Особенности строения кожи крыс в условиях воздействия дегтя березового

Крутых, Евгений Геннадьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности строения кожи крыс в условиях воздействия дегтя березового
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности строения кожи крыс в условиях воздействия дегтя березового"

На правах рукописи

Крутых Евгений Геннадьевич

ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ КОЖИ КРЫС В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ ДЁГТЯ БЕРЁЗОВОГО

03.00.25. — гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

^иоччаьэ1

Москва-2008

003449591

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Орловский государственный университет» и в ЗАО Фармацевтическое научно-производственное предприятие «Ретиноиды».

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

НОЗДРИН Владимир Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

степанова Ирина Петровна

Ведущая организация: Государственное учреждение Научно-исследовательский институт Морфологии человека Российской академии медицинских наук.

Защита диссертации состоится «13» ноября 2008 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.08 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6.

доктор медицинских наук, доцент боронихина Татьяна Владимировна

Автореферат разослан « 0& »

Ученый секретарь

диссертационного совета / (У

кандидат биологических наук у О.Б. САВРОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Большинство веществ при местном нанесении способно оказывать биологическое действие, изменяя процессы гистогенеза кожи (S. Inan et al., 2006). Исследование этих процессов даёт представление о механизме действия лекарственных препаратов и открывает качественно новый подход к рациональной фармакотерапии кожных болезней (А.А. Кубанова, 2005). С древних времён дёгти (древесные и каменноугольные) использовались в народной медицине, а в дерматологии в течение последних 100 лет входят в состав многих лекарственных прописей (С. Есснер, 1913; А. Максимова, 2006). В последние годы у дерматологов появился интерес к средствам, не содержащим глюкокортикоиды. Терапия хронических дерматозов с применением содержащих дёготь препаратов занимает особое место, оказывая схожий с лечением стероидами клинический эффект (В.И. Альбанова, О.Г. Лукина, 2005). Его применение в клинике может быть эффективно, когда другие средства не помогают или не могут быть использованы (W.A. Dodd, 1993). В литературе имеется небольшое количество публикаций по биологической активности каменноугольного дёгтя. Местное нанесение каменноугольного дёгтя вызывает утолщение эпидермиса, образование комедонов и атрофию сальных желёз, а также он подавляет и изменяет синтез ДНК в человеческих кератиноцитах in vitro (В. Schoket et al., 1991). Работы, посвященные изучению воздействия дёгтя берёзового на гистоструктуру эпидермиса, практически отсутствуют, из чего следует, что изучение гистогене-тических процессов, происходящих в коже в условиях воздействия дёгтя берёзового, является актуальным. Цель и задачи исследования были сформулированы следующим образом.

Цель и задачи. Целью настоящего исследования стало изучение особенностей строения кожи крыс в условиях воздействия дёгтя берёзового. В соответствии с целью сформулированы задачи:

1. Продемонстрировать дерматотропную активность дёгтя берёзового на примере кожи крыс.

2. Изучить особенности строения кожи крыс при накожном нанесении дёгтя берёзового с учётом его воздействия на изучаемые структуры.

3. Изучить особенности строения структурных компонентов кожи, с учётом дозы наносимого дёгтя берёзового и полом экспериментальных животных.

4. Проследить длительность дерматотропного эффекта, достигнутого применением берёзового дёгтя, в различные сроки после отмены аппликаций исследуемого средства.

Положения, выносимые на защиту. На защиту вынесены следующие положения:

1. Изменения эпидермиса под действием дёгтя берёзового проявляются в виде его дозозависимого утолщения; увеличения площади кератиноцитов шиповатого слоя и ширины зернистого слоя, утолщения рогового слоя, возрастания в ростковом слое клеток, меченных маркёрами пролиферации РСЫА и Кл-67. Изменения производных кожи проявляются в морфологических признаках себостатического эффекта и трихотропного воздействия. Изменения дермы проявляются в диффузной лимфогистиоцитарной инфильтрации и полнокровии, подтверждаемых дозозависимым увеличением клеточной плотности дермы и доли суммарной площади сосудов микроциркуляторного русла в поле зрения микроскопа.

2. Степень выраженности выявленных морфологических проявлений и особенности их регресса после отмены аппликаций зависят от пола экспериментальных животных.

3. Морфологические и иммуноморфологические проявления дермато-тропного эффекта от воздействия дёггя берёзового носят транзиторный характер, снижаясь к 28-му и достигая контрольных значений параметров к 42-му дню после отмены аппликаций.

Научная новизна. В условиях эксперимента морфологическими и им-муноморфологическими методами продемонстрированы гистоструктурные проявления дерматотропной активности дёгтя берёзового. Показано его модифицирующее влияние на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов. В течение 6 недель после отмены воздействия прослежены морфологические изменения строения кожи, вызванные дёгтем берёзовым. Впервые выявлены особенности изменений структурных компонентов кожи при воздействии дёгтя берёзового, связанные с его дозой и полом экспериментальных животных, а также степень обратимости наблюдаемых эффектов.

Практическая значимость. Использованный в работе подход к изучению специфической дерматотропной активности дёгтя берёзового может быть реализован при изучении действия других дерматотропных веществ в рамках направления «Гистофармакологические исследования кожи». Полученные данные о путях модифицирования воздействием дёгтя берёзового отдельных звеньев морфогенеза структурных компонентов кожи могут быть полезны для понимания механизмов клинических эффектов, достигаемых применением дёгтя или содержащих дёготь лекарственных препаратов. Установленные факты о характере изменений эпидермальных и дермальных структур, наступающих под воздействием берёзового дёгтя, с учётом использованной дозы, половых особенностей и продолжительности эффекта могут

оказать пользу дерматологам при выработке тактики фармакотерапии хронических дерматозов.

Внедрение. Результаты исследований использованы при составлении нормативно-технической документации на лекарственное средство «Дёготь берёзовый». Получен патент № 2221587 с приоритетом от 20.01.2004. на изобретение «Лекарственное средство для лечения дерматозов, способ его получения (варианты) и способ лечения заболеваний кожи». Разработана методика анализа дёгтя берёзового по содержанию фенола, которая внесена в ФСП на субстанцию (ФСП 42-1970-06).

Апробация. Основные положения диссертации доложены и обсуждены: на III конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2003), на VII Международном съезде ФИТОФАРМ-2003 «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2003), на Всероссийской конференции «Бабухинские чтения в Орле» (2004), на Всероссийском научном совещании анатомов, гистологов и эмбриологов «Актуальные проблемы учения о тканях» (Санкт-Петербург, 2006), на II Всероссийском конгрессе дерматовенерологов (Санкт-Петербург, 2007), на пяти Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2002,2003,2005,2006,2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них в журналах, рекомендуемых ВАК, — 4.

Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 120 страницах компьютерного текста (гарнитура Times New Roman, формат А4, 1800 знаков на 1 странице), состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение результатов собственных исследований», заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 72 рисунками. Указатель литературы включает 136 источников, в том числе— 70 отечественных и 66 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дёготь берёзовый-сырец получали на дёгтекурне из коры берёз, произрастающих в ареале г. Зилаир (Башкортостан). Дёготь подвергали обработке по технологии, разработанной в ЗАО «Ретиноиды», позволяющей очистить его от механических примесей (патент № 2221587 «Лекарственное средство

для лечения дерматозов, способ его получения (варианты) и способ лечения заболеваний кожи» с приоритетом от 20.01.2004). Образцы дёгтя берёзового, отобранные для исследования, стандартизировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии по разработанной методике, приведенной ниже. Для исследования использовали аутбредных крыс обоего пола в возрасте 1,5-2 месяцев. Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755). Эвтаназию животных осуществляли в соответствии с «Методическими рекомендациями по выведению животных из эксперимента» (1985).

Исследование 1. Исследование строения кожи межлопаточной области крыс-самок, подвергавшихся воздействию дегтя берёзового по 0,05; 0,1 и 0,25 г/сут в течение 14-и дней. Изучение проводили на 4 группах крыс по 6 самок в каждой: интактные животные — контрольная группа; накожное нанесение дёгтя берёзового — 0,05 г/сут (ДБ 0,05 г/сут); накожное нанесение дёгтя берёзового — 0,1 г/сут (ДБ ОД г/сут); накожное нанесение дёгтя берёзового — 0,25 г/сут (ДБ 0,25 г/сут). Нанесение дёгтя берёзового проводили ежедневно в течение 14-и суток по 0,05; 0,1 и 0,25 г/сут, что в пересчёте на массу тела соответствовало 0,25; 0,5 и 1,25 г/кг. Аппликации осуществляли при помощи механической микропипетки с регулируемым объемом дозы на предварительно выстриженный участок кожи межлопаточной области спины размером 2x2 см.

Исследование 2. Исследование строения кожи межлопаточной области крыс обоих полов, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового по 0,05 г/сут в течение 14-и дней. Эксперимент проводили на 2-х группах крыс по 6 особей обоего пола в каждой: интактные животные — контрольная группа (самки и самцы); накожное нанесение дёгтя берёзового— 0,05 г/сут (ДБ 0,05 г/сут) (самки и самцы). Нанесение дёгтя берёзового проводили ежедневно в течение 14-и суток по 0,05 г/сут (0,25 г/кг) при помощи механической микропипетки с регулируемым объёмом дозы на предварительно выстриженный участок кожи межлопаточной области спины, размером 2x2 см. Образцы кожи забирали через сутки после последней аппликации.

Исследование 3. Исследование строения кожи межлопаточной области крыс обоих полов после отмены воздействия дёгтя берёзового по 0,05 г/сут в течение 14-и дней. Нанесение дёгтя берёзового проводили ежедневно в течение 14 суток по 0,05 г/сут (0,25 г/кг) при помощи механической микропипетки с регулируемым объемом дозы на предварительно выстриженный участок кожи межлопаточной области спины, размером 2x2 см. Состояние эпидермиса оценивали на 14-й, 28-й и 42-й дни после прекращения нанесения дёгтя берёзового. На каждом сроке изучалось по 2 группы крыс по 6 особей обоего

пола: интактные животные — контрольная группа (самки и самцы); накожное нанесение дёгтя берёзового — 0,05 г/сут (ДБ 0,05 г/сут) (самки и самцы).

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Дёготь берёзовый представляет собой многокомпонентную композицию, состав которой установлен далеко не полностью. В настоящей работе была предпринята попытка разработать методику позволяющую стандартизировать образцы дёгтя берёзового, используемого в экспериментальной программе. Вещества определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Использовали систему для ВЭЖХ фирмы «Gilson» (Франция): однопоршневый насос (модель 302) с манометрическим модулем (модель 802 С); инжектор для ввода проб «Rheodyne» (США), УФ-детектор с переменной длиной волны «Holochome» (Франция), колонку заполненную сорбентом Ultrasphere Si, 5 мкм, (250x4,6 мм), персональный компьютер IBM PC с программой «Муль-тиХром» для записи и обработки хроматограмм (Ю.А. Каламбет, 1995). В качестве стандартных образцов использовали фенол, орто-, мета-, пара-крезолы, гваякол и салициловую кислоту фирмы ICN (США). Рассчитали абсолютные времена удерживания изучаемых образцов. В тех же условиях произведён анализ модельной смеси, включающей все выбранные компоненты. Абсолютное время удерживания стандартных веществ и соответствующих компонентов в смеси равно (Табл. 1). На основании полученных данных стало возможным идентифицировать изучаемые компоненты в дёгте берёзовом и определить их количественное содержание. В дальнейшем было проведено исследование 6 различных образцов дёгтя берёзового одной серии, получены схожие хроматограммы, идентифицированы искомые вещества и рассчитано их процентное содержание (Рис. 1, табл. 2). Содержание фенола оказалось преобладающим, в связи с чем было решено стандартизировать образцы дёгтя именно по этому компоненту. В результате этих исследований впервые была предложена методика стандартизации дёгтя берёзового по фенолу, которая вошла в ФСП 42-1970-06.

Гистологическая техника. Для гистологических и иммуноморфологи-ческих исследований иссекали лоскут кожи площадью 4 см2 из зоны аппликаций и фиксировали его в расправленном состоянии в 10 % нейтральном формалине (pH 7,4). Дальнейшую обработку материала проводили по стандартным гистологическим методикам. Подготовка срезов проводилась с учетом требований по технологической стандартизации. Проводили одновременное окрашивание всех образцов. В исследовании использовали световые микроскопы Бимам Р-13-1 (Ломо), Axioscop-2 (Carl Zeiss) и Axiostar (Carl Zeiss). При изучении препаратов учитывали следующие критерии: общая характери-

стика эпидермиса, состояние слоев эпидермиса, число рядов эпидермоцитов, наличие митозов, а также общая характеристика сально-волосяных комплексов и дермы.

Морфометрические измерения проводили на аппаратно-программном комплексе ДиаМорф (фирма ДиаМорф, Россия), который состоял из микроскопа Aksioskop-2 фирмы Carl Zeiss (Германия) с TV-адаптером, цифровой видеокамеры Kampro КС 583С (Тайвань), монитора для получения изображений, компьютера с программным обеспечением фирмы ДиаМорф (Россия). При этом использовали программы компьютерного анализа видеоизображений CITO. Для отдельных морфометрических исследований применяли свободно распространяемое программное обеспечение Image Tool (USA, University Texas), калибровку которого осуществляли при помощи объект-микрометра ОМП с ценой деления 0,01 мм. Оценивали толщину клеточного слоя эпидермиса (до рогового слоя). От каждого животного из группы исследовали по одному срезу. Измерения производили во всех полях зрения при об. х40, ок. х Ю (в среднем 18-20 полей зрения на срез). В поле зрения осуществляли 3 измерения перпендикулярно базальной мембране. Число вариант в группе составляло 360 и более. Для определения средних геометрических размеров кератиноцита шиповатого слоя исследовали по одному срезу от каждого животного из группы. Измерения производили при об. хЮО и ок. х40 (в среднем 18—20 полей зрения на срез). В поле зрения измеряли площади двух кератиноцитов и их ядер. Площадь цитоплазмы определялась как разность между площадью кератиноцита и площадью его ядра. Число вариант в группе составляло 216 и более. Ядерно-цитоплазматическое отношение рассчитывали по формуле:

AS, _ AS,

AS4 " A(S.-SJ '

где SK— площадь клетки, Su— площадь цитоплазмы клетки, S,— площадь клеточного ядра, AS,— средняя площадь ядра измеренных клеток, AS„— средняя площадь цитоплазмы измеренных клеток. Если ядерно-цитоплазматическое отношение равно или больше 1, то клетку относят к стволовым, юным или напротив, умирающим клеткам, а если — меньше 1, то это характерно для зрелых, дифференцированных, активно функционирующих клеток; при этом, чем меньше значение ядерно-цитоплазматического отношения, тем выше степень дифференцировки клетки (О.Д. Мяделец, 2002). Абсолютные и относительные размеры сальных желёз и их компонентов определяли, исследуя по одному срезу от каждого животного из группы. Измерения производили во всех полях зрения, содержащих профили сальных желёз, при об. х40, ок. хЮ (в среднем 18-20 полей зрения на срез).

Определялась суммарная площадь железы, площади базальных и дифференцированных себоцитов. Относительные параметры рассчитывали по формулам:

о _ Sfa, и _ _ йдиф

С*21 итк ^ диф отн '

где S - площадь сальной железы, S5a3OTH. - относительная площадь базальных себоцитов, - относительная площадь дифференцированных себоцитов, Se^ • -площадь базальных себоцитов, S^ -площадь дифференцированных себоцитов. Оценку себостатического эффекта осуществляли, анализируя частное от деления S6a3 o-m/S^ отю увеличение которого указывало на снижение функциональной активности железы.

Определяли клеточную плотность дермы с распределением клеток по фактору формы. От каждого животного из группы исследовали по одному срезу. Измерения производили во всех полях зрения при об. х40, ок. х10 (в среднем 18-20 полей зрения на срез). Измеряли общее количество клеток в субэпидермальном слое дермы, после чего проводили разделение по фактору формы. Клетки с фактором формы от 0 до 0,6 считали клетками фибробла-стического ряда, а от 0,61 до 1,0 — мононуклеарного (клетки воспалительного инфильтрата). Оценивали удельную долю сосудов микроциркуляторного русла в субъэпидермальном слое дермы. Для этого от каждого животного из группы исследовали по одному срезу. Измерения производили во всех полях зрения, где присутствовали сосуды, при об. ><40, ок. хЮ (в среднем 18-20 полей зрения на срез). Проводили измерение суммарной площади сосудов микроциркуляторного русла субэпидермапьного слоя дермы, после этого измеряли общую площадь дермы в поле зрения. Расчёт вели по фомуле:

где Р — удельная доля сосудов (%), Sc — суммарная площадь сосудов в поле зрения, 8д — площадь дермы в поле зрения.

Иммуноморфологические методы исследований. Для иммуноморфоло-гического исследования использовали антитела к белкам:

PCNA (proliferation cell nuclear antigen — ядерный антиген пролиферую-щих клеток) — представляет собой циклин с молекулярной массой 36 кД, является частью ДНК-полимеразы 5. Его экспрессия осуществляется на всех стадиях митотического цикла и отражает общий уровень кратного (поли-плоидизация, деление клеток) или некратного (репарация, направленный синтез белка и др.) увеличения ДНК. Некратное увеличение минимально, поэтому его можно не учитывать (Е.М. Каралова и др., 1988). PCNA является неселективным маркёром, т.е. не позволяет отличить деление клетки от увеличения ДНК, не сопровождающегося дальнейшими кариокинезом и цитотомией.

Ki-67— ядерный белок, высокоселективный маркёр пролиферативной активности, разрушается после митоза в течение 60-90 минут, поэтому клетки не окрашиваются им в раннем Gj периоде; по информативности близок к 3Н-тимидиновой метке (T. Scholzen, J. Gerdes, 2000).

Постановку иммунопатологического окрашивания осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя. После депарафинирования и регидратации срезов проводили демаскировку антигенов кипячением образцов в 10 мМ цитратном буфере на водяной бане. Для проведения иммуноги-стохимической реакции использовали моноклональные антитела PCNA (Clone PC 10), Ki-67 (Clone SP-6), фирмы Labvision (США). Использовали следующие рабочие разведения антител: PCNA— 1:200; Ki-67— 1:200. Визуализацию результатов проводили с использованием системы детекции UltraVision ONE Détection System HRP Polymer & DAB Plus Chromogen той же фирмы (фермент— пероксидаза хрена, конъюгированная с аминокислотным полимером, субстрат — 3,3'-диаминобензидин). Срезы докрашивали гематоксилином Карацци и заключали в канадский бальзам. Окраску образцов проводили одномоментно; срезы покрывали стандартными покровными стеклами. Для оценки качества реакции использовали стекла с позитивным контролем для каждого из антигенов (фирма Labvision, США). Для оценки экспрессии Ki-67 и PCNA рассчитывали индексы PCNA (IPCNA) и Ki-67 (IKi-67) по формуле:

/(%) =—х100%, N

где п+ — количество меченых ядер, N — общее число ядер в базальном и шиповатом слоях в поле зрения микроскопа. Исследовали по одному срезу кожи от каждого животного. Подсчёты производили при об. х100, ок. х15 в 20-23 полях зрения среза.

Для разделения делящихся и увеличивающих содержание ДНК без последующего деления (в основном, полиплоидизирующихся) кератиноцитов, использовали индекс Р (1Р), который рассчитывали по формуле:

1р (%) = IPCNA ~~ Ifo-67 >

учитывая, что индекс PCNA отражает общий уровень ДНК, а индекс Ki-67 — пролиферативную активность клеток.

Статистическая обработка полученных данных. Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью параметрических методов вариационной статистики. Вычисления производили с использованием приложения Microsoft Excel®, входящего в пакет программного обеспечения Microsoft Office®. Статистически значимыми считали результаты с уровнем вероятности не менее 95% (достоверные значения в группах подопытных крыс в таблицах обозначены [*], достоверные значения между полами — [f ]).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследование строения кожи межлопаточной области крыс-самок, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового по 0,05; 0,1 и 0,25 г/сут в течение 14-и дней

Гистологическое исследование. Эпидермис межлопаточной области ин-тактных крыс представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием (Рис. 2а). Кератиноциты базального слоя кубической формы, расположены в один ряд; встречаются фигуры митоза. В шиповатом слое насчитывается до 2-х рядов кератиноцитов, в зернистом — 2-3 ряда клеток, содержащих небольшое количество мелких гранул кератогиалина. Роговой слой отличается полиморфизмом — имеет место чередование участков плотного и рыхлого кератина. Корнеоциты иногда содержат остатки ядер. В одном поле зрения, при объективе 10, встречается до 6-и волосяных фолликулов. Доминируют фолликулы, находящиеся в стадии анагена. В местах выхода волоса на поверхность кожи их стержни оплетены кератиновыми пластами. Сальные железы развиты хорошо, образуют комплексы с волосяными фолликулами. Дермальные сосочки немногочисленны, их расположение носит случайный характер. Клетки дермы локализуются преимущественно в субэпидермаль-ных участках. Сосуды микроциркуляторного русла мелкие, хорошо выражена подсосочковая сеть капилляров.

Эпидермис межлопаточной области крыс, подвергавшихся воздействию дёгтя березового по 0,05 г/сут в течение 14-и дней, представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием (Рис. 26). Ростковый слой состоит из 2-5 рядов кератиноцитов. В базальном слое встречаются единичные митозы. В шиповатом слое отмечены участки расширения межклеточных пространств. Зернистый слой насчитывает до 3-х рядов кератиноцитов. Гранулы кератогиалина крупнее, чем у интактных животных. В роговом слое идёт чередование участков компактного и рыхлого кератина. Встречаются локусы, содержащие ядра кератиноцитов. В одном поле зрения насчитывается до 5-и волосяных фолликулов, находящихся в стадии анагена. Структура волос представляется относительно сохранной. Сальные железы единичные, редуцированы. Дермальные сосочки немногочисленны, выглядят отечными, инфильтрированными мононуклеарными клетками. По сравнению с интактным контролем количество видимых сосудов в дерме больше. В субэпидермаль-ной зоне наблюдается выход эритроцитов в периваскулярные пространства.

Эпидермис межлопаточной области крыс, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового по 0,1 г/сут в течение 14-и дней, представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием (Рис. 2в). Базальные кератиноциты крупные, встречаются единичные митозы. Ростковый слой состоит из 4-6 рядов кератиноцитов. Зернистый слой насчитывает 3-4 ряда кератиноцитов.

Гранулы кератогиалина больше по размеру, обнаруживаются в клетках шиповатого и зернистого слоев. Роговой слой оксифильный, толстый, некоторые участки содержат ядра кератиноцитов. Волосяные фолликулы, в сравнении с интактной и подопытной группой, получавшей по 0,05 г/сут, встречаются реже — до 4-х на поле зрения. Большинство фолликулов находится в стадии анагена, единичные — в стадии телогена. Сальные железы обнаруживаются редко, редуцированы, содержат по несколько себоцитов в профиле. Дермаль-ные сосочки единичны, с признаками умеренного отёка. Отмечается значительная, практически равномерная мононуклеарная инфильтрация дермы. Поверхностные сосуды полнокровны; в субэпидермальной зоне наблюдается выход эритроцитов в периваскулярные пространства, выраженный сильнее, чем при нанесении дёгтя берёзового по 0,05 г/сут.

Кожа межлопаточной области крыс-самок, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового по 0,25 г/сут в течение 14-и дней имеет ряд характерных отличий (Рис. 2г). Ростковый слой эпидермиса состоит из 3-7 рядов кератиноцитов. В базальном слое наблюдаются единичные митозы. Участки расширения межклеточных пространств между кератиноцитами шиповатого слоя отмечаются чаще, чем в группах, подвергавшихся нанесению меньшего количества дёгтя берёзового. Зернистый слой насчитывает до 5-и рядов кератиноцитов. Гранулы кератогиалина крупные, имеют тенденцию к слиянию. В роговом слое идёт чередование участков компактного и рыхлого кератина, с преобладанием рыхлого. Участки, содержащие ядра кератиноцитов, встречаются часто, приблизительно через равные промежутки. Волосяные фолликулы фиксируются с частотой 2-4 на поле зрения. Волосы находятся преимущественно в стадии анагена, редко — в стадии телогена. Волосяные фолликулы залегают близко к поверхности, увеличены в размерах; структуры корня определяются нечётко, стержни плотно окружены компактным кератином. Сальные железы мелкие; их профили представлены несколькими себоцитами. Дермальные сосочки единичны, с признаками сильного отёка. Сосуды субэпидермальной зоны полнокровны, без признаков диапедеза. Инфильтрация по сравнению с предыдущей группой выражена сильнее.

Морфометрическое исследование. Изучены параметры: толщина клеточного эпидермиса, клеточная плотность дермы, удельная доля сосудов микроциркуляции в субэпидермальном слое дермы. Из полученных данных следует, что в сравнении с интактным контролем в группах животных, подвергавшихся нанесению дёгтя берёзового, толщина клеточного эпидермиса достоверно выше (Табл. 3). Параметр проявляет себя дозозависимо: при аппликации 0,05 г/сут толщина клеточного эпидермиса достоверно ниже, чем при более высоких дозировках. Однако значение при дозе 0,25 г/сут несколько меньше, чем при дозе 0,1 г/сут.

Клеточная плотность дермы в подопытных группах также выше в сравнении с группой интактного контроля. Повышение параметра происходит на всех дозах (Табл. 4). Значения при дозах 0,05 г/сут и 0,1 г/сут достоверно неотличимы между собой, а при дозе 0,25 г/сут — выше. Независимо от дозы происходит увеличение доли клеток мононуклеарного ряда (лимфоциты, моноциты) и снижение клеток фибробластического ряда. При дозе 0,25 г/сут изменения соотношения клеток наблюдаются, но менее выражены чем при нанесении 0,05 и 0,1 г/сут дёгтя берёзового. Установлено, что при накожном нанесении дёгтя берёзового в течение 14-и дней происходит увеличение доли сосудов микроциркуляторного русла в субэпидермальном слое дермы (Табл. 4). Изменения происходят дозозависимо. Значение, наиболее близкое к интактному, наблюдается при аппликациях 0,05 г/сут. Максимальная доля сосудов микроциркуляторного русла отмечена в случае нанесения дёгтя берёзового по 0,1 и 0,25 г/сут, причём значения показателей неотличимы друг от друга.

Таким образом, при микроскопии кожи межлопаточной области спины крыс-самок выявлено, что дёготь берёзовый обладает выраженной биологической активностью в отношении неповрежденного покрова. В эпидермисе происходит увеличение количества слоёв и усиление кератинизации. В сально-волосяных комплексах происходит снижение числа дифференцированных себоцитов, разрастание луковиц волосяных фолликулов и усиление кератинизации. В дерме отмечено увеличение числа профилей и размеров сосудов, появление периваскулярных скоплений клеток дермы (мононуклеарного и фибробластического рядов). Существует прямая зависимость между количеством наносимого дёгтя и степенью выраженности изменений в коже. С увеличением дозы происходит увеличение толщины клеточного эпидермиса за счёт числа и размеров клеток. В диапазоне доз от 0,05 до 0,25 г/сут. усиливается себостатическое действие, при максимальной дозе сальные железы практически отсутствуют. Нарастают изменения в строении волос — в разросшихся волосяных фолликулах структуры корня волоса определяются слабо, а стержни, плотно окружены компактным кератином. Происходит дозозависимое увеличение клеточной плотности дермы с преобладанием клеток лейкоцитарного ряда. С увеличением дозировки происходит увеличение доли сосудов микроциркуляции в дерме.

Исследование строения кожи межлопаточной области крыс обоих полов, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового по 0,05 г/сут в течение 14-и дней

Гистологическое исследование. Строение кожи межлопаточной области интактных крыс-самок не имеет принципиальных отличий от описанного в предыдущем исследовании. Строение кожи самцов имеет ряд отличий. Кле-

точный эпидермис, от базальной мембраны до рогового слоя, в группе крыс-самцов — толще и состоит из 4-6 рядов. В шиповатом слое насчитывается до 3 рядов кератиноцитов, в зернистом — до 2-3 рядов клеток, содержащих небольшое количество мелких гранул кератогиалина. Роговой слой выражен интенсивнее, чем у самок; преобладают участки рыхло расположенного кератина. Волосы находятся преимущественно в стадии анагена, у некоторых животных в стадии телогена. Фолликулы располагаются в дерме группами, несколько реже, чем у самок, до 5 в поле зрения. В местах выхода волос на поверхность кожи стержни оплетены кератиновыми пластами. Сальные железы образованы 2-3 дольками. Внутри группы размеры сальных желёз варьируют, но, в целом, в коже крыс-самцов они несколько меньше. Клетки дермы концентрируются преимущественно в субэпидермальных участках, визуально их количество больше в группе крыс-самцов.

Интерфолликулярный эпидермис межлопаточной области крыс обоих полов, подвергавшихся воздействию дегтя березового по 0,05 г/сут в течение 14-и дней, представлен многослойным плоским ороговевающим эпителием, состоящим из четырёх слоев. Количество рядов эпидермоцитов от базальной мембраны до рогового слоя достигает 8-9 у самок и 10-12 у самцов. Керати-ноциты базального слоя имеют кубическую форму. Встречаются единичные фигуры митоза. В некоторых полях зрения выявляются внутриэпидермальные лимфоциты. Шиповатый слой насчитывает 2-4 у самок и 4-6 у самцов рядов кератиноцитов, зернистый слой состоит из 3-5 рядов клеток у самок и 4-6 — у самцов соответственно, обнаруживаются участки, содержащие 10 и более пластов; гранулы кератогиалина крупные, имеют тенденцию к слиянию. Роговой слой неоднороден — участки плотного кератина чередуются с разрыхлённым кератином. В некоторых местах кератин отсутствует, в других образует роговые пробки и кисты, окружает стержни и корни волос. Участки плотного кератина преобладают в группе крыс-самок, напротив, у самцов он визуально более рыхлый. Волосы находятся преимущественно в стадии анагена, единичные — в стадии телогена. В одном поле зрения встречается до 5-и волосяных фолликулов, расположенных в дерме группами, глубина их залегания различна. Встречаются фолликулы щёткообразной формы, расположенные поверхностно, в них слабо различимы структурные компоненты. Подобный тип фолликулов чаще встречается в группе крыс-самцов. В местах выхода волос на поверхность кожи их стержни сильно оплетены кератиновыми пластами. Сальные железы единичные, чаще встречаются у крыс-самцов. В сравнении с группой интактного контроля железы состоят из 1-2 долек, размеры которых несколько уменьшены. Дерма содержит большое количество клеточных элементов, которые локализуются преимущественно в субэпидермальных участках и периваскулярных зонах, что выражено больше в группе крыс-самок. Отёк дермы умеренный, преобладает в группе самцов. Сосуды микроциркуляторного русла расширены, полнокровны.

Морфометрическог исследование. Для объективизации визуальной картины проведён морфометрический анализ кожи межлопаточной области спины крыс обоих полов. Установлено, что у интактных животных средняя толщина клеточного эпидермиса больше в группе крыс-самцов. Через 14 дней ежедневных аппликаций дёгтя берёзового происходит достоверное увеличение параметра, также выраженное больше у самцов (Табл. 5). При измерении толщины зернистого слоя эпидермиса было выявлено, что в интактных группах данный показатель статистически значимо более выражен в группе крыс-самцов. При воздействии дёгтя берёзового происходит достоверное увеличение толщины зернистого слоя, более выраженное в группе самцов (Табл. 5). Измерение средней площади шиповатого кератиноцита в интактных группах позволило установить, что размеры этих клеток больше в группе крыс-самцов. Под воздействием дёгтя берёзового происходит статистически значимое увеличение параметра, большее значение отмечено в группе подопытных крыс-самок (Табл. 5). При расчёте ядерно-цитоплазматического отношения было установлено, что во всех исследованных группах его значения меньше 1, т.е. измеренные клетки вступили в дифференцировку (Табл. 5). Воздействие на кожу дёгтя берёзового приводит к снижению этого показателя. В группах как интактных, так и подопытных крыс-самок он несколько ниже, чем в группе крыс-самцов.

Произведена оценка состояния сальных желёз кожи межлопаточной области крыс (Табл. 6). У интактных животных средние размеры сальных желёз больше у самок. В группе интактных крыс-самцов относительная площадь дифференцированных клеток достоверно больше. При воздействии дёгтя берёзового происходит уменьшение средних площадей сальных желёз. Наблюдается увеличение относительной суммарной площади базальных себоцитов и уменьшение относительной суммарной площади дифференцированных клеток. Отношение базальных и дифференцированных клеток возрастает. Эти тенденции наблюдаются в группах обоего пола, чётких половых отличий не наблюдается.

Клеточная плотность дермы в группе крыс-самцов статистически значимо больше в сравнении с группой крыс-самок. В обеих группах отмечается преобладание клеток мононуклеарного ряда по отношению к фибробластиче-скому. Количество мононуклеаров достоверно больше в группе крыс-самок (Табл. 7). Рассчитана доля сосудов микроциркуляторного русла в субэпидер-мальном слое дермы в % от общей площади дермы. Установлено, что достоверных тендерных отличий в интактных группах нет. При накожном нанесении дёгтя берёзового в течение 14-и дней происходит увеличение доли сосудов микроциркуляторного русла в субэпидермальном слое дермы; большее значение параметра наблюдается в группе самцов (Табл. 7).

Иммуноморфологическое исследование. В группах интактных крыс ядра кератиноцитов, меченные антителами, расположены в базальном слое эпи-

дермиса. Клетки, меченные антителами к РСЫА, располагаются группами по 2-4 клетки (1-3 группы в поле зрения), а к ¥л-61 определяются как единичные в поле зрения. Визуально число клеток, меченных моноклональными антителами к ГСНА больше в группе самцов, а меченных антителами к КЙ>7 — в группе самок (Рис. 3 а, б). В сальных железах меченые ядра локализуются в базальном слое и расположены ровной цепочкой. В волосах выявлено 2 места их локализации — в области матрицы волоса, а также в месте слияния выводного протока сальной железы с фолликулярным каналом (колба ?).

В группах крыс, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового по 0,05 г/сут, метка локализуется в базальном и шиповатом слоях эпидермиса. В сравнении с группой интактного контроля в эпидермисе подопытных животных позитивно окрашенных ядер больше. Ядра, меченные антителами к РСИА, располагаются группами по 4-6 клеток (1-3 группы у самок, 2-4 — у самцов), а антителами к Кь67 определяются единичными скоплениями по 1-3 клетки (Рис. 3 в, г, ж, з). При микроскопии эпидермиса в группе самцов число клеток, меченых антителами к РСИА, визуально больше. Разницы в экспрессии маркёра к Кь67 между группами самок и самцов не отмечено. В сальных железах происходит снижение экспрессии обоих маркёров на фоне редукции железы, в целом, более выраженной у самцов. В фолликулах, находящихся на стадии телогена происходит снижение меченых клеток; фолликулы на стадии анагена аналогичны интактным.

Рассчитаны 1к,-б7, 1рсыа и 1р для групп интактньгх животных; установлено, что экспрессия маркёра к РСКА и значение индекса Р выше у самцов, экспрессия маркёра к Ю-67 — у самок (Табл. 8). После 14-и дней накожного воздействия дёгтя берёзового происходит увеличение всех показателей, причём значения индексов РСКА и Р достоверно больше у крыс-самцов, а значение индекса Кг-67 не имеет статистически значимой разницы между полами.

Таким образом, ежедневное нанесение дёгтя берёзового по 0,05 г/сут вызывает достоверное увеличение толщины клеточного эпидермиса. Происходит возрастание средней площади кератиноцита шиповатого слоя, утолщение зернистого слоя, снижение ядерно-цитоплазматического отношения клеток и повышение значения индекса Р, что можно трактовать, как усиление диффе-ренцировки кератиноцитов эпидермиса. Вместе с тем, наблюдается увеличение Р^А- и Кг-67-положительных клеток, отражающее усиление процессов пролиферации базальных кератиноцитов. Можно заключить, что аппликации дёгтя берёзового вызывают равновесное усиление процессов пролиферации и дифференцировки кератиноцитов.

В сальных железах происходит увеличение относительной площади базальных и снижение этого показателя у дифференцированных себоцитов; отмечено увеличение числа К1-67-положительных клеток. Из этого следует, что дёготь обладает себостатическим эффектом. Визуально отмечено разрастание луковицы волосяного фолликула и усиление кератинизации.

Рис I Разделение гексанового экстракта дегтя березового с помощью ВЭЖХ Условия хрома-тографирования колонка (250x4,6 мм), заполненная сорбентом иИгаБрИеге в!, 5 мкм, элюент — гексан-изопропаиол-уксусная кислота (99,7 0,25 0,05), скорость потока— 1,0 мл/мин, X — 260 нм 1 - гваякол, 2 - орто-крезол, 3 - мета- и р-крезолы, 4 - салициловая кислота, 5 - фенол

Табл 1 Абсолютные времена удерживания стандартных образцов и модельной смеси фенола,

гваякола, изомеров крезола и салициловой кислоты, Ь

Абсолютное время удерживания, (мин) Определяемые вещества

Гваякол орто-Крезол мета-Крезол пара-Крезол Салициловая кислота Фенол

Стандартные образцы 3,5 4,5 6,5 6,5 7,5 12,5

Смесь образцов 3,5 4,5 6,5 6,5 7,5 12,5

Табл 2 Содержание фенола, орто-, пара- мета-крезолов и салициловой кислоты в дегте березовом, п=6___

Определяемые вещества Фенол Гваякол Салициловая кислота мета-, пара-Крезол ы орто-Крезол

Содержание, % 1,29 ±0,03 0,66 ± 0,02 0,49 ± 0,02 0,70 + 0,05 0,50 ±0,01

Рис. 2. Общий план строения кожи межлопаточной области спины крыс-самок: а— интактных; б— подвергавшихся нанесению 0,05 г/сут дёгтя берёзового в течение 14-и дней; в— подвергавшихся нанесению 0,1 г/сут дёгтя берёзового в течение 14-и дней; г— подвергавшихся нанесению 0,25 г/суг дёгтя берёзового в течение 14-и дней. Окраска гематоксилином и эозином. Об. *10, ок. »10.

Табл.3. Толщина клеточного эпидермиса (мкм) межлопаточной области крыс-самок(М+гп), подвергавшихся нанесению дёгтя берёзового по 0,05; 0,1 и 0,25 г/сут в течение 14-и дней, п=6._

Группы Параметр ---- Интактные ДБ 0,05 г/сут ДБ 0,1 г/сут ДБ 0,25г/сут

Толщина клеточного эпидермиса, мкм 20,0+0,4 33,4+0,4* 44,7+0,3* 41,3+0,5*

Табл. 4. Морфометрические показатели состояния дермы межлопаточной области крыс-самок, подвергавшихся нанесению дёгтя берёзового по 0,05; 0,1 и 0,25 г/сут в течение 14-и дней, п=6.

Параметр Группы Клеточная плотность Доля клеток (%) Доля сосудов микроцирку-ляторного русла в субэпи-дермальном слое дермы, %

мононуклеарного ряда фибробластического ряда

Интактные 41,67±1,41 67,0+2,7 33,0±2,7 5,07+0,6

ДБ 0,05 г/сут 54,8+3,16* 79,89±0,8 20,11 ±0,8 7,34±0,48*

ДБ 0,1 г/сут 52,60±2,43* 79,84±1,1 20,16+1,1 10,48+0,52*

ДБ 0,25 г/сут 69,27±2,44* 74,42±1,3 25,58±1,3 10,25+0,55*

Табл 5 Морфометрические показатели состояния эпидермиса межлопаточной области крыс (М±т). подвергавшихся нанесению дегтя березового (ДБ) по 0,05 г/сут в течение 14-и дней, п=6_

Параметр Группа ~— Толщина клеточного эпидермиса, мкм Толщина зернистого слоя, мкм Средняя площадь кератиноцита шиповатого слоя (мкм2) Ядерно-цитоплазматиче-ское отношение

Самки Интактные 14,5±0,2 5,3 ±0,2 86,2+2,8 0,70±0,03

ДБ 0,05 г/сут 29,0+0,6* 15,8+0,5* 187,5±8,8* 0,44+0,02*

Самцы Интактные 15,9±0,3 8,4±0,2t 91,2+2,9t 0,80±0,03

ДБ 0,05 г/сут 32,I±0,6*t 18,9±0,7*t 170,7+7,9* 0,57±0,03*f

Табл 6 Средняя площадь (в мкм2) сальных желез, абсолютная (абс) и относительная (отн ) площади (%), занимаемые базальными себоцитами (5б) и дифференцирующимися себоцитами (Бд) кожи межлопаточной области интактных крыс и крыс, подвергавшихся нанесению дегтя березового

Параметр Группа Площадь сальной железы, мкм2 S6, мкм2 Бд, мкм2 S6/Sfl

Абс Отн Абс Отн

Самки Интактные 6452,7+ 89,3 1816,9+ 81,5 28,2± 0,5 4635,8± 91,3 71,8+ 0,7 0,39± 0,04

ДБ 0,05 г/сут 5433,0± 103,4* 1780,8± 93,7* 32,8± 0,9* 3652,3+ 114,7* 67,2+ 1,1* 0,49± 0,07

Самцы Интактные 5802,4+ 96,2t 1347,1± 86,2t 23,2± 0,4t 4455,3± 87,5t 76,8± 0,7t 0,30+ 0,02t

ДБ 0,05 г/сут 4922,'4+ 104,7*t 1606,6± 99,4*t 32,6± 0,7* 3315,8± 93,9* t 67,4+ 0,9* 0,49± 0,08*

Табл 7 Морфометрические показатели состояния дермы межлопаточной области крыс (М±гп), подвергавшихся нанесению дегтя березового (ДБ) по 0,05 г/сут в течение 14-и дней, п=6_

Параметр Группа Клеточная плотность Доля клеток, % Доля сосудов микроцирку-ляторного русла в субэпи-дермальном слое дермы, %

мононуклеар-ного ряда фибробласти-ческого ряда

Самки Интактные 40,8±0,7 70,0±1,9 30,0±1,4 5,3+0,2

ДБ 0,05 г/сут 59,3±1,3* 82,3+0,8* 17,7±0,9* 7,2±0,4*

Самцы Интактные 44,3±0,9t 66,3±0,9t 33,7+1, lt 5,9±0,4

ДБ 0,05 г/сут 63,4±l,l*t 81,1±1,3* 18,9±1,3* 8,7±0,3*

Табл 8 Значение 1№ 1к,.67 и 1Р (%) в группе крыс, подвергавшихся нанесению дёгтя березового по 0,05 г/суг в течение 14-и дней, п=6_

"——^__11араметр Группа -— Индекс PCNA, % Индекс Ki-67, % Индекс Р

Самки Интактные 39,3±1,0 14,3+0,5 25,0±1,0

ДБ 0,05 г/сут 55,4+0,8* 23,6+1,1* 31,8+1,1*

Самцы Интактные 42,0+0,7f 13,1+0,4t 28,9+0,7t

ДБ 0,05 г/сут 63,0±l,0*t 23,3+1,0* 39,7±l,0*f

Рис. 3. Экспрессия РСЫА и Кь67 кератииоцитами интерфолликулярного эпидермиса межлопаточной области спины крыс.

РСЫА: интактные крысы (а - самки, б - самцы); крысы, подвергавшиеся нанесению дёгтя берёзового по 0,05 г/сут в течение 14-и дней (в - самки, г - самцы).

К1-67; интактные крысы (д- самки, е - самцы); крысы, подвергавшиеся нанесению дёгтя берёзового по 0,05 г/сут в течение 14-и дней (ж - самки, з - самцы). Продукт реакции коричневого цвета, докраска ядер гематоксилином К. Об. *40, ок. *10.

— 20,5* -£- 17,9" 15,3 15,6 145 15,4

----- -----

14-й день 28-й день 42-й день

| ' Самки, после отмены ДБ I I Самцы, после отмены ДБ-Интактныесамки-Интактныесамцы

Рис. 4. Толщина клеточного эпидермиса (мкм) межлопаточной области крыс после отмены дёгтя берёзового (ДБ).

| | Самки, послеотмены ДБ I I Самцы, после отмены ДБ-Интактныесамки-Интактныесамцы

Рис. 5. Толщина зернистого слоя эпидермиса (мкм) межлопаточной области крыс после отмены дёгтя берёзового (ДБ).

14-й день 28-й день 42-й день

I 1 Самки, послеотмены ДБ ' ' Самцы, послеотмены ДБ-Интактныесамки-Интактныесамцы

Рис. 6. Ядерно-цитоплазматическое отношение кератиноцитов эпидермиса межлопаточной области крыс обоих полов после отмены нанесения дёгтя берёзового (ДБ).

у ,

^■««у, I >

* -_:_У <*,_* ~

Ч . А

-г**** к г- я ^

и^-^ш Г % *

' г«

-я

л» V»

> к . ' - г-

о»

НьЧ,

I Л. ч

■Л

«1ч ^

«Г»»

V 1}

•v

Рис. 7. Экспрессия РСЫА кератиноцитами интерфолликулярного эпидермиса межлопаточной области спины крыс. Интактные крысы: а - самки, б - самцы. После отмены накожного нанесения дёгтя берёзового: 14-е сутки (в - самки, г - самцы), 28-е сутки (д- самки, е - самцы), 42-е сутки (ж — самки, з - самцы). Продукт реакции коричневого цвета, докраска ядер гематоксилином К. Об. х40, ок. *10.

Рис. 8. Экспрессия Кл-67 кератиноцитами интерфолликулярного эпидермиса межлопаточной области спины крыс. Интактные крысы: а-самки, б-самцы. После отмены накожного нанесения дёгтя берёзового: 14-е сутки (в - самки, г- самцы), 28-е сутки (д- самки, е - самцы), 42-е сутки (ж - самки, з - самцы). Продукт реакции коричневого цвета, докраска ядер гематоксилином К. Об. *40, ок. х]0.

14-й день 3 Самки, послеотменыДБ [

28-й день ] Самцы, после отмены ДБ —

42-й день - Интактныесамки-И нтактные самцы

Рис. 9. Экспрессия РСЫА кератиноцитами росткового слоя эпидермиса межлопаточной области крыс после отмены нанесения дёгтя берёзового (ДБ).

14-й день

Самки, после отмены ДБ

28-й день Самцы, после отмены ДБ —

-Интактныесамки -

42-й день — И нтактные самцы

Рис. 10. Экспрессия Ю-67 кератиноцитами росткового слоя эпидермиса межлопаточной области крыс после отмены нанесения дёгтя берёзового (ДБ).

14-й день 28-й день 42-й день

| I Самки, послеотменыДБ ч Самцы, после отмены ДБ-Интактныесамки-И нтактные самцы

Рис. 11. Индекс Р в интерфолликулярном эпидермисе межлопаточной области крыс после отмены нанесения дёгтя берёзового (ДБ).

В дерме отмечено увеличение клеточной плотности с преобладанием мо-нонуклеарного звена и повышение доли сосудов микроциркуляторного русла от общей площади дермы. Строение кожи крыс имеет ряд тендерных особенностей: в группе крыс-самок толщина клеточного эпидермиса, средняя площадь кератиноцита и ядерно-цитоплазматическое отношение, 1рсыа и 1р достоверно выше у самцов, а значение 1^-67 у самок. Это означает, что процессы пролиферации в условиях длительного эксперимента более выражены у самок, а дифференцировки у самцов. В дерме значения параметров клеточной плотности дермы и доли сосудов микроциркуляции больше у самцов, свидетельствуя в пользу большей реактивности их покрова.

Исследование строения кожи межлопаточной области крыс обоих полов после отмены воздействия дёгтя берёзового по 0,05 г/сут в течение 14-и дней

Гистологическое исследование. На разных сроках эксперимента кожа межлопаточной области интактных крыс имеет сходное строение. При этом наблюдаются половые отличия, описанные в предыдущем исследовании.

Эпидермис межлопаточной области крыс обоих полов на 14-й день после отмены дёгтя березового представлен многослойным плоским ороговеваю-щим эпителием. Он визуально толще, чем в группе интактного контроля. Количество рядов эпидермоцитов от базальной мембраны до рогового слоя достигает 7—8 у самок и 8-11 у самцов. Кератиноциты базального слоя имеют кубическую форму, встречаются единичные фигуры митоза, в некоторых полях зрения обнаруживаются внутриэпидермальные лимфоциты. Шиповатый слой выражен неравномерно, насчитывает до 4-х у самок и до 6 рядов керати-ноцитов у самцов. Зернистый слой состоит из 3-5 рядов кератиноцитов у самок и 4-6 — у самцов соответственно, гранулы кератогиалина крупные, имеют тенденцию к слиянию. В группах обоего пола роговой слой толще, чем у интактных крыс. Он представлен участками компактного и рыхлого кератина, периодически чередующимися. Рыхлый кератин преобладает в местах выхода волоса на поверхность. В одном поле зрения встречается до 6 волосяных фолликулов, расположенных в дерме группами, глубина их залегания различна. Преобладают волосы на стадии анагена, встречаются единичные фолликулы на других стадиях. В местах выхода волос на поверхность кожи стержни оплетены кератиновыми пластами. Сальные железы единичны, образуют комплексы с волосяными фолликулами, состоят из 1-2 долек. У самок размеры сальных желёз несколько больше. Дермальные сосочки немногочисленны, расположены нерегулярно. Клеточные элементы дермы встречаются часто, концентрируются преимущественно в сосочковом слое. Наблюдается умеренная отёчность дермы, более выраженная в группе крыс-самцов. Сосуды микроциркуляторного русла расширены, полнокровны.

Эпидермис кожи межлопаточной области крыс обоих полов на 28-й день после отмены дёгтя берёзового состоит из четырёх слоев. Количество рядов

кератиноцитов от базальной мембраны до рогового слоя достигает 3-5 у самок и 4-6 у самцов. Кератиноциты базального слоя кубической формы. Имеют место единичные фигуры митоза. В некоторых полях зрения встречаются внутриэпидермальные лимфоциты. В шиповатом слое насчитывается до 2-х рядов кератиноцитов, зернистый слой выражен умеренно, насчитывает 1-3 ряда клеток, содержащих небольшое количество мелких гранул кератогиали-на. Роговой слой выглядит тоньше, чем в интактной группе и чем на 14-й день после отмены. Волосяные фолликулы располагаются в дерме по 6-7 в поле зрения, в местах выхода оплетены кератином. Сальные железы образованы 23 дольками. В коже крыс-самцов сальные железы встречаются значительно чаще. Дермальные сосочки встречаются редко, случайно. Клетки дермы локализуются преимущественно в субэпидермальном слое дермы. Сосуды микро-циркуляторного русла единичные, имеют небольшие размеры, расположены преимущественно в подсосочковой области дермы. Диапедезного просачивания эритроцитов не отмечено.

Эпидермис межлопаточной области крыс обоих полов на 42-й день после отмены дегтя берёзового представлен многослойным плоским ороговеваю-щим эпителием, состоящим из 4-х слоев. Количество рядов эпидермоцитов от базальной мембраны до рогового слоя достигает 3-5 у самок и 4-6 у самцов. Кератиноциты базального слоя кубической формы, встречаются редкие фигуры митоза. В шиповатом слое насчитывается до 2-х рядов кератиноцитов, зернистый слой выражен умеренно, насчитывает 1-2 ряда клеток, содержащих небольшое количество гранул кератогиалина. Роговой слой представлен рыхлым кератином, выглядит визуально тоньше, чем на предыдущих сроках эксперимента. На данном сроке эксперимента волосы неотличимы от интакт-ных. Волосяные фолликулы располагаются глубоко в дерме группами по 8 в поле зрения. В местах выхода волос на поверхность кожи они оплетены компактным кератином. Сальные железы образованы 2-3 дольками, число которых несколько больше у самцов, а размеры — у самок. Дерма хорошо выражена, по своему строению неотличима от группы интактного контроля. Дермальные сосочки сглажены, встречаются редко. Клетки локализуются в пери-васкулярных областях субэпидермального слоя. Сосуды микроциркуляторно-го русла мелкие, расположены преимущественно в сосочковом слое. Иногда обнаруживаются единичные эритроциты.

Морфометрическое исследование. Эффект от накожного нанесения дёгтя берёзового сохраняется как минимум в течение 14-и дней после отмены воздействия. При этом наблюдается уменьшение толщины клеточного эпидермиса до значений, сопоставимых с интактным контролем. На 14-й день данный параметр у крыс-самок имеет большее значение, чем у самцов, несколько превышая контрольные значения. На 28-й день после отмены воздействия дёгтя берёзового выявлено, что толщина эпидермиса сходна со значениями контрольных групп; достоверных половых отличий не отмечено. На 42-й день

параметр достоверно не отличается от контроля, имея несколько большее значение в группе крыс-самцов (Рис. 4). Измерение средней площади керати-ноцита шиповатого слоя показало, что уже на 14-й день после отмены значения параметра достигают контрольных значений, в дальнейшем достоверно от них не отличаясь. Половые различия отмечены на 28-й и 42-й дни после отмены — в обоих случаях средняя площадь шиповатых кератиноцитов больше в группе крыс-самцов. После отмены воздействия дёгтя берёзового с течением времени происходит уменьшение средней толщины зернистого слоя эпидермиса. У самок этот показатель достигает значений, сопоставимых с контрольными, к 28-му дню после отмены, а на 42-й день толщина зернистого слоя сходна с контрольными значениями. В группе самцов наблюдается тенденция к снижению параметра, однако величин сопоставимых с контрольными, в ходе эксперимента, зафиксировано не было (Рис. 5). Вычисление ядер-но-цитоплазматического отношения показало, что после отмены аппликаций дёгтя показатель статистически значимо больше, чем у контрольных животных лишь на 14-й день; на этом сроке половых отличий между группами не отмечено. На 28-й и 42-й дни после прекращения воздействия достоверных отличий между подопытными и контрольными группами не наблюдается; показатель больше в группе самцов (Рис. 6).

Проведён анализ состояния сальных желёз. Установлено, что абсолютная площадь сальных желёз достигает контрольных значений приблизительно на 14-й день у самцов и 28-й — у самок. В дальнейшем происходит увеличение данного параметра по сравнению с контрольной группой. Относительная площадь базальных себоцитов с течением времени уменьшается, её значения имеют достоверные половые различия лишь на 42-й день после отмены — они меньше у крыс-самцов. Относительная площадь дифференцированных себоцитов напротив увеличивается, достоверно превышая показатели контрольных групп. Максимальное значение отмечено в группе крыс-самцов на 42-й день после отмены накожного нанесения дёгтя берёзового.

Клеточная плотность дермы в группе крыс, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового, уменьшается до контрольных значений лишь к 42-у дню после его отмены. Выявлены тендерные отличия — на 14-й и 28-й дни после отмены значения параметра достоверно больше у крыс-самцов, а на 42-й день параметры статистически не отличаются. Оценив соотношение различных типов клеток на единицу площади дермы, можно сделать вывод, что на 14-й день после отмены аппликаций дёгтя берёзового преобладают клетки лейкоцитарного ряда (лимфоциты, моноциты). Содержание этих клеток в дерме крыс, подвергавшихся нанесению дёгтя, достоверно выше, чем в контрольной группе. Начиная с 28-го дня, статистически значимой разницы между данными показателями в контрольной группе и группе, получавшей аппликации дёггя берёзового, не наблюдается. Рассчитана удельная доля сосудов микро-циркуляторного русла в субэпидермальном слое дермы в % от общей площа-

ди дермы. Установлено, что после отмены нанесения дёгтя берёзового происходит достоверное уменьшение показателя до значений, статистически не отличающихся от таковых в группах интактного контроля. Максимальное значение доли сосудов микроциркуляторного русла наблюдается в группе самцов на 14-й день после прекращения аппликаций дёгтя берёзового. В то же время у крыс-самок это значение достоверно ниже, но превышает контрольное. Начиная с 28-го дня после отмены воздействия, значения удельной доли сосудов микроциркуляторного русла в группах крыс интактного контроля и подвергавшихся нанесению дёгтя крыс не имеют статистически значимых отличий.

Иммуноморфологинеское исследование. Экспрессия маркёров РСИА и Кл-67 в эпидермисе и придатках кожи интактных крыс на разных сроках эксперимента сходна (Рис. 7а, б; рис. 8а, б). В эпидермисе интактных крыс ядра кератиноцитов, меченные антителами к РСЫА и Кл-67, расположены в ба-зальном и редко в шиповатом слоях. Клетки, позитивные по маркёру РСИА, располагаются группами по 2-4 клетки (1-3 группы в поле зрения), а по Ю-67 — определяются как единичные клетки в поле зрения. Отмечены половые различия в экспрессии маркёров: число РСНА-положительных клеток выше в группе крыс-самцов, а Кь67-положительных — в группе самок. В сальных железах позитивные к исследуемым маркёрам клетки локализуются в базаль-ном слое и расположены ровной цепочкой. Визуально количество клеток, экспрессирующих маркёр РСЫА, больше, чем экспрессирующих Ю-67. Наблюдаются чёткие тендерные различия — количество К1-67-положительных клеток больше в группах крыс-самок, а РСИА-положительных в группах крыс-самцов. В волосах выявлено два места локализации клеток, экспрессирующих маркёры, — это область матрицы волоса и точка слияния выводного протока сальной железы с фолликулярным каналом, так называемая «колба». В зоне матрицы преобладают клетки, меченные антителами к К1-67, в области колбы доминируют РСКА-положительные клетки. Уровень общей экспрессии маркёров выше в группах крыс-самок.

На 14-й день после отмены дёгтя березового метка локализуется в ба-зальном и шиповатом слоях эпидермиса. В сравнении с группой интактного контроля позитивно окрашенных ядер больше (Рис. 7в, г; рис. 8в, г). Ядра, меченные антителами к РСИА, располагаются группами по 4-6 клеток (1-3 группы в поле зрения у самок и 2-4 — у самцов), а к К-67 — определяются как единичные скопления по 2-3 клетки. В экспрессии РСЫА имеются половые различия — количество маркируемых клеток визуально больше в группе крыс-самцов. Тендерных особенностей в экспрессии маркёра к К1-67 не отмечено. В сальных железах и волосах экспрессия маркёров имеет типичную локализацию. В сальных железах количество позитивных клеток обоих маркёров ниже, чем в группе интактного контроля. В волосах видимых отличий в экспрессии не наблюдается. Отмечены половые различия: в зоне матрицы

количество РС^- и Кл-67-положительных клеток больше в группах крыс-самцов.

На 28-й день после отмены дегтя березового метка локализуется в ба-зальном и шиповатом слоях эпидермиса (Рис. 7д, е; рис. 8д, е). РСИА-экспрессирующие клетки располагаются по 3 группы в поле зрения, состоящие из 3-5 клеток; К¡-67-экспрессирующие клетки обнаруживаются как единичные клетки в поле зрения. Выявлены половые различия — в группе крыс-самцов преобладает экспрессия РСЫА, а в группе крыс-самок — Кь67. Локализация маркируемых клеток в сальных железах и волосах типична. Визуальных отличий от интактного контроля не наблюдается. Половых различий в экспрессии маркёров не обнаружено.

На 42-й день после отмены дёгтя берёзового метка локализуется в ба-зальном и шиповатом слоях эпидермиса. Клетки, экспрессирующие РСЫА, располагаются по 1-2 группы в поле зрения, состоящие из 2-3 клеток. В случае с Кь67 в поле зрения определяется 1-2 маркируемые клетки (Рис. 7 ж, з; рис. 8ж, з). В сальных железах, в сравнении с контрольными группами животных, отмечается усиление экспрессии маркёров, преимущественно Ю-67. В волосах локализация маркируемых клеток типична. Визуальных отличий от интактного контроля не наблюдается; половых различий в экспрессии маркёров не обнаружено.

Оценка экспрессии Р(ЖА позволила судить об изменении данного показателя после отмены нанесения дёгтя берёзового (Рис. 9). На 14-й день индекс РСЛ^А достоверно больше в группе животных, подвергавшихся аппликациям. К 28-му дню показатель достигает уровня интактной группы. На 42-й день значения 1рсмд также статистически неотличимы от контрольных значений. Половые особенности экспрессии маркёра к РСИА наблюдаются лишь на 14-й день после отмены дёгтя — значение больше в группе крыс-самцов. Изучив динамику экспрессии маркёра Кл-67, можно отметить, что после отмены максимальные значения 1к>67 наблюдаются на 14-й день. Достигнув уровня контрольных величин к 28-му дню после отмены, индекс К1-67 в дальнейшем практически не меняется (Рис. 10). Как и в случае с РСИА, на 14-й день после последней аппликации выявлены половые отличия в экспрессии маркёра — значение 1^-67 больше в группе крыс-самок. На основании данных по экспрессии РСИА и Ю-67 был вычислен индекс Р (Рис. 11). Изменения, описанные выше, характерны и для 1р. После отмены воздействия дёгтя берёзового он максимален на 14-й день, достоверно преобладая у самцов. На более поздних сроках значение индекса приходит к уровню контрольных значений — у самцов на 28-й день после отмены нанесения дёгтя берёзового, а у самок—на 42-й день.

Таким образом, проанализировав полученные данные, можно сделать заключение, что действие дёггя берёзового является пролонгированным, одновременно с этим обладая транзиторным характером, постепенно уменьшаясь

после отмены воздействия. Изменение показателей носит асинхронный характер — величины, сопоставимые с контрольными, достигаются в разное время после отмены воздействия. У крыс-самок быстрее — к 28-му, у крыс-самцов медленнее — к 42-му дню после прекращения аппликаций. Значение толщины зернистого слоя в группе крыс-самцов — единственный параметр, имевший тенденцию к снижению, но не достигший контрольных величин в рамках проведённого исследования.

ОБСУЖДЕНИЕ

В соответствии с целью и задачами настоящей работы и полученными в результате экспериментальных исследований данными целесообразным представляется обсуждение вопросов, касающихся особенностей строения структурных компонентов кожи крыс при воздействии дёгтя берёзового с учётом его дозы и пола экспериментальных животных, в различные сроки после отмены его воздействия.

В работе рассмотрены и подлежат обсуждению результаты трёх исследований, первое из которых подтверждает, что дёготь берёзовый оказывает дер-матотропное действие, носящее дозозависимый характер. Второе исследование детализирует полученную картину — проведено более детальное изучение эпидермиса, его производных и дермы. В третьем исследовании рассмотрены вопросы морфогенетические аспекты состояния кожи после отмены дёгтя берёзового. Условия проведения исследований в максимальной степени стандартизированы по виду экспериментальных животных, их массе, способу содержания, распределению по группам, методике нанесения исследуемого вещества и др. Проведение нескольких исследований было продиктовано необходимостью изучения половых особенностей, а также принципиальной значимостью выяснения вопросов о дозозависимом характере действия дёгтя берёзового и о продолжительности вызываемых им эффектов в условиях накожного нанесения лекарственного средства.

Проявления дерматотропной активности дёгтя берёзового. В ходе проведённых исследований стало ясно, что дёготь берёзовый обладает выраженной биологической активностью. При гистологическом исследовании выявлены основные точки приложения его воздействия:

— эпидермис — наблюдается увеличение количества слоев кератиноци-тов и усиление кератинизации;

— дериваты — установлено снижение представительства сальных желёз и числа долек в них, структура волос деформирована; наблюдаются кератино-вые пробки в устьях фолликулов;

— дерма — происходит возрастание кровонаполнения сосудов микро-

циркуляторного русла, отмечено увеличение числа клеток дермы, происходит их периваскулярная группировка.

Наблюдения согласуются с результатами, полученными в предшествующих исследованиях (В.И. Ноздрин и др., 2006).

Исследование эпидермиса методами морфометрии и иммуногистологии позволило выявить, что накожное нанесение дёгтя стимулирует процессы пролиферации и дифференцировки кератиноцитов. Под воздействием дёгтя берёзового происходит достоверное увеличение толщины клеточного эпидермиса, средней площади кератиноцита и толщины зернистого слоя, снижение ядерно-цитоплазматического отношения клеток и повышение значения индекса Р, что можно трактовать как усиление дифференцировки. Вместе с этим возрастает число клеток, экспрессирующих PCNA и Ю-67, что указывает на усиление как синтеза ДНК в целом, так и на активацию пролифератив-ных процессов. В литературе есть сведения о похожих реакциях, наступающих при нанесении веществ естественного и синтетического происхождения. Например, в случае ежедневных в течение двух недель аппликаций 13-цис-ретиноевой кислоты возникает увеличение толщины клеточного эпидермиса и усиление экспрессии маркеров пролиферации (С.А. Жучков, 2007). Схожие данные получены для нафталанской нефти (А.Н. Яцковский, 2003), каменноугольного дёгтя (Р. ТЬашогпсЬшэк, К. НашсЬагоеп, 2007) и пр. По всей видимости, данные процессы является универсальной реакцией эпидермиса на нанесение модификаторов морфогенеза и хронические внешние воздействия в целом. Изменение состояния эпидермиса под воздействием дёгтя берёзового может быть вызвано как непосредственным влиянием компонентов дёгтя на клеточные популяции, так и опосредованными— хемокины Т-лимфоцитов (Б. ЗеЬазйаш е1 а]., 2002). Морфометрический анализ сальных желёз показал, что воздействие дёгтя приводит к себостатическому эффекту, который выражается увеличением суммарной относительной площади базальных себоци-тов и снижением этого показателя для себоцитов дифференцированных. Это отмечено при визуализации экспрессии маркёров пролиферации: происходит увеличение числа РСНА- и Кл-67-положительных клеток в базальном слое сальной железы. Возникновение такого эффекта может быть связано с липо-литическим и себостатическим действием компонентов дёгтя, одним из которых может быть салициловая кислота (В.Ф. Крамаренко, 1989). С другой стороны, как и в случае с эпидермисом, воздействие дёгтя на сальные железы может идти опосредованно, через индуктивные влияния, оказываемые на ба-зальные себоциты хемокинами, вырабатываемыми фибробластами и макрофагами дермы (В.В.Серов, 1995). В разросшихся волосяных фолликулах структуры корня волоса определяются слабо, а стержни плотно окружены компактным кератином. В этом случае можно предположить некое влияние дёгтя на цикл роста волоса, возможно, через активацию фибробластов дер-

мального сосочка и соединительной ткани волосяной сумки, обладающих способностью побуждать эпидермальные клетки не покрытой волосами кожи к образованию новых волосяных фолликулов (V. ВйсИкатеу, 1997). В дерме под воздействием дёгтя берёзового происходит увеличение клеточной плотности с преобладанием клеток лейкоцитарного ряда. Основываясь на данных литературы, можно предположить, что в данном случае среди клеток дермы будут преобладать Т-лимфоциты (Ю.К. Скрипкин, Е.М. Лезвинская, 1989; А.Б. Шехтер, 1995). Они же в свою очередь будут запускать механизмы ан-гиогенеза (¿. МНе\у1сЬ, 1998). Действительно, при нанесении происходит достоверное увеличение доли сосудов микроциркуляторного русла по отношению к площади дермы.

Таким образом, дёготь берёзовый показывает себя сильным биологически активным веществом, возможно оказывающим на интактную кожу, по-видимому, как прямое и опосредованное влияние.

Дозозависимые особенности строения кожи межлопаточной области крыс обоих полов, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового. В ходе первого исследования удалось выяснить, что эффекты от воздействия дёгтя берёзового носят дозозависимый характер. Причём, существует прямая зависимость между количеством наносимого дёгтя и степенью выраженности изменений в коже. Отмечено, что с увеличением дозы происходит увеличение толщины клеточного эпидермиса за счёт числа и размеров клеток. Так, уже при нанесении 0,05 г/сут дёгтя берёзового у самок возникает изменение значения толщины клеточного эпидермиса, которое увеличивается прямо пропорционально дозировке. В диапазоне доз от 0,05 до 0,25 г/сут усиливается себостатическое действие; при максимальной дозе сальные железы практически отсутствуют. Нарастают изменения в строении волос. Происходит дозоза-висимое увеличение клеточных элементов дермы с преобладанием клеток мононуклеарного ряда. С увеличением дозировки происходит увеличение профилей сосудов микроциркуляции в дерме.

Половые отличия строения кожи крыс, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового. Анализируя полученные данные, удаётся проследить половые различия в характере ответной реакции кожи на воздействие дёгтя берёзового. При дозировке 0,05 г/сут толщина клеточного эпидермиса крыс достоверно отличима от контрольных значений, причём значение данного параметра более выражено в группе крыс-самцов. Подобные изменения можно расценить, как более сильную чувствительность эпидермиса крыс-самцов к воздействию внешнего фактора. Нужно отметить, что величины, характеризующие состояние эпидермиса у самцов, являются более выраженными, чем у самок. Самцы имеют большую толщину клеточного эпидермиса, большую

площадь кератиноцита шиповатого слоя, более выраженный зернистый слой, который практически не изменяется со временем, тогда как у самок зернистый слой становится тоньше. Ддерно-цитоплазматическое отношение у ке-ратиноцитов шиповатого слоя, клеточная плотность дермы и удельная доля сосудов микроциркулягорного русла также выражены больше у самцов. У самок значительно выше значения средней площади сальных желёз, однако представительство сальных желёз в поле зрения меньше. При оценке иммуно-гистологических данных выявлено, что 1ГСкА и 1р достоверно больше у самцов, а 1к1-б7—У самок, из чего следует, что в эпидермисе крыс-самок преобладают процессы пролиферации, а в эпидермисе крыс-самцов более выражены процессы, направленные на дифференцировку. Одной из причин, объясняющей описанные различия может служить тот факт, что клетки кожи имеют рецепторы к эстрогенам. Известно, что повышение содержания половых гомонов в организме женского пола оказывает влияние на пролиферацию и дифференцировку клеточных популяций эпидермиса и дермы (О. Кп^ек-Масгка, 2005).

Особенности строения кожи крыс обоих полов после отмены воздействия дёгтя берёзового. Основываясь на данных, полученных вследствие продолжительного изучения кожи крыс после отмены дёгтя берёзового, можно заключить, что его действие носит транзиторный характер. Все изученные показатели состояния морфогенеза кожи при нанесении дёгтя имели отличия от контрольных значений; с течением времени разница нивелировалась, а затем и вовсе исчезла. Так, на 14-й день после отмены намечается тенденция к снижению всех изученных показателей. У самок значения показателей достигают величин, сопоставимых с контрольными, к 28-му, а у самцов — к 42-му дню после прекращения аппликаций дёгтя берёзового. Исключение составляет значение толщины зернистого слоя в группе крыс-самцов. Этот показатель имеет тенденцию к снижению, но не достигает контрольных величин в рамках проведённого эксперимента. Возникновение такого эффекта может обосновать эффективность терапии псориаза дёгтем, т.к. известно, что патомор-фологическая картина псориаза характеризуется полным отсутствием зернистого слоя, вновь появляющегося с наступлением ремиссии (Ю.К. Скрипкин, 2001). Возможно, стимуляция появления зернистого слоя эпидермиса, в известной степени, выводит патологический процесс на стационарный уровень. Можно предположить, что присутствие зернистого слоя может выполнять функцию индикатора, указывая на разрешение процесса. Наличием пролонгированного последействия дёгтя берёзового можно объяснить факт наступления ремиссии у больных с хроническими дерматозами, проходящих курс терапии с применением дёгтя берёзового (В.И. Альбанова, 2006а).

Заключение. Несмотря на длительную историю применения дёгтя берёзового в дерматологической практике, его состав и особенности воздействия на кожу не изучены. Таким образом, изучение гистогенетических процессов, происходящих в коже в условиях воздействия берёзового дёгтя, является актуальным. В соответствии с этим была поставлена цель — изучить в эксперименте проявления дерматотропной активности берёзового дёгтя. Для достижения цели были сформулированы задачи: продемонстрировать наличие у дёгтя берёзового специфической дерматотропной активности на примере кожи крыс; изучить особенности строения эпидермиса и дермы кожи крыс при накожном нанесении дёггя берёзового с учётом его воздействия на изучаемые структуры; изучить особенности строения структурных компонентов кожи, с учётом дозы наносимого дёгтя берёзового и полом экспериментальных животных; проследить длительность дерматотропного эффекта, достигнутого применением берёзового дёгтя, в различные сроки после отмены аппликаций исследуемого средства. Для решения поставленных задач подобраны адекватные методы — светооптический, морфометрический, иммуноморфологи-ческий. При светооптическом изучении учитывалась общая характеристика эпидермиса, состояние его слоёв, число рядов эпидермоцитов, наличие митозов, а также, общая характеристика сально-волосяных комплексов и дермы. Морфометрическими методами определяли толщину клеточного эпидермиса, среднюю площадь кератиноцита шиповатого слоя, толщину зернистого слоя, вычисляли ядерно-цитоплазматическое отношение, абсолютные и относительные параметры сальных желёз, долю сосудов микроциркуляторного русла в субэпидермальном слое дермы в % от её общей площади, клеточную плотность дермы и соотношение клеточных элементов в ней. При помощи иммуноморфологических методов определяли клетки, экспрессирующие белки РСКА и Кл-67. В результате установлены структурные и иммуноморфоло-гические проявления воздействия дёгтя берёзового на интерфолликулярный эпидермис крыс. Доказано, что дёготь берёзовый в условиях ежедневных в течение 14-и дней накожных аппликаций на неповреждённую кожу крыс вызывает в её структурных компонентах изменения, свидетельствующие о его дерматотропной биологической активности. Эти изменения эпидермиса проявляются в виде дозозависимого утолщения, увеличения площади кератино-цитов шиповатого слоя и ширины зернистого слоя, утолщения рогового слоя, возрастания в ростковом слое клеток, экспрессирующих маркёры пролиферации РСЫА и К.1-67. Особенности строения производных кожи проявляются в морфологических признаках себостатического эффекта и трихотропного воздействия в виде разрастания корневых влагалищ и наличия кератиновых пластов в глубоких отделах волосяного фолликула. В дерме под воздействием дёгтя берёзового развивается дозозависимое увеличение клеточной плотности дермы и доли суммарной площади сосудов микроциркуляторного русла в по-

ле зрения микроскопа. Морфологические и иммуноморфологические проявления дерматотропного эффекта от воздействия дёгтя берёзового носят тран-зиторный характер, снижаясь к 28-м суткам после отмены аппликаций и достигая контрольных показателей параметров к 42-м суткам. Степень выраженности выявленных морфологических проявлений и особенности их регресса после отмены аппликаций в определённой степени зависят от пола экспериментальных животных.

Результаты исследований использованы при составлении нормативно-технической документации на лекарственное средство «Дёготь берёзовый». Получен патент на изобретение «Лекарственное средство для лечения дерматозов, способ его получения (варианты) и способ лечения заболеваний кожи». Разработана методика анализа дёгтя берёзового по содержанию фенола, которая внесена в ФСП на субстанцию (ФСП 42-1970-06).

ВЫВОДЫ

1. Ежедневные в течение двух недель аппликации дёгтя берёзового на неповреждённую кожу межлопаточной области спины крыс вызывают дозо-зависимые гистоструктурные изменения, свидетельствующие о его дермато-тропной активности.

2. В области нанесения дёгтя берёзового изменения морфогенеза интер-фоликулярного эпидермиса проявляются его утолщением с развитием гапер-кератоза, возрастанием средней площади кератиноцитов шиповатого слоя, уменьшением ядерно-цитоплазматического отношения, расширением зернистого слоя, увеличением пролиферативной активности кератиноцитов и числа гипердиплоидных клеток.

3. В месте нанесения дёгтя берёзового происходит уменьшение представительства и площади сальных желёз и увеличение относительной площади базальных себоцитов. После аппликаций заметно разрастание корневых влагалищ и образовываются кератиновые пласты в глубоких отделах волосяного фолликула.

4. Гистоструктурные изменения дермы в области нанесения дёггя берёзового проявляются в виде диффузной лимфогистиоцитарной инфильтрации и полнокровия, подтверждённых при морфометрическом анализе увеличением клеточной плотности дермы и доли суммарной площади сосудов микро-циркуляторного русла от общей площади дермы.

5. Существует прямая зависимость между количеством наносимого дёгтя и степенью выраженности изменений в коже. Значения большинства изучаемых показателей у самцов достоверно больше, чем у самок.

женный зернистый слой, большую суммарную относительную площадь дифференцированных себоцитов и высокие показатели клеточной плотности дермы.

7. Гистоструктурные изменения, вызванные накожным нанесением дёгтя берёзового, носят транзиторный характер, постепенно уменьшаясь после отмены воздействия. У самок значения показателей достигают величин, сопоставимых с контрольными, к 28-м, а у самцов к 42-м суткам после прекращения аппликаций (за исключением зернистого слоя у самцов).

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Ноздрин В И, Белоусова Т А, Лаврик О И, Альбанова В И, Архапчев Ю П, Гузев К С., Поля-ченко Л Н, Остапчук Н В, Жучков С А, Крутых Е.Г. и др Морфологические проявления дерматотропного воздействия нафталанской нефти и березового дегтя в эксперименте // Матер VI Межд съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» — СПб, 2002 — С 465-469

2 Кинзирский А С, Белоусова Т А, Лаврик О И, Жучков С А., Крутых Е.Г. и др Морфологические проявления дерматотропного специфического воздействия дегтя березового очищенного на эпидермис и его дериваты в эксперименте // Ретиноидьг Сб ст — M • Изд-во ЗАО «Региноиды». — 2003 - Вып 15. — С 61-69

3 Ноздрин В И, Белоусова ТА, Лаврик О.И., Крутых Е.Г. и др Гисгоструктура соединительнотканного слоя кожи крыс в условиях воздействия дёгта березового очищенного в эксперименте // Ретаноиды Сб ст — МИзд-воЗАО «Ретаноиды» —2003 —Вып 15 —С 69-71

4 Архапчев Ю.П., Крутых Е Г, Осипов А С и др Содержание фенола, о-, м- и р- крезолов и салициловой кислоты у крыс после аппликации дегтя берёзового // Тез докл X Российский над конгр. «Человек и лекарство» 7-11 апр 2003 — М, 2003 —С. 574

5 Пронина Н В, Архапчев Ю П, Осипов A.C., Хромых Н Н, Крутых Е.Г. Использование XMC и ВЭЖХ для идентификации и количественного определения некоторых фенолов и салициловой кислоты // Тез докл X Российский нац. конгр «Человек и лекарство» 7-11 апр 2003 —М,2003 —С 651.

6 Архапчев Ю П, Пронина Н В, Осипов А С, Нестеренко П R, Крутых Е.Г. и др Использование хромато-масс-спектрометрии для идентификации некоторых фенолов и салициловой кислоты, входящих в состав дегтя березового // VII Международный съезд «ФИТОФАРМ-2003» Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения 3-5 июля 2003 Материалы съезда Сб ст — СПб,2003 —С 319-321

7 Крутых Е.Г. Гистоструктурные аспекты дерматотропной активности дегтя березового очищенного // III конф молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» 20-24 янв 2004: Сб ст — М Изд-во Научно-исслед центр ММА им И М Сеченова, 2004 — С 98

8 Ноздрин В И, Белоусова T А, Кинзирский А С Лаврик О И, Крутых Е.Г. и др Морфогенетиче-ский аспект действия на кожу деггя березового очищенного//Морфология —2004. — Т. 126, №5 —С 5660

9 Ноздрин В И, Кинзирский А С, Белоусова Т. А, Жучков С А, Крутых Е.Г. и др Закономерности изменения толщины эпидермиса животных при воздействии стимуляторов регенерации // Омский научный вестник «Морфоло гические науки — практической медицине» — 2004. — № 1 (26)—С. 75-78

10 Ноздрин В И, Белоусова T А, Архапчев Ю П, Крутых Е.Г. и др Морфофункциональные закономерности действия дёгтя берёзового очищенного на кожу в эксперименте // Морфологические ведомости — 2004 — № 1-2. — С. 74

11 Ноздрин К В, Крутых Е.Г., Архапчев Ю П, Ноздрин В И Берёза как источник фармакологически активных веществ // Ретиноидьг Сб ст. — М Изд-во ЗАО «Ретаноиды» —2005 —Вып 19. — С 4-12

12 Ноздрин В И, Кинзирский А С, Белоусова Т.А, Лаврик О И, Крутых Е.Г. и др Изучение биоэквивалентности дегтя берёзового неочищенного и очищенного // Тез докл XII Российский нац конгр «Человек и лекарство» 18-22 апр 2005. — М, 2005 — С 779-780

13 Кинзирский А С, Архапчев Ю П, Гузев К С, Ноздрин К В, Крутых Е.Г. и др Изучение биодос-

тупности мази на основе дегтя березового//Тез докл XIII Российский нац конгр «Человек и лекарство». 3-7апр 2006, —М,2006 — С 536-537.

14 Ноздрин В И, Белоусова Т А, Кинзирский АС, Лаврик О И, Крутых Е.Г. и др Морфогенез дермы при накожном нанесении дегтя березового//Тез докл XIII Российский нац конгр «Человек и лекарство» 3-7 апр 2006 — М.,2006 — С 565-566

15 Крутых Е.Г., Жучков С А, Ноздрин В И и др Влияние дегтя березового на экспрессию маркеров пролиферации // Тез докл XIV Российский нац конгр «Человек и лекарство» 16-20 апр 2007.— М, 2007 — С. 858

16 Ноздрин В И, Белоусова ТА, Лаврик О И, Алексеев А Г, Горелова М В, Горпинич И В, Крутых Е.Г. и др Морфогенез кожи и ее производных в свете данных доказательной морфологии // Морфология — 2008 —Т 133,№3 —С 80

ПАТЕНТ

Архапчев Ю П, Апьбанова В И, Белоусова Т А, Жучков С А, Крутых Е.Г. и др Лекарственное средство для лечения дерматозов, способ его получения (варианты) и способ лечения заболеваний кожи // Патент на изобретение № 2221587 приоритет от 20 01 2004

СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА

Фармакопейная статья предприятия ЗАО Фармацевтическое научно-производственное предприятие «Реганоиды» ФСП 1970-06 Деготь берёзовый

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю благодарность канд. мед. наук, доц. Т.А. Белоусовой— за обсуждение гистологических данных, канд. биол. наук О.И. Лаврик— за обсуждение экспериментальной программы, докт. мед. наук В.И. Альбановой — за обсуждение клинических аспектов проблемы, К.В. Ноздрину— за помощь при описании хроматографических данных, докт. фармац. наук КС. Гузеву—за обсуждение фармакологических свойств дёгтя, докт. фармац. наук Ю.П. Архапчеву — за помощь в освоении ВЭЖХ, канд. мед. наук. В.П. Бобылеву— за постоянную организационную поддержку, канд. мед. наук С.А. Жучкову — за обсуждение экспериментальных данных, И.В. Горпинич— за обсуждение особенностей цикла волоса, Л.В. Маркиной— за помощь в освоении гистологической техники, А.Г. Алексееву и М.В. Гореловой — за помощь в проведении экспериментальной части работы.

Подписано в печать 03 10 2008 г Формат 60x90, 1/16 Объем 1,25 пл Тираж 100 экз Заказ № 13

Отпечатано в типографии ЗАО «Ретиноиды» 111123, Москва, ул Плеханова, д 2/46 стр 5 Тел/факс (495)788-50-14

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Крутых, Евгений Геннадьевич

Глава 1. Общая характеристика работы.

1.1. Актуальность.

1.2. Цель и задачи.

1.3. Положения диссертации, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна

1.5. Практическая значимость

1.6. Внедрение

1.7. Апробация

1.8. Публикации.

Глава 2. Обзор литературы.

2.1. Особенности строения кожи крыс.

2.2. Дёготь берёзовый

2.2.1. Состав дёгтя берёзового.

2.2.2. Фармакологические свойства дёгтя берёзового.

2.2.3. Особенности строения кожи при воздействии дёгтя берёзового.

Глава 3. Материалы и методы исследования.

3.1. Материалы

3.1.1. Дёготь берёзовый

3.1.2. Экспериментальные животные

3.2. Методы.

3.2.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография

3.2.2. Гистологическая техника.

3.2.3. Получение цифровых изображений

3.2.4. Статистическая обработка полученных данных

Глава 4. Результаты собственных исследований.

4.1. Исследование строения кожи межлопаточной области крыс-самок, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового по 0,05; 0,1 и 0,25 г/сут в течение 14-и дней

4.2. Исследование строения кожи межлопаточной области крыс обоих полов, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового по 0,05 г/сут в течение 14-и дней.

4.3 Исследование строения кожи межлопаточной области крыс обоих полов в различные сроки после отмены аппликаций дёгтя берёзового по 0,05 г/сут, проводившихся в течение 14-и дней

Глава 5. Обсуждение результатов собственных исследований.

5.1. Проявления дерматотропной активности дёгтя берёзового

5.2. Дозозависимые особенности строения кожи межлопаточной области крыс обоих полов, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового

5.3. Половые отличия строения кожи крыс, подвергавшихся воздействию дёгтя берёзового.

5.4. Особенности строения кожи крыс обоих полов после отмены воздействия дёгтя берёзового

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности строения кожи крыс в условиях воздействия дегтя березового"

1.1. Актуальность

Большинство веществ при местном нанесении способно оказывать биологическое действие, изменяя процессы гистогенеза кожи (А.Н. Яцковский, 2003; S. Inan et al., 2006; С.А. Жучков, 2007). Исследование этих процессов даёт представление о механизме действия лекарственных препаратов и открывает качественно новый подход к рациональной фармакотерапии кожных болезней (Н.Д.Алиев, 1983; Н.Д. Бунятян, 2004; А.А. Кубанова, 2005).

С древних времён дёгти (древесные и каменноугольные) использовались в народной медицине, а в дерматологии в течение последних 100 лет они входят в состав многих лекарственных прописей (С. Есснер, 1913; И.Л. Белахов, 1937; П.В. Кожевников, 1950; А.И. Картамышев, 1964; А. Максимова, 2006). В последние годы у дерматологов появился интерес к средствам, не содержащим глюко-кортикоиды. Терапия хронических дерматозов с применением содержащих дёготь препаратов в этом ряду занимает особое место, оказывая схожий с лечением стероидами клинический эффект (В.И. Альбанова, 2006 а,б; В.И. Альбанова, О.Г. Лукина, 2005). Тяжесть побочных эффектов от применения дёгтя, в целом, меньше, чем от лечения местными кортикостероидами. Его применение в клинике может быть эффективно, когда другие средства не помогают или не могут быть использованы (W.A. Dodd, 1993).

В литературе имеется небольшое количество публикаций по биологической активности, в основном, каменноугольного дёгтя. Показано, что его местное нанесение вызывает утолщение эпидермиса, увеличение количества чешуек, образование комедонов и атрофию сальных желёз, а также что он подавляет и изменяет синтез ДНК в трансформированных человеческих кератиноцитах in vitro (J.Brown, 1982; A. Bernd et al., 1988; В. Schoket et al., 1991). Работы, посвященные изучению воздействия дёгтя берёзового на гистоструктуру эпидермиса, практически отсутствуют, из чего следует, что изучение гистогенетиче-ских процессов, происходящих в коже в условиях воздействия дёгтя берёзового, является актуальным. Цель и задачи исследования были сформулированы следующим образом.

1.2. Цель и задачи

Целью настоящего исследования стало изучение особенностей строения кожи крыс в условиях воздействия дёгтя берёзового. В соответствии с целью в работе были сформулированы следующие задачи:

1. Продемонстрировать дерматотропную активность дёгтя берёзового на примере кожи крыс.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Крутых, Евгений Геннадьевич

Выводы

1. Ежедневные в течение двух недель аппликации дёгтя берёзового на неповреждённую кожу межлопаточной области спины крыс вызывают дозозависимые гистоструктурные изменения, свидетельствующие о его дерматотропной активности.

2. В области нанесения дёгтя берёзового изменения морфогенеза ин-терфоликулярного эпидермиса проявляются его утолщением с развитием гиперкератоза, возрастанием средней площади кератиноцитов шиповатого слоя, уменьшением ядерно-цитоплазматического отношения, расширением зернистого слоя, увеличением пролиферативной активности кератиноцитов и числа гипердиплоидных клеток.

4. Гисто структурные изменения дермы в области нанесения дёгтя берёзового проявляются в виде диффузной лимфогистиоцитарной инфильтрации и полнокровия, подтверждённых при морфометрическом анализе увеличением клеточной плотности дермы и доли суммарной площади сосудов микроциркуляторного русла от общей площади дермы.

6. Степень выраженности изменений, наблюдаемых сразу и с течением времени после отмены воздействия дёгтя берёзового, зависят от пола животного. Кожа крыс-самцов имеет достоверно большую толщину клеточного эпидермиса с преобладанием гипердиплоидных кератиноцитов, более выраженный зернистый слой, большую суммарную относительную площадь дифференцированных себоцитов и высокие показатели клеточной плотности дермы.

5.5. Заключение

Несмотря на всю историю применения дёгтя берёзового в дерматологической практике, его состав и особенности воздействия на эпидермис не изучены. Таким образом, изучение гистогенетических процессов, происходящих в коже в условиях воздействия берёзового дёгтя, является актуальным. В соответствии с этим была поставлена цель — изучить в эксперименте проявления дерматотропной активности берёзового дёгтя. Для достижения цели были сформулированы задачи: продемонстрировать наличие у дёгтя берёзового специфической дерматотропной активности на примере кожи крыс; изучить особенности строения эпидермиса и дермы кожи крыс при накожном нанесении дёгтя берёзового с учётом его воздействия на изучаемые структуры; изучить особенности строения структурных компонентов кожи с учётом дозы наносимого дёгтя берёзового и пола экспериментальных животных; проследить длительность дерматотропного эффекта, достигнутого применением берёзового дёгтя, в различные сроки после отмены аппликаций исследуемого средства.

Для решения поставленных задач подобраны адекватные методы — светооптический, морфометрический, иммуноморфологический. При светооптическом изучении учитывалась общая характеристика эпидермиса, состояние его слоёв, число рядов эпидермоцитов, наличие митозов, а также, общая характеристика сально-волосяных комплексов и дермы. Морфометрическими методоми определяли толщину клеточ

101 ного эпидермиса, среднюю площадь кератиноцита шиповатого слоя, толщину зернистого слоя, вычисляли ядерно-цитоплазматическое отношение, абсолютные и относительные параметры сальных желёз, долю сосудов микроциркуляторного русла в субэпидермальном слое дермы в % от её общей площади, клеточную плотность дермы и соотношение в ней клеточных элементов. При помощи иммуноморфологиче-ских методов выявляли клетки, экспрессирующие белки PCNA (маркёр увеличения ДНК) и Ki-67 (маркёр делящихся клеток). В результате установлены структурные и иммуноморфологические проявления воздействия дёгтя берёзового на интерфолликулярный эпидермис крыс.

Было доказано, что дёготь берёзовый в условиях ежедневных в течение 14-и дней накожных аппликаций на неповреждённую кожу крыс вызывает в её структурных компонентах изменения, свидетельствующие о его дерматотропной биологической активности. Эти изменения эпидермиса проявляются в виде дозозависимого утолщения, увеличения площади кератиноцитов шиповатого слоя и ширины зернистого слоя, утолщения рогового слоя, возрастания в ростковом слое число клеток, меченных маркёрами пролиферации PCNA и Ki-67. Особенности строения производных кожи проявляются в морфологических признаках себостатического эффекта и трихотропного воздействия в виде разрастания корневых влагалищ и наличия кератиновых пластов в глубоких отделах волосяного фолликула. В дерме под воздействием дёгтя берёзового развивается диффузная лимфогистиоцитарная инфильтрация и полнокровие, выраженные в дозозависимом увеличением клеточной плотности дермы и доли суммарной площади сосудов микроциркуляторного русла в поле зрения микроскопа. Морфологические и иммуноморфологические проявления дерматотропного эффекта от воздействия дёгтя берёзового носят транзиторный характер, снижаясь к 28-м суткам после отмены аппликаций и достигая контрольных показателей

102 параметров к 42-м суткам. Степень выраженности выявленных морфологических проявлений и особенности их регресса после отмены аппликаций в определённой степени зависят от пола экспериментальных животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Крутых, Евгений Геннадьевич, Москва

1. Алиев Н.Д., Тагдиси Д.Г., Мамедов ЯД. Механизмы терапевтического действия нафталана//Баку: Азерб. гос. изд-во, 1983. - 191 с.

2. Алъбанова В.И. Дёготь берёзовый (очищенная субстанция) // Рети-ноиды: Сб. ст. -М.: Изд-во ЗАО «Ретиноиды». —2005а. —Вып. 19. — С. 3-4.

3. Алъбанова В.И. Новый способ лечения хронических дерматозов дёгтем берёзовым (очищенной субстанцией) П Ретиноиды: Сб. ст. —М.: Изд-во ЗАО «Ретиноиды». — 20056. — Вып. 19. — С. 19-20.

4. Алъбанова В.И. Применение чистого дёгтя в дерматологической практике // Ретиноиды: Сб. ст. — Изд-во ФН1111 «Ретиноиды», М., 2006а. — Вып. 23. —С. 35-40.

5. Алъбанова В.И. Эффективность лечения псориаза очищенным берёзовым дёгтем // Альманах клин, мед.: Сб. ст. — М. — 20066. — Т. IX. —-С. 163-166.

6. Алъбанова В.И., Лукина О.Г. Новый метод лечения псориаза берёзовым дёгтем // Тез. докл. XII Росс. нац. конгр. «Человек и лекарство», 18— 22 апреля 2005.— М., — 2005. — С. 305.

7. Артёмова А. Берёза исцеляющая и омолаживающая. — СПб.: «ДИЛЯ», 2001. — 160 с.

8. Архапчев Ю.П., Хромых Н.Н. Содержание полициклических ароматических углеводородов в дёгте берёзовом // Ретиноиды: Сб. ст. М.: Изд-во ЗАО «Ретиноиды». — 2005а. —Вып. 19. — С. 21-22.

9. Архапчев Ю.П., Хромых Н.Н., Архапчев М.Ю. Количественное определение ПАУ в дёгте берёзовом // Тез. докл. XII Росс. нац. конгр. "Человек и лекарство", 18-22 апреля 2005. —М. — 20056. — С. 734-735.

10. Бабаева А.Г. Иммунологические механизмы регуляции восстановительных процессов. —М.: Медицина, 1972. — 150 с.

11. Белахов И.Л., Демьянович М.П., Елистратова М.Ф. и др. Лечение кожных и венерических болезней. — М., 1937. — С. 58.

12. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия. Пролиферация и дифференцировка. —М.: Наука, 1981. — 259 с.

13. Букштынов А.Д. Леса. — М.: Мысль, 1981. — 184 с.

14. Бунятян Н.Д., Березнякова В.В., Глазкова Т.Ю. Эффективность 5 % альтановой мази при контактном дерматите у крыс // Вестник ВГУ. — 2004. —№1.—С. 160-162.

15. Герксгеймер К., Гофман Э. Кожные болезни.— М—Л., 1931.—348 с.

16. Григорьев П.С. Краткий курс венерических и кожных болезней. -М.: Медгиз, 1946. С. 363.

17. Добронравов В.Н. Опыт советской медицины в Великой Отечественной войне 1941-1945 гг. — М.: Медгиз, 1951. — Т. 27-28. — С. 72-82.

18. Дъячук Г.И., Вишневецкая Т.Г. Пищевые добавки на основе бету-лина // Фармацевтическое обозрение. — 2002. — № 6. — С. 53-54.

19. Есснер С. Руководство по кожным и венерическим болезням. — СПб., 1913.—322 с.

20. Жучков С. А. Состояние кератиноцитов интерфолликулярного эпидермиса при аппликации 13-цис-ретиноевой кислоты (иммуноцитохимиче-ский анализ) // Морфология. 2007а. - Т. 132, №4. - С. 68-72.

21. Жучков С. А. Влияние 13-цис-ретиноевой кислоты на пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов крыс: Автореф. дис. канд. мед. наук. — М., 20076. — 25 с.

22. Искренов С., Пейчев П., Хаджиева И. Исследование некоторых дёгтей и препаратов из них на наличие полициклических ароматических углеводородов. // Тез. докл. 6-го Междунар. съезда. София. — София, 1973. — С. 400-410.

23. Каламбет Ю.А. Пакет программ МультиХром. Версия 2.7: Справочное руководство. -М.: Ampersand, 1995 — 120 с.

24. Капитца Х.Г. Первые шаги в микроскопии. Изд 2-ое, переработанное. — Иена: Карл Цейсс, 1997. — 44 с.

25. Каралова Е.М., Петросян А.В., Аброян Л.О., Ноздрин В.И., Мага-кян Ю.А. Синтез и содержание ДНК в ядрах клеток эпидермиса кожи мышей в процессе их дифференцировки и специализации // Бюл. эксперимент, биол. и мед. — 1988. — № 11. — С. 604-606.

26. Крамаренко В.Ф. Токсическая фармакология.— Киев: «Выща школа», 1989. —448 с.

27. Картамышев А.И. Кожные и венерические болезни. — Киев, 1964. — 356 с.

28. Калукин А.В. Древоцелительство. — М.: Советский спорт, 2002. —224 с.

29. Кожевников П.В. Лечение кожных болезней. — Л., 1950. — 212 с.

30. Максимова А. Псориаз: лечение народными средствами. — Ростов: Феникс. — 2006. — 224 с.

31. Машковский Д.М. Лекарственные средства. В 2 тт. —14-е изд., пе-рераб. и доп. —М.: Изд-во Новая Волна, 2002. В 2 тт. — Т. 2. — 576 с.

32. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники.-Л.: Медицина, 1969.—423 с.

33. Молочков В.А., Бадокин В.В., Алъбанова В.И., Волнухин В.А. Псориаз и псориатический артрит. — М.: КМК, Авторская академия, 2007. — 332 с.

34. Мяделец ОД Изменение функциональной активности макрофагов кожи и регионального лимфоузла после воздействия на организм белых крыс глубокой гипертермии // Арх. анат. — 1989. — № 6. — С. 65-69.

35. Мяделец О.Д. Основы цитологии, эмбриологии и общей гистологии. — М.: Медицинская книга, Н.-Новгород: Изд-во НГМА, 2002. — 367 с.

36. Мяделец ОД., Адаскевич В.П. Морфофункциональная дерматология. — М.: Медлит, 2006. — 752 с.

37. Ноздрин В.И., Белоусова Т.А., Алъбанова В.И., Лаврик О.И. Гисто-фармакологические исследования кожи (наш опыт). — М.: Изд-во ЗАО «Ре-тиноиды», 2006а. — 380 с.

38. Ноздрин В.И., Мурников В.Т., Яцковский А.Н. К методике количественной микрофотометрии // Сист. свойства тканевых организаций: Сб. ст. — М.: Изд-во I МММ, 1977. — С. 173-176.

39. Озерова В.М. Берёзовый дёготь в лечении псориаза и других болезней кожи. —СПб., Весь, 2005. — 128 с.

40. Осетров В.Д. Альтернативная фитотерапия: рецептурный сборник. Киев: Наукова думка. - 1993. - 271с.

41. Осипов А.С., Архапчев Ю.П., Пронина Н.В., Нестеренко П.Н. Исследование возможности применения ЖХВД для анализа лекарственного средства деготь березовый // Вопр. биол. мед. и фармац. химии. — 20026. — №4. —С. 27-31.

42. Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных. Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755.

43. Пронина Н.В., Осипов А.С., Архапчев Ю.П. Определение фенолов в березовом дегте с помощью ВЭЖХ // Тез. докл. IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: Сб. ст. — М., 2002. — С. 682.

44. Прохоренков В.И., Рукша Т.Г., Петрова JI.JI., Салмина А.Б. Запрограммированная клеточная гибель кератиноцитов и её роль в патогенезе некоторых заболеваний кожи // Вестн. дерматол. и венерол.— 2005.— №4. —С. 4-7.

45. Пъянкова З.П. Результаты лечения и некоторые общие реакции организма после местного применения дегтярных препаратов при экзематозных процессах: Дис. канд. мед. наук. М., 1956. - 294 с.

46. Рациональная фармакотерапия заболеваний кожи и инфекций, передаваемых половым путём: Рук. для практикующих врачей / Под ред. Куба-новой А.А., Кисиной В.И. —М.: Литтерра, 2005. — 882 с.

47. Розентул М.А. Общая терапия кожных болезней.— М.: Медгиз, 1956. —442 с.

48. Российский Д.М. Лечебные препараты из белой берёзы // Фармация. — 1943. — № 3. — С. 18-23.

49. Рудаков О.Б., Вострова И.А, Фёдоров С.В., Филиппов А.А., Селе-менев В.Ф., Приданцев А. А. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии. — Воронеж: Водолей, 2004. — С. 15.

50. Сазыкина JI.H. Применение Ретасола в терапии обыкновенных угрей с морфологическим и клинико-экспериментальным обоснованием: Ав-тореф. дис. канд. мед. наук. — М., 2004. — 23 с.

51. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А. и др. Аналитическая хроматография. —М.: Химия, 1993. — 464 с.

52. Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержа-нию экспериментально-биологических клиник (вивариев). Утверждены Главным государственным санитарным врачом СССР 06.04.1973 г. № 1045-73.

53. Серов В.В., Пауков B.C. Воспаление. Рук. для врачей. — М.: Медицина, 1995. —640 с.

54. Скрипкин Ю.К. Кожные и венерические болезни: Учебн. для врачей и студ. мед. ВУЗов. — М.: Триада-фарм, 2001. — 688 с.

55. Скрипкин Ю.К., Лезвинская Е.М. Кожа — орган иммунной системы // Вестн. дерматол. — 1989. —№10. — С. 14-18.

56. Соколов В.Е., Степанова Л.В. Структура и химическая организация рогового слоя эпидермиса млекопитающих // Успехи совр. биол.: Сб. ст. —1985. —Т. 100, №1.-С. 113-127.

57. Упоров А.В., Семиглазов В.Ф., Пожарисский К.М. Иммуноги-стохимическое изучение клеток рака молочной железы с использованием разных маркеров пролиферации. // Арх. патол. — 2000. — Т. 62, № 2. — С. 26-30.

58. Френкель М. Фармакология. / Пер. с нем. В.Г. Лазарева.— М.: Изд-во "Сотрудника", 1907. — 237 с.

59. Шехтер А.Б. Воспаление: Рук. для врачей / Под ред. Серова В.В. и Паукова B.C. — М.: Медицина, 1995. — С. 164-173.

60. Эвтаназия экспериментальных животных (методические рекомендации по выведению животных из эксперимента). — М.: Наука, 1985. — 32 с.

61. Яцковский А.Н., Белоусова Т.А., Ноздрин В.И. Гистоструктурные и морфометрические проявления дерматотропной активности препарата наф-тадерм в эксперименте // Ретиноиды: Сб.ст. — М.: Изд-во ЗАО «Ретиноиды». — 2003. — Вып. 15. — С. 51-60.

62. BerndA., TheiligC., Muller К., Bereiter Hahn J., Hevert F., Holz-mann H. Antiproliferative activity of highly purified coal tar preparation in comparison with clobetasol-17-propionate // Arzneimittelforschung.— 1990.-Vol. 40, № 7. —P. 782-787.

63. Bernd A., Wehrenberg O., Hevert F., Holzmann H. Experimental and clinical demonstration of the antiproliferative effect of a highly purified coal tar fraction in a special gel vehicle // Arzneimittelforschung.— 1988.— Vol.38, №4. —P. 582-586.

64. Botchkarev V.A., Eichmuller S., Johansson O., Paus R. Hair cycle-dependent plasticity of skin and hair follicle innervation in normal murine skin // J. Comp Neurol. — 1997. — № 386. — P. 379-395.

65. Chen, J.D., Lapiere J.C., Sander D.N. Interleukin-1 alpha stimulates keratinocytes migration through an epidermal growth factor transformationsgrowth factor-alpha-independent pathway // Invest. Dermatol.— 1995.

66. Vol. 104, № 5. — P. 729-733.

67. Chiou S.K., Jones M.K., Tarnawski A.S. Survivin — an anti-apoptosis protein: its biological roles and implications for cancer and beyond // Med. Sci. Monit. —2003. —Vol. 9, №4. —P. 125-129. PMID 12709681.

68. Crish J.F., Bone F., Banks E.B., Eckert R.L. The human involucrin gene contains spatially distinct regulatory elements that regulate expression during early versus late epidermal differentiation // Oncogene 2002.— Vol.21, №5.— P. 738-747.

69. Dodd W.A. Tars. Their role in the treatment of psoriasis. Review // Dermatol. Clin. — 1993.— Vol. 11, № 1. —P. 131-135.

70. Eckert R.L., Rorke E.A. Molecular biology of keratinocyte differentiation // Environmental Health Perspectives. — 1989. — Vol. 80. — P. 109-116.

71. Eckert R.L., Yaffe M.B., Crish J.F. et al. Involucrin structure and role in envelope assembly // J. Invest. Dermat.— 1993.— Vol.100, №5.— P. 613-617.

72. Eckert R.L, Crish J.F, Efimova Т., et al. Regulation of involucrin gene expression // J. Invest. Dermatol. —2004. —Vol. 123, № 1. —P. 13-22.

73. Endl E., Gerdes J. The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function // Exp. Cell Res. — 2000. — Vol. 257, № 2. — P. 231-237.

74. Enjolras O. Local treatment of cutaneous psoriasis // Rev. Prat. — 1991. — Vol. 41, № 22. — P. 2174-2176.

75. Essers .J, Theil A.F., Baldeyron C., van Cappellen W.A., Houtsmuller A.B., Kanaar R, Vermeulen W. Nuclear dynamics of PCNA in DNA replication and repair //Mol. Cell. Biol. — 2005. — Vol. 25, № 21. — P. 9350-9359.

76. Foreman M.I., Picton W., Lukowieecki G.A., Clark C. The effect of topical crude coal tar treatment on unstimulated hairless hamster skin // Br. J. Dermatol. — 1979. — Vol. 100, № 6. — P. 707-715.

77. Galand P. Degraef C. Cyclin/PCNA immunostaining as an alternative to tritiated thymidine pulse labeling for marking S phase cells in paraffin sections from animal and human tissues // Cell Tissue Kinet. — 1989. — Vol. 22, № 5. — P. 383-392.

78. Gerdes J., Schwab U., Lemke H., Stein H. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation // Int. J. Cancer — 1983. — Vol. 31, № 1. — P. 13-20.

79. Heen M., Thiriar S., Noel J.C. Galand P. Ki-67 immunostaining of normal human epidermis: comparison with 3H-thymidine labeling and PCNA immunostaining // Dermatology. — 1998. — Vol. 197, № 2. — P. 123-126.

80. Hagens G., Roulin K., Hotz R., et al. Probable interaction between S100A7 and E-FABP in the cytosol of human keratinocytes from psoriatic scales // Mol. Cell. Biochem. — 1999. — Vol. 192, № 1-2. — P. 123-128.

81. Hohojf C., Borchers Т., Riistow В., et al. Expression, purification, and crystal structure determination of recombinant human epidermal-type fatty acid binding protein // Biochemistry. — 1999. — Vol.38. — P. 12229-12239.

82. Hughes N.C., Pfau W., Hewer A., Jacob J., Grimmer G., Phillips D.H. Covalent binding of polycyclic aromatic hydrocarbon components of coal tar to DNA in mouse skin // Carcinogenesis. — 1993. — Vol. 14, № 1. — P. 135-144.

83. Hussein M.A. The overall pattern of hair follicle arrangement in the rat and mouse//J. Anat. — 1971. — Vol. 109, №2.—P. 307-316.

84. Inan S., Oztukcan S., Vatansever S., Ermertcan A.T., Zeybek D., Ok-sal A., Giray G., Muftuoglu S. Histopathological and ultrastructural effects of gly-colic acid on rat skin // Acta Histochem. — 2006. — Vol. 108, № 1. — P. 37-47.

85. International Patent Application (РСТ/ N095/ 00038): Therapeutic Skin Cream. Inventor: Marit Eriksen. 1995.

86. Iskandar Z.A., Al-Joudi F.S. Expression of survivin in fetal and adult normal tissues of rat // Malays J. Pathol. — 2006. — Vol. 28, № 2. — P 101-105.

87. Kai-Hong J., Jun X, Kai-Meng H., Ying W., Hou-Oi L. P63 expression pattern during rat epidermis morphogenesis and the role of p63 as a marker for epidermal stem cells // J. Cutan Pathol. — 2007. Vol. 34, № 2. — P. 154-159.

88. Kirk-Othmer encyclopedia. 3 ed., N. Y., 1978.115

89. Krzysiek-Maczka G. Skin cells as steroid target; the steroid action in some skin diseases and wound healing // Przegl Lek. — 2005. —Vol. 62, № 3. — P. 181-187.

90. Lavker R.M., Grove G.L., Kligman A.M. The atrophogenic effect of crude coal tar on human epidermis // Br. J. Dermatol.— 1981.— Vol. 105, № 1.—P. 77-82.

91. Leong L.Y. How I use coal tar in dermatology // Singapore Med. J. — 1990. — Vol. 31, № 6. — P. 614-615.

92. Morioka K., Matsuzaki Т., Takata K. Localization of Myosin and actin in the pelage and whisker hair follicles of rat // Acta Histochem Cytochem. — 2006. — Vol. 30, № 39. — P. 113-123.

93. Matsui Т., Matsushita Y., Kaikake K., Sakamoto T. Chromatographic analysis of constituent of wood tar obtained from hardwood bark // Miyazaki Dai-gaki Kogahubu Kenkyu Hokoku. — 1994. — Vol. 40. — P. 183-189.

94. The Merck Index. Twelfth Edition. (An Encyclopedia of chemicals, drugs and biologicals) // Merck and Co., 1996.

95. Milewich Z, Shaw C.B., Sontheimer R.D. In Endocrin, metabollic and immunological functions of keratinocytes // Annals N. Y. Academ. of Sci. — 1998.—Vol. 548. —P. 66-89.

96. Nogami M., Hoshi Т., Kinoshita M., Arai Т., Takama M., Takahashi I. Vascular endothelial growth factor expression in rat skin incision wound // Med. Mol. Morphol. — 2007. — Vol. 40, № 2. — P. 82-87.

97. International Patent Application (РСТ/ FR98/ 00448): Coal tar extract with reduced aromatic hydrocarbon content, method obtaining same and dermato-logical and cosmetic compositions. Invertor: Roger Navarro. 1998.

98. Sebastiani S., Albanesi C. The role of chemokines in allergic contact dermatitis // Arch. Dermatol. — 2002. — Vol. 293. — P. 552-559.

99. Sah N.K., Khan Z, Khan G.J, Bisen P.S. Structural, functional and therapeutic biology of surviving // Cancer Lett. 2006. — Vol. 244, № 2. — 164-171.

100. Scholzen Т., Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown // J. Cell Physiol. — 2000. — Vol. 182, № 3. p. 311-322.

101. Spain K.C. The relation between the structure of the epidermis of the rat and the guinea pig, and the proloferative power of normal and regenerating epithelial cells of the same species // J. Exp. Med. — 1915. — Vol. 21. — P. 193— 202.

102. Thami GP, Sarkar R. Coal tar: past, present and future // Clin. Exp. Dermatol. — 2002. — Vol. 27, № 2. — P. 99-103.

103. Thawornchaisit P., Harncharoen K. A comparative study of tar and betamethasone valerate in chronic plaque psoriasis: a study in Thailand. // J. Med. Assoc. Thai. — 2007. — Vol. 90, № 10. — P. 1997-2002.

104. UK Patent Application (GB 2 116 423 A): Dermatological compositions. Inventor: John Brown, 1982.

105. Vandekerkhof P.C.M. Biological activity of vitamin D analogues in the skin, with special reference to antipsoriatic mechanisms // Brit. J. Dermatol. — 1995. —Vol. 132, №5.—P. 675-682.

106. Watanabe R., Fujii H., Yamamoto A., Yamaguchi H., Takenouchi Т., Kameda K., Ito M., Ono T. Expression of cutaneous fatty acid-binding protein and its mRNA in rat skin // Arch. Dermatol. Res. — 1996. — Vol. 288, № 8. — P. 481-483.

107. Zhang G., Gibbs E., Kelman Z., O'Donnell M., Hurwitz J. Studies on the interactions between human replication factor С and human proliferating cell nuclear antigen // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1999. — Vol. 96, № 5. — P. 18691874.

108. Zhang C., Zhang X., Yang J., Liu Z. Analysis of polynuclear aromatic hydrocarbons in heavy products derived from coal and petroleum by high performance liquid chromatography // J.Chromatogr A.— 2007.— Vol.1167.— P. 171-177.

109. Zimmermann R. The rabbit ear model as an acnegenicity test. 2. Effect of coal tar on follicle and sebaceous gland epithelium tumor induction // Dermatol. Monatsschr. — 1989. — Vol. 175. — P. 691-698.1. Благодарности

Информация о работе

Крутых, Евгений Геннадьевич
кандидата медицинских наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.25

Диссертация

Особенности строения кожи крыс в условиях воздействия дегтя березового - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы