Компьютерный анализ структуры и эволюции функциональных сайтов белка P53

Пинтус, Сергей Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Компьютерный анализ структуры и эволюции функциональных сайтов белка P53
ВАК РФ 03.01.09, Математическая биология, биоинформатика

Автореферат диссертации по теме "Компьютерный анализ структуры и эволюции функциональных сайтов белка P53"

004609103

На правах рукописи

ПИНТУС СЕРГЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ЭВОЛЮЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ САЙТОВ БЕЛКА Р53

03.01.09 - математическая биология, биоинформатика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН 2010

Новосибирск — 2010

004609103

Работа выполнена в секторе компьютерной протеомики Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Иванисенко В.А.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Бажан С.И.

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», Новосибирская обл., пгт. Кольцово

кандидат биологических наук Кочетов В.А.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии

имени В.А. Энгельгардта, г. Москва

Защита состоится «2Q, » с р 2010 г.

на утреннем заседании Диссертацисшного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д 003.011.01) при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10. Факс: (383) 333-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ni.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан «(Я- » 2010 г.

Ученый секретарь . \ /

Диссертационного совета, \х(\Ч

доктор биологических наук / у Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Основной функцией белка Р53, являются предотвращение деления клеток, имеющих повреждения в своей ДНК, и участие в формировании органов у эмбрионов большинства позвоночных животных. В случае повреждения клеточной ДНК, белок Р53 вызывает либо задержку клеточного цикла в одной из контрольных точек, либо вызывает апоптоз данной клетки. При этом белок может выступать как в качестве фактора транскрипции, так и активировать продукты других генов напрямую. Как правило, для задержки клеточного цикла необходима транскрипционная активность гена р53, тогда как апоптоз может проходить и посредством белок-белковых взаимодействий (Levine, 1997).

Противоопухолевые функции Р53 включают также его прямое участие в эксцизионной репарации ДНК (Donehower, 1997). Белок Р53 также играет важную роль в эмбриональном развитии у позвоночных, регулируя пролиферацию и апоптоз клеток (Prochazkova et al, 2004). Таким образом, исследование структуры, функции и эволюции Р53 является актуальным и представляет как чисто теоретический, так и прикладной интерес.

Белку Р53 родственны белки Р63 и Р73. Белки Р63 и Р73 способны вызывать остановку клеточного цикла и апоптоз, но имеют большее значение в эмбриогенезе, чем Р53. Оба гена имеют множество функциональных продуктов альтернативного сплайсинга. Организация функциональных доменов белков Р53, Р63, Р73 эволюционно консервативна, за исключением того, что Р63 и Р73 отличаются наличием С-концевого домена, обозначаемого как SAM (sterile alpha motif).

На основании филогенетического анализа белков Р53, Р63 и Р73 (Aguinaldo et al, 1997; Gerhard and Kírschner, 1997) ранее было предположено, что белок Р53 произошел от предка, общего с предком белков Р63 и Р73, и, впоследствии, потерял SAM-домен (Saccone et al, 2002; Yang et al, 2002).

При этом его функции претерпели значительную специализацию, что в работе (Yang et al, 2002) было предположительно связано с естественным отбором, направленным на уменьшение риска образования опухолей, который повышен у позвоночных, в связи с тем, что у них повышена скорость регенерации тканей. Итак, для полного понимания всех аспектов функционирования белка Р53 в клетке необходимо детальное изучение структурно-функциональной организации и эволюции родственных ему белков Р63 и Р73.

В настоящее время накоплено довольно много экспериментальных данных, представленных в электронных базах, по первичной последовательности, структуре и функции белка Р53, как для человека, так и для других видов.

Функциональные характеристики сайта в белке непосредственно зависят от типа входящих него аминокислот и от их пространственного расположения в третичной структуре белка. С другой стороны, на функциональные свойства сайтов белка также могут оказывать влияние аминокислоты, удаленные от этих сайтов в пространственной структуре белка. Изучение связи структуры и

функции белков требует рассмотрения различных аспектов их структурной организации, включающих как физико-химические, так и геометрические и конформационные свойства функциональных сайтов, а также окружающих их участков белка и всей белковой молекулы в целом.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было выявление закономерностей структурно-функциональной организации белка Р53 на основе анализа пространственных структур мутантных форм белка и определения режимов его эволюции.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода предсказания функциональных сайтов белков на основе структурного выравнивания шаблонов сайтов из базы данных пространственных структур функциональных сайтов белков РОВБ^е с пространственными структурами анализируемых белков.

2. Разработка метода выявления участков белка, подверженных конформационным изменениям в результате мутаций, на основе статистического анализа траекторий молекулярной динамики.

3. Анализ влияния мутаций на структурно-функциональную организацию белка Р53 с помощью моделирования пространственных структур его мутантных форм и разработанных методов предсказания функциональных сайтов, а также определения участков белка, подверженных статистически значимым конформационным изменениям в результате мутаций.

4. Изучение влияния естественного отбора на эволюционную историю и структуру белка Р53: поиск этапов движущего отбора в эволюционной истории белков Р53, Р63, Р73, определение в кодирующих последовательностях соответствующих генов позиций, замены в которых давали кодируемым белкам селективное преимущество.

5. Сравнительный анализ частот аминокислотных, замен, приходящихся на позиции белка Р53, подверженные различным режимам естественного отбора.

Научная новизна. Разработан метод оценки влияния мутаций на конформационные свойства белков на основе анализа траекторий молекулярной динамики с помощью метода г-статистики. Предложенный подход является новым и ранее не применялся другими авторами. Впервые предположено возникновение нового функционального сайта связывания катиона цинка в мутантной форме белка Р53 человека, возникающей в результате аминокислотной замены С245С. Предположен новый механизм влияния данной замены на функцию соответствующей мутантной формы белка. Механизм основан на предположении, что катион цинка может смещаться из нормального положения во вновь образованный сайт, нарушая конформационные свойства белка. Впервые обнаружено выраженное действие стабилизирующего отбора против мутантных форм белка Р53 с фенотипическим эффектом приобретения функции.

Положения, выносимые на защиту.

помощью Z-статистики. Метод позволяет оценивать влияние мутаций на конформацию отдаленных участков белков.

2. Возникновение новых потенциальных сайтов связывания катиона цинка в мутантных формах белка Р53 человека обусловлено аминокислотными заменами G245C и G245D. Связывание иона цинка новыми сайтами, обеспечивает изменение конформационных различий ДНК-связывающего мотива между мутантными формами и нормальной формой белка Р53.

3. Получены свидетельства движущего отбора в эволюционной истории семейства Р53. Установлено выраженное действие стабилизирующего отбора против мутантных форм белка Р53 с фенотипическим эффектом приобретения функции.

Практическая значимость. Полученные результаты по анализу молекулярных механизмов нарушения функции мутантных форм белка Р53 могут быть использованы при создании противоопухолевых лекарственных препаратов, направленных на коррекцию возникшего сайта связывания катиона цинка. Такой подход к фармакологической коррекции генетических нарушений может быть применен и к другим заболеваниям, вызванных возникновением новых сайтов в мутантных белках.

База данных функциональных сайтов белков может использоваться при решении широкого круга задач.. функциональной аннотации белков, планировании генно-инженерных экспериментов и конструировании лекарственных препаратов.

Широкое применение также может найти предложенный в работе метод оценки влияния мутаций на конформационные свойства белков. В частности с помощью таких оценок могут планироваться эксперименты по получению белков с повышенной стабильностью, а также заранее заданной функцией.

Апробация работы. Результаты работы были представлены автором на следующих российских и международных конференциях: «BGRS'III-VI -International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure» (Новосибирск, 2002, 2004, 2006, 2008), «МССМВ'2005 - International Moscow Conference On Computational Molecular Biology» (Москва, 2005), «МНСК'2003-2006 - Международная научная студенческая конференция» (Новосибирск, 2003-2006).

Публикапии. По теме диссертации опубликованы две работы в рецензируемых зарубежных журналах и две работы в рецензируемых отечественных журналах, рекомендованных ВАК, а также две статьи в рецензируемых коллективных монографиях и девять сообщений в трудах научных конференций.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Автором непосредственно был проведен компьютерный анализ молекулярной эволюции семейств Р53, Р63, Р73, проанализировано влияние естественного отбора на мутантные формы белка с различным фенотипическим проявлением. Автором было предсказано возникновение новых функциональных сайтов связывания катиона цинка в мутантных структурах белка Р53 человека, соответствующих аминокислотным заменам G245C и G245D. Механизм влияния замены G245C на структуру белка был предложен автором совместно с В.А.

Иванисенко. Автором непосредственно было проведено исследование влияния замен G245C и G245D белка Р53 на конформацию мутантных форм методом молекулярной динамики. Методы пространственного выравнивания функциональных сайтов с пространственными структурами белков на основе генетического алгоритма, совмещения фрагментов белковых структур на основе алгоритма поиска наилучшего вращения, автоматической классификации функциональных сайтов белков разработаны автором совместно с В.А. Иванисенко.

Структура н объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела "Результаты и обсуждение", заключения, выводов, библиографического списка (164 источника). Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, включает 48 формул, 13 таблиц и 11 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Филогенетический анализ. Проводился филогенетический анализ для каждого из белковых семейств Р53, Р63, Р73 по отдельности, а также для всей группы Р53/Р63/Р73. Кодирующие нуклеотидные последовательности генов и аминокислотные последовательности белков были взяты из базы данных EMBL/Genbank, версия 81. Выравнивания аминокислотных последовательностей были проведены с помощью программы ClustalW, версия 1.7 (Thompson et al, 1994). Были построены филогенетические деревья с помощью программы PhyML, версия 2.4.4 (Guindon and Gascuel, 2003), реализующей метод максимального правдоподобия. Был проведен поиск аминокислот, подверженных движущему отбору, с помощью программы codeml из пакета PAML, версия 3.14 (Yang, 1997).

Поиск новых функциональных сайтов в мутантных формах белка Р53. Проводился поиск функциональных сайтов в мутантных формах белка Р53 с помощью веб-сервера PDBSiteScan (Ivanisenko et al, 2004), на основе сходства пространственных структур исследуемого белка и шаблона функционального сайта из базы PDBSite. Структуры мутантных форм белка Р53 были получены в результате предсказания по гомологии с помощью сервера SWISS-MODEL (Schwede et al, 2003).

Молекулярная динамика. Моделирование молекулярной динамики комплексов мутантных форм ДНК-связывающего домена белка Р53 с ионом цинка, а также тех же мутантных форм, свободных от иона, проводилось с помощью пакета Gromacs 3.3.2 с использованием явной модели воды TIP4P. Начальное положение иона цинка в структурах комплексов белок-цинк задавалось таким, каким оно было получено в результате предсказания сайта связывания цинка в данной мутантной форме.

Взаимодействие иона цинка с атомами сайта моделировалось посредством задания химических связей (т.н. bonded approach), по аналогии с работой (Hwangseo and Kenneth, 2004). Кулоновский заряд иона цинка был положен равным +0,67 Кл, согласно квантово-химическим расчетам (Hoops et al, 1991).

С использованием критерия Z-статистики был проведен статистический анализ полученных траекторий молекулярной динамики мутантных форм G245C и G245D белка Р53, по сравнению с нормальной формой белка. Анализ был проведен отдельно для комплексов мутантных форм, в которых цинк был связан аминокислотами нормального сайта и для комплексов этих же форм, в которых цинк был связан аминокислотами сайтов, возникающих в результате мутаций, а также для этих же форм белка, не связанных с ионом цинка.

•Для каждого из двух комплексов обеих мутантных форм (всего 4 структуры) и для каждой мутантной формы, свободной от иона (2 структуры) а также для нормальной формы, как свободной, так и связанной с Zn2+, проводился расчет по 12 траекторий молекулярной динамики, различающихся между собой распределениями начальных скоростей атомов (итого 8 расчетов по 12 траекторий).

Для каждой из 6-ти структур мутантных форм каждая из 12 траекторий сравнивалась со статистикой из 12 траекторий, вычисленных для нормальной формы. При этом, комплексы мутантных форм сравнивались с комплексом нормальной формы, а мутантные формы, свободные от цинка, сравнивались с нормальной формой, свободной от цинка. Для каждого С„-атома ДНК-связывающего домена каждой структуры мутантной формы белка Р53 и для каждой из 30 последних пикосекунд молекулярной динамики вычислялось значение Z-статистики координат этого атома.

Далее, полученные для каждого С„-атома значения усреднялись по 30-ти пикосекундам динамики. Поскольку такой анализ проводился для каждой из 12 траекторий структуры мутантной формы, каждое из полученных в результате усреднения значений усреднялось еще раз, по 12 траекториям. Таким образом, строился профиль значений критерия Z-статистики по аминокислотным позициям ДНК-связывающего домена белка Р53 для каждого из комплексов мутантных форм и для каждой мутантной формы, свободной от иона.

Анализ частот мутаций. Данные литературных источников по влиянию различных аминокислотных замен, соответствующих наследуемым в поколениях и возникающим de novo мутациям, на функцию белка в клетке, т.е на фенотипическое проявление мутантных аллелей гена р53, взяли из 9-й версии базы данных IARC ТР53 Database (Olivier et al, 2002). В настоящей работе рассматривались следующие фенотипические проявления мутаций: эффект сохранения, потери, приобретения функции, а также доминатно-негативный эффект. Для каждого их этих четырех эффектов, с помощью статистического метода многопольных таблиц и критерия х2 Пирсона, определялось, подвержены ли мутации с данным фенотипическим проявлением элиминированию под действием стабилизирующего отбора. Дня этого подсчитывало«, количество мутаций, отдельно для каждого из четырех типов, затрагивающих аминокислотные сайты белка Р53, которые в результате исследования эволюции Р53 были определены как подверженные стабилизирующему отбору.

Реконструкция предковых последовательностей и анализ адаптивных замен. Реконструкция предковых последовательностей белка Р53 проводилась с помощью программы ANCESCON (Cai et al, 2004). Проводилась реконструкция предковых аминокислот белка Р53, которые в результате исследования

эволюции Р53 были определены как подверженные движущему отбору, а также предковых аминокислот белка Р53 и ингибирующей его убиквитин-лигазы МОМ2, участвующих в связывании этих белков.

Для аминокислотных сайтов белков Р53 и МОМ2, в которых на некотором этапе истории видообразования позвоночных фиксировались замены аминокислот, было проведено сравнение между изменениями физико-химических свойств этих аминокислот белка Р53 и изменениями тех же физико-химических свойств аминокислот белка МБМ2 на данном этапе истории видообразования. Для каждого этапа видообразования был проведен поиск таких пар замен, что одна замена в белке Р53 изменяла физико-химические свойства аминокислоты некоторым образом, а другая замена в белке Ш)М2 изменяла те же физико-химические свойства аминокислоты в противоположную сторону. Такие замены рассматривались как потенциально компенсаторные. Особое внимание уделялось аминокислотным заменам в области контакта белков Р53 и МЛМ2 в комплексе Р53-Ж)М2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Методы, разработанные для исследования структуры функциональных сайтов белков. Разработан метод поиска функциональных сайтов в пространственных структурах белков, основанный на сравнении фрагментов пространственной структуры белка с пространственными структурами шаблонов функциональных сайтов из базы РОВБке (Гуаш^епко е/ аI, 2005). Для оптимизации поиска метод использует генетический алгоритм. Для нахождения наилучшего совмещения пространственных структур сайта и шаблона метод использует алгоритм поиска наилучшего совмещения векторов (КаЬБсЬ, 1976) и критерий среднеквадратичного отклонения координат КМББ (МсЬасЫап, 1979).

Разработан метод автоматической классификации функциональных сайтов базы РОВв^е по химической природе лиганда. Активные центры ферментов классифицировались согласно четырехзначному номеру классификации фермента, а также типу сайта (каталитический, структурный), представленному в поле описания сайта — «8ГГЕ_ОЕ8С11». Для распознавания функциональных сайтов остальных типов использовались ключевые слова из поля описания сайта. Тип функционального сайта, полученный в результате классификации, заносился в поле «81ТЕ_ТУРЕ» базы РЭВЗке. Значения этого поля используются программой РОВвке^сап (1уашяепко е1 а1, 2004) для поиска сайтов заданного типа.

Поиск функциональных сайтов в пространственной структуре белка Р53. В предсказанных структурах мутантных форм Р53, соответствующих заменам 0245С и 02450, ассоциированных с наследственным синдромом Ли-Фраумени, в результате поиска функциональных сайтов были найдены потенциальные сайты связывания иона Zn2+, включающие в себя аминокислоты, не характерные для нормального сайта связывания цинка в белке Р53, а также было предсказано положение иона Тп2' в найденных потенциальных сайтах (табл. 1).

Замена РОЕШТЕ ГО Последовательность сайта 11ШО,А

02450 Ш5МВС4 242С 2450 176С 0.97

0245С 1Е51гЫ 242С 245С 176С 0.83

норма шгнкм 176С 179Н238С 242С 0.05

Согласно проведенному предсказанию, в мутантных формах 0245С и 0245Б потенциальный сайт связывания располагается в кармане

нормального сайта связывания Zn2+. Также было предсказано смещение положения связанного иона цинка в потенциальных сайтах мутантных форм относительно нормальной формы белка (рис. 1).

На основании результатов предсказания был предположен механизм влияния функционирования найденных потенциальных сайтов на функцию белка Р53, основанный на конкуренции найденных потенциальных сайтов с нормальным сайтом за ион цинка.

Рисунок I. Относительное расположение потенциального сайта связывания Zn2*, найденного для замен й2450 (А), С245С (Б) и сайта связывания 2п2^, характерного для нормальной формы белка Р53. Зеленым показаны аминокислоты потенциальных сайтов мутантных форм. Синим показаны аминокислоты сайта связывания цинