Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Модификация интерфенорами процессов репарации ДНК в клетках человека

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Модификация интерфенорами процессов репарации ДНК в клетках человека"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ имени Н.И.Вавилова

На правах рукописи УДК 575:591:577:117

ГУБИЦШ Елена Григорьевна

МОДИФИКАЦИЯ ИНТЕРФЕРОНАМИ ПРОЦЕССОВ РЕПАРАЦИИ ДОС В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

03.00.15- Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990 г.

Работа выполнена б Институте общей генетики АН СССР

Научный руководитель : доктор медицинских наук,профессор Г.Д.Засухина

Научный консультант : доктор биологических наук.чл-корресповдент Ш КазССР

Официальные оппоненты : доктор медицинских наук,профессор Ф.И.Ершов доктор биологических наук,профессор В.А.Шевченко

Ведущее учреждение - Институт цитологии АН СССР

в " " часов на заседании Специалиэ1фОванного совета Д 002.49.01 при Институте общей генетики АН СССР по .адресу: 117809, Москва, ул.Губкина,д.3. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики АН СССР.

Н .Б. Ахматуллина

Защита состоится

1991 года

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

Г.Н.Лолухина

■ --"Актуальность проблемы. Устойчивость клетки к экзогенным воз-

•VIЭЛ

:ертац!

»действиям различной природа обеспечивается работой репаратив-

ных систем, направленной на элиминацию спонтанных и индуцированных повреждений ДНК. Разработка методов повышения резистентности организмов к биологически активным факторам внешней среды представляет собой важную задачу генетики. Одним из подходов к решению этой проблемы является поиск модификаторов процессов репарации ДНК. К классу таких веществ.отнесен интерферон '(№>), преимущество которого заключается в том, что, будучи продуктом самой клетки, ИФ совершенно безвреден для организма .

. Несколько лет назад была открыта новая биологическая активность Ш - способность защищать клетки от. действия мутагенов разной природы (Засухина Г.Д. и др., 1979-19Э0). Имеющиеся в данное время результаты исследований антимутагеняых свойств ИФ дают возможность предположить существование нескольких механизмов для осуществления этого феномена. Во-первых, из данных исследования кинетики антякластогенного эффекта ИФ, регистрируемого по формированию хромосомных аберраций (ХА) и сестринских хроматидных обменов (СХО), индуцированных быстрыми нейтронами .и гашагизлучением,- следует, что Щ защищает от.поражения саму систему репарации клетки. Во-вторых, снижение ИФ уровней индуцированных ХА и СХО свидетельствует о стимуляции лнгибированной системы эксцизяонной репарации в ре-наратявно-дефектных клетках.человека. В-гретьих, Ш, по-видимому, стимулирует.новый, путь репарации. Дрказательством этого предположения служит'четкий защитный эффект ИФ по критерию ХА, в основе механизма^образования которых легат двунитевые разрывы ДНК. Однако оставался неясным вопрос об оптимальных условиях проявления I® своей антямутагенкой активности. По этой при-

♦

чине одной из задач исследования было определение параметров, в рамках которых проявляется способность ИФ защищать клетки от действия повреждающих агентов. При этом представлялось необходимым выявление возмошюй связи между влиянием ИФ на про-лиферативную активность клеток и репликативный синтез ДНК, с одной стороны, и процессами репарации, - с другой.

Для выявления путей, через которые ИФ осуществляет защитные функции, необходимо изучение его действия в различных ре-паративно-дефекгных клетках, характеризующихся мутациями в различных генах. С этой целью в работе были выделены и охарактеризованы по критерию репаративной активности клеточные линии, полученные от больных синдромом Марфана, гомоцистинурией, подагрой. В качестве позитивного контроля использовали фибро-бласты пигментной хсеродермы, которые обладают повышенной чув-. ствительносгьи к УФ-излучении, что связано с нарушением процесса-вырезания пиримидиновых димеров, индуцированных в ДНК УФ-излучением.

К факторам, модифицирующим репарацию ДНК, относятся также и некоторые вирусы (Засухина Г.Д. и др., 1983; Синельникова Т.А., 1983). Их способность угнетать или стимулировать ре-паративные процессы зависит от вида вируса, генотипа клеток, типа течения инфекции.. Вирус осповакцины обладал стимулирующей активностью в клетках человека. Однако не было изучено его влияние на процесс формирования разрывов ДНК и их реснн-тез в репаративно-дефектных клетках. Этот вопрос также был исследован в данной работе.

Известно, что противовирусное и ангипролиферативное действие ИФ связано с индукцией клеточных белков. Могло было предположить, что актимутагенное действие ИФ также обусловлено индукцией некоторых белков. Нами проведено исследование с

целью выявления белков, индуцированных Ш и вирусом осповакци-ны, и сравнения их с белками, образующимися при тепловом шоке, который, как известно, повышает устойчивость клеток к стрес-сорным воздействиям.

Полученные экспериментальные данные позволили выявить ряд новых закономерностей в механизме действия ИФ, которые тесно связаны с основными генетическими процессами в клетке.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение закономерностей модифицирующего действия ИФ на процессы репарации ДНК в фибробластах человека.

Поставленная цель определила необходимость решения сле-дугоцих задач:

1. Исследование влияния ингерферонов на репарацию и репликацию ДНК в зависимости от природа мутагена и способов аппликации препаратов.

2. Характеристика новых репаративно-дефектных линий перевиваемых фибробластов кожи человека, полученных от больных синдромом Марфана, гомоцистинурией, подагрой,

и сравнение их с клетками пигментной ксеродермн по критериям репаративной активности.

3. Изучение особенностей действия модификаторов репарации ДНК (ИФ и вируса осповакцины) по критерию репаративной активности в репаративно-дефектных клетках синдрома Марфана, гомоцистинурия, пигментной ксеродермы.

Научная новизна:

- показано, чточмодвфицдгущее действие Ш на процессы репарации и репликацшгДНК при воздействии мутагенов различной природы зависит от генотипа клеток и особенностей аппликации препарата:

- впервые определены оптимальные условия проявления антимутагенной активности ИФ на репарацию ДНК (по критерию образования индуцированных: разрывов ДНК) и показано, что для формирования защитного эффекта ИФ необходим инкубационный период не менее 4 ч; '

- выявлено, что предобработка клеток ИФ приводит к увеличению редаративного синтеза ДНК, которое сохраняется на протяжении 7-9 сут после удаления препарата и пассирования клеток;

- выделены новые линии перевиваемых фибробластов кожи человека, полученные.«? йэльных синдромом Марфана, гомоцистину-рией и подагрой, которые охарактеризованы как репаративно-дефектные при использовании комплекса методов определения активности систем репарации ДНК;

- обнаружено," что репродукция вируса осповакцины в нормальных и репаративно-дефектных клетках гомоцистинурии сопровождается стабилизацией структуры ДНК, в которой образуется меньше гамгла-индущрованных разрывов" ДНК, чем в неинфициро-ванных клетках;

- при анализе индуцированных белков было выявлено, что ИФ (в концентрации 50 МЕ/мя) и вирус осповакцины индуцируют в фиб-робластах человека клеточные белки с м.м. 18 и 24 кД.

Практическое значение. Показано, что ИФ повышает репарацию ДНК при -воздействии мутагенов различной природы в клетках человека. Это свойство-® может быть использовано для разработки подходов к увеличению устойчивости человека к некоторым химическим и физическим мутагенам в экстремальных условиях.

Основные положения, выносимые на защиту: I. О зависимости модифицирушего действия ИФ на процессы репарации и репликации ДНК от генотипа клеток и особенностей аппликации препарата.

-52. Оптимальные условия формирования защитного эффекта ИФ.

3. О длительности сохранения защитного действия Ш после удаления препарата и пассирования клеток.

4. О стабильности нарушений репарации ДНК в перевиваемых линиях фибробластов, полученных от больных синдромом Марфа-на, гомоцистинурией, подагрой.

5. О стабилизации структуры ДНК в нормальных и репаративно-дефектных клетках при гомоцистннурии, инфицированных вирусом осповакцины, к гамма-излучению.

. 6.0 возможной индукции белков в нормальных клетках человека, предобработанных Ш или инфицированных вирусом осповакцины.

. Апробация. Материалы диссертационной работы доложены на уг и VI1 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987,. 1990); на I Всесоюзном съезде . радиобиологов (Москва, 1989);_на секции,"Генетические'аспекты проблемы "Человек и биосфера". (Ереван, 1987;. Киев,. 1988);.на II Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Алма-Ата, 1990); на'семинаре "Молекуларные механизмы генетических процессов" отдела "Генетической безопасности" ИОГен имени Н.И. Вавилова АН СССР (Москва, .1990).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем диссертации, и ее структура. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав, заключения, выводов и указателя: литературы. Диссертация изложена на 147 странинЬс ма-шяаошскогэ -текста, содержи? g. табжц и ZQ глсуяйсз\ Список литератур!' вюготае® 21.1 названий.

СОДЕРЗДНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В работе использованы линии перевиваемых фибробластов человека, полученные из биоптата кожи внутренней поверхности средней трети предплечья «Зольных синдромом Марфана, гомоцистинурией и подагрой. В качестве контроля брали нормальные фибробласгы человека (штаммы ШГ 1214, ЖГ 855, ЖГ 812) и фибробласты больных пигментной . ксеродермой (штамм ИМГ 1021), полученные из репозитория Института медицинской генетики АМН СССР.

Все клеточные линии, пассировали на среде ИГЛа с добавлением -10 % сыворотки крови крупного рогатого скота и 5 % пупо-зянной сыворотки крови человека. Исследования проводили на уровне 4-12 пассажей.

Обработка клеток иятерщеронами и вирусом осповакцины. Клетки инкубировали с лшфбластоидным ИФ,^ ("Sisma", США) и реком-бинантным ("Roche", Япония) на протяжения 20 или 6 ч

до эксперимента. Концентрации ИФ составляли 5, 50, 500 или 2500 МЕ/мл.

Инфицирование фибробластов вирусом осповакцины .(штамм Листер) при множественности заражения I БОЕ/кл проводили в' течение 40 мин при температуре 37 °С, после чего клетки отмы-ьаяи и инкубировала б термостате на протяжении. 24 ч.

Воздействие мутагенов. В качестве мутагенов использовали: УФ-излученяе (дозы от 5 до 15 Дж/м2); 4-нитрохшолин-1-оксид (4-НХО) в концентрами I-I0"6 М при экспозиции 30 и 60 мин; гамма-излучение (дозы 5, 10, 100 Гй; установка 1УП0С с источником излучения ^cs мощностью 3,62 Гц/мин) при температуре О °С; Н-меткл-И'-Еагро-й-нитрозогуанидин (МНЕТ) в концентрации 5 мкг/мл при экспозиции 30 и 60 мин.

Иетод реактивации и индуцированного мутагенеза вируса осповак-цины. Неспособность клетки к выразенной реактивации проявляется в пониженной выживаемости вируса и отракает подавление процесса восстановления сублетальных повреждений ДНК. Показатели повышенного мутагенеза вируса свидетельствует о неспособности клетки восстанавливать повреждения ДНК, реализующиеся в мутациях. Эти два критерия были использованы для оценки способности' клеток к репарации как сублетальных, так и предмутацион-ных повреждений.

Фибробласты, находящиеся в монослое, инфицировали вирусом осповакцины (штамм Листер), после чего внутриклеточный вирус обрабатывали мутагенами. Для выделения вируса клетки дважды замораживали, оттаивали и титровали методом бляшек на куль-'туре.куриных фибробластов. Выживаемость, вируса осповакцины для каждого образца вычисляли по разнице титров вируса, в.контрольных и обработанных мутагенами клетках. йутабильность вируса учитывали по размеру бляшек: мелкими считали, бляшки менее 2 мм, крупными - более 2 мм. Для изучения стабильности мелко-бляшечных вариантов было проведено клонирование мелких бляшек размером от.О,5 до 1,3 мм. Потомство вируса.пассировали в клетках куриного эмбриона (3-4 пассажа). Било изучено 10 клонов. Варианты вируса, образующие мелкие бляшки, сохраняли мел-коблятечный вариант фенотипа, т.е. их размеры не превышали .1,3-1,5 мм.

Определение формирования и ресинтеза разрывов ДНК проводили с помощью злюция клеток, лязировакных ка мембранных фильтрах. Меченные по %-тимцдину (I мкКд/мл; удельная активность -18,.В Ки/ммоль) клетки собирали на мембранные фильтры (1,2 мкм, 0 24 мм; "Сынлор", ЧССР), промывали 5 мл раствора холодного Версенг и лизировали. в 5 мл раствора, ссдехагцего 0,02 м

Яа2-ЭДТА (pH 10,2); 0,2 % лаурил саркозилата; 2 М flaCl (рНЮД Фильтры промывали 3 мл 0,02 М Яа2-ЭДТА (pH 10,2) и элюировали раствором 0,02 М ЭДГА, pH которого доводили до 12,45, добавляя 20 % раствора гидроксида тетрапрошшакмония - ТПА ("Jiuka, Швеция).. Элюдаю выполняли со скоростью 0,3 мл/мин в темноте на протяжении 2 ч. Четыре 30-шнутные фракции собирали в пробирки, добавляли бычий сывороточный альбумин (2 мг/мл) и трихлоруксус-ную кислоту (ТХУ) до концентрации'5 % и осаздали на фильтрах "Сынпор" (0,4 мкм). Оставшуюся на фильтре после элюции ДНК промывала 5 % раствором ТХУ и 70 % этанолом. Относительную радиоактивность каздой элюированной фракции вычисляли по формуле К = (Р0 Рй)-Р0, где PQ - радиоактивность всех элюированннх фракций плюс радиоактивность, оставшаяся на фильтре после элюции; Pgj - радиоактивность каждой, фракции.

Определение репликативного синтеза ДНК. Клетки выращивали на 24-луночных пластиковых плато в инкубаторе с 5 % СО2 на протяжении 24.ч. После замены среды на обедненную (0,5 % сыворотки) клетки инкубировали в течение 4 сут и затем стимулировали к делению, заменяя обедненную среду на полную питательную среду. Через 48 ч после начала стимуляции клетки, меченные тямвдином (0,5 мкКи/мл) в последние 24 ч инкубации, собирали на фильтрах (0,4 мкм), прог,швали 5 % раствором ТХУ и 70 % этанолом. Радиоактивность измеряли в толуольном или диоксановом сцинтил-ляторе на счетчике "Mark-II".

Определение репаративного синтеза ДНК, индуцированного мутагенами, проводили с помощью жидкостно-сцинтилляционной радиометрии по включению %-тимидина (2,5 мкКи/мл) в общий пул клеток (1-10® кл/мл), находящихся либо в состоянии покоя, либо в стационарной фазе роста. В некоторых экспериментах использовали оксимочезнну для подавления репликативного синтеза ДНК. Состо-

яния покоя достигали путем длительного культивирования клеток в обедненной питательной среде (0,5 % сыворотки). Репаратив-ный синтез ДНК рассчитывали как отношение радиоактивности в обработанных мутагенами клетках к радиоактивности в контрольных образцах, Кавдый вариант ставили в 3-5 параллелях.

Метод электросБоратического разделения белков. В работе использовали культуру перевиваемых фибробласгов человека (штамм ИМГ 814), находящуюся в покое. После культивирования клеток в условиях голодания, их стимулировали к делению заменой среды на полную питательную среду, в которой клетки инкубировали на протяжении 6 ч либо с ИФ<х (50 ME/мл), либо инфицировали вирусом осповакцины. ^s-метионин (100 мКи/мл) в фосфатном буфере (pH 7,2) вносили в культуру после 3-кратного промывания раствором Хэнкса. Через 1,5 ч метку удаляли и клетки промывали, лизирование проводили в буферном растворе, содержащем 0,01 М Трис-BCl, 5 % додецилсульфата и 5 % 2-ß -меркаптозтанола. Пробы инкубировали в кипящей бане на протяжении 3 мин и хранили при температуре -20 °С. Анализ полученных образцов проводили с помощью электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (10-15 %) по методу Laemmli. Гелевые пластины обрабатывали с применением флюорографии по методу Chamberlain, высушивали на приборе фирмы "Bio Rad" и экспонировали с рентгеновской пленкой orwo при температуре -70 °С в течение 3-7 сут.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУДЦЕНИЕ I. Модификация интетхЕероками процессов репарации и репликации

ДНК в зависимости от природы мутагена (УФ-излучение и МННГ)

и особенностей аппликации препарата

Изучение закономерностей модификации процессов репарации ДНК является необходимым этапом в разработке подходов к повышению устойчивости клетки и организма к повреждающим воздействиям.

-101.1. Определение оптимальных условий проявления защитных свойств интерферона

Интерферон - .один из модификаторов репарации ДНК, оказывающий стимулирующее влияние на процессы .репарации и мутагенеза в клетках человека. Однако оставался неясным вопрос об оптимальных условиях проявления Ш защитных свойств. Решению этой задачи посвящен данный раздел 'исследования.

Как известно, интерфероны ингибируют пролиферацию клеток. В то яе время, данные об антипролиферагивном действии Ш получены с высокими концентрациями препарата.

Для решения поставленных задач необходимо было выявить концентрации ИФ, не вызывающие значительного енкхения реплика-тпвного синтеза ДНК.

Как видно на рисунке I, низкие концентрации препарата (5 и 50 Ж/мл) при экспозиции 20 ч не оказывают существенного влияния на репликативный синтез ДНК. Поэтому в дальнейших экспериментах использовали концентрации не превышающие 50 Исследование условий оптимизации защитного эффекта ИФ проводили по критерию формирования индуцированных разрывов ДОС. Методом щелочной элюции изучали зависимость образования индуцированных разрывов ДНК от времени введения препарата ИФ. В качестве мутагенного воздействия использовали МННГ, механизм ззаиыодействия с ДНК которого хорошо известен. На рисунке 2 показано, что в ИФ-лредобработанных клетках человека происходит снижение числа индуцированных разрывов ДЕК, которое проявлялось уже через 4 ч инкубации клеток с ИФ. Однако при увеличении срока инкубации клеток с ИФ выявили различия в ответе клеток на ыутагенное воздействие разной продолжительности. Если при 30-минутной экспозиции ИШГ защитное действие ИФ регистрировалось уне после 4-часовой предобработки клеток препа-

ШО и 2500 МЕ/мл Концентрация Ш

Рис Л .Подавление репликативного синтеза ДНК в ■ нормальных фибробластах человека, предобработан-ньк интерфероном.

-о--природный ; --рекомбинантный

20 30 40 Время. инкубации с

(час)

Рш.2.Образование МШГ-индуцированных разрывов ДНК в клетках1 человека с различной продолжительностью предобработки интерфероном, -а—клетки,предобработанные №?л(50 МЕ/мл); -А—клетки,инкубированные с ИЗЬи обработанные

ШНГ(5 кмг/мл,30 мин); -а—клетки,инкубированные с Шщи обработанные ЫННГ(5 мкг/ыл,б0 мин).

ратом и далее оставалось на этом уровне, то при 60-шшутной экспозиции МННГ характер кривой изменялся. Максимальная устойчивость клеточной ДНК к мутагену в этом случае наблюдалась токе после 4 ч предобработки клеток ИФ, но затем защитный эффект ИФ снижался. Пои инкубации клеток с ИФ в течение 20 ч без последующей обработки мутагеном регистрировалось незначительное количество однонитевах разрывов ДНК. При удлинении срока инкубации с препаратом до 30-40 ч наблюдалось некоторое увеличение скорости элюции ДНК (рис. 2).

Таким образом, выявлено, что 4-часовой период предобработки клеток Ш оптимален для выявления защитного эффекта ИФ по критерию образования разрывов ДНК, т.е. по ее устойчивости к мутагену. Эти результаты использовали для решения следующей задачи исследования, включающей вопрос о том, как долго сохраняется способность Ш защищать ДНК после его удаления из среды роста. С этой целью югетки, инкубированные с ИФ ..отмывали от него и обрабатывали. МННГ сразу после удаления ИФ и через 24 и 48 ч. Данные, предстазленные в таблице I, показывают, что защитный эффект ® сохраняется после его удаления из среды роста на одном уровне в течение 24 ч, после чего не регистрируется.

Таблица I. Образование разрывов ДНК в клетках,

предварительно инкубированных с ИФсС- *

-г

Вид воздействия

Время после удаления ИФ из среды роста, ч О ! 24 > 48

Шл(50МЕ/мл) 100+5 92+1* 98+7

МННГ (5 мкг/мл, 30 мин) 78+5

ИФЛ +. МННГ _ 87+5 86+5 70+4

ж Среднее арифметическое значение радиоактивности фрагментов ДНК, оставшихся на фильтре после элюции, %. от контроля.

Суммируя результаты, приведенные выше, можно сделать вывод о том, что для проявления защитных свойств ИФ необходим определенный инкубационный период. Возможно, в течение этого периода ИФ активирует ряд генов, принимающих участие в формировании устойчивости ДНК к экстремальным воздействиям. Продолжительность времени инкубации, необходимого для проявления защитных свойств ИФ, как оказалось, неодинакова и зависит от экспозиции клеток мутагеном. Можно предположить, что это связано не только с увеличением количества индуцированных повреждений ДНК, но и с угнетением мутагеном ферментов, прямо или опосредованно принимающих участие в процессах репарации.

1.2. Влияние интерферона на синтез ДНК в условиях

воздействия мутагенами

Ранее рядом авторов было показано стимулирующее действие ИФ на репаративный синтез ДНК, индуцированный 4-НХО и УФ-излу-чением, в стимулированных фитогемагглгатинином (ФГА) лимфоцитах периферической крови человека при подавлении репликативного синтеза ДНК оксимочевиной (Засухина Т.Д. и др., 1982; Македо-нов Г.П. и др., 1984). Нами проведено исследование эффектов ИФ и УФ-излучения на синтез ДНК в нормальных фибробластах человека. При этом использовали две клеточные модели: I) клетки, которые выращивали в течение 21 сут в бессывороточной среде, т.е. находящиеся в покое; 2) культуры с низким уровнем пролиферации, которые за 24 ч включали %-тимидина в 4-5 раз меньше, чем культуры с высоким уровнем пролиферации. При стимуляции к делению стационарных культур с низким уровнем пролиферации включение меченого тнмидина увеличивалось в 8 раз, в то время как в культурах с высоким уровнем пролиферации - только в 3 раза. Использование таких моделей дает возможность выявления репара-тивного синтеза ДНК без применения ингибиторов репликативного

А

Рис.3.Эффекты интерферона (® 50 МЕ/ыл)и УФ-обяу-чения на синтез ДНК в нормальных фибробластах че-_ловека.

>-.-~:-эф|ект определяли как отношение радиоактивности - -. в облученных клетках к контролю;

га -клетки,предобработашше Ш и облученные УФ-лучами: □ -УФ-облученные клетки.

скнтеза (рис. 3). Во всех экспериментах ИФл (50 МЕ/мл) добавляли одновременно со сменой среды, стимулирующей клетки к пролиферации. Инкубация клеток с ИФ продолжалась 6 ч, после чего клетки облучали и определяли подавление реплдкативного синтеза ДНК. В фибробластах с низким уровнем пролиферации (14 сут в бессывороточной среде) при добавлении КФ репликативный синтез ДНК снижался до 0,47 (рис. 3, а). После УФ-облучения этих клеток наблюдали зависимое от дозы подавление синтеза ДНК: до 0,82 - при 5 Дж/м2 и до 0,70 - при 10 Дж/м2. Таким-образом, обработка клеток ИФ и УФ-излучением в отдельности вызывала подавление синтеза ДНК. Однако при совместном действии этих агентов регистрировали противоположный эффект: в предварительно . обработанных Щ клетках синтез ДНК после УФ-облучения превышал уровень синтеза в контрольных вариантах, обработанных только ИФ. Такой результат мояет объясняться тем, что ИФ стимулирует индуцированный УФ-излучением. репаративный синтез ДНК. В покоящихся культурах отмечался высокий уровень реларативного синтеза ДНК, но не наблюдалась его модификация ИФ (рис. 3, б).

Таким образом, установлено, что для реализации эффекта ИФ, связанного со стимуляцией процессов репарации, необходима активация генов, регулирующих лролиферативный статус клеток. Кроме того, проведенные исследования показали, что проявление модифицирующей активности ИФ зависит от способа аппликации и времени введения препарата. Необходимо было выявить возможность сохранения наблюдаемого эффекта Ш при пассировании клеток, предобработанвдх ИФ, в среде, не содержащей препарата.

Методом репаративного синтеза ДНК было показано, что в клетках, предобработаняых ИФ однократно или хронически (ежедневная замена среды, содержащей ИФ, в течение 5 сут), пассированных и подвергшихся УФ-облучению, показатели репаративного

о с.

о §

§

<и

Си ф

¡4

к.

(ИЬс

ч

й) аЗ/с И СО1"*

М) Е< 0) Я О К а: о

(5

щ ^

к о о к

Е1 О

1.0

А '1 Е ' /\Ч

Т ^^^ - * * I / \ и

___I

/г- * /

8

г

Рис.4.Стимуляция репаративного. синтеза. ДНК в.ИШ-обработанных.клетках чоловека после УФ-облученш}^.

А-концентрация ®-10.МЕ/мл,Бр'еш.'.шкубации'24^час;В-концентр.Ш-50 МЕ/мл,время инкубации 24 час) В-конц.№-10 МЕ/мл,продолжительность предобработки 5 суток с ежедневной заменой среды;

-в— природный ; - о--рекомбинантныя

Х- рвпаративный синтез в контрольных клетках принят за I.

синтеза ДНК были выше, чем в необработанных ИФ метках (рис.4). Определение эффекта проводили через 7-9 сут после пересева клеток, т.к. меньший срок инкубации не давал возможности для выявления репаративного синтеза ДНК без применения одсимочевины. В культурах, обработанных Ш хронически, уровень репаративного синтеза ДНК был значительно выше, чем в клетках, обработанных ИФ однократно (ряс. 4, в). В то. же время, эффект рекомбинант-ного ИФос2 был более выра-кен по сравнению, с действием природного Ша.

Таким образом, в приведенных выше экспериментах.- представлены доказательства, активации ® процессов, приводящих к усилению репаративного синтеза ДНК в клетках, предварительно обработанных ИФ и затем в течение нескольких циклов культивированных без него. По-видимому, Ш способен индуцировать в клетке длительно протекающие процессы, стимулирующие репарацию ДНК, которые были условно названы 'Ьнтерферон-индударованной памятно"

2. Репаративно-деФектные клетки как модель для изучения механизмов действия лнтерфероноз •

Использование клеток, имеющих дефекты различных генов репарации ДНК, может служить одним из подходов для определения пути, через который интерфероны осуществляют свою активность.

Ранее были получены сведения о нарушении процессов репарации ДНК в лимфоцитах периферической крови больных синдромом Марфана, гомоцистинурией, подагрой (Засухина Г.Д., 1983). Однако не было ясно, сохраняется ли дефект репарации ДНК в перевиваемых клетках таких, больных. С этой целью нами получены перевиваемые линии фибробластов из биолтата кожи больных гомоци- . стинурией, подагрой или синдромом Марфана. Было проведено сравнительное изучение этих линий с перевиваемыми фибробластами здоровых доноров и больных пигментной ксеродермой, которые ис-

Таблица 2. Характеристика фибробластов,полученных из биоптатов кожи больных пигментной ксеродермой',гомоцистинурией,синдромом Марфана,подагрой, по критериям-:реак-тивация и'мутагенез вируса осповакцины,репаративный синтез ДНК*скорость репарации индуцированных разрывов ДНК ( нормальный процесс обозначен знаком "=", сниженный - повышенный - "Г" ) ■

Линии !Выживаемость вируса! Мутабильноеть вируса перевивае-1 осповакцины 1 осповакцины

мы* фибро-1-!-

бластов ¡443X0*1 гамма- (Спонтанный!.нуп' гамма-

1'шлио.— юииптшпыи I « НУГИ А'ихлми.—

I излучение ! уровень !излучение

Репарация разрывов ДНК

й—НУо' гамма-!излучение

Репаративный сштез ДНК

л цупI гамма-Л I излучение

Пигментная ксеродерма

Гомоцис-тинурия

Синдром Марфана

Подагра

Т

т т

1

1

1 1

т т

? ?

СО I

л Или УФ-иэлучение

пользовали в качестве контроля репаративно-дефектных клеток (табл. 2).

Активность репаративннх систем полученных клеточных линий оценивали, используя следующие критерии:

- репаративннк синтез ДНК'- один из важнейших этапов репарации, деятельность которого обеспечивается работой ряда ферментов, принимающих участие в этом процессе;

- ресинтез разрывов ДНК, возникающих при воздействии различных мутагенов и свидетельствующих об активации этапа репарации, контролирующего воссоединение разрывов ДНК;

- реактивация и мутагенез вируса осповакцины, отражающие интегральную способность клетки-хозяина к репарации повреждений вирусного генома.

Выбор мутагена обусловливался спецификой репаративннх систем, участвующих в восстановлении индуцированных повреждений ДНК. Повреждения ДНК, вызванные УФ-излучением или УФ-миметяком (4-НХО), восстанавливаются по "длинному" пути с участием большого количества ферментов, активность которых главным образом реализуется в течение 20-24 ч. Гамма-излучение вызывает повреждения ДНК, восстановление которых осуществляют ферменты "короткого" пути репарации. В таком случае репарация происходит в течение I ч, при этом из ДНК удаляется '4-3 нуклеотида.

Анализ данных показал нарушение "длинного" УФ-пути репарации ДНК в фибробластах больных синдромом Марфана и подагрой, в то время как в фибробластах больных гомоцистинурией обнаружено нарушение "короткого" гамма-пути репарации ДНК.

Таким образом, показано, что дефект репарации ДНК, обнаруженный в лимфоцитах крови больных синдромом Марфана, гомоцистинурией или подагрой, сохраняется в линиях перевиваемых фибробластов ком этих больных.

-203. К механизму действия интерферона и вируса осповакцкны в нормальных и репарагивно-дефектннх ¡слетках человека

Вирус осповакцияы ислользовали в качестве модифицирующего фактора на процесс репарации ДНК в нормальных и репаративно-дефектных клетках, поскольку с этим вирусом ранее были получены данные о его стимулирующем влиянии на репаративную систему в клетках человека (Засухина Г.Д"., Синельщикова Т.А., 1987). Было исследовано влияние вируса осповакцины на формирование гамма-индуцированкнх разрывов ДНК в нормальных и репарагивно-дефектных клетках больных гемоцистинурией (рис. Ш). Показано, что в инфицированных вирусом клетках здоровых доноров количество индуцированных разрывов ДНК достоверно меньше, чем в не-инфицированных. Аналогичная закономерность отмечена и в культуре фибробластов больных гомоцистинурией (рис. 5, б). Этот эффект, возможно, .'связан со способностью вируса осповайршы индуцировать в'клетке ряд новых ферментов, которые мохут принимать участие в процессах репарации ДНК. В данном случае ус-' тойчивость ДНК к гамма-излучению в инфицированных вирусом клетках, вероятно, связана с усилением процессов сверхбыстрой ("под лучом") репарации ДНК, которая феноменологически отражается в уменьшении количества индуцированных разрывов ДНК.

Однако действие вируса осповакцины, обеспечивающее стабилизации структуры ДНК, не может быть обусловлено синтезом ИФ, так как данный вирус не является интерфероногенным.

Таким образом, действие ИФ и вируса осповакцины фенотипь-чески сопровождается одним и тем же явлением - модификацией репарации ДНК. Однако механизмы наблюдаемого процесса различны, что следует из данных, полученных с репаратявно-дефектными клетками больных гомоцистинурией. Предобработка этих клеток ИФ не сообщала устойчивости ДНК к гаша-излуч&ш£2> (Шоньн Е.Е.

19 50 100 ГЙ

" Гамма-облучение

Рис.5.Индукция разрывов ДНК в гамма-облученных клетках,предварительно инфицированных вирусом осповакцины(1 БОЕ/мл,40 млн). А - нормальные фибробласты человека; В - фибробласты гомоцистинурии; -А— клетки,инфицированные вирусом; -Д— контрольные клетки.

и др., 1989), в то время как инфицирование клеток вирусом осповакцины приводило к формированию устойчивости ДНК в клетках больных гешцистияурией к повреждающему воздействию.

Как было показано выше, для проявления ЙФ защитных свойств необходим определенный инкубационный период. Это, по-вмдшому, обусловлено индукцией некоторых клеточных белков. Кроме того, известно, что вирус осповакцины также индуцирует в клетке синтез специфических белков, которые прямо или опосредованно могут влиять, как нами обнаружено, на формирование устойчивости ДНК к мутагенному воздействию.

• . Наш выполнены исследования, целью которых было выявление белков, индуцированных КФ и вирусом осповакцины, к сравнение их с белками теплового шока, относящихся к семейству "стрессорннх" белков, синтезируювдахся в ответ на нагревание и сообщающих клетке устойчивость к воздействию мутагенов. Результаты показали, что Ш и вирус осповакцины индуцируют в фибробластах человека белки с м.м. 18 и 24 кД, тогда.как при тепловом шоке ситезируются те же белки и белок с м.м..85 нД.

В результате исследований установлено, что Ш и вирус осповакцины не лддуцаруют основного белка теплового шока -с м.м. 85 кД, в то время как низкомолекулярные белки (18 и 24 кД) располагаются в аналогичных белкам теплового шока позициях.

