Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменения пролиферации и дифференцировки кератиноцитов в интерфолликулярном эпидермисе кожи у лиц мужского пола в онтогенезе

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Изменения пролиферации и дифференцировки кератиноцитов в интерфолликулярном эпидермисе кожи у лиц мужского пола в онтогенезе"

На правах рукописи

0050012'°

ГОРЕЛОВА МАРИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ИЗМЕНЕНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЕРАТИНОЦИТОВ ИНТЕРФОЛЛИКУЛЯРНОГО ЭПИДЕРМИСА ВИСОЧНОЙ ОБЛАСТИ У ЛИЦ МУЖСКОГО ПОЛА В ОНТОГЕНЕЗЕ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ 1 О НОЯ 2011

диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва-2011

005001276

Работа выполнена на кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии медицинского института ФГБОУ ВПО "Орловский государственный университет" и в Научном отд^е ЗАО Фармацевтическое научно-производственное предприятие "Ретиноиды"

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальныеоппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Ноздрин Владимир Иванович

Яглов Валентин Васильевич Боронихина Татьяна Владимировна

Ведущее учревдение: ГБОУ ВПО "Московский государственный медико-стоматологический университет"

Защита диссертации состоится "^ГШёМ^ШХ года в _12.00__часов на заседании диссертационного совета Д <Й 1.004.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт морфологии человека РАМН по адресу: 117418, г. Москва, ул. Цюрупы, д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения РАМН НИИ морфологии человека РАМН

Автореферат разослан 011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Михайлова Лилия Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность. Общий план строения эпидермиса на уровне световой и электронной микроскопии у экспериментальных животных и человека описан достаточно полно, что нашло отражение в монографиях и оригинальных работах последних десятилетий (Смирнова И.О., 2005; Мяделед О.Д. и др., 2006; Ноздрин В.И. и др., 2008; Bhattacharyya Т.К. et al., 2004; DayanN., 2008). Вместе с тем, многие детали, важные в фундаментальном и особенно в прикладном отношениях, ещё нуждаются в углублённом изучении. Так, например, остаются малоизученными расовые, половые и региональные особенности строения кожи в возрастном аспекте. В предыдущих исследованиях подробно изучены особенности реактивных изменений кожи в ответ на воздействие температурных факторов, влажности, ультрафиолетового облучения и проч. (Москалев A.A., 2008; СкибаМ.Н., 2008; Снарская Е.С., 2011; Fisher G.J. et al., 2002; Baumann L., 2007; Krutmann J., 2010). Однако в этих работах не делается акцент на особенностях строения интерфолликулярного эпидермиса, эпителия волосяных воронок, устьев потовых желёз и др. Продолжают оставаться актуальными вопросы строения кожи в антенатальном и постнатальном онтогенезе у животных и человека. Недостаток фундаментальных знаний по этим вопросам не позволяет объективно оценивать активность дерматотропных лекарственных препаратов, что в конечном счёте негативно сказывается на рекомендациях по их применению. В практику гистологических исследований последних лет входят методы идентификации ядерных и цитоплазматических макромолекул с помощью моноклональных антител. Преимуществом таких методов является точность выявления этих соединений, так как моноклональные антитела отличаются высокой специфичностью и селективно выявляют антигены с известной локализацией, функцией и молекулярным строением. Использование моноклональных антител позволяет по-новому взглянуть на устоявшиеся факты и концепции, даёт возможность получить аргументы для новых предположений, способствует расширению знаний, как фундаментальных, так и прикладных. Всё это

з

делает актуальным дальнейшее изучение структурных элементов кожи человека с учётом её возрастных, половых и региональных особенностей с использованием доказательных методов исследования, таких как иммуногисто-химия и морфометрический анализ. Учитывая вышесказанное, были сформулированы цель и задачи настоящей работы.

Цель исследования. Целью настоящей работы стало выявление изменений пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

Задачи исследования

1. Изучить изменение толщины интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

2. Изучить изменение содержания К>67-позитивных клеток (маркёр пролиферации) в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

3. Изучить изменение содержания р53-позитивных клеток (маркёр повреждения ДНК) в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

4. Изучить толщину пласта инволюкрин-позитивных клеток (маркёр терминальной дифференцировки) в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

Положения диссертации, выносимые на защиту. Пролиферация и дифференцировка интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе претерпевает определённые изменения. 1. Изменяется его толщина - у плодов и новорождённых эпидермис тонкий, к 1921 годам он постепенно утолщается, далее его толщина не изменяется до 4045 лет, а к старческому возрасту эпидермис истончается. 2. Изменяется про-лиферативная активность кератиноцитов - начиная с антенатального периода развития происходит постепенное увеличение количества Кь67-позитивных клеток, максимальное число клеток, меченных МКА к белку К>67, в эпидермисе достигается к 19-21 годам жизни. Оставаясь приблизительно на одном

4

уровне до 45 лет, к 75 годам количество К1-67-позитивных клеток уменьшается. 3. Содержание клеток с повреждённой ДНК (апоптотические клетки) нарастает с возрастом, при этом первый максимум содержания р53-позитивных клеток выявляется в 19-25 лет. Проявление второго максимума экспрессии белка р53 наблюдается в возрастном интервале 66-75 лет. 4. Экспрессия кератиноцитами белка терминальной дифференцировки - инволюк-рина - с возрастом существенно не изменяется.

Научная новизна. Впервые с использованием моноклонапьных антител - маркёров основных процессов гистогенеза, таких как пролиферация и дифференцировка, на аутопсийном материале прослежены изменения интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе. Показано, что толщина эпидермиса и его пролиферативная активность одновременно нарастают до 19-21 года и в дальнейшем постепенно снижаются. Количество клеток с повреждённой ДНК увеличивается к 1925 годам и резко возрастает после 60 лет. Терминальная дифференцировка кератиноцитов с возрастом существенно не меняется.

Практическая значимость. Полученные результаты используются в гистофармакологических исследованиях при оценке эффективности новых лекарственных средств кожного действия, в морфологической диагностике заболеваний кожи, а также в учебном процессе при преподавании курса гистологии по специальности "Лечебное дело" и "Педиатрия".

Внедрение. По результатам исследования написаны методические рекомендации: "Окраска гистологических препаратов с помощью монокло-нальных антител к Кь67", "Окраска гистологических препаратов с помощью моноклональных антител кр53", "Окраска гистологических препаратов с помощью моноклональных антител к инволюкрину" и "Окраска биопсийного материала кожи человека с помощью моноклональных антител к Кь67". Рекомендации внедрены в Научном дерматологическом центре и Научном отделе Фармацевтического научно-производственного предприятия ЗАО "Ре-тиноиды". На кафедру гистологии, цитологии и эмбриологии медицинского

5

института ФГБОУ ВПО "Орловский государственный университет" передано 80 гистологических препаратов кожи височной области лиц мужского пола в возрасте 9 месяцев, 13, 19 и 74 лет, окрашенных гематоксилином и эозином, для преподавания курса гистологии по специальностям "Лечебное дело" и "Педиатрия".

Апробация. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XVII и XVIII Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, апрель 2010 г., апрель 2011 г.), на X Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, сентябрь 2010 г.), на VIII Всероссийской научной конференции "Бабухинские чтения в Орле" (Орёл, июнь 2011г.), на Межлабораторной конференции НИИ морфологии человека РАМН (Москва, сентябрь, 2011), на III Эмбриологическом симпозиуме "ЮГРА-ЭМБРИО-2011" (Ханты-Мансийск, октябрь 2011 г.), на Всероссийской научной конференции "Регенеративная биология и медицина" (Москва, октябрь 2011 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них статей в журналах по списку ВАК - 3.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов "Общая характеристика работы", "Обзор литературы", "Материал и методы", "Результаты собственных исследований", "Обсуждение результатов собственных исследований", "Выводы", "Стандартные операционные процедуры" и "Литература". Написана на 137 стр., включает 4 таблицы, 46 рисунков, в их числе 25 микрофотографий. Список литературы содержит 205 источника, в том числе 121 иностранный.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материал. Объектом исследования была аутопсийная кожа височной области волосистой части головы субъектов мужского пола в возрасте от 23 недель антенатального и до 75 лет постнатального развития. Участок кожи височной области размером 1x1 см забирали по линии разреза мягких тканей головы не позднее 12-14 ч после наступления смерти. Всего собрано 120 образцов. Кусочки фиксировали в забуференном (рН=7,4) 10 % нейтральном

е

формалине. Аутопсийные образцы не брали у лиц, страдавших при жизни согласно данным протокола судебно-медецинского и патологоанатомического вскрытия заболеваниями кожи, сахарным диабетом и др. Образцы, принадлежащие умершим одного возраста, объединяли с формированием возрастных "точек" (всего 53) с определением для каждой из них среднего значения и стандартной ошибки изученных параметров. Собранный материал объединяли также в возрастные группы с интервалом периодизации в 5 лет.

Методы. Гистологическая техника. Фиксированный материал обезвоживали путём постепенного проведения через спирты возрастающей концентрации. Материал заливали в Histomix (БиоВитрум, Россия) - среду, содержащую парафин и пластификаторы. Парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм изготавливали на санном микротоме Microm HM 400 R (Carl Zeiss, Германия). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике, заключали в канадский бальзам и изучали с помощью светового микроскопа Axiostar 2 (Carl Zeiss, Германия).

Методика измерения толщины интерфолликулярного эпидермиса. Толщину интерфолликулярного эпидермиса до рогового слоя измеряли в мкм на аппаратно-программном комплексе «ДиаМорф» (ДиаМорф, Россия). Морфометрические исследования проводили с помощью программы Image Tool (University Texas, США), которая калибровалась объект-микрометром ОМП с ценой деления 0,01 мм. Измерение толщины клеточного эпидермиса проводили в одном срезе кожи каждого аутопсийного образца по вертикали от базальной мембраны; в поле зрения микроскопа делали по 3 измерения (об. 20 х, всего 16-18 полей зрения на стекло). По результатам измерения вычисляли среднее значение со стандартной ошибкой.

Иммуногистохимический метод выявления белка Ki-67. Парафиновые срезы кожи расправляли на водяной бане, помещали на предметные стёкла с полизиновым покрытием (Menzel, Германия) и сушили в термостате при температуре 37 °С в течение 2-3 недель. Белок Ki-67 выявляли с помощью двойного непрямого метода окрашивания антител с использованием поли-

7

мерной системы детекции. Депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов проводили кипячением срезов в течение 10 мин под повышенным давлением в растворах Trilogy (Cell marque, США). Применяли мо-ноклональные антитела к Ki-67 (clone SP6), выпускаемые той же фирмой, которые наносили на срезы в разведении 1:500 с последующей инкубацией во влажной камере в термостате при 37 °С в течение 1 часа. Визуализацию Ki-67-позитивных клеток проводили с помощью полимерной системы Histofme Simple DAB-3S kit (3,3-диаминобензидин) (Multi) (Nicherei biosciences, Япония). Срезы докрашивали гематоксилином Караччи и заключали в канадский бальзам. Качество проведённой реакции оценивали путём сравнения с позитивным контролем для антигена.

Особенности иммуногистохштческого метода выявления белка р53. Для визуализации белка р53 использовали МКА к р53 (clone D07) и АЕС So-lutio З-амино-9-этилкарбазол (Nicherei biosciences, Япония). Препараты заключали в водорастворимую среду UltraMount Plus (LabVision, США).

Особенности иммуногистохимического метода выявления белка инво-люкрин. При окраске МКА к инволюкрину (clone SY5) депарафинирование, регидратацию и демаскировку антигенов проводили кипячением срезов в течение 8 мин под повышенным давлением в растворах Decler (Cell marque, США).

Методика подсчёта Ki-67- и р53-позитивных клеток. В каждом поле зрения светового микроскопа при об. 100 х, ок. 10 * считали общее количество клеток (в базальном и шиповатом слоях), а также количество клеток, меченных МКА к белкам Ki-67 и р53 отдельно для базального слоя эпидермиса, нижней части шиповатого -"супрабазального" слоя и всех пластов шиповатого. Ростковым считали слои в которых выявлялись Ki-67-позитивные клетки; это были базальный и все пласты шиповатого. Вычисляли в процентах индексы Ki-67- и р53-позитивных клеток. По результатам измерения для каждого случая вычисляли среднее значение со стандартной ошибкой.

Методика подсчёта инволюкрин-позитивных клеток. Для получения цифровых характеристик экспрессии инволюкрина в эпидермисе измеряли (мкм) толщину пласта позитивно окрашенных клеток. По результатам измерения вычисляли среднее значение со стандартной ошибкой и долю инво-люкрин-позитивного пласта в общей толщине клеточного эпидермиса.

Обоснование выбора методов статистического анализа. При выборе критериев статистической оценки учитывали тип распределения (нормальный/ненормальный), тип показателя (качественный, количественный, порядковый), число сравниваемых групп/точек и количество вариантов выборки (п). При нормальном распределении использовали t-критерий Стьюдента. Если распределение было ненормальным и/или же п <30, но >3, достоверность рассчитывали по непараметрическому методу — U-критерию Манна-Уитни. В работе использовали также коэффициент корреляции Спирмена (rs). Для определения направления возрастных изменений эпидермиса по коэффициенту детерминации была избрана полиномиальная линия тренда 6-й степени, которую строили в программе Microsoft Office Excel 2007. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Statistica», версия 6.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изменение толщины интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе. Интерфолликулярный эпидермис височной области у лиц мужского пола представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием, состоящим из базального, шиповатого, зернистого и рогового слоёв. В антенатальном периоде на 23-й и 25-й неделях развития он представлен чётко выраженным слоем базальных кератиноцитов, 12 пластами шиповатого слоя и слабо выраженным зернистым слоем клеток. К 32-й и 40-й неделям внутриутробного развития базальный и зернистый слои остаются такими же, шиповатый слой утолщается и он представлен 23 пластами полигональных клеток (рис. 1 а). К 70- и 78-му дням после рож-

дения количество кератиноцитов в шиповатом слое возрастает, прослеживаются единичные, слабо выраженные гребешки. К 92-му дню изменения затрагивают только зернистый слой, в цитоплазме клеток которого на всём протяжении гистологического препарата выявляются базофильно окрашенные гранулы кератогиалина. В дальнейшем происходит постепенное увеличение клеточной популяции кератиноцитов, эпидермальные гребешки становятся более выраженными. К 19-21 годам количество клеток шиповатого слоя значительно увеличивается, эпителиальный пласт кожи достигает максимальной толщины, зернистый слой образован несколькими пластами клеток с отчётливыми гранулами кератогиалина в цитоплазме, эпидермальные гребешки хорошо выражены и глубоко внедряются в дерму (рис. 1 б). В промежутке от 25 до 45 лет толщина эпидермиса изменяется незначительно, оставаясь приблизительно постоянной. В дальнейшем эпидермис постепенно истончается, преимущественно за счёт уменьшения числа клеток шиповатого слоя; глубина внедрения гребешков в сосочковый слой дермы уменьшается, линия контакта эпидермиса с дермой сглаживается. Зернистый и роговой слои у лиц зрелого и пожилого возраста развиты слабо (рис. 1 в). Морфомет-рическая оценка интерфолликулярного эпидермиса изучаемых образцов показала, что с 23-й недели внутриутробного развития толщина его клеточной части постепенно нарастает до 20-летнего возраста постнатального развития, после чего отмечается устойчивая, хотя и неравномерно выраженная, тенденция к его истончению. Из графического материала (рис. 2) следует, что от рождения до 16-20 лет эпидермис утолщается. В возрастном периоде 2545 лет толщина его приблизительно остаётся на одном уровне и в дальнейшем постепенно снижается. Итак, в онтогенезе человека толщина интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола изменяется следующим образом: у плодов, новорождённых и грудных мальчиков эпидермис тонкий, он постепенно утолщается к 19-21 годам, остаётся неизменным до 40-45 лет и вновь истончается к старческому возрасту.

Некоторые конкретные сведения о толщине эпидермиса кожи волосистой части головы у человека мы нашли в следующих публикациях. Так, в кандидатской диссертации Е.А. Загорученко (1954), выполненной на аутоп-сийном материале от лиц мужского пола в возрасте от первых дней жизни

Рис. 1. Фрагменты кожи височной области плода на 40-й неделе развития

—-______ ____ ^ (а), юноши 19 лет (б) и мужчины

«С „•»**"«? 3 74 лет (в). Эп - эпидермис, Д - дерма.

** ' ' Г " Окр. - гематоксилин и эозин.

-1 Д . Л

" , ^ -л 20 ут ■

до 82 лет, отмечено, что в коже волосистой части головы эпителиальные гребешки достигают максимального развития к 18 годам и в дальнейшем подвергаются инволюции. Ростковый слой эпидермиса, по данным этого автора, наиболее тонким оказался у новорождённых; к 25 годам он увеличивался вдвое и после 50 лет истончался. С этими данными согласуются результаты исследования И.Г. Железникова (1958), который показал, что у детей эпидермис в теменной области утолщается от периода новорождённости до 7 лет более чем в 3 раза. Некоторые сведения об изменении толщины эпидермиса височной области кожи (в основном, у женщин) в возрастном аспекте можно найти в работе И.О. Смирновой (2004), которая установила, что после 19 лет пласт кожного эпителия проявляет тенденцию к истончению. И.И. Подвысоцкая (1975) изучила 1500 образцов кожи из 18 областей от 30 новорождённых, 10 детей в возрасте от года до 10 лет, 10 человек в период

11

полового созревания, 40 взрослых и 20 лиц пожилого и старческого возраста. Автор отмечает, что в эпидермисе с возрастом развиваются и прогрессируют атрофические процессы, и в результате он истончается. Работа основана на данных описательной гистологии; подтверждения заключений морфометри-ческими измерениями в ней нет. В исследовании не указана точная область взятия материала.

Наши данные с использованием морфометрического анализа позволили объективизировать эту закономерность. Следует подчеркнуть, что у лабораторных грызунов эпидермис с возрастом также истончается (Ноздрин В.И. и др., 2006). Из этого следует, что возрастные изменения толщины эпидермиса - это общебиологическая закономерность.

О Антенатальный период развития

■ Постнатальный период развития Возрастные группы, годы

Рис. 2. Толщина клеточного интерфолликулярного эпидермиса височной области кожи мужчин в различных возрастных группах.

Изменение содержания Ю-67-позитивных клеток в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

На рис. 3 показаны изменения содержания Кл-67-позитивных клеток в эпителиально-клеточном пласте кожи височной области волосистой части головы у лиц мужского пола в антенатальном и постнатальном периодах развития. В

исследованный временной диапазон с 23-й недели антенатального до 75 лет постнатального развития с увеличением толщины эпидермиса количество пролиферирующих клеток в нём нарастает, достигая своего максимума к 1921 годам. В дальнейшем количество меченых клеток в истончающемся ин-

э„

'Д

• х-

20 щ»

Эп.

« * • Г..»-,;

А'" 'Л ~ * _ -''■='

Эп

„I ... * Чс .* г.

» " ,ч.» >. »> -»-.л . » . ;*

Д

К» 20.Ж.

Рис. 3. Кл-67-позитивные клетки (в овалах) в интерфолликулярном эпидермисе кожи головы височной области плода на 23-й неделе развития (а), юноши 21 года (б) и мужчины 75 лет (в). Эп - эпидермис, Д - дерма. До-краска - гематоксилин.

плоды 0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-30 31-35 36-40 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-70 70-75

И Антенатальный период развития Возрастные группы, годы

™ Постнатальный период развития

Рис. 4. Индекс Кт-67-позитивных клеток в интерфолликулярном эпидермисе кожи височной области у лиц мужского пола в различных возрастных группах.

терфолликулярном эпидермисе кожи снижается приблизительно в 2 раза (рис. 4).

В результате изучения содержания Кь67-позитивных клеток в различных слоях интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе установили, что в базальном слое, начиная с 23-й недели антенатального развития их количество увеличивается до 43 лет постна-тального развития с резко выраженным подъёмом показателя в 19-летнем возрасте. В период от 44 до 65 лет содержание этих клеток уменьшается. В "супрабазальном" слое максимальное число таких клеток приходится на период от 23-й недели антенатального периода развития до 21 года. В дальнейшем число К>67-позитивных клеток уменьшается. В шиповатом слое без учёта "супрабазального" количество Кь67-позитивных клеток невелико и варьирует в течение всего онтогенеза - от 0 до 1 в поле зрения микроскопа; только в 19-летнем возрасте этот показатель превышал цифру 2. Следует отметить, что в возрасте от 43 до 53 лет количество Кл-67-позитивных клеток было минимально и в дальнейшем увеличивалось незначительно. Содержание Кь67-позитивных клеток в шиповатом слое во время антенатального и постнатального развития практически оставалось на одном уровне на всём протяжении онтогенеза. Оценивая весь ростковый слой (базальный и шиповатый слои вместе) по содержанию Кл-67, можно отметить, что количество пролиферирующих клеток после рождения увеличивалось до 43-летнего возраста и в дальнейшем с годами постепенно снижалось.

Итак, пролиферативная активность кератиноцитов зависит от возраста (см. рис. 4): у плодов, новорождённых и грудных мальчиков на фоне увеличения толщины эпидермиса происходит постепенное повышение количества Кь67-позитивных клеток. К 19-21 годам отмечается максимальное число кератиноцитов, меченых МКА к белку Кл-67. Оставаясь приблизительно на одном уровне до 40-45 лет, в дальнейшем в истончающемся эпидермисе количество Кл-67-позитивных клеток уменьшается.

В работах Е.А. Ефимова (1977, 1979) и G.D. Weinstein и др. (1984) для оценки пролиферативной активности эпидермиса использовалась 3Н-тимидиновая метка и было установлено, что ускорение регенерации сопровождается ростом митотической активности кератиноцитов. Первые упоминания о возможности применения для выявления пролиферативной активности тканей моноклональных антител к белку Ki-67 относятся к 1983 году (Gerdes J. et al., 1983). Н.Е. Knaggs и др. (1998) оценивали пролиферативный пул эпидермиса кожи грудной области и его изменения вокруг акне путём подсчёта индекса Ki-67. N.A. Coolen и др. (2010) изучали 21 образец кожи от плодов с 13-й до 22-й недели внутриутробного развития, сравнивая их с образцами кожи людей в возрасте от 34 до 45 лет. Пролиферативную активность эпидермиса в его базальном слое оценивали путём подсчёта индекса Ki-67; при этом обнаружили, что во внутриутробном периоде развития делящиеся клетки встречаются чаще, чем в постнатальном. Исследователи отметили, что в 13-14 недель внутриутробного развития значение индекса Ki-67 было максимальное, к 16-18-й неделям он понижался, с последующим повышением к 21-22-й неделям.

Сходные данные были получены в отношении эпидермиса заушной и височной областей у женщин 19-64 лет (Смирнова И.О., 2004). А. Gilhar и др. (2004) отмечали, что с возрастом снижается пролиферативная активность.

Изменение содержания р53-иозитивных клеток в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе. На фоне утолщения интерфолликулярного эпидермиса с последующим его истончением количество р53-позитивных клеток в нём с возрастом в основном увеличивается (рис. 5).

При послойном подсчёте числа р53-позитивных клеток установили, что их содержание в базальном слое эпидермиса относительно невелико. Наибольшее количество р53-позитивных клеток содержалось в шиповатом слое. Их абсолютное число уменьшается до 68 лет с последующим значительным увеличением к 75 годам. В "супрабазальном" слое позитивно окрашенных

15

клеток было меньше, чем в шиповатом слое без учёта "супрабазального". В период антенатального развития белок р53 выявлялся преимущественно в "супрабазальном"слое шиповатого слоя, состоящем из 2-3 пластов клеток. Увеличение представительства меченых клеток после 50 лет идёт преимущественно за счёт повышения их числа в базальном и "супрабазальном" слоях. Оценивая послойное содержание меченых кератиноцитов, мы сочли целесообразным суммировать все р53-позитивные клетки в базальном и шиповатом слоях и представить результат в виде индекса, указывающего их долю (%) в общем числе клеточных элементов эпидермиса для каждой возрастной группы. Индекс р53 с возрастом увеличивался и составил в группе 71-75 лет -12,4%.

Рис. 5. р53-позигивные клетки (в овалах) в интерфолликулярном эпидермисе кожи головы височной области плода на 40-й неделе развития (а), юноши 19 лет (б) и мужчины 74 лет (в). Эп - эпидермис, Д - дерма. Докра-ска - гематоксилин.

На рис. 6 представлена полиномиальная линия тренда, отражающая направление изменения содержания в эпидермисе р53-позитивных клеток с возрастом.

Таким образом, минимальная толщина клеточного эпидермиса в сочетании с низким содержанием Кл-67- и р53-позитивных клеток выявляется в

антенатальном периоде развития. К 20 годам эпидермис достигает макси-

16

мальной толщины, что сопровождается максимумом его пролиферативной активности и первым повышением содержания р53-позитивных клеток. В более поздние возрастные периоды происходит истончение эпидермиса и снижение уровня пролиферативной активности кератиноцитов с одновременным увеличением числа р53-позитивных клеток. Следует подчеркнуть, что р53-позитивные клетки встречались в базальном и в основном в "супра-базальном" слоях эпидермиса, редко - в верхних пластах шиповатого слоя и никогда - в зернистом и роговом. Это говорит, что процессы апоптоза и терминальной дифференцировки - это два разных процесса, которые протекают относительно независимо и параллельно друг другу. Необходимо отметить, что МКА к р53 выявляют клетки с повреждённой ДНК. Они могут погибнуть путём апоптоза или, репарировав свою ДНК, вступить в терминальную диф-ференцировку.

0-5 6-10 11-15 16-20 21-25 26-S0 31-35 36-40 41-45 46-50 51-55 56-60 61-65 66-70 70-75 EJ Антенатальный период развития

■ Постнатальный период развития Возрастные группы, годы

Рис. 6. Индекс р53-позитивных клеток (%) в базальном и шиповатом слоях эпидермиса височной области головы мужчин в различных возрастных группах.

Направление изменений числа р53-позитивных клеток в эпидермисе кожи с возрастом было прослежено в работе М.В. Е1-ПотуаП и др. (2003). Авторы изучали кожу лица, подвергавшуюся солнечному воздействию, и кожу живота, защищенную от солнца, у людей обоего пола в возрасте от 6 до

17

77 лет. Обнаружено, что одинаковая доза инсоляции у пожилых сильнее повреждает ДНК кератиноцитов, чем у молодых, что прямо отражается на содержании в эпидермисе р53-позитивных клеток. Т.Ю. Витрук (2008), Т.Ю. Витрук и др. (2008), оценивая содержание маркёров апоптоза в био-псийных образцах кожи лица, шеи и груди от 16 женщин в возрасте от 16 до 64 лет, показали, что с возрастом количество клеток, меченных МКА к р53 возрастает. По нашим данным, примерно к 19-25 годам выявляется первый заметный максимум содержания р53-позитивных клеток. Это вполне понятно, если принять во внимание, что активация белка р53 маркирует клетки с повреждённой ДНК или клетки, разрушающиеся путём апоптоза (Nigro J.M. et al.,1997; Chylicki К. et al, 2000; Raj D. et al., 2006), т. к. чем выше пролифе-ративная активность, тем больше вероятность появления клеток с повреждением ДНК. Появление второго максимума экспрессии р53 на фоне низкой пролиферативной активности (возрастной интервал 70-75 лет) связано, вероятно, уже с другими причинами, поскольку известно, что частота появления клеток с повреждённой ДНК с возрастом увеличивается во многих тканях (Чумаков П.М., 2007; Batinac Т. et al, 2004). На графиках, представленных на рис. 7, можно видеть, что изменения пролиферативной активности эпидермиса и содержания в нём р53-позитивных клеток идёт параллельно до 50 лет, а после шестидесяти эти процессы приобретают противоположную направленность: количество Ki-67-позитивных клеток прогрессивно падает, а р53-позитивных - нарастает. Анализируя эти данные, можно предположить, что в юношеские годы белок р53 преимущественно активирует репарацию повреждённой ДНК, хотя апоптотическая гибель клеток здесь тоже должна иметь место. К пожилому возрасту, клеток с повреждённой ДНК становится больше, в основном они гибнут путём апоптоза, однако наличие репарации ДНК в этом возрасте исключить нельзя.

Анализируя результаты настоящего исследования, можно с определённой долей уверенности утверждать, что терминальная дифференцировка и апоптоз - это разные пути клеточной гибели. Об этом говорит тот факт, что

18

р53-позитивные клетки никогда не встречаются в зернистом и роговом слоях, т.е. там, где протекает процесс терминальной дифференцировки, а не апоп-тоз.

Рис. 7. Индекс Кл-67 и р53 в интерфолликулярном эпидермисе кожи височной области у лиц мужского пола в различных возрастных группах.

Изменение инволнжрин-позитивного пласта клеток в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе. Клетки, меченные антителами к инволюкрину, располагаются в верхних слоях эпидермиса и образуют инволюкрин-позитивный пласт (рис. 8). Как показали измерения, толщина пласта инволюкрин-позитивных клеток в эпидермисе с 23-й недели антенатального развития до 75 лет постнатального развития практически не зависит от возраста и колеблется от 11 до 27 мкм. Как и следовало ожидать, при постоянной абсолютной толщине этого пласта его доля в эпидермисе изменяется в обратной зависимости от величины общей толщины кожного эпителия. Так, у 11-летнего ребёнка она составляет 46,1 %; у мужчины в возрасте 21 года - 68,1 %; в 63 года - 95,4 %; после чего наблюдается незначительное снижение показателя - до 82,6% у мужчин 75 лет (рис. 9).

Таким образом, в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола пласт терминально дифференцированных клеток, изученный на примере инволюкрин-позитивных клеток, в абсолютных величинах остаётся постоянным на протяжении всего онтогенеза, т. е. кожа сохраняет основную свою функцию - барьерную - как в антенатальном, так и в постнатальном периодах развития. При этом доля инволюкрин-позитивного пласта в истончающемся эпидермисе с возрастом увеличивается.

Рис. 8. Пласт инволюкрин-позитивных клеток интерфолликулярного эпидермиса кожи височной области плода 40-й неделе развития (а), юноши 13 лет (б) и мужчины 74 лет (в). Эп - эпидермис, Д - дерма. До-краска - гематоксилин.

Работ посвященных изучению процессов терминальной дифференцировки в интерфолликулярном эпидермисе кожи височной области у мужчин в онтогенезе, нам обнаружить не удалось. Однако провести некоторые параллели с двумя исследованиями всё же возможно. Так, в работе Т. Tezuka и др. (1994) методами иммуногистохимии было показано, что в юношеские и зрелые годы в коже лица содержание таких белков терминальной дифференцировки, как филаггрин, инволюкрин и карбоангидразоподобный белок, оставалось неизменным. N.A. Coolen и др. (2010) изучали дифференцировку эпидермиса с помощью маркёров к цитокератину 10 и инволюкрину. Согласно их данным, с 13-14-й недели внутриутробного периода цитокератин 10 визуализи-

20

ГЛ -

ровался в промежуточной пластинке и перидерме, с 16-й недели цитокератин 10 выявлялся только в промежуточной пластинке, а в возрасте 34-45 лет - в шиповатом и зернистом слоях. Инволюкрин с 13-й по 22-ю неделю внутриутробного развития присутствовал во всех слоях эпидермиса, кроме базаль-ного; в постнатальном периоде - только в зернистом. С учётом этих данных можно сделать вывод, что способность кератиноцитов формировать эпидер-мальный барьер является доминирующей функцией кожи и с возрастом существенно не изменяется даже при изменении общей толщины эпидермиса.

Рис. 9. Толщина инволюкрин-позитивного пласта клеток в эпидермисе кожи височной области у лиц мужского пола в онтогенезе в различных возрастных точках.

В обсуждаемом исследовании обнаружено, что к пожилому и старческому возрасту у мужчин общая толщина эпидермиса кожи височной области существенно уменьшается. Однако абсолютные значения толщины пласта инволюкрин-положительных клеток, т. е. клеток, вступивших в стадию терминальной дифференцировки, остаются неизменными и примерно равными тому значению, которое характерно для эпидермиса в юношеские годы. Это обстоятельство может свидетельствовать, что несмотря на низкую скорость клеточного обновления в старческом возрасте (небольшую толщину эпидер-

миса и низкую пролиферативную активность кератиноцитов) барьерная функция кожного эпителия остаётся сохранной. Полагаем, что в старческих возрастных группах клетки раньше вступают в фазу терминальной диффе-ренцировки и, очевидно, пропускают ряд промежуточных фаз, характерных для последовательно дифференцирующихся клеток зрелого эпидермиса. Такое предположение возможно, поскольку, как показали недавние исследования, программа терминальной дифференцировки кератиноцитов находится под контролем белков группы polycomb, которые репрессируют ген терминальной дифференцировки, сохраняя, таким образом, пролиферативный потенциал клеток базального слоя (Watt F.M., 2006; Ezhkova Е. et al., 2009). Последовательное снятие этой блокады позволяет клеткам вступать на путь терминальной дифференцировки за счёт активации транскрипции соответствующих генов с помощью белков-активаторов. При этом показано, что с возрастом при детерминации клеток к терминальной дифференцировке активность группы polycomb существенно уменьшается (Adhikary G. et al., 2004). Предполагаем также, что поскольку пласт, в котором экспрессируется инво-люкрин, выполняет функцию защитного барьера кожи, его сохранение даже в пожилом и старческом возрасте, несмотря на снижение пролиферативной активности эпидермиса, представляется жизненно необходимым.

Взаимосвязь возрастных изменений эпидермиса с уровнем содержания андрогенов в крови у лиц мужского пола. В литературе имеются сведения о прямой, либо опосредованной стимуляции андрогенами пролиферативной активности кератиноцитов (Kanda N. et al, 2005; Seiffert К. et al., 2007). Показана корреляция между общим содержанием тестостерона в крови и количеством эндокриноцитов бульбоуретральных желёз у мужчин разного возраста (Боронихина Т.В., 2007). Мы также проделали подобный анализ и получили корреляцию между пролиферативной активностью интерфолликулярного эпидермиса и уровнем тестостерона в крови (рис. 10). Корреляция составила 0,758, что даёт основания полагать, что возрастное истончение

эпидермиса у мужчин тесным образом связано с угасанием тестостеронобра-зующей функции яичек.

Заключение. Впервые с использованием моноклональных антител, являющихся маркёрами основных процессов гистогенеза эпидермиса (пролиферация, дифференцировка, клеточная гибель), на аутопсийном материале прослежены изменения интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе. Толщина клеточного пласта и его проли-феративная активность нарастают до 19-21 года и в дальнейшем постепенно снижаются. Пролиферативная активность кератиноцитов коррелирует с возрастными изменениями концентрации тестостерона в крови. Количество клеток с повреждённой ДНК (апоптотические клетки) увеличивается к 1925 годам и резко увеличивается после 60 лет. Терминальная дифференцировка кератиноцитов с возрастом существенно не изменяется.

0-1 2-7 8-12 13-16 17-21 22-35 36-45 46-60 61-74 75-90

Возрастные группы, годы 4 Индекс К/-67 —А—Концентрация тестостерона

Рис. 10. Индекс Кл-67 в интерфолликулярном эпидермисе кожи височной области (собственные данные) в сравнении с концентрацией общего тестостерона в крови (по Н.У. Гец, 2003; цит. по Т.В. Боронихиной, 2007) у лиц мужского пола в различных возрастных группах. По оси ординат слева - индекс Кт-67,%; справа - концентрация тестостерона в крови, нг/дл.

ВЫВОДЫ

1. Толщина интерфолликулярного эпидермиса кожи височной области у лиц мужского пола изменяется на всём протяжении онтогенеза. Так, начиная

с антенатального периода до юношеского возраста, происходит утолщение

23

клеточного пласта. В последующие возрастные периоды наблюдается его постепенное истончение.

2. Изменение толщины интерфолликулярного эпидермиса, связанное с интенсивностью пролиферативной активности кератиноцитов, изучено путём определения в нём содержания Кь67-позитивных клеток. Начиная с 23-й недели антенатального развития происходит постепенное увеличение количества делящихся клеток, к 19-21 годам постнатального развития отмечается максимальная экспрессия белка Кл-67. Оставаясь на одном уровне до 45 лет, к 75 годам количество этих клеток уменьшается.

3. В онтогенезе содержание клеток с повреждённой ДНК (апоптотиче-ские р53-позитивные клетки) в интерфолликулярном эпидермисе возрастает. Наблюдается два максимальных значения этого показателя: первое - в 1925 лет, второе, более выраженное, - в 66-75 лет.

4. Барьерная функция эпидермиса, если судить по толщине пласта инво-люкрин-позитивных клеток, в онтогенезе не изменяется в абсолютных величинах, но возрастает в процентах от общей толщины пласта клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Горелова М.В. Пролиферативная активность интерфолликулярного эпидермиса кожи височной области мужчин 20-45 лет // Морфология. - 2010. - Т. 137, № 4. - С. 59.

2. Горелова М.В. Направление изменения толщины эпидермиса кожи волосистой части головы мужчин с учётом пролиферации кератиноцитов // Ученые записки Орловского государственного университета. - 2010. - Т. 36, № 2. - С. 150-155.

3. Горелова М.В. Послойное распределение Ю-67- и р53-позитивных клеток в эпидермисе волосистой части головы у мужчин в постнатальном онтогенезе // Ученые записки Орловского государственного университета. - 2010. - Т. 38, № 4. — С.180-184.

4. Горелова М.В. Оценка состояния интерфолликулярного эпидермиса в качестве критерия специфической активности ГЛС кожного действия И XVIII Российский нац. конгр. "Человек и лекарство": Тез. докл., Москва, 11-15 апр. 2011г. - М., 2011. - С. 591.

5. Горелова М.В. Изучение возрастных особенностей пулов Кл-67- и р53-позитивных кератиноцнтов интерфолликулярного эпидермиса человека // XVIII Российский нац. конгр. "Человек и лекарство": Тез. докл., Москва, 11-15 апр. 2011г. - М., 2011. -С. 591.

6. Горелова М.В. Пролиферативная активность эпидермиса височной области у лиц мужского пола с 23 недель эмбрионального до 3 месяцев постэмбрионального развития // Мат. VIII Всероссийской научи, конф. "Бабухинские чтения в Орле", Орёл, 1-2 июня 2011. - Альманах "Ретиноиды". - М.: Изд. ЗАО "Ретиноиды", 2011. - Вып. 32. - С. 247-250.

7. Горелова М.В. Пролиферативная активность интерфолликулярного эпидермиса кожи височной области с 21-й до 40-й недели антенатального периода развития // Морфология.-2011.-Т. 140, № 5. - С. 37.

8. Горелова М.В. Изменение интерфолликулярного эпидермиса кожи височной области у мужчин в онтогенезе // Всероссийская науч. конф. "Регенеративная биология и медицина": Сб. науч. трудов - М., 2011. - С. 51.

9. Горелова М.В., Алексеев А.Г., Жучков С.А. Изучение пролиферативной активности кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса кожи височной области мужчин в возрастном аспекте // XVII Российский нац. конгр. "Человек и лекарство": Тез. докл., Москва, 12-16 апр. 2010 г. -М., 2010. - С. 598.

10. Ноздрин В.И., Горелова М.В., Алексеев А.Г., Банин В.В. Морфологические особенности эпидермиса и волосяных фолликулов кожи височной области мужчин в возрастном аспекте//Морфология.-2010.-Т. 137, № 4. - С. 143.

11. Ноздрин В.И., Горелова М.В., Белоусова Т.А. Возрастные изменения эпидермиса кожи волосистой части головы у мужчин // Морфология. -2011.-Т. 139, № 1. -С. 74-81.

Соискатель

М.В. Горелова

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю благодарность сотрудникам ЗАО "Ретиноиды" -ведущ. науч. сотр., ст. науч. сотр., доц. Т.А. Белоусовой и зам. директора, по научной работе канд. биол. наук. О.И. Лаврик, докт. мед. наук, проф., чл-корр. РАМН, зам. руководителя НИЦ БМТ ГНЦ ВИЛАР Россельхозакадемии

B.В. Банину - за обсуждение работы и конструктивные замечания, экспертам и патологоанатомам Бюро судебно-медицинской экспертизы Орловского облздравотдела (рук. - А.М. Лобанов), патологоанатомического отделения Городской больницы им. С.П. Боткина г. Орла (рук. — O.A. Тимошина), эксперту Бюро судебно-медицинской экспертизы № 1 г. Москвы Е.В. Колесниковой - за помощь в сборе аутопсийного материала, сотруднику кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии МИ ОГУ доц.

C.А. Жучкову и ст. лаб. патологоанатомического отделения Орловской областной клинической больницы Л.В. Маркиной - за помощь в освоении гистологической техники и иммуногистохимических методов.

Подписано в печать 16.10.2011 г. Формат 60 х 84/16. Усл. печ. л. 1,8. Гарнитура Times New Roman. Бумага тип. Печать цифровая. Тираж 100 экз. Заказ №204

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором в типографии ЗАО "Ретиноиды" 111123, Москва, ул. Плеханова, д.2/46 стр. 5. Тел./факс: (495) 788-50-14.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Горелова, Марина Вячеславовна, Москва

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Орловский государственный университет"

ЗАО Фармацевтическое научно-производственное предприятие

"Ретиноиды"

На правах рукописи

04.2.01 1 6 5 517"

ГОРЕЛОВА МАРИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ИЗМЕНЕНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЕРАТИНОЦИТОВ ИНТЕРФОЛЛИКУЛЯРНОГО ЭПИДЕРМИСА ВИСОЧНОЙ ОБЛАСТИ У ЛИЦ МУЖСКОГО ПОЛА В ОНТОГЕНЕЗЕ

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация

на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: докт. мед. наук., проф. В.И. Ноздрин

Москва-2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ...................................7

1.1. Обоснование выбора специальности................................................7

1.2. Актуальность........................................................................................7

1.3. Цели и задачи........................................................................................8

I » | г

1.4. Положения диссертации, выносимые на защиту...........................9

1.5. Научная новизна..................................................................................10

1.6. Практическая значимость.................................................................10

1.7. Внедрение.............................................................................................10

1.8. Апробация............................................................................................11

1.9. Публикации.........................................................................................11

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. БЕЛКИ К1-67, Р53 И ИНВОЛЮК-РИН КАК МАРКЁРЫ ОСНОВНЫХ ПРОЦЕССОВ ГИСТОГЕНЕЗА ИНТЕРФОЛЛИКУЛЯРНОГО ЭПИДЕРМИСА У ЧЕЛОВЕКА.......................................................................................12

2.1. Современные представления о гистофизиологии эпидермиса у

человека............................................................................................12

2.2. Возрастные особенности строения инетрфолликулярного эпи-

дермиса у человека...........................................................................20

2.3. Белок КЗ-67 как маркёр пролиферации интерфолликулярного

эпидермиса у человека...................................................................24

2

2.4. Белок р53 как маркёр клеток с повреждённой ядерной ДНК в интерфолликулярном эпидермисе у человека............................25

2.5. Белок инволюкрин как маркёр терминальной дифференциров-ки клеток интерфолликулярного эпидермиса у человека........26

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.............................................................29

3.1. Материал..............................................................................................29

3.2. Методы.................................................................................................37

3.2.1. Гистологическая техника......................................................37

3.2.2. Методика измерения толщины интерфолликулярного

эпидермиса..............................................................................38

3.2.3. Иммуногистохимический метод выявления белка Ю-67.39

3.2.4. Особенности иммуногистохимического метода выявления

белка р53.................................................................................40

3.2.5. Особенности иммуногистохимического^метода выявления

белка инволюкрин................................................................41

3.2.6. Методика подсчёта Ю-67- и р53-позитивных клеток......41

3.2.7. Методика подсчёта инволюкрин-позитивных клеток.... 42

3.3. Методы статистического анализа...................................................42

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..........45

4.1. Изменение толщины интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе...........................45

4.2. Изменение содержания Кь67-позитивиых клеток в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе............................................................................................52

4.3*. Изменение содержания р53-позитивных клеток интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского полав онтогенезе............................................................................................61

4.4. Изменение пласта инволюкрин-позитивных клеток интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе........................................................................................69

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ........................................................................................76

511. Толщина интерфолликулярного эпидермиса кожи височной области у лиц мужского пола в онтогенезе......................................76

5.2. Состояние пролиферативной активности кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе...............................................................................78'

5.3. Степень выраженности, инволютивных процессов в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе........................................................................................80

5.4. Выраженность процессов терминальной дифференцировки интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе....................................................................82

5.5. Взаимосвязь возрастных изменений эпидермиса с уровнем содержания андрогенов в крови у лиц мужского пола..................84

5.6. Заключение...........................................................................................85

ВЫВОДЫ............................................................................................................87

ВНЕДРЕННЫЕ СТАНДАРТНЫЕ ОПЕРАЦИОННЫЕ ПРОЦЕДУРЫ И МЕТОДИЧЕСКАЯ РЕКОМЕНДАЦИЯ.......................................................88

ЛИТЕРАТУРА.................................................................................................118

ПРИЛОЖЕНИЕ...............................................................................................138

БЛАГОДАРНОСТИ........................................................................................142

\

СОКРАЩЕНИЯ

Гем. — гематоксилин Д - дерма

МКА - моноклональные антитела Окр. — окраска Эоз. — эозин Эп - эпидермис

ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Обоснование выбора специальности

В' соответствии с Государственным рубрификатором научно-технической информации (ГРНТИ-2007, дата введения - 01.01.2008) работа относится к разделу 34.41 "Морфология человека и животных", подразделу 34.41.02 "Общие закономерности морфогенеза, эмбриогенеза и онтогенеза человека и животных" (УДК 611.013; 591.4; 591.3).

Работа выполнена в соответствии со специальностью 03.03.04 "Клеточная биология, цитология,, гистология". Формула специальности (с купюр.): ... строение, развитие; функционирование клеток и тканей, ... в норме, ... Области исследований (с купюр.): ... изучение закономерностей цито- и гистогенеза, строения и функции клеток и тканей; ... изучение закономерностей дифференцировки клеток и тканей, их физиологической-регенерации и регуляции этих процессов ... Отрасль наук: медицинские науки.

1.2. Актуальность

Общий план строения эпидермиса на уровне световой' и электронной микроскопии у экспериментальных животных и человека описан достаточно полно, что нашло отражение в монографиях и оригинальных работах последних десятилетий (К.А. Калантаевская, 1972; О.Д. Мяделец и др., 2006; В.И. Ноздрин и др., 2008; И.О. Смирнова, 2005; Т.К. Bhattacharyya et al., 2004; N. Dayan, 2008). Вместе с тем, многие детали, важные в фундаментальном и особенно в прикладном отношениях, ещё нуждаются в углублённом изучении. Так, например, остаются малоизученными расовые, половые и региональные особенности строения кожи в возрастном аспекте. В предыдущих исследованиях подробно изучены особенности реактивных изменений кожи в ответ на воздействие температурных факторов, влажности, ультрафиолетового облучения и проч. (В.А. Дубинская и др., 2000; A.A. Москалев,

2008; М.Н. Скиба, 2008; Е.С. Снарская, 2011; L. Baumann, 2007; A.R. Böwen et al., 2003; M. Engelke et al., 1997; G.J. Fisher et al., 2002; J. Krutmann, 2010)..

Однако в этих работах не делается акцент на особенностях строения интерфолликулярного эпидермиса, эпителия волосяных воронок, устьев потовых желёз и др: Продолжают оставаться актуальными; вопросы строения кожи в антенатальном и постнатальном онтогенезе у животных и человека. Недостаток фундаментальных знаний по этим вопросам не позволяет объективно оценивать активность дерматотропных лекарственных препаратов, что в конечном счёте негативно сказывается на рекомендациях по их применению.

В практику гистологических исследований последних лет входят методы идентификации ядерных и цитоплазматических макромолекул с помощью моноклональных антител. Преимуществом таких методов является точность выявления этих соединений, так как моноклональные антитела отличаются высокой специфичностью и селективно выявляют антигены с известной локализацией, функцией и молекулярным строением. Использование моноклональных антител позволяет по-новому взглянуть на устоявшиеся факты и концепции, позволяет получить аргументы для новых предположений; способствует расширению знаний, как'фундаментальных, так ^»прикладных. Всё: это делает актуальным дальнейшее изучение структурных элементов'кожи человека с учётом её возрастных, половых и региональных особенностей с использованием доказательных методов исследования, таких как. иммуноги-стохимия и морфометрический анализ. Учитывая вышесказанное, были сформулированы цель и задачи настоящей работы.

1.3. Цель и задачи

Целью настоящей работы стало выявление изменении пролиферации и дифференцировки кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса височ-

ной области у лиц мужского пола в онтогенезе. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи.

1. Изучить изменение толщины интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

2. Изучить изменение содержания К1-67-позитивных клеток (маркёр пролиферации) в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

3. Изучить изменение содержания; р53-позитивных клеток (маркёр-повреждения^ ДНК) в .интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

4. Изучить толщину пласта инволюкрин-позитивных клеток (маркёр терминальной дифференцировки) в интерфолликулярном эпидермисе височной области у лиц мужского пола в онтогенезе.

1.4. Положения диссертации, выносимые назащиту

Пролиферация и дифференцировка интерфолликулярного, эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе претерпевает определённые изменения..

1. Изменяется его толщина - у плодов и новорождённых эпидермис тонкий, к 19-21 годам он постепенно утолщается, далее его толщина не изменяется до 40-45 лет, а к старческому возрасту эпидермис истончается.

2. Изменяется- пролиферативная активность кератиноцитов - начиная с антенатального периода развития происходит постепенное увеличение количества Кл-67-позитивных клеток, максимальное число клеток, меченых МКА к белку Кл-67, в эпидермисе достигается к 19—21 годам жизни. Оставаясь приблизительно на одном уровне до 45 лет, к 75 годам количество Кл-67-позитивных клеток уменьшается.

3. Содержание клеток с повреждённой ДНК (апоптотические клетки) нарастает с возрастом, при этом первый максимум содержания р53-

позитивных клеток выявляется в 19—25 лет. Проявление второго максимума экспрессии белка р53 наблюдается в возрастном интервале 66-75 лет.

4. Экспрессия кератиноцитами белка терминальной дифференцировки - инволюкрина - с возрастом существенно не изменяется.

1.5. Научная новизна

Впервые с использованием моноклональных антител — маркёров основных процессов гистогенеза, таких как пролиферация и дифференцировка, на аутопсийном материале прослежены изменения интерфолликулярного эпидермиса височной области у лиц мужского пола в онтогенезе. Показано, что толщина эпидермиса и его пролиферативная активность одновременно нарастают до 19-21 года и в дальнейшем постепенно снижаются. Количество клеток с повреждённой ДНК увеличивается к 19-25 годам и резко возрастает после 60 лет. Терминальная дифференцировка кератиноцитов с возрастом существенно не меняется.

1.6. Практическая значимость

Полученные результаты используются^ в гистофармакологических исследованиях при оценке эффективности новых лекарственных средств кожного действия, в морфологической диагностике заболеваний кожи, а также в учебном процессе при преподавании курса гистологии по специальности "Лечебное дело" и "Педиатрия".

1.7. Внедрение

По результатам исследования написаны методические рекомендации: "Окраска гистологических препаратов с помощью моноклональных антител к Ki-67", "Окраска гистологических препаратов с помощью моноклональных антител к р53", "Окраска гистологических препаратов с помощью моноклональных антител к инволюкрину" и "Окраска биопсийного материала кожи

человека с помощью моноклональных антител к Ki-67". Рекомендации внедрены в Научном дерматологическом центре и Научном отделе Фармацевтического научно-производственного предприятия ЗАО "Ретиноиды". На кафедру гистологии, цитологии и эмбриологии медицинского института ФГБОУ ВПО "Орловский государственный университет" передано 80 гистологических препаратов кожи височной области лиц мужского пола в возрасте 9 месяцев, 13, 19 и 74 лет, окрашенных гематоксилином и эозином, для преподавания курса гистологии по специальностям "Лечебное дело" и "Педиатрия".

1.8. Апробация

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XVII и XVIII Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, апрель 2010 г., апрель 2011 г.), на X Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, сентябрь 2010 г.), на VIII Всероссийской научной конференции "Бабухинские чтения в Орле" (Орёл, июнь 2011г.), на Межлабораторной конференции НИИ морфологии человека РАМН (Москва, сентябрь, 2011), на Ш Эмбриологическом симпозиуме "ЮГРА-ЭМБРИО-2011" (Ханты-Мансийск, октябрь 2011 г.), на Всероссийской научной конференции "Регенеративная биология и медицина" (Москва, октябрь 2011 г.).

1.9. Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них статей в журналах по списку ВАК - 3.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. БЕЛКИ KI-67, Р53 И ИНВО-ЛЮКРИИ КАК МАРКЁРЫ ОСНОВНЫХ ПРОЦЕССОВ ГИСТОГЕНЕЗА ИНТЕРФОЛЛИКУЛЯРНОГО ЭПИДЕРМИСА У ЧЕЛОВЕКА

2.1. Современные представления о гистофизиологии эпидермиса у человека

Интерфолликулярный эпидермис — это поверхностный слой кожи между волосяными фолликулами, который представлен системой постоянно обновляющихся клеток, образующих многослойный плоский ороговевающий эпителий. Эпидермис характеризуется наличием нескольких дифферонов клеток, отсутствием межклеточного вещества, развитыми межклеточными соединениями и высокой способностью к физиологической и репаративной регенерации. Полидифферонная ткань интерфолликулярного эпидермиса представлена, в основном, клеточным диффероном кератиноцитов.

Кроме дифферона кератиноцитов- в эпидермисе имеются другие диф-фероны - нейроэктодермального (меланоциты, клетки Меркеля) и мезенхи-мального (внутриэпидермальные лимфоциты, клетки Лангерганса и. Грин-стейна) происхождения. Клетки эпителиального пласта связаны между собой при помощи контактов: интердигитаций, щелевидных соединений, десмосом, плотных и промежуточных соединений, обеспечивающих в клеточном пласте эпидермиса механическую и коммуникативную связи (Н.В. Махнева и др., 2009; J.Fore, 2006; А. Haake et al., 2001).

Основным процессом, протекающим в эпидермисе и затрагивающим дифферон кератиноцитов, является их кератинизация - это процесс цито-дифференцировки, связанный с синтезом и накоплением в цитоплазме кератинов (специфических фибриллярных белков) и преобразованием их в тоно-филаменты и тонофибриллы (сложные надмолекулярные структуры тонофи-ламентов) (Е. Fuchs, 1995; J. Karasek, 1988; D. Skerrow, 1982).

Основные морфогенетические превращения кератиноцитов находятся под контролем нервной, эндокринной и иммунной систем. В монографии И.О. Смирновой и соавт. (2005) обобщены литературные данные, что кера-тиноциты эпидермиса человека не только имеют специфические рецепторы и потому чувствительны к целому ряду гормонов, но и сами способны к синтезу или метаболизму биологически активных пептидов. Это относится как к серотонину, мелатонину, кортикотропину, тиронину, глюкокортикоидам, гормону роста, половым гормонам, так и к целому ряду цитокинов (H.H. Белушкина и др., 2009; И. Помыткин, 2010). Опубликованы доказательства, что кератиноциты имеют собственную 5а-редуктазу, которая превращает тестостерон в активный дигидротестостерон (К. Seiffert et al., 2007; С.С. Zouboulis et al., 2007). Эти клетки содержат ядерные рецепторы к андро-генам, которые могут прямо или опосредованно контролировать их пролиферацию (N. Akimoto et al., 2002; V. Chaturvedi et al., 1999; N. Kanda et al, 2005; G. Pelletieret al., 2004; C. Zouboulis et al., 2007). Есть данные, что половые гормоны могут влиять прямо или опосредованно на апоптоз кератиноцитов (V.l. Alexaki et al., 2009). Эпидермальные цитокины обеспечивают кооперацию иммунных и неиммунных клеток. Как медиаторы цитокины осуществляют позитивную и негативную иммунную регуляцию^ контролируют все этапы дифференцировки и функционирования клеток (О.В. Белова и др., 2008; О.П. Гладских и др., 2002; В.К. Гусак и др., 2001). Избирательное взаимодействие, локальность эффекта, избыточность и взаимосвязанность являются характерными для цитокинов свойствами (O.P. Катунина, 2009; О.Д. Мяделец и др., 2006; I.M. Freedberg et al., 2001).

Кератиноциты с помощью полудесмосом связаны с базальной мембраной, формируя дермоэпидермальное соединение. Оно представлено клеточной мембраной базальных кератиноцитов с полудесмосомами, светлой, базальной и фиброретикулярной пластинками. Светлая пластинка располагается под слоем базальных кератиноцитов. Она образована гликопротеинам