. 4А).

Результаты, представленные на рис.4,4 показывают, что фибробласты содержат белок, иммунологически идентичный рецептору ЦП из мембраны эритроцитов. Основная доля обнаруживаемого в фибробластах рецептора ЦП сосредоточена во фракции, содержащей плазматическую мембрану. Во фракции внутриклеточных мембран обнаруживается некоторое количество иммунореактивных полипептидов рецептора ЦП. Их меньше, чем в осадке-1, и по абсолютному содержанию (иммунопреципитационная зона ниже), и по удельному содержанию иммунореактивного белка (в образце общего белка в три раза больше). Невозможно точно судить об относительном количестве рецептора ЦП в этих фракциях по высоте иммунопреципитационной зоны, так как Эйв, который нельзя удалить из образца, искажает геометрию преципитационной ракеты. Во всяком случае, с уверенностью можно сказать, что во фракции внутренних мембран фибробластов. по крайней мере, в 10 раз меньше рецептора ЦП, чем во фракции, содержащей плазматическую мембрану. Поэтому, присутствие рецептора ЦП в осадке-2 может быть отнесено за счет перекрестного загрязнения фракции. В цитозольной фракции рецептор ЦП не обнаруживается. Приведенные данные показывают, что рецептор ЦП в фибробластах локализован на плазматической мембране и иммунологически сходен с рецептором ЦП из эритроцитов.

Преинкубация фибробластов с атителами к рецептору ЦП в течение ночи при 0°С полностью предотвращает связывание 1251-ЦП с клеточной поверхностью (рис.4В). Неспецифические иммуноглобулины не влияют на связывание ЦП с клетками. Эти данные позволяют заключить, что:

и

Рис. 4. Внутриклеточная тканеспецифическая локализация рецептора ЦП.

A.Ракетный иммуноэлектрофорез субклеточных фракций НТ-1080 против антител к рецептору ЦП, выделенного из эритроцитов человека. 1 - 35 мкл осадка-1, 1 мг белка в 1 мл; 2 - 35 мкл осадка-2, 3 мг белка в 1 мл; 3 - 35 мкл цитозоля, 4 мг белка в 1 мл; 4-35 мкл препарата рецептора ЦП, 0.01 мг белка в 1 мл. Агарозный гель содержит 1 мг/мл антител, 40 мг/мл ПЭГ, 0.8% тритона Х-100.

B. Конкурентное связывание 1251-ЦП и антител к рецептору ЦП с поверхностью фибробластов. Монослой клеток линии НТ-1080 в течение 16 часов инкубировали с антителами к Ьсгкомплексу цитохромов из митохондрий крысы (1) и с антителами к рецептору ЦП (2), клетки отмывали и проводили связывание с 1251-ЦП, вновь отмывали, лизировали, и лизат анализировали в ПААГ-ДС-Ыа, гель радиоавтографировали.

C. Радиоавтограф иммуноэлектрофореза субклеточных фракций, выделенных из фибробластов и гепатоцитов против антител к рецептору ЦП. 1-4 - фибробласты линии НТ-1080; 5-8 - гепатоциты линии НерС2; 1 и 5 -осадок-1, плазматическая мембрана: 2 и 6 - осадок-2, эндоплазматический ретикулум; 3 и 7 - цитозоль; 4 и 8 - культуральная среда. Примерно 10е клеток в стационарной фазе роста культивировали на минимальной среде в присутствии смеси '4С-аминокислот в течение 3-х часов, клетки собирали, гомогенизировали и фракционировали.

1.Рецептор ЦП в организме человека не характеризуется тканеспецифичностью;

2.Молекулы ЦП взаимодействуют име^*- Г со"специфическим~ рецептором.-----------------

локализованным на плазматической мембране;

3. По-видимому, молекула рецептора ЦП имеет экстрацеллюлярный

иммунореактивный домен, который участвует в связывании ЦП

Данные о тканеспецифическом характере связывания ЦП полностью подтверждаются результатами изучения экспрессии гена рецептора ЦП на уровне синтеза белка в клетках линий НТ-1080 и HepG2 (рис.4С). Результаты иммуноэлектрофореза импульсно меченных 14С-белков из фибробластов и гелатоцитов показывают, что экспрессия гена рецептора ЦП происходит в фибробластах, но не имеет места в клетках линии HepG-2 которые синтезируют тот же набор белков, что и нормальные гепатоциты. В отличие от данных, представленных на рис.4Д новосинтезированный рецептор ЦП обнаруживается в фибробластах не только во фракции плазматических мембран, но и в цитозольной фракции. Это может объясняться присутствием меченого рецептора в мембранных везикулах, осуществляющих перенос ЦП через фибробласты. Условия эксперимента, (длительное мечение в течение трех часов), возможно, способствуют появпению меченого рецептора ЦП внутри клеток. Новосинтезированный рецептор ЦП не обнаруживается во фракции мембран эндоплазматического ретикул ума. что подтверждает предположение, что он присутствует в ней только как примесь, а незрелые молекулы рецептора ЦП. которые должны присутствовать в этих мембранах, методом ракетного иммуноэлектрофореза не выявляются.

Внутриклеточная топография синтеза и посттрансляционное перемещение молекулы рецептора ЦП были изучены в "пульс-чейз" эксперименте. Клетки метили в течение 40 мин. - времени, примерно необходимом для: а) - синтеза полипептидной цепи, содержащей примерно 1000 аминокислотных остатков: б) - включения и созревания углеводной цепи; в) - достижения новосинтезированным белком плазматической мембраны. Затем мечение останавливали и наблюдали за перемещением радиоактивного рецептора ЦП в субклеточных фракциях, идентифицируя его с помощью антител.

Данные рис.54 показывают, что после 40 мин мечения при нулевом времени чейза основная радиоактивность, связанная с молекулами рецептора ЦП обнаруживается во фракции мембран эндоплазматического ретикулума Это вполне ожидаемый результат, так как. чтобы оказаться на плазматической поверхности, рецептор ЦП должен синтезироваться на мембраносвязанных полирибосомах и на ранних этапах трансляции секвестрироваться в мембраны эндоплазматического ретикулума, где он также подвергается гликозилированию. То, что через 40 мин. лишь часть молекул рецептора ЦП

достигает поверхности фибробластов, показывает, что этого срока недостаточно для синтеза внутриклеточного созревания и транспорта рецептора ЦП к месту функционирования. Через 60 мин. чейза новосинтезированный рецептор ЦП практически полностью сосредотачивается на плазматической мембране. Значительное количество его продолжает оставаться здесь и через 1 АО мин чейза.

На поздних сроках чейза наблюдается накопление 14С-рецептора ЦП в цитозольной фракции. Этот результат согласуется с данными, что при длительном мечении радиоактивность, связанная с рецептором ЦП, определяется не только в плазматической мембране, но и в цитозоле (рис.4С). Через 140 мин чейза в культуральной среде происходит накопление 14С-рецептора ЦП. Данные, представленные на рис.5А, подтверждаются результатами молекулярно-весового анализа иммунопреципитатов, содержащих меченый рецептор ЦП. Рецептор ЦП, преципитированный из плазматических мембран, представлен специфическими полипептидами с мол.массой 67, 47 и 19 кДа (Пучкова и др.,1991). Полипептиды рецептора ЦП, иммунопреципитируемые из культуральной среды, имеют молекулярную массу, примерно соответствующую минимальному, 19 кДа. протеолитическому фрагменту рецептора ЦП (данные в автореферате не приводятся). Возможно, что отсутствие пика преципитации на рис.4С объясняется тем, что этот полипептид не способен образовывать нерастворимый иммунный комплекс.

Данные о посттрансляционном перемещении рецептора ЦП были сопоставлены с динамикой перемещения меченого ЦП через фибробласты. Результаты, полученные при анализе пути внутриклеточного перемещения 1251-ЦП после связывания его с поверхностью фибробластов показали, что 1251-ЦП после интернализации и до освобождения из клетки обнаруживается в цитозольной фракции рис.5А. Таким образом, присутствие в цитозольной фракции интернализованного ЦП и обнаружение там новосинтезированного рецептора ЦП имеют одинаковую временную зависимость.

В отдельном исследовании фибробласты после связывания с 1251-ЦП были культивированы при 37°С 120 мин, но клетки фракционировали не методом дифференциального центрифугирования, а методом флотации в ступенчатом градиенте сахарозы (рис.5С). Оказалось, что основная часть ,251-ЦП связана с фракциями на границе 33% сахарозы, где аккумулируются флотирующие элементы. По-видимому, обнаруживаемые в цитозоле ,251-ЦП и 14С-рецептор ЦП содержатся в мелких мембранных пузырьках (рецептосомах), выполняющих функцию транспортных везикул. Приведенные данные показывают также, что перемещение 1251-ЦП и '4С-рецептора ЦП в фибробластах происходит синхронно и по одному маршруту. Он начинается эндоцитозом на плазматической мембране и через систему транспортных

р

Рис.5.Внутриклеточное перемещение рецептора ЦП и ,;51-ЦП в фибробластах.

A.Динамика перемещения пульс-меченого ,4С-рецелтора ЦП в фибробластах.

1 - осадок-1; 2- осадок-2; 3 - цитозоль, 4 - культуральная среда

По оси абсцисс - время от начала мечения, мин; по оси ординат -радиоактивность в иммунопреципитатах, %.

B.Гистограмма динамики внутриклеточного перемещения 1251-ЦП, интернализованного фибробластами.

1 - через 60 мин после начала интернализации: 2 - через 120 мин, то же;

а - осадок-1; в - осадок-2; с - цитозоль. По оси ординат - радиоактивность 1г51-ЦП, %.

C.Определение плотности субклеточной фракции фибробластов, содержащей ,251-ЦП. через 120 мин интернализации.

По оси абсцисс - фракции, составляющие ступенчатый градиент сахарозы, как указано на схеме пробирки; по оси ординат - радиоактивность ,г51-ЦП.

(имп /мин) х10"2

везикул завершается экзоцитозом. В результате трансцеллюлярного переноса молекулы ЦП модифицируются и после освобождения из фибробластов могут поглощаться гепатоцитами.

ВЫВОДЫ.

1.Поверхность клеток негепатоцитарных рядов, исключая клетки кишечника, содержит специфические места связывания для ЦП. Связывание носит насыщающий характер и высокоаффинно,

Гепатоциты не связывают нативный, не модифицированный ЦП.

2.Снижение содержания ЦП в среде культивирования индуцирует увеличение количества мест связывания ЦП на поверхности клеток примерно в два раза. Кинетический характер связывания при этом не изменяется.

3.ЦП, связывающийся с клеточной поверхностью фибробластов и почек интернализуется и, без видимой протеолитической деградации, освобождается клетками в среду культивирования.

4.Трансклеточное перемещение молекулы ЦП осуществляется в мембранных везикулах и сопровождается модификацией молекул ЦП, что выражается в утрате способности последними связываться с поверхностью фибробластов, и в появлении способности узнаваться, связываться и интернализоваться гепатоцитами.

5.Рецептор ЦП не демонстрирует высокой видовой или клеточной специфичности. Однако, экспрессия гена рецептора ЦП носит выраженный тканеспецифический характер. Рецептор ЦП не синтезируется в гепатоцитах и синтезируется в фибробластах.

6.Пульс-меченые молекулы рецептора ЦП, локализованные на клеточной мембране, совершают передвижение внутрь клетки, по времени и компартментализации полностью совпадающими с маршрутом молекулы ЦП, после интернализации фибробластами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Пучкова Л.В., Сасина Л.К.,Алейникова Т.Д., Гайцхоки B.C. Внутриклеточный ЦП -подобный белок млекопитающих. Бюлл. эксп. биол. и мед. 1, 83-85, 1994.

2.Пучкова Л.В., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д., Гайцхоки B.C. Специфическое взаимодействие церулоплазмина с рецептором, локализованным на поверхности клеток линии CV-1. Бюлл. эксп. биол. и мед. 4, 417-420, 1995.

3. Сасина Л.К., Алейникова Т.Д., Захарова Е Т.. Шавловский М.М.. Гайцхоки B.C., Пучкова Л.В. Регуляция высокоаффинного связывания церулоплазмина человека с поверхностью плазматической мембраны клеток CV-1. Тезисы I Российского съезда медицинских генетиков, Москва, 14-16 декабря, часть 2, стр. 217, 1994.

4. Пучкова Л.В., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д. Предполагаемый механизм переноса ионов меди из крови в клетки через систему церулоплазмин-рецептор церулоплазмина. Там же, часть1, стр.47.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сасина, Людмила Константиновна

Список сокращений

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Общая характеристика группы микроэлементов.

2.2. Биологическая роль меди.

2.3. Механизмы, контролирующие баланс меди в клетках различных организмов.

2.3.1. Контроль баланса меди у микроорганизмов.

2.3.2. Поступление, распределение и выведение меди у млекопитающих. 2.3.2.1 .Роль печени в метаболизме меди у млекопитающих. 2.3.2.2.Церулоплазмин и его роль в осуществлении печенью центральной роли в метаболизме меди.

2.4. Врожденные ошибки метаболизма меди.

2.5. Идентификация и частичная характеристика рецептора ЦП.

2.6. Внутриклеточные медьсвязывающие белки.

3. Материалы, использованные в работе.

4. Методы исследования.

4.1. Клеточные линии и условия культивирования.

4.2. Измерение связывания, интернализации и деградации 1251-ЦП.

4.3. Определение площади клеточной поверхности.

4.4. Электрофоретический анализ связанного, интернализованного и выделенного клетками !251-ЦП.

4.5. Фракционирование клеток.

4.6. Анализ препарата ЦП сыворотки крови.

4.7. Выделение рецептора ЦП.

4.8. Иммунопреципитация.

4.9. Аналитические методы.

5. Результаты и их обсуждение.

5.1. Перенос молекулы ЦП по каналам внутриклеточной и межклеточной коммуникаций.

5.1.1. Взаимодействие ЦП с плазматической поверхностью клеток линии СУ-1 и его регуляция по типу обратной связи.

5.1.2. Изучение внутриклеточного перемещения 1251-ЦП, связавшегося с клеточной поверхностью.

5.1.3. Молекулярно-весовой анализ 1251-ЦП, связанного, интернализованного, а затем освобождаемого фибробластами в среду культивирования.

5.1.4. Свойства 1251-ЦП, освобождаемого фибробластами.

5.1.5. Предполагаемый механизм межорганного переноса ЦП у млекопитающих.

5.2. Роль специфического рецептора во внутриклеточном транспорте

ЦП в клетках негепатоцитарного ряда.

5.2.1. Сравнительный анализ антигенных свойств рецептора ЦП из эритроцитов и фибробластов.

5.2.2. Тканеспецифический синтез рецептора ЦП.

5.2.3. Анализ перемещения новосинтезированного рецептора ЦП в фибробластах.

5.2.4. Внутриклеточное перемещение интернализованного ЦП.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Тканеспецифический синтез рецептора церулоплазмина и его взаимодействие с церулоплазмином"

Актуальность темы. Медь входит в состав ферментов, контролирующих акие жизненно важные функции организма, как окислительное юсфорилирование, синтез гормонов, формирование соединительной ткани, еятельность центральной нервной системы и многие другие (15,39,60,92). В то же ремя, ионы меди, являясь мощными окислителями, при прямом контакте овреждают все типы биомолекул. Поэтому многоклеточные организмы, в том исле и млекопитающие, должны на молекулярно-генетическом уровне решать опросы, связанные с упаковкой ионов меди в "безопасные оболочки" и с их ранспортировкой, как по межклеточным и внутриклеточным пространствам »рганизма, так и через мембранные барьеры клеток и внутриклеточных :омпартментов. Нарушение работы любого звена в этом транспортном цикле, в ависимости от локализации поломки, приведет или к дефициту, или к [акоплению токсических количеств меди в различных частях организма, что, южет быть, и, по-видимому, является, причиной разнообразных медьзависимых «икроэлементозов, природа которых не ясна (1).

Выяснение молекулярно-генетических основ таких заболеваний, и, :ледовательно, их лечение, может быть успешным только при полном знании сругооборота меди в организме. Однако, сведения о молекулярном механизме юступления, распределения и выведения меди в различных организмах и особенно у млекопитающих отрывочны.

Почти не вызывает сомнений, что универсальным медьтранспортным Зелком по каналам межклеточных коммуникаций является медьсодержащий ^ликопротеин сыворотки крови - церулоплазмин (ЦП), белок, синтезирующийся в гепатоцитах (33,90,100,118). К тому же установлен факт существования специфического рецептора ЦП на поверхности некоторых клеток негепатоцитарного ряда (31,82,119). В то же время почти ничего не известно о молекулярном механизме взаимодействия ЦП с его рецептором.

Изучение этого взаимодействия поможет понять механизм поступления энов меди в клетку.

Целью данной работы является изучение молекулярного механизма (аимодействия ЦП со специфическим рецептором плазматических мембран и ^следование особенностей экспрессии гена рецептора ЦП в организме лекопитающих.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи. Изучить связь между содержанием ЦП в среде роста и количеством рецептора !,П на поверхности клеток, рост и функционирование которых в целом организме 1висит от меди, доставляемой ЦП;

Проследить судьбу ЦП, связавшегося с поверхностью клеток егепатоцитарного ряда;

Исследовать экспрессию гена рецептора ЦП в организме млекопитающих; .Сопоставить перемещение ЦП и импульсно-меченного рецептора ЦП в (ибробластах и реконструировать в опытах на различных клеточных линиях ежорганный маршрут пептидной части молекулы ЦП.

Научная новизна. В ходе работы установлено, что рецептор ЦП интезируется только в клетках негепатоцитарного ряда, а количество его на леточной поверхности регулируется по типу обратной связи уровнем ЦП в среде оста. Фибробласты интернализуют связанный с клеточной поверхностью ЦП, и, осле трансклеточного переноса в составе мембранных везикул, освобождают его культуральную среду. Выделяемый фибробластами ЦП приобретает пособность связываться с клеточной поверхностью гепатоцитов, которые, [нтернализуют его и затем секретируют. В ходе трансклеточного переноса через епатоциты ЦП значительно деградируется. Динамика и внутриклеточный тршрут 1251-ЦП и импульсно-меченого рецептора ЦП полностью совпадают. На >снове полученных данных предлагается гипотетический молекулярный механизм, [ежащий в основе межорганного транспорта ЦП и возможный вариант аимодействия между ЦП, рецептором ЦП и медьтранспортной АТР-азой 1-типа, мембранным транспортером меди.

Научно-практическое значение. Полученные в диссертации данные о теточно-специфической экспрессии гена рецептора ЦП и регуляции его сспрессии по обратному типу могут быть использованы для описания новых эзологических форм медных микроэлементозов наследственного и риобретенного происхождения. К тому же, антитела к рецептору ЦП, олученные в ходе выполненной работы, являются диагностическим тестом для :тановления молекулярной природы специфических нарушений экспрессии гена ецептора ЦП.

Основные положения выносимые на защиту. , Синтез рецептора ЦП носит тканеспецифический характер и зависит от эдержания ЦП в среде роста клеток. ЦП после связывания с рецептором клеточной поверхности фибробластов нтернализуется, модифицируется и, после трансклеточного переноса, свобождается в культуральную среду. Выделяемый фибробластами ЦП риобретает способность связываться с поверхностью гепатоцитов, нтернализуется, частично деградируется и вновь секретируется. . Межорганный маршрут молекул ЦП обеспечивает доставку меди к клеткам егепатоцитарного ряда и, возможно, выведение определенной ее части из рганизма через желчь.

Апробация диссертации. Результаты диссертации опубликованы в 2-ух гатьях и доложены на Первом Российском съезде медицинских генетиков, Москва, 14-16 декабря 1994 г., что отражено в материалах съезда.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 93 страницах, состоит з разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы, использованные в работе, Методы исследования, Результаты и их обсуждение, Заключение и Выводы, "писок цитируемой литературы включает 133 работы, (иссертация содержит: 4 схемы, 2 таблицы, 17 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Сасина, Людмила Константиновна

Выводы.

Поверхность клеток негепатоцитарных рядов, исключая клетки кишечника, одержит специфические места связывания для ЦП. Связывание носит асьпцающий характер и высокоаффинно. Гепатоциты не связывают нативный, Щ.

Снижение содержания ЦП в среде культивирования индуцирует увеличение оличеств мест связывания ЦП на поверхности клеток примерно в два раза, "инетический характер связывания при этом не изменяется.

ЦП, связывающийся с клеточной поверхностью фибробластов и почек нтернализуется и, без видимой протеолитической деградации, освобождается, летками в среду культивирования.

Трансклеточное перемещение молекулы ЦП осуществляется в мембранных езикулах и сопровождается модификацией молекул ЦП, что выражается в утрате пособности последними связываться с поверхностью фибробластов и в оявлении способности узнаваться, связываться и интернализоваться гпатоцитами.

Рецептор ЦП не демонстрирует высокой видовой или клеточной специфичности, »днако, экспрессия гена рецептора ЦП носит выраженный тканеспецифический арактер. Рецептор ЦП не синтезируется в гепатоцитах и синтезируется в ибробластах.

Пульс-меченые молекулы рецептора ЦП, локализованные на клеточной ембране, совершают передвижение внутрь клетки по времени и эмпартментализации полностью совпадающими с маршрутом молекулы ЦП, осле интернализации фибробластами.

Заключение.

Представленные результаты однозначно показывают, что ведущая роль в вязывании ЦП поверхностью клеток негепатоцитарного ряда принадлежит пецифическому рецептору, локализованному на плазматической мембране этих леток. Полученные в работе данные позволяют заключить, что рецептор ЦП тносится к классу мембранных рецепторов интернализующего типа. Его □держание в клетке регулируется количеством лиганда в среде роста по типу братной связи. Рецептор ЦП синтезируется в клетках негепатоцитарного ряда, ен рецептора ЦП не экспрессируется в гепатоцитах и в клетках кишечника, озможно, что отсутствие рецептора ЦП на поверхности клеток кишечника редотвращает реабсорбцию ЦП, экскретируемого гепатоцитами в желчь и, таким бразом, обеспечивается выведение ионов меди, упакованных в молекулы ЦП :елчи (33). В пользу такого предположения свидетельствуют данные, что у ольных болезнью Вильсона медь в желчи, в отличие от здоровых людей, не вязана с ЦП, находится в низкомолекулярной фракции, не выводится с екалиями, а реабсорбируется кишечнике (80). Тканеспецифический характер репрессии гена рецептора ЦП выражается не только в наличии или отсутствии эответствующего белкового продукта в клетках данного типа, но и в различной лотности молекул рецептора ЦП на единицу площади клеточной поверхности ифференцированных клеток негепатоцитарного ряда.

После интернализации обе молекулы, и ЦП и его рецептор, претерпевают згласованный во времени и по внутриклеточной локализации транспорт, эторый завершается высвобождением фрагмента рецептора ЦП и глобулы олекулы ЦП во внеклеточное пространство. Появление фрагмента молекулы щептора ЦП в среде культивирования фибробластов наводит на мысль о эзможном участии этого фрагмента в регуляции поступления ионов меди в тетки негепатоцитарного ряда. Молекулярный механизм может состоять в 1едующем. Так в наших опытах клетки культивировали в условиях, здуцирующих увеличение количества рецепторов ЦП на клеточной поверхности низкий уровень ЦП в среде роста), а затем, после процедуры голодания и пульс-[ечения на минимальной среде, клетки культивировали на полной среде. Сочетание большого числа рецепторов на клеточной поверхности и достаточного ровня ЦП в среде роста приводят к быстрому насыщению клетки необходимым оличеством ионов меди. В результате, чтобы прекратить их поступление в летку, происходит физиологическое "слущение" гидрофильных доменов ецепторов в экстрацеллюлярное пространство. Здесь "слущенный" фрагмент с ысокой аффинностью может связываться с лигандом, в данном случае с ЦП, и, аким образом, через метаболический шунт "снижать" концентрацию последнего среде.

Появление фрагмента рецептора ЦП в культуральной среде, возможно, меет другое объяснение. Известно, что связывание ЦП с рецептором эпровождается обязательной специфической протеолитической модификацией оследнего и в присутствии ингибиторов сериновых протеаз не происходит (22). озможно, гидрофильный экстрацеллюлярный фрагмент рецептора ЦП остается вязанным с ЦП во время трансклеточного переноса и освобождается вместе с ним культуральную среду.

Освобожденный фибробластами ЦП, в отличие от нативного, распознается, зязывается, интернализуется и затем экскретируется гепатоцитами. Вероятно, что риобретение ЦП свойства узнаваться гепатоцитами является следствием одификации ЦП, которой он подвергает в фибробластах. Косвенным указанием, го такой модификацией может быть десиалирование ЦП, является тот факт, что кровотоке больного сиалидозом-1 с дифицитом лизосомальной нейраминидазы иркулирует отсутствующая у здоровых людей молекулярная форма ЦП. Эта орма по подвижности в агарозном геле соответствует ЦП, утратившему ионы еди, чувствительные к хелатирующему агенту, но, в отличие от таковой у моровых людей, она сохраняет способность связываться с лектином из роростков пшеницы. По-видимому, ЦП, доставивший ионы меди в клетки згепатоцитарного ряда, теряет остатки сиаловых кислот во время рансклеточного везикулярного переноса. Возможно, что эта модификация делает Щ узнаваемым для орозомукоидного рецептора, локализованного на :лазматической мембране гепатоцитов, который высокоэффективно связывает ;есиалированные гликопротеины крови (70).

Полученные результаты, с учетом имеющихся в литературе данных, :озволяют реконструировать кругооборот молекулы сывороточного ЦП в организме млекопитающих, предположительный маршрут которого представлен :а схеме 4. ЦП сывортки крови синтезируется только в гепатоцитах (10) на юмбраносвязанных полирибосомах (66). В ходе внутриклеточного озревания молекула ЦП подвергается специфическому протеолизу (отщепление игнального пептида) и насцентному гликозилированию (105,106). В юмбранах эндоплазматического ретикулума в молекулу ЦП встраиваются томы меди (113), введение которых в зрелую молекулу ЦП осуществить не дается. В молекуле ЦП атомы меди представлены тремя типами, отличающимися друг от друга по спектральным характеристикам (28). Упаковка :х в пространственно организованной белковой глобуле ЦП не известна. Однако, шогими исследованиями подтверждено, что часть атомов ЦП меди так крепко вязана с молекулой ЦП, что не удаляется из нее никакими воздействиями (48). {ля дальнейших рассуждений важно отметить, что ЦП осуществляет благодоря томам меди, встроенным в его молекулу две важные функции. Это перенос меди к юдьзависимым ферментам клеток негепатоцитарного ряда и окисление ионов селеза в трансферрине. Возможно, что к клеткам транспортируются легко ссоцированные с молекулой ЦП атомы меди, а атомы меди, участвующие в >кислении, остаются связанными с пептидной частью молекулы ЦП до полного ее атаболизма.

Формирование сложных по составу разветвленных углеводных цепей юлекулы ЦП, завершается в мембранах аппарата Гольджи.

Новосинтезированный нативный ЦП не связывается с поверхностью епатоцитов, но он эффективно узнается специфическим рецептором лазматических мембран клеток негепатоцитарного ряда. После связывания ЦП нтернализуется этими клетками. При +37°С ЦП остается на поверхности вязавших его клеток в течении примерно полутора часов. О событиях, роисходящих в это время ничего неизвестно. Но с высокой долей вероятности южно предположить, что в это время на клеточной поверхности происходит пастеризация комплексов ЦП с его рецептором. Возможно, что в это время роисходят и другие важные события, связанные с метаболизмом меди. Известно, то атомы меди, находящиеся в составе ЦП, поступают в клетки независимо от ептидной части молекулы ЦП (79). Поэтому возможно, что после фиксации ЦП а поверхности клеток с помощью специфического рецептора, он оказывается элиженным с медьпереносящим мембранным каналом АТР-азы гена болезни 1енкеса. В результате сближения легко ассоциированная медь ЦП поступает по аналу АТР-азы к её медьсвязывающим доменам, а пептидная часть молекулы ЦП недиссоциирующими атомами меди поступает в составе первичной эндосомы в петку. Затем из поздних эндосом формируются рецептосомы, в составе которых [Д переносится через клетку и освобождается в кровоток. Во время нахождения в оздних эндосомах молекула ЦП теряет остатки сиаловых кислот, что делает ее знаваемой для рецептора асиалогликопротеинов на поверхности гепатоцитов. [П вновь оказывается в гепатоцитах, но на этот раз в системе компартмента ембранных везикул трансклеточного переноса, которые выделяют его в желчь, тим объясняется присутствие в желчи частично деградированного, но тособного к окислению парафенилендиамина и ортодианизидина, лвороточного ЦП (126).

Таким образом, АТР-аза гена болезнни Менкеса обеспечивает поступление энов меди в клетку. Это предположение хорошо согласуется с фактом, что при эвреждении гена, кодирующего этот белок, нарушается поступление меди в 1етки (102).

Возможно, что во время трансклеточного переноса в клетках ¡гепатоцитарных рядов ЦП связывает также и атомы меди, которые

79 освобождаются из медьзависимых внутриклеточных ферментов после их атаболизма в процессе аутофагии. Так могла бы быть решена проблема ыведения меди из этих клеток.

Выдвигаемое предположение предусматривает независимые нутриклеточные пути для пептидной части молекулы ЦП и атомов меди, ринесенных ею. Согласно предположению, уже в периферической части цитозоля томы меди оказываются упакованными в медьсвязывающие домены АТР-азы 4енкеса, из которых они могут быть мобилизованы цитозольным ЦП-подобным елком (18,106) и в дальнейшем, доставлены к мембранным компартментам летки. Если бы атомы меди попадали в эндосомы вместе с молекулой ЦП, как го происходит с атомами железа, для них нужны были бы дополнительные нутриклеточные переносчики.

Разобщение легкоассоциированных атомов меди, предназначенных к оставке в клетки негепатоцитарного ряда, и атомов меди, недиссоциирующих из олекулы ЦП, представляется целесообразным в условиях, когда белок редназначен для выполнения двух функций, которые обеспечиваются одним эфактором. Возможно, особенности кругооборота ЦП отражают событие рипликации предкового гена ЦП и дальнейшей специализации доменов цноцепочечной молекулы ЦП.

Схема к. Предположительный маршрут перемещения пептидной части молекулы ЦП в организме млекопитающих.

Обозначания на схеме: I -гепатоцит II- фибробласт

БРМ - плазматическая мембрана гепатоцитов, обращенная в кровь

СРМ - плазматическая мембрана гепатоцитов, обращенная в желчный проток

N -ядро

М - митохондрия

ЕЯ - эндоплазматический ретикулум в - аппарат Гольджи

ЕЕ - ранняя эндосома

ЬЕ - поздняя эндосома

ТУ - транспортная везикула

БУ - секреторная везикула

Р- пэтчи

ИСи -комплекс меди с гистидином СР - церулоплазмон бСР - секретируемый ЦП ЬСР - ЦП желчи

СР' - ЦП, освобождаемый экстрагепатическими органами Си - медь

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сасина, Людмила Константиновна, Санкт-Петербург

1. Баранов B.C., Шварцман А.Л., Горбунова В.Н., Гайцхоки B.C. Применение специфических ДНК-зондов для картирования гена церулоплазмина на хромосомах крысы методом прямой гибридизации. Генетика, 21, 1:23-30, 1985.

2. Варфоломеев С.Д., Зайцев C.B. Кинетические методы в биохимических исследованиях, M ГУ. М., стр. 180-299,1982.

3. Васильев В.Б., Шавловский М.М., Нейфах С.А., Прозоровский В.А. Внутримолекулярная гомология церулоплазмина. Биоорган.химия 5,10451052,1979.

4. Вернадский В.И. Биогеохимические очерки. Проблемы биогеохимии. М. Наука, 1980.

5. Гайцхоки B.C., Воронина О.В., Денежкина В.В., Плисс М.Г., Пучкова Л.В., Шварцман А.Л., Нейфах С.А. Экспрессия гена церулоплазмина в различных органах крысы. Биохимия, 55,5:927-937,1990.

6. Лекарь П.Г., Макарова В.А. Гепатоцеребральная дистрофия. Л., Медицина, 1984.

7. Маурер. Диск-электрофорез. М. Мир, 1974.

8. Нейфах С.А., Васильев В.Б., Шавловский М.М. Строение, каталитические свойства и эволюция церулоплазмина и других голубых белков. Успехи биол.химии., 23,102-124,1988.

9. Пучкова Л.В., Алейникова Т.Д., Цымбаленко Н.В., Захарова Е.Т., КонописцеваЛ.А., ЧеботарьН.А., Гайцхоки B.C. Биосинтез и секреция церулоплазмина клетками молочной железы в период лактации. Биохимия, 59,2:341-348,1994.

10. Пучкова Л.В., Алейникова Т.Д., Захарова Е.Т., Цымбаленко Н.В., Конописцева Л.К., Гайцхоки B.C. Экспрессия гена церулоплазмина в онтогенезе у крыс. Биохимия, 59,9:963-973,1994.

11. Пучкова Л.В., Сасина Л.К., Алейникова Т.Д., Гайцхоки B.C. Внутриклеточный церулоплазминоподобный белок млекопитающих. Бюл.эксперим.биол.и мед. 1,83-85,1994.

12. Э.Пучкова Л.В., Алейникова ТД., Вербина И.А., Захарова Е.Т., Плисс М.Г., Гайцхоки B.C. Биосинтез двух молекулярных форм церулоплазмина в печеникрысы и их полярная секреция в кровоток и в желчь. Биохимия. 58,12:18931900,1993.

13. Ю.Пучкова Л.В., Вербина И.А., Денежкина В.В., Гайцхоки B.C., Нейфах С.А. Молекулярные дефекты выведения меди через желчь у больных гепатолентикулярной дегенерацией. Биополимеры и клетка, 7,3:24-30,1991.

14. Пучкова Л.В., Вербина И.А., Денежкина В.В., Шавловский М.М., Гайцхоки B.C., Нейфах С.А. Некоторые свойства рецептора церулоплазмина, выделенного из мембран эритроцитов человека. Биохимия, 55,12:21822189,1990.

15. Пучкова Л.В., Вербина И.А., Гайцхоки B.C., Нейфах С.А. Взаимодействие молекулярных форм церулоплазмина со специфическим рецептором мембран эритроцитов здоровых людей и больных гепатолентикулярной дегенерацией. Биохимия, 56,12: 2261-2269,1991.

16. Саенко Е.Л. Басевич В.В., Ярополов А.И. Особенности взаимодействия церулоплазмина со специфическим рецептором эритроцитов человека. 53,2:317-321,1988.

17. Шварцман А.Л., Вахарловский В.Г., Гайцхоки B.C., Нейфах С.А. Молекулярная структура гена церулоплазмина человека и его экспрессия при мутации Вильсона-Коновалова. Докл. Акад. Наук СССР, 253,3:717719,1981.

18. Шварцман А.Л., Воронина О.В., Гайцхоки B.C., Паткин Е.Л. Экспрессия гена церулоплазмина в органах млекопитающих по данным гибридизационного анализа с комплементарными ДНК-зондами.Мол.биол. 3,657-662,1990.

19. Adman E.T. Copper protein structures. Advances in protein chemistry. 12,1: 145197,1991.

20. Alcain F., Low H., Crane F.L. Ceruloplasmin stimulates thymidine incorporation by CCL-39 cells in the absence of serum or growth factors. Biochem.Biophys.Res.Commun., 180,2:790-796,1991.

21. Baranov V.S., Schwartzman A.L., Gorbunova V.N. Chromosomal localization of ceruloplasminand transferin genes in laboratory rats, mice and in man by hybridization with specific DNA probes. Chromosoma,96,1:60-66,1987.

22. Barnes G., Frieden E. Ceruloplasmin receptors of erytrocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 125:157-162,1984.

23. Beck A.B. The copper content of the liver and blood of some vertebrates. Austral.J.Zool. 35,8,1-18,1955.

24. Bremner L. Absorption, transport and distribution of copper. Hunt Ciba Foundation Symp., 23-37,1980.

25. Brothwell T.H., Charlton R.W., Motulsky A.C. The metabolic basis of inherited disease. (Scriver C.R., Beaudet A.L., Sly W.S., Valle D., eds), 1433-1462,1989.

26. Bull P.C., Cox D.W. Wilson disease and Menkes disease: new handles on heavy-metal transport. TIG 10,7,246-252, 1994.

27. Bull P.C., Thomas G.R., Rommens J.M., Forbes J.R., Cox D.W. The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase similar to the Menkes gene. Nature Genet. 5:327-337, 1993.

28. Butt T.R., Strenberg E.J., Gorman J.A., Clark P., Hamer D., Rosenberg M., Crooke S.T. Copper metallothionein of yeast, structure of the gene, and regulation of expression. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81:3332-3336,1984.

29. Chelly J., Turner Z., Tonnesen T., Petterson A., Ishikawa-Brush Y. Isolation of a candidate gene for Menkes disease that encodes a potential heavy metal binding protein. Nature genetics 3,14-19, 1993.

30. Cousin R.J. Absorption, transport, and hepatic metabolism of copper and zinc: special reference to metallothionein and ceruloplasmin. Physiol. Rev. 65,2,238309,1985.

31. Cox D., Fraser F., Sass-Kotsak A. A genetic study of Wilson's disease: evidence for heteroeneity. Am.J.Hum.Genet., 24,646-666,1972.

32. Crampton R.F., Matthews D.M., Poisner R. Observations on the mechanism of absorption of copper by the small intestine. J.Physiol 178:111-126,1965.

33. Darwish H.M., Cheney J.C., Schmitt R.C., Ettinger M.J. Mobilization of copper (II) from plasma components and mechanism of hepatic copper transport. Am.J.Physiol.246:G72-G79,1984.

34. Darwish H.M., Hoke J.E., Ettinger M.J. Kinetics of Cu(ll) transport and accumulation by hepatocytes from copper-deficient mice and the brindled mouse of Menkes disease.J.Biol.Chem.258: 13621-13626,1983.

35. Darwish H.M., Schmitt R.S., Cheney J.S., Ettinger M.J. Copper efflux kinetics from rat hepatocytes. Am.J.Physiol.246:G48-G55,1984.

36. Davies K. Cloning the Menkes disease gene. Nature Genetics,361, 98,1993.

37. Davies N.T., Williams R.B. The effect of pregnancy on uptake and distribution of copper in the rat.Pros.Nutr.Soc.35: 4A.

38. Dawson C.R. The Biochemistry of copper. (Peisach J., Aisen P., Blumberg W.E., eds), Academic Press, New York,305-337,1966.

39. Dunn, Michael A., Michael H.Green,and Roland M.Leach,Jr. Kinetics of copper metabolism in rats: a comparmental model. Am. J. Physiol.261 (Endocrinol.Metab.24): E115-E125,1991.

40. D.Ettinger M.J., Darwish H.M., Schmitt R.C. Mechanism of copper transport from plasma to hepatocytes. Fed. Proc., 45,12,2800-2804,1986.

41. Falconer D.S., Fraser A.S., King J.W.B. The genetics and development of 'crinkled', a new mutant in the house mouse.J.Genet 50:324-346,1952.

42. Faller R.A., McArdle H.J., Camakaris J. Effects of metallothionein on the observed copper distribution in cell extracts. J.Inorganic Biochemistry. 49,1:923,1993.

43. Fleischer B., Fleischer S. Glucosidase activity of bovine liver plasma membranes. Biochim. Biophys. Acta, 183,2,265-275,1969.

44. Fleming R.E., Gitlin J.D. Primary structure of rat ceruloplasmin and analisis of tissue specific gene expression during development. J.Biol.Chem. 265,13:77017709,1990.

45. Fleming R.E., Whitman I.P., Gitlin J.D. Induction of ceruloplasmin gene expression in rat lung during inflammation and hyperoxia. Am.J.Physiol.260:L68-1.74,1991.

46. Freedman J.H., Ciriolo M.R., Peisach J. The role of glutathione in copper metabolism and toxicity.!Biol.Chem.264:5598-5605,1989.

47. Freedman J.H., Peisach J. Intracellular copper transport in cultured hepatoma cells. Biochem.Biophys. Res.Commun. 164:134-140, 1989.

48. French J.H., Sherard E.S. Studies of the biochemical basis of kinky hair desease. (Abstract) Pediat.Res. 1,206,1967.

49. Frieden E. Caeruloplasmin: a multi-functional metalloprotein of vertebrate plasma. ln:Bioiogical roles of copper. Excerta Medica, 93-124,1980.

50. Frieden E. Metal ions in biological systems.Ed.H.Siegel.N.Y.;Basel:Marcel Deccer Inc., 13:2-14,1981.

51. Frieden E. Isolation of the ceruloplasmin receptor from erythrocytes of the rat. Analyt. Biochem., 103,1:113-118,1993.

52. Frydman M., Bonne-Tamir B., Farrer L.A., Assignment of the of Wilson disease to chromosome 13: linkage to the esterase D locus. Pros. Nat.Acad.Sci.USA.82,7:1819-1821,1985.

53. Furst P., Hamer D. Cooperative activation of a eukaryotic transcription factor: Interaction between Cu(l) and yeast ACE1 protein.Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 86,5267-5271,1989.

54. Gaitskhoki V.S., L'vov L.V., Puchkova L.V., Schwartzman A.L., Neifakh S.A. Highly purifid ceruloplasmin messenger RNA from rat liver. Mol.Cel.Biochem. 35:171-182,1981.

55. Gaitskhoki V.S., L'vov V.M., Schwartzman A.L., Skobeleva N.A., Frolova L.Yu., Neifakh S.A. Identification of ceruloplasmin messenger RNA seqences in heterogeneous nuclear RNA from rat liver. Mol.Biol.Rep. 8,1:57-62,1981.

56. Gaitskhoki V.S., L'vov V.M., Monakhov N.K., Puchkova L.V., Schwartman A.L., Frolova L.J., Skobeleva N.A., Zagorski W., Neifakh S.A.Intracellular distribution of rat-liver polyribosomes synthesizing coeruloplasmin. Eur.J.Biochem.115,1:39-44, 1981.

57. George A.M., Reed V., Glenister P., Chelly J., Turner Z. Analysis of mnk, the murine homologue of the locus for Menkes disease, in normal and mottled (mo) mice. Genomics 22, 27-35,1994.

58. S.Gitlin J.D. Transcriptional regulation of ceruloplasmin gene expression during inflammation. J.Biol.Chem.263,13:6281 -6287, 1988.

59. Graves K., Kestenbaum T., Kalivas I. Hereditary acrodermatitis enteropathica in an adult. Arch.Derm., 116, 562-564,1980.

60. Gregoriadis G., Morell A.G., Sternlieb I., Scheiberg I.H. Catabolizm of the desialylated ceruloplasmin in liver. J.Biol.Chem.245,21,5833-5837,1970.

61. Gross J.B., Myers B.M., Kost L.J. Biliary copper excretion by hepatocyte lysosomes in the rat. Major exretory pathway in experimental copper overload.J.Clin.invest. 83,1:30-39,1989.

62. Hall A.C., Young B.W., Bremner I. Intestinal metallothionein and the mutual antagonism between copper and zinc in the rat.J.lnorg.Biochem.11:57-66,1979.

63. Hamanaka R., Kohno K., Segushi T., Okamura A. Induction of Low density lipoprotein receptor and a transcription factor SP-1 by tumor necrosis factor in human microvascular endotelial cells.J.Biol.Chem. 267, 19,13160-13165,1992.

64. Hazerlig,J.B., C.A.Owen, Jr., and E.Ackerman. A mathematical model for copper metabolism and its relation to Wilson s disease Am.J. Physiol.211:1075-1081,1966.

65. T.Holmberg C.G. ON the presence of a laccase-like enzyme in serum and its relation to the copper in serum. Acta. Physiol.Scand.8:227-229,1944.

66. Holmberg C.G., Laurell C.B. Investigations in serum copper:ll Acta.Chem.Scand. 2:550-556,1948.

67. Hurley L.S., Keen C.L., Bo Lonnerdal. Copper in fetal and neonatal development. Hunt Ciba Foundation Symp., 227-245, 1980.

68. Karlin K.D. Metalloenzymes, structural motif, and inorganic models. Science,261,701-707,1993.

69. Kataoka M., Tavassoli M., Ceruloplasmin receptors in liver cell suspensions are limited to the endothelium.Exper.Gell Res., 155,2,232-240,1984.

70. Keen C.L., Hurley L.S. Developmental patterns of copper and zinc concentrations in mouse liver and brain: Evidence that the gene crinkled (cr) is associated with an abnormality in copper metabolism. J.lnorg.Biochem 11:269-277,1979.

71. Kroll I. A mannual of quantitative immuno-electrophoresis.Ed. by N.H. Axelsen,

72. J.Kroll,B.Weeke.Oslo-Bergen-Troms: Universitet Storlaget, 1973. I7.laemmli U.K. Cleavage of structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature,227,680-685,1970.

73. Lerch K. Copper metallothionein, a copper-binding protein from Neurospora crassa. Nature, 284,368-370,1980.

74. Li Y., Togashi Y., Sato S., Emato T., Kang J.-H., Takeichi N., Kobayashi H. Spontaneous hepatic copper accumulation in long-evans cinnamon rats with hereditary hepatitis. J.CIin.lnvest. 87,1858-1861,1991.

75. Mason K.E. A conspectus of research on copper metabolism and requirements of man. J.Nutr., 109,11,1979-2066,1979.

76. McArdle H.J., Gross S.M., Danks D.M. Uptake of copper by mouse hepatocytes. J.Cell Physiol. 136:373-378,1988.

77. McArdle H.J., Guthrie J., Ackland M.L., Danks D.M. Albumin has no role in copper uptake by fibroblasts. J.lnogran Biochem 31:123-131,1987.

78. Mercer J.F.B., Livingston J., Hall B., Paynter J.A. Isolation of a partial candidategene for Menkes disease by positional cloning. Nature Genetics, 3,1:20-25,1993.i

79. S.Mertz W. Trace elemens. Science .

80. Messerschmidt A., Huber R. The blue oxidases, ascorbat oxidase, laccase and ceruloplasmin. Eur.J.Biochem. 187:341-352,1990.

81. OO.Orena S.J., Goode C.A., Linder M.C. Binding and uptake of copper from ceruloplasmin. Biochem.Biophys.Res.Commun. 139:822-829, 1986.

82. OlPalida F.A., Ettinger M.J. Identification of proteins involved in intracellular copper metabolism. J.Biol. Chemistry, 266,4586-4592,1991.

83. Paynter J.A., Grimes A., Lockhart P., Mercer J.F.B. Expression of the Menkes gene homologue in mouse tissues lack of effect of copper on the mRNA levels. FEBS Letters, 351,186-190,1994.

84. Petrukhin K., Fiscer S.G., Pirastu M., Tanzi R.E., Chernow I., Devoto M. Mapping, cloning and genetic characterization of the region containing the Wilson disease gene. Nature Genetics 5, 338-343.

85. Phung L.T., Ajlani G., Haselkorn R. P-type ATP-ase from the cyanobacterium synechococcus 7942 related to the human menkes and Wilson disease gene prodacts. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 91, 9651-9654,1994.

86. Puchkova L.V., Gaitskhoki V.S., L vov V.M., Monakhov N.K., Schwartsman A.L., Timchenko L.T., Vakharlovski V.G., Neifakh S.A. Intracellular stages in biosynthesis and maturation of ceruloplasmin. Macromolekular in function cell., M., Nauka,209-227,1984.

87. Puchkova L.V., Gaitskhoki V.S., Monakhov N.K., Timchenko L.T., Neifakh S.A. Preproceruloplasmin id a primary product of cell-free translation of ceruloplasmin messenger RNA. Mol.Cell. Biochem.35,1:159-169,1981.

88. Royle N.J., Irwin D.M., Koschinsky M.L., MacGillivray R.T.A., Hamerton J.L. Humen genes encoding prothrombin andceruloplasmin map to 11p11-q12 and 3q21-24,respectively.Somat.Cell Molec.Genet. 13,285-292,1987.

89. Ryden L. Ceruloplasmin is a single peptide chain. Eur.J.Biochem.26:380-386,1972.lO.Saddi R., Feingold I. Idiopatic haemochromatisis: an autosomal recessive. Clin.Genet., 5,234-241,1974.

90. Schilsky M.L., Stockert R.J., Pollard J.W. Ceruloplasmin biosynthesis by the human uterus. Biochem. J., 288,2:657-661,1992.

91. Sato M., Gitlin J.D. Mechanisms of copper incorporation during the biosynthesis of humen ceruloplasmin. J.Biol.Chem. 266,8: 5128-5134,1991.

92. Schwartzman A.L., Gaitskhoki V.S., L'vov V.M., Nosikov V.V., Braga E.M., Frolova L.Yu., Skobeleva N.A., Kisselev L.L., Neifakh S.A. Complex molecular structure of the gene coding for rat ceruloplasmin. Gene 11:1-10,1980.

93. Shokeir M.N.K., Shreffler D.C. Cytochrome oxidase deficiency in Wilson's disease: a suggested ceruloplasmin function. Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 62,867872,1969.

94. M7.Srai S.K.S., Burroughs A.K., Epstein B.W.O. The ontogeny of liver copper metabolism in the Guinea Pig: clues to the etiology of Wilson's disease. Hepatology, 6,3, 427-432,1986.

95. Sternlieb I., Morrell A.G., Tucker W.D. Incorporation of copper into caeruloplasmin in vitro: studies with copper 64 and copper 67. J. Clin. Invest., 40,8,1837-1840,1961.

96. Sternlieb I., Scheinberg I.H. Radiocopper in diagnosing liver disease. Semin.Nucl. Med., 2,1,176-188,1972.

97. Stevens M.D., DiSilvestro R.A., Harris E.D. Specific receptor for ceruloplasmin in membrane fragments from aortic and heart tissues. Biochemistry 23:261266,1984.

98. Stockert R.J., Morell A.G., BentleyG.E., O'Brien H.A., Scheinberg I.H., Sternlieb I. Transport and intracellular distribution of copper in a human hepatoblastoma cell line, HepG2.Hepatology 6:60-64,1986.

99. Takahashi N., Ortel T.L., Putnam F.W. Single-chain structure of human ceruloplasmin. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:390-394,1984.

100. Tzvetkova I.V., Petushkova N.A., Zolotuchina T.V., Kucharenko V.I., Rosenfeld E.L. Biochemical study of sialidosis type 1 in a Russian famaly. J.lnher.Metab.Dis., 10,18-23, 1987.

101. Underwood E.J. Trace elemnt in human and animal nutriton,4th.edn. Academic Press, New York (see Chapter 3,p 56-108), 1977.

102. Verbina I.A., Puchkova L.V., Gaitskhoki V.S., Neifakh S.A. Isolation and partial characterization of molecular forms of ceruloplasmin from human bile. FEBS, 298,105-108,1992.

103. Wang H., Koschinsky M., Hamerton J.L. Localization of processed gene for human ceruloplasmin to chromosome region 8q21.13-q23.1 by in situ hybridization. Cytogenet.Cell Genet. 47:230-231,1988.

104. Yang F., Freidrichs W.E., Cupples R.L., Bonifacio M.J., Sanford J. A., Horton W.A., Bowman B.H. Human ceruloplasmin. Tissue-specific expression of transcripts produced by alternative splicing J.Biol.Chem. 265,18:1078010785,1990.

105. Yangeer J.L., Shimizu, Gitlin J.D. Tissue-specific syntesis of the ceruloplasmin by mamary glands of the rat. Biochem. J., 280,3,671-677,1977.

106. Yoshida K., Furihata K., Takeda S., Nakamura A., Yamamota K., Morita H., Hiyamuta S., Ikeda S., Shimizu N., Yanagisawa N. A mutation in the ceruloplasmin gene is associated with systemic hemosiderosis in humans. Nature Genetics, 9, 267-272,1995.

107. Mas A., Sarkar B. Uptake of 67.Cu by isolated human trophoblast cell. Biophys. Res. Commun., 1135, 2: 123-128, 1992.

108. Феник С.И., Трофимяк Т.Б., Блюм Я.Б. Механизм формирования устойчивости растений к тяжелым металлам. Успехи совр. биол., 115, 261275, 1995.