Разработка и экспериментальное обоснование клинического применения комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Орлова, Елена Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка и экспериментальное обоснование клинического применения комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка и экспериментальное обоснование клинического применения комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

На правах рукописи

ООЗО544 17

Орлова Елена Владимировна

РАЗРАБОТКА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО НУКЛЕОТИДНОГО ПРЕПАРАТА ИЗ ДРОЖЖЕЙ Басскаготусех сегем51ае.

03.00.04,- биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2007

003054417

Работа выполнена в Государственном научном учреждении "Всероссийский научно- исследовательский институт пищевой биотехнологии" РАСХН и Федеральном государственном учреждении "Российский кардиологический научно- производственный комплекс" Росздрава РФ.

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор

Арзамасцев Евгений Вениаминович

Яровая Галина Алексеевна Болдырев Александр Александрович

Доктор биологических наук,

профессор Старосельцева Людмила Константиновна

Ведущая организация: Биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова

Защита состоится 19 марта 2007 года в 14.00 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.002.01 в ГУ НИИ питания Российской академии медицинских наук по адресу: 109240, Москва, Устьинский проезд, д. 2/14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ питания РАМН Автореферат разослан « Z У » 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук,

профессор В.М.Коденцова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди важнейших внутриклеточных компонентов особое положение занимают вещества нуклеотидной природы, которые в качестве кофакторов и в составе ДНК и РНК участвуют в таких жизненноважных процессах живых организмов, как биосинтез белков, регуляция биохимических процессов, энергетического обмена, иммунитета и функционирования наследственного аппарата. В настоящее время существенно возрос интерес к поиску и разработке лекарственных препаратов на основе природных нуклеотидов, которые могут стать эффективными средствами регуляции различных функций организма и метаболической терапии (van der Giet M. et al., 2001; Химкина JI.H. с соавт, 2001; Медведев М.С. с соавт., 2002). Известна также ключевая роль некоторых нуклеотидов в синтезе оксида азота- NO, которому принадлежит важная роль в регуляции многих биохимических процессов, в частности, активировании гуанилатциклазы, фосфолипазы С, влиянии на синтез инсулина, адреналин- и дофаминергическую системы. Кроме того, NO является нейротрансмиггером и веществом, участвующим в регуляции артериального давления, иммунореактивности и многих других важных физиологических процессов (Kerwin, J. F., et al., 1995, Bartberger M. D., et al., 2002). В связи с тем, что влияние нуклеотидов на синтез NO в организме осуществляется путем изменения активности NO-синтаз (NOS), в частности Са 24 - зависимой NO-синтазы, поиск препаратов, влияющих на активность NOS, является одной из актуальных задач современной биологии и медицины.

Наше внимание привлекла возможность получения нуклеотидных препаратов из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые по данным Лидак М.Ю., (1980); Заерко В.В с соавт, (2000) обладают выраженной биологической активностью, низкой токсичностью и перспективны для разработки на их основе лекарственных препаратов для повышения иммунореактивности организма, коррекции метаболических нарушений и

нормализации физиологических процессов при развитии ряда патологических состояний.

Цели исследования: получение нуклеотидных препаратов при различных условиях культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae, оценка влияния полученных препаратов на активность Са2+- зависимой NOS, выбор наиболее активного из них, исследование его фармакологических свойств и токсичности для получения разрешения на проведение клинических испытаний препарата.

Для достижения указанных целей были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способы получения и стандартизации нуклеотидных препаратов из 5 штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae при различных условиях их культивирования.

2. Изучить влияние условий культивирования исследуемых штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae на активность полученных нуклеотидных препаратов по действию на Са2+-зависимую NO-синтазу тимоцитов крыс Wistar и отобрать наиболее активный из них.

3. Исследовать иммуномодулирующее действие отобранного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae на основные звенья гуморального и клеточного иммунитета, а также на систему естественной резистентности организма.

4. Исследовать антиоксидантное действие полученного нуклеотидного препарата при окислительном стрессе на модели диабета 2 типа у крыс Wistar и изучить влияние препарата на секрецию инсулина Р-клетками поджелудочной железы при данной патологии.

5. Изучить цитотоксическое действие полученного нуклеотидного препарата на клетки человеческой аденокарциномы линии HeLa, человеческой монобластоидной линии U937, человеческой карциномы молочной железы MCF7 и мышиной фибробластомы L929.

6. Провести доклиническое токсикологическое изучение нуклеотидного препарата для получения разрешения на проведение его клинических испытаний.

Научная новизна и практическая значимость работы.

о Впервые разработан способ получения, изучен состав и биологическая активность комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14, который является активатором Са2+ зависимой N0- синтазы, обладает

иммуномодулирующей активностью, защищает при окислительном стрессе и стимулирует образование инсулина Р-клетками поджелудочной железы при диабете 2 типа и является селективным апоптотическим фактором по действию на опухолевые клетки. По эффективности действия разработанный препарат не уступает используемым в настоящее время в клинической практике лекарственным препаратам аналогичного действия. Препарат малотоксичен, не обладает мутагенными, эмбриотоксическими, тератогенными, аллергизирующими свойствами и не влияет на репродуктивную функцию животных.

о Изучен предполагаемый механизм действия препарата, связанный с его нормализующим действием на систему свободно-радикального окисления путем активации ряда таких ключевых ферментов и ферментных систем, как Са 2+ - зависимая N0- синтаза и активация Са + - мобилизующей системы, глутатион-связывающей системы и, возможно, с нивелированием убиквитин-перехватывающей активности.

о На модели диабета 2 типа у крыс установлено, что полученный нуклеотидный препарат оказывает выраженное антиоксидантное действие, восстанавливая нарушенные системы супероксид-перехватывающей активности и восстановленного глутатиона. Назначение препарата купирует изменение активности синтазы оксида азота, вызванное стрептозотоцином.

о Впервые получены данные, свидетельствующие о способности разработанного препарата в концентрациях 0,2-0,5 мг/мл оказывать цитотоксическое действие in vitro на перевиваемые клетки аденокарциномы линии HeLa, человеческой монобластоидной линии U937, человеческой карциномы молочной железы MCF7 и мышиной фибробластомы L929.

о Установлено, что в диапазоне испытанных концентраций нуклеотидный препарат активирует каспазу-3 в опухолевых клетках указанных выше линий, вызывая при этом снижение доли G2/M в популяции клеток и увеличение доли апоптотирующих клеток (< Gi) и не влияет на клетки в культуре нормальных лейкоцитов человека, т.е. обладает селективным апоптотическим действием на опухолевые клетки.

о На способ получения, являющийся экологически чистым, безотходным, и биологическую активность разработанного

комплексного нуклеотидного препарата получено 3 патента Российской Федерации (№ 2128218, № 2128702, № 2138549) и 3 Европатента (ЕР 0 805 201, ЕР 0 805 202, ЕР 0 805 203). На Всемирном салоне «Брюссель-Эврика-98» изобретение награждено Золотой медалью.

Внедрения в клиническую практику.

В соответствии с Законом Российской Федерации, разработанный комплексный нуклеотидный препарат зарегистрирован Министерством здравоохранения РФ в качестве лекарственного средства иммуностимулирующего действия для лечения острых респираторных вирусных инфекций у взрослых и детей с 6 лет и старше, сезонной профилактики ОРВИ, а также для комплексной терапии сахарного диабета 2 типа (Регистрационное удостоверение № Р №000949/ 02-2001 от 27.12.2001, ФСП 42-0331-1690-01, код ATC-[L0AX]), и в качестве БАД (Регистрационное удостоверение Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека № 77.99.23.3.У.9412.8.05 от 16.08.2005).

Результаты исследований использованы при подготовке методических

указаний для врачей "Перекисное окисление липидов и его значение в

патогенезе сахарного диабета и его осложнений" Министерства

здравоохранения и социального развития РФ (Москва, 2004).

Результаты исследований используются в клинической практике по

целевой Федеральной программе "Профилактика гриппа и ОРВИ в

дошкольных и школьных учреждениях"

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Оптимальным источником для получения нуклеотидного препарата из 5 изученных штаммов хлебопекарных дрожжей Saccharomyces cerevisîae (раса 14, гибрид 67, гибрид 581, гибрид 722, гибрид 739) при различных режимах культивирования на глюкозе является раса 14. Полученный при этом комплексный нуклеотидный препарат содержит: адениновые нуклеотиды, свободные аминокислоты, микро- и макроэлементы, витамины, жирные кислоты и обладает выраженным активирующим действием на Са2+-зависимую NOS тимоцитов крыс Wistar.

2. Нуклеотидный препарат, полученный из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14, оказывает выраженное иммуномодулирующее действие на клеточный и гуморальный иммунитет, а также на систему естественной резистентности организма.

3. На модели инсулиннезависимого диабета (диабет 2 типа) у крыс Wistar нуклеотидный препарат в диапазоне испытанных доз от 100-1000 мг/кг при внутрижелудочном введении животным обладает выраженным гипогликемическим эффектом и повышает уровень секретируемого поджелудочной железой инсулина. При этом восстанавливается уровень сульфгидрильных групп глутатиона в плазме крови, нормализуется активность СОД и супероксидперехватывающей активности, а также уровень Са2+-зависимой NOS в печени, (î-клетках поджелудочной железы и буром жире, что свидетельствует о нормализации антиоксидантных систем организма. У интактных животных нуклеотидный препарат не влияет на указанные выше биохимические показатели.

4. Нуклеотидный препарат в концентрациях 0,2-0,5мг/мл обладает цитотоксическим эффектом на перевиваемых клетках человеческой аденокарциномы линии HeLa, человеческой монобластоидной линии U937, человеческой карциномы молочной железы линии MCF7 и мышиной фибробластомы L929; активирует каспазу-3 в клетках указанных опухолевых линий, изменяет их клеточный цикл и не влияет на эти показатели в эксперименте на интактных лейкоцитах донорской крови человека. Нуклеотидный препарат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae обладает селективным апоптотическим действием на опухолевые клетки.

5. Нуклеотидный препарат, полученный из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, является малотоксичным при однократном введении мышам и крысам, хорошо переносится при длительном назначении лабораторным животным. Препарат не проявляет мутагенности в тесте Эймса, не вызывает хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей и не влияет на количество доминантных леталий в зародышевых клетках мышей. При назначении беременным крысам препарат не обладает эмбриотоксичностью и тератогенностью. Препарат не влияет на репродуктивную функцию половозрелых животных. В испытанных дозах и схемах введения препарат не проявляет аллергизирующего действия.

6. Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать полученный комплексный нуклеотидный препарат в качестве лекарственного средства сопутствующей терапии для коррекции метаболических нарушений при диабете 2 типа, в качестве иммуностимулятора и БАД общеукрепляющего действия.

Апробация работы.

Основные результаты работы были доложены, обсуждены и опубликованы в материалах следующих симпозиумов и конференций: The XI-Th International Symposium on Microsoms and Drug Oxidation, Los-Angeles, USA, 1996; International Conference of EPR Spectroscopy of NO in Biological Systems. Suzdal, Russia, 1996; The VII Bait-LAS A Conference «Animal Models», Vilnius, Lithuania, 1997; 6th European Symposium on calcium binding properties in normal and transformed cells. Paris, France, 2000; International Conference "New food technologies" , Russia, Moscow, 2003; 11-th International Congress of yeasts "Yeasts in science and technology. The quest for sustainable development", Brazil, Rio De Janeiro, 2004; 25th Congress of Russian Biochemical Society, Russia, Moscow, 13-15 October, 2004, p.44; XII международный конгресс "Человек и лекарство", 2005, Москва, Россия, с.497., International Conference NMRCM-2005, Russia, St. Petersburg, 11-15 July, 2005, p.94; VI Научно-техническая конференция-выставка с международным участием "Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации", Москва, 2006, 15-16 ноября, с. 24.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 31 печатная работа, из них 9 статей в журналах перечня ВАК Министерства образования и науки РФ, 1 монография, 15 работ в материалах международных конференций. Получено 6 патентов (3 Патента РФ и 3 Европатента), а также Золотая медаль Всемирного салона "Брюссель-Эврика-98".

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 233 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 56 таблицами, 21 рисунком. Список литературы содержит 581 источник, в том числе 112 отечественных и 463 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При разработке нуклеотидного препарата были использованы 5 штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae (гибриды 67, 581, 722, 739 и раса 14), полученные из коллекции Института общей генетики РАН.

Экспериментальные исследования выполнены на: 150 мышах линии СВА, 144 мышах линии BALB/c, 72 мышах линии С57В16, 45 мышах-гибридах Fi (СВА х C57BL6), 272 крысах Wistar, 15 пестрых морских свинках, 24 морских свинках-альбиносах, 10 кроликах и 10 беспородных собаках.

На этапе технологических исследований при выборе наиболее оптимального продуцента нуклеотидных препаратов культивирование указанных выше штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в зависимости от поставленных задач, проводили в ферментерах типа АНКУМ-2 (СКБП АН СССР) объемом 10,0 л периодическим способом и в условиях протока на средах с глюкозой и этанолом. При многоступенчатом непрерывном культивировании дрожжей Saccharomyces cerevisiae на среде с этанолом, а затем после его полного потребления на глюкозе, осуществляли выращивание указанных дрожжей в батарее из 5 аппаратов типа АНКУМ-2.

Для выделения нуклеотидного препарата дрожжевую биомассу с концентрацией 40 г/л (по влажному весу) и имеющую рН 6,8-7,0 нагревали до 90°С в течение 20 мин. (при постоянном перемешивании). Затем нагревание прекращали и суспензию дрожжевой биомассы выдерживали 3 ч при 34°С при постоянном перемешивании для деполимеризации нуклеиновых кислот. Полноту денуклеинизации определяли по снижению нуклеиновых кислот в биомассе и по появлению аденинового пула в центрифугате. Адениновую компоненту в центрифугате идентифицировали по спектрам поглощения образцов центрифугата; в качестве стандарта использовали аденин (Sigma).

Активность Са2+-зависимой NOS в тимоцитах крыс Wistar определяли методом Hwang S., et al (1994) с некоторыми модификациями (Орлова Е. В.,

2005). Тимоциты выделяли из тимуса крыс Wistar по методу Förstermann U., Schmidt H.H. (1991).

Для определения активности ряда ключевых ферментов гликолиза, пентозофосфатного шунта и цикла трикарбоновых кислот в бесклеточных гомогенатах использовали особенности их сопряжения с реакцией восстановления- окисления NAD- NADP. При этом активность пируваткиназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы определяли по методу Bennet R. J. et al, (1968), изоцитратдегидрогеназы и изоцитратлиазы по Bellion Е., Hersh L., (1972).

При приготовлении бесклеточных гомогенатов клетки культивируемых дрожжей отделяли от культуральной жидкости центрифугированием и брали по 1 г осадка, который дважды промывали 0,01 М TRISHC1 буфером и затем дезинтегрировали на прессе Хьюза-Итона. Процесс дезинтеграции клеток контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии. Разрушенные клетки центрифугировали при 14000 g в течение 1 часа и полученный супернатант использовали для определения активности ферментов и содержания белка.

При изучении состава полученного комплексного нуклеотидного препарата содержание аминокислот определяли на аминокислотном анализаторе "Varian" (США). Микро- и макроэлементы определяли методом атомно-адсорбционной спектроскопии по методу Enujiugha V.N, (2003) на атомно-адсорбционном спектрометре фирмы "Varian" (США).

Витамины, нуклеиновые кислоты и углеводы определяли, используя высокоэффективный жидкостной хроматограф фирмы "Waters" (США). Колонки "Symmetry С18" производства фирмы «Waters» (США) использовали для анализа водорастворимых витаминов (В1 (тиамин), В2 (рибофлавин), ниацин (витамин РР), холин, пантотеновая кислота, В6 (пиридоксин), фолиевая кислота, биотин) и углеводов. Колонки "Nucleosil С18" производства фирмы «Macherey-Nagel» (Германия) - для определения содержания жирорастворимых витаминов Е (токоферолы) и К (филлохинон, пренилменахинон), для определения жирных кислот использовали обращено-

фазную колонку "С[8]" фирмы "Shimadzu" (Япония). Для анализа нуклеиновых кислот применяли DEAE-анионообменную колонку "Nucleogen 4000-7" фирмы «Macherey-Nagel» (Германия) (Dell'Anno М. et al., 1998, Nishiyama-Naruke A. et al., 1998).

Исследование влияния нуклеотидного препарата на систему иммунитета проведено на мышах линий СВА, BALB/c, С57В1б (самцы и самки, масса тела 16-18г), полученных из питомника "Столбовая" РАМН и лимфоцитах донорской крови человека.

При изучении влияния нуклеотидного препарата на В-клеточное звено иммунитета определяли титры агглютининов к эритроцитам барана в сыворотке крови мышей в тесте прямой гемагглютинации по методу Кудриной Г.П. с соавт., (1992), количество антителообразующих клеток в селезенке мышей, иммунизированных эритроцитами барана, определяли по методу Ерне (Jeme N.K.. Nordin А.А, 1963), влияние препарата на реакцию бластгрансформации В- лимфоцитов, индуцированную липополисахарядом исследовали по методу Фукса Б.Б. и соавт., (1986).

Для оценки влияния нуклеотидного препарата на Т-клеточное звено иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) по методу Гусева Е.Ю. и соавт., (1991) и метода поликлональной активации Т-лимфоцитов фитогемагглютинином и конканавалином А по методу Фукса Б.Б. и соавт., (1986).

При исследовании влияния нуклеотидного препарата на поликлональную активацию Т-лимфоцитов, индуцированную фитогемагглютинином (ФГА) и конканавалином А (КонА) использовали суспензию клеток селезенки мышей СВА. Пролиферацию и бласттрансформацию Т-лимфоцитов оценивали по количеству меченого 3Н-тимидина (Amersham, США), включенного в ДНК лимфоцитов. Результаты выражали в имп/мин.

Изучение влияния нуклеотидного препарата на продукцию ИЛ-2 клетками селезенки мышей BALB/c, стимулироваными КонА, проводили по методу Сухих Г.Т. и соавт., (1984).

Оценку влияния нуклеотидного препарата на продукцию ИЛ-2 лимфоцитами периферической крови человека, стимулированными ФГА, проводили по методу Lyte М. (1987).

Исследование влияния нуклеотидного препарата на уровень глюкозы, секрецию инсулина и функциональное состояние р-клеток поджелудочной железы у интактных крыс и крыс с диабетом 2 типа проведено в 4-х сериях экспериментов. ВI серии экспериментов на интактных крысах Wistar (самцы, масса тела 180-200 г) изучали влияние нуклеотидного препарата в различных дозах на уровень глюкозы по методу Trinder Р., (1969) и инсулина в крови (радиоиммунологическим методом с помощью коммерческих наборов РИА-инсулин (Минск, Беларусь)).

Во II серии экспериментов на предварительно голодавших в течение 24 ч крысах Wistar (самцы, масса тела 180-200 г) исследовали влияние нуклеотидного препарата в различных дозах на уровень глюкозы и инсулина в крови. В качестве контроля использовали крыс, у которых оценивали изменение указанных показателей в ответ на внутрибрюшинное и внутривенное введение глюкозы и физиологического раствора.

В III серии экспериментов на крысах Wistar (самцы, масса тела 180-200 г) с инсулиннезависимым диабетом (диабет 2 типа) изучали влияние различных доз нуклеотидного препарата при его ежедневном введении в течение 3-х недель на уровень глюкозы и инсулина в крови. Модель инсулиннезависимого диабета у крыс воспроизводили по методу Porta B.G. et al., (1989).

В IV серии экспериментов изучали прямое действие нуклеотидного препарата на функциональную активность р-клеток островков Лангерганса, используя культуру изолированных клеток поджелудочной железы крысят Wistar 3-5-дневного возраста.

Для проведения различных биохимических исследований при изучении влияния нуклеотидного препарата на показатели окислительного стресса и антиоксидантной защиты в органах, тканях и средах организма ткани гомогенизировали в автоматическом гомогенизаторе Поттера и

получали тканевые экстракты по методикам Forstermann et al (1991), Fandrey J., et al., (1990), Wenger RH et al., (1997), Wang J., et al., (1991), на которых проводили указанные исследования.

Определение активности NOS осуществляли радиометрически по образованию 3Н-цитруллина из 3Н-Ь-аргинина (Bredt and Snyder, 1994). Выявление различных изоформ NOS проводили в трех параллельных пробах с использованием специфических ингибиторов центров связывания фермента: для каталитического центра связывания - Ыт-монометил-Ь-аргинин (L-NMMA) (Sigma, США) 0.9цМ (nNOS) и 2.1 цМ (iNOS), для аллостерического Са-связывающего центра NOS - трифлюоперазин (TFP) (Sigma, США) (20цМ) и калмидазолиум хлорид (R24571) (Sigma, США) (20цМ).

Содержание тиолов в органах, тканях и средах организма определяли по методу Hayes JD et al., (1999).

Активность супероксиддисмутазы в эритроцитах и супероксид-перехватывающую активность в мышцах, печени, головном мозге и плазме крови определяли по восстановлению нитросинего тетразолиевого в системе генерации супероксидного радикала феназинметасульфат-НАДН (Nishikimi M., 1972).

Продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой, определяли в плазме по методу Ohkawa H. Et al., (1979), a в тканях - по методу Путилиной Ф.Е, (1982).

Определение активности каспазы-3 в культуре клеток человеческой аденокарциномы линии HeLa, человеческой монобластоидной линии U937, человеческой карциномы молочной железы линии MCF7, мышиной фибробластомы L929 и в лейкоцитах донорской крови человека проводили по методу Barge R. M. Y., et al, (1997) и Thornberry N.A, (1994).

Исследование действия нуклеотидного препарата на клеточный цикл проводили методом проточной цитометрии на проточном цитометре-анализаторе в лаборатории структурно-функционального анализа клеток Института биофизики клетки РАН. Исследования проведены при добавлении

нуклеотидного препарата в концентрациях 0.2 и 0.5 мг/мл к 100%-ному монослою клеток при культивировании в течение 72 ч.

Выделение нейтрофилов из цельной крови проводили модифицированными методами Showell Н. J.et al.,(1998) и Cormier A. et al., (2004).

Образование АФК нейтрофилами регистрировали методом люминол-зависимой хемилюминесценции на люминометре 1250 LKB (Швеция). В качестве активатора генерации активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами использовали fMLP (Formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine) (1ц М).

Фагоцитоз исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа. В качестве объекта фагоцитоза использовали меченые флюоресцеин-изотиоцианатом (FITC) пекарские дрожжи.

Адгезию нейтрофилов регистрировали по количеству неприлипших клеток.

Белок в сыворотке крови и других биологически пробах определяли по методу Лоури (Lowry О.Н., et al.,1951).

Токсикологическое изучение нуклеотидного препарата проведено в соответствии с современными требованиями органов здравоохранения к безопасности новых лекарственных препаратов и "Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ" (М., 2000) в 6 сериях экспериментов.

В 1 серии экспериментов было проведено изучение токсичности и переносимости нуклеотидного препарата на мышах линии BALB/c и на крысах Wistar при однократном внутрижелудочном введении. Параметры токсичности препарата определяли методом пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону (Беленький М. Л., 1963).

Во 2 серии экспериментов было проведено изучение токсичности нуклеотидного препарата при длительном внутрижелудочном введении в условиях 3-месячного хронического эксперимента на крысах и 2-х месячного опыта на собаках.

В 3 серии экспериментов проведено изучение эмбриотоксических и тератогенных свойств нуклеотидного препарата.

В 4 серии экспериментов было проведено изучение влияния нуклеотидного препарата на репродуктивную функцию крыс линии Wistar.

В 5 серии экспериментов было проведено изучение мутагенных свойств и потенциальной канцерогенной опасности нуклеотидного препарата. При этом были проведены следующие исследования:

1. Учет генных мутаций на микроорганизмах в тесте Эймса.

2. Учет хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих.

3. Учет доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей.

4. Изучение ДНК - повреждающего действия в SOS-хромотесте.

В 6 серии экспериментов проведено изучение аллергизирующих свойств нуклеотидного препарата. При этом было исследовано влияние препарата на:

1. реакцию гиперчувствительности III типа;

2. реакцию гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок;

3. непрямую реакцию дегрануляции тучных клеток (РДТК) (Федосеева В.Н. с coaem, 1993);

4. оценка аллергизирующего действия препарата при накожных аппликациях.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета статистических программ "SPSS", "Statistica 6.0" и "Excel 2000".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка методов получения и стандартизации нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Высокая устойчивость рибонуклеаз к действию денатурирующих

факторов, в том числе и к сильно кислой среде, показанная Ohta N. et al.,

(1978), была положена в основу разработанного нами метода

денуклеинизации биомассы дрожжей (патент Российской Федерации

№2128218 и Европатент ЕР 0 805 201).

На 1 этапе технологических разработок необходимо было изучить влияние состава среды и различных условий культивирования 5 штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae на количественный выход нуклеотидных препаратов и оценить их действие на активность Са2+-зависимой NOS тимоцитов крыс. Результаты проведенных исследований, показали, что наилучшим штаммом для получения нуклеотидного препарата из 5 изученных является штамм дрожжей Sacchromyces cerevisiae раса 14 (таблица !)•

Таблица 1. Влияние выращивания штаммов Saccharomyces cerevisiae в условиях периодического культивирования на средах с глюкозой и этанолом на степень денуклеинизации, содержание аденина в получаемых нуклеотидных препаратах и эффективность их действия на активность Са2+-зависимой NOS из тимоцитов крыс Wistar.

Штаммы Saccharomyces cerevisiae Содержание нуклеиновых кислот в сухой биомассе, в % Содержание адепинового пула в денуклеинизате, в% Активность Са2+-зависимой NOS, мкМ NOVmhh/мг белка

До денуклеинизации После денуклеинизации

Выращивание на среде с глюкозой

Раса 14 7,8±0,1 0,41±0,03 2,8±0,1 73,050±0,011

Гибрид 722 7,2±0,3 0,86±0,04 1,9±0,3 60,006±0,016

Гибрид 67 7,6±0,1 0,87±0,03 1,9±0,3 59,003±0,010

Гибрид 581 7,2±0,2 0,85±0,05 1,8±0,4 57,030±0,014

Гибрид 739 5,9±0,2 0,72±0,05 1,9±0,3 59,800±0,013

Выращивание на среде с этанолом

Раса 14 5,9±0,3 1,10±0,04 0,82±0,40 27,070±0,009

Гибрид 722 5,8±0,1 2,01±0,05 0,78±0,31 25,510±0,010

Гибрид 67 6,1±0,1 1,98±0,03 0,76±0,24 25,014±0,010

Гибрид 581 6,2±0,1 1,88±0,04 1,77±0,30 25,030±0,014

Гибрид 739 6,0±0,1 1,78±0,04 0,71±0,34 24,800±0,010

Как видно из представленных в таблице 1 данных, процесс денуклеинизации биомассы, выход аденинового пула у всех исследуемых штаммов дрожжей и влияние полученных препаратов на активность Са2+-зависимой NOS при выращивании клеток на среде с этанолом были ниже,

чем при их росте на среде с глюкозой. По-видимому, это связано с более низкой активностью РНКаз в условиях роста дрожжей на этаноле.

Большой выход аденинового пула при денуклеинизации биомассы дрожжей, выращенных на среде с глюкозой, демонстрируется на рис 1.

Рис.1. Спектры поглощения адениновой компоненты в образцах нуклеотидного препарата,

полученных при выращивании дрожжей Засскготусеь сегеуЫеах

(_) -на среде с глюкозой; (----

) - при измненении неуглеводного типа обмена веществ на углеводный; (-х-х-х) - на среде с этанолом.

Сравнительное изучение влияния комплексного нуклеотидного препарата, полученного с использованием разработанного метода из дрожжей Sacchromyces cerevisiae раса 14 при их культивировании на среде с глюкозой, и иммуностимулятора Т-активина при их 3-крагаом в/брюшинном введении крысам Wistar на активность Са2+-зависимой NOS из тимоцитов показало высокую активность нуклеотидного препарата. Доза тестируемого образца нуклеотидного препарата была сравнима с рекомендуемыми для практического применения дозами нуклеината натрия (Машковский М.Д., 1997).

При этом комплексный нуклеотидный препарат в испытанной дозе 10 мг/кг оказывал более выраженное активирующее действие на Са2+-зависимую NOS (уменьшение Кт в 2.6 раза) по сравнению с Т-активином (таблица 2).

ОП;

Таблица 2. Влияние полученного иуклеотидного препарата и Т-активина при 3-кратном в/б введении крысам Wistar на кинетические параметры Са2+-зависимой NOS.

Исследуемые параметры Исследуемые кинетические параметры для Са""-зависимой NOS

Km, м M L-Arg V, мкМ 1\Ю"2/мин/мг белка

Контроль -интактные тимоциты 0,0620+0,0008 6,300±0,040

Нуклеотидный препарат (10 мг/кг) 0,0030±0,0004* 73,210±0,025*

Т-активин (0,25 мг/кг) 0,0080±0,0003* 65,100±0,021*

Здесь и во всех последующих таблицах означают: *- достоверные отличия по сравнению с контролем при Р<0,05 ** - достоверные отличия по сравнению с контролем при Р<0,01

Одноступенчатое хемостатное культивирование микроорганизмов получило всеобщее признание и нашло широкое применение в научных исследованиях и в условиях производства. Поэтому информация о возможности получения нуклеотидного препарата из дрожжей Sacchromyces cerevisiae раса 14 в условиях одноступенчатого хемостата имела первостепенное значение для оценки перспективности практического использования этого процесса. Как и предполагалось, при выращивании дрожжей в режиме одноступенчатого хемостата на средах с глюкозой и этанолом наблюдалось существенное уменьшение содержания аденинового компонента в нуклеотидном препарате и снижение его активирующего действия на Са2+-зависимую NOS из тимоцитов крыс Wistar по сравнению с режимом периодического культивирования (таблица 3).

Таблица 3. Влияние выращивания дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 в режиме одноступенчатого хемостата на средах с глюкозой и этанолом на степень денуклеинизации, содержание аденина в нуклеотидных препаратах и эффективность их действия на Саг+-зависимую NOS из тимоцитов крыс Wistar.

Штамм дрожжей Содержание НК в биомассе, % Содержание аденинового пула в денук-леинизате, % Активность Са**-зависимой NOS, мкМ NOVmhh/мг белка

До денуклеинизации После денуклеинизации

Выращивание на среде с глюкозой

Раса 14 4,8±0,4 2,2±0,5 0,31±0,01 7,630±0,011

Выращивание на среде с этанолом

Раса 14 3,9±0,4 2,8±0,2 0,21±0,04 5,210±0,010

При этом более выраженное снижение указанных показателей наблюдалось при культивировании дрожжей на среде с этанолом (таблица 3).

Полученные данные свидетельствуют о существенных различиях метаболизма дрожжей Басскаготусея сегеУ1$1ае при культивировании на разных средах. В этой связи представляло большой практический интерес исследование детальных особенностей метаболизма дрожжей и выхода нуклеотидного препарата при их выращивании на среде с этанолом и на глюкозе, а также возможности перестройки обмена дрожжей с неуглеводного (этанольного) на углеводный при ступенчатом добавлении в культуральную среду глюкозы.

Результаты проведенных исследований показали, что активности исследованных ферментов биомассы дрожжей, полученных в ферментерах с различной концентрацией глюкозы, очень сильно отличаются друг от друга. Активность ферментов в 1-3 ферментерах (с преобладанием в культуральной среде этанола и отсутствием глюкозы) отражала обмен веществ при росте дрожжей на этаноле. Во 2-ом ферментере активность ферментов, за исключением изоцитратлиазы, была довольно низкой. Функционирование глиоксилатного цикла свидетельствовало о наличии в среде неуглеводной природы углеродсодержащего субстрата. В 3-ем ферментере все ферменты, в том числе и изоцитратлиаза, находились практически в неактивном состоянии. Ингибирование активности изоцитратлиазы указывало на отсутствие неуглеводного источника углерода в среде (таблица 4). При утилизации глюкозы в 4-ом ферментере (с добавлением в среду глюкозы) началась перестройка неуглеводного типа обмена веществ на углеводный тип обмена и в 5-ом ферментере она была полностью завершена. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Таблица 4. Характеристика процесса получения дрожжей Засскаготусех сегеетае раса 14 с углеводным типом обмена веществ при последовательном непрерывном культивировании на средах с этанолом и глюкозой и показатели активности ферментов биомассы получаемых образцов дрожжей.

Анализируемые показатели Номера ферментеров

1 2 3 4 5 Контроль

Коэффициент разбавления, ч"1 0,09 0,09 0,09 0,14 0,19 0,18

Концентрация спирта в протоке, % 1,5 - - - - -

Концентрация глюкозы в протоке, % - - - 0,4 0,6 1,0

Концентрация биомассы, г/л по сухому весу 7,81 ±0,03 7,96±0,01 7,9410,03 9,31±0,01 11,94±0,03 4,87±0,03

Активность ферментов, мкмоль/мин/мг белка

Гексокиназа 0,181±0,002 0,068±0,04 0,031*0,01 0,924±0,02 1,162±0,04 1,141±0,01

Пируваткиназа 0,194±0,02 0,071±0,04 0,024±0,01 0,396±0,02 0,432±0,02 0,427±0,01

Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа 0,189±0,01 0,082±0,04 0,021±0,01 0,386±0,02 0,428±0,04 0,431±0,01

Ичоцитрат-дегидрогеназа 0,242±0,01 0,075±0,02 0,027±0,01 0,374±0,02 0,415±0,04 0,409±0,01

Изоцитратлиаза 0,287±0,02 0,135±0,02 0,024±0,01 0,018±0,01 0,019±0,04 0,021±0,01

"-" здесь и далее означает, что субстрат не вносили

В биомассе 4-го ферментера, куда поступала глюкоза, активность всех ферментов, за исключением изоцитратлиазы, очень сильно возросла, но была ниже, чем в биомассе 5-го ферментера (с преобладанием в среде глюкозы) и контроле. Это указывало на перестройку обмена дрожжей с неуглеводного типа обмена на углеводный. Практически одинаковая активность ферментов гликолиза, пентозофосфатного шунта, цикла трикарбоновых кислот и отсутствие функционирования глиоксилатного цикла в биомассе 5-го

ферментера и контроле указывают на полное завершение перестройки обмена веществ. Для оценки качества (по содержанию аденинового пула и по влиянию на активность Са2+-зависимой NOS из тимоцитов крыс Wistar) нуклеотидного препарата, полученного из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 с углеводным типом обмена веществ (5-й ферментер) при их выращивании на среде с этанолом, были проведены сравнительные исследования с препаратом контрольной группы при выращивании дрожжей на среде с глюкозой. Результаты эксперимента представлены в таблице 5.

Таблица 5. Показатели процесса денуклеинизации дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14, выращенных на этаноле с углеводным типом обмена веществ при непрерывном культивировании, и влияние полученного нуклеотидного компонента (10 мг/кг) при 3-кратном внутрибрюшинном введении крысам Wistar на активность Са2*-зависимой NOS из тимоцитов.

Анализируемые показатели Номера ферментеров

1 5 контроль

Коэффициент разбавления, ч"1 0,09 0,19 0,18

Концентрация спирта в протоке, % 1,5

Концентрация глюкозы в протоке, % - 0,6 1,0

Количество НК, в биомассе, % 2,8±0,1 5,8+0,2 5,7+0,2

Количество адениновый пула, % 0,21±0,02 2,6±0,1 2,7±0,1

Активность Са2*-зависимой NOS, мкМ ГЮУмин/мг белка 5,703±0,009 73,050±0,011 72,014±0,013

Как видно из данных таблицы 5, процесс денуклеинизации биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 в опыте и в контроле проходит с одинаковой интенсивностью, т.е. активность нуклеаз в дрожжах, выращенных на спирте с углеводным типом обмена веществ такая же, как и активность нуклеаз в дрожжах, выращенных на глюкозе, что также подтверждается данными об одинаковом влиянии полученных препаратов на активность Са2+-зависимой NOS тимоцитов крыс Wistar. Таким образом, осуществлено последовательное выращивание дрожжей Saccharomyces cerevisiae на этаноле и глюкозе, что позволяет получать указанные дрожжи на не пищевом сырье - этаноле с углеводным типом обмена веществ

(Патенты РФ: № 2128702, № 2138549, Европатенты: ЕР 0 805 202, ЕР 0 805 203).

В результате исследований был получен стандартизированный комплексный нуклеотидный препарат, являющийся порошком кремового цвета, хорошо растворимым в воде и содержащим адениновые нуклеотиды, а также другие биологически активные вещества- аминокислоты, витамины, микро- макроэлементы (таблица 6).

Таблица 6. Состав комплексного нуклеотидного препарата, мг/100г сухого вещества

Компоненты комплексного нуклеотидного препарата

Адениновые нуклеотиды (АН), аминокислоты Витамины Макро- и микроэлементы Жирные кислоты

АН 2800 В1 (тиамин) 0,58 Фосфор 130 Миристиновая 0,023

Аминокислоты: лизин 0,78 62 (рибофлавин) 7,15 Калий 294 Миристо-леиновая 0,015

Гистидин 0,39 ниацин (витамин РР) 10,8 Натрий 36,5 Пентадекановая 0,045

Аргинин 0,64 холин 253,0 Кальций 43,8 Пальмитиновая 2,2

Аспарагиновая кислота 1,17 пантотеновая кислота 42,5 Магний 47,6 Пальмито-леиновая 8,58

Треонин 0,55 В6 (лиридоксин) 0,59 Медь 0,2 Маргариновая 0,22

Серии 0,44 фолиевая кислота 0,83 Кобальт 0,16 Гептадеценовая 0,23

Глутаминовая кислота 4,64 В12(цианоко-баламин) 0,05 Железо 1,03 Стеариновая 1,075

Пролин 0,41 Н (биотин) 0,05 Марганец 0,32 Олеиновая 6,525

Глицин 0,73 К (филлохинон, пренил- менахинон) 0,62 Цинк 0,19 Линолевая 0,35

Алании 1,26 Е (токоферол) 0,36 Никель 0,17 Линоленовая 0,48

Валин 0,5 Хром 0,23 Арахиновая 0,25

Метионин 0,21 Молибден 0,35 Гадолеиновая 0,65

Изолейцин 0,34 Арахидоновая 0,30

Лейцин 0,42 Бегеновая 0,05

Тирозин 0,35

Фенилаланин 0,35

Цистеин 0,46

Изучение иммуномодулирующих свойств нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14.

В связи с важной ролью Са2+-зависимой NOS в регуляции многих иммунных процессов в организме человека и животных (Volk T. et al., 1997; Gross S.S. et al., 1995; Shmigol AV, et al., 2001; Willmott NJ, et al.,2000), представляло большой интерес исследование влияния полученного нуклеотидного препарата, повышающего активность указанного фермента, на отдельные звенья системы иммунитета.

При изучении влияния нуклеотидного препарата на B-клеточное звено иммунитета было установлено, что препарат в испытанных дозах 5 и 10 мг/кг при в/брюшинном и в/желудочном способах введения повышает иммунный ответ, увеличивая титр антиэритроцитарных антител в сыворотке крови и количество антителообразующих клеток в селезенке при иммунизации мышей эритроцитами барана в субоптимальной и, особенно, в оптимальной дозах (таблицы 7, 8).

Таблица 7. Влияние нуклеотидного препарата на титр гемагглютининов (1о&Т) к эритроцитам барана в сыворотке крови мышей линий СВА и С;7ВЬб при иммунизации эритроцитами барана в субоптимальной дозе.

Группы Доза и способ введения нуклеотидного препарата Линии мышей

СВА C57BI.6

log2T 1од2Т

1 контроль 3,80±0,41 3,50±0,55

2 в/б однократно 5мг/кг 4,50±0,42 3 67±0,65

3 в/б однократно 10мг/кг 4,67±0,62 4,33±0,36*

4 в/ж трехкратно 5мг/кг 4,67±0,65 3,83±0,76

Таблица 8. Влияние нуклеотидного препарата на количество антителообразующих клеток (АОК) у мышей линий СВА и С57ВЬв, иммунизировапных ЭБ (представлены средние геометрические и доверительные интервалы.)

Группы животных, испытанные дозы препарата и способ введения Количество АОК вселезенке мышей линий СВА и С57ВЦ. 1x104

СВА С57ВЦ

1 Группа - физиологический раствор (контроль) 5,81 (4,51-7,12) 2,78(1,90-3,67)

2. Группа -нуклеотидный препарат в/б 5 мг/кг 5,12 (3,91+7,02) 2,51 (2,24+2,77)

3 Группа -нуклеотидный препарат в/б 10 мг/кг 9,18 (7,86+10,51) 7,35 (6,25+8,45)"

4 Группа -нуклеотидный препарат в/ж трехкратно 5 мг/кг 7,07 (5,60-8,53)' 6,03 (4,90+7,15)"

Установлено, что нуклеотидный препарат в диапазоне испытанных концентраций 1-100 мкг/мл не влияет на индукцию бластгрансформации В-лимфоцитов селезенки мышей линии СВА бактериальным липополисахаридом (LPS). Указанный эффект может быть связан с тем, что нуклеотидный препарат является селективным активатором Са2+- зависимой NO-синтазы, a LPS как было показано Xie О. с соавт., (1994), является индуктором экспрессии iNOS, которая не является конститутивно экспрессируемой в большинстве тканей и органов, а индуцируется посредством стимуляции LPS или ее промотора - бактериальной хлорамфениколацетилтрансферазой. _

При исследовании влияния нуклеотидного препарата на Т-клеточное звено иммунитета было показано, что препарат в концентрации 100 мкг/мл усиливает пролиферативный ответ Т-лимфоцитов, индуцируемый ФГА в концентрациях 1 и 10 мкг/мл. Нуклеотидный препарат в концентрации 10 мкг/мл усиливает пролиферацию Т-лимфоцитов на ФГА в концентрации 10 мкг/мл (рис.2).

х103 (имп/мин)

0,1 1 Ю 50

мкг/мл ФГА

Д -ФГА; • -ФГА +НП (100 мкг/мл); о - ФГА+ НП (10 мкг/мл); где НП -нуклеотидный препарат.

Рис. 2. Влияние нуклеотидного препарата на пролиферацию Т -лимфоцитов селезенки мышей СВА, индуцируемую ФГА.

Установлено также, что нуклеотидный препарат оказывает резко выраженное нейтрализующее действие на активность КонА, что выражается

в пропорциональном смещении кривых доза-ответ (рис.3). Препарат дозозависимо усиливает ответ Т-лимфоцитов на высокие дозы КонА (2,5-20,0 мкг/мл) и угнетает ответ на малые (0,06-0,5 мкг/мл) и оптимальную (1,0 мкг/мл) дозы митогена.

Д -КонА; •- КонА+НП (100 мкг/мл); о- КонА+НП (10 мкг/мл); где НП-нуклеотидный препарат

Рис. 3. Влияние нуклеотидного препарата на пролиферацию Т- лимфоцитов селезенки мышей СВА, индуцируемую КонА.

Нуклеотидный препарат практически не оказывал влияния на реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у мышей.

При оценке влияния нуклеотидного препарата на продукцию интерлейкина-2 спленоцитами мышей линии ВАЬВ/с, стимулированными КонА, было установлено, что изучаемый препарат дозозависимо угнетает продукцию ИЛ-2 клетками селезенки мышей ВАЬВ/с (таблица 9).

Таблица 9. Влияние нуклеотидного препарата на продукцию ИЛ-2 клетками селезенки мышей ВАЬВС, стимулированными КонА.

Группы животных, испытуемые препараты и дозы Уровень выработки ИЛ-2, или °Н-тимидина, имл/мин

1 фуппа - КонА 9,45±4,40

2 группа - нуклеотидный препарат 10мг/кг Менее 1

3 группа - нуклеотидный препарат 50мг/кг Менее 1

4 группа - нуклеотидный препарат 100мг/кг Менее 1

5 группа КонА+ нуклеотидный препарат 10мг/кг е,4а±4,31

6 группа КонА+ нуклеотидный препарат 50мг/кг 7,00±3,83

7 группа КонА+ нуклеотидный препарат 100мг/кг 5,3112,31

Нуклеотидный препарат в испытанных концентрациях не влиял на продукцию интерлейкина-2 лимфоцитами периферической крови человека, стимулированными фитогемагглютинином. Таким образом, нуклеотидный препа-рат является иммуномодулятором широкого спектра действия, причем эффект препарата проявляется при различных способах введения, включая пероральный.

Исследование антидиабетического действия нуклеотидного препарата на модели диабета 2 типа.

Ключевыми моментами в патогенезе метаболических нарушений при диабете 2 типа являются снижение синтеза инсулина р-клетками поджелудочной железы и связанное с ним изменение обмена глюкозы с последующим развитием окислительного стресса. В связи с отмеченным Т1ес1£е М., й а1., (1997) и рядом других авторов при диабете 2 типа снижением активности Са2+-зависимой >Ю-синтазы, которая индуцирует продукцию инсулина р-клетками поджелудочной железы и принимает активное участие в защите организма от окислительного стресса, представлялось целесообразным изучение действия полученного комплексного нуклеотидного препарата.

Исследования на крысах 'М81аг с диабетом 2 типа вызванного стрептозотоцином (9 неделя заболевания), показали, что нуклеотидный препарат в испытанных дозах 100, 500 и 1000мг/кг уже при 7-дневном внутрижелудочном введении вызывает выраженный гипогликемический эффект, который существенно не зависел от величины использованной дозы. Гипогликемическое действие препарата несколько усиливалось при продолжении его назначения в испытанных дозах в течение последующих 14 и 21 дня (таблица 10).

Снижение уровня глюкозы в крови крыс с диабетом под влиянием нуклеотидного препарата в испытанных дозах 100, 500 и 1000 мг/кг сопровождалось ростом секретируемого инсулина (таблица 10).

Таблица 10. Влияние 3-недельного в/желудочного введения нуклеотидного препарата на содержание глюкозы и инсулина в крови у крыс АУ^аг с диабетом 2 типа.

Исследуемые показатели при диабете 2 типа Группы животных, дозы нуклеотидного препарата

1 группа -100мг/кг 2 группа -500мг/кг 3 группа -1000мг/кг

Исходный уровень

Глюкоза, моль/л 18,4±1,9 21,2±1,6 20,8±1,9

Инсулин, мкЕд/мл 10,2±1,5 8,7±0,9 8,4±0,8

Через 7 дней

Глюкоза, моль/л 8,3±1,7* 8,7±0,9** 10,6±0,9"

Инсулин, мкЕд/мл 13,1±1,2 12,6±1,5 10,5±0,9"

Через 14 дней

Глюкоза, моль/л 5,1 ±0,25" 5,5±0,3" 6,4±1,0"

Инсулин, мкЕд/мл 14,2±2,0 13,6±2,1* 11,7±1,2**

Через 21 день

Глюкоза, моль/л 5,9±0,3" 6,3±0,6* 6,2±0,5"

Инсулин, мкЕд/мл 15,0+2,1 13,3±1,4* 13,0±1,0"

В тоже время, длительное в/желудочное введение нуклеотидного препарата в тех же дозах интактным кpыcaмWistar не влияло на уровень инсулина и глюкозы в крови этих животных (таблица 11).

Таблица 11. Влияние 3-недельного в/желудочного введения нуклеотидного препарата на содержание глюкозы и инсулина в крови у интактных крыс Л\Ыаг.

Исследуемые показатели у интактных животных Группы животных, дозы нуклеотидного препарата

1 группа - ЮОмг/кг | 2 группа - 500мг/кг | 3 группа- ЮООмг/кг

Исходный /ровень

Глюкоза, моль/л 4,91 ±0,26 5,00±0,23 5,03±0,18

Инсулин, мкЕд/мл 13,6±1,5 12,8±0,8 11,3±1,5

Через 7 дней

Глюкоза, моль/л 5,17±0,21 5,26±0,39 5,16±0,23

Инсулин, мкЕд/мл 13,0±0,9 11,9±1,5 13,6±0,9

Через 14 дней

Глюкоза, моль/л 5,23±0,32 5,32±0,24 4,65±0,37

Инсулин, мкЕд/мл 12,8±0,7 13,0±0,9 13,6±0,9

Через 21 день

Глюкоза, моль/л 5,21±0,30 4,78±0,32 4,76±0,31

Инсулин, мкЕд/мл 12,9±0,7 13,6±1,5 14,3±1,5

В условиях in vitro в диапазоне испытанных концентраций было установлено, что нуклеотидный препарат дозозависимо стимулирует секрецию инсулина культивируемыми р-клетками островков поджелудочной железы новорожденных крысят Wistar. При этом наибольшая секреция инсулина наблюдалась при внесении в культуральную среду нуклеотидного препарата в концентрации 100 мкг/мл (таблица 12).

Таблица 12. Влияние нуклеотндиого препарата на секрецию инсулина культурой р-клеток островков поджелудочной железы новорожденных крыс \Vistar.

Исследуемые препараты, их концентрации Количество повторов эксперимента Концентрация инсулина, мкЕд/мл

Контроль 8 89,0±8,0

Нуклеотидный препарат 0 1 мкг/мл 8 94,0±7,0

Нуклеотидный препарат 1 0 мкг/мл 7 107,0±8,0

Нуклеотидный препарат 10 мкг/мл 7 124,0±9,0*

Нуклеотидный препарат 100 мкг/мл 8 137,0±15,0*

Глюкоза 20мМ 8 215,0±18,0"

Проведенные исследования показали, что развитие диабета 2 типа вызывает выраженный окислительный стресс в крови и тканях крыс. При этом наблюдается резкое снижение, вплоть до полного исчезновения, свободных 8Н-групп (глутатиона) в плазме крови и в гомогенатах головного мозга (рис. 4).

180,00 160,00 140,00 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00

□ 8Н общ ■ СБН В вН белк

1 -плазма

2-галовиой мозг

3-печень

4-мышца бедра

^_диабет_^ диаб+НП14

диаб+НПЗО

где НП14 и НП30 - применение нуклеотидного препарата в течение 14 и 30 дней

Рис. 4. Влияние 14- и 30-дневного в/желудочного введения нуклеотидного препарата в дозе 500мг/кг на динамику тиолов (пмоль/мг белка): общих вН-групп, белковых вН-групп и глутатиона (0811) при диабете 2 типа.

В то же время развитие диабета оказывало менее выраженное влияние на уровень 511-групп глутатиона в печени и мышце бедра животных. Следует отметить увеличение уровня белковых БН-групп в ткани мозга крыс с

диабетом, что, по-видимому, свидетельствует о структурных изменениях белков мозга при диабете. Внутрижелудочное введение в течение 14 и 30 дней нуклеотидного препарата в испытанной дозе 500 мг/кг крысам с диабетом полностью восстанавливало уровень SH-групп глутатиона в плазме крови и головном мозге. Под влиянием длительного назначения изучаемого препарата в дозе 500 мг/кг наблюдалось также восстанавление сниженной при диабете 2 типа супероксидперехватывающей активности плазмы крови, тканей головного мозга и печени подопытных животных.

Обращают на себя внимание экспериментальные данные по оценке влияния нуклеотидного препарата в испытанной дозе 500 мг/кг при внутрижелудочном введении на динамику активности различных изоформ NO-синтазы (индуцибельная - ÏNOS и - Са2+- зависимая NOS) в буром жире, печени и мышце бедра у крыс Wistar с диабетом 2 типа (рис.5).

□ общ ВСа-зав

где НП14 и НПЗО - применение нуклеотидного препарата в течение 14 и 30 дней

Рис. 5. Влияние 14- и 30-дневного в/желудочного введения нуклеотидного препарата (500мг/кг) на динамику NOS (пмоль цитруллина/мин/мг белка): общего пула, Саг+-зависимой и индуцибельной изоформ при диабете 2 типа.

Установлено, что при диабете у крыс активность Са2+- зависимой NOS снижается, a iNOS возрастает (рис.5). При назначении крысам с диабетом в течение 14 и 30 дней нуклеотидного препарата наблюдается первоначальное торможение индукции iNOS, а затем возрастание уровня активности Са2+-зависимой NOS практически до уровня у контрольных животных. Эти

результаты свидетельствуют о селективной активации нуклеотидным препаратом Са2+-зависимой NOS. Уровень ТБК- реактивных продуктов при диабете не изменялся в плазме крови, гомогенатах головного мозга и мышце бедра крыс.

Исследование влияния нуклеотидного препарата на клетки перевиваемых опухолей и функциональное состояние нейтрофилов крови человека.

В связи с участием Са2+-зависимой NOS и производимого ею NO совместно с ростостимулирующими факторами, тирозинкиназой, Na+/H -обменником, вторичными мессенжерами (цАМФ, ЦГМФ, Insp3 и арахидоновая кислота) в регуляции Са2+- мобилизующей системы внутриклеточной передачи сигнала, а также в процессах деления клеток при злокачественном росте (Реутов В. П.с соавт., 1997), были предприняты исследования для изучения влияния нуклеотидного препарата, являющегося активатором Са2+-зависимой NOS, на опухолевые клетки.

При изучении влияния комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 на жизнеспособность клеток в культурах перевиваемых опухолей было установлено, что препарат при добавлении во все использованные культуры перевиваемых злокачественных опухолевых клеток (HeLa, U937, MCF7 и L929) в диапазоне концентраций 0,2-1,0 мг/мл оказывает выраженный цитотоксический эффект (рис. 6).

Концентрация нуклеотидного препарата, Ш/ип

В связи с выявлением цитотоксического действия нуклеотидного

£ ™

Рис 6. Влияние нуклеотидного препарата на

жизнеспособность клеток в культурах перевиваемых опухолей (тест на окрашивание нейтральным красным).

препарата на клетках перевиваемых опухолей представляло интерес изучение некоторых механизмов этого эффекта. При этом было установлено, что нуклеотидный препарат вызывает дозозависимую активацию каспазы-3 во всех исследованных культурах клеточных линий опухолевых клеток, не влияя при этом на активацию каспазы-3 в культуре нормальных лейкоцитов человека, т.е. препарат вызывает селективный апоптоз в опухолевых клетках (таблица 13).

Таблица 13. Влияние нуклеотидного препарата на активность каспазы -3 в клеточных линиях.

Культуры клеточных линий Исследуемые концентрации нуклеотидного препарата

0,2 мг/мл 0,5 мг/мл

Активность каспазы-3, нмоль АРС/мин/мкг белка

НеЬа 0,500±0,003 1,10010,002

1929 0,290*0,001 0,910±0,003

и937 0,340±0,004 0,960±0,003

МСР7 0,370±0,002 1,500±0,003

Лейкоциты человека 0 0

При исследовании влияния нуклеотидного препарата на клеточный цикл не выявлено существенных различий в фазах клеточного цикла клеток линии Ь929, в то время как для линий НеЬа, Ш37, МСЕ7 наблюдалось снижение доли С2/М популяции клеток по сравнению с контролем (таблица! 4).

Таблица 14. Влияние нуклеотидного препарата (НП) в концентрации 0,5 мг/мл на клеточный цикл линий НеЬа, и937, МСР7, Ь929 при культивировании в течение 72 часов.

Исследуемые культуры клеток с добавлением нуклеотидного препарата и без него (контроль) Фазы клеточного цикла

<6, С, в ем

Соотношение фаз клеточного цикла, %

Не1_а контроль 7,3±0,9 82,511,2 5,210,8 9,910,8

НП 43,0±2,5 45,514,6 4,411,2 3,511,0

1929 контроль 6,1 ±0,6 54,311,1 5,410,7 5,110,7

НП 31,6±2,3 25,210,9 5,310,9 6,011,0

1)937 контроль 7,2±1,0 65,516,9 5,411,1 16,211,0

НП 54,310,8 34,717,9 4,310,7 5,410,8

МСР7 контроль 15,3±2,8 46,816,4 6,711,1 31,211,9

НП 69,0±5,3 19,413,2 5,410,8 11,110,8

При этом было также установлено, что под влиянием нуклеотидного препарата в испытанной концентрации 0,5 мг/мл наблюдается значительное увеличение доли апоптотирующих клеток (< Gi) (табл. 14).

Изучение влияния нуклеотидного препарата на функциональное состояние мононуклеарных клеток (нейтрофилов), которые играют большую роль в развитии системного воспаления, показало, что препарат дозозависимо ингибирует образование АФК нейтрофилами (рис. 7).

При изучении действия нуклеотидного препарата на активированные липополисахаридом (LPS) нейтрофилы показало, что препарат значительно снижает активацию нейтрофилов (рис. 8) и дозозависимо увеличивает их адгезию (рис. 9).

0 2 20 230 2500

Концентрация нуклеотидного препарата, мкг/мл

Рис. 7. Влияние нуклеотидного препарата на продукцию АФК нейтрофилами. Предварительная инкубация с препаратом 25 мин.

20МКГ/МЛ 200мкг/мл

Концентрация нуклеотидного препарата, мкг/мл

Рис. 8. Влияние нуклеотидного препарата на генерацию активных форм кислорода активированными (+LPS) и неактивированными (-LPS) нейтрофилами.

Изучение влияния нуклеотидного препарата на фагоцитарную активность нейтрофилов показало дозозависимое увеличение их фагоцитоза (рис. 10) и дозозависимое ингибирование йп1р-индуцированной их дегрануляции (рис. 11).

О 2 20 200

Концентрация нуклеотидного препарата, мкг/мл

Рис. 9. Влияние нуклеотидного препарата на адгезию нейтрофилов.

5 »

0 0,2 1 Концентрация нуклеотидного препарата, мкг/мл

Рис. 10. Влияние нуклеотидного препарата на фагоцитарную активность нейтрофилов

ОДед

Рис. 11. Влияние нуклеотидного препарата в концентрации 1 мг/мл на дегрануляцию нейтрофилов,

вызванную 1МЬР (1ткМ). По оси ординат - оптическая плотность. А — контроль; В - коптроль с препаратом; С - дегрануляция без препарата; Б - дегрануляция в присутствии препарата.

Доклиническое токсикологическое изучение нуклеотидного препарата.

Программа доклинического токсикологического исследования

полученного комплексного нуклеотидного препарата предусматривала:

о изучение токсичности препарата при однократном введении лабораторным животным, о изучение токсичности препарата в условиях 3-месячного хронического эксперимента на крысах,

о исследование токсичности готовой лекарственной формы препарата в условиях 2-месячного

хронического опыта на собаках, о исследование мутагенности препарата, о исследование эмбриотоксичноети и тератогенности препарата, о исследование влияния препарата на репродуктивную функцию, о исследование аллергизирующих свойств препарата

Установлено, что комплексный нуклеотидный препарат из дрожжей БассЪаготусея сегЫ81ае раса 14 является малотоксичным веществом при однократном введении в желудок лабораторным животным. При в/ж введении мышам линии ВАЬВ/с и крысам "Мз1аг показатели средних смертельных доз (ЛД50) составляют 15000-20000 мг/кг (таблица 15).

Таблица 15. Показатели токсичности иуклеотидного препарата при внутрижелудочном введении мышам ВАЬВ/с и крысам \Vistar.

Вид и пол животных Показатели токсичности, мг/кг

лд,в ЯД»»* ЛДя

Мыши ВАЬВ/с самцы 11600 15000±1755 19500

Мыши ВА1.В/с самки 12500 15900±2100 20400

Крысы \№з1аг самцы 14400 19000±1865 25000

Крысы \№з1аг самки 15300 20000±2200 26200

При исследовании токсичности нуклеотидного препарата в условиях 3-месячного хронического эксперимента на крысах Wistar было показано, что при ежедневном в течение 3 месяцев введении в желудок в дозах 100 и 500 мг/кг (2 и 10-кратные суточные терапевтические дозы) препарат не влияет на общее состояние и поведение животных, а также на гематологические показатели (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и уровень гемоглобина) (таблица 16).

Для выявления возможного повреждающего действия нуклеотидного препарата на печень в сыворотке крови животных во время хронического эксперимента определяли активность щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы, а-гидроксибутиратдегидрогеназы, аспартат- и аланинаминотрансфераз. На протяжении всего эксперимента показатели активности указанных ферментов не изменялись и соответствовали средним величинам, характерным для данного вида лабораторных животных (таблица 17).

Таблица 16. Гематологические показатели у крыс при 3-х месячном введении в желудок препарата в дозах 100 и 500 мг/кг._

Периоды наблюдения Группы животных

1 Контроль 2 Нуклеотидный препарат 100 мг/кг 3 Нуклеотидный препарат 500мг/кг

самцы | самки самцы | самки самцы I самки

Эритроциты, 10 12/л

До введения (фон) 7,6±0,3 7,9 ±0,3 7,5+0,2 7,б±0,3 7,4±0,3 7,3±0,3

1 месяц 7,5±0,5 8,1±0,3 7,1±0,4 7,6±0,3 7,7±0,4 7,5±0,2

3 месяца 7,7±0,2 8,0±0,4 7,6±0,3 7,5±0,4 7,4±0,5 7,7±0,3

Лейкоциты, 103/л

До введения (фон) 13,0±0,5 12,4±0,4 14,7±0,9 13,9 ±0,7 13,7±0,7 12,6±0,9

1 месяц 13,2±0,8 12,6±0,3 13,7±0,6 13,6±0,5 14,8±0,8 12,3±0,5

3 месяца 12,9+0,5 12,5±0,4 13,5±0,4 12,3±0,5 13,1±0,4 12,9±0,6

Тромбоциты, 109/л

До введения (фон) 468±19 492±32 457±23 436±20 421±34 476±23

1 месяц 414±22 501±29 400±21 471±27 457±25 482+19

3 месяца 488±37 525±32 483±39 508±24 483±38 558±30

Гемоглобин, г/л

До введения (фон) 129±3 127±4 133±5 132±4 131±4 131 ±2

1 месяц 136±7 138±4 137±5 133±7 130±6 134±4

3 месяца 134±5 132±4 135±4 136±2 134±3 134±3

Таблица 17. Показатели активности ферментов в сыворотке крови крыс во время хронического эксперимента._

Периоды наблюдения Группы животных

1 Контроль 2 Нуклеотидный препарат 100 мг/кг 3 Нуклеотидный препарат 500мг/кг

самцы I самки самцы | самки самцы | самки

Щелочная фосфатаза, Е/л

До введения (фон) 677,5±24,4 674,6±20,6 624,6+24,3 652,3±29,9 662,3±22,1 644,2±27,0

1 месяц 653,3+28,7 642,7±22,3 641,8±23,9 632,6±23,3 651,9±27,3 622,7±28,3

3 месяца 639,1 ±20,7 622,4±29,9 635,6±29,3 636,3±20,2 647,5±28,1 653,2±24,8

Аланинаминотрано) зераза, Е/л

До введения (Фон) 83,9±3,3 86,7±5,0 90,0±4,6 82,9±4,7 85,2±3,2 80,1±4,4

1 месяц 89,8±3,2 87,0±4,6 84,3±3,8 87,7±3,9 80,9±4,8 90,2±4,5

3 месяца 87,2±4,7 83,4±3,1 83,7±4,0 83,2±3,8 80,7±5,2 89,6±4,7

Аспартатаминотрансфераза, Е/л

До введения (Фон) 63,9±4,9 64.5±3,7 71,7±4,1 67,9±4,0 71,3±4,8 69,5±4,6

1 месяц 65,4±4,3 63,5±3,5 66,8±3,1 68,1 ±3,6 63,7±4,3 64,9±4,6

3 месяца 69,4±3,9 68,9±4,1 66,8+3,6 69,1±4,9 67,4+3,9 60,7±4,1

Лаетатдегидрогеназа, Е/л

До введения (фон) 661,3±25,2 676,2±20,9 648,2±28,8 645,3±29,0 693,2±34,2 630,1±25,9

1 месяц 635,9±29,6 638,8±27,3 669,1 ±30,2 630,6±27,3 708,4±29,5 621,7±23,5

3 месяца 685,4±22,3 627,6±29,9 668,0+26,5 626,9±26,4 677,8±33,6 627,1 ±30,7

а- гидроксибутиратдегидрогеназа, Е/л

До введения (фон) 114,6±13,7 119,9±19,7 126,5±17,3 124,7±25,4 109,1±18,1 112,1 ±12,8

1 месяц 112,7±17,0 107,8±12,1 113,3±17,7 108,1±10,4 108,4±17,8 100,7±11,1

3 месяца 101,2±12,5 121,8±8,2 112,5±14,7 109,9±14,7 107,7±13,4 122,5±16,3

Введение нуклеотидного препарата в испытанных дозах 100 и 500 мг/кг не влияло на функциональное состояние поджелудочной железы и почек. Об этом свидетельствуют стабильные уровни содержания глюкозы, мочевины и креатинина в сыворотке крови крыс, получавших препарат, и контрольных животных, на протяжении всего хронического эксперимента. Для выявления возможного повреждающего действия нуклеотидного препарата в условиях хронического эксперимента на липидный обмен в сыворотке крови животных была исследовано содержание общего холестерина и триглицеридов. Как показали проведенные исследования, введение препарата крысам в течение 3-х месяцев в испытанных дозах 100 и 500 мг/кг не влияло на указанные показатели липидного обмена.

При изучении токсичности готовой лекарственной формы нуклеотидного препарата (таблетки по 0.5г для приема внутрь) в условиях 2-месячного хронического эксперимента на собаках, было установлено, что назначение препарата в желудок собакам в дозе 500 мг/кг на протяжении 2-х месяцев не влияет на общее состояние и поведение животных. На протяжении всего эксперимента не зарегистрировано статистически достоверных различий массы тела и ректальной температуры у собак, получавших препарат, по сравнению с контролем; не отмечено влияния препарата на гематологические показатели: количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов и уровень содержания гемоглобина. Нуклеотидный препарат в испытанной дозе 500 мг/кг на протяжении 2 месячного хронического эксперимента не оказывал влияния на уровни общего белка и глюкозы в сыворотке крови подопытных животных, что свидетельствует об отсутствии повреждающего действия изучаемого препарата на белковообразующую функцию печени, углеводный обмен и функциональное состояние поджелудочной железы.

На протяжении 2-месячного хронического эксперимента не выявлено существенных изменений активности а-гидроксибутиратдегидрогеназы, аспартат- и аланинтрансаминаз, щелочной фосфатазы и лактатдегидрогеназы сыворотки крови собак, подвергавшихся воздействию препарата в дозе 500

мг/кг, по сравнению с исходными величинами и интактным контролем (табл. 18). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии повреждающего действия на препарата в испытанной дозе на функциональное состояние печени собак.

Длительное 2-месячное назначение собакам препарата в готовой лекарственной форме в дозе 500 мг/кг не влияло на биохимические показатели (глюкоза, мочевина, креатинин, общий холестерин и триглицериды) сыворотки крови, характеризующие функциональное состояние поджелудочной железы, печени, почек и липидного обмена.

Электрокардиографические исследования, проведенные до начала хронического опыта, через 1 и 2 мес. внутрижелудочного введения таблеток нуклеотидного препарата в испытанной дозе 500 мг/кг, не выявили повышения частоты сердечных сокращений и изменений параметров ЭКГ под влиянием изучаемого препарата. Все показатели ЭКГ не выходили за пределы допустимых колебаний, характерных для данного вида лабораторных животных.

Таблица 18. Показатели активности ферментов сыворотки крови собак, во время 2-месячного хронического эксперимента.

Периоды наблюдения Группы животных

До введения (фон) 1 месяц | 2 месяца

а-Гидроксибутиратдегидрогеназа, Е/л

1. Контроль 78,4±8,6 82,3±9,4 83,7±7,5

2 Нуклеотидный препарат 500 мг/кг 82,6±8,4 87,9±7,6 85,4±8,7

Аспартатаминотрансфераза, Е/л

1 Контроль 57,6±8,3 62,1±9,1 56,8±7,4

2 Нуклеотидный препарат 500 мг/кг 53,7±9,1 60,3+9,6 61,6±8,3

Аланинаминотрансфераза, Е/л

1. Контроль 73,7±9,2 75,4±8,4 72,6±7,4

2 Нуклеотидный препарат 500 мг/кг 74,5±6,9 79,7±7,5 76,4±8,1

Щелочная фосфатаза, Е/л

1 Контроль 126,6±13,5 132,8±14,8 122,6±17,4

2 Нуклеотидный препарат 500 мг/кг 117,8±13,6 125,6±11,4 126,1 ±12,5

Лактадегидрогеназа, Е/л

1 Контроль 365,7±26,3 383,4±28,6 357,5±29,4

2 Нуклеотидный препарат 500 мг/кг 341,4±28,8 359,6±22,6 363,9±24,7

Отсутствие повреждающего действия препарата на внутренние органы

животных было подтверждено результатами патоморфологических исследований, проведенных после окончания хронических экспериментов на крысах и собаках.

Оценка мутагенных свойств нуклеотидного препарата в тесте Эймса показала, что бактериальные штаммы ТА 98, ТА 100 и ТА 1537 увеличивают число ревертантов под действием веществ, взятых в качестве положительных контролей, т.е. экспериментальные данные объективны. В то же время нуклеотидный препарат в диапазоне испытанных концентраций 1,0-10000,0 мкг/чашку (на среде с неполной активирующей микросомальной смесью (НАМС) и его метаболиты, образовавшиеся под влиянием микросомальной фракции Б9 печени (на среде с полной микросомальной активирующей смесью (ПАМС)) не вызывали достоверного увеличения числа ревертантов. Полученные данные свидетельствуют о том, что нуклеотидный препарат в концентрациях 1,0-10000,0 мкг/чашку и его метаболиты не обладает мутагенным действием в тесте Эймса (таблица 19).

Таблица 19. Действие нуклеотидного препарата на индикаторные штаммы бактерии Salmonella typhimurium ТА 98, ТА 100, ТА 1537 в тесте Эймса.

Препарат Дозы, мкг на чашку Среднее геометрическое число ревертантов на чашку

ТА98 ТА 100 ТА 1537

НАМС ПАМС НАМС ПАМС НАМС ПАМС

Контроль (Н20) 98,9 105,9 80,8 113,5 4,7 6,1

2-аминоантрацен 10,0 385,0 189,0 49,5

2-нитрофлуорен 0,2 1690 2388

9-аминоакридин 10,0 1268

Нуклеотидный препарат 1,0 99,4 61,5 87,6 102,0 3,6 4,3

10,0 62,9 91,7 42,2 57,1 3,6 4,7

100,0 75,5 106,2 28,8 41,6 2,2 7,8

1000,0 74,3 104,0 16,3 17,0 7,2 3,6

10000,0 23,9 63,1 129,6 126,3 4,8 7,0

Исследование цитогенетической активности препарата при внутрижелудочном введении в дозе 7500 мг/кг однократно (экспозиция 24 ч) и в дозе 1500 мг/кг 5-кратно (экспозиция 6 ч после последнего

введения) методом учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей-гибридов Б] (СВА х С^ВЬв) не выявило статистически достоверных различий в уровне хромосомных аберраций в клетках костного мозга.

Установлено также, что нуклеотидный препарат при введении в желудок в дозе 1500 мг/кг не индуцирует доминантные летальные мутации в зрелых спермиях, поздних сперматидах и ранних сперматидах мышей.

Нуклеотидный препарат ни в одной из исследованных концентраций в диапазоне 1-10000 мкг/чашку не вызывает активации системы репарации ДНК у Е.соН РС>37, т.е. не обладает ДНК-повреждающим действием и, следовательно, не является потенциальным канцерогеном.

Изучение эмбриотоксических и тератогенных свойств нуклеотидного препарата при внутрижелудочном введении в исследуемой дозе 500 мг/кг беременным крысам 'М81аг с 1 по 19 день гестации показало, что препарат не вызывает статистически достоверных различий по сравнению с контролем таких показателей эмбриотоксичности, как продолжительность беременности, число желтых тел и мест имплантации, количество живых эмбрионов, масса их тела и кранио-каудальный размер, а также показателей пред- и постимплантационной гибели (таблица 20).

Таблица 20. Показатели эмбриотоксического действия нуклеотидного препарата при его внутрижелудочном введении крысам в дозе 500 мг/кг с 1 по 19 день беременности.

Периоды наблюдения Группы животных

1 Контроль 2 Нуклеотидный препарат 500 мг/кг

Продолжительность беременности, сут. 22,0+0,2 21,8+0,2

Количество эмбрионов на 1 крысу 10,3±0,6 10,8±1,3

Количество желтых тел на 1 крысу 12,1±0,5 12,5±0,8

Количество мест имплантации на 1 крысу 11,3±0,7 11,8+0,8

Количество резорбции на 1 крысу 1,4±0,4 1,7+0,4

Предимплантационная гибель,% 8,8 8,5

Постимплантационная гибель,% 9,6 9,4

Кранио-каудальный размер эмбриона, см 3,0±0,1 3,1±0,2

Масса 1 эмбриона, г 2,9±0,2 2,6±0,2

Препарат не вызывал каких-либо уродств и пороков развития, не влиял на постнатальное развитие потомства. Следовательно, нуклеотидный препарат в испытанной дозе 500 мг/кг при внутрижелудочном введении беременным крысам Wistar не обладает эмбриотоксическими и тератогенными свойствами. Проведенные исследования также показали, что в испытанной дозе 500 мг/кг при в/ж введении самцам крыс в течение 10 нед.

(2 цикла сперматогенеза) и самкам в течение 10 дней (2-3 эстральных цикла) нуклеотидный препарат не влияет на репродуктивную функцию животных.

Нуклеотидный препарат в разрешающей дозе 500 мг/кг при введении в желудок как на 14, так и на 21 день сенсибилизации в дозах 100 и 500 мг/кг не вызывает анафилактического шока; не влияет на реакцию гиперчувствительности Ш типа; реакцию гиперчувствительности замедленного типа у морских свинок, а также на реакцию дегрануляции тучных клеток и не вызывает развития аллергического контактного дерматита и эозинофилии и базофилии у лабораторных животных.

Токсикологическое исследование не выявило противопоказаний для проведения клиничеких испытаний разработанного комплексного нуклеотидного препарата, активирующего Са2+-зависимую NOS, нормализующего уровень глюкозы в крови и стимулирующего образование инсулина Р-клетками поджелудочной железы при диабете 2 типа, регулирующего эффекты антиоксидантной системы защиты организма и вызывающего селективный апоптоз клеток перевиваемых опухолей. Применение комплексного нуклеотидного препарата открывает новые возможности лечения иммунодефицитных состояний, коррекции биохимических нарушений при диабете 2 типа, оксидативном стрессе и, вероятно, в комплексной терапии опухолевых заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Из 5 штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae (раса 14, гибрид 67, гибрид 581, гибрид 722, гибрид 739) наиболее подходящим по технологичности культивирования, количественному выходу целевого продукта - биологически активного комплексного нуклеотидного препарата, доступности его выделения из биомассы и стандартизации, а также по выраженности активирующего действия на Са2+-зависимую NOS тимоцитов крыс Wistar является штамм Saccharomyces cerevisiae раса 14.

витамины, макро- и микроэлементы) и не содержащий чужеродных, несвойственных организму человека и животных веществ.

3. Полученный по оригинальной технологии из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 нукпеотидный препарат, содержащий комплекс биологически активных веществ обладает выраженным активирующим действием на Са2+-зависимую NOS, играющую важную роль в регуляции многих физиологических процессов в организме.

4. Нуклеотидный препарат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 является иммуномодулятором широкого спектра действия: оказывает дозозависимое усиление иммунного ответа и увеличение числа антителообразующих клеток на фоне антигенного стимула, усиливает пролиферацию Т-лимфоцитов селезенки мышей при действии митогенов фитогемагглютинина и конканавалина А, угнетает реакцию гиперчувствителыюсти замедленного типа, индуцируемую эритроцитами барана.

5. Внутрижелудочное введение нуклеотидного препарата в испытанных дозах крысам с диабетом 2 типа вызывает выраженный гипогликемический эффект и стимулирует образование инсулина ß-клетками поджелудочной железы. Указанные эффекты связаны с прямым активирующим действием препарата на Са2+-зависимую NOS, индуцирующую продукцию инсулина ß-клетками поджелудочной железы.

6. Введение в желудок крысам с диабетом 2 типа нуклеотидного препарата на фоне развивающегося оксидативного стресса, восстанавливает уровень SH-глутатиона и супероксидперехватывающую активность плазмы крови и головного мозга, а также активность Са2+-зависимой NOS.

7. Нуклеотидный препарат в диапазоне испытанных концентраций 0,2-0,5 мг/мл в культуре перевиваемых клеток человеческой аденокарциномы линии HeLa, человеческой монобластоидной линии U937, человеческой карциномы молочной железы линии MCF7 и мышиной фибробластомы L929 обладает цитотоксическим действием, механизм которого обусловлен индуцированием препаратом каспазы-3, вызывая селективный апоптоз опухолевых клеток. Указанный эффект сопровождается снижением доли G2/M популяции клеток перевиваемых опухолей, приводящим к увеличению доли апоптотирующих клеток (< Gi).

животным. ЛД50 при внутрижелудочном введении препарата мышам BALB/c и крысам Wistar установлены на уровне 15000-20000 мг/кг. При этом не выявлено существенных видовых и половых различий в чувствительности указанных видов животных к токсическому действию препарата.

9. При ежедневном 3-х месячном введении в желудок крысам Wistar нуклеотидного препарата в дозах 100 и 500 мг/кг и при 2-х месячном назначении внутрь препарата собакам в готовой лекарственной форме (таблетки по 0,5 г) в дозе 500 мг/кг установлена хорошая переносимость препарата и отсутствие его повреждающего действия на функциональное состояние основных органов и систем организма подопытных животных. Отсутствие токсического действия препарата в испытанных дозах подтверждено результатами патоморфологических исследований, проведенных после окончания хронических экспериментов.

10. Нуклеотидный препарат на вызывает генные мутации у индикаторных штаммов бактерий Salmonella thyphimurium ТА 98, ТА 100 и ТА 1537 (тест Эймса), не вызывает хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих, не влияет на количество доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей и систему репарации ДНК в SOS-хромотесте, т.е. препарат не обладает мутагенностью и не является потенциальным канцерогеном.

11. Нуклеотидный препарат при введении в желудок беременным крысам в дозе 500 мг/кг с 1 по 19 день гестации не проявляет эмбриотоксических и тератогенных свойств. При ежедневном внутрижелудочном введении нуклеотидного препарата в дозе 500 мг/кг крысам-самцам в течение 10 недель (2 цикла сперматогенеза) и 2 недель крысам-самкам (2-3 эстральных цикла) не установлено влияния препарата на репродуктивную функцию животных.

12. Разработка комплексного нуклеотидного препарата, активирующего Са2+-зависимую NOS, обладающего иммуномодулирующим действием, нормализующего уровень глюкозы и стимулирующего образование инсулина ß-клетками поджелудочной железы при диабете 2 типа, регулирующего эффекты антиоксидантной системы защиты организма и вызывающего селективный апоптоз клеток перевиваемых опухолей открывает новые возможности нормализации биохимических нарушений при использовании препарата в качестве средства комплексной терапии при лечении указанных патологических состояний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученный по разработанной технологии из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 нуклеотидный препарат, содержащий комплекс биологически активных веществ - нуклеотиды, аминокислоты, витамины, макро- и микроэлементы, обладает выраженными иммуномодулирующими свойствами в экспериментах на лабораторных животных и перспективен для клинических испытаний для лечения заболеваний, сопровождающихся развитием иммунодефицитных состояний.

2. Выраженное гипогликемическое действие, защита от оксидативного стресса и стимуляция образования инсулина ß-клетками поджелудочной железы под влиянием нуклеотидного препарата на модели диабета 2 типа у крыс свидетельствуют о целесообразности проведения клинических испытаний разработанного препарата у больных с данным заболеванием.

3. Индуцирование нуклеотидным препаратом каспазы-3 и вызываемый препаратом селективный апоптоз в культуре клеток перевиваемых опухолей, а также его выраженное иммуномодулирующее действие позволяют рассматривать разработанный препарат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 в качестве перспективного лекарственного средства сопутствующей терапии при лечении опухолевых заболеваний.

4. Результаты доклинического токсикологического изучения разработанного нуклеотидного препарата, показавшие его низкую токсичность при однократном введении и хорошую переносимость при длительном назначении лабораторным животным, отсутствие мутагенных, эмбриотоксических, тератогенных и аллергизирующих свойств, а также негативного влияния на репродуктивную функцию свидетельствуют о перспективности клинических испытаний препарата при лечении ряда заболеваний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Orlova E.V., Uvarov V.U., Astashkin E.I. Effect of ionomycin on catalytic activity of nitric oxide synthase (NOS) from rat thymocytes. In: Abstracts of the XI-Th International Symposium on Microsome and Drug Oxidation, Los-Angeles, USA, 21-24 July 1996, p. 186.

2. Orlova E.V., Arzamastsev E.V., Severina I.S. Polymorphyzm of Ca2+-dependent iNOS properties In: Absracts of the International Conference of EPR Spectroscopy of NO in Biological Systems. Suzdal, Russia, 10-15 December 1996, p.19.

3. Orlova E.V., Arzamastsev E.V., Severina I.S. Kinetics of the Ca2+-dependent N0-synthase from Wistar rat thymocytes and hepatocytes in ontogenesis In: Abstracts of the VII Balt-LASA Conference « Animal Models», Vilnius, Lithuania, 24-26 September,1997, p.36.

4. Orlova E.V., Arzamastsev E.V. Investigation of the influence of immunomodulators(T-Activine and cyclofluoramid) on kinetic properties of the Ca2+-dependent NO-synthase from Wistar rat thymocytes and hepatocytes. In: Abstracts of the V-th National Congress « Human and drugs»,Moscow, Russia, 21-25 April, 1998, pp.599-600.

5. Orlova E.V., Orlova V.S., Sucharev V.I.,. The usage of the multiflow chemostatic cultivation under the growth of the new stamm Sacchromyces Cerevisiae G-l on ethanol is the one of the possible methods of introduction of microorganisms into pollution. In: Materials of the National Conference «Introduction of the microorganisms into pollution», Moscow, Russia, 17-19 May, 1994, pp.77-78.

6. Орлова B.C., Орлова Б.В. и соавт. Способ получения биомассы микроорганизмов с низким содержанием нуклеиновых кислот. Патент № 2128218 Россия, МПК G О 1 L 23/10. - 83021114/24, заявлено 05.07.93. опубл. 27.09.99. Бюл. 14. Приоритет 10.02.93 (Россия).

7. Орлова B.C., Орлова Е.В. и соавт. Способ получения биомассы микроорганизмов. Патент № 2138549 Россия, МПК G 0 1 L 23/10. -83021114/24; заявлено 10.02.93, опубл. 27.09.99. Бюл. 14. Приоритет 10.02.93 (Россия).

8. Орлова B.C., Орлова Е.В. и соавт. Способ получения пищевых дрожжей рода сахаромицетов. Патент № 2128702 Россия, МПК G 0 1 L 23/10. - 83021114/24; заявлено 10.02.93, опубл. 27.09.99. Бюл. 14. Приоритет 10.02.93 (Россия).

9. Orlova V.S., Orlova E.V. et al. Method of obtaining the biomass with low containing of nuclei acids. European Patent: EP 0 805 201 (5.12.1996).

10. Orlova V.S., Orlova E.V. et al. Method of cultivation the biomass of the microorganisms. European Patent: EP 0 805 202 (5.12.1996).

11. Orlova V.S., Orlova E.V. et al. Method of cultivation the biomass of the microorganisms. European Patent: EP 0 805 203 (5.12.1996).

12. Orlova E.V. Nitric oxide and apoptosis. Нейрохнмия, 1999, т.16,1, c.9-14.

13. Orlova E.V. Investigations of kinetic paramemtrs of Ca2+- dependent nitric oxide synthase in Wistar rat thymocytes and hepatocytes under ontogenesis. 6th European Symposium on calcium binding properties in normal and transformed cells. Paris, France, June 14-17,2000, P74.

14. Orlova E. V. , Orlova V.S. Glutation perturbations in human plasma : its dependence from antioxidant effect. In: International conference " New food technologies" , Russia, Moscow, 21-25 October, 2003, p. 36.

15. Орлова E.B., Орлова B.C. Новое поколение иммуностимуляторов. Международная практическая конференция по сертификации и переводу предприятий на международные системы управления, Москва,4-5.11.2003, с. 15

16. Орлова Е.В., Орлова B.C. Многоплановость свойств биокорректоров из Saccharomyces cerevisiae. II международная конференция "Обязательные требования в сфере обращения лекарственных средств", Москва, 24-26.03.2004, с.28

17. Orlova E. V. New generation of immunostimulators. In: 11-th International Congress of yeasts "Yeasts in science and technology. The quest for sustainable development", Brazil, Rio De Janeiro, 15-20 August, 2004, p 86.

18. Orlova E.V. Influence of soft immunostimulator from S. Cerevisiae leicocytes-dependent imunity. 25th Congress of Russian Biochemical Society, Russia, Moscow, 1315 October, 2004, p.44

19. Орлова E.B., Костанян И.А., Панов В.П. Роль регуляторных белков апоптоза в клеточном Са- гомеостазе. Химико-фармацевтический журпал, 2005 т.39, № 12, с.47-52

20. Орлова Е. В. Анализ структурных особенностей калмодулинового домена Са2+-зависимой NO-синтазы в условиях онтогенеза. Вопросы биологической, медиципской и фармацевтической химии, 2005, т.2., с. 49-54.

21. Орлова Е.В. Влияние Са2+-антагониста верапамила и двух иммуномодуляторов: Т-активина и циклофосфамида на Са2+-зависимую NOS из тимоцитов и гепатоцитов крыс Wistar. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2005, т.4.,с. 26-29.

22. Орлова Е.В.. Са2+-зависимая NOS из тимоцнтов и гепатоцитов крыс Wistar в онтогенезе. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2005,т.4, с.21-25.

23. Орлова Е.В., Орлова B.C., Плужникова Г. А. Влияние натурального биокорректора из Saccharomyces cerevisiae на уровень инсулина и глюкозы на модели диабета 2 типа при разных способах введения препарата в организм. 2005, Вестник РУДН Сер. Экология и безопасность жизнедеятельности т. 11,с.118-122.

24. Орлова Е.В., Орлова B.C., Плужникова Г. А., Козлов Ю.П. Изучение действия натурального биокорректора из Saccharomyces cerevisiae на функциональную активность островков Лангерганса., 2005, Вестник РУДН, Сер. Экология и безопасность жизнедеятельности, т. 11,92-94.

25. Орлова Е.В., Орлова В. С., Козлов Ю. П. Нуклеотадный биокорректор в решении проблемы абдоминального родразрешения в условиях свободнорадикалыюго окисления. Материалы XII международного конгресса "Человек и лекарство", 2005, Москва, Россия, с.497.

26. Орлова Е.В., Орлова В. С., Джубалиева С.К. Применение нового биокорректора в пред- и послеоперационном периоде у больных раком молочной железы. Материалы XII международного конгресса "Человек и лекарство", 2005, Москва, Россия, с.497.

27. Орлова Е.В, Орлова B.C., Гергерт В.Я. Применение нуклеотидного биокорректора из дрожжей Saccbromyces cerevisiae в комбинированной терапии туберкулеза. 2006, Пульмонология, т.6, с.34-43.

28. Orlova E.V., OrlovaV. S. The role of interactions Ca2+ and Bax-dependent apoptotic proteins. In: International Conference NMRCM-2005, Russia, St. Petersburg, 11-15 July, 2005, p. 23.

29. Орлова Е.В. Биологическая активность комплексного нуклеотидного препарата из Saccharomyces cerevisiae. М.: ООО «МАКС Пресс», 2006, 96 с. (6,0 усл. печ. л., тираж 300 экз.)

30. Орлова Е.В., Орлова B.C., Римарева Л.В. Получение нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae и его биологическая эффективность. Хранение и переработка сельхозсырья, 2006, т. 12, с. 45-49.

31. Орлова Е.В., Орлова B.C., Римарева Л.В. Применение нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisia в качестве продукта функционального питания при иммунодефицитах различного генеза и диабете 2 типа. VI Научно-техническая конференция-выставка с международным участием "Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации", Москва, 2006,15-16 ноября, с. 24.

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 22.01.2007 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 2,0. Тираж 125 экз. Заказ 019. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Орлова, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Нуклеотиды и нуклеозиды: биологическая роль, участие в метаболических процессах, регуляции иммунитета, механизмов апоптоза и антиоксидантной защиты организма.

ГЛАВА I. Материалы и методы исследований.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА II. Разработка метода получения и стандартизации комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2.1. Выбор оптимальных условий культивирования дрожжей

Saccharomyces cerevisiae для получения нуклеотидного препарата.

2.2. Исследование влияния состава среды в условиях периодического культивирования штаммов дрожжей Sacchromyces cerevisiae на выход нуклеотидных препаратов и эффективность их действия на

Са2+-зависимую NOS тимоцитов крыс Wistar.

2.3. Исследование влияния состава среды при культивировании в условиях одноступенчатого хемостата дрожжей Sacchromyces cerevisiae раса 14 на выход нуклеотидного препарата и эффективность его действия на Са2г-зависимую NOS.

2.4. Исследование влияния состава среды при культивировании в условиях турбидостата дрожжей Sacchromyces cerevisiae раса 14 на выход нуклеотидного препарата и эффективность его действия на Са2+ -зависимую NOS.

2.5. Исследование влияния культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 при последовательном выращивании на средах с этанолом и глюкозой на свойства нуклеотидных препаратов.

ГЛАВА III. Изучение иммуномодулирующих свойств комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14.

3.1. Исследование влияния нуклеотидного препарата на В-клеточное звено иммунитета.

3.2. Исследование влияния нуклеотидного препарата на Т-клеточное звено иммунитета.

ГЛАВА IV. Исследование антидиабетического действия комплексного нуклеотидного препарата на модели диабета 2 типа.

4.1 .Влияние нуклеотидного препарата на уровень содержания глюкозы и инсулина в крови крыс с диабетом 2 типа.

4.2. Влияние нуклеотидного препарата на показатели окислительного стресса у крыс с диабетом 2 типа.

ГЛАВА V. Исследование влияния нуклеотидного препарата на культуры клеток перевиваемых опухолей и функциональное состояние нейтрофилов крови человека.

5.1. Влияние нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 на жизнеспособность клеток в культурах перевиваемых опухолей.

5.2. Влияние нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 на процессы апоптоза в культурах перевиваемых опухолей.

5.3. Влияние нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 на клеточный цикл перевиваемых опухолевых клеток.

5.4. Влияние нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 на продукцию активных форм кислорода, фагоцитоз, клеточную адгезию и дегрануляцию нейтрофилов.

ГЛАВА VI. Доклиническое токсикологическое изучение комплексного нуклеотидного препарата.

6.1. Исследование токсичности комплексного нуклеотидного препарата при однократном введении лабораторным животным.

6.2. Исследование токсичности комплексного нуклеотидного препарата в условиях 3-месячного хронического эксперимента на крысах Wistar.

6.3. Исследование токсичности готовой лекарственной формы комплексного нуклеотидного препарата в условиях 2-месячного хронического эксперимента на собаках.

6.4. Изучение мутагенных свойств комплексного нуклеотидного препарата.

6.5. Исследование эмбриотоксических и тератогенных свойств комплексного нуклеотидного препарата.

6.6. Изучение влияния комплексного нуклеотидного препарата на репродуктивную функцию.

6.7. Изучение аллергизируюших свойств препарата.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка и экспериментальное обоснование клинического применения комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

Известна также ключевая роль некоторых нуклеотидов в синтезе оксида азота- NO, которому принадлежит важная роль в регуляции многих биохимических процессов, в частности, активировании гуанилатциклазы, фосфолипазы С, влиянии на синтез инсулина, адреналин- и дофаминергическую системы. Кроме того, NO является нейротрансмиттером и веществом, участвующим в -регуляции артериального давления, иммунореактивности и многих других важных физиологических процессов (Kerwin, J. F., et al., 1995, Bartberger M. D., et al., 2002).

В связи с тем, что влияние нуклеотидов на синтез NO в организме осуществляется путем изменения активности NO-синтаз (NOS), в частности Са - зависимой NO-синтазы, поиск препаратов, влияющих на активность NOS, является одной из актуальных задач современной биологии и медицины.

Цели исследования: получение нуклеотидных препаратов при различных условиях культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae, оценка влияния полученных препаратов на активность Са - зависимой NOS, выбор наиболее активного из них, исследование его фармакологических свойств и токсичности для получения разрешения на проведение клинических испытаний препарата.

Для достижения указанных целей были поставлены следующие задачи:

4. Исследовать антиоксидантное действие полученного нуклеотидного препарата при окислительном стрессе на модели диабета 2 типа у крыс Wistar и изучить влияние препарата на секрецию инсулина (3-клетками поджелудочной железы при данной патологии.

5. Изучить цитотоксическое действие полученного нуклеотидного препарата на клетки человеческой аденокарциномы линии НеЬа, человеческой монобластоидной линии И937, человеческой карциномы молочной железы МСР7 и мышиной фибробластомы Ь929.

Научная новизна и практическая значимость работы. о Впервые разработан способ получения, изучен состав и биологическая активность комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Засскаготусез сеге\Ыае раса 14, который является

2+ активатором Са - зависимой N0- синтазы, обладает иммуномодулируюгцей активностью, защищает при окислительном стрессе и стимулирует образование инсулина [3-клетками поджелудочной железы при диабете 2 типа и является селективным апоптотическим фактором по действию на опухолевые клетки. По эффективности действия разработанный препарат не уступает используемым в настоящее время в клинической практике лекарственным препаратам аналогичного действия. Препарат малотоксичен, не обладает мутагенными, эмбриотоксическими, тератогенными, аллергизирующими свойствами и не влияет на репродуктивную функцию животных. о Изучен предполагаемый механизм действия препарата, связанный с его нормализующим действием на систему свободно-радикального окисления путем активации ряда таких ключевых ферментов и ферментных систем, как Са - зависимая N0- синтаза и активация

Са2+ - мобилизующей системы, глутатион-связывающей системы и, возможно, с нивелированием убиквитин-перехватывающей активности.

На модели диабета 2 типа у крыс установлено, что полученный нуклеотидный препарат оказывает выраженное антиоксидантное действие, восстанавливая нарушенные системы супероксидперехватывающей активности и восстановленного глутатиона. Назначение препарата купирует изменение активности синтазы оксида азота, вызванное стрептозотоцином.

Впервые получены данные, свидетельствующие о способности разработанного препарата в концентрациях 0,2-0,5 мг/мл оказывать цитотоксическое действие in vitro на перевиваемые клетки аденокарциномы линии HeLa, человеческой монобластоидной линии U937, человеческой карциномы молочной железы MCF7 и мышиной фибробластомы L929.

Установлено, что в диапазоне испытанных концентраций нуклеотидный препарат активирует каспазу-3 в опухолевых клетках указанных выше линий, вызывая при этом снижение доли G2/M в популяции клеток и увеличение ДОЛИ апоптотирующих клеток (< Gi) и не влияет на клетки в культуре нормальных лейкоцитов человека, т.е. обладает селективным апоптотическим действием на опухолевые клетки.

На способ получения, являющийся экологически чистым, безотходным, и биологическую активность разработанного комплексного нуклеотидного препарата получено 3 патента Российской Федерации (№ 2128218, № 2128702, № 2138549) и 3 Европатента (ЕР 0 805 201, ЕР 0 805 202, ЕР 0 805 203). На Всемирном салоне «Брюссель-Эврика-98» изобретение награждено Золотой медалью.

Внедрение результатов исследований в клиническую практику.

В соответствии с Законом Российской Федерации, разработанный комплексный нуклеотидный препарат зарегистрирован Министерством здравоохранения РФ в качестве лекарственного средства иммуностимулирующего действия для лечения острых респираторных вирусных инфекций у взрослых и детей с 6 лет и старше, сезонной профилактики ОРВИ, а также для комплексной терапии сахарного диабета 2 типа (Регистрационное удостоверение № Р №000949/ 02-2001 от 27.12.2001, ФСП 42-0331-1690-01, код АТС-[Ь0АХ]), и в качестве БАД (Регистрационное удостоверение Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 77.99.23.3.У.9412.8.05 от 16.08.2005).

Результаты исследований использованы при подготовке методических указаний для врачей "Перекисное окисление липидов и его значение в патогенезе сахарного диабета и его осложнений" Министерства здравоохранения и социального развития РФ (Москва, 2004).

Результаты исследований используются в клинической практике по целевой Федеральной программе "Профилактика гриппа и ОРВИ в дошкольных и школьных учреждениях"

Положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Оптимальным источником для получения нуклеотидного препарата из 5 изученных штаммов хлебопекарных дрожжей 8асскаготусез сегеу1н1ае (раса 14, гибрид 67, гибрид 581, гибрид 722, гибрид 739) при различных режимах культивирования на глюкозе является раса 14. Полученный при этом комплексный нуклеотидный препарат содержит: адениновые нуклеотиды, свободные аминокислоты, микро- и макроэлементы, витамины, жирные кислоты и обладает выраженным активирующим действием на Са -зависимую NOS тимоцитов крыс Wistar.

3. На модели инсулиннезависимого диабета (диабет 2 типа) у крыс Wistar нуклеотидный препарат в диапазоне испытанных доз от 100-1000 мг/кг при внутрижелудочном введении животным обладает выраженным гипогликемическим эффектом и повышает уровень секретируемого поджелудочной железой инсулина. При этом восстанавливается уровень сульфгидрильных групп глутатиона в плазме крови, нормализуется активность СОД и супероксидперехватывающей активности, а также уровень Са -зависимой NOS в печени, (3-клетках поджелудочной железы и буром жире, что свидетельствует о нормализации антиоксидантных систем организма. У интактных животных нуклеотидный препарат не влияет на указанные выше биохимические показатели.

Апробация работы.

Человек и лекарство", 2005, Москва, Россия, с.497., International Conference NMRCM-2005, Russia, St. Petersburg, 11-15 July, 2005, p.94.

Объем и структура диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Орлова, Елена Владимировна

выводы

1. Из 5 штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae (раса 14, гибрид 67, гибрид 581, гибрид 722, гибрид 739) наиболее подходящим по технологичности культивирования, количественному выходу целевого продукта - биологически активного нуклеотидного препарата, доступности его выделения из биомассы и стандартизации, а также по выраженности активирующего действия на Са -зависимую NOS тимоцитов крыс Wistar является штамм Saccharomyces cerevisiae раса 14.

2. Применение разработанного метода, позволяет получать нуклеотидный препарат, состоящий из комплекса биологически активных компонентов (нуклеотиды, включая адениннуклеотиды, аминокислоты, витамины, макро- и микроэлементы) и не содержащий чужеродных, несвойственных организму человеку и животных веществ.

3. Полученный по оригинальной технологии из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 нуклеотидный препарат, содержащий комплекс биологически активных веществ обладает выраженным активирующим действием на Са2+-зависимую NOS, играющую важную роль в регуляции многих физиологических процессов в организме.

4. Комплексный нуклеотидный препарат из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 является иммуномодулятором широкого спектра действия: оказывает дозозависимое усиление иммунного ответа и увеличение числа антителообразующих клеток на фоне антигенного стимула, усиливает пролиферацию Т-лимфоцитов селезенки мышей при действии митогенов фитогемагглютинина и конканавалина А, угнетает реакцию гиперчувствительности замедленного типа, индуцируемую эритроцитами барана.

6. Введение в желудок крысам с диабетом 2 типа нуклеотидного препарата на фоне развивающегося оксидативного стресса, восстанавливает уровень SH-глутатиона и супероксид-перехватывающую активность плазмы крови и головного мозга, а также активность Ca -зависимой NOS.

8. Нуклеотидный препарат, полученный из дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 по разработанному регламенту, является малотоксичным веществом при однократном введении лабораторным животным. ЛД50 при внутрижелудочном введении препарата мышам BALB/c и крысам Wistar установлены на уровне 15000-20000 мг/кг. При этом не выявлено существенных видовых и половых различий в чувствительности указанных видов животных к токсическому действию препарата.

9. При ежедневном 3-х месячном введении в желудок крысам Wistar нуклеотидного препарата в дозах 100 и 500 мг/кг и при 2-х месячном назначении внутрь препарата собакам в готовой лекарственной форме (таблетки по 0,5 г) в дозе 500 мг/кг установлена хорошая переносимость препарата и отсутствие его повреждающего действия на функциональное состояние основных органов и систем подопытных животных. Отсутствие токсического действия препарата в испытанных дозах подтверждено результатами патоморфологических исследований, проведенных после окончания хронических экспериментов.

10. Нуклеотидный препарат на вызывает генные мутации у индикаторных штаммов бактерий Salmonella thyphimurium ТА 98, ТА 100 и ТА 1537 (тест Эймса), не вызывает хромосомных аберраций в клетках костного мозга млекопитающих, не влияет на количество доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей и систему репарации ДНК в SOS-хромотесте, следовательно, препарат не обладает мутагенностью и не является потенциальным канцерогеном.

11. Нуклеотидный препарат при введении в желудок беременным крысам в дозе 500 мг/кг с 1 по 19 день гестации не проявляет эмбриотоксических и тератогенных свойств. При ежедневном внутриже луд очном введении нуклеотидного препарата в дозе 500 мг/кг крысам- самцам в течение 10 недель (2- 3 цикла сперматогенеза) и 2 недель крысам- самкам (2-3 эстральных цикла) не установлено влияния препарата на репродуктивную функцию животных.

12. Разработка нуклеотидного препарата, активирующего Са2+-зависимую NOS, обладающего иммуномодулирующим действием, нормализующего уровень глюкозы и стимулирующего образование инсулина (3-клетками поджелудочной железы при диабете 2 типа, регулирующего эффекты антиоксидантной системы защиты организма и вызывающего селективный апоптоз клеток перевиваемых опухолей открывает новые возможности нормализации биохимических нарушений при использовании препарата в качестве средства комплексной терапии при лечении указанных патологических состояний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученный по разработанной технологии из дрожжей Басскаготусез сегеугзгае раса 14 нуклеотидный препарат, содержащий комплекс биологически активных веществ - нуклеотиды, аминокислоты, витамины, макро- и микроэлементы, обладает выраженными иммуномодулирующими свойствами в экспериментах на лабораторных животных и перспективен для" клинических испытаний для лечения заболеваний, сопровождающихся развитием иммунодефицитных состояний.

2. Выраженное гипогликемическое действие, защита от оксидативного стресса и стимуляция образования инсулина (3-клетками поджелудочной железы под влиянием комплексного нуклеотидного препарата на модели диабета 2 типа у крыс свидетельствуют о целесообразности проведения клинических испытаний разработанного препарата у больных с данным заболеванием.

3. Индуцирование нуклеотидным препаратом каспазы-3 и вызываемый препаратом селективный апоптоз в культуре клеток перевиваемых опухолей, а также его выраженное иммуномодулирующее действие позволяют рассматривать разработанный препарат из дрожжей БасскаготусеБ сегеуІБІае раса 14 в качестве перспективного лекарственного средства сопутствующей терапии при лечении опухолевых заболеваний.

4. Результаты доклинического токсикологического изучения разработанного нуклеотидного препарата, показавшие его низкую токсичность при однократном введении и хорошую переносимость при длительном назначении лабораторным животным, отсутствие мутагенных, эмбриотоксических, тератогенных и аллергизирующих свойств, а также негативного влияния на репродуктивную функцию животных свидетельствуют о возможности проведения клинических испытаний препарата в качестве комплексной терапии указанных выше заболеваний.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Орлова, Елена Владимировна, Москва

1. Ажипа Я.И., Реутов В.П., Каюшин Л.П. Окислительные свойства NO и их связь с процессами нитрозирования ненасыщенных жирных кислот. Физиол. человека, 1990, т. 16, с.131-149.

2. Аликулов З.А., Львов Н.П., Кретович В.П. Восстановление ионов NO3" в NO2" в цикле окиси азота. Биохимия, 1983, т.45, с.1714-1717.

3. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки. 1994, М., «Мир».

4. Ананиади А.И., Сергеев Н.С., Кильдибеков H.A., Львов Н.П., Кретович В.А. Цикл окиси азота. Биохимия, 1983, т.48, с.932-936.

5. Арчаков а А.И. Оксигеназы биологических мембран. 37-е Баховское чтение. М., Наука, 1982, с.56.

6. Арчаков А.И. Микросомальные окисления. М., Наука, 1975, с. 327.

7. Баскакова A.A., Безбородова С.И., Беляева М.И. Нуклеазы микроорганизмов. М., Наука, 1974, с.328.

8. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Ленинград, Государственное изд-во медицинской литературы, 1963.

9. Бендолл Дж. Мышцы, молекулы и движения. М., Мир, 1970, с.256.

10. Бердиев У.Б., Кузнецов Ю.П., Куклин П.Г., Реутов В.П., Шекшеев Э.М. Моделирование спектров ЭПР парамагнитных центров крови на персональных ЭВМ типа IBM PC/XT/AT. М, Ин-т хим.физики АН СССР, 1989, 208 с.

11. Бердиев У.Б., Реутов В.П., Вишневский Е.С., Шекшеев Э.М., Каюшин Л.П.Свободно-радикальные окислы азота могу участвавовть формировании конформеров комплексов гемоглобина с окстдом азота. Биофизика, 1990, т.35, с.382-383.

12. Болдырев A.A. Биологические мембраны и транспорт ионов. М., МГУ, 1985, с. 208.

13. Болдырев A.A. Введение в биохимию мембран. М., Высшая школа, 1986, с. 112.

14. Ванин А.Ф. Взаимопревращение двух возможных форм эндотелиального фактора релаксации сосудов S-нитрозоцистеина и динитрозильного комплекса железа с цистеином. Биофизика, 1993, т.38, с. 751-761.

15. Ванин А.Ф., Блюменфельд Л.А., Четвериков А.Г. Исследование методом ЭПР комплексов негемового железа в клетках и тканях. Биофизика, 1967, т.12, с. 829-838.

16. Ванин А.Ф., Бурбаев Д.Ш. Белки, содержащие железо-серные активные центры. Журн. Всес. хим. об-ваим. Д.И. Менделеева, 1976, т.21, с.672-684.

17. Ванин А.Ф., Кубрина Л.Н., Мордвинцев П.И. Карбахол индуктор образования окиси азота в печени животных in vivo. Докл. АН СССР, 1988, т.301, с. 490-493.18

Информация о работе

Орлова, Елена Владимировна
доктора биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Разработка и экспериментальное обоснование клинического применения комплексного нуклеотидного препарата из дрожжей Saccharomyces cerevisiae - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы