Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка комплексной технологии получения высокоочищенного препарата эпидермального фактора роста на основе рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вещикова, Елена Владимировна, Москва

Работа выполнена в Научно-исследовательском и учебно-методическом центре биомедицинских технологий

На правах рукописи

ВЕЩИКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОЙ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННОГО ПРЕПАРАТА ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ

ЗАССНАКОМУСЕБ СЕКЕУ181АЕ

/03.00.23. - Биотехнология/

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор технических наук, профессор, академик РАМН В. А. Быков кандидат медицинских наук 3. К. Никитина

у

/

ч..

Москва 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................7

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Пептидные ростовые факторы..................................................................10

1.1. Основные свойства ростовых факторов................................................12

1.1.1. Бифункциональность............................................................................12

1.1.2. Индукция синтеза других ростовых факторов....................................13

1.1.3. Несколько мест синтеза ростовых факторов.....................................13

1.1.4. Связь с протоонкогенами.....................................................................14

1.1.5. Физиологическая роль в организме....................................................15

1.2. Механизм действия..................................................................................16

2. Эпидермальный фактор роста

2.1. Физиологическая роль в организме в норме.........................................17

2.2. Физиолоогическая роль ЭФР при патологии.........................................23

3. Методы получения высокоочищенного препарата

3.1. Структура ЭФР.........................................................................................31

3.2. Биотехнологические методы синтеза ЭФР............................................36

3.3. Основные способы выделения ЭФР......................................................37

3.4. Использование аффинной хроматографии для получения и очистки ЭФР...............................................................................................40

4.Увеличение продуктивности рекомбинантных штаммов З.сегеу'мае.....41

4.1. Технология получения гетерологических протеинов в сегемз/ае... 42

4.2. Питание и рост 5. сегемв/'ае....................................................................45

4.3 Повышение стабильности плазмид.........................................................49

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Получение ЭФР-обогащенной фракции из подчелюстных желез мышей-самцов............................................................................................53

2. Очистка ЭФР хроматографией на биогеле и ИОХ...................................53

3. Хроматографические методы очистки ЭФР-обогащенной фракции......54

4. Культивирование рекомбинантных штаммов S. cerevisiae.....................55

5. Получение ЭФР-обогащенной фракции из культуральной

жидкости S. cerevisiae.................................................................................56

6. Иммунизация животных..............................................................................56

7. Определение титра антител против ЭФР в иммунной сыворотке..........57

8. Выделение иммуноглобулинов из сыворотки иммунизированных

животных................................................................................................58

9. Получение иммуносорбентов....................................................................59

10. Выделение ЭФР из культуральной жидкости S. cerevisiae методами иммуносорбции.......................................................................59

11. Хранение рекомбинантных штаммов S. cerevisiae................................60

12. Обработка дрожжевых клеток ультразвуком..........................................60

13. Получение гидролизата казеина - компонента питательной среды.....61

14. Получение суспензий клеток различных слоев эпидермиса.................61

15. Гель-фильтрация......................................................................................62

16. Диск-электрофорез

16.1. Дисковый электрофорез по методу R.T.Swank...................................62

16.2. Дисковый электрофорез по Шелудько Н.С..........................................63

17. ВЭЖХ (аналитический вариант)..............................................................65

18. Аминокислотный анализ..........................................................................65

19. Определение биологической активности ЭФР

19.1. in vivo.......................................................................................................65

19.2. in vitro......................................................................................................66

20. Определение включения меченных предшественников в клетках различных слоев эпидермиса...................................................................66

21. Определение влияния ЭФР на репликативную активность клеток различных слоев эпидермиса...................................................................67

22. Определение радиоактивности клеток...................................................67

23. Определение белка, ДНК, РНК, триптофана, свободных аминогрупп,

статистическая обработка результатов

23.1. Определение белка...............................................................................68

23.2. Определение ДНК..................................................................................68

23.3. Определение РНК..................................................................................69

23.4. Определение триптофана.....................................................................70

23.5. Определение свободных аминогрупп..................................................70

23.6. Статистическая обработка результатов..............................................71

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

1. Методы выделения и очистки ЭФР

1.1. Характеристика препарата ЭФР, полученного из слюнных

желез мышей-самцов...............................................................................72

1.2. Характеристика препарата ЭФР, полученного из культуральной жидкости рекомбинантных штаммов S.cerevisiae с помощью хроматографической очистки....................................................................76

1.3. Характеристика препарата ЭФР, полученного с помощью аффинной хроматографии из культуральной жидкости рекомбинантных штаммов S.cerevisiae..................................................80

1.4. Сравнение препаратов ЭФР, получаемых различными

методами...................................................................................................84

2. Влияние ЭФР на пролиферативную активность клеток

различных слоев эпидермиса...................................................................86

3. Особенности культивирования рекомбинантных штаммов S.cerevisiae.................................................................................................91

3.1. Культивирование рекомбинантных штаммов на среде Yeast Nitrogen Base (YNB) с Casein hydrolisate acids "Difco".............................92

3.2. Влияние замены YNB на искусственно-композиционную среду..........93

3.3. Замена Casein hydrolisate acids "Difco"Ha гидролизат казеина............94

3.4. Сравнение способов культивирования между собой...........................98

4. Поддержание и хранение рекомбинантных штаммов З.сегеу/з/'ае

4.1. Периодические пересевы........................................................................99

4.2. Хранение при различных температурных режимах............................102

4.3. Хранение под глицерином или вазелиновым маслом........................104

4.4. Сравнение способов хранения между собой.......................................107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................................................109

ВЫВОДЫ.......................................................................................................113

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................115

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АА - акриламид

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ВМ - вторичные мессенджеры

ГМ-КСФ - колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ИЛ - интерлейкины

ИНФ - интерфероны

ИОХ - ионообменная хроматография

И РФ - инсулиноподобные ростовые факторы

ИР-ЭФР - иммунореактивный эпидермальный фактор роста

КСФ - колониестимулирующие факторы

МБА - Ы.М" метилен бисакриламид

М-КСФ - моноцитарный колониестимулирующий фактор

мЭФР - эпидермальный фактор роста мыши

ОПН - острая почечная недостаточность

оф-ВЭЖХ - обратно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография

ПКА - портоковальный анастамоз

ПФР - полипептидные ростовые факторы

ТЕМЕД - Ы^.Ы/Ы.-тетраэтилдиамин

ТФР - трансформирующие факторы роста

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ФНО - фактор некроза опухоли

ФР - факторы роста

ФРВТ - фактор роста выделяемый тромбоцитами ФРФ - фактор роста фибробластов ЦНС - центральная нервная система ЧСА - сывороточный альбумин человека

чЭФР - эпидермальный фактор роста человека

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭФР - эпидермальный фактор роста

ЭФРР - рецептор эпидермального фактора роста

DsNa - додецилсульфат натрия

FPLC - быстрая жидкостная хроматография

HBsAg - поверхностный антиген гепатита В

YEHD - среда, содержащая дрожжевой экстракт, гидролизат сои и декстрозу

YEP - среда, содержащая дрожжевой экстракт и пептоны

YEPD - среда содержащая дрожжевой экстракт, пептоны и декстрозу

YNB - дрожжевая минеральная среда, содержащая азот

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последние годы большой интерес для практической медицины вызывают работы, направленные на изучение ростовых факторов пептидной природы, которые специфически стимулируют синтез ДНК и пролиферацию клеток. Имеющиеся в литературе данные позволяют предполагать, что лекарственные препараты на основе пептидных ростовых факторов могли бы найти широкое применение в качестве ранозаживляющих средств. Кроме того, обнаруженная бифун-кциональность некоторых из них, то есть способность, с одной стороны, стимулировать рост нормальных клеток, а с другой - тормозить пролиферацию трансформированных, предполагает возможность получения на их основе противоопухолевых препаратов.

В настоящее время основным способом получения веществ пептидной природы являются биотехнологические методы. Получаемые с помощью генной инженерии штаммы микроорганизмов продуцируют реком-бинантные белки и пептиды, такие как инсулин, гормон роста, интерлей-кин, ростовые факторы и т.д.

Одним из наиболее часто используемых для этих целей микроорганизмов являются ЭассЬаготусез сегеу'Шае. В частности, получены реком-бинантные штаммы дрожжей, способные синтезировать и секретировать эпидермальный фактор роста человека (чЭФР) в культуральную жидкость [59]. ЭФР - кислотоустойчивый и гидрофобный пептид с молекулярной массой около бкДа, является одним из ростовых факторов, обнаружен в некоторых тканях человека и животных и играет важную роль в поддержании нормального гомеостаза организма. Однако, несмотря на то, что в нашей стране также получены рекомбинантные штаммы Э.сеге\//5/ае - продуценты чЭФР, до настоящего времени комплексной технологии получения этого пептида не разработано.

В связи с этим целью настоящей диссертации явилась разработка научно-методических основ универсальной комплексной технологии получения пептидов с использованием рекомбинантных штаммов-продуцентов 5. сегеу'Шае на примере эпидермального фактора роста человека. В задачи настоящего исследования вошли:

1. Отбор наиболее продуктивных дрожжевых рекомбинантных штаммов-продуцентов чЭФР в качестве биотехнологического средства производства.

2. Определение параметров экзогенной биорегуляции микроорганизмов-продуцентов, адаптация на этой основе процессов культивирования и оптимизация состава питательной среды.

3. Разработка способов хранения и консервации рекомбинантных штаммов 8.се№181ае, обеспечивающих высокий уровень их секретирующей способности.

4. Разработка методов выделения и очистки чЭФР;

5. Исследование биологической активности получаемого пептида и его стандартизация.

Научная новизна исследования состоит в комплексном подходе к технологии получения пептида, включающем оптимизацию условий культивирования, хранения, консервации рекомбинантных штаммов сеге\ч-з1ае, оригинальные методы выделения, фракционирования, очистки и стандартизацию чЭФР. Подобраны среды, обеспечивающие увеличение скорости роста и продуктивности штаммов З.сегеи/'з/ае. Разработан способ выделения чЭФР, позволяющий сократить число стадий очистки и увеличить выход пептида (Патент РФ № 2108343). Впервые с помощью методики на клеточном уровне показана способность ростового фактора увеличивать пролиферативную активность только стволовых базальных клеток эпидермиса.

Практическая значимость. Разработана универсальная комплексная технология получения препарата эпидермального фактора роста человека на основе оптимизации условий культивирования, хранения, консервации рекомбинантных штаммов 5. сегемгё/ае, оригинальных методов выделения, фракционирования, очистки и стандартизации ростового фактора. Предлагаемые научно-методические подходы могут быть использованы для получения широкой номенклатуры пептидов. Разработан лабораторный регламент, позволяющий получать чЭФР в препаративных количествах со степенью чистоты, соответствующей мировым стандартам, что открывает возможности для создания на его основе лекарственных и диагностических средств нового поколения.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ПЕПТИДНЫЕ РОСТОВЫЕ ФАКТОРЫ К ростовым факторам (ФР) принято относить вырабатываемые в организме пептиды и гликопротеиды, которые обладают способностью в на-номолярных концентрациях стимулировать пролиферацию, опосредованную связыванием ФР со специфическим рецептором [16]. Интерес к ФР вызван, в первую очередь, их основной биологической ролью - специфическим стимулированием синтеза ДНК и пролиферации клеток. В присутствии полного набора питательных веществ, но без ФР, нормальные клетки животных не делятся [10, 57]. Кроме того, некоторые из ФР, непосредственно или через структуру их рецептора, имеют ярко выраженную близость с белками - продуктами онкогенов.

По молекулярной массе, структуре, принадлежности к пептидам и гликопротеидам ФР представляют гетерогенную группу. Часть из них, такие как эпидермальный фактор роста (ЭФР), трансформирующий фактор роста а (ТФР-а), инсулиноподобные ростовые факторы (И РФ) -одноцепочечные пептиды (пептидные ФР - ПФР) с молекулярной массой 6-7кДа. Другие ФР, такие как фактор роста выделяемый тромбоцитами (ФРВТ), трансформирующий фактор роста (3 (ТФР-(3) - двухцепочечные (гликопротеины) с молекулярной массой около ЗОкДа [16].

С конца 70-х годов утвердилась точка зрения, что разные ФР стимулируют прохождение клетками разных участков фазы G-j. [19]: 1) факторы

компетенции, делающие клетки компетентными к восприятию других факторов, что часто обозначают как переход из фазы покоя Go в фазу Gi

(ФРВТ и ряд гомологичных белков, например, продукт онкогена sis [58] и

др.). 2) факторы прорессии, вызывающие у компетентных клеток вступление в репликацию, что обозначают как переход из фазы G-j в фазу S

(ЭФР, ТФР-а, ИФР-1, ИФР-2 и др.) [8, 19]. Считается, что остальные фазы цикла от ФР не зависят, поскольку клетки завершают синтез ДНК и митоз

даже при удалении ФР из межклеточной среды. Регуляторы пролиферации также принято делить на позитивные и негативные, например, кей-лоны. Под кейлонами подразумевают аутокринные ингибиторы делений, действующие строго тканеспецифично, нецитотоксично и обратимо [19].

ФР могут действовать как тканеспецифично, так и на многие типы клеток [10], что определяется, в первую очередь, тканеспецифичностью экспрессии рецепторов к ФР В тоже время ингибирование и стимуляция пролиферации не зависят от количества рецепторов и их связывающей способности [25]. Рецепторы многих ФР являются протеинкиназами, фос-форилирующими тирозиновые остатки: например рецепторы ЭФР, ФРВТ, фактор роста фибробластов (ФРФ) и инсулина, рецепторы ТФР-3 [21], фактор роста тимоцитов |3 (ФРТ-р) и ИРФ-2 не имеют киназной активности [57]. Связывание с ФР вызывает аутофосфорилирование рецептора, что необходимо для его активации.

Остановимся подробнее на некоторых наиболее изученных ФР ТФР стимулируют пролиферацию и индуцируют фенотипическую трансформацию клеток [21]. ТФР-а [153] относится к семейству ЭФР-подобных пептидов, имеющих сходное строение и конкурирующих за связывание с его рецептором. ТФР-(3 - семейство белков, состоящее из 5 изоформ, причем млекопитающие экспрессируют из них только три [16]. ТФР-0 относят к кейлонам [19, 197].

Интерлейкины (ИЛ) - принадлежат к семейству цитокинов или семейству гормоноподобных молекул, участвующих в регуляции иммунных процессов. В настоящее время известно более 10 интерлейкинов, все они могут быть охарактеризованы как секреторные регуляторные белки [13].

Фактор некроза опухоли (ФНО) является одним из цитокинов и способен вызывать геморрагический некроз опухоли при помощи реализации рострегулирующего потенциала макрофагов [26, 87]. Сравнение физико-

химических и серологических характеристик ФРФ моноцитарного происхождения и ФНО указывает на их возможную гомологию [25].

ИРФ (соматомедины) влияют на линейный рост организма, синтез белка и нуклеиновых кислот, поддержание определенного уровня митоти-ческой активности. Найдена высокая степень гомологии между первичной структурой этих пептидов и последовательностью а.к. в инсулине [8].

Колониестимулирующие факторы (КСФ) - гемопоэтические Ф.Р.[24]. Интерфероны (ИНФ) - обладают антивирусными и антипролифера-тивными эффектами [24].

1.1. Основные свойства ростовых факторов 1.1.1 Бифункциональность. Бифункциональность в отношении пролиферации - достаточно универсальное свойство ПФР и зависит от нескольких обстоятельств:

1) свойств клетки-мишени: например, один и тот же эпитоп ФНО отвечает как за ростстимулирующую, так и за ростингибирующую и цитотоксичес-кую активность молекулы [187].

2) условий культивирования клеток: например, наблюдается отсутствие соответствия между противоопухолевым действием ФНО in vivo и in vitro для одних и тех же ли