Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфогенез и его регуляция в культуре эпидермальных клеток человека

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфогенез и его регуляция в культуре эпидермальных клеток человека"

На правах рукописи

ВОРОТЕЛЯК Екатерина Андреевна

МОРФОГЕНЕЗ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ В КУЛЬТУРЕ ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Специальность - 03.03.04. клеточная биология, цитология, гистология

1 2 ид? 20і2

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2012

005015326

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Терских Василий Васильевич Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Ярыгин Константин Никитич (НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН)

Доктор биологических наук, Григорян Элеонора Норайровна (Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН)

Доктор биологических наук, Лагарькова Мария Андреевна (Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН)

Ведущая организация: МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра клеточной биологии и гистологии

Защита состоится 21 марта 2012 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д002.238.01 Учреждения Российской академии наук

Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334

Москва, ул. Вавилова, д. 26;

e-mail: idbras@bk.ru;

Факс: 8-499-135-80-12;

http://idbras.comcor.ni

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН и на сайте Института http://idbras.comcor.ru

Автореферат разослан

февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук ele0806@yandex.ru

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние несколько десятилетий клеточная биология и биология развития значительно продвинулись в понимании закономерностей регенерации и морфогенеза у многоклеточных организмов. Одним из инструментов, позволивших сделать это, явилось развитие техники культивирования клеток и тканей. При этом выяснилось, что с одной стороны эти подходы могут быть с успехом применены в фундаментальных исследованиях, а с другой - открывают совершенно новые перспективы для регенеративной медицины.

Эпидермис был одной из первых тканей, которую начали культивировать in vitro (Green, 2008). Способность эпидермальных клеток к реконструкции многослойного пласта с последующим встраиванием в нормальные ткани после пересадки позволила успешно применять культивированные кератиноциты для закрытия ожоговых дефектов кожи и ран (Терских В.В., Васильев A.B., 1995). Одновременно был открыт путь к изучению особенностей биологии эпидермальных клеток. При этом наибольшее число исследований касалось пролиферативной активности эпидермальных клеток и ее стимуляции, а также закономерностей дифференцировки. Связано это, прежде всего, с большим количеством травм и заболеваний кожи у человека, сопровождающихся гиперпролиферацией и нарушением программы дифференциации. Поиск стимулирующих пролиферацию агентов также позволил повысить эффективность культивирования эпидермальных клеток. С ростом интереса к проблеме стволовых клеток появилась серия исследований, посвященных структурно-функциональной организации эпидермиса и регенеративному потенциалу различных клеточных компартментов, его составляющих (Blanpain & Fuchs, 2006). Однако подавляющее большинство подобных работ было проведено с использованием лабораторных животных, часто генетически модифицированных. При кажущейся гистологической однородности эпидермиса оказалось, что его функционирование поддерживается сложной иерархической системой клеточных популяций. До сих пор динамическую структуру этой ткани нельзя считать окончательно выясненной. Еще меньше ясности имеется относительно развития этой системы в онтогенезе и ее восстановлении в ходе регенерации. При этом закономерности регенерации и морфогенеза эпидермиса у человека исследуются недостаточно. Между тем, на наш взгляд, подходы с использованием культуры клеток, могут многое прояснить в этой области. Восстановление многослойной структуры эпидермального пласта в культуре с возможностью его длительного культивирования указывает на прохождение процессов регенерации, которые представляют собой вторичное развитие. Возможность воспроизведения в

культуре начальных этапов регенерации наиболее сложно устроенных структур - придатков кожи человека - позволит детально изучить механизмы их развития, а также патогенез многих заболеваний кожи и волос.

В то же время, накоплена значительная информация относительно развития и функционирования придатков кожи, в частности волосяных фолликулов у животных (Tiede et al., 2007; Fuchs, 2009). У мыши исследование данного объекта оказалось чрезвычайно плодотворным для определения механизмов эпителио-мезенхимного взаимодействия в ходе морфогенеза и регенерации (Botchkarev et al., 1999; Rendí et al., 2005). Выяснилось также, что волосяной фолликул содержит несколько популяций стволовых клеток, имеющих разное происхождение. Потенциал этих клеток кажется сегодня настолько широким, что кожу можно рассматривать в качестве весьма перспективного источника клеточного материала для регенеративной медицины. Однако закономерности эпителио-мезенхимных взаимодействий, регенерации и морфогенеза, а также структуру и потенциал клеточных популяций волосяного фолликула у человека невозможно в достаточной мере изучить только с помощью методов, используемых на лабораторных животных. Это привело к возникновению пробела в изучении структурно-функциональной организации эпидермиса, эпителио-мезенхимных взаимодействий в ходе морфогенеза и регенерации у человека. Поэтому возникла необходимость разработки новых подходов. Настоящая работа посвящена изучению этих вопросов.

Цель исследования. Изучение морфогенетических процессов и механизмов их

регуляции в культуре эпидермальных кератиноцитов человека.

Задачи:

1. Исследовать закономерности формирования эпидермального пласта из кератиноцитов человека и возможность реконструкции структурно-функциональных единиц in vitro.

2. Определить способ и механизмы миграции многоклеточных кластеров на пластике и коллагеновом геле in vitro.

3. Охарактеризовать динамику пролиферативной активности мигрирующих клеток.

4. Определить сохраняются ли стволовые/прогениторные эпидермальные кератиноциты в культуре, и каковы их характеристики.

5. Создать клеточную модель, позволяющую изучать эпителио-мезенхимные взаимодействия и эпидермальный морфогенез in vitro, использовать ее для моделирования фолликулогенеза и изучения его механизмов.

6. Разработать методы для выделения и культивирования клеток дермальной папиллы (волосяного сосочка) и охарактеризовать фенотип, дифференцировку и морфогенетический потенциал этих клеток.

7. Оценить динамику транскрипции генов ключевых сигнальных путей в клетках дермальной папиллы при культивировании.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые показано, что культивированные эпидермальные клетки человека сохраняют способность к морфогенезу вне организма, в частности, в ходе эпителио-мезенхимных взаимодействий. Обоснована возможность реконструкции в культуре структурно-функциональных единиц кожи человека.

Найден новый клеточный механизм коллективной миграции кластера эпидермальных кератиноцитов человека. Впервые изучены ультраструктурные особенности таких кластеров. Продемонстрирована активация эпидермальных клеток при культивировании и способность к миграции клеток высокого уровня дифференцировки. Обнаружен феномен базальной миграции эпидермальных клеток в отсутствие сыворотки и митогенов.

Установлены закономерности эпителизации коллагенового геля эпидермальными кератиноцитами человека при взаимодействии с различными компонентами матрикса и мезенхимными клетками, включенными в состав геля. Впервые на основании этих данных разработана модель, воспроизводящая ключевые события морфогенеза волосяного фолликула человека в культуре. Продемонстрировано, что клетки дермальной папиллы человека полипотентны, индуцируют эпидермальный морфогенез и ангиогенез.

Полученные результаты вносят значительный вклад в понимание механизмов эпидермального морфогенеза у человека, а также биологии клеток кожи. Обозначено новое научное направление, позволяющее решать проблемы как фундаментального, так и прикладного характера в области регуляции гомеостаза кожи и коррекции ее патологий.

Практическая значимость работы. Результаты работы могут быть использованы в образовательных курсах по клеточной биологии, цитологии, гистологии, эмбриологии, применены для разработки новых тканеинженерных конструкций с включением культивированных клеток и методов стимуляции регенерации и морфогенеза, в частности реконструкции кожных придатков. По результатам работы запатентован метод подготовки кожных трансплантатов, позволяющий значительно стимулировать их васкуляризацию и приживление. Разработаны способы модификации матрикса для повышения эффективности его эпителизации, что может быть использовано для разработки новых тканевых эквивалентов. В волосяном фолликуле обнаружена популяция

стволовых клеток, пригодных для использования в регенеративной медицине. Разработанная модель эпидермального морфогенеза может быть использована для моделирования патологических состояний волосяных фолликулов человека, а также тестирования лекарственных препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Реконструкция паттерна организации культуры кератиноцитов in vitro, сходного с тем, что наблюдается в эпидермисе in vivo, позволяет предположить, что самоорганизация клеток в эпидермисе является внутренне присущим кератиноцитам свойством и обеспечивает восстановление морфологической и динамической структуры популяции эпидермальных клеток при культивировании.

2. Коллективная миграция является универсальным клеточным механизмом, обеспечивающим эпителизацию. В многослойном эпидермальном пласте она осуществляется за счет одновременного активного движения нескольких рядов активированных клеток лидирующего края пласта.

3. В процессе культивирования происходит активация эпидермальных клеток, что позволяет им эффективно эпителизовать коллагеновый матрикс. Присутствие мезенхимных клеток модифицирует поведение кератиноцитов и реализует их морфогенетический потенциал.

4. Волосяной фолликул человека содержит несколько популяций стволовых клеток с широким спектром дифференцировок. В ходе длительного культивирования клеток дермальной папиллы волосяного фолликула человека изменяются уровни транскрипции генов ряда ключевых сигнальных путей.

5. В культуре эпидермальных кератиноцитов сохраняются стволовые/прогениторные клетки. Стволовые клетки способны переходить в состояние покоя и длительное время сохранять пролиферативный потенциал.

6. В культуральных условиях возможна реконструкция начальных этапов морфогенеза кожных придатков. В этом случае в клетках активируются соответствующие сигнальные пути.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и обсуждены на российских и международных конгрессах и конференциях, в частности: Республиканский научный симпозиум "Пролиферативные заболевания кожи", 1996, Москва; European Study Group for Cell Proliferation, Маклесфилд, Великобритания, 1999; 1-й съезд Общества клеточной биологии, Санкт-Петербург, 2003, European Study Group of Cell Proliferation, Прага, 2004; Международный симпозиум по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», 2004, Санкт-Петербург; 66th Annual Meeting of the Society for Investigative Dermatology, St. Louis, США; II

Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», 2005, Москва; Биология стволовых клеток. Фундаментальные аспекты, 2005, Москва; Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза, 2007, Москва; Российский Медицинский Форум, Симпозиум «Клеточные технологии в медицине», 2007, Москва; Всероссийская научная школа-конференция для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования», 2009, Москва; VI международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», 2009, Москва; Второй международный форум красоты и здоровья, 2009, Москва; Здравоохранение 2009, Москва; Stem Cell Meeting on Mesa. 2009. La Jolla, США; Первый Санкт-Петербургский конгресс по косметологии и эстетической медицине, 2010 год, Санкт-Петербург; III форум красоты и здоровья, 2010, Москва; 3rd Arnual Congress of Regenerative Medicine & Stem Cell-2010, Шанхай; Второй Санкт-Петербургский конгресс по косметологии и эстетической медицине «Невские берега», 2011, Санкт-Петербург; Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии, 2011, Москва, III конференция «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты», памяти Н.Г. Хрущова, 2011, Москва, Всероссийская научная школа-конференция для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования», 2011, Москва.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации. Все экспериментальные результаты получены лично автором, под его непосредственным руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 статей в отечественных журналах, соответствующих перечню ВАК, и 3 - в международных рецензируемых журналах, имеется 1 патент.

Структура и объем. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение. Обзор литературы. Материалы и методы. Результаты и их обсуждение. Заключение. Выводы. Список литературы. Работа содержит 305 страниц текста, документирована 71 рисунком и 4 таблицами. Список литературы содержит 475 источников.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение и культивирование клеток человека

Эпидермальные кератиноциты. Фрагменты кожи получали в ходе хирургических косметологических операций с информированного согласия пациентов. Кератиноциты получали ферментативной обработкой кожи по методу Рейнвальда и Грина (Rheinwald and Green, 1987). Суспензию кератиноцитов вносили в культуральные сосуды в смеси сред ДМЕМ.Р12 (1:1) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) с добавлением инсулина (5 мкг/мл, Sigma), изопротеренола (10"бМ, Sigma), эпидермального фактора роста (10 нг/мл, Sigma). Клетки инкубировали при +37°С в атмосфере воздуха, содержащем 3 % С02 и насыщающей влажности. Для получения колоний кератиноциты вносили в концентрации 150 тыс/мл в чашки Петри диаметром 30 мм, на дно которых помещали покровное стекло. На коллагеновый гель суспензию высаживали в концентрациях 300 тыс/мл и 1 млн/мл. В некоторых случаях для этих целей использовали кератиноциты 1-го пассажа.

Для выделения клеток интерфолликулярного эпидермиса волосяные фолликулы отделяли от эпидермиса под контролем бинокуляра с помощью микрохирургических ножниц. Затем эпидермис обрабатывали, как описано выше.

Линии клеток А-431 и НаСаТ. Клетки эпидермоидной карциномы человека А-431 и иммортализованные кератиноциты человека НаСаТ были получены из коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН). Клетки культивировали в среде Игла или ДМЕМ с 10% ЭТС.

Выделение клеток дермальной папиллы (ДП) волосяного фолликула. Выделенные пинцетом фолликулы инкубировали в 0,1%-ном растворе коллагеназы I типа в среде ДМЕМ, содержащей 10% ЭТС, в течение 7 ч при 37°С. ДП ресуспендировали в среде ДМЕМ с 10% ЭТС (Биолот), 4mML-глутамина (Sigma). Клетки ДП вибрисс крыс выделяли с помощью микрохирургических манипуляций под контролем бинокуляра и культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% ЭТС.

Электронно-микроскопическое исследование. Материал фиксировали в 2,5%-ном растворе глутаральдегида на 0,1 М какодилатном буфере (pH 7,2-7,4) с добавлением сахарозы, дофиксировали в 1%-ном растворе осмиевой кислоты на том же буфере, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заключали в смесь эпон-аралдит методом плоско-параллельной заливки. Ультратонкие срезы контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца, после чего исследовали в электронном микроскопе JEM-100CX:! 1.

Радиоавтографическое исследование. Клетки, предварительно проинкубированные с 3Н-тимидином (1 мкКи/мл; уд. акт. 48,6 Ки/моль), фиксировали в 70%-ном этаноле. Затем препараты промывали в 96%-ном этаноле и высушивали. После этого наносили фотоэмульсию типа М, расплавленную при 37°С, и экспонировали в течение 25 сут. Затем препараты проявляли в проявителе D-19 (5 мин), промывали в дистиллированной воде и фиксировали в 40%-ном растворе гипосульфита натрия в течение 7,5 мин. Полученные препараты окрашивали красителем Гимза или гематоксилином. Определение скорости миграции зпидермальпых клеток в рану. Клетки НаСаТ или А-431 вносили в чашки Петри в концентрации 150 тыс/мл (1,5 мл на чашку) в среде Игла с 10% ЭТС. Через 24 ч среду меняли на бессывороточную и инкубировали в течение 72 ч. После этого пластмассовым шпателем удаляли часть клеточного монослоя в центре чашки. Скорость миграции определяли, измеряя ширину раны в пяти точках с помощью окуляр-микрометра сразу же после нанесения раны и через 24,48 и 72 ч. Приготовление живого эквивалента кожи. Коллагеновый гель готовили на льду во избежание быстрого застывания. Эмбриональные фибробласты вносили в последнюю очередь из расчета 2,5*104 клеток/мл геля. Гель с клетками заливали в чашки Петри диаметром 30 мм, на дно которых была предварительно уложена лавсановая сеточка «Линтекс-Эслан», и помещали в С02-инкубатор при +37°С. Через 1 час коллагеновый гель полностью желатинизировался. Суспензию кератиноцитов высевали на поверхность коллагенового геля после его полного застывания в концентрации 3*105 клеток/мл, заливали полученный эквивалент средой для культивирования кератиноцитов (см. выше) и помещали в ССЬ-инкубатор при +37°С. Включение BrdU. В среду для культивирования вносили BrdU в концентрации ЮмМ. На пятый день инкубирования среду с меткой удаляли и заливали культуры средой без метки, среду меняли каждые три дня. В некоторых опытах BrdU в концентрации 2,5 мМ вносили в среду во время культивирования кератиноцитов в пластиковых культуральных флаконах на следующий день после посадки и далее в течение семи суток. На восьмой день приготовляли живой эквивалент кожи, который заливали средой без метки, среду меняли через день. Пласты кератиноцитов фиксировали на 18, 26 и 28 сутки разбавления.

Иммуногистохимические исследования

Иммунофлуоресценция. Культуры фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида (ПФА), затем после промывки фосфатным буфером (PBS) пермеабилизировали в 0,5%-ном растворе Triton Х-100. Затем промывали PBS и наносили блокирующий раствор или раствор нормальной сыворотки и

инкубировали с первыми антителами в течение 18 ч при 4°С. После промывки в PBS наносили вторые антитела, конъюгированные с флуорохромами (Alexa), и изучали препараты с помощью флуоресцентной и конфокальной микроскопии (Конфокальный микроскоп Leica TCS SP с программным обеспечением Leica LCS, флуоресцентный микроскоп Leica DM RXA2).

Иммунофлуоресцентное исследование поперечных срезов колоний кератиноцитов проводили на колониях, выращенных на коллагеновом геле. Культуры фиксировали, как описано выше и пропитывали 20%-ным раствором сахарозы в течение 12 ч. Затем замораживали в парах азота. Срезы толщиной 10 мкм делали на криостате. Далее срезы обрабатывали, как описано выше. Окраска с помощью диаминобензидина ЩАБ). Депарафинизированные срезы промывали в PBS и инкубировали в 3%-ом растворе Н2О2 в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем промывали в PBS и помещали в 0,5%-ный раствор Triton-XlOO (в PBS) на 20 мин при комнатной температуре. После повторной промывки в PBS инкубировали 20 мин в растворе нормальной сыворотки. Затем наносили первые антитела на 12 ч при +4° С. После промывки в PBS наносили вторые антитела на 30 мин при комнатной температуре. Отмывали в PBS 3 раза по 5 мин и окрашивали с помощью ДАБ (DAB, BD Pharmingen) до проявления окраски, реакцию останавливали перемещением в дистиллированную воду. При необходимости докрашивали гематоксилином. Гистохимическое окрашивание. Для окрашивания культуры клетки при достижении конфлуентного монослоя фиксировали 10%-ным раствором формалина в течение 10 мин при комнатной температуре; промывали проточной водой. Для окраски срезов кожи, срезы депарафинировали в ксилоле и регидратировали, поочередно инкубируя в спиртах понижающейся концентрации. Материал окрашивали 0,1%-ным раствором толуидинового синего (рН-2.0) в 30% этаноле в течение 20 мин; 1%-ным раствором альцианового синего (рН-2.84) в 3% уксусной кислоте в течение 30 мин; затем споласкивали дистиллированной водой. Обезвоживали препараты через спирты возрастающей концентрации и ксилол, заключали в канадский бальзам. Индукция и детекция остео- и адипогенной дифференцировок. Для индукции остеогенной дифференцировки клетки культивировали до достижения конфлуэнтного слоя. Затем среду меняли на среду следующего состава: среда ДМЕМ/Р-12, 10% ЭТС, 0.01 мкМ 1,25-дигидрокси витамин Дз (Sigma), 50 мкМ аскорбат-2-фосфат (Sigma), 10 MMß -глицерофосфат (Sigma). Клетки культивировали в течение 21 сут, среду меняли каждые 3 дня. Кальцификацию внеклеточного матрикса определяли с помощью окраски ализариновым красным. Для этого клетки промывали в PBS, затем фиксировали 4% ПФА 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки

промывали PBS и окрашивали 1%-ным раствором ализаринового красного (Sigma) в течение 2 мин, промывали дистиллированной водой, затем в подкисленном этаноле.

Для индукции адипогенной дифференцировки клетки культивировали в среде следующего состава: среда ДМЕМ/Р-12, 10% ЭТС, 0.5 мМ изобутил-метилксантин, 1 мкМ дексаметазон, 10 мкМ инсулин, 200 мкМ индометацин. Смену среды проводили каждые 3 дня. Для окраски клеток липофильным красителем Oil Red-0 (Sigma) их промывали в PBS, фиксировали в 4%-ном ПФА 30 мин при комнатной температуре, инкубировали 15 мин в 60%-ном изопропаноле и затем окрашивали в течение 15 мин профильтрованным раствором Oil Red-O. После этого клетки споласкивали в 60%-ном изопропаноле, тщательно промывали в дистиллированной воде и докрашивали гематоксилином.

Выявление активности щелочной фосфатазы. Клетки фиксировали в 70%-ном этаноле в течение 10 мин, промывали в PBS и инкубировали в растворе NBT/BCIP (Roche) в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте и промывали дистиллированной водой.

Статистическая обработка результатов. При обработке результатов оценивали значение средней величины и стандартное отклонение. Построение графиков проводили в программе Excel. Различие считали статистически достоверным, если уровень значимости был р<0,05, что является мерой достаточной надежности биологических результатов.

Выделение и очистка РНК. Суспензию клеток в растворе RNAlater разбавляли стерильным раствором PBS в 2 раза, клетки собирали центрифугированием в течение 10 мин при 13400 оборотов в минуту в центрифуге Eppendorf MiniSpin. Супернатант удаляли, а к осадку добавляли 350 мкл лизирующего раствора из набора для выделения РНК QIAGEN Rneasy Mini Kit. Суспензию гомогенизировали до получения полностью прозрачного лизата. Дальнейшее выделение осуществляли с использованием центрифугирования колонок. После всех промывок РНК с колонки элюировали двумя порциями (25 мкл) стерильной свободной от РНКаз воды, предварительно нагретой до 55°С. Концентрацию РНК в полученных образцах измеряли с помощью минифлюориметра Qubit (Invitrogen). Выход РНК составлял, в зависимости от исходного количества клеток, от 5 до 40 мкг. Качество полученных препаратов РНК контролировали с помощью Биоанализатора Agilent. Обратная транскрипция. Для синтеза кДНК использовали набор First Strand cDNA Synthesis Kit фирмы Fermentas с oligo(dT) 18-праймером. Качество полученных препаратов кДНК проверяли с помощью контрольных реакций амплификации кДНК глицеральдегвд-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) в

соответствии с рекомендациями фирмы-производителя набора. Из 1,3 мкг исходной РНК получали 20 мкл раствора кДНК и использовали ее как матрицу для ПЦР с детекцией в реальном времени - по 1 мкл на 25 мкл реакцию. ПЦР с детекцией в реальном времени. Праймеры синтезировали в компании Синтол (Москва). Качество праймеров контролировали с помощью классической ПЦР с электрофоретической детекецией конечного продукта.

Для проведения реакций ПЦР в реальном времени использовали набор Maxima SYBR Green Master Mix (2X) компании Fermentas и детектирующий амплификатор ДТ-322 компании «ДНК-Технология». Программа амплификации состояла из предварительной инкубации 10 мин при 95°С для активации ДНК-полимеразы Maxima Hot Start Tag DNA polymerase и 60 циклов [95°С-15 сек - 58°С-60 сек], после завершения которых прибор переходил в режим хранения образцов. Детекция флюоресценции в канале Fam и первичная обработка результатов осуществлялись программным обеспечением, поставляемым с прибором, в автоматическом режиме. В качестве внутреннего стандарта, относительно которого вычислялись концентрации всех остальных мРНК, служила мРНК GAPDH.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Формирование многослойного эпидермального пласта в культуре.

Адгезия критична для формирования тканей животных из индивидуальных клеток как первое событие морфогенеза. Изолированные кератиноциты, при культивировании образуют агрегаты. Мы изучили формирование этих агрегатов и их состав. В результате слипания образуются мелкие агрегаты, которые хорошо прикрепляются к субстрату и достаточно быстро распластываются. В составе прикрепившихся агрегатов распластывание кератиноцитов усиливается, причем можно выделить плотно упакованные, компактизованные клетки в центре агрегата и хорошо распластанные клетки на его периферии. Среди распластанных клеток обнаруживаются клетки, экспрессирующие белок КІ67 (Рис. 1а), ассоциированный с пролиферацией.

Рис. 1а. Первичная колония кератиноцитов человека. Стрелкой помечена Кл67+- клетка. Иммуногистохимия. Окраска диаминбензидином. Докрашено гематоксилином и эозином. Масштабный отрезок 50 мкм.

Рис. 16. Первичная колония кератиноцитов человека. Экспрессия рбЗ. Иммуногистохимия. Окраска

диаминобензидином. Масштабный отрезок 50 мкм.

Доля Кл67-положительных клеток в первые 8 часов культивирования не превышает 30%. В культуре обнаруживаются кератиноциты, экспрессирующие транскрипционный фактор рбЗ - мастер-ген эпидермальной дифференцировки и маркер столовых/прогениторных клеток (Рис. 16). На 2-3 сут культивирования число рбЗ-положительных клеток достигает 35+7% и располагаются они в агрегатах случайным образом. Эти кератиноциты обладают большим пролиферативным потенциалом и участвуют в формировании многослойного пласта. В первые дни присутствуют одиночные клетки, исчезающие в последующие сутки культивирования. Они либо погибают в результате апоптоза, либо входят в состав агрегатов. В течение первой недели еще не образуется конфлуентный слой клеток, и нет крупных

клеточных колоний, но всегда сохраняются небольшие агрегаты, обычно состоящие из нескольких плотно контактирующих клеток и рыхло расположенного окружения. В начальные сроки культивирования преобладают процессы пролиферации, поскольку происходит увеличение плотности клеточного пласта. После пассирования способность кератиноцитов к самоорганизации и формированию агрегатов сохраняется. При этом между агрегатами возникали контакты, образованные длинными ламеллоподиями.

Компактизация клеток и адгезия - важнейшие элементы морфогенеза. Агрегация кератиноцитов в условиях культуры отражает процесс формирования структурно-функциональных единиц (СФЕ) in vivo. Дезагрегированные эпидермальные кератиноциты сохраняют необходимую информацию для воссоздания путем самосборки трехмерных структур, которые после трансплантации в организм формируют СФЕ.

Реконструкция паттерна организации культуры кератиноцитов in vitro, сходного с тем, что наблюдается в эпидермисе, в отсутствие элементов окружения, существующих in vivo, позволяет предположить, что самоорганизация клеток в эпидермисе может быть внутренне присущим кератиноцитам свойством. Это обеспечивает восстановление морфологической и кинетической структуры популяции эпидермальных клеток при культивировании, и позволяет культивированному эпидермису встраиваться в структуры организма после трансплантации.

3.2. Клеточные механизмы коллективной миграции многоклеточных кластеров кератиноцитов.

К 7-14 суткам культивирования кератиноцитов достаточно крупные колонии, содержащие несколько тысяч клеток, начинают активно мигрировать. Ведущий край колоний составляют кератин 14- и рбЗ-позитивные клетки (Рис. 2а, б), т.е. кератиноциты с фенотипом клеток базального слоя с высоким пролиферативным потенциалом. Окраска колоний на актин показала, что в этих клетках плотность кольца филаментов, характерного для эпителиальных клеток, снижена, а в некоторых кератиноцитах оно практически отсутствует (Рис. 2в). В то же время, большинство клеток остаются соединенными с помощью плотных контактов (Рис. 2г). Таким образом, они представляют собой типичные лидирующие кератиноциты, находящиеся в состоянии псевдо эпителио-мезенхимного перехода.

• ' л

• ф 0

' 9 г

Я

50.0 рт)

Рис. 2а. Ведущий край колонии кератиноцитов. Иммунофлуоресценция. Красный цвет - актин, синий - DAPI, зеленый - рбЗ.

Рис. 26. Ведущий край колонии кератиноцитов. Иммунофлуоресценция. Синий - DAPI, зеленый - К14.

Рис. 2в. Клетки ведущего края колонии, окрашенные антителами против актина.

Иммунофлуоресценция.

Рис. 2г. Белок плотных контактов ZO-1 в мигрирующей колонии кератиноцитов.

Иммунофлуоресценция.

Механизм миграции пластов стратифицирующихся эпителиев неясен. На модели повреждения роговицы у мышей были получены некоторые экспериментальные свидетельства того, что клетки у края раны могут, чередуясь, переползать друг через друга - так называемая модель «чехарды» (Danjo Y. et al., 2002). В то же время, есть указания на то, что стратифицирующиеся эпителии мигрируют единым пластом, «скользя» по субстрату (Zhao М. et al., 2003.). Эти две модели рассматриваются как основные. Наше исследование мигрирующих колоний эпидермальных кератиноцитов человека с помощью конфокального микроскопа, цейтраферной съемки и электронной микроскопии показало, что клетки пласта, расположенные в первых 5-6 рядах от края колонии, образуют ламеллоподии, подползающие под впереди лежащую клетку и направленные в сторону

миграции пласта (Рис. За., б). В центре колонии в базальном слое располагаются малодифференцированные клетки с признаками стволовых/прогениторных (высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение, слабо развитые органеллы, малое число кератиновых филаментов), а в супрабазальном - высокодифференцированные кератиноциты, экспрессирующие кератин 10 - маркер дифференцированных клеток.

Рис. За. Тангенциальный срез колонии. Рис. 36. Тангенциальный оптический

Клетки нескольких рядов ведущего края, срез колонии. Окраска флуоресцентным образующие ламеллоподии. мембранным трейсером Dil. Конфокальная Трансмиссионная электронная микроскопия. Масштабный отрезок 30 мкм. микроскопия.

Таким образом, миграция эпидермального пласта in vitro осуществляется за счет кооперативной миграционной активности первых нескольких рядов клеток, которые остаются связанными между собой лабильными межклеточными контактами (Рис. 4). Описанный механизм коллективной миграции эпидермальных клеток обнаружен впервые и позднее подтвердился в работе зарубежных коллег, проведенной на линии клеток эпителия почки собаки MDCK (Farooqui R. et al., 2005).

Исследование пролиферативной активности в многоклеточных кластерах первичных эпидермальных кератиноцитов, а также иммортализованных и трансформированных клеток, показало, что различия в числе

пролиферирующих клеток в разных частях колонии мало влияют на выбор кластером клеток направления движения, однако, обработанные

митомицином С неделящиеся клетки никогда не оказываются в первом ряду ведущего края колонии. Для интенсивной миграции, вероятно, необходима

Рис. 4. Схема миграции многоклеточного эпидермального кластера.

активация клетки. Активация эпидермальных клеток, происходящая при культивировании, включает в себя усиление пролиферации. Культивированные кератиноциты, поэтому, можно сопоставить с клетками, мигрирующими в рану in vivo. Трансформированные эпителиоциты также характеризуются повышением подвижности и пролиферативной активности, причем интенсивность размножения коррелирует со способностью клетки к активной миграции.

3.3. Эффект факторов роста на миграцию. Базальный уровень миграции.

В ране ш vivo содержится широкий спектр цитокинов, включая факторы роста. Питательная среда для культивирования кератиноцитов также содержит факторы роста, которые оказывают влияние на все клеточные процессы, включая морфогенез, через управление, в частности, пролиферацией и миграцией клеток. На модели «раны», нанесенной на монослой культивируемых клеток, мы установили ряд интересных фактов о регуляции факторами роста пролиферации и миграции. Исследования проводили в культуре иммортализованных кератиноцитов человека НаСаТ.

Анализ миграции клеток в рану показал, что при выращивании культур в среде с 10% ЭТС максимальная скорость миграции наблюдается в первые 24 ч после нанесения раны, а через 72 ч рана первоначальной ширины 2,5 мм полностью закрывается. Радиоавтография раны показала, что пролиферация идет интенсивно во всех участках культуры, и преимущественной пролиферации на краю раны не наблюдается. В первые 24 ч в культуре наблюдается самый высокий уровень включения меченого тимидина. Это можно объяснить тем, что впоследствии общее повышение плотности культуры снижает темпы пролиферации. Сходные данные по темпам пролиферации были получены позднее на культуре клеток почки собаки MDCK. Пик пролиферации приходился на первые 12-24 часа после нанесения раны в зависимости от ее ширины (Farooqui R. et al., 2005). Эмбриональная телячья сыворотка, используемая при культивировании клеток, содержит большое количество митогенов, гормонов и компонентов внеклеточного матрикса. Все эти агенты влияют на миграцию клеток и маскируют действие изучаемых веществ. Поэтому клетки выращивали в среде с сывороткой до образования субконфлуентного монослоя, а затем среду меняли на бессывороточную и выращивали клетки до образования конфлуентного монослоя, после чего наносили рану. В этих условиях через 72 ч после нанесения раны остается незакрытой более половины ширины раны. При добавлении в среду культивирования эпидермального фактора роста (EGF) наблюдали значительную стимуляцию миграции (Рис. 5).

s О

3 0 24 48 72 ч

Рис. 5. Динамика миграции эпидермальных клеток в рану in vitro.

Как известно, EGF не только влияет на миграцию эпидермальных клеток, но и вызывает ряд других эффектов, в том числе стимулирует пролиферацию. Поэтому мы изучили действие EGF на миграцию клеток, в которых подавлена пролиферация. Для подавления пролиферации клетки обрабатывали митомицином С (20 мкг/мл). Через 72 ч включение меченого тимидина в таких культурах падало до 4+0,5% от контроля. На монослой наносили рану и изучали действие EGF на миграцию в таких культурах. После обработки митомицином С сохранялся базальный уровень миграции, но клетки теряли способность отвечать на добавление фактора роста (Рис. 6). Аналогичные результаты мы получили в ходе исследования действия фактора роста кератиноцитов на миграцию.

Рис. 6. Динамика миграции эпидермальных клеток в рану in vitro после их обработки митомицином С.

Следовательно, для реализации мотогенного эффекта факторов роста на эпидермальные клетки необходимо, чтобы они находились в пролиферирующем состоянии. В то же время, для базальной миграции наличие пролиферативной активности необязательно. Сходные данные по миграции клеток после их обработки митомицином С позднее наблюдали в культуре MDCK, когда в течение 10 часов динамика миграции в рану не отличалась от контрольной (Poujade et al., 2007). В организме базальная миграция ответственна за немедленную миграцию эпителиальных клеток в ответ на повреждение. Независимость от пролиферативного потенциала клеточной популяции и статуса отдельных клеток делает возможным возникновение реакции эпителия на свободный край в кратчайшие сроки. Это обеспечивает скорейшее восстановление барьерной функции. В дальнейшем на ведущем крае мигрирующего кластера эпителиальных клеток оказываются активированные пролиферирующие клетки, что обеспечивает «заселение» лишенного эпителия участка клетками с высокими регенеративными возможностями. 3.4. Структурно-функциональная организация эпителия in vitro. 3.4.1. Длительно сохраняющие метку клетки в эпидермальном пласте.

После формирования в культуре многослойного эпидермального пласта устанавливается баланс между пролиферацией и гибелью клеток, частично воспроизводящий ситуацию in vivo. В условиях достаточного снабжения базальных клеток питательными веществами эпидермис можно культивировать месяцами. Критичным в такой ситуации становится вопрос о сохранении стволовых/прогениторных клеток, способных обеспечить самоподдержание пласта. Наличие их также необходимо для успешного приживления эпидермиса после трансплантации пациентам. Поэтому перед нами стояла задача идентификации стволовых/прогениторных клеток в эпидермисе человека in vitro. Одной из главных характеристик стволовых клеток считается длительное сохранение метки.

Мы разработали метод по определению локализации длительно сохраняющих метку клеток с использованием живого эквивалента кожи (ЖЭК), в качестве аналога дермы содержащего коллагеновый гель с дермальными фибробластами. Кератиноциты вносили после предварительного культивирования на пластике для оптимального роста на поверхности геля. Многослойные эпидермальные пласты формировались на поверхности геля через 7-10 суток после посадки. Модель ЖЭК позволяла проводить культивирование кератиноцитов до 30 суток. После 8-10 суток, в течение которых происходило разбавление метки, количество меченых ядер по отношению к общему числу ядер составило 30+6%. Через 26 суток в нескольких полях зрения определялось по одной меченой клетке. Через 28

суток в препарате (размером примерно 4x5 мм) обнаружено 5 меченых клеток с мелкими ядрами в базальном слое.

Таким образом, мы показали, что в условиях культивирования можно получить кератиноциты, которые длительно сохраняют метку, то есть с точки зрения динамики клеточной популяции могут рассматриваться как стволовые покоящиеся клетки. Использованный подход может послужить полезным инструментом для исследований в области стволовых эпидермальных клеток, с которыми часто отождествляют длительно сохраняющие метку клетки. Он позволяет сопоставлять функциональный признак стволовых клеток (длительное сохранение метки) с экспрессией маркеров стволовых эпидермальных кератиноцитов.

3.4.2. Маркеры стволовых и прогениторных эпидермальных клеток в культуре.

Первичная культура включает клетки различной степени дифференциации. При ферментативной обработке попадают туда и стволовые клетки. Идентификация стволовых/прогениторных эпидермальных клеток по экспрессии специфичных маркеров в условиях культуры является нетривиальной задачей. Список маркеров, которые могут предположительно указывать на принадлежность к компартменту стволовых эпидермальных клеток, весьма обширен.

Среди маркеров стволовых эпидермальных клеток указываются кератины 15 и 19. В первичной культуре обнаруживаются кератиноциты, позитивные по кератину 15 и кератину 19. Мы подробно изучили характер и динамику экспрессии кератина 19.

В коже взрослого человека кератин 19 (К19) обнаруживается только в волосяном фолликуле. Наши исследования многочисленного биопсийного материала кожи и индивидуальных фолликулов показали, что К19+-клетки в фолликуле на стадии анагена обнаруживаются в наружном корневом влагалище в области бугорка, матрикса или в нижней трети фолликула. Исследование первичной культуры на ранних сроках культивирования выявило единичные К19+-клетки (менее 1% от общего числа клеток). При культивировании в течение 6 дней доля К19+-клеток в культуре возрастала до 20%. Двойное иммуногистохимическое окрашивание на кератин 19 и К1-67 показало, что после суток культивирования К19+-клетки не окрашивались антителами против Кл-67, т.е. находились в пролиферативном покое, в то время как К19"-клетки уже пролиферировали. Однако на 6-е сутки культивирования 15% К19+-кератиноцитов одновременно были позитивны по антигену Кл-67, что в среднем соответствовало доле пролиферирующих клеток среди К 19~-клеток. Это означает, что пролиферативная активность К19+-клеток в культуре

возрастает, что могло приводить к увеличению их доли в популяции кератиноцитов. Для уточнения пролиферативной активности К19+-клеток кератиноциты базального слоя диссоциировали с помощью ферментативной обработки и в момент пассирования добавляли BrdU. Количество К19+-кератиноцитов в начале опыта составляло 20+8% и возрастало до 30% через 21 ч культивирования. В то же время, доля К19+-клеток, включивших метку BrdU, не возрастала. Таким образом, наблюдающееся в культуре увеличение К19+-клеток без интенсификации их пролиферации свидетельствовало об индукции экспрессии К19. Чтобы прояснить этот вопрос, мы исследовали динамику изменения количества К19+-клеток после ингибирования пролиферации митомицином С. Обработку клеток митомицином С производили через сутки после инициации культуры. В первичной культуре на момент обработки митомицином С содержание К19+-клеток составляло около 1%. На 6 сутки содержание К19+-клеток возрастало до 25%. Однако полученные данные не исключали возможности увеличения доли К19+-клеток за счет преимущественной гибели К19"-клеток. Известно, что простые цитокератины, в частности, кератин 8 и 18, защищают клетки от апоптоза, индуцированного фактором некроза опухолей альфа (TNF-a) (Oshima RG. 2002). Мы проверили, защищены ли К19+-клетки от TNFa-индуцированного апоптоза лучше, чем К19" -клетки. Культуру кератиноцитов обрабатывали TNF-a в присутствии циклогексимида и выявляли апоптотические клетки методом TUNEL совместно с окрашиванием на К19 (Рис. 7). Проверяли также уровень апоптоза в культурах, не обработанных TNFa. Анализ препаратов показал, что процент апоптотических клеток был одинаков в популяциях К19+ и К19 -кератиноцитов. Таким образом, интенсивность гибели путем апоптоза не может быть причиной возрастания доли К19 клеток в культуре первичных кератиноцитов.

Полученные данные свидетельствуют об индукции экспрессии К19 в культуре. Учитывая характер экспрессии К19 in vivo, а также данные литературы, мы считаем, что К19 может служить маркером активированного эпидермиса, а также регенеративного потенциала и способности к самообновлению кератиноцитов. Экспрессия К19 может не только указывать на принадлежность клетки к субпопуляции стволовых или прогениторных, но также свидетельствовать об ее реакции на нарушение эпидермального гомеостаза и изменение

Рис. 7. Апоптоз в первичных кератиноцитах человека.

Красный - К19, зеленый - ядра, подвергшиеся апоптозу, синий -ПАРТ

программы дифференцировки в результате смены микроокружения.

3.5. Морфогенез эпидермиса в ходе эпителио-мезенхимных взаимодействий.

3.5.1. Эпителизация коллагенового матрикса.

Задачей данного раздела работы было создать систему, позволяющую моделировать эпидермальный морфогенез в культуре клеток человека. В качестве матрикса для культивирования мы использовали коллагеновый гель, что позволяет изучать взаимодействие клеток с матриксом, регуляцию пролиферации и дифференциации клеток, а также создает возможность выявить факторы, способствующие росту и миграции эпидермальных кератиноцитов.

При внесении суспензии первичных кератиноцитов на коллагеновый гель в концентрации 300 тыс. клеток/мл, характер роста клеток отличен от роста первичных кератиноцитов, высаженных в такой же концентрации на пластик. Суспендированные клетки сравнительно слабо распластывались на геле и не образовывали мигрирующих колоний, а превращались в сфероиды дифференцированных клеток. Анализ радиоавтографов показал, что индекс меченных 3Н-тимидином клеток на вторые сутки культивирования на пластике был существенно выше, чем на геле (Рис. 8). К пятым суткам культивирования

количество клеток,

синтезирующих ДНК на пластике возрастало до 32%, в то время как на коллагеновом геле процент меченых клеток оставался низким (3.2%). Мы также модифицировали поверхность коллагенового геля, нанося на него дополнительные компоненты внеклеточного матрикса. Предварительная обработка поверхности коллагенового геля полилизином перед посадкой на него суспензии кератиноцитов в концентрации 300 тыс/мл увеличивает рост клеток на 86% по сравнению с контролем. Модификация поверхности коллагенового геля фибронектин-подобным белком также вызывала увеличение количества клеток, приходящихся на единицу площади, но лишь на 26%. Для сравнения на этой же диаграмме показан рост кератиноцитов на пластиковой поверхности. Видно, что рост кератиноцитов на пластике идет

Рис. 8. Включение 3Н-тимидина клетками культур первичных и пассированных кератиноцитов.

значительно лучше, чем на коллагеновом геле. Обработка пластиковой поверхности синтетическим аналогом фибронектина незначительно увеличивала рост клеток, а сорбированный на пластик полилизин отрицательно влиял на рост кератиноцитов, уменьшая его на 30%. Внесение в коллагеновый гель эмбриональных фибробластов значительно улучшало рост кератиноцитов. Анализ радиоавтографов показал, что включенные в коллагеновый гель фибробласты стимулируют рост культуры первичных кератиноцитов на коллагеновом геле. Так, на вторые сутки культивирования индекс меченых 3Н-тимидином клеток в среднем составлял 1.07%, а к пятым суткам количество клеток, синтезирующих ДНК, возрастало до 25.5%. Рост высаженных на коллагеновый гель в концентрации 300 тыс. клеток/мл пассированных кератиноцитов значительно отличается от роста на геле первичных кератиноцитов. Вторичные кератиноциты одинаково хорошо распластывались как на коллагеновом геле, так и на пластиковой поверхности. Анализ радиоавтографов культуры кератиноцитов 1-го пассажа показал, что уже на вторые сутки культивирования индекс меченных 3Н-тимидином клеток выше, чем в культуре первичных кератиноцитов и одинаков для культур на пластике и геле (Рис. 8).

Для оценки функциональных свойств клеток используется способность кератиноцитов контрактировать коллагеновый гель. Кератиноциты 1-го пассажа быстрее и значительно эффективнее контрастируют коллагеновый гель

(Рис. 9).

Полученные данные позволяют

заключить, что кератиноциты

первого пассажа отличаются

по пролиферативным и

функциональным параметрам

от первичных кератиноцитов.

Пассированные кератиноциты

обладают повышенной

пролиферативной активностью

„ _ и уже на третьи сутки после

Рис. 9. Динамика контракции коллагенового геля

кератиноцитами.человека посадки формируют пласт,

состоящий из нескольких слоев клеток. Это подтверждает предположение об активации кератиноцитов в культуре .

3.5.2. Миграция эпидермальных клеток по коллагеновому гелю.

Поскольку для формирования трехмерных эпителиальных структур необходим этап клеточной миграции, на основании полученных результатов мы создали

сутки культивирования

оригинальную модельную систему для изучения миграции эпидермальных клеток по коллагеновому гелю. После внесения вторичных кератиноцитов в лунки колец, помещенных на коллагеновый гель, клетки хорошо распластываются и формируют пласт, имеющий вид ровного круга. Спустя 2448 ч кератиноциты начинали мигрировать за пределы круга. На 3-4 сутки после посадки происходила поляризация округлых колоний с образованием мигрирующих кластеров. В процессе поляризации пласты компактизовались и, таким образом, площади образующихся колоний были меньше исходной площади круга приблизительно в 6 раз. Колонии приобретали асимметричную форму с выгнутым (ведущим) и вогнутым (ведомым) краями. Морфология колоний была аналогична таковой колоний первичных кератиноцитов на пластике. Гистологическое исследование колоний на коллагеновом геле показало, что кератиноциты базального слоя контактируют с субстратом частью своей поверхности. Прикрепившаяся к субстрату клетка, как правило, образует длинный тонкий отросток (ламеллоподию), направленный в сторону движения колонии, и короткий - в противоположную. Основная часть этой клетки, включая ядро, располагается во втором слое пласта, контактируя своей базальной поверхностью с таким же отростком следующей за ней клетки. Таким образом, морфология клеток кластера аналогична таковой в описанных выше колониях, мигрирующих по пластику. Это позволяет утверждать, что коллективная миграция кластеров кератиноцитов является универсальным механизмом эпителизации.

Внесение в состав коллагенового геля эмбриональных фибробластов коренным образом изменяло поведение кератиноцитов 1-го пассажа, высеянных в лунки на коллагеновый гель. На 2-3 сутки после посадки кератиноциты начинали выползать за границы образующегося круга, при этом характер их миграции отличался от отмеченного в контрольных экспериментах. Краевые клетки начинают формировать большое число мигрирующих фронтов. К 4 суткам культивирования кератиноциты на коллагеновом геле, содержащем фибробласты, формируют звездчатые фигуры с различными направлениями миграции. В некоторых случаях один из фронтов становится ведущим и имеет очень большую протяженность.

Таким образом, результаты проведенных экспериментов на этом этапе работы позволили сделать предварительные выводы относительно возможности моделирования морфогенетических процессов в культуре эпидермальных кератиноцитов человека. Стало очевидным, что для этих целей необходимо использовать пассированные клетки, способные более эффективно взаимодействовать с трехмерным внеклеточным матриксом, мигрировать и пролиферировать на нем. Была разработана новая модель для изучения

миграции эпидермальных клеток, которая впоследствии с небольшими модификациями была применена для моделирования начальных этапов фолликулогенеза. Результаты также свидетельствовали о стимуляции миграции кластеров вторичных кератиноцитов на коллагеновом геле при внесении в его состав эмбриональных фибробластов. В дальнейшем, результаты экспериментов по влиянию мезенхимных клеток на поведение кератиноцитов на коллагеновом геле были использованы нами для разработки модели эпидермального морфогенеза.

3.5.3. Дермальная папилла - резервуар специализированных мезенхимных клеток, индуцирующих эпидермальный морфогенез.

Результаты, полученные на предыдущих этапах работы, ясно демонстрируют, что мезенхимные клетки оказывают существенное влияние на особенности морфогенетических процессов в культуре эпидермальных клеток. Их использование позволяет моделировать эпидермальный морфогенез. Для того чтобы создать адекватную модель начальных этапов формирования придатков кожи, необходимо было использовать мезенхимные клетки, являющиеся естественными индукторами этих процессов in vivo. Такими клетками являются клетки дермальной папиллы (ДП) волосяного фолликула.

Была проведена характеристика клеток ДП человека. Выделенные нами клетки ДП в культуре пролиферировали, организовывали группы и даже при достижении монослоя формировали многослойные агрегаты (так называемые псевдопапиллы). Выявлен также ряд функциональных особенностей клеток ДП. Мы впервые сравнили клетки ДП волосяного фолликула человека и фолликула вибриссы крысы по способности к контракции и лизису коллагенового геля. Клетки ДП вибрисс сжимали гель сильнее, чем клетки ДП волосяного фолликула человека (60 и 40% от контроля, соответственно), а добавление кератиноцитов в обоих случаях способствовало усилению контракции коллагенового геля (75 и 56%, соответственно). Через неделю клетки ДП крысы, культивируемые вместе с кератиноцитами, дезагрегировали и лизировали гель. Через 3 недели клетки ДП крысы лизировали коллагеновый гель и без помощи кератиноцитов, однако, при помещении в коллагеновый гель клеток ДП волосяного фолликула человека лизиса геля не наблюдали даже при кокультивировании с кератиноцитами.

В литературе имеются указания на то, что волосяной фолликул является источником мезенхимных стволовых клеток (МСК), которые участвуют в восстановлении дермы при ее повреждении (Jahoda & Reynolds, 2001). Мы исследовали экспрессию поверхностных маркеров клеток ДП, клеток стромы жировой ткани и постнатальных фибробластов дермы. Маркеры CD49d, CD 105 и STRO-1 являются характерными для клеток стромы жировой ткани. CD 105 и

8Т1Ю-1 являются поверхностными маркерами мезенхимных стволовых клеток из костного мозга. Анализ экспрессии данных маркеров показал, что клетки ДП экспрессируют С049(1 на том же уровне, что и клетки стромы жировой ткани, однако уровень экспрессии СО 105 и 8ТЯО-1 - ниже. Фибробласты дермы имеют низкий уровень экспрессии СГ)49с1, единичные клетки в популяции экспрессируют 8Т1Ю-1 и не экспрессируют СШ 05. Таким образом, клетки ДП и клетки стромы жировой ткани обладают схожим фенотипом.

Мы исследовали потенции клеток ДП человека дифференцироваться в клетки костной и жировой ткани, а также в нейральном направлении при культивировании в индукционных средах. Отложение липидных капель в цитоплазме и экспрессию лептина (маркер зрелых адипоцитов) наблюдали только в 20-30% клеток ДП (Рис. 10а). Адипогенная дифференцировка клеток ДП была менее выражена по сравнению с клетками стромы жировой ткани. Спонтанную дифференцировку клеток ДП не наблюдали. Для определения способности клеток ДП дифференцироваться в клетки костной ткани при культивировании в индукционной среде исследовали уровень экспрессии молекулярных маркеров остеогенеза, в частности, остеопонтина (Рис. 106). На 21 сутки в клетках ДП обнаруживали экспрессию этих маркеров на уровне, сопоставимом с клетками стромы жировой ткани. Постнатальные фибробласты не обладали такими свойствами. В контрольной среде небольшое количество клеток ДП спонтанно дифференцировались в клетки костной ткани. Остеогенная дифференцировка подтверждалась окраской клеток ализариновым красным. В индукционной среде наблюдали дифференцировку ДП в нейральном направлении (Рис. 10в).

- ¿Г

- -

Рис, 10. Дифференцировка клеток дермальной папиллы. а. Адипогенная дифференцировка. Окраска на нейтральные жиры красителем Oil Red О. Масштабный отрезок 50 мкм. б. Остеогенная дифференцировка. Иммуногистохимическое окрашивание на остеопонтин. в. Нейральная дифференцировка. Иммуногистохимическое окрашивание на маркер нейронов (белок ассоциированный с микротрубочками 2, МАР-2). Масштабный отрезок 100 мкм.

В экспериментах по трансплантации клеток ДП в кожу человека была обнаружена способность этих клеток стимулировать ангиогенез (Рис. 11).

— \

И

В —

Рис. 11. Стимуляция ангиогенеза клетками дермальной папиллы человека. Схема эксперимента.

При культивировании клетки ДП теряют способность индуцировать фолликулогенез. В связи с этим данные клетки являются очень удобной моделью для исследования изменений в транскрипции генов, а также поисков сигнальных систем и групп генов, ответственных за уникальную способность клеток ДП индуцировать эпидермальный морфогенез. Совместно с В.В. Ашапкиным (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ), была проанализирована транскрипция (концентрации мРНК) генов, составляющих «сердцевину» транскрипционного статуса клеток ДП. Целью этого исследования было выяснить, как изменяется уровень транскрипции каждого из этих генов при культивировании клеток ДП и при их индуцированной дифференцировке в остеобласты.

При культивировании клеток ДП в стандартных условиях в 3-6 раз возрастает уровень транскрипции генов ВМР6, FGFR1 и NDP, в 1,4-2 раза -генов FGFR2, ALX4, NOG, SOX, HHIP, HEY1, WIF1, LTBP1 и PRSS12. Уровень транскрипции генов ALPL, FGF10 и TWIST1, наоборот, заметно (в 2-5 раз) уменьшается (Таблица 1). Уровень транскрипции остальных генов варьирует в небольших пределах. Все перечисленные гены кодируют белки, так или иначе, связанные с передачей сигналов и регуляцией базовых клеточных процессов. При индуцированной дифференцировке клеток ДП в остеобласты в 2-3 раза возрастает уровень транскрипции трех генов, FGFR2, TWIST1 и CRABP1, и в 1,3-1,5 раза - генов SOSTDC1, GDF10 и CRABP2. Уровень транскрипции генов

ALPL, BMP4, FGF7, FGFR1, ALX4, SOX, HEY], WIF1 и NDP уменьшается в 1,52 раза.

Таблица 1. Уровни транскрипции генов в клетках ДП первого (ДПО) и седьмого (ДП7) пассажей

Ген ДПО ДП7 Примечание

ВМР6 1.4x10 s 0.9x10"4 Поддерживает статус клеток ДП

NOG 5x102 ю-' Ингибитор сигнального пути BMP

SOX2 4.5х10"2 ю-' Маркирует клетки ДП в развитии

НН1Р 6.6x10"3 ш-2 Антагонист Hh сигналинга

НЕУ1 6.9x10"4 l.lxlO"3 Индуцируется в ДП, ген-мишень сигнального пути Notch

TWIST1 0.8x10"3 4.5ХІ0*4 Twist homolog 1 (Drosophila), участвует в остеогенной дифференцировке в зубах

FGF10 0.5 1.3x10"' Негативно регулирует путь wnt, экспрессия возрастает в волосяном фолликуле в фазе анаген.

FGFR1 1.2x10"3 6.9x10"3 Уровень FGF1R возрастает в фазе позднего анагена и катагене.

WIF1 0.9x10^ 1.4x10"4 Ингибитор пути wnt.

NDP 5x10"4 1.5х10"3 Norrie disease (pseudoglioma), активирует путь wnt через ингибирование ftizzled-4

В последующем было проведено более обширное исследование уровней транскрипции генов в этих клетках в масштабах целого транскриптома на геномном анализаторе компании Иллюмина. Общее число активно транскрибируемых генов, транскрипция которых при культивировании клеток заметно повышается, весьма значительно, поэтому для дальнейшего рассмотрения мы выбрали только те из них, транскрипция которых увеличивается в 3 или более раз. Таких генов оказалось около 70. Большинство генов, транскрипция которых при культивировании клеток ДП заметно повышается, кодируют белки цитоскелета и межклеточного матрикса, участвующие в процессах клеточной адгезии, межклеточных контактах, регуляции пролиферации, дифференцировки, апоптозе, миграции клеток, явлениях эндо- и экзоцитоза и т.п. Почти столь же обширна группа генов,

кодирующих белки, участвующие в работе различных сигнальных систем. Несколько меньше в этой категории генов, кодирующих белки-регуляторы экспрессии других генов и клеточного цикла. Интересно, что аналогичные категории преобладают и среди генов, транскрипция которых при культивировании уменьшается, хотя общее их число примерно в два раза меньше.

Полученные результаты показывают, что при культивировании стволовых клеток в неиндуцирующих условиях происходят спонтанные эпигенетические процессы, заметно изменяющие их внутренние свойства. Культура клеток ДП дает уникальную возможность сопоставления этих процессов и изменения функциональной активности клеток. 3.5.4. Разработка модели эпидермального морфогенеза. 3.5.4.1. Клетки дермальной папиллы индуцируют эпидермальный морфогенез in vitro.

На основании разработанной модели исследования миграции эпидермальных кератиноцитов по трехмерному коллагеновому гелю был разработан метод изучения эпидермального морфогенеза в культуре (Рис. 12).

Клетки ДП помещали в коллагеновый гель, а сверху на коллагеновый гель высевали пассированные кератиноциты. В качестве контроля использовали коллагеновый гель, содержащий фибробласты человека.

Через 10 дней в присутствии клеток ДП кератиноциты мигрировали в коллагеновый гель и формировали тубулярные выросты (ТВ). При этом происходила контракция верхнего слоя коллагенового геля кератиноцитами, что облегчало наблюдение за клетками. Постнатальные фибробласты не вызывали миграции кератиноцитов внутрь геля и формирования ТВ. Использование в эксперименте среды, кондиционированной клетками ДП, показало, что индукция тубулогенеза происходит в среде кондиционированной клетками ДП. Поэтому в дальнейшем в качестве индуктивного сигнала использовали кондиционированную среду. Такая система дала возможность оценивать и анализировать получаемые выросты, поскольку ТВ формировались в горизонтальном направлении, а использование кондиционированной среды позволило избежать сильной контракции геля, вызываемой клетками ДП. При помещении кератиноцитов в колагеновый гель и культивировании их в среде, кондиционированной клетками ДП, мы наблюдали формирование ТВ различной формы. ТВ начинают формироваться через 4-5 дней после посадки, и к 10-14 суткам достигают в среднем 1-2 мм.

ра

Первый слой геля

Пластиковое

4 С

кольцо

' -'к-:

і , Второй слой

геля

Внесение суспензии кератиноцитов

Кератиноциты в геле после удаления кольца

Добавление среды

Рис. 12. Модель изучения эпидермального морфогенеза в культуре

Электронно-микроскопическое исследование показало, что ТВ состоят из клеток различной степени дифференцировки. На срезе одного уровня можно найти молодые клетки, зрелые, содержащие кератогиалиновые зёрна в цитоплазме, и отмирающие, с разрушающимися ядром и клеточными мембранами. При этом наблюдалась закономерность распределения клеток, имеющих разную степень дифференцировки. Ближе к центру располагались молодые кератиноциты, а зрелые и отмирающие - на периферии. При панорамной реконструкции одного из срезов было отмечено спиральное расположение клеток. По крупным межклеточным пространствам и наличию многочисленных выростов и ворсинок можно судить о том, что клетки находятся в движении.

Рис. 13. Поперечные срезы средней части ТВ. Иммуногистохимия. Окраска диамивобензимидом. Докрашено гематоксилином, а - кератин 14, б-кератин 10, в -кератин 19.

Изучение экспрессии кератина 10 (К10) показало, в растущем крае доля К10+-клеток мала, а в средней части выростов дифференцированные кератиноциты распределяются по периферии (Рис. 13). При изучении экспрессии К19 какой-либо закономерности в распределении К19+-клеток обнаружено не было. Экспрессия кератина 14 была выявлена в клетках ведущего края эпидермального выроста.

Фолликулогенез de novo во взрослом эпидермисе может происходить по-разному (Inamatsu et al., 2006). При рекомбинации взрослого эпидермиса с эмбриональными дермальными конденсатами и последующей трансплантацией бестимусным мышам фолликулы формируются с прохождением стадии плакоды, т.е. с полной рекапитуляцией эмбрионального фолликулогенеза. Рекомбинация эпидермиса с ДП из взрослой кожи также приводит к формированию фолликулов, но образования плакод не наблюдается. В этом случае фолликулы образуются за счет активной пролиферации и миграции эпидермальных клеток в дерму, т.е. фолликул сразу оказывается на стадии анагена. Мы полагаем, что именно такие события имитирует наша модель. Несомненно, она является удобным инструментом для изучения сигнальных путей, вовлеченных в фолликулогенез и факторов, которые могут на него влиять.

3.5.4.2. Роль факторов роста и некоторых сигнальных путей в морфогенезе кератиноцитов человека in vitro

В контрольной среде, не содержащей факторов роста, ТВ не образовывались. При добавлении в среду EGF и фактора роста кератиноцитов (KGF) был отмечен активный рост ТВ. Их форма и размеры были схожи со структурами, образующимися при культивировании в среде, кондиционированной клетками ДП. При этом формирование ТВ в этих двух вариантах опытов началось позже (на 5-6 сут) и продолжалось дольше, чем в опытах с кондиционированной клетками ДП средой и фактором роста гепатоцитов (HGF) (новые выросты образовывались и на 10-14 сут).

Как известно, эти факторы стимулируют митотическую активность и миграцию эпидермальных клеток. EGF in vivo продуцируется фибробластами кожи. Он стимулирует пролиферацию культуры кератиноцитов и усиливает миграцию краевых клеток в колониях (Barrandon, Green, 1987). Ранее мы продемонстрировали в модели заживления раны в культуре, что EGF значительно сокращает время эпителизации. KGF синтезируется фибробластами дермы и, попадая в эпидермис, активирует ряд генов, которые прямо или косвенно влияют на пролиферацию, дифференцировку и миграцию кератиноцитов. Синтез KGF значительно усиливается в процессе эпителизации ран (Márchese et al., 1995). Стимуляция пролиферации и миграции кератиноцитов под действием EGF и KGF, вероятно, вносит существенный вклад в инициацию тубулярных структур в использованной нами модели.

Инсулиноподобный фактор роста и основной фактор роста фибробластов индуцировали незначительное число ТВ. При добавлении HGF в среду культивирования наблюдали самые протяженные и ветвящиеся ТВ. Известно, что HGF индуцирует инвазию кератиноцитов в дерму и участвует в

морфогенезе и регуляции роста волосяного фолликула в органотипической культуре клеток мыши (Lindner et al., 2000), однако индукция морфогенеза в культуре кератиноцитов человека HGF была показана впервые.

Следует, однако, отметить, что не все из изученных факторов постоянно присутствуют в микроокружении волосяного фолликула in vivo (Botckkarev and Paus, 2003). Кроме того, как было отмечено выше, существует большое количество других регуляторов морфогенеза. Изменение спектра факторов, а также инициация их синтеза в клетках мезенхимного компартмента являются компонентами регуляторного механизма, обеспечивающего формирование волосяного фолликула из эмбрионального эпидермиса в онтогенезе, а также смену фаз роста и дегенерации волосяного фолликула на протяжении жизни организма.

Мы предприняли попытку определить активацию некоторых сигнальных путей при воздействии факторов клеток дермальной папиллы на эпидермальные клетки. Для этого кератиноциты культивировали в среде, кондиционированной клетками ДП и в контрольной среде. Методом ПЦР в реальном времени определяли экспрессию кератина 17, LEF1, Shh и WntlOb. Результаты исследований показали, что под действием кондиционированной клетками ДП среды повышается экспрессия генов Shh и WntlOb, однако абсолютные значения невелики. Экспрессия LEF1 и К19 изменялась разнонаправлено. Несомненно, дальнейшие исследования на основе созданной модели позволят получить ценные данные о регуляции индукции фолликулогенеза у человека. Открываются перспективы по поиску агентов, эффективно регулирующих этот процесс.

Заключение

Разработка методов культивирования клеток способствовала значительному прогрессу в клеточной биологии. При культивировании часть характеристик клетки сильно изменяется. Однако по мере развития техники культивирования, клетка in vitro стала отдельным биологическим объектом и все шире применяется в медицине и биотехнологии. Задача стоит в управлении свойствами культивируемых клеток: обнаружении закономерностей поведения клеток в культуре, поиске тех элементов, которые аналогичны их поведению в организме и определении факторов, которые могут модулировать поведение клеток. Особенно актуально это в отношении клеток человека. Представленная работа демонстрирует, что в культуре клеток кожи человека возможна реконструкция ключевых моментов начальных этапов морфогенеза -компактизация клеток, миграция, дифференцировка и формирование многоклеточных трехмерных структур в матриксе. Во многом, эти события

отражают внутренние, присущие кератиноцитам свойства, а для реализации некоторых из них необходимо присутствие компетентных мезенхимных клеток.

Кожа - легкодоступный источник двух основных типов клеток (эпителиальных и мезенхимных). Мы показали, что эпидермальные стволовые клетки в культуре сохраняются. На основании проведенных нами исследований можно также с уверенностью заключить, что волосяной фолликул кожи человека является источником специализированных мультипотентных стволовых клеток. Мы продемонстрировали, что клетки ДП волосяного фолликула могут быть эффективно выделены, культивированы и использованы для моделирования эпидермального морфогенеза у человека, изучения эпигенетических изменений, происходящих в клетках, в том числе стволовых, в процессе культивирования, а также, вероятно, в прикладных исследованиях, направленных на реконструкцию волосяного фолликула и/или стимуляцию собственных фолликулов, разработку новых способов лечения алопеции, тестирование лекарственных препаратов.

Кожа - первый после костного мозга орган, подвергшийся тканеинженерной (клеточной) реконструкции. Представленная работа обосновывает возможность реконструкции в культуре не только эпидермального пласта, но и сложно устроенной структурно-функциональной единицы кожи человека, включающей волосяные фолликулы и другие придатки кожи. Проведенные исследования позволяют воспользоваться свойствами клеток кожи и особенностями их поведения в культуре для моделирования фундаментальных процессов морфогенеза и тканевого гомеостаза, а также для создания новых технологий регенерационной медицины.

ВЫВОДЫ

1. Кератиноциты in vitro сохраняют способность к образованию гистотипических структур, сходных с межфолликулярным эпидермисом. Они обладают пролиферативной активностью и формируют кластеры, аналогичные структурно-функциональным единицам эпидермиса in vivo.

2. Для коллективной миграции кластеров эпидермальных клеток на плоском субстрате in vitro характерна зависимость от пролиферации отдельных клеток: на ведущем крае мигрирующего кластера находятся клетки, обладающие высокой пролиферативной активностью; миграция эпидермального пласта in vitro осуществляется за счет кооперативной миграционной активности первых нескольких рядов клеток. Существует базальный уровень миграции, не

зависимый от подавления пролиферации и действия факторов роста и обеспечивающий быстрый ответ клеток эпидермиса на появление свободного края.

3. На модели эпителизации коллагенового геля выявлена морфогенетическая роль мезенхимных клеток. При миграции эпидермальных кератиноцитов человека в коллагеновом геле происходит образование тубулярных структур. Этот морфогенетический процесс сходен с ранними стадиями развития волосяного фолликула. Предложенная модель может служить для определения морфогенетического потенциала клеток in vitro.

4. Мезенхимные стволовые клетки, находящиеся в волосяном сосочке (дермальной папилле) волосяного фолликула, в культуре индуцируют эпидермальный морфогенез. Факторы роста HGF, EGF и KGF могут частично заменить указанное действие клеток дермальной папиллы.

5. Культивируемые клетки дермальной папиллы обладают свойством дифференцироваться в остеогенном, нейрогенном, и, в меньшей степени, адипогенном направлениях. Они способны реорганизовывать внеклеточный матрикс, стимулировать ангиогенез, формировать псевдопапиллы.

6. В процессе культивирования клеток дермальной папиллы человека происходит значительное повышение уровня транскрипции генов ВМРб, FGFR1 и NDP и понижение уровня транскрипции генов ALPL, FGF10 и TWIST 1.

7. Культивированные клетки волосяного фолликула человека могут быть использованы для разработки новых технологий для регенеративной медицины как легкодоступный источник клеток, обладающих широкими дифференцировочными и функциональными возможностями для стимуляции эпителизации, ангиогенеза и фолликулогенеза.

Список основных публикаций по теме диссертации.

Статьи в рецензируемых журналах

1. Васильев A.B., Воротеляк Е.А., Терских В.В. Моделирование регенерации эпидермиса in vitro: совместное действие сыворотки и эпидермального фактора роста// Онтогенез. 1994. Т. 25. №3. С. 74-79.

2. Воротеляк Е.А., Васильев A.B., Гусев С.А., Повалий Т.М., Терских В.В. Альфа-фетопротеин подавляет пролиферацию кератиноцитов in vitro II Известия РАН. Серия биол. 1996. №1. С. 117-120.

3. Воротеляк Е.А., Леонова О.Г., Шинин В.В., Васильев A.B., Терских

B.В. Рост эпидермальных кератиноцитов человека на коллагеновом геле // Доклады Академии Наук. 1999. Т. 369. № 5. С. 695-697.

4. Воротеляк Е.А., Шихвердиева А.Ш., Васильев A.B., Терских В.В. Моделирование процесса миграции эпидермальных кератиноцитов человека по трехмерному коллагеновому гелю // Известия РАН. Серия биол. 2002. №1. С. 30-37.

5. Воротеляк Е.А., Шихвердиева А.Ш., Васильев A.B., Терских В.В. Фибробласты стимулируют эпителизацию коллагенового геля // Известия РАН. Серия биол. 2002. №4. С. 421-426.

6. Терских В.В., Васильев A.B., Воротеляк Е.А. Структурно-функциональные единицы эпидермиса // Известия РАН. Серия биол. 2003. №6.

C. 645-649.

7. Васильев A.B., Воротеляк Е.А., Крохина Т.Б., Цитрин Е.Б., Терских В.В., Хрущов Н.Г. Нестинположительные клетки базального слоя эпидермиса человека в культуре // Доклады Академии наук. 2004. Т. 394. С. 555-557.

8. Воротеляк Е.А., Цитрин Е.Б., Васильев A.B., Терских В.В. Кератиноциты человека, длительно сохраняющие метку в культуре // Доклады Академии наук. 2005. Т. 402. № з, с. 418-420.

9. Воротеляк Е.А., Чермных Э.С., Васильев A.B., Терских В.В. Организация популяции кератиноцитов в культуре in vitro // Известия РАН. Серия биол. 2005. №6. С. 645-649.

10. Терских В.В., Васильев A.B., Воротеляк Е.А. Стволовые клетки: эволюция концепции // Вестник дерматологии и венерологии. 2005. № 2. С. 4-8.

11. Терских В.В., Васильев A.B., Воротеляк Е.А. Стволовые клетки и структура эпидермиса// Вестник дерматологии и венерологии. 2005. № 3. С. IIIS.

12. Воротеляк Е.А., Чермных Э.С., Васильев A.B., Терских В.В. Экспрессия кератина 19 в культуре эпидермальных кератиноцитов человека // Доклады Академии наук. 2006. Т. 408. №6. С. 835-837.

13. Терских В.В., Васильев A.B., Воротеляк Е.А. Ниши стволовых клеток // Известия РАН. Серия биол. 2007. № 3. С. 261-272.

14. Воротеляк Е.А., Чермных Э.С., Ткаченко С.Б., Васильев A.B., Терских В.В. Экспрессия и функция гена рбЗ в эпителиальных клетках // Известия РАН. Серия биол. 2007. № 4. С. 389-393.

15. Терских В.В., Васильев A.B., Воротеляк Е.А. Поляризация и асимметричное деление стволовых клеток // Цитология. 2007. Т. 49. № 11. С. 933-938.

16. Чермных Э.С., Воротеляк Е.А., Ткаченко С.Б., Васильев A.B., Терских В.В. Пролиферация кератин 19-положительных эпидермальных кератиноцитов человека in vitro // Доклады Академии наук. 2007. Т. 416. №4. С. 555-557.

17. Терских В.В., Васильев A.B., Воротеляк Е.А. Сохранение генетической информации в стволовых клетках // Генетика. 2008 Т. 44, № 3. С. 305-308.

18. Терских В.В., Васильев A.B., Воротеляк Е.А. SP-фенотип стволовых клеток // Известия РАН. Серия биол. 2008. №5. С. 517-521.

19. Васильев A.B., Воротеляк Е.А., Киселев И.В., Терских В.В. Реконструкция эпителиальных тканей с использованием клеточных технологий // Вестник РАМН. 2008. №2. С. 45- 53.

20. Киселева Е.В., Чермных Э.С., Воротеляк Е.А., Воложин А.И., Васильев A.B., Терских В.В. Сравнение дифференцировочных потенций фибробластоподобных клеток стромы костного мозга, жировой ткани, волосяного сосочка и фибробластов дермы человека // Цитология. 2009. Т. 51. №1. С. 12-19.

21. Гнедева К.Ю., Чермных Э.С., Воротеляк Е.А., Васильев A.B., Терских В.В. Влияние факторов роста на морфогенез кератиноцитов человека in vitro // Известия РАН. Серия биол. 2009. №3. С. 368-372.

22. Воротеляк Е.А., Терских В.В., Стволовые клетки эпителиальных тканей // В кн.: Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Под ред. М.А. Пальцева. Москва. «Медицина» «Шико». 2009. С. 53-74.

23. Терских В.В., Васильев A.B., Воротеляк Е.А. Микроокружение стволовых клеток // В кн.: Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Под ред. М.А. Пальцева. Москва. «Медицина» «Шико». 2009. С. 44-66.

24. Терских В.В., Воротеляк Е.А., Васильев A.B. Самоподдержание стволовых клеток // Actae Natura. 2009. №2 С. 67-72.

25. Терских В.В., Васильев A.B., Воротеляк Е.А. Самоподдержание стволовых клеток: роль асимметричного деления // Известия РАН. Серия биол. 2009. №5. С 509-514.

26. Terskikh V. V., Vasiliev V. A., and Vorotelyak Е. A. Daughter Cells Self-Renew through Asymmetric Division // In: Daughter Cell, Ed. A. Hitomi and M. Katoaka, Nova Science Publishers Inc. 2010. P. 267-282.

27. Chermnykh E.S., Vorotelyak E.A., Gnedeva K.Y., Moldaver M.V., Yegorov Y.E., Vasiliev A.V. and Terskikh V.V. Dermal papilla cells induce

keratinocyte tubulogenesis in culture // Histochemistry and Cell Biology. 2010. V. 133, Issue 5. P. 567-576.

28. Чермных Э.С., Радюхина H.B., Руткевич П.Н., Шевелев А.Я., Власик Т.Н., Воротеляк Е.А., Васильев А.В., Терских В.В. Культивированные клетки волосяного фолликула человека способны встраиваться в структуру кожи in vivo // Цитология. 2010. Т. 52. №3. С. 219-224.

29. Гнедева К.Ю., Воротеляк Е.А., Терских А.В., Васильев А.В, Терских В.В. Дифференцировочный и морфогенетический потенциал клеток дермальной папиллы крысы // Известия РАН. Серия биол. 2011. № 6. С. 653658.

30. Terskikh V.V., Vasiliev A.V., Vorotelyak Е.А. Label retaining cells and cutaneous stem cells // Stem Cell Review and Reports. 2011. DOI: 10.1007/sl2015-011-9299-6.

Патент

E. Vorotelyak, A. Vasiliev, E. Chermnykh, N. Tankovich. Angiogenically induced transplants and methods for their use and manufacture. - US20090148416.

Заказ № 329-1 /02/2012 Подписано в печать 15.02.2012 Тираж 120 экз. Усл. п.л. 1,8

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-ma.il■.zak@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Воротеляк, Екатерина Андреевна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Структурно-функциональная организация эпидермиса.

1.2 Эпидермальные стволовые клетки.

1.3 Волосяной фолликул.

1.3.1 Волосяной фолликул - придаток кожи.

1.3.2 Мезенхимные клетки волосяного фолликула.

1.4 Эпителиальный морфогенез.

1.4.1 Формирование стратифицированного эпидермиса.

1.4.2 Морфогенез волосяного фолликула.

1.4.3 Моделирование морфогенеза волосяного фолликула.

1.4.4 Эпителиальный тубулогенез.

1.5 Культивирование эпидермальных кератиноцитов.

1.6 Пролиферация и дифференцировка эпидермальных клеток в культуре и их регуляция.

1.7 Клеточная миграция.

1.7.1 Коллективная миграция.

1.7.2 Эпителизация раневой поверхности.

1.7.3 Регуляция миграции.

1.7.4 Факторы роста и миграция.

1.7.5 Моделирование миграции.

1.8 Использование культивированных кератиноцитов в регенеративной медицине.

2. Матриалы и методы.

3. Результаты и обсуждение.

3.1 Формирование многослойного эпителиального пласта в культуре.

3.1.1 Самоорганизация популяции кератиноцитов человека.

2.1.2 Коллективная миграция эпидермальных клеток человека.

3.1.3 Клеточная структура мигрирующих колоний кератиноцитов. Клеточные механизмы коллективной миграции.

3.1.4 Выбор направления движения колоний. Возможная связь с пролиферацией клеток.

3.1.5 Эффект факторов роста на миграцию. Базальный уровень миграции.

3.2 Структурно-функциональная организация эпителия in vitro.

3.2.1 Длительно сохраняющие метку клетки в эпидермальном пласте.

3.2.2 Маркеры стволовых и прогениторных эпидермальных клеток в культуре.

3.3. Морфогенез эпидермиса в ходе эпителио-мезенхимных взаимодействий.

3.3.1. Эпителизация коллагенового матрикса.

3.3.1.1 Характер роста первичных кератиноцитов человека на коллагеновом геле.

3.3.1.2 Характер роста кератиноцитов первого пассажа на коллагеновом геле.1^

3.3.1.3 Миграция эпидермальных клеток по коллагеновому гелю.

3.3.2 Дермальная папилла (волосяной сосочек) - резервуар специализированных мезенхимных клеток, индуцирующих эпидермальный морфогенез.

3.3.3 Клетки дермалыюй папиллы индуцируют эпидермальный морфогенез in vitro.

3.3.4 Структура тубулярных выростов.

3.3.5 Влияние факторов роста на морфогенез кератиноцитов человека in vitro.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Морфогенез и его регуляция в культуре эпидермальных клеток человека"

В последние несколько десятилетий клеточная биология и биология развития значительно продвинулись в понимании закономерностей регенерации и морфогенеза в многоклеточных организмах. Одним из инструментов, позволивших сделать это, явилось развитие техники культивирования клеток и тканей. При этом выяснилось, что с одной стороны эти подходы могут быть с успехом применены в фундаментальных исследованиях, а с другой - открывают совершенно новые перспективы для биологии и регенеративной медицины.

Эпидермис - это наружный слой кожи, который является первым защитным барьером организма. В течение жизни целостность эпидермиса неоднократно нарушается, он подвергается постоянным неблагоприятным воздействиям: ультрафиолетовому излучению, механическим повреждениям, контактам с микроорганизмами. Непрерывная регенерация эпидермиса противостоит этим воздействиям, обеспечивая регенерацию и удаление старых и поврежденных клеток. От эффективности этой регенерации зависит благополучие всего организма.

Эпидермис был одной из первых тканей, которые начали культивировать in vitro. В нашей лаборатории была впервые в России освоена технология культивирования эпидермальных кератиноцитов человека. Проведен ряд оригинальных исследований биологии эпидермальных клеток, участником которых был и автор данной работы.

Способность эпидермальных клеток к реконструкции многослойного пласта с последующим встраиванием в нормальные ткани после пересадки позволил применять культивированные кератиноциты для закрытия ожоговых дефектов кожи и ран (Терских В.В., Васильев A.B., 1995). Первые успешные трансплантации выращенных в культуре кератиноцитов были проведены

Ховардом Грином в 1980 году (Green Н., 1980, 2008). Это послужило стимулом для исследований в двух направлениях. Во-первых, возникла новая область на стыке биотехнологии и клеточной биологии 6 регенеративная медицина, которая достигла впечатляющих результатов уже через 10 лет после успешных экспериментов Грина. Во-вторых, появился большой интерес к изучению кожи и, в частности, эпидермиса.

Появились новые инструменты и подходы к изучению фундаментальных особенностей биологии эпидермальных клеток. При этом наибольшее число исследований касалось пролиферативной активности эпидермальных клеток и ее стимуляции, а также закономерностей дифференцировки. Связано это, прежде всего, с большим количеством травм и заболеваний кожи у человека, сопровождающихся гиперпролиферацией и нарушением программы дифференциации. С другой стороны, поиск стимулирующих пролиферацию агентов позволял повысить эффективность культивирования эпидермальных клеток.

Формирование концепции стволовых клеток началось с кроветворных органов. Эпидермис длительное время оставался мало изученным объектом.

Работы последних 20 лет существенно расширили наше представление о структуре эпидермиса и свойствах эпидермальных стволовых клетках работы под руководством Р.А^ай и Е.РисЬэ). С ростом интереса к проблеме стволовых клеток появилась серия исследований, посвященных структурнофункциональной организации эпидермиса и регенеративному потенциалу различных клеточных компартментов, его составляющих. Однако, подавляющее большинство подобных работ было проведено с использованием лабораторных животных, часто генетически модифицированных. При кажущейся гистологической однородности эпидермиса оказалось, что его функционирование поддерживается сложной иерархической системой клеток. До сих пор кинетическую структуру этой ткани нельзя считать окончательно выясненной. Еще меньше ясного относительно развития этой системы в онтогенезе и ее восстановлении в ходе регенерации. При этом закономерности регенерации и морфогенеза эпидермиса у человека вообще мало исследуются. Между тем, на наш взгляд, подходы с использованием культуры клеток, могут многое прояснить в этой 7 области. Восстановление многослойной структуры эпидермального пласта в культуре с возможностью его длительного культивирования указывает на прохождение процессов регенерации, которые, в общем смысле, представляют собой вторичное развитие. Возможность реконструкции в культуре начальных этапов регенерации более сложно устроенных структур - придатков кожи человека - до последнего времени вообще не рассматривалась. А ведь такие исследования могут значительно продвинуть нас в понимании закономерностей развития, а также патогенетической основы ряда заболеваний.

В то же время, накоплен значительный массив данных относительно развития и функционирования придатков кожи, в частности волосяных фолликулов. У мыши исследование данного объекта оказалось чрезвычайно плодотворным в плане определения механизмов эпителио-мезенхимного взаимодействия в ходе морфогенеза и регенерации. Выяснилось также, что волосяной фолликул, вероятно, содержит несколько популяций стволовых клеток разного происхождения. Потенциал этих клеток кажется сегодня настолько широким, что кожу можно рассматривать в качестве весьма перспективного источника клеточного материала для регенеративной медицины. Однако закономерности эпителио-мезенхимных взаимодействий, регенерации и морфогенеза, а также структура и потенциал клеточных популяций волосяного фолликула у человека невозможно изучить с помощью хорошо разработанных методов, используемых на лабораторных животных. Здесь необходим поиск новых подходов и идеологии исследований.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую признательность своему научному консультанту, заведующему лабораторией проблем клеточной пролиферации Василию Васильевичу Терских за многолетнее мудрое руководство, постоянную помощь, поддержку и понимание. Автор также считает своей приятной обязанностью поблагодарить заместителя директора Института биологии развития РАН Андрея Валентиновича Васильева за сотрудничество, материальную поддержку в проведении исследований, терпимость и плодотворное обсуждение результатов. Автор приносит благодарность всем бывшим и настоящим сотрудникам лаборатории за всестороннюю помощь и сотрудничество.

Автор также признателен сотрудникам ИБР РАН Г.П. Сатдыковой, Т.А. Тортуновой, Е.Б. Цитрину и всем, кто помогал в проведении данной работы. Искренне благодарю В.И. Попенко и О.Г. Леонову (Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарта) за проведение электронно-микроскопического исследования эпидермальных выростов и помощь в обработке фотографий, В.В. Ашапкина (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского) за проведение анализа транскриптома, а также Т.Н. Власик (НИИ Экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса) за сотрудничество в работе по мечению клеток кожи лентивирусными конструкциями.

Отдельную благодарность автор выражает всем своим студентам и апирантам, а особенно Э.С. Чермных и К.Ю. Гнедевой, за совместные плодотворные усилия в научной работе.

Искреннюю благодарность автор выражает оппонентам и рецензентам данной работы.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Воротеляк, Екатерина Андреевна

выводы

1. Кератиноциты in vitro сохраняют способность к образованию гистотипических структур, сходных с межфолликулярным эпидермисом. Они обладают пролиферативной активностью и формируют кластеры, аналогичные структурно-функциональным единицам эпидермиса in vivo.

2. Для коллективной миграции кластеров эпидермальных клеток на плоском субстрате in vitro характерна зависимость от пролиферации отдельных клеток: на ведущем крае мигрирующего кластера находятся клетки, обладающие высокой пролиферативной активностью; миграция эпидермального пласта in vitro осуществляется за счет кооперативной миграционной активности первых нескольких рядов клеток. Существует базальный уровень миграции, не зависимый от подавления пролиферации и действия факторов роста и обеспечивающий быстрый ответ клеток эпидермиса на появление свободного края.

3. На модели эпителизации коллагенового геля выявлена морфогенетическая роль мезенхимных клеток. При миграции эпидермальных кератиноцитов человека в коллагеновом геле происходит образование тубулярных структур. Этот морфогенетический процесс сходен с ранними стадиями развития волосяного фолликула. Предложенная модель может служить для определения морфогенетического потенциала клеток in vitro.

4. Мезенхимные стволовые клетки, находящиеся в волосяном сосочке (дермальной папилле) волосяного фолликула, в культуре индуцируют эпидермальный морфогенез. Факторы роста HGF, EGF и KGF могут частично заменить указанное действие клеток дермальной папиллы.

5. Культивируемые клетки дермальной папиллы обладают свойством дифференцироваться в остеогенном, нейрогенном, и, в меньшей степени, адипогенном направлениях. Они способны реорганизовывать внеклеточный матрикс, стимулировать ангиогенез, формировать псевдопапиллы.

6. В процессе культивирования клеток дермальной папиллы человека происходит значительное повышение уровня транскрипции генов ВMP6, FGFR1 и NDP и понижение уровня транскрипции генов ALPL, FGF10 и TWIST 1.

7. Культивированные клетки волосяного фолликула человека могут быть использованы для разработки новых технологий для регенеративной медицины как легкодоступный источник клеток, обладающих широкими дифференцировочными и функциональными возможностями для стимуляции эпителизации, ангиогенеза и фолликулогенеза.

4. Заключение.

Формирование эпителиального пласта в культуре после ферментативного разобщения клеток сопровождается регенеративными процессами, в числе которых агрегация, клеточная миграция, пролиферация, а также установление кинетического и структурно-функционального гомеостаза в иерархической популяции эпидермальных клеток.

Наши исследования с очевидностью показали, что эпидермальные кератиноциты человека способны реконструировать in vitro паттерн структурно-функциональной организации эпидермиса. В культуре кератиноциты практически сразу же формируют аналоги структурно-функциональных единиц - многоклеточные кластеры. Изучение коллективной миграции таких кластеров обнаружило активацию транзиторного компартмента эпидермиса, а также позволило выявить неизученный ранее механизм миграции многоклеточных колоний. Оказалось также, что миграция относительно небольшого числа клеток в составе колоний зависит от пролиферативного статуса культуры, в то время как базальная миграция без факторов роста и митогенов конфлуентного эпидермального пласта может проходить и в условиях блока пролиферации. Миграция эпидермальных клеток продолжается при необратимом подавлении пролиферации. Наличие базального уровня миграции может свидетельствовать об аутокринной регуляции миграции. Такая регуляция может иметь место не только при трансформации эпидермальных клеток, но также в процессе нормальной миграции регенерации. В опытах по инициации миграции клеточных кластеров удалось показать, что непролиферирующие клетки никогда не находятся на лидирующем крае колонии.

Способность к миграции является характерной чертой эпителиальных клеток. Миграция in vivo свойственна эпителию в онтогенезе и активно возобновляется в процессе регенерации поврежденного эпителия. Миграция при регенерации - это естественная, присущая эпителию реакция на образование свободного края. В процессе раневого заживления происходит не только перераспределение клеток в результате перемещения, но и приобретение ими новых свойств - их активация, которая заключается в перестройке цитоскелета, активизации пролиферации. Кератиноциты в культуре могут быть сопоставлены с кератиноцитами раневого ложа, имеющими миграционный фенотип. Формирование особого подвижного фенотипа имеет место и при трансформации эпидермальных клеток и их метастазированию. Оказалось, что трансформированные клетки сохраняют способность к коллективной миграции.

В мигрирующей колонии кератиноцитов одновременно проходят по крайней мере три процесса: миграция, пролиферация, и дифференциация. В связи с этим колония представляет собой трехмерную структуру, которая, однако, перемещается по субстрату с высокой скоростью, сопоставимой со скоростью миграции отдельной клетки. При визуальном наблюдении создается впечатление, что колония движется как единое целое и клетки внутри нее не изменяют своего положения относительно частей колонии. Однако проведенный нами ультраструктурный анализ позволяет предположить, что хотя в колонии и не происходит центробежной миграции клеток, их относительное местоположение со временем меняется. Это связано с тем, что не все клетки колонии имеют одинаковую способность к миграции. Наиболее активно мигрируют клетки, которые по морфологии могут быть отнесены к кератиноцитам шиповатого слоя или к дифференцированным элементам базального. Они сосредотачиваются в ведущем крае колонии и интенсивно синтезируют ДНК. Слабодифференцированные клетки базального слоя локализуются в центральной части колонии и не проявляют признаков миграции. Известно, что кератиноциты этого компартмента эпидермиса находятся в состоянии покоя или медленно продвигаются по клеточному циклу. Однако они обладают большим пролиферативным потенциалом, т.е. способны дать начало большому числу клеток (стволовые клетки эпидермиса). Клетки транзиторной популяции базального слоя и кератиноциты шиповатого слоя интенсивно пролиферируют. В дальнейшем в процессе дифференциации снова происходит удлинение клеточного цикла. Можно предположить, что in vivo к активной миграции в процессе регенерации способны клетки супрабазальных слоев, подвергшиеся некоторой дифференциации. Они активируются в ответ на появление свободного края и обеспечивают краевую эпителизацию ран.

Связь процессов миграции и пролиферации проявляется не только на уровне общей активации клеток. Хорошо известно, что многие факторы, оказывающие воздействие на пролиферацию кератиноцитов, модулируют также и их подвижность. При изучении действия факторов роста на миграцию эпидермальных клеток мы выяснили, что воздействие одного и того же фактора может приводить к разным митогенным и мотогенным эффектам. Хотя взаимодействие клетки с фактором роста осуществляется через один рецептор, внутриклеточные пути передачи сигнала для активации миграции и пролиферации могут различаться. Эти два процесса могут происходить одновременно или быть диссоциированы. Усиление миграции под действием фактора роста может проходить без интенсификации пролиферации, а миграция может быть ингибирована без подавления пролиферации. Это пример диссоциации пролиферации и миграции.

Способность кератиноцитов к морфогенезу проявляется по-разному в зависимости от микроокружения (субстрата, факторов роста, наличия клеток соединительной ткани). Способность к формированию тубулярных структур проявляется на плоском субстрате в образовании длинных тяжей клеток. Многоклеточные мигрирующие колонии на плоском субстрате могут быть соотнесены с цистами, формирование которых было показано в коллагеновом геле (Шинин, 2000).

Изучение эпителио-мезенхимных взаимодействий в ходе эпителизации коллагенового матрикса позволило нам разработать несколько моделей, одна из которых послужила основанием для разработки модели эпидермального морфогенеза в культуре. Параллельно мы выяснили некоторые закономерности миграции эпидермальных клеток по трехмерному матриксу. При конструировании тканеинженерных эквивалентов стоит учитывать, что плотность матрикса может драматически менять поведение эпидермальных клеток и модулировать эпителизацию субстрата.

В некоторых первых опытах мы использовали фибробласты эмбриона человека, которые весьма активно влияют на поведение кератиноцитов. Следует отметить, что под «фибробластами эмбриона» подразумеваются все клетки дермы эмбриона человека. Дерма эмбриона содержит многочисленные физиологически очень активные клетки, выделяющие большое количество факторов роста, цитокинов и гормонов. Эти клетки очень активны в отношении индукции морфогенеза, потому что, прежде всего, содержат популяцию мезенхимных клеток из эмбриональных волосяных фолликулов. В дальнейшем мы поставили задачу по получению культуры клеток дермальной папиллы (ДП) волосяного фолликула, которые в эмбриогенезе индуцируют формирование придатков кожи. На основании проведенных нами исследований можно с уверенностью заключить, что волосяной фолликул кожи человека является источником специализированных мультипотентных стволовых клеток. Мы продемонстрировали, что клетки ДП волосяного фолликула могут быть эффективно выделены, культивированы и использованы для моделирования эпидермального морфогенеза у человека, изучения эпигенетических изменений, происходящих в клетках, в том числе стволовых, в процессе культивирования, а также, вероятно, в прикладных исследованиях, направленных на реконструкцию волосяного фолликула и/или стимуляцию собственных фолликулов. Эти клетки обладают остеогенным, нейрогенным и, в меньшей степени, адипогенным потенциалом. Они реорганизуют внеклеточный матрикс, стимулируют ангиогенез и проявляют склонность к самоорганизации и формированию псевдопапилл. Под действием клеток ДП, а точнее растворимых факторов, которые они выделяют, эпидермальные кератиноциты способны особым образом реализовывать имеющийся у них морфогенетический потенциал и формируют эпидермальные выросты. Нам представляется, что эта модель является удобной альтернативой применяемым в настоящее время подходам для определения фолликул-индуцирующих способностей мезенхимных клеток. Наиболее распространенным является использование трансплантации бестимусным мышам смешанной суспензии кератиноцитов и исследуемых клеток. Очевидно, что это весьма дорогостоящий и длительный метод. Поиск способов продления сроков культивирования клеток ДП с сохранением их специфических фолликул-стимулирующих свойств, несомненно, предполагает их проверку. Кроме того, эта модель может быть удобной, на наш взгляд, для определения закономерностей дифференциации кератиноцитов на начальных стадиях формирования фолликулов.

Вопрос о сохранении стволовых клеток в культуре кератиноцитов человека открыт. За счет чего поддерживается постоянный клеточный состав и восстанавливается структура пласта после трансплантации на раневое ложе? Обнаружение сохраняющих метку клеток в культивированном живом эквиваленте кожи указывает на возможность долговременной физиологической регенерации культуры и существование покоящихся клеток, способных к отложенному регенеративному ответу.

Как судить о регенеративных возможностях культуры? Одним их маркеров функционального состояния культуры может стать кератин 19. Неслучайно его присутствие в волосяном фолликуле матриксе и верхней трети наружного корневого влагалища фолликула - в структурах, содержащих клетки с высоким регенеративным потенциалом. Экспрессия кератина 19 в культивированных кератиноцитах может указывать на пластичность этих клеток, которые при культивировании (в условиях регенеративного микроокружения) приобретают черты активно пролиферирующих элементов.

Когда-то разработка методов культивирования клеток позволила осуществить значительный прогресс в клеточной биологии. Затем постепенно стало ясно, что при культивировании часть свойств и параметров клетки сильно изменяется. Однако за время применения культуры клеток в исследованиях она сама стала отдельным биологическим объектом и все шире применяется в медицине и биотехнологии. Задача стоит в управлении свойствами культивированных клеток: обнаружении закономерностей поведения клеток в культуре, поиск тех элементов, которые аналогичны организму и определение факторов, которые могут модулировать поведение клеток. Особенно актуально это в отношении клеток человека. Представленная работа демонстрирует, что в культуре клеток кожи человека возможна реконструкция ключевых моментов начальных этапов морфогенеза - компактизация клеток, миграция, дифференцировка и формирование многоклеточных трехмерных структур в матриксе. Во многом, эти события отражают внутренние, присущие кератиноцитам свойства, а для реализации некоторых из них необходимо присутствие компетентных мезенхимных клеток.

Кожа - легкодоступный источник двух основных типов клеток (эпителиальных и мезенхимных). Это первый после костного мозга орган, подвергшийся тканеинженерной (клеточной) реконструкции. Проведенные исследования позволяют воспользоваться свойствами клеток кожи и особенностями их поведения в культуре для моделирования фундаментальных процессов морфогенеза и тканевого гомеостаза, а также для создания новых технологий регенерационной медицины.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Воротеляк, Екатерина Андреевна, Москва

1. Горелик Ю. В., Дьяконов И. А., Кухарева JI. В., Блинова М. И., Пинаев Г. П. Влияние элементов внеклеточного матрикса на псевдоподиальную активность кератиноцитов крыс. //Цитология. 1998. Т. 40. N 12. С. 1037-1044.

2. Летучая Ф. М., Кетлинский С.А. Становление «функциональных единиц» эпидермиса крыс в процессе его гистогенеза // Цитология. 1980. Т. 22. С. 176-180.

3. Малахов С. Ф., Терских В. В., Баутин Е. А., Васильев А. В., Парамонов Б. А. Аутотрансплантация выращенных вне организма эпидермальных кератиноцитов с целью лечения обширных ожогов // Вестн. хирургии им. Грекова. 1993. № 4. С. 59-62.

4. Терских В.В., Васильев A.B. Эпидермальные кератиноциты человека и животных: Проблемы культивирования и трансплантации. Москва. Наука. 1995. 104 с.

5. Терских В.В., Зосимовская А.И. Изучение параметров митотического цикла в однослойной культуре клеток китайского хомячка// Цитология. 1971. Т. 13. по. 11. С. 1388-1395.

6. Хрущов Г.К., Бродский В.Я. Орган и клетка (некоторые проблемы цитологии и гистологии) // Успехи совр. биол. 1961. Т. 52. №2. С. 181-207.

7. Abella J.V., Parachoniak C.A., Sangwan V., Park M. Dorsal ruffle microdomains potentiate Met RTK signalling and downregulation // J. Biol. 2010. V. 285. P. 24956-24967.

8. O.Adams J.C., Furlong R.A., Watt F.M. Production of scatter factor by ndk, a strain of epithelial cells, and inhibition of scatter factor activity by suramin// J.Cell Sci. 1991. V.98.Pt.3.P. 385-394.

9. Albers K.M., Setzer R.W., Taichman L.B. Heterogeneity in the replicating population of cultured human epidermal keratinocytes // Differentiation. 1986. V. 31. No. 2. P. 134-140.

10. Albrecht-Buehler G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells // Cell. 1977. V. 11(2). P. 395-404.

11. Albrecht-Buehler G. The motile behavior of virus-transformed 3T3 cells // Scan Electron Microsc. 1986. (Pt4). P. 1427-1436.

12. Allen T.D., Potten C.S. Fine stractural identification and organization of the epidermal proliferative unit // J. Cell Sci. 1974. V. 15. P. 291-319.

13. Aman A., Piotrowski T. Wnt/13-catenin and Fgf signaling control collective cell migration by restricting chemokine receptor expression // Dev. Cell. 2008. V. 15. P. 749-761.

14. Andresen J.L., Ledet T., Ehlers N. Keratinocyte migration and peptide growth factors: The effect of PDGF, bFGF, EGF, IGF-1, aFGF and TGF-beta on human keratinocyte migration in a collagen gel // Curr.Eye Res. 1997. V. 16. No. 6. P. 605-613.

15. Andl T., Reddy S.T., Gaddapara T., Millar S.E. WNT signals are required for the initiation of hair follicle development // Dev Cell. 2002. V. 5 P. 643-53.

16. Araki T., Naklo H., Takeuchi I., Maeda Y. Cell-cycle-dependent sorting in the development of Dictyostelium cells// Dev. Biol. 1994. V. 162. P. 221-228.

17. Baghdiguian S., Fantini J. Suramin: A molecule with a broad spectrum of biological and therapeutic properties// Cancer J. 1997. V. 10. No. l.P. 31-37.

18. Basson M.D., Modlin I.M., Madri J.A. Human enterocyte (Caco-2) migration is modulated in vitro by extracellular matrix composition and epidermal growth factor // J. Clin. Invest. 1992. V. 90. P. 15-23.

19. Barrandon Y., Green H. Cell size as a determinant of the clone-forming ability of human keratinocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. US. 1985. V.82. P. 5390-5394.

20. Barrandon Y., Green H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication // Proc.Natl. Acad. Sci. US. 1987a. V. 84. P. 2302-2306.

21. Barrandon Y., Green H. Cell Migration is essential for sustained growth of keratinocyte colonies: the roles of transforming growth factor a and epidermal growth factor// 1987b. Cell. V. 50. N. 7. P. 1131-1137.

22. Barrientos S., Stojadinovic O., Golinko M.S., Brem H., Tomic-Canic M., Growth factors and cytokines in wound healing // Wound Rep. Reg. 2008. V. 16. P. 585601.

23. Basset-Segium N., Escot C., lanchard J.M. et al. High levels of c-fos proto-oncogene expression in normal human adult skin // J. Invest. Dermatol. 1990. V. 94. P. 418-422.

24. Bates R.C., Buret A., van Helden D.F., Horton M.A., Burns G.F. Apoptosis induced by inhibition of intercellular contact// J. Cell Biol., 1994. V. 125. P. 403-415.

25. Bell E, Ehrlich H.P, Sher S., Merrill C, Sarber R, Hull B, Nakatsuji T, Church D, Buttle D.J. Development and use of a living skin equivalent // Plast. Reconstr. Surg. 1981. V. 67. P. 386-392.

26. Bennett W.R, Crew T.E, Slack J.M.W, Ward A. Structural-proliferative units and organ growth: effects of insulin-like growth factor 2 on the growth of colon and skin // Development. 2003. V. 130. P. 1079-1088.

27. Beretta C, Chiarelli A, Testoni B, Mantovani R, Guerrini L. Regulation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p57Kip2 expression by p63 // Cell Cycle. 2005. V. 4. P. 1625-1631.

28. Bernot KM, Coulombe PA, McGowan KM. Keratin 16 expression defines a subset of epithelial cells during skin morphogenesis and the hair cycle. J. Invest Dermatol. 2002. V. 119(5). P. 1137-1149.

29. Bertolero F., Kaighn M.E, Camalier R.F, Saffiotti U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes// In Vitro. 1986. V. 22. No. 7. P. 423-428.

30. Bickenbach J.R. Identification and behaviour of label-retaining cells in oral mucosa and skin//J. Dent. Res. 1981. V. 60. P. 1611-1620.

31. Bickenbach J, Mackenzie I. Identification and localization of label retaining cells in hamster epithelium // J. Invest. Dermatol. 1984. V. 82. P. 618-22.

32. Bickenbach J.R, McCutecheon J, Mackenzie I.C. Rate of loss of tritiated thymidine label in basal cells in mouse epithelial tissues. Cell Tissue Kinet. 1986. V. 19(3). P. 325-333.

33. Blanpain C, Fuchs E. Epidermal stem cells of the skin // Annu Rev Cell Dev Biol. 2006. V. 22. P. 339-73.

34. Blanpain C. and Fuchs E. p63: reviving up epithelial stem-cell potential // Nat. Cell Biol. 2007. Vol. 9. No. 7. P. 731-733.

35. Blanpain C., Fuchs E. Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin // Nat Rev Mol Cell Biol. 2009. V. 10(3). P. 207-217.

36. Blanpain C., Lowry W.E., Pasolli H.A., and Fuchs E. Canonical notch signaling functions as a commitment switch in the epidermal lineage // Genes & Development. 2006. V. 20. P. 3022-3035

37. Blay J., Brown K. D. Epidermal growth factor promotes the chemotactic migration of cultured rat intestinal epithelial cells // J. Cell. Physiol. 1985. V. 124. P. 107112.

38. Botchkarev V.A. Bone morphogenetic proteins and their antagonists in skin and hair follicle biology // J. Invest. Dermatol. 2003. V. 120. P. 36-47.

39. Botchkarev V.A., Botchkareva N.V., Nakamura M. et al., Noggin is required for induction of the hair follicle growth phase in postnatal skin. FASEB J. 2001. V. 15. P. 2205-2214.

40. Botchkarev V.A., Kishimoto J. Molecular control of epithelio-mesenchymal interactions during hair follicle cycling // J. Invest. Dermat. 2003. V. 8. P. 46-55.

41. Botchkarev V.A. and Paus R. Molecular biology of hair morphogenesis: development and cycling // J. Exp. Zool. (Mol. Dev. Evol.). 2003. V. 298B. P. 164-180.

42. Bottaro D.P., Rubin J.S., Faletto D.L. et al. Identification of the hepatocyte growth factor receptor as the c-met proto-oncogene product // Science. 1991. V. 251(4995). P. 802-804.

43. Boudreau N., Werb Z., and Bissel M.J. Suppression of apoptosis by basement membrane requires three-dementional tissue organization and withdrawal from the cell cycle // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 3509-3513.

44. Boudreau N., Sympson C., Werb Z., Bissell M.J. Suppression of ICE and apoptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix // Science. 1995. V. 267. P. 891-893.

45. Brachmann R., Lindquist P.B., Nagashima M., Kohr W., Lipari T., Napier M., Derynck R. Transmembrane TGF-a precursors activate EGF/TGF-a receptors// Cell. 1989. V. 56. P. 691-700.

46. Braun K.M., Niemann C., Jensen U.B., Sundberg J.P., Silva-Vargas F.M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualization of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis // Development. 2003. V. 130. P. 5241-55.

47. Brinkmann V., Foroutan H., Sachs M., Weidner K.M., Birchmeier W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells //J Cell Biol. 1995. V. 131(6 Pt 1). P. 1573-86.

48. Brown R.M., Middleton C.A. Contact-induced spreading in cultures of corneal epithelial cells//J. Cell Sci. 1981. V. 51. P. 143-152.

49. Byrne C., Tainsky M., Fuchs E. Programming gene expression in developing epidermis // Development. 1994. V. 120. P. 2369-2383.

50. Candi E., Oddi S., Paradisi A., Terrinoni A., Ranalli M., Teofoli P., Citro G., Scarpato S., Puddu P., Melino G. Expression of transglutaminase 5 in normal and pathological humal epidermis // J. Invest. Dermatol. 2002. V. 119. P. 670-677.

51. Carmona-Fontaine C. Matthews H.K., Kuriyama S., Moreno M., Dunn G.A., Parsons M., Stern C.D., Mayor R. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration // Nature. 2008. V. 456. P. 957-961.

52. Carpenter P. M., Nguyen H. P. Mammary epithelium induced motility of MCF-7 cells. //Anticancer Res. 1998. V. 18 (2A). P. 1063-1068.

53. Carroll D.K., Carroll J.S., Leong C.O., Cheng F., Brown M., Mills A.A., Brugge J.S. and Ellisen L.W. p63 regulates an adhesion programme and cell survival in epithelial cells //Nat Cell Biol. 2006. V. 8. P. 551-561.

54. Celli J., Duijf P., Hamel B.C., Bamshad M. et al. Heterozygous germline mutations in the p53 homologue p63 are the cause of EEC syndrome // Cell. 1999. V. 99. P. 143-153.

55. Cha D., Obrien P., Otoole E.A., Woodley D.T., Hudson L.G. Enhanced modulation of keratinocyte motility by transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) relative to epidermal growth factor (EGF) // J.Invest.Dermatol. 1996. V. 106. No. 4. P. 590-597.

56. Chen Ph., Gupta K., and Wells A. Cell movement elicited by epidermal growth factor receptor requires kinase and autophosphorylation but is separable from mitogenesis// J.Cell Biol. 1994. V. 124. No. 4. P. 547-555.

57. Chung Ch.Y., Murphy-Ullrich J.E., and Erickson H.P. Mitogenesis, cell migration, and loss of focal adhesions induced by tenascin-C interacting with its cell surface receptor, annexin II //Mol.Biol.Cell. 1996. V. 7. P. 883-892.

58. Clark P. Modulation of scatter factor/hepatocyte growth factor activity by cell-substratum adhesion //J Cell Sci. 1994. V. 107 ( Pt 5). P. 1265-1275.

59. Claudinot S., Nicolas M., Oshima H., Rochat A., Barrandon Y. Long-term renewal of hair follicles from clonogenic multipotent stem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. 2005. V. 102. P. 14677-14682.

60. Clayton E., Doupe D.P., Klein A.M., Winton D.J., Simons B.D., Jones P.H. A single type of progenitor cell maintains normal epidermis // Nature. 2007. V. 446. P. 185-189.

61. Collins C.A. and Watt F.M. Dynamic regulation of retinoic acid-binding proteins in developing, adult and neoplastic skin reveals roles for (3-catenin and Notch signaling // Dev. Biol. 2008. V. 324. P. 55-67.

62. Collins M.K., Perkins G.R., Rodriguez-Tarduchy G., Nieto M.A., Lopez-Rivas A. Growth factors as survival factors: regulation of apoptosis // Bioessays. 1994. V. 16(2). P. 133-138.

63. Compton C.C. Current concepts in pediatric burn care: The biology of cultured epithelial autografts: an eight-year study in pediatric burn patients // Europ.J. Pediat .Surg. 1992. V. 2. P. 216-222.

64. Cook P.W., Pittelkow M.R., Shipley G.D. Growth factor-independent proliferation of normal human neonatal keratinocytes: production of autocrine- and paracrine-acting mitogenic factors// J.Cell.Physiol. 1991. V. 146. No. 2. P. 277-289.

65. Cotsarelis G. Epithelial stem cells: a folliculocentric view // J. Investig. Dermatol. 2006a. V. 126. P. 1459-1468.

66. Cotsarelis G. Gene expression profiling gets to the root of human hair follicle stem cells // J. Clin. Invest. 2006b. V. 116.- P. 19-22.

67. Cui C.Y., Kunisada M., Childress V., Michel M., Schlessinger D. Shh is required for Tabby hair follicle development // Cell Cycle. 2011. V. 10(19). P. 3379-3386.

68. Dale B.A., Holbrook K.A., Kimball J.R., Hoff M. and Sun T.-T. Expression of epidermal keratins and filaggrin during human fetal skin development // J. Cell Biol. 1985. V. 101. 1257-1269.

69. Danjo Y., Gipson I.K. Specific transduction of the leading edge cells of migrating epithelia demonstrates that they are replaced during healing // Exp Eye Res. 2002. V. 74(2). P. 199-204.

70. Defize L.H.K., Boonstra J., Meisenhelder J. et al. Signal transduction by epidermal growth factor occurs through the subclass of high affinity receptors // J.Cell Biol. 1989. V. 109. No. 5. P. 2495-2507.

71. Delescluse C., Stohr M., Prunieras M., Goerttler K. Microflowfluorometric evaluation of homeostasis in cultured epidermal cells // Cell Biol Int Rep. 1979. V. 3(8). P. 685-690.

72. De Rosa L., Antonini D., Ferone G., Russo M.T., Yu P.B., Han R., Missero C. p63 suppresses non-epidermal lineage markers in a bone morphogenetic protein-dependent manner via repression of Smad7 // J. Biol. Chem. 2009. V. 284. No. 44. P. 30574-30582.

73. DeRouen M.C., Oro A.E. The primary cilium: a small yet mighty organelle // J. Invest Dermatol. 2009. V. 129(2). P. 264-265.

74. Devenport D. and Fuchs E. Planar polarization in empryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicle //Nature Cell Biol. 2008. V. 10. P. 1257-1268.

75. Dhimolea E, Maffini MV, Soto AM, Sonnenschein C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model // Biomaterials. 2010. Y. 31(13). P. 3622-3630.

76. Donaldson J.D., Mahan J.T. Keratinocyte migration and the extracellular matrix// J.Invest.Dermatol. 1988. V. 5. P. 623-628.

77. Dover R., Potten C.S. Heterogenity and cell cycle analysis from tme-lapse studies of human keratinocytes in vitro II J.Cell Sci. 1988. V 89. P. 359-364.

78. Driskell R.R., Clavel C., Rendl M., Watt F.M. Hair follicle dermal papilla cells at a glance // J Cell Sci. 2011. V. 124(Pt 8). P. 1179-1182

79. Dunn G.A., Brown A.F. Alinment of fibroblasts on grooved surfaces described by simple geometric transformation// J.Cell Sci. 1986. V. 83. P. 313-340.

80. Eccles S.A., Box C., Court W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnol Annu Rev. 2005. V. 11. P.391-421.

81. Eham R., Ishimatsu-Tsuji Y., Iriyama S., Ideta R., Soma T., Yano K. et al. Hair follicle regeneration using grafted rodent and human cells // J. Invest. Dermatol. 2007. V. 127. P. 2106-2115.

82. Ehrlich H.P., Buttle D.J., Nakatsuji T. Living tissue formed in vitro and accepted as skin equivalent tissue of full thickness // Science. 1981. V. 211. No. 4486. P. 1052-1054.

83. Ettensohn C.A. Gastrulation in the sea urchin embryo is accompanied by the rearrangement of invaginating epithelial cells // Dev. Biol. 1985. V. 107. P. 66-74.

84. Ezratty E.J., Stokes N., Chai S., Shah A.S., Williams S.E., Fuchs E. A role for the primary cilium in Notch signaling and epidermal differentiation during skin development // Cell. 2011. V. 145(7). P. 1129-1141.

85. Farooqui R. and Fenteany G. Multiple rows of cells behind an epithelial wound edge extend cryptic lamellipodia to collectively drive cell-sheet movement // J. Cell Sci. 2005. V. 118. P. 51-63.

86. Fell P.E., Grobstein C. The influence of extra-epithelial factors on the growth of embryonic mousepancreatic epithelium. // Exp Cell Res. 1968. V. 53(1). P.301- 304.

87. Fibbi G., Magnelli L., Pucci M., and Rossso M.D. Interaction of urokinase A chain with the receptor of human keratinocytes stimulates release of urokinase-like plasminogen activator// Exp. Cell Res. 1990. V. 187. P. 33-38.

88. Finch P.W., Rubin J.S., Miki T., Ron D., and Aaronson S.A. Human KGF is EGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth// Science. 1989. V. 245. P. 752-755.

89. Fischer R.S., Gardel M., Ma X., Adelstein R.S. & Waterman C.M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching // Curr. Biol. 2009. V. 19. P. 260-265.

90. Fleischmajer R., MacDonald E.D. 2nd, Contard P., Perlish J.S. Immunochemistry of a keratinocyte-fibroblast co-culture model for reconstruction of human skin. //J Histochem Cytochem. 1993. V. 41(9). P. 1359-1366.

91. Fleming T.P., Matsui T., Molloy C.J., Robbins K.C., and Aaronson S.A. Autocrine mechanism for v-sis transformation requires cell surface localization of internally activated growth factor receptors// Proc.Natl.Acad.Sci. 1989. V. 86. P. 8063-8067.

92. Fong C. J., Sutkowski D. M., Kozlowski J. M., Lee C. Utilization of the Boyden chamber to further characterize in vitro migration and invasion of benign and malignant human prostatic epithelial cells// Invasion Metastasis. 1992. V. 12. P. 264-274.

93. Friedl P. and Gilmour D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009. V. 10. P. 445-457.

94. Friedl P., Noble P.B., Walton P.A., Laird D. E., Chauvin P.J., Tabah R.J., Black M., Zanker K.S. Migration of coordinated cell clusters in mesenchymal and epithelial cancer explants in vitro // Cancer Res. 1995. V. 55. P. 45574560.

95. Frisch S.M., Francis H. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis // J.Cell Biol.V. 1994. V. 124. P. 619-626.

96. Frye M, Fisher A.G, Watt F.M. Epidermal stem cells are defined by global histone modifications that are altered by Myc-induced differentiation // PlosOne. 2007. No. 8. e763.

97. Fuchs E. Finding one's niche in the skin. Cell Stem Cell // 2009. V. 4(6). P. 499-502.

98. Fuchs E, Nowak J.A. Building epithelial tissues from skin stem cells // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2008. V. 73. P. 333-350.

99. Fujuchi S, Ohsaki Y, Kikuchi K. Suramin inhibits the growth of non-small-cell lung cancer cells that express the epidermal growth factor receptor// Oncology. 1997. V. 54. No. 2. P. 134-140.

100. Galbraith C.G, Sheetz M.P. Forces on adhesive contacts affect cell function // Curr Opin Cell Biol. 1998. V. 10. P. 566-571.

101. Gallico G.G, O'Connor N.E. Cultured epithelium as a skin substitute// Clinics in Plast. Surg. 1985. V. 12. P. 149-157.

102. Gallico G.G, O'Connor N.E, Compton C.C, Kehinder O, Green H. Permanent coverage of large burn wounds with autologous cultured human epithelium // New Engl. J. Med. 1984. V. 311. P. 448-454.

103. Gandarillas A, Goldsmith L.A, Gschmeisner S, Leigh I.M, and Watt F.M. Evidence that apoptosis and terminal differentiation of epidermal keratinocytes are distinct processes // Exp. Dermatol. 1999. V. 8. P. 71-79.

104. Garlick J. A., Taichman L.B. Fate of human keratinocytes during reepithelialization in an organotypic culture model // Lab. Invest. 1994. V. 70. P. 916-924.

105. Ghabrial A.S. and Krasnow M.A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis //Nature. 2006. V. 441. P. 746-749.

106. Ghazizadeh S., Taichman L.B. Multiple classes of stem cells in cutaneous epithelium: a lineage analysis of adult mouse skin // EMBO J. 2001. V. 20. P. 1215-1222.

107. Gherardi E., Stoker M. Hepatocyte growth-scatter factor: mitogen, motogen and met// Cancer Cells. 1991. V. 3. P. 227-232.

108. Giannelli G, Falk-Marzillier J, Schiraldi O, Stetler-Stevenson WG, Quaranta V: Induction of cell migration by matrix metalloprotease-2 cleavage of laminin-5 // Science. 1997. V. 277. P. 225-228.

109. Gilchrest B.A., Marshall W.L., Karassik R.L., Weinstein R., Maciag T. Characterization and partial purification of keratinocyte growth factor from the hypothalamus // J Cell Physiol. 1984. V. 120(3). P. 377-383.

110. Green H. The keratinocyte as differentiated cell type// Harvey Lectures. 1980. V. 74. P. 101-139.

111. Green H. The birth of therapy with cultured cells / BioEssays.2008. V. 30. P. 897-903.

112. Greif F., Soroff H.S., Setzer R.W., Taichman L.B. The effect of growth-promoting agents on replication and cell cycle withdrawal in cultures of epidermal keratinocytes // In Vitro. 1988. V. 24. P. 985-989.

113. Grinnell F. The activated keratinocyte: up regulation of cell adhesion and migration during wound healing// J.Trauma.1990. V. 30. No. 12. S144-149.

114. Grinnell F. Wound repair, keratinocyte activation and integrin modulation // J Cell Sci. 1992. V. 101 (Pt 1). P. 1-5.

115. Gumbriner B.M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis // Cell. 1996. V. 84. P. 345-357.

116. Guo M., Toda K.-I., Grinnell F. Activation of human keratinocyte migration on type I collagen and fibronectin // J.Cell Sci. 1990. V. 96. P. 197-205.

117. Guo N., Hawkins C., and Nathans J. Frizzled6 controls hair patterning in mice // PNAS. 2004. V. 101, No. 25. P. 9277-9281.

118. Hahn A.W.A., Kern F., Jonas U., John M., Buhler F.R., and Resink T.J., Functional aspects of vascular tenascin-C expression // J.Vasc.Res. 1995. V. 32. P. 162-174.

119. Hall P.A., Watt F.M. Stem cells: the generation and maintenance of cellular diversity//Development. 1989. V. 106. P. 619-633.

120. Halprin K.M. Epidermal "turnover time" a re-examination // Br. J. Dermatol. 1972. V. 86. P. 14-19.

121. Hardy M. The Secret life of the hair follicle // Trends in Genetics. 1992. V. 8. No. 2. P. 55-61.

122. Hashiro M., Matsumoto K., Okumura H. et al. Growth inhibition of human keratinocytes by antisense c-myc oligomer is not coupled to induction of differentiation //Biochem. and Biophys. Res. Commun. 1991. V. 174. No. 1. P. 287-292.

123. Havlickova B., Biro T., Mescalchin A., Arenberger P., Paus R. Towards optimization of an organotypic assay system that imitates human hair follicle-like epithelial-mesenchymal interactions // Br. J. Dermatol. 2004. V. 151. P. 753-765.

124. Heckman C.A., Oravecz K.I., Schwab D., Ponten J. Ruffling and locomotion: role in cell resistance to growth factor-induced proliferation // J.Cell Physiol. 1993. V. 154. P. 554-565.

125. Hegerfeldt Y., Tusch M., Brocker E.B., Friedl P. Collective cell movement in primary melanoma explants: plasticity of cell-cell interaction, □ 1-integrin function and migration strategies // Cancer Res. 2002. V. 62. P. 2125-2130.

126. Heenen M., De Graef Ch., Galand P. Kinetics of the calcium induced stratification of human keratinocytes in vitro // Cell Prolif. 1992. V. 25. P. 233240.

127. Hennighausen L. and Robinson G.W. Information networks in the mammary gland //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. V. 6. P. 715-725.

128. Herrera R. Modulation of hepatocyte growth factor-induced scatterring of HT29 colon carcinoma cells. Involvement of the MAPK pathway //J. Cell Sci. 1998. V. 111 (pt 8). P. 1039-1049.

129. Hertle M.D., Kubler M.D., Leigh I.M., Watt F.M. Aberrant integrin expression during epidermal wound healing and in psoriatic epidermis // J. Clin. Invest. 1992. V. 89. P. 1892-1901.

130. Hesse M., Franz T., Tamai Y., Taketo M.M., Magin T.M. Targeted deletion of keratins 18 and 19 leads to trophoblast fragility and early embryonic lethality // EMBO J. 2000. V. 19. P. 5060 5070.

131. Higa K., Shimmura S., Miyashita H., Shimazaki J. and Tsubota K. Melanocytes in the corneal limbus interact with K19-positive basal epithelial cells // Exp. Eye Res. 2005. V. 81. P. 218-223.

132. Hinck L. The versatile roles of "axon guidance" cues if tissue morphogenesis // Dev. Cell. 2004. V. 7. P. 783-793.

133. Hirai Y. Molecular cloning of human epimorphin: identification of isoforms and theirunique properties // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. 191(3). P. 1332-1337.

134. Hodilava K.J., Watt F.M. Evidence that cadherins play a role in the downregulation of integrin expression that occurs during keratinocyte terminal differentiation// J. Cell Biol. 1994. V. 124. P. 589-600.

135. Hodges G.M., Livingston D.C., Franks L.M. The localization of trypsin in cultured mammalian cells // J Cell Sci. 1973. V. 12(3). P. 887-902.

136. Hogan B.L.M., Morphogenesis // Cell. 1999. V. 96. P. 225-233

137. Hoogduijn M.J., Gojup E., Genever P.G. Comparative characterization of hair follicle dermal stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells // Stem Cell Dev. 2006. V. 15. P. 49-60.

138. Horowitz A., Simons M. Branching morphogenesis // Circ. Res. 2008. V. 103. P. 784-795.

139. Huelsken J., Vogel R., Erdmann B., Cotsarelis G., Birchmeier W. (3-Catenin controls hair follicle morphogenesis and stem cell differentiation in the skin // Cell. 2001. V. 105. P. 533-545.

140. Humes H.D., Cieslinski D.A. Interaction between growth factors and retinoic acid in the induction of kidney tubulogenesis in tissue culture //Exp Cell Res. 1992. V. 201(1). P. 8-15.

141. Hynes R.O., Fibronectins, Springer-Verlag, New York, 1990.

142. Ignotz R.A. and Massague J. Cell adhesion protein receptors as targets for transforming growth factor-beta action// Cell. 1987. V. 51. P. 189-197.

143. Iida M., Ihara S., Matsuzaki T. Hair cycle-dependent changes of alkaline phosphatase activity in the mesenchyme and epithelium in mouse vibrissal follicles. Develop. Growth Differ. 2007. V. 49. P. 185-195.

144. Inamatsu M., Matsuzaki T., Iwanari H., Yoshizato K. Establishment of rat dermal papilla cell lines that sustain the potency to induce hair follicles from afollicular skin // J. Invest. Dermatol. 1998. V. 111. P. 767-775.

145. Inyang A.L., Tobelem G. Tssue-plasminogen activator stimulates endothelial cell migration in wound assays// Biochem. Biophys. Res. Com. 1990. V. 171. No. 3.P. 1326-1332.

146. Ito M., Liu Y., Yang Z., Nguyen J., Liang F., Morris R.J. Cotsarelis G. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis //Nat. Med. 2005. V. 11. P. 1351-1354.

147. Jahoda C.A.B. Induction of follicle formation and hair growth by vibrissa dermal papillae implanted into rat ear wounds: vibrissa-type fibres are specified // Development. 1992. V. 115. P. 1103-1109.

148. Jahoda C.A., Home K.A., Oliver R.F. Induction of hair growth by implantation of cultured dermal papilla cells. Nature. 1984. V. 311. P. 560-562.

149. Jahoda C.A., Oliver R.F. Vibrissa dermal papilla cell aggregative behaviour in vivo and in vitro // J Embryol Exp Morphol. 1984. V. 79. P. 211-224.

150. Jahoda C.A., Reynolds A.J. Hair follicle dermal sheath cells: unsung participants in wound healing // Lancet. 2001. V. 358. P. 1445-1448.

151. Jamora R., DasGupta, Kocieniewski P., Fuchs E. Links between signal transduction, transcription and adhesion in epithelial bud development // Nature. 2003. V. 422 P. 317-322.

152. Jarecki J., Johnson E. and Krasnow M.A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF // Cell. 1999. V. 99. P. 211-220.

153. Jensen K.B., Watt F.M. Single-cell expression profiling of human epidermal stem and transit-amplifying cells: Lrigl is a regulator of stem cell quiescence // Proc Natl Acad Sci USA. 2006. V. 103. P. 11958-11963.

154. Jensen K.B., Collins C.A., Nascimento E., Tan D.W., Frye M., Itami S., Watt F.M. Lrigl expression defines a distinct multipotent stem cell population in mammalian epidermis // Cell Stem Cell. 2009. V. 4(5). P. 427-39.

155. Jensen P.K.A., Pedersen S., Bolund L. Basal-cell subpopulations and cell-cycle kinetics in human epidermal explant culture // Cell and Tissue Kinet. 1985. V. 18. No. 2. P. 201-215.

156. Jensen P.K., Bolund L., Low Ca2+ stripping of differentiating cell layers in human epidermal cultures: an in vitro model of epidermal regeneration // Exp. Cell Res. 1988. V. 175. P. 63-73.

157. Jensen P.K., Fey S.J., Larsen P.M., Norgard J.O., Bolund L. Morphological differentiation and changes in polypeptide synthesis pattern during regeneration of human epidermal tissue developed in vitro // Differentiation. 1991. V. 47(1). P. 3748.

158. Jensen P.J., John M., Baird J. Urokinase and tissue type plasminogen activators in human keratinocyte culture// Exp. Cell Res. 1990. V. 187. P. 162-169.

159. Jensen U.B., Lowell S., and Watt F.M. The spatial relationship between stem cells and their progeny in the basal layer of human epidermis: A new view based on whole mount labeling and lineage analysis // Development. 1999. V. 126. P. 2409-2418.

160. Jiang S.T., Chiu S.J., Chen H.C., Chuang W.J., Tang M.J. Role of alpha3betal integrin in tubulogenesis of Madin-Darby canine kidney cells. // Kidney Int. 2001. V. 59(5). P. 1770-1778.

161. Jones P.H. Epithelial stem cells // BioEssays. 1997. V. 19. P. 683-690.

162. Jones P.H., Harper S., Watt F.M. Stem cell patterning and fate in human epidermis // Cell. 1995. V.80. P. 83-93.

163. Jones P.H., Watt F.M. Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression // Cell. 1993. V. 73. P. 713-724.

164. Jones P.H., Simons B.D., Watt F.M. Sic transit gloria: farewell to the epidermal transit amplifying cell? // Cell Stem Cell. 2007. V. 1(4). P. 371-381.

165. Kadoya Y, Nomizu M, Sorokin LM, Yamashina S, Yamada Y. Laminin alpha 1 chain G domain peptide, RKRLQVQLSIRT, inhibits epithelial branching morphogenesis of cultured embryonic mouse submandibular gland //Dev Dyn. 1998. V. 212(3). P. 394-402.

166. Karihaloo A., O'Rourke D.A., Nickel C., Spokes K., Cantley L.G. Differential MAPK pathways utilized for HGF- and EGF-dependent renal epithelial morphogenesis //J Biol Chem. 2001. V. 276(12). P. 9166-9173.

167. Karlsson L., Bondjers C. and Betsholtz C. Roles for PDGF-A and sonic hedgehog in development of mesenchymal components of the hair follicle // Development. 1999. V. 126. P. 2611-2621.

168. Karp G.C., Solursh M. Dynamic activity of the filopodia of sea urchn embryonic cells and their role in directed migration of the primary mesenchyme in vitro // Dev.Biol. 1985. V. 112. P. 276-283.

169. Kartha S., Toback F.G . Adenine nucleotides stimulate migration in wounded cultures of kidney epithelial cells// J Clin Invest. 1992. V. 90(1). P. 288-292.

170. Kaur P. Interfollicular epidermal stem cells: identification, challenges, potential //J. Invest. Dermatol. 2006. V. 126. P. 1450-1458.

171. Kim HJ, Tinling SP, Chole RA. Expression patterns of cytokeratins in cholesteatomas: evidence of increased migration and proliferation // J Korean Med Sci. 2002. V. 17(3). P. 381-388.

172. Kim J.P., Zhang K., Chen J.D., Kramer R.H., Woodley D.T. Yitronectin-driven human keratinocyte locomotion is mediated by the av (35 integrin receptor// J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 26926-26932.

173. Kirfel G. and Herzog V. Migration of epidermal keratinocytes: mechanisms, regulation, and biological significance // Protoplasma. 2004. V. 223. P. 67-78.

174. Kishimoto J., Burgeson R.E., Morgan B.A. Wnt signaling maintains the hair-inducing activity of the dermal papilla // Genes Dev. 2000. V. 14. P. 1181-1185.

175. Khalil A. A., Friedl P. Determinants of leader cells in collective cell migration // Integr Biol (Camb). 2010. V. 2(11-12). P. 568-574.

176. Klebe R.J., Escobedo L.V., Bentley K.L., Thompson L.K. Regulation of cell motility, morphology, and growth by sulfated glycosaminoglycans //Cell Motil. Cytoskeleton. 1986. V. 6. N 3. P. 273-281

177. Klein-Soyer C., Archipoff G., Beretz A., Cazenave J.P. Opposing effects of heparin with TGF-beta or aFGF during repair of a mechanical wound of human endothelium. Influence of cAMP on cell migration // Biol Cell. 1992. Y. 75(2). P.155-162.

178. Kleinman HK, Jacob K. Invasion assays. Curr Protoc Cell Biol. 2001. Chapter 12:Unit 12.2.

179. Kobayashi K, Rochat A, Barrandon Y. Segregation of keratinocyte colony-forming cells in the bulge of the rat vibrissa // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V. 90. P. 7391-7395.

180. Kobayashi H, Yasudo H, Ohkawara A, Dosaka H, Ogiso Y, Kuzumaki N. Enhanced expression of ras gene products in psoriatic epidermis // Arch. Dermatol. Res. 1988. V. 280. P. 259-263.

181. Koike T, Yasugi S. In vitro analysis of mesenchymal influences on the differentiation of stomach epithelial cells of the chicken embryo // Differentiation. 1999. V. 65(1). P. 13-25.

182. Kolega J. The movement of cell clusters in vitro: morphology and directionality //J.Cell Sci. 1981. V. 49. P. 15-32.

183. Kolodka T.M, Garlick J, Taichman L.B. Evidence for keratinocyte stem cells in vitro: Long term engraftment and persistence of transgene expression from retrovirus-transduced keratinocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 4356-4361.

184. Kondo H, Matsuda R, and Yonezawa Y. Autonomous migration of human fetal skin fibroblasts into a denuded area in a cell monolayer is mediated by basic fibroblast growth factor and collagen// In Vitro Cell.Dev.Biol. 1993. V. 29A. P. 929-935.

185. Koster M.I, Roop D.R. The role of p63 in development and differentiation of the epidermis // J. Dermatol. Sci. 2004. V. 34. P. 3-9.

186. Koster M.I. and Roop D.R. Mechanisms Regulating Epithelial Stratification // Annual Review of Cell and Developmental Biology. 2007. V. 23. P. 93-113.

187. Koster M.I, Dai D, Marinari B, Sano Y, Costanzo A, Karin M, Roop D.R. p63 induces key target genes required for epidermal morphogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. No. 9. P. 3255-3260.

188. Koster M.I., Kim S., Huang J., Williams T., Roop D.R. TAp63alpha induces AP-2gamma as an early event in epidermal morphogenesis // Dev. Biol. 2006. V. 289. P. 253-261.

189. Koster M. I., Kim S., Mills A.A. et al. p63 is the molecular switch for initiation of an epithelial stratification program // Genes Development. 2004. V. 18. P. 126131.

190. Krawczyk W.S. A pattern of epidermal cell migration during wound healing// J.Cell Biol. 1971. V. 49. P. 247-263.

191. Krohn P.L. Review lectures on senescence. II. Heterochronic transplantation in the study of ageing // Proc R Soc Lond B Biol Sci. 1962.V. 157. P. 128-147.

192. Kubo M., Kan M., Isemura M., Yamane I., Tagami H. Effects of extracellular matrices on human keratinocyte adhesion and growth and on its secretion and deposition of fibronectin in culture//J. Invest. Dermatol. 1987. V. 88. P. 594-601.

193. Kupfer A., Louvard D., Singer S.J. Polarization of the Golgi apparatus and the mcrotubule-organizing center in cultured fibroblasts at te edge of an experimental wound//Proc.Natl.Acad.Sci. 1982. V. 79. P. 2603-2607.

194. Lako M., Armstrong L., Cairns P.M., Harris S., Hole N., Jahoda C.A. Hair follicle dermal cells repopulate the mouse haematopoietic system // J Cell Sci. 2002. V. 115. P. 3967-3974.

195. Landry J., Bernier D., Ouellet C., Goyette R., Marceau N. Spheroidal aggregate culture of rat liver cells: Histotypic reorganization, biomatrix deposition, and maintenance of functional activities // J. Cell Biol. 1985. V. 101. P. 914-923.

196. Latijnhouwers M, Bergers M, Ponec M, Dijkman H, Andriessen M, Schalkwijk J. Human epidermal keratinocytes are a source of tenascin-C during wound healing // J Invest Dermatol. 1997. V. 108(5). P. 776-83.

197. Lauffenburger D.A., Horwitz A.F. Cell migration: a physically integrated molecular process // Cell. 1996. V. 84(3). P. 359-369.

198. Laurikkala J., Mikkola M.L., James M., Tummers M., Mills A.A. and Thesleff I. p63 regulates multiple signalling pathways required for ectodermal organogenesis and differentiation // Development. 2006. V. 133. P. 1553-1563.

199. Lavker R.M., Cotsarelis G., Wei Z.G., Sun T.T. Stem cells of pelage, vibrissae, and eyelash follicles: the hair cycle and tumor formation // Ann N Y Acad Sci.-1991. V. 642. P. 214-24.

200. Lavker R.M., Sun T.T: Epidermal Stem Cells // J. Invest Dermatol. 1983. V. 81. P. 1215-1275.

201. Lecaudey V. and Gilmour D. Organizing moving groups during morphogenesis // Curr. Opin. Cell Biol. 2006. V. 18. P. 102-107.

202. Lecaudey V., Cakan-Aktogan G., Norton W.H.J, and Gilmour D. Dynamic Fgf signaling couples morphogenesis and migration in the zebrafish lateral line primordium // Development. 2008. V. 135. P. 2695-2705.

203. Lee J., Ishihara A., Jacobson K. How do cells move along surfaces? // Trends Cell Biol. 1993.V. 3. P. 366-370.

204. Lee J., Leonard M., Oliver T., Ishihara A., Jacobson K. Traction forces generated by locomoting keratinocytes // J.Cell Biol. 1994. V. 127. P. 1957-1964.

205. Legue E., Nicolas J.-F. Hair follicle renewal: organization of stem cells in the matrix and the role of stereotyped lineages and behaviors // Development. 2005. V. 132. P. 4143-4154.

206. Lehman J.M., Laag E., Michaud E.J., Yoder B.K. An essential role for dermal primary cilia in hair follicle morphogenesis // J. Investig. Dermatol. 2009. V. 129. P. 438-448.

207. Levy V., Lindon C., Zheng Y., Harfe B.D., Morgan B.A. Epidermal stem cells arise from the hair follicle after wounding // FASEB J. 2007. V. 21. P. 1358-1366.

208. Li J., Tzu J., Chen Y., Zhang Y.-P., Nguyen N. T., Gao J., Bradley M., Keene D. R., Oro A. E., Miner J. H. and Marinkovich M.P. Laminin-10 is crucial for hair morphogenesis // The EMBO J. 2003. V. 22. No. 10. P. 2400-2410.

209. Li Y., Fan J., Chen M., Li W., Woodley D.T. Transforming growth factor-alpha: a major human serum factor that promotes human keratinocyte migration // J. Investig. Dermatol. 2006. V. 126. P. 2096-105

210. Lichti U., Weinberg W.C., Goodman L., Ledbetter S., Dooley T., Morgan D., Yuspa S.H. In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell population onto nude mice // J. Invest. Dermatol. 1993. V. 101. 124S-129S.

211. Liu Y., Lyle S., Yang Z., Cotsarelis G. Keratin 15 promoter targets putative epithelial stem cells in the hair follicle bulge // J. Invest. Dermatol. 2003. V. 121. P. 963-968.

212. Lohrum M.A.E., Vousden K.H. Regulation and function of the p53-related proteins: same family, different rules // Trends Cell Biol. 2000. V. 10. P. 197-202.

213. Long B.H., Willson J.K.V., Brattain D.E., Musial S., Brattain M.G. Effects of mitomycin on human colon carcinoma cells// J.Natl.Cancer Inst. 1984. V. 73. No. 4. P. 787-792.

214. Lowell S., Jones P., Le Roux I., Dunne J., Watt F.M. Stimulation of human epidermal differentiation by Delta-Notch signaling at the boundaries of stem-cell clusters // Curr. Biol. 2000. V. 10. P. 491-500.

215. Lubarsky B. and Krasnow M.A. Tube morphogenesis: Making and Shaping Biological Tubes // Cell. 2003. V. 112. P. 19-28.

216. Luscher B., Eisenman R.N. New light on myc and myb: l.Myc // Genes and Develop. 1990. V. 4. No. 12a. P. 2025-2035.

217. Lyle S., Christofidou-Solomidou M., Liu Y., Elder D.E., Albelda S., Cotsarelis G. The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 // J. Cell Sci. 1998. V. 111. P. 3179-3188.

218. Ma E.Y., Raible D.W. Signaling pathways regulating zebrafish lateral line development // Curr Biol. 2009. V. 19(9). R381-386.

219. Maas-Szabowski N., Stark H-J., Fusenig N.E. Keratinocyte growth regulation in defined organotypic cultures through IL-1-induced keratinocyte growth factor expression in resting fibroblasts // J. Invest. Dermatol. 2000. V. 114. P. 1075-1084.

220. Mackenzie I.C., Bickenbach J.R. Label-retaining keratinocytes and Langerhans cells in mouse epithelia // Cell Tissue Res. 1985.V. 242. P. 551-556.

221. Madri J.A., Pratt B.M., Tucker A.M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-(3 depends upon the composition and organization of the extracellular matrix//J.Cell Biol. 1988. V. 106. P. 1375-1381.

222. Magee A.I., Lytton N.A., and Watt F.M. Calcium -induced changes in cytoskeleton and motility of cultured human keratinocytes //Exp. Cell Res. 1987. V. 172. P. 43-53.

223. Mahan J.T., Donaldson D.J. Events in the movement of newt epidermal cells across implanted substrates// J. Exper. Zool. 1986. V. 237. No.l. P. 35-44.

224. Malcovati M., Tenchini M.L. Cell density affects spreading and clustering, but not attachment, of human keratinocytes in serum-free medium // J. Cell Sci. 1991. V. 99. P. 387-395.

225. Mansbridge J.N., Knuchel R., Knapp A.M., Sutherland R.A., Modulation of EGF signal transduction by cell-cell contacts and microenvironments: Involvement of tyrosine phosphatases// J.Cell.Physiol. 1992. V. 151. P. 433-442.

226. Mansbridge J.N., Knapp A.M. Changes in keratinocyte maturation during wound healing // J. Investig. Dermatol. 1987. V. 89. P. 253-263.

227. Marchese C., Chedid M., Dirsh O.R. et al. Modulation of keratinocyte growth factor and its receptor in epithelializing human skin // J. Exp. Med. 1995. V. 182. P. 1369-1376.

228. Martin P. Wound healing: aiming for perfect skin regeneration // Science. 1997. V. 276. P. 75-81.

229. Martin P. and Parkhurst S.M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis // Development. 2004. V. 131. P. 3021-3034.

230. Matsumoto K., Hashimoto K., Hashiro M. et al. Modulation of growth and differentiation in normal human keratinocytes by transforming growth factor 3 // J. Cell.Physiol. 1990. V. 145. No. 1. P. 95-101.

231. Matsumoto K., Hashimoto K., Yoshikawa K., Nakamura T. Marked stimulation of growth and motility of human keratinocytes by hepatocyte growth factor // Exp. Cell Res. 1991. V. 196. P. 114-120.

232. McCarthy J.B., Sas D.F., Furcht L.T. Mechanisms of parenchymal cell migraton into wounds// In: "The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair", Ed.: Clark & Henson. 1988. P. 281-319.

233. McConkey D.J., Orrenius S. Signal transduction pathways to apoptosis //Trends in Cell. Biol. 1994. V. 4. P. 370-375.

234. McElwee K.J., Kissling S., Wenzel E., Huth A., Hoffman R. Cultured peribulbar dermal sheath cells can induce hair follicle development and contribute to the dermal sheath and dermal papilla // J. Invest. Dermatol. 2003. V. 121. P. 1267-1275.

235. McGaw W.T., Ten Cate A.R. A role for collagen phagocytosis by fibroblasts in scar remodeling: an ultrastructural stereologic study // J Invest Dermatol. 1983. V. 81(4). P. 375-378.

236. McMinn J.M.H., Pritchard J.J. Tissue Repair. Academic Press, N. Y., 1972, pp. 1-76.

237. McNeill H., Jensen P.J. A high-affinity receptors for urokinase plasminogen activator on human keratinocytes: characterization and potential modulation during migration// Cell Regulation. 1990. V. 31. P. 843-852.

238. McNeil P.L., Muthukrishcan L., Warder E., D'Amore. Growth factors are released by mechanically wounded endothelial cells // J.Cell Biol. 1989. V. 109. P. 811-822.

239. Meili R. and Firtel R.A. Follow the leader // Dev. Cell. 2003. V. 4. P. 291-293.

240. Messenger A.G. Hair follicle tissue culture // Br J Dermatol. 1985. V. 113. P. 639-640.

241. Messenger A.G., Jennifer H.Sr., Bleehen S.S. The in vitro properties of dermal papilla cell lines established from human hair follicles. Br J Dermatol. 1986. V. 114. P. 425-430.

242. Michel M, L'Heureux N, Auger F.A, and Germain L. From newborn to adult: phenotypic and functional properties of skin equivalent and human skin as a function of donor age // J. Cell. Physiol. 1997. V. 171. P. 179-189.

243. Mildner M, Eckhart L, Lengauer B, Tschachler E. Hepatocyte growth factor/scatter factor inhibits UVB induced apoptosis of human keratinocytes via the PI-3-kinase pathway // J Invest Dermatol. 1999. V. 113(6). P. 11361137.

244. Millar S.E. Molecular mechanisms regulating hair follicle development // J. Investig. Dermatol. 2002. V. 118. P. 216-225.

245. Mills A.A, Zheng B.H, Wang X.J. et al. P63 is a p53 homologue required for limb and epidermal morphogenesis //Nature. 1999. V. 398. P. 708-713.

246. Milo G.E, Ackerman C.A, Noyes J. Growth and ultrastructural characterization of proliferating human keratinocytes in vitro without added extrinsic factors // In Vitro. 1980. V. 16. P. 20-30.

247. Moll R, Franke W.W, Schiller D.L. et al. The catalog of human cytokeratins: Patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells // Cell. 1982. V. 31. P. 11-24.

248. Moll R, Moll I, and Wiest W. Changes in the pattern of cytokeratin polypeptides in epidermis and hair follicles during skin development in human fetuses // Differentiation. 1982. V. 23. P. 170-178.

249. Montell D.J. Border cell migration. The race is on // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003. V. 4. P. 13-24.

250. Montell D.J. Morphogenetic cell movements: diversity from modular mechanical properties // Science. 2008. V. 322. P. 1502-1505.

251. Montell D.J., Rorth P., Spradling A.C. Slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP // Cell. 1992. V. 71. P. 51-62.

252. Montesano R, Matsumoto K, Nakamura T, Orci L. Identification of a fibroblast-derived epithelial morphogen as hepatocyte growth factor //Cell. 1991a. V. 67(5). P. 901-908.

253. Montesano R, Schaller G, Orci L. Induction of epithelial tubular morphogenesis in vitro by fibroblast-derived soluble factors //Cell. 1991b. V. 66(4). P. 697-711.

254. Morris R.J., Liu Y., Maries L., Yang Z., Trempus C., Li S., Lin J.S., Sawicki J.A., Cotsarelis G. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells // Nat. Biotech. 2004. V. 22. P. 411-417.

255. Morton D.M., and Tchao R. Regulation of motility and cytoskeleton organization of rat bladder carcinoma cells by cyclic AMP. //Cell Motility and Cytoskeleton. 1994. V. 29. P. 375-382.

256. Murphy G., Gavrilovic J. Proteolysis and cell migration: creating a path? // Curr Opin Cell Biol. 1999. 11. P. 614-621.

257. Murphy-Ullrich J.E., Lightner V.A., Aukhil I., Yan Y.Z., Erickson H.P., and Hook M. Focal adhesion integrity is downregulated by the alternatively spliced domain of human tenascin//J.Cell Biol. 1991. V. 115. P. 1127-1136.

258. Nabeshima K., Shimao Y., Inoue T., Itoh H., Kataoka H., Kooono M. Hepatocyte growth factor /scatter factor induces not only scatterring but also cohort migration of human colorectal-adenocarcinoma cells //Int. J. Cancer. 1998. V. 78. N. 6. P. 750-759.

259. Nakamura T., Nawa K., Ichihara A. et al. Purification and subunit structure of hepatocyte growth factor from rat platelets // FEBS. 1987. V. 224(2). P. 311-316.

260. Naldini L., Weidner K.M., Vigna E. et al. Scatter factor and hepatocyte growth factor are indistinguishable ligands for the MET receptor // EMBO J. 1991. V. 10(10). P. 2867-2878.

261. Natarajan E., Saeb M., Crum C. P., Woo S. B., McKee P. H., and Rheinwald J.

262. G. Co-Expression of pl6INK4A and Laminin 5 y2 by Microinvasive and Superficial Squamous Cell Carcinomas in Vivo and by Migrating Wound and Senescent Keratinocytes in Culture // Am. J Pathol. 2003. V. 163. No. 2. P. 477491.

263. Niemann C., Brinkmann V., Spitzer E., Hartmann G., Sachs M., Naundorf

264. H., Birchmeier W. Reconstitution of mammary gland development in vitro: requirement of c-met and c-erbB2 signaling for branching and alveolar morphogenesis // J Cell Biol. 1998. V. 143(2). P. 533-45.

265. Nguyen H., Rendl M., Fuchs E. Tcf3 Governs stem cell features and represses cell fate determination in skin // 2006. Cell. V. 127. P. 171-183.

266. Nishida T., Nakamura M., Ofuji K., Reíd T.W., Mannis M.J., and Murphy J. Synergetic effects of Substance P with insulin-like growth factor-1 on epithelial migration of the cornea // J.Cell.Physiol. 1996. V. 169. P. 159-166.

267. Nishikawa T., Kobayashi H., Yasuda H. et al. Ras gene expression in the regenerating epidermis// J. Invest. Dermatol. 1989. V. 92. P. 491.

268. Nose A., Nagafuchi A., Takeichi M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model system // Cell. 1988. V 54. P. 993-1001.

269. Odland G., Ross R. Human wound repair. 1. Epidermal regeneration //J.Cell Biol. 1968.V. 39.P. 135-151.

270. Oakley C. and Brunette D.M. Response of single, pairs, and clusters of epithelial cells to substratum topography// Biochem.Cell Biol. 1995. V. 73. P. 473489.

271. O'Connor N.E., Mulliken J.B., Banks-Schlegel S., Kehinde O., Green H. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal cells//Lancet. 1981. V. l.P.75-78.

272. Ogata R. Type IV collagen and laminin enhance the motility, adhesion, and proliferation of hepatoma cells. //Kurume Med J. 1998. V. 45. N 1. P. 11-20.

273. Oh H.S. and Smart R.C. An estrogen receptor pathway regulates the telogen-anagen hair follicle transition and influence epidermal cell proliferation // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996; V. 93. P. 12525-12530.

274. Ojakian G.K., Schwimmer R. Regulation of epithelial cell surface polarity reversal by beta 1 integrins //J Cell Sci. 1994. V. 107. (Pt 3). P. 561-576.

275. O'Kane S., Ferguson M.W. Transforming growth factor beta s and wound healing // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1997. V. 29 P. 63-78.

276. O'Keefe E.J., Payne R.E., Russell N. Keratinocyte growth-promoting activity from human placenta // J. Cell. Physiol., 1985a. V. 124. P. 439-445.

277. O'Keefe E. J., Payne R. E. Jr., Russell N., Woodley D. T. Spreading and enhanced motility of human keratinocytes on fibronectin //J. Invest. Dermatol. 1985b. V. 85 (2). P. 125-130.

278. Oliver R.F. The induction of hair follicle formation in the adult hooded rat by vibrissa dermal papillae // J. Embryol. Exp. Morphol. 1970. V. 23. P. 219-236.

279. Oliver R.F. Histological studies of whisker regeneration in the hooded rat // J. Embryol. Exp. Morphol. 1996. V. 16. P. 231-244.

280. Oliver, R.F. Whisker growth after removal of the dermal papilla and lengths of follicle in the hooded rat // J. Embriol. Exp. Morphol. 1966. V. 15. P. 331-347.

281. Ohyama M., Terunuma A., Tock C.L., Randonovich M.F., Pise-Masison C.A., Hopping S.B., Brady J.N., Udey M.C., Vogel J.C. Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells // J. Clin. Invest. 2006. V.l 16. P. 249-260.

282. Ortonne J.P., Loning T., Schmitt D., Thivolet J. Immunomorphological and ultrastructural aspects of keratinocyte migration in epidermal wound healing // Virchows Arch A Pathol Anat Histol. 1981. V. 392(2). P. 217-230.

283. Oshima R.G. Apoptosis and keratin intermediate filaments // Cell Death and Differentiation. 2002. V. 9. P. 486-492.

284. Oshima H., Rochat A., Kedzia C., Kobayashi K., Barrandon Y. Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells // Cell. 2001. V. 104. P. 233-245.

285. Osorio KM, Lilja KC, Tumbar T. Runxl modulates adult hair follicle stem cell emergence and maintenance from distinct embryonic skin compartments // J Cell Biol. 2011. 193(1). P. 235-250.

286. Otoole E.A., Marinkovich M.P., Hoeffler W.K., Furthmayr H., Woodley D.T. Laminin-5 inhibits human keratinocyte migration// Exp.Cell Res. 1997. V. 233. No. 2. P. 330-339.

287. O'Toole E.A. Extracellular matrix and keratinocyte migration // Clin Exp Dermatol. 2001. V. 26. P. 525-530.

288. Pastor-Pareja J.C., Grawe F., Martin-Blanco E. and Garcia-Bellido A. Invasive cell behavior during Drosophila imaginal disc eversión is mediated by the JNK signaling cascade // Dev. Cell. 2004. V. 7. P. 387-399.

289. Patel G.K., Wilson C.H., Harding K.G., Finlay A.Y. Bowden P.E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization // J. Investig. Dermatol. 2006. V. 126. P. 497-502.

290. Patel V.N., Rebustini I.T., Matthew P. Salivary gland branching morphogenesis //Differentiation. 2006. V. 74. P. 349-364.

291. Paus R., Hanjiski B., Eichmuller S., and Czarnetzki B.M. Chemotherapy-induced alopecia in mice. Induction by cyclophosphamide, inhibition by cyclosporine A, and modulation by dexamethasone // Am. J. Pathol. 1994. V. 144. P. 719-734.

292. Pays L., Hemming F.J., Saxod R. Regulation of the chick cutaneous innervation pattern in retinoic acid-induced ectopic feathers and in the naked neck mutant // Int J Dev Biol. 1997. V. 41(4). P. 575-579.

293. Pearton D.J., Yang Y., and Dhouailly D. Transdifferentiation of corneal epithelium into epidermis occurs by means of a multistep process triggered by dermal developmental signals // Proc. Natl. Acad. Sci. 2005. V. 102. No. 10. P. 3714-3719.

294. Peehl D.M., Ham R.G. Clonal growth of human keratinocytes with small amounts of dialyzed serum // In Vitro. 1980a. V.16(6). P. 526-540.

295. Peehl D.M., Ham R.G. Growth and differentiation of human keratinocytes without a feeder layer or conditioned medium // In Vitro. 1980b. V. 16(6). P. 516525.

296. Pellegrini G., Dellambra E., Golisano O., Martinelli E., Fantozzi I., Bondanza S., Ponzin D., McKeon F., De Luca M. p63 identifies keratinocyte stem cells // Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. P. 3156-3161.

297. Petersson M, Brylka H, Kraus A, John S, Rappl G, Schettina P, Niemann C. TCF/Lefl activity controls establishment of diverse stem and progenitor cell compartments in mouse epidermis // EMBO J. 2011. 30(15). P. 3004-3018.

298. Pittelkow M.R., Wille J.J.Jr., Scott R.E. Two functionally distinct classes of growth arrest states in human keratinocytes that regulate clonogenic potential //J. Invest. Dermatol. 1986. V. 86. P. 410-417.

299. Plowman G.D., Green J.M., McDonald V.L., Neubauer M.G., Disteche C.M., Todaro G.J., Shoyab M. The amphiregulin gene encodes a novel epidermal growth factor-related protein with tumor-inhibitory activity // Mol Cell Biol. 1990. V. 10(5). P. 1969-1981.

300. Pohl M., Sakurai H., Stuart R.O., Nigam S.K. Role of hyaluronan and CD44 in in vitro branching morphogenesis of ureteric bud cells //Dev Biol. 2000. V. 224(2). P. 312-325.

301. Potten C.S. The epidermal proliferative unit: the possible role of the central basal cell // Cell Tissue Kinet. 1974. V. 7. P. 77-88.

302. Potten C.S. Stem cells in epidermis from the back of the mouse // In: Stem Cells: Their Identification and Characterisation. 1983. P. 200-232. Ed. C.S. Potten.

303. Potten C.S., Wichmann H.E., Dobek K., Birch J., Codd T.M. Horrocks L., Pedrick M., Tickle S.P. Cell kinetic studies in the epidermis of mouse. Ill The percent labeled mitosis (PLM) technique // Cell Tissue Kinetics. 1982. V. 18. P. 59-70.

304. Potten C.S., Saffhill R., Maibach H.I. Measurement of the transit time for cells through the epidermis and stratum corneum of the mouse and guinea-pig // Cell Tissue Kinet. 1987. V. 20. P. 461-472.

305. Potten C.S. and Morris R.J. Epithelial stem cells in vivo // J. Cell Sci. Suppl. 1988. V. 10. P. 45-62.

306. Potten C.S., Hendry J. H. Clonogenic cells and stem cells in epidermis // Int. J. Radiat. Biol. 1973. V.24. P. 537-540.

307. Potten C.S. and Hendry J.H. Cryptogenic cells and proliferative cells in intestinal epithelium //Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 1974. V. 6. P. 583-588.

308. Poujade M, Grasland-Mongrain E, Hertzog A, Jouanneau J, Chavrier P, Ladoux B, Buguin A, Silberzan P. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc. Natl. Acad. Sci. 2007. V. 104. No. 41. P. 15988-15993.

309. Prunieras M, Regnier M, Woodley D. Methods of cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface // J. Invest. Dermatol. 1983. V. 81. N 1. P.28s-33s.

310. Putnins EE, Firth JD, Lohachitranont A, Uitto VJ, Larjava H. Keratinocyte growth factor (KGF) promotes keratinocyte cell attachment and migration on collagen and fibronectin // Cell Adhes Commun. 1999. V. 7(3). P. 211-221.

311. Radice G.P. The spreading of epithelial cells during wound closure in Xenopus larvae // Developmental Biol. 1980. V. 76. P. 26-46.

312. Raff M. Social controls on cell survival and cell death // Nature. 1992. V. 356. P. 397-400.

313. Regauer S, Seiler G.R, Barrandon Y, Easley K.W, Compton C.C. Epithelial origin of cutaneous anchoring fibrils // J Cell Biol. 1990. V. 111. P. 2109-2115.

314. Reiss M, Dibble C.L, Narayanam R. Transcriptional activation of the c-myc protooncogene in murine keratinocytes enhances the response to epidermal growth factor//J. Invest. Dermatol. 1989. V. 93. P. 136-141.

315. Reiss M, Zhou Z.-L. Uncoupling of the calcium-induced terminal differentiation and the activation of membrane-associated transglutaminase in murine keratinocytes by type P transforming growth factor // Exp.Cell Res. 1989. V. 183. No. l.P. 101-111.

316. Rendl M, Polak L, Fuchs E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties // Genes Dev. 2008. V. 22. P. 543-557.

317. Reynolds A.J., Jahoda C.A.B. Hair follicle stem cells? A distinct germinative epidermal cell population is activated in vitro by the presence of hair dermal papilla cells // J. Cell Sci. 1991. V. 99. P. 373-385.

318. Rheinwald J.G., Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: The formation of keratinizating colonies from single cells // Cell. 1975. V. 6. P. 331-344.

319. Rheinwald J.G., Green H., Epidermal growth factor and the multiplication of cultured human epidermal keratinocytes //Nature. 1977. V. 265. No. 5593. P. 421-424.

320. Riley P.A., Hola M. Transient intraclonal variation in interdivision time in relation to orientation of cytokinesis of GPK cells in layer culture // Cell and Tissue Kinet. 1983. V. 16. No. 2. P. 189-198.

321. Rizk-Rabin M., Pavlovich J.H. Epidermal calcium-binding protein: A marker of early differentiation of basal layer keratinocytes of rats // Cell and Tissue Res. 1993. V. 272. P.161-168.

322. Rochat A., Kobayashi K., Barrandon Y. Location of stem cells of human hair follicles by clonal analysis // Cell. 1994. V. 76. P. 1063-1073.

323. Rodeck U., Jost M., Kari C., Shih D.T., Lavker R.M., Ewert D.L., Jensen P.J. EGF-R dependent regulation of keratinocyte survival // J. Cell Sci. 1997. V. 110. P. 113-121.

324. Romano R.A., Birkaya B., Sinha S.A functional enhancer of keratin 14 is a direct transcriptional target of Delta.Np63 // J. Invest. Dermatol. 2007. V. 127(5). P. 1175-86.

325. Romano R.A., Ortt K., Birkaya B., Smalley K., Sinha S. An active role of the AN isoform of p63 in regulating basal keratin genes K5 and K14 and directing epidermal cell fate // PloS ONE. 2009. V. 4, e5623. 1-12.

326. Ronfard V., Rives J.M., Neveux Y., Carsin H., Barrandon Y. Long-term regeneration of human epidermis on third degree burns transplanted with autologous cultured epithelium grown on a fibrin matrix // Transplantation. 2000. V. 70. P. 1588-1598.

327. Rosario M., Birchmeier W. How to make tubes: signaling by the Met receptor tyrosine kinase // Trends Cell Biol. 2003. V. 13. P. 328-335.

328. Rosdy M., Bernard B.A., Schmidt R., Darmon M. Incomplete epidermal differentiation of A-431 epidermoid carcinoma cells// In Vitro Cell. & Dev. Biol. 1986. V. 22. No. 5. P. 295-300.

329. Rosen E.M., Meromsky L., Setter E., Vinter D.W., Goldberg I.D. Purified scatter factor stimulates epithelial and vascular endothelial cell migration // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1990a. V. 195. P. 34-43.

330. Rosen E.M., Goldberg I.D., Liu D., Setter E., Donovan M.A., Bhargava M., Reiss M., Kacinski B. Tumor necrosis factor stimulates epithelial tumor cell motility//Cancer Res. 1991. V. 51. P. 5315-5321.

331. Rubin J.S., Osada H., Finch P.W., Taylor W.G., Rudikoff S., and Aaronson S.A. Purification and characterization of a newly identified growth factor specific for epithelial cell s// Proc.Natl.Acad.Sci. 1989. V. 86. P. 802-806.

332. Rufaut N.W., Goldthorpe N.T., Wildermoth J.E., Wallace O.A. Myogenic differentiation of dermal papilla cells from bovine skin // J Cell Physiol. 2006. V. 209. P. 959-66.

333. Sakurai H, Tsukamoto T, Kjelsberg CA, Cantley LG, Nigam SK. EGF receptor ligands are a large fraction of in vitro branching morphogens secreted by embryonic kidney. //Am J Physiol. 1997a. V. 273(3 Pt 2). P. 463472.

334. Sakurai H., Elvino J. Barros, Tsukamoto T. et al. An in vitro tubulogenesis system using cell lines derived from the embryonic kidney shows dependence on multiple soluble growth factors // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997b. V. 94. P. 6279-6284.

335. Sancho E., Batlle E., Clevers H. Live and let die in the intestinal epithelium // Curr. Opin. Cell Biol. 2003. V. 15(6). P. 763-770.

336. Sanders E.J. The roles of epithelial-mesenchymal cell interactions in developmental processes // Biochem Cell Biol. 1988. V. 66(6). P. 530-40.

337. Santos O.F., Nigam S.K. HGF-induced tubulogenesis and branching of epithelial cells is modulated byextracellular matrix and TGF-beta // Dev Biol. 1993. V. 160(2). P. 293-302.

338. Santoro M.M., Gaudino G. Cellular and molecular facets of keratinocyte reepithelization during wound healing // Exp. Cell Res. 2005. V. 304. P 274286.

339. Sarret Y., Stamm C., Jullien D., Schmitt D. Keratinocyte migration is partially supported by the cell-binding domain of fibronectin and is RGDS-dependent. //J. Invest. Dermatol. 1992. V. 99. N 5. P. 656-659.

340. Schmidt G.H., Blount M.A., Ponder B.A. Immunochemical demonstration of the clonal organization of chimeric mouse epidermis // Development. 1987. V. 100. P. 535-541.

341. Schmidt-Ullrich R, Paus R. Molecular principles of hair follicle induction and morphogenesis // Bioassays. 2005. V. 27(3). P. 247-61.

342. Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell // Blood cells. 1978. V. 4. P. 7-25.

343. Schmidt-Ullrich R. and Paus R. Molecular principles of hair follicle induction and morphogenesis // BioEssays. 2005. V. 27. P. 247-261.

344. Semenova E., Koegel H., Hasse S. et al., Overexpression of mIGF-1 in keratinocytes improves wound healing and accelerates hair follicle formation and cycling in mice. Am // J. Pathol. 2008. V. 173. No. 5. P. 1295-1310.

345. Senoo M., Pinto F., Crum C.P., and McKeon F., p63 is essential for the proliferative potential of stem cells in stratified epithelia // Cell. 2007. V. 129. P. 523-536.

346. Shaw T.J. and Martin P. Wound repair at a glance // J. Cell Sci. 2009. V. 122. P. 3209-3213.

347. Sherley J.L. Asymmetric cell kinetics genes: the key to expansion of adult stem cells in culture // Stem Cells. 2002. V. 20. P. 561-572.

348. Shimomura Y., Christiano A.M. Biology and genetics of hair // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2010. V. 11. P. 109-132.

349. Shimomura Y., Wajid M., Shapiro L., Christiano A.M. P-cadherin is a p63 target gene with a crucial role in the developing human limb bud and hair follicle // Development. 2008. V. 135. P. 743-753.

350. Shipley G.D., Pittelkow M.R., Wille J.J.,Jr. et al. Reversible inhibition of normal prokeratinocyte proliferation by type (3 transforming growth factor -growth inhibitor in serum-free medium // Cancer Res. 1986. V. 40. P. 2068-2071.

351. Shirakata Y. Regulation of epidermal keratinocytes by growth factors // J. Dermatol Sci. 2010. V. 59. P. 73-80.

352. Shirakata Y., Ueno H., Hanakawa Y., Kameda K., Yamasaki K., Tokumaru S., et al. TGF-beta is not involved in early phase growth inhibition of keratinocytes by 1 alpha, 25(OH)2vitamin D3 // J. Dermatol Sci. 2004. V. 36. P. 41-50.

353. Siekmann A.F. & Lawson N.D. Notch signaling limits angiogenic cell behaviour in developing zebrafish arteries // Nature. 2007. V. 445. P. 781-784.

354. Singer S.J., Kupfer A. The directed migration of eukaryotic cells // Ann.Rev. Cell Biol. 1986. V. 2. P. 337-365.

355. Slack J.M.W. Stem Cells in Epithelial Tissues // Science. 2000. V. 287. P. 1431-1433.

356. Smola H., Thiekotter G., and Fusenig N. E. Matual induction of growth factor gene expression by epidermal-dermal cell interaction. //J. Cell Biol. 1993. V. 122. P. 417-429.

357. Soriano J.V., Pepper M.S., Nakamura T., Orci L., Montesano R. Hepatocyte growth factor stimulates extensive development of branching duct-likestructures by cloned mammary gland epithelial cells //J Cell Sci. 1995. V. 108 (Pt 2). P. 413-430.

358. Soucy P.A., Romer L.H. Endothelial cell adhesion, signaling, and morphogenesis in fibroblast-derived matrix // Matrix Biol. 2009. V. 28. P. 273283.

359. Stasiak P.C., Purkis P.E., Leigh I.M. and Lane E.B. Keratin 19: predicted amino acid sequence and broad tissue distribution suggest it evolved from keratinocyte keratins // J. Invest. Dermatol. 1989. V. 92. P. 707-716.

360. Stocker M. Effect of scatter factor on motility of epithelial cells and fibroblasts. //J. Cell Phisiol. 1989. V. 139. P. 565-569.

361. Stoker M., Gherardi E., Rennyman M., Gray J. Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell motility // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 327. P. 239-242.

362. Sudbeck B.D., Parks W.C., Welgus H.G., Pentland A.P. Collagen-stimulated induction of keratinocyte collagenase is mrdiated via tyrosine kinase and protein kinase C activities// J.Biol.Chem. 1994. V. 269. No. 47. P. 30022-30029.

363. Sutherland D., Samakovlis C. and Krasnow M. Branchless encodes a Drosophila FGF homolog that controls tracheal cell migration and the pattern of branching//Cell. 1996. V. 87. P. 1091-1102.

364. Sutherland J., Denyer M., Britland S. Motogenic substrata and chemokinetic growth factors for human skin cells // J Anat. 2005. V. 207(1). P. 67-78.

365. Tani H., Morris R.J., Kaur P. Enrichment for murine keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype //'Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 10960-10965.

366. Tanner K, Ferris DR, Lanzano L, Mandefro B, Mantulin WW, Gardiner DM, Rugg EL, Gratton E. Coherent movement of cell layers during wound healing by image correlation spectroscopy // Biophys J. 2009. V. 97(7). P. 2098-106.

367. Taylor G., Lehrer M.S., Jensen P.J., Sun T.T., Lavker R.M. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis // Cell.-2000.-V. 102.-P. 451-61.

368. TeepeR.G.C., Kreis R.W., Koebrugge E.J., Kempenaar J.A., Vloemans

369. A.F.P.M., Hermans R.P., Boxma H., Dokter J., Hermans J., Ponec M., Vermeer

370. B.J. . The use of cultured autologous epidermis in the treatment of extensive burn wounds // J.Trauma. 1990. V. 30. P. 269-275.

371. Terskikh V.V., Vasiliev A.V. Cultivation and transplantation of epidermal keratinocytes//Int. Rev. Cytol. 1999. V. 188. P. 41-72.

372. Thomas L.A., Yamada K.M. Contact stimulation of cell migration // J. Cell Sci. 1992. V. 103. P. 1211-1214.

373. Thompson C.H., Rose B.R., Cossart Y.E. Optimised growth of human epidermal cells in vitro without the use of a feeder layer or collagen substrate // Aust J Exp Biol Med Sci. 1985. V. 63. P. 147-156.

374. Tiede S., Kloepper J.E., Bodo E., Tiwari S., Kruse C., Paus R. Hair follicle stem cells: Walking the maze // Eur. J. Cell Biol. 2007. V. 86. P. 355-376.

375. Tong X. and Coulombe P.A. Keratin 17 modulates hair follicle cycling in a

376. TNFalpha-dependent fashion. Genes Dev 2006. V. 20. P. 1353-1364.

377. Trinkaus J.P. Cells into organs. The forces that shape the embryo // Prentice-Hall, Englewood Cliffs, New Jersey, 1984.

378. Truong A.B., Kretz M, Ridky T.W, Kimmel R, Khavari P.A. p63 regulates proliferation and differentiation of developmentally mature keratinocytes // Genes Dev. 2006. V. 20. P. 3185-3197.

379. Tsujioka M. Cell migration in multicellular environments // Dev Growth Differ. 2011. V. 53(4). P. 528-537.

380. Tucker S.P, Melsen L.R, Compans R.W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size// Eur.J.Cell Biol. 1992. V. 58. P. 280-290.

381. Tumbar T, Guasch G, Greco V, Blanpain C, Lowry W.E, Rendl M, and Fuchs E. Defining the epithelial stem cell niche in skin // Science. 2004. V. 303. P. 359-363.

382. Turksen K, Youngsook C, Fuchs E. Transforming growth factor alpha induces collagen degradation and cell migration in differentiating human epidermal raft cultures // Cell Regulation. 1991. V. 2. P. 613-625.

383. Vainio S, Lehtonen E, Jalkanen M, Bernfield M, Saxen L. Epithelial-mesenchymal interactions regulate the stage-specific expression of a cell surface proteoglycan, syndecan, in the developing kidney // Dev. Biol. 1989. V. 134. P. 382-391.

384. Van Ruissen F., Van Erp P.E.J., De Jongh G.J. et al. Cell kinetic characterization of growth arrest in cultured human keratinocytes // J.Cell Sci. 1994. V. 10. P. 2219-2228.

385. Van Muijen G.N., Warnaar S.O., Ponec M. Differentiation-related changes of cytokeratin expression in cultured keratinocytes and in fetal, newborn, and adult epidermis // Exp Cell Res. 1987. V. 171. P. 331-345.

386. Vasiliev J.M., Gelfand I.M., Domina L.V., and Rappaport R.I. Wound healing processes in cell culture // Exp. Cell Res. 1969. V. 54. P. 83-93.

387. Vaughan P.B., Trinkaus J.P. Movement of epithelial cell sheets in vitro // J. Cell. Sci. 1996. V. 1. P. 227-234.

388. Vicente-Manzanares M., Choi C.K., Horwitz A.R. Integrins in cell migration -the actin connection // J. Cell Sci. 2009. V. 122(Pt 2). P. 199-206.

389. Vitorino P. and Meyer T. Modular control of endothelial sheet migration // Genes&Dev. 2008. V. 22. P. 3268-3281.

390. Vlodavsky I., Bar-Shavit R., Ishai-Michaeli R., Bashkin P., Fuks Z. Extracellular sequestration and release of fibroblast growth factor: a regulatory mechanism? // Trends Biochem Sci. 1991. V. 16(7). P. 268-271.

391. Waseem A., Dogan B., Tidman N., Alam Y., Purkis P., Jackson S. et al. Keratin 15 expression in stratified epithelia: downregulation in activated keratinocytes // J. Invest. Dermatol. 1999. V. 112. P. 362-369.

392. Watt F.M. Selective migration of terminally differentiating cells from the basal layer of cultured human epidermis// J.Cell Biol. 1984. V. 98. P. 16-21.

393. Watt F. M. Influence of cell shape and adhesiveness on stratification and terminal differentiation of human keratinocytes in culture// J. Cell Sci. 1987. Suppl. 8. P. 313-326.

394. Watt F. Epidermal stem cells: markers, patterning and the control of stem cell fate // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 1998.V. 353(1370). P. 831-837.

395. Watt F.M., Hoggan BLM. Out of Eden: stem cells and their niches // Science. 2000. V 287. P 1427-1430.

396. Watt F.M., Jensen K.B. Epidermal stem cell diversity, quiescence and versatility // EMBO Mol. Med. 2009. 1(5). P. 260-267.

397. Watt F., Celso C.L., and Silva-Vargas V. Epidermal stem cells: an update // Curr Opinion in Gen & Dev. 2006. V. 16. P. 518-524.

398. Webb A., Li A., Kaur P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin // Differentiation. 2004. V. 72. P. 387-395.

399. Wessells N.K., Roessner K.D. Nonproliferation in dermal condensations of mouse vibrissae and pelage hairs // Develop. Biol. 1965. V. 12. P. 419-433.

400. Wheelock M.J., Jensen P.J. Regulation of keratinocyte intercellular junction organization and epidermal morphogenesis by E-cadherin// J. Cell Biol. 1992. V. 117. P. 415-425.

401. Wilke M.S., Hsu B.M., Scott R.E. Two subtypes of reversible cell cycle restriction points exist in cultured normal human keratinocyte progenitor cells // Lab.Invest. 1988. V. 58. No 6. P. 660-665.

402. Wilson P.D., Burrow C.R. Cystic diseases of the kidney: role of adhesion molecules in normal and abnormal tubulogenesis // Exp Nephrol. 1999. V. 7(2). P. 114-124.

403. Wilson A.J., Gibson P.R. Epithelial migration in the colon: filling in the gaps// Clin.Sci. 1997. V. 93. No. 2. P. 97-108.

404. Winkler M.E., O'Connor L., Winget M., Fendly B. Epidermal growth factor and transforming growth factor a bind differently to the epidermal growth factor receptor // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 6373-6378.

405. Wolf K., Wu Y.I., Liu Y., Geiger J., Tam E., Overall C., Stack M.S., Friedl P. Multi-step pericellular proteolysis controls the transition from individual to collective cancer cell invasion //Nature Cell Biol. 2007. V. 9. P. 893-904.

406. Woodley D.T., Bachmann P.M., O'Keefe E.J. Laminin inhibits human keratinocyte migration//J.Cell.Physiol. 1988. V. 136. P. 140-146.

407. Wu J.J., Liu R.Q., Lu Y.G., Zhu T.Y., Cheng B., Men X // Arch. Dermatol. Res. 2005. V. 297. P. 60-67.

408. Xia Y. and Karin M. The control of cell motility and epithelial morphogenesis by Jun kinases // Trends in Cell Biology. 2004. V. 14(2). P. 94-101.

409. Yamanishi K., Liew F.M., Hosokawa Y. et al. Growth advantage by overexpression of normal Harvey ras proto-oncogene in cultured at epidermal keratinocytes // Arch.Dermatol.Res. 1990. V. 282. P. 330-334.

410. Yang C.-C. and Cotsarelis G. Review of hair follicle dermal cells // J. Dermatol. Sei. 2010. V. 57. P. 2-11.

411. Yang A., McKeon F. p63 and p73: p53 mimics, menaces and more // Nature Rev: Molec. Cell Biol. 2000. V. 1. P. 199-207.

412. Yang A., Kaghad M., Wang Y. et al. p63, a p53 homolog at 3q27-29, encodes multiple products with transactivating, death-inducing, and dominant-negative activities // Molecular Cell.1998. V. 2. P. 305-316.

413. Yang A., Schweitzer R., Sun D., Kaghad M., Walker N., Bronson R.T., Tabin C., Sharpe A., Caput D., Crum C. et al. p63 is essential for regenerative proliferation in limb, craniofacial and epithelial development //Nature. 1999. V. 398. P. 714-718.

414. Yang E.Y., Moses H.L. Transforming growth factor ßl-induced changes in cell migration, proliferatiion, and angiogenesis in the chiicken chorio allantoic membrane//J.Cell Biol. 1990. V. 111. P. 731-741.

415. Yung S., Davies M. Response of the human peritoneal mesothelial cell to injury: an in vitro model of peritoneal wound healing //Kidney Int. 1998. V. 54(6). P. 2160-2169.

416. Zahm J.M., Kaplan H., Herard A. L., Doriot F., Pierrot D., Somelette P., Puchelle E. Cell migration and proliferation during the in vitro wound repair of the respiratory epithelium // Cell Motil. & Cytoskel. 1997. V. 37. N. 1. P. 33-43.

417. Zegers M.M., O'Brien L.E., Yu W., Datta A., Mostov K.E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro // Trends Cell Biol. 2003. V. 13. P. 169-176.

418. Zhang K., Kramer R.H. Laminin-5 deposition promotes keratinocyte motility // Exp Cell Res. 1996. V. 227. P. 309-322.

419. Zhao M., Song B., Pu J., Forrester J.V. and McCaig C.D. Direct visualization of a stratified epithelium reveals that wounds heal by unified sliding of cell sheets. FASEB J. 2003. V. 17. P. 397-406.

420. Zheng Y., Du X., Wang W., Boucher M., Parimoo S., Stenn K. Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells // J. Invest. Dermatol. 2005. V. 124. P. 867-876.

421. Zheng J., Siren V., Vaher A. Keratinocyte growth factor enhances urokinase-type plasminogen activator activity in HPV16 DNA-immortalized human uterine exocervical epithelial cells // Europ.J.Cell Biol. 1996. V. 69. No. 2. P. 128-134.

422. Zieske J.D., Bukusoglu G., Gipson I.K. Enhancement of vinculin synthesis by migrating stratified squamous epithelium // J.Cell Biol. 1989. V. 109. P. 571-576.

423. Zuk P., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J., Katz A., Benhaim P., Lorenz H., Hedrick M. Multilineage cells from adipose tissue: implication for cell-based therapies // Tissue Eng. 2001. V. 7. P. 211-228.