Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Научно-методологические основы комплексной технологии получения биологически активных веществ из рекомбинантных штаммов - продуцентов эпидермального фактора роста

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Научно-методологические основы комплексной технологии получения биологически активных веществ из рекомбинантных штаммов - продуцентов эпидермального фактора роста"

На правах рукописи

^ чН^ ОФ

сснш- тоо V

НИКИТИНА ЗОЯ КИМОВНА

НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОМПЛЕКСНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ - ПРОДУЦЕНТОВ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА.

03.00.23. - Биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2000 г.

Работа выполнена в Научно-исследовательском и учебно-методическом Центре биомедицинских технологий

Научный консультант:

доктор технических наук, профессор, академик РАМН

Быков Валерий Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Амбросов Валерий Антонович

доктор медицинских наук, профессор

Далии Михаил Викторович

доктор биологических наук, профессор

Сазыкин Юрий Осипович

Ведущее учреждение:

Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ

Защита состоится 2000 г. в ¥ часов на заседании дис-

сертационного совета Д 053.34.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева (125047, Москва, Миусская пл., 9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан <.<{/-$ »О^и/С^п 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

И.И. Гусева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одним из путей совершенствования лекарственных средств, имеющихся в арсенале современной медицины, является использование для создания фармакологических препаратов новых, ранее не использовавшихся групп биологически активных веществ. К числу таких веществ можно отнести ростовые факторы. К ростовым факторам традиционно относят вещества пептидной или гликопротеидной природы, вырабатываемые в организме и способные в наномолярных концентрациях опосредованно за счет их связывания со специфическими рецепторами, расположенными на поверхности клеточных мембран, стимулировать синтез ДНК и пролиферацию клеток. Ростовые факторы участвуют в таких процессах, как эмбрио- и онтогенез, регенерация, иммунный ответ. Открытия последнего десятилетия значительно расширили представления о роли этих биологически активных веществ в развитии многих патологий, например, воспалительных и шоковых реакциях, дистрофических процессах, онкологических заболеваниях, склеродермии, остеопорозах и многих других. Такой широкий диапазон биологических эффектов определяет и большой интерес к ним как к основе для создания новых фармакологических препаратов.

Однако следует отметить, что до сих пор лекарственные средства на основе ростовых факторов не вошли в широкую медицинскую практику. Основной причиной такого положения является крайне низкое содержание этих веществ в биологических тканях и жидкостях, составляющее обычно мкг/г ткани, что делает нерентабельным выделение и очистку ростовых факторов из биологического материала, а, следовательно, и разработку на их основе лекарственных препаратов. Только с созданием рекомбинантных штаммов микроорганизмов, способных синтезировать ростовые факторы, появилась возможность получения этих пептидов в количествах, необходимых для проведения доклинических и клинических испытаний.

Одним из таких ростовых факторов является эпидермальный фактор роста (ЭФР) - видоспецифичный пептид с молекулярной массой около 6 кДа. В многочисленных экспериментальных работах показана способность ЭФР стимулировать регенерацию эпителиальных клеток, заживление язв желудка и двенадцатиперстной кишки, восстановление поврежденной роговицы глаз, что позволяет предполагать возможность его широкого использования в медицине. Кроме того, в последние годы в нашей стране получены перспективные рекомбинантные штаммы, в том числе на основе непатогенных микроорганизмов - дрожжей ЗассЬаготусез сегеу1з!ае, способные синтезировать ростовой фактор человека (чЭФР) и секретировать его в культуральную жидкость. Однако для получения чЭФР необходимо было разработать новые технологии, обеспечивающие сохранение секретирующей способности штаммов-продуцентов и включающие оригинальные методы выделения, очистки, контроля и стандартизации ростового фактора, в том числе с использованием биотест-систем. До сих пор подобной технологии получения ЭФР, а также лекарственных и диагностических средств на его основе с использованием указанных рекомбинантных штаммов разработано не было. Это направление является актуальным также в связи с тем, что позволяет создать комплексную технологию переработки микроорганизмов за счёт выделения ростового фактора из культуральной жидкости и других биологически активных веществ из отработанной биомассы.

В связи с этим целью настоящей диссертационной работы являлось изучение биологических особенностей рекомбинантных штаммов БассИаготусеБ сегеу^ае - продуцентов эпидермального фактора роста и разработка научно-методических основ комплексной технологии получения чЭФР и других биологически активных веществ, перспективных для медицинской практики.

В задачи настоящего исследования вошли:

1.Разработка методологии отбора наиболее перспективных дрожжевых штаммов-продуцентов и способов их консервации, обеспечивающих сохранение жизнеспособности и специфической секретирующей активности микроорганизмов.

2.Исследование возможностей экзогенной регуляции рекомбинантных штаммов ЗассЬаготусез сегеу^ае и выбор параметров, позволяющих оптимизировать условия культивирования и увеличить продуктивность микроорганизмов.

3.Разработка методов выделения, очистки и стандартизации эпидер-мальиого фактора роста из культуральной жидкости рекомбинантных штаммов ЗассЬаготусея сегеу)яте.

4.Разработка способов комплексной переработки рекомбинантных штаммов дрожжей за счет выделения чЭФР из культуральной жидкости и биологически активных веществ из отработанной биомассы, а также использования отходов биотехнологического процесса в качестве компонентов питательных сред.

5.Конструирование эритроцитарных диагностических тест-систем, позволяющих определять ростовой фактор в культуральной жидкости на различных этапах процесса получения чЭФР.

6.Разработка и апробация биотест-системы для изучения действия ЭФР на процессы метаболизма клеток животных и человека.

7.Изучение возможности получения готовой лекарственной формы на основе чЭФР (глазные капли) в качестве средства, избирательно стимулирующего процессы регенерации.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На основании изучения биологических особенностей рекомбинантных штаммов БассЬаготусез сегеу1з1ае - продуцентов чЭФР, применения ори-

гинальных методов выделения, очистки и стандартизации, контроля эффективности биотехнологического процесса с помощью диагностикумов и биотест-систем, разработаны научно-методические основы комплексной технологии получения чЭФР и других БАВ, обеспечивающей возможность создания лекарственных и диагностических средств нового поколения с использованием эпидермального фактора роста человека.

2. Предложенная методология отбора рекомбинантных штаммов, способы консервации и экзогенной регуляции позволяют выбрать наиболее перспективные продуценты чЭФР, оптимизировать условия культивирования и сохранять специфическую секретирующую активность микроорганизмов.

3. Разработанные методы выделения, очистки и стандартизации чЭФР дают возможность получения биологически активного пептида в высокоочи-щенном состоянии в количествах, необходимых для создания на его основе лекарственных и диагностических препаратов.

4. Сконструированные диагностические эритроцитарные антигенные и антительные тест-системы с различной чувствительностью позволяют контролировать содержание чЭФР на всех этапах биотехнологического процесса получения ростового фактора и создают условия для определения пептида в биологических жидкостях.

5. Предложенная биотест-система с использованием клеток эпидермиса, дает возможность изучать влияние эпидермального фактора роста на процессы клеточного метаболизма и прогнозировать некоторые свойства лекарственных препаратов на основе ЭФР.

6. Разработанная технология получения, состав и условия применения содержащих ростовой фактор глазных капель, обладающих терапевтическим эффектом при деэпителизации роговицы глаз, определяют методические подходы создания лекарственных средств с ранозаживляющими свойствами.

7. Комплексная технология одновременного выделения чЭФР из куль-туралыюй жидкости, иммуномодулирующих полисахаридных препаратов и РНК из биомассы дрожжевых клеток, а также использование побочных продуктов в качестве компонентов питательных сред, обеспечивает снижение отходов и увеличение эффективности процесса получения БАВ.

Научная новизна. В работе впервые изучены биологические свойства отечественных рекомбинантных штаммов БассЬагошусез сегеу1з1ае - продуцентов эпидермального фактора роста человека, исследованы возможности экзогенной биорегуляции микроорганизмов, на основании чего предложен состав питательной среды и условия культивирования, обеспечивающие значительное увеличение скорости роста микроорганизмов и их продуктивности.

Разработан оригинальный иммунохимический метод выделения и очистки ростового фактора с использованием поликлональных антител, позволивший повысить выход целевого продукта с чистотой не менее 99% (Патент РФ № 2108343).

Предложена новая модификация способа получения иммуномодулирующих полисахаридов из отработанной биомассы дрожжевых клеток, обеспечившая увеличение их биологической активности. Изучена и доказана возможность использования отходов, образующихся на различных этапах выделения и очистки биологически активных веществ из культуральной жидкости и дрожжевых клеток, в качестве компонентов питательных сред.

На основании результатов проведенного исследования впервые разработана комплексная технология получения биологически активных веществ с использованием отечественных рекомбинантных штаммов 8ассЬагошусе$ сегеу1з1ае.

Разработана биотест-система на клеточном уровне, позволившая провести изучение действия эпидермального фактора роста на процессы метабо-

лизма эпидермальных клеток, что дало возможность приступить к созданию лекарственных средств, обладающих ранозаживляющим действием.

Практическая значимость. Разработана комплексная технология получения биологически активных веществ на основе оптимизации условий хранения и культивирования рекомбинантных штаммов Б. сегеуЫае, применения оригинальных методов выделения, очистки и стандартизации БАВ, позволяющая выделять чЭФР, иммуномодулирующие полисахариды, РНК, компоненты питательных сред в препаративных количествах. Это, в свою очередь, обеспечивает возможность создания новых лекарственных препаратов на основе ростового фактора, обладающих ранозаживляющими свойствами. В частности, разработан состав и технология получения глазных капель, содержащих ЭФР и проявляющих терапевтическую активность при хирургической деэпителизации роговицы глаз.

Сконструированы эритроцитарные диагностические тест-системы с различной чувствительностью, дающие возможность определять ростовой фактор в культуральной жидкости в процессе культивирования дрожжей, а также в биологических жидкостях, что может быть использовано для целей практической медицины.

Предложенная технология может быть адаптирована для получения других веществ пептидной природы с использованием рекомбинантных штаммов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на конференции "Количественные методы в изучении морфогенеза и регенерации" г. Иваново, 1984 г.; 2-ом симпозиуме "Неинвазивные методы диагностики" г. Москва, 1995 г.; на 2-ом съезде Российского биохимического общества г.Москва 1997г.; конференциях "Биомедицинские технологии", РАМН, ММА им. И.М.Сеченова, РУДН, г.Москва в 1994,1995,1996, 1998 гг.; Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", г.Москва, 1999 г.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа и получен один патент РФ на изобретение.

Объем н структура работы. Структура диссертации традиционна и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, главу, содержащую описание материалов и методов исследования, 4 главы собственных исследований и их обсуждения, заключение, выводы и список литературы, содержащий 465 наименований, из которых 354 на иностранных языках. Диссертация содержит 46 рисунков, 29 таблиц и 1 схему.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе были использованы триптофан-зависимые штаммы Saccharomyces cerevisiae, трансформированные плазмидами, содержащими ген эпидермального фактора роста человека и способные секретировать пептид в культуральную жидкость, любезно предоставленные нам лабораторией генетики дрожжей Центра биоинженерии РАН /заявка на патент, Эльдаров М.А. и др., 1999/. Фактором селективности служила независимость рекомби-нантных штаммов от присутствия триптофана в среде.

Основные методы, использованные в работе, представлены на рис.1 1) Методы работы с рекомбинантными микроорганизмами-продуцентами ЭФР включали: культивирование в глубинных условиях, в колбах объемом 500 мл со 100 мл среды на качалках в термостатируемой комнате при температуре 26°С с использованием селективных и неселективных сред. Селективная среда для культивирования штаммов содержала 0,67% Yeast Nitrogen Base (YNB), 0,5% Casein acid hydrolysate без триптофана, 2% глюкозы, pH 5,3. В ряде случаев Casein acid hydrolysate заменяли на гидролизат казеина, полученный по разработанной нами схеме /Вещикова Е.В., Никитина З.К., 2000/.

1.Методы работы с микроорга-

4.Конструирование диагности

5.Методы разработки технологии и состава глазных _капель._

5. ¡.Методы отбора вспомогательных веществ.

5.2. Стерилизация растворов

ЭФР.

5.3. Определение терапевтической активности и токсичности.

5.4. Определение стабильности глазных капель при хранении.

8.Разные методы.

2.Методы выделения и очистки _ЭФР._

2.1 .Получение ЭФР-обогащенной фракции.

2.2.Методы хроматографичес-кой очистки ЭФР.

2.3.Иммунохимические методы _выделения и очистки ЭФР.

3.Методы стандартизации ЭФР.

3.1.Диск-электрофорез в ПААГ.

3.2.ВЭЖХ.

3.3.Аминокислотный анализ.

3.4. Определение биологической активности in vivo и in vitro.

6.Методы выделения и стандар-_тизацни полисахаридов.

6.1.Выделение полисахаридов. 6.2.Определение физико-химических свойств. 6.3. Определение биологической _активности._

7.Методы выделения и стандар-

!. 1 .Количественные методы

определения БАВ. 1.2. ИК-спектроскопия. '.3.Статистическая обработ-_ка результатов._

тизации РНК.

7.1 .Выделение РНК методом

аффинной хролштографии. 7.2. Определение нуклеотидного состава и молекулярной __массы РНК.

низмами-продуцентами ЭФР.

1.1 .Культивирование штаммов. 1.2.Определение количества

плазмидных клеток. 1.3.Хранение штаммов._

кумов на ЭФР.

4.1 .Консервация эритроцитов.

4.2. Сенсибилизация ЭФР.

4.3.Контроль и стандартизация.

4.4. Оценка чувствительности.

Рис. 1. Блок-схема и последовательность применения основных методов, использованных в работе.

Состав неселективной глюкозо-пептонной среды: 2% пептона, 2% глюкозы, 0,01% тиамина, 0,001% биотина, pH 5,3. Культивирование проводили до достижения оптической плотности 6,0 при длине волны 660 нм.

Для определения соотношения плазмидных и бесплазмидных клеток в популяции микроорганизмов использовали способ, описанный нами ранее /Яковлева М.Б., Никитина З.К. и др., 1998/.

Клетки дрожжевых рекомбинантных штаммов хранили либо методом криоконсервирования при различных температурных режимах, либо на ага-ризованной среде под растворами глицерина или вазелинового масла при 40С.

2) Методы выделения и очистки ростового фактора включали хроматографию на сорбенте "Диапак С-16", ВЭЖХ, аффинную хроматографию на иммуносорбенте, полученном по разработанному нами способу /Никитина З.К. и др., 1994/. Животных иммунизировали по схеме, предложенной Кравцовым Э.Г. и Кармановым М.И. /1981/, для оценки специфичности антисыворотки использовали метод двойной иммунодиффузии /Ouchterlony О., 1967/. Выделение иммуноглобулинов из сыворотки иммунизированных животных проводили по методу, предложенному Hjeim Н. /1972/. Иммуносорбенты получали по обычной схеме /Ахеп R., 1967/.

Для характеристики пептида использовали диск-электрофорез в ПА-АГ/Swank R.T., Muñeres K.D., 1971/, аминокислотный анализ /Остерман Л.А., 1985/, определение биологической активности пептида in vivo и in vitro. При определении биологической активности in vivo новорожденным мышам ежедневно вводили препарат ЭФР (5 мкг/г веса животного) и регистрировали время открытия глаз с помощью стандартного метода (Cohen S., 1962).

Биологическую активность ростового фактора in vitro изучали с помощью разработанной тест-системы с использованием базальных клеток эпидермиса. С этой целью предварительно получали суспензии клеток различ-

ных слоев эпидермиса следующим образом: эпидермис отделяли от дермы после инкубации кожи в соответствующем буфере при 52-540С в течение 1 мин. и измельчали.Все дальнейшие процедуры проводили при 4°С, используя модифицированный метод Stern I.B., Kallione H.S.-P. /1972/. Для определения метаболической активности клеток различных слоев эпидермиса к 1 мл суспензии, содержащей 10б клеток, добавляли 0,5 мкКи С14-тимидина, -уридина и -лейцина. Пробы инкубировали различное время при 37оС. Для изучения влияния ростового фактора на метаболическую активность клеток его добавляли к тем же суспензиям (от 1 до 100 нг/мл) /Томашевич C.B., Никитина З.К. и др., 1996/.

3)Методы конструирования эритроцитарных диагностических тест-систем основывались на выборе способов консервации /Weinbach R., 1959/ и активации эритроцитов барана /Boyden S.V., 1951/, с последующей иммобилизацией на них ЭФР; контроле на всех этапах неспецифической агглютинации и определении стабильности сенсибилизированных эритроцитов /Каральник Б.В., 1976/. Стандартизацию готовых диагностикумов проводили с помощью реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) или реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Чувствительность определяли с использованием стандартного раствора антигена.

4)Методы разработки состава и технологии получения ранозажив-ляющих средств с использованием ЭФР (на примере глазных капель) включали: разработанный нами способ определения пролонгирующей активности вспомогательных веществ /Юдаев И.М., Никитина З.К. и др., 1995/; стерилизацию растворов ЭФР методом ультрафильтрации на половолоконных мембранах ВПУ-100 и ВПУ-ЮОМ /Айзенштейн Э.М., 1991/; хирургическую де-эпителизацию роговицы глаз /Campos M. et al., 1994/ с последующим определением терапевтической активности глазных капель; определение токсичности и стабильности глазных капель /Гендролис А.Ю.-А., 1988/.

5)Методы выделения и стандартизации иммуномодулирующих поли-сахаридных препаратов и РНК из отработанной биомассы дрожжевых клеток основаны на получении полисахаридов методом Pillemer L. et al. /1963/ или предложенной нами модификацией метода /Горднова И.К.. Никитина З.К., 1995/ и изучении их характеристик по общепринятым показателям /Басс-Шадхан Х.Ф., 1970/. Кроме того, для более четкого сравнения препаратов, полученных из рекомбинантных и нерекомбинантных штаммов, проводилось определение их влияния на фагоцитарную активность полиморфноядерных лейкоцитов с использованием латексов /Ефремова Н.Б. и др., 1994/ и реакцию розеткообразования /Бем Э., 1979/.

Для выделения РНК из отходов технологического процесса был разработан способ аффинной хроматографии на сорбенте, полученным иммобилизацией этидий бромида на сефарозе /Гордонова И.К., Никитина З.К. и др., 2000/. Молекулярную массу полученных препаратов нуклеиновой кислоты определяли с помощью электрофореза в ПААГ /Loening U.E., 1967/, нуклеотидный состав - спектрофотометрическим методом, разработанным Василенко С.К. и др. /1962/.

6) Различные методы количественного определения БАВ и их качественного анализа, а именно: определение общего азота проводили по Къельда-лю с использованием автоматического анализатора "Kjeltec Auto System" /Волынец В.Ф., Волынец М.В., 1977/, концентрацию белков и пептидов - по методу Sedmak J.J., Grossberg S.E. /1977/, ДНК - методом Dische Z. /1956/, РЖ - орциновым методом /Mejbaum W.Z., 1939/, триптофан - методом Horn M.L. /1954/, свободные аминогруппы - нингидриновой реакцией /Lee Y.P., Tarahashi Т., 1966/, глюкозу и маннозу - антроновым методом /Seifter S. et al., 1950/.

ИК-спектры получали, используя сухие препараты, смешанные с КВг, на спектрофотометре "Perkin-Elmer". Радиоактивность определяли на сцин-

тилляционном счетчике "ABAC-SL-40", спектры поглощения снимали на спектрофотометре "Shimadzu MSR 2000", гели после электрофореза сканировали при различных длинах волн на сканирующем денситометре "Chromoscan 200". Хроматографические процедуры проводили на жидкостном хроматографе "Varian Model 8500". Статистическую обработку результатов проводили, используя распределение Стъюдента для малых выборок, данные выражали в виде X ± ст /Лакин Г.Ф., 1980/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов - продуцентов ЭФР.

1.1. Методология отбора рекомбинантных штаммов.

На первом этапе проводимого исследования необходимо было разработать методы отбора наиболее перспективных штаммов-продуцентов. Анализ собственных и литературных данных показал, что для этих целей требуется определение следующих характеристик : продуктивности, скорости роста, количества плазмидных клеток в популяции и анализ изменения указанных показателей в процессе культивирования и хранения микроорганизмов.

При этом для определения соотношения плазмидных и бесплазмидных клеток была разработана специальная микробиологическая методика, заключающаяся в рассеве одного и того же количества дрожжевых клеток одновременно на селективную и неселективную среду с последующим подсчетом количества выросших колоний (рис.2).

Используя предложенный подход, был проведен скрининг 20, имеющихся в нашем распоряжении штаммов, который позволил отобрать 5 наиболее продуктивных и стабильных штаммов, секретирующих 1-2 мг ЭФР на 1л культуральной жидкости (табл.1). Следует отметить, что продуктивность и

I.

К>

со^

уч.-

О

'О V ' " - сР'О ^

. /

¡ГЧ

V

.О

1 1 О и " м.

\<\. О • п О,

. -"•,: ^ О.

* Ч \

и С '

.с п

'..С:

Рис.2.Число колонии шгамма 11-11 Ь.ееге\¡5ше при выраишьакни на неселекшвноп (А) и селеюииной * 1>» среде.

етаонльносп. выявленных штаммов ооеспсчивдс! иринцшшальнчю возможное^ наработки ростового фактора в масштабах, необходимых хм получения лекарственных ерелетв. так как биологические »ффек-ты ')ФР обычно проявляю :с>' при чикромолчрных и наномоляриых концентрациях пен шла.

Таблица 1. Продуктивность различных штаммов 8.сегеу1з1ае при их культивировании на жидкой селективной среде.

Штамм Продуктивность мг/л х А660 Штамм' Продуктивность мг/л х А660

1-11 0,06±0,01 11-11 0,23±0,03

1-12 0,07±0,01 11-12 0,25±0,05

1-13 0,06±0,02 11-13 0,08±0,02

1-14 0,06±0,01 11-14 0,19±0,02

1-15 0,04±0,01 11-15 0,22±0,03

1-16 0,03±0,01 11-16 0,07±0,01

1-17 11-17 0,05±0,01

1-18 0,04±0,02 11-18 0,05±0,02

1-19 0,05±0,01 11-19 0,12±0,02

1-20 0,06±0,02 11-20 0,06±0,02

1,2

41

о,8 ;

¡а

0,4

_ 0

0 2 I I § '

Время культивирования, сутки.

Рис.3 Динамика роста и продуктивность рекомбинантных штаммов при культивировировании на стандартной питательной среде. 1 - оптическая плотность при 660 нм; 2 - биомасса, г/л;

3 - суммарная продуктивность, чЭФР, мг/л;

4 - удельная продуктивность, чЭФР, мг/л х А660.

Скорость роста у исследованных рекомбинантных штаммов была практически одинакова. Типичная кривая роста представлена на рисунке 3. Можно видеть, что на всех этапах культивирования приращение количества биомассы, выраженное в г/л (кривая 2), коррелировало с оптической плотностью суспензии дрожжевых клеток при 660 нм (кривая 1), что позволяло в дальнейшем при исследовании динамических характеристик различных популяций клеток использовать последний показатель. Удельная продуктивность всех исследованных штаммов была максимальна в середине логарифмической фазы роста дрожжей.

Таким образом, предложенный методический подход, дает возможность выявлять наиболее перспективные рекомбинантные штаммы - продуценты чЭФР.

1.2. Разработка способов консервации микроорганизмов.

Сохранение жизнеспособности и продуктивности микроорганизмов является обязательным элементом комплексной технологии получения на их основе биологически активных веществ. Несмотря на хорошо изученную биологию БассИаготусеБ сеге\'1х1ае, наличие в микроорганизмах плазмид, необходимых для синтеза гетерологичного пептида, требовало поиска особых условий их консервации. Были исследованы два основных подхода: 1) хранение микроорганизмов на агаризованных средах под растворами вазелинового масла и глицерина с периодическими пересевами и 2) криоконсервирование дрожжевых клеток при различных температурных режимах. Как показали проведенные исследования, все использованные методы имели определенные недостатки. Так, при хранении культур на агаризованных средах удавалось сохранить их продуктивность в течение 1,5-2 лет, однако при пересевах даже на селективных средах наблюдалось некоторое снижение количества плазмидных клеток и продуктивности (рис.4), а также уменьшение скорости роста штаммов, главным образом за счет увеличения лаг-фазы.

а

I 80

ш ={

0 а

1 40

«э <

§0,3

ое со

,-0,2.

о о

ш 2

ь 0,1-

о

I 2

Номер пассажа

А

0

Рис.4. Доля плазмидсодержащих клеток (А) и продуктивность (Б) рекомбинантного штамма 11-12 в процессе пересевов на селективной среде.

Криоконсервирование при -250С не обеспечивало сохранения жизнеспособности штаммов, при -60ОС удавалось добиться сохранения жизнеспособности и продуктивности, однако наблюдалось значительное уменьшение скорости роста после хранения (рис.5). Криоконсервирование при температуре жидкого азота (рис.6) позволяло длительно сохранять (срок наблюдения более 3 лет) продуктивность, количество плазмидных клеток в популяции и практически не влияло на скорость роста дрожжей.

Месяцы хранения О

8 10 12

Время культивирования, сутки Рис.5.Изменение динамики роста рекомбинантных штаммов, хранившихся в 15% растворе глицерина при -60оС.

А

---после хранения

— до хранения ^

0,3

Б

и—ь

100 200 300

0

Время культивирования, сутки Время хранения, сутки

Рис.6. Динамика роста (А) и продуктивность (Б) рекомбинантного штамма Б.сегеУ151ае (11-11) до и после хранения при -1960 С.

Недостатком последнего метода являлось значительное снижение общего числа жизнеспособных клеток в процессе замораживания-оттаивания, что делало необходимым разработку специфических для данных штаммов условий криоконсервации. Подбор криопротекторов и режима замораживания-оттаивания позволил сохранить до 25% жизнеспособных клеток, содержащих плазмиды. Оптимальные результаты были получены при сочетании различных методов хранения: криоконсервации микроорганизмов при температуре жидкого азота с последующим их рассевом и хранением на агаризо-ванных средах. Такой подход давал возможность получать необходимое количество посевного материала для культивирования рекомбинантных штаммов.

Таким образом, на основании проведенных исследований разработан комплексный способ консервации и хранения рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae - продуцентов чЭФР, позволяющий сохранить генетический материал плазмидных клеток, скорость роста и секретирующую способность штаммов.

1.3. Изучение возможности экзогенной регуляции секретирующей активности штаммов.

Поскольку состав культуральной среды может оказывать существенное влияние на продуктивность микроорганизмов и скорость их роста, на следующем этапе работы были исследованы возможности экзогенной регуляции штаммов-продуцентов и выбраны параметры, позволяющие оптимизировать условия их культивирования. Показано, что основным фактором экзогенной регуляции является количественный и качественный состав Casein acid hydrolysate. Так, уменьшение его концентрации приводило к снижению скорости роста микроорганизмов, особенно после их длительного хранения (рис. 7), а культивирование в неселективных условиях (присутствие триптофана в гидролизате) значительно уменьшало продуктивность (табл.2).

0 2 4 6 8

Время культивирования, сутки.

Рис.7. Влияние различных концентраций Casein acid hydrolysate на динамику роста рекомбинантных штаммов и изменение содержания нингидрин-положительного материала (2) и глюкозы (3) в культуральной жидкости при культивировании микроорганизмов в стандартных условиях.

1 - Casein acid hydrolysate (5 г/л); 4 - Casein acid hydrolysate (2,5 г/л).

Концентрация глюкозы в исследованном диапазоне не оказывала влияния на эти показатели, что, вероятно, связано с ее практически полной утилизацией уже на ранних этапах культивирования (рис.7, кривая 3). Исходя из полученных результатов, был выбран состав селективной среды и разработаны условия получения гидролизата казеина /Вещикова Е.В., Никитина З.К.

Таблица 2. Продуктивность различных штаммов S.cerevisiae при их культивировании на жидкой неселективной среде.

Штамм Продуктивность,*мг/л х А660

11-11 0,13±0,02

11-12 0,14±0,03

11-14 0,10±0,02

11-15 0,1210,02

11-19 0,08±0,03

2000/, введение которого в культуральную жидкость обеспечивало повышение продуктивности штаммов более чем в 2 раза, а также увеличение скорости их роста после хранения (рис.0).

5 I О <D СО

О. С л I-о о г н о с с с: пз

S Ус О

<

f 0,3

с.

СО

£ ь о

10,1

> ч:

О. 0

а

Щ £

/

-у

I

Время культивирования, сутки Среда культивирования

Рис.8.Динамика роста (А) и продуктивность (Б) рекомбинантного штамма S.cerevisiae, культивируемого на среде, содержащей Casein acid hydrolysate (1) и полученный нами гидролизат (2).

2 X

О

аэ

N

а. с

л е< о о X ь о ч с

в 2

3

щ

г я ес

о

5 X

О со сч

а. с

о ч

с «

й

100 200

Объем элюции. мл

Б

20 40

Время удерживания, мин.

Рис.9.Этапы очистки ЭФР из культуральной жидкости. А - хроматография на колонке "Диапак-С16" (1-нанесение культуральной жидкости, 2-элюция 20% метанолом, 3-десорбция ростового фактора 60% метанолом); Б - ВЭЖХ; В - рехроматография пептида. Отрезками отмечены фракции, содержащие ЭФР.

Таким образом, определены экзогенные факторы биорегуляции ре-комбинантных штаммов БассЬаготусез сегеу1з1ае, влияющие на продуктивность и скорость роста микроорганизмов.

I

2.Разработка методов выделения, очистки и стандартизации ЭФР.

Изучение биологических свойств микроорганизмов-продуцентов чЭФР, разработка способов их консервации и оптимизация условий культивирования позволили приступить к следующему этапу исследований - разработке технологии выделения биологически активных веществ из рекомби-нантных штаммов БассЬаготусез сегеУ1з1ае.

Для выделения и очистки ЭФР было использовано два методических подхода: метод трехстадийной хроматографической очистки (рис.9) и разработанный нами метод выделения ростового фактора из культуральной жидкости с помощью иммуносорбции (рис.10).

Объем элкция, мл

Рис.Ю.Выделение ЭФР из культуральной жидкости с помощью аффинной хроматографии на полученном иммуносорбенте: 1- нанесение культуральной жидкости; 2-элюция фосфатным буфером; 3- десорбция пептида уксусной

кислотой.

Таблица 3. Проверка биологической активности in vivo ЭФР, выделенного из культуральной жидкости S.cerevisiae разными методами.

Доза ЭФР, Метод получения Время открытия

мкг/г веса глаз, сутки

5 трехстадийный 7

5 одностадийный 6-7

контроль — 11-12

Оба метода позволяли получать биологически активный ростовой фактор (табл.3) в высокоочищенном состоянии (степень чистоты не менее 99%). При этом применение метода иммуносорбции позволило повысить выход пептида от 75 до 85%.

12 3 4

ю ю

О 0,2 0,4 0,6 0,8

Относительное расстояние миграции, Rf.

20 40 60 Время удерживания, мин.

Рис.11. Анализ чЭФР, полученного методом трехстадийной (сплошная линия)

и аффинной (пунктир) хроматографии с помощью ВЭЖХ (А) и диск-электрофореза в ПААГ (Б). Стрелками указаны положения маркерных белков и пептидов: 1 - 16,95; 2 - 14,40; 3 - 8,16; 4 - 6,21; 5 - 2,51 кДа.

Б

Необходимым этапом разработки технологии получения ЭФР являлся выбор методов его стандартизации. В результате проведенных исследований был установлен комплекс показателей, отражающих основные физико-химические и биологические свойства пептида,и включающий данные диск-электрофореза в ПААГ, ВЭЖХ (рис.11), аминокислотного анализа (табл.4) и определение биологической активности in vivo и in vitro.

Таблица 4. Аминокислотный состав чЭФР из культуральной жидкости ре-комбинантных штаммов S.cerevisiae, остаток/моль белка.

Аминокислота Хроматография Литературные

трехстадийная иммуносорбция данные/Gregory, 1975/

лизин 2,09 2,16 2

гистидин 1,89 1,85 2

аргинин 2,50 2,56 3

аспарагин 6,92 6,84 7

треонин 0 0 0

серин 2,68 2,70 3

глутамин 5,05 5,12 5

пролин 1,10 1,06 1

глицин 4,15 4,21 4

аланин 2,05 2,01 2

цистеин 5,42 5,40 6

валин 2,74 2,65 3

метионин 0,95 0,93 1

изолейцин 2,11 2,06 2

лейцин 5,09 5,06 5

тирозин 4,85 4,80 5

фенилаланпн 0 0 0

триптофан 1,70 1,74 2

Предложена новая биотест-система с использованием базальных клеток эпидермиса, которая позволила изучить метаболическую активность клеток по включению меченных предшественников синтеза ДНК, РНК и белка (рис.12) и влияние на нее ЭФР (рис.13).

ЗЕРНИСТЫЙ СЛОЙ

_3 -4- тя

Г^ 2--?— —1—? —

; ! I-?- —,1

0 12 3

Время, час.

Рис.12. Включение С14-тимидина (1), -уридина (2) и -лейцина (3) в суспензии клеток различных слоев эпидермиса.

Кроме того, использованная биотест-система позволила сделать некоторые выводы о свойствах лекарственных средств на основе ростового фактора. Показано, что для стимуляции синтеза ДНК ростовой фактор должен контактировать с базальными клетками, а время такого контакта, необходимое для запуска процессов пролиферации, должно быть не менее 3 часов (рис.14).

Концентрация ЭФР, нг/мл Рис. 13.Влияние ЭФР на включение С 14-тимидина в суспензию базальных

клеток эпидермиса.

Таким образом, разработанная технология выделения, очистки и стандартизации создала необходимые условия получения биологически активных, высокоочищенных препаратов чЭФР, что дало возможность приступить к созданию лекарственных и диагностических средств на его основе.

сп

I

о

Время, час

Рис.14. Влияние времени преинкубации ЭФР с суспензией базальных клеток эпидермиса на включение в них С|4-тимидина.

3.Разработка эритроцитарных диагностических тест-систем для определения ЭФР в биологических жидкостях.

При конструировании эритроцитарной тест-системы основной задачей являлось обеспечение возможности определения концентрации ростового фактора в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов - продуцентов чЭФР на различных этапах культивирования, выделения и очистки пептида. Для этой цели был сконструирован антигенный эритроцитарный диагности-кум. Найдены оптимальные условия формалинизации, активации, таннизации и нагрузки эритроцитов соответствующим белковым антигеном, обеспечивающие получение стабильной в течение года тест-системы. При этом мак-

симальная чувствительность диагностикума (0,01 мкг/мл) в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА) наблюдалась при концентрации сенситина 125 мкг/мл (табл.5). Полученная тест-система была апробирована при определении ЭФР в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов (табл.6).

Таблица 5. Характеристика отобранных образцов эритроцитарных диагностикумов (ЭД).

Концентрация суспензии нативных ЭБ,% 8

Содержание формальдегида,% 3

Время инкубации с формальдегидом, час. 16

Концентрация таннина,% 0,05 0,025 0,125 0,001

Концентрация суспензии таннизаро-ванных ЭБ,% 5 5 5 5

Концентрация 500 250 125 500 250 сенситина мкг/мл 125 500 250 125 500 250 125

МАД антисыво- 1:48 1:96 1:192 1:384 1:768 1:1536 1:1536 1:3072 1:3072 1:6144 1:6144 1:12288 ротки,титр

Десорбировав- 82 54 43 64 37 25 28 12 8 10 5 3 шийся белок, %

Таблица 6. Сравнительное определение содержания ЭФР в культуральной жидкости рекомбинантных штаммов 8.ссге\ч51ае разными методами, мг/л.

Штамм Метод определения

РТПГА Хроматографическая очистка

11-11 1,8 1,38

11-12 2,0 1,50

11-14 1,6 1,22

11-15 1,7 1,32

11-19 1,1 0,80

В то же время чувствительность ее оказалась недостаточной для обнаружения ростового фактора в биологических жидкостях человека и животных. В связи с этим была предпринята попытка создания антительного эрит-роцитарного диагностикума и использования реакции пассивной гемагглюти-нации (РПГА). Дополнительная очистка иммуноглобулинов из сыворотки животных, иммунизированных ЭФР, путем аффинной хроматографии на сорбенте с иммобилизованным ростовым фактором, увеличивала чувствительность антительного диагностикума до 0,001 мкг/мл /Астанина H.A., Никитина

3.К., 1999/ что дает принципиальную возможность его использования в медицинской практике.

Таким образом, предложена принципиальная схема получения эритро-цитарных диагностических тест-систем с различной чувствительностью для определения ростового фактора.

4.Разработка состава и технологии получения ранозаживляющих средств на основе ЭФР (на примере глазных капель).

Предложенная технология получения рекомбинантного эпидермально-го фактора роста, способного избирательно стимулировать митотическую активность эпителиальных клеток, дает возможность создания принципиально

новых офтальмологических препаратов В результате проведенных исследований осуществлен выбор оптимальной концентрации ЭФР в каплях (рис. 15). Показан пролонгирующий эффект декстранов с молекулярной массой выше 40 кДа и полиглюкина (рис.16).

Концентрация ЭФР,% Концентрация ЭФР,%

Рис.15.Влияние состава глазных капель, содержащих ЭФР, на время заживления хирургической деэпителизации глаз у экспериментальных животных. В качестве растворителя лиофильно высушенного препарата ЭФР с консервантами служил раствор полиглюкина (А) или 0,9% раствор КтаС1 (Б).

Разработана технологическая схема получения капель (табл. 7), которая включает следующие этапы: стерилизацию растворов ЭФР вместе с консервантами методом ультрафильтрации, лиофилизацию, укупорку, а затем

г

перед употреблением растворение препарата в полиглюкине.

Подобран температурный режим хранения, обеспечивающий стабильность лекарственного средства в течение 2 лет. Показан терапевтический эффект глазных капель у экспериментальных животных с хирургической деэпи-телизацией глаз, а именно: уменьшение времени закрытия раневого дефекта на 2-3 суток по сравнению с контролем (рис.17 и 18).

75

¡х в со V

50

х и

г

о >о

а Я

ш

25

№ £

з г

у-

А

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

Время, час.

РисЛб.Время высвобождения чЭФР из растворов различных пролонгаторов: 1, 2 и 3 - растворы декстранов с молекулярной массой 10, 40 и 70 кДа соответственно; 4 - полиглюкин.

Таблица 7. Технологическая схема получения глазных капель на основе ЭФР.

1. Подготовительные работы.

1.1. Подготовка помещения, оборудования, вспомогательных средств.

1.2. Подготовка сырья (ЭФР, консерванты, вода). : 2. Приготовление растворов.

2.1. Растворение сырья.

2.2. Анализ пробы.

3. Фильтрование и стерилизация.

3.1. Фильтрование и стерилизация.

3.2. Розлив и укупорка.

3.3. Маркировка._

4. Лиофильная сушка.

4.1. Замораживание.

4.2. Сушка.

4.3. Укупорка, обкатка.

4.4. Маркировка._

5. Приготовление капель.

5.1. Вскрытие упаковки.

5.2. Растворение в полиглюкине.

г д

Рис 17. Роговица кролика. Окраска гематксилин-эозином. Увеличение 200. а - роговица до повреждения; б - роговица через час после повреждения; в - то же через 4 суток при инсталляции глазных капель, содержащих ЭФР в растворе полиглюкина; г - то же через 4 суток при инсталляции глазных капель, содержащих ЭФР в 0,9% растворе NaCl; д - то же через 7 суток при инсталляции 0,9% NaCl.

1 2 3

№ группы животных. Рис.18.Время заживления хирургической деэпителизации роговицы глаз у различных групп кроликов при инсталляции в полость конъюктивы глазных капель, содержащих ЭФР. О - опыт, глазные капли содержали ЭФР, К - контроль, глазные капли не содержали ЭФР. Растворитель: полиглюкин (1 группа) и 0,9% раствор ЫаС1 (2 группа). 3 группа - рствор 0,9% №С1 без ЭФР.

Обнаружено отсутствие токсического, местно раздражающего действия капель при их кратковременном и длительном применении. Таким образом, разработан состав и технология получения глазных капель на основе ЭФР, проведены основные доклинические испытания лекарственного средства.

5.Разработка методов выделения иммуномодулирующих препаратов из клеток рекомбинантных штаммов БассЬагошусез сегеу1$1ае.

Одним из приоритетных направлений развития современной биотехнологии является комплексный подход, обеспечивающий переработку биомассы и различных технологических отходов. Как показали наши исследования, использованные в работе рекомбинантные штаммы секретируют ростовой фактор только в культуральную жидкость, при этом биомасса дрожжевых клеток не используется. Следовательно, одним из способов увеличения эффективности разрабатываемой технологии является попытка выделения других биологически активных веществ, в том числе иммуномодулирующих полисахаридов оболочек дрожжевых клеток (например, «Зимозан»).

В связи с тем, что активность таких веществ в значительной степени зависит от биологических свойств микроорганизма, необходимо было сравнить химический состав и биологическую активность полисахаридов, полученных из рекомбинантных и нерекомбинантных штаммов. С целью более полного изучения иммунологических свойств полисахаридных препаратов были применены дополнительные тест-системы: определение фагоцитарной активности с использованием латексов (рис. 19) и количества розеткообра-зующих клеток (рис.20). Можно видеть (табл.8), что характеристики препаратов, выделенных из рекомбинантных штаммов, практически не отличались от соответствующих показателей препаратов из нерекомбинантных штаммов.

Предложена модификация условий проведения ферментативного гидролиза дрожжей в процессе получения полисахаридных препаратов, позволившая увеличить степень депротеинизации и их биологическую активность.

Таким образом, показана возможность получения иммуномодулирующих полисахаридов из дрожжевых клеток рекомбинантных штаммов S.cerevisiae одновременно с выделением ростового фактора из культуральной жидкости.

Рис. 19.Световая микроскопия мазка лейкоконцентрата после инкубации с ла-тексами. Окраска по Романовскому-Гимзе. Увеличение 900. а - частицы латекса до инкубации; б, в, г - лейкоциты с включенными частицами латекса.

о

. К

У

,«-> * -С.-'О

в г

Рис. 20. Различные формы зрнтроцигарных розеток. Окраска по Романовско-\i\-I имзе. Увеличение 900. а - начальные стадии процесса розеткоооразова-ния: б - полярная розетка: ь - венчик зршронитов не замыкается вокруг лим-фошпа: I - розе! ка в форме морулы.

Таблица 8. Характеристика полисахаридных препаратов, полученных из различных штаммов БассЬагошусеБ сегеу1з1ае.

Характеристика Зимозан /ВФС/ Рекомбинантный Нерекомбинантный

Описание светло-серый светло-серый светло-серый

порошок порошок порошок

Растворимость

в воде,спирте не растворим не растворим не растворим

Суспензия в устойчива в устойчива в устойчива в

0,9% ЫаС1 течение 30 мин течение 30 мин течение 30 мин

Потеря в весе

при высушивании менее 12% менее 5% менее 5%

Восстанавлива-

ющие вещества не менее 65% 68% 71%

Общий азот 1,1 -2,1% 1,9% 1,5%

Выход 8 - 12% 9,8% 9,6%

Увеличение числа

лейкоцитов не менее 40% 94% 98%

Серологическая

активность менее 5 мг/мл 1,3 мг/мл 1,1 мг/мл

Фагоцитарный

индекс * 61,3 59,4

Фагоцитарное

число * 3,6 3,5

Число розеткообра-

зующих клеток х 10-4

на 10б спленоцитов * 2,3 2,2

* - данных не имеется.

6.Использование отходов технологического процесса для получения биологически активных веществ и компонентов питательных сред.

При выделении и очистке эпидермального фактора роста, а также получении иммуномодулирующих полисахаридов оставался ряд непереработанных отходов. Проведенный анализ показал наличие в некоторых из них рибонуклеиновой кислоты. Поскольку препараты низкомолекулярной дрожжевой

РНК обладают рядом фармакологических эффектов, была разработана методика получения высокоспёцифичного аффинного сорбента и способ выделения с его помощью из указанных отходов препаратов нуклеиновой кислоты /Гордонова И.К., Никитина З.К./ со степенью чистоты не менее 99% и с молекулярной массой (рис.21) и нуклеотидным составом (табл.9) близким к таковым у тРНК дрожжей.

Рис.21. Диск-электрофорез в ПААГ препаратов РНК при концентрации геля 2,2 (А) и 6,0% (Б). Стрелками указано положение маркеров: 1 - 28 Б РНК из 8.сегеу1з1ае; 2-188 РНК из 5.сеге\аз!ае; 3 - т-РНК из 5.сегеУ151ае.

Таблица 9. Соотношение азотистых оснований в препаратах РНК из различных штаммов 8.сегеу1з1ае, %.

Препарат Аденин Гуанин Цйтозин Урацил

н/р* 19,7±1,8 31,8±2,4 29,6±2,5 18,9±2,0

11-11 20,4±1,9 32,6±2,8 29,2±1,5 17,8±1,6

11-12 20,0±1,5 30,9±2,5 28,4±1,7 20,7±1,8

11-14 19,4±1,8 29,8±2,6 29,8±2,3 21,0±1,9

11-15 20,6±2,0 31,4±2,6 29,0±2,5 19,0±2,0

11-19 20,1±2,1 32,0±2,9 28,5±2,0 19,4±1,7

* - нерекомбинантные штаммы.

Время культивирования, сутки. Питательная среда.

Рис.22.Динамика роста (А) и продуктивность (Б) рекомбинантных штаммов S.cerevisiae при культивировании на различных средах: 1 - Casein acid hydrolysate, 2 - препарат 1 (18 г/л).

Рис. 23. Схема комплексного технологического процесса получения биологически активных веществ, а также лекарственных и диагностических средств на их основе из рекомбинантных штаммов - продуцентов чЭФР.

Кроме того, были предприняты попытки использования отходов в качестве компонентов питательных сред для рекомбинантных штаммов - продуцентов ЭФР. Подобраны оптимальные концентрации препаратов, обеспечивающие нормализацию скорости роста культур после длительного хранения и значительное увеличение продуктивности (рис.22).

Таким образом, в результате проведенных исследований предложена следующая схема получения БАВ из рекомбинантных штаммов - продуцентов ЭФР (рис. 23). Основными этапами этой схемы являются: отбор штаммов, оптимизация условий их культивирования и хранения; выделение и очистка ЭФР из культуральной жидкости и иммуномодулирующих полисахаридов из биомассы; разработка на основе полученного ростового фактора диагностических и ранозаживляюших средств; использование отходов технологического процесса для получения РНК и компонентов питательных сред.

Разработанные научно-методические основы комплексной технологии позволяют в значительной степени увеличить эффективность, снизить отходы технологического процесса и приступить к созданию лекарственных и диагностических средств нового поколения.

ВЫВОДЫ.

1. На основе изучения биологических свойств рекомбинантных штаммов -продуцентов чЭФР разработан методический подход, включающий определение продуктивности, скорости роста и соотношения плазмидных и бес-плазмидных клеток, который позволяет проводить отбор микроорганизмов. Скрининг 20 рекомбинантных штаммов БассЬагошусез сегеу1я1ае выявил 5 наиболее продуктивных и стабильных продуцентов, перспективных для получения ростового фактора в количествах, необходимых для разработки лекарственных и диагностических средств.

2. Предложена комплексная технология консервации рекомбинантных штаммов, включающая замораживание микроорганизмов при температуре жидкого азота с последующим их рассевом и хранением при 4-50 С на агари-зованных средах под растворами глицерина и вазелинового масла, обеспечивающая сохранение генетического материала плазмидных клеток, скорости роста и секретирующей способности штаммов (срок наблюдения 5 лет).

3. Определены возможности экзогенной биорегуляции рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae за счет изменения состава гидролизата казеина и его содержания в культуральной жидкости. Предложен способ получения гидролизата казеина и селективная среда на его основе, позволившие увеличить скорость роста дрожжей и их продуктивность в 2-2,5 раза.

4. Разработаны методы выделения и очистки эпидермального фактора роста из культуральной жидкости рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae, определившие возможность получения биологически активного пептида со степенью чистоты не менее 99% и выходом от 75% (трехстадий-ная хроматографическая очистка) до 85% (метод иммуносорбции).

5. Отработан способ стандартизации ростового фактора, включающий: диск-электрофорез в ПААГ, ВЭЖХ, аминокислотный анализ, определение биологической активности in vivo и in vitro. Создана оригинальная методика оценки активности чЭФР с помощью биотест-системы на клеточном уровне. Установлена способность ростового фактора увеличивать метаболическую активность базальных клеток эпидермиса и время контакта клетки-мишени с биологически активным веществом необходимое для запуска пролифератив-ного процесса.

6. Разработана схема конструирования эритроцитарных диагностических тест-систем, позволяющих контролировать содержание чЭФР на различных этапах культивирования рекомбинантных штаммов. Определены условия по-

лучения антигенного и антительного диагностикумов с чувствительностью от 0,01 мкг/мл (РТПГА) до 0,001 мкг/мл (РПГА).

7. Показана принципиальная возможность использования в медицинской практике лекарственных средств на основе ЭФР. Разработан состав и технология получения глазных капель, обладающих терапевтическим эффектом при повреждении роговицы глаз у экспериментальных животных. Определены температурный режим хранения и условия применения, обеспечивающие стабильность и высокую эффективность препарата.

8. Предложена схема одновременного выделения ростового фактора из культуральной жидкости и иммуномодулирующих полисахаридов из клеток рекомбинантных штаммов БассЬаготусез сегеукя1ае. Установлено, что полисахариды, выделенные из рекомбинантных и нерекомбинантных микроорганизмов, обладают подобным стимулирующим действием на иммунную систему. Осуществлена модификация стадии ферментативного гидролиза дрожжей, увеличившая степень депротеинизации полисахаридных препартов и их биологическую активность.

9. Разработана методика получения РНК из продуктов ферментативного гидролиза дрожжей с помощью аффинной хроматографии, позволяющая выделять биополимер со степенью чистоты не менее 99%, молекулярной массой и нуклеотидным составом близким к аналогичным показателям суммарной дрожжевой тРНК.

10. Показана возможность использования технологических отходов, образующихся в процессе получения биологически активных веществ из рекомбинантных штаммов в качестве компонентов питательных сред. Определены оптимальные концентрации препаратов, обеспечивающие нормализацию скорости роста культур и значительное увеличение их продуктивности (в 2,2 -2,8 раза).

11. Разработаны научно-методические основы комплексной технологии выделения и очистки биологически активных веществ из рекомбинантных штаммов S.cerevisiae - продуцентов чЭФР, позволяющие в значительной степени снизить отходы технологического процесса и обеспечить увеличение эффективности получения БАВ, что в свою очередь дает возможность приступить к созданию новых лекарственных и диагностических средств с использованием эпидермального фактора роста человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1.Томашевич C.B., Никитина З.К. Сравнительная цитофотометрическая и биохимическая характеристика процесса кератинизации // Количественные методы в изучении морфогенеза и регенерации. Тезисы докладов научной конференции АГЭ, г.Иваново, 1984, С. 147.

2.Никитина З.К., Спивак С.М., Томашевич C.B., Быков В.А. Разработка им-мунохимических методов выделения и очистки эпидермального фактора роста. //Биомедицинские технологии.-1994.-№ 1.-С.9-16.

3.Быков В.А., Никитина З.К. и др. Итоги и перспективы использования эпидермального фактора роста для разработки лекарственных и диагностических средств. // Биомедицинские технологии.-1995.-№ 2.-С.9-17.

4.Юдаев И.М., Никитина З.К., Кондратьева Т.С., Юдаева Е.А. Выбор пролон-гатора для глазных капель человеческого рекомбинантного эпидермального фактора роста. //Фармация.-1995.-№ 5.-С.28-30.

5.Гордонова И.К., Никитина З.К. Разработка способов получения полисаха-ридных комплексов, обладающих фармакологической активностью. // Биомедицинские технологии.-1995.-№ 2.-С.17-18.

5.Спивак С.М., Кушелевская И.М., Никитина З.К. Разработка методов диагностики заболеваний щитовидной железы по содержанию эпидермального фактора роста в слюне. // Неинвазивные методы диагностики. Тезисы докладов 2-ого симпозиума, г.Москва.-1995.-С.50.

6.Гордонова И.К., Никитина З.К., Яковлева М.Б., Быков В.А. Оценка физико-химических свойств и зимозан-подобной активности полисахаридных комплексов дрожжевых клеток рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae. // Химико-фармацевтический журнал.-1996.-№ 4.-С.33-36.

7.Спивак С.М., Никитина З.К., Кушелевская.И.М. Тест-система контроля за биотехнологическим производством ЭФР из рекомбинантных штаммов. //

Биомедицинские технологии.-1996.-№ 3.-С.43-47.

8.Томашевич C.B., Никитина З.К., Вещикова Е.В. Влияние ЭФР на пролифе-ративную активность клеток различных слоев эпидермиса. // Биомедицинские технологии.-1996.-№ 5.-С.54-58.

9.Вещикова Е.В., Якунина Л.Н., Никитина З.К., Яковлева М.Б., Быков В.А. Особенности культивирования и сохранения синтезирующей способности ре-комбинантных штаммов - продуцентов биологически активных веществ. // Биомедицинские технологии,- 1997.-№ 8.-С.9-18.

Ю.Томашевич C.B., Никитина З.К., Быков В.А. Биомедицинское моделирование и конструирование лекарственных форм. // Тезисы докладов 2-ого съезда Российского биохимического общества, г.Москва.-1997.-С. 148-149. П.Никитина З.К., Спивак С.М., Вещикова Е.В., Быков В.А. Способ выделения и очистки эпидермального фактора роста человека. // Патент РФ № 2108343.-1998.-10c.

12.Яковлева М.Б., Якунина Л.Н., Захарова Е.А., Никитина З.К., Быков В.А. Методические подходы, используемые для стабилизауии популяции реком-бинантных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae. // Биомедицинские технологии,-1998.-№ 10.-С. 12-16.

13.Гордонова И.К., Никитина З.К., Быков В.А. Изучение иммуномодулирую-щих свойств полисахаридных препаратов из рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae. //Биомедицинские технологии.-1998.№ 10.С.16-22.

14.Никитина З.К., Якунина Л.Н., Вещикова Е.В., Яковлева М.Б., Быков В.А. Разработка научно-методических подходов для поддержания специальной активности рекомбинантных штаммов - продуцентов в процессе их хранения. //Биомедицинские технологии,-1999.-№ 11.-С.30-36.

15.Гордонова И.К., Якунина Л.Н., Никитина З.К., Быков В.А. Использование отходов, полученных при очистке чЭФР, в качестве компонентов питательных сред. //Биомедицинские технологии.-1999.-№ И.-С.35-46.

16.Гордонова И.К., Якунина Л.Н., Никитина З.К., Быков В.А. Повышение эффективности технологии получения чЭФР на основе оптимизации питательных сред для выращивания рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae. // Биомедицинские технологии.-1999.-№ 11.-С.46-50.

17.Астанина H.A., Никитина З.К., Быков В.А. Адаптация тест-системы для определения содержания эпидермального фактора роста с целью использования в медицинской практике. // Биомедицинские технологии.-1999.-№ 11.-С.81-86.

18.Кравцов А.Н., Никитина З.К. //Человек и лекарство. Тезисы докладов Рос-

сийского национального конгресса. г.Москва.- 1999.-С.

19.Гордонова И.К., Никитина З.К., Быков В.А. Разработка способа выделения РНК из технологических отходов при комплексной переработке продуктов ферментативного гидролиза рекомбинантных штаммов БассЬаготусез ссгеУ151ае. //Биомедицинские технологии.-2000.-№ 13.-С.52-59.

20.Вещикова Е.В., Никитина З.К. Оптимизация состава питательной среды для рекомбинантных штаммов БассИаготусез сегеу1з1ае - продуцентов чЭФР. //Биомедицинские технологии.-2000.-№ 14 (в печати).

21.Никитина З.К., Быков В.А. Разработка состава глазных капель на основе чЭФР. // Биомедицинские технологии.-2000.-№ 14. (в печати).

22.Никитина З.К. Разработка технологии получения глазных капель, содержащих чЭФР. //Биомедицинские технологии.-2000.-№ 14. (в печати).