Таким образом, в работе выявлены оптимальные условия для проявления защитных свойств интерфероноз в низких концентрациях (50 МЕ/мл) на процессы репарации ДНК и установлены параметры продолжительности влияния ИФ. Обнаружено, что стимулирующее действие № на репаратнзный синтез ДНК сохраняется при пассировании клеток. По-видимому, это обусловлено индукцией белков определенного класса. Получепн новые репаратквко-де-

фектные линии перевиваемых фибробластов человека и показано, что использование таких клеток дозволит выявить пути, через которые Ш осуществляет стимулирующее действие на процессы репарации ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что модификация процессов репарации и репликации ДНК днгерферолами при воздействии различных мутагенов зависит от генотипа клеток человека и условий аппликации препаратов интерферона.

2. ¡^явлены оптимальные условия__действия интерферона в низких концентрациях (50 МЕ/мл) на репарацию ДНК (по критерию фор. мирования индуцированных разрывов ДНК) и показано, что их

стимулирующая активность проявляется через 4 ч после введения препарата. Предобработка клеток человека интерферонами приводила к увеличению уровня репаративкого синтеза ДНК, который сохранялся, на протяжении 7-9 сут после удаления интерферона и пассирования клеток.

3. ЕЫло показано, что активность интерферона зависит от проли-феративного статуса клеток. Усиления репаративкого синтеза ДНК не происходит, если культура клеток находится в состоя. яии покоя.

'4. Доказано ингибирование репарации ДНК в фибробластах кожи больных синдромом Ыарфана, гомоцистинурией, подагрой по следующим критериям: реактивация и индуцированный мутагенез вируса осповакцины; репаративный синтез ДНК; выживаемость клеток и ресянтез разрывов ДНК, индуцированных различными мутагенами. 5. В репаративно-дефектяых клетках больных гомоцистинурией, инфицированных вирусом осповакцины, при воздействия гамма-

излучения образовывалось меньше индуцированных разрывов ДНК, чем в неинфицированных клетках.

6. Показано, что интерферон и вирус основакцины индуцируют в клетках человека белки с м.м. 18 и 24 кД, которые, возможно, принимают участие в процессах репарации ДНК.

Список работ, опубликованных до теме диссертации

1. Синельщикова Т.А., Губицкая Е.Г., Засухина Г.Д. Механизмы нарушений репарации ДНК в клетках человека. Эффекты натив-ного и рекомбинантного интерферонов в УФ-облучешшх фибро-

.' бластах человека // Генетика. - 1989. - Т. 25, й II. -С. 2044-2049.

2. Губицкая Е.Г., Синелыдекова Т.А. Различия в формировании устойчивости ДНК к гамма-облучению в клетках репаративно-дефектных и здоровых доноров, инфицированных вирусом оспо-вакцины // Тез. докл. симп. "Эколого-генетические последствия воздействия на окружающую среду антропогенных факторов" . Сыктывкар, 1989. - С. II.

3. Филиппова В.Т., Чекова В.В., Львова Г.Н., Васильева Й.М., Синельщикова Т.А., 1убицкая Е.Г., Балкаров И.М^, Засухина Г.Д. Нарушение репарации ДНК сохраняется в перевиваемых фибробластах, полученных от больных подагрой // Терапевтический архив. - 1990. - гё 6. - С. 79-81.

4. Губицкая Е.Г., Синельщикова Т.А., Ахматуллнна Н.Б., Засухина Г.Д. Оптимизация защитных свойств интерферонов в' клетках человека при воздействии мутагенами по критериям оцен-

• ки репарагивной активности ДНК // Генетика. -1990. - Т. 26, & 8. - С. 1519-1522.

5. Синельиикова Т.А., Губицкая Е.Г., Ахматуллнна Н.Б., Засухина Г.Д. Инфицирование реларативно-дефектных клеток .человека

вирусом осповакцкяы снижает формирование гамма-индудирован-ных разрывов ДНК // Радиобиология. - 1990. - JS 6.

6. Губицкая Е.Г., Синелыдикова Т.А., Ахматуллина Н.Б. Защита клеток человека от мутагенного воздействия интерфероном. Оптимизация эффекта // Тез. докл. Всесоюз. координац. со-вещ. "Генетические последствия загрязнения окружающей среды мутагенными факторами". - Самарканд, 1990. - С_ 67.

7. ЗГубицкая Е.Г., Ташенова A.A., Синелыдикова Т.А., Ахматулли-на Н.Б., Засухина Г.Д. К механизму антимутагенного действия интерферона в фибробластах человека на анализе индуцированных белков // Цитология и генетика. - 1991. - fö 2.

8. Синельщикова Т.А., Губицкая Е.Г. Модификация репарации ДНК в гамма-облученных клетках человека с помощью вирусов и интерферона // Доклада I Всесоюзного съезда радиобиологов.

■ - М., 1989. - Т. 5, - С. 1099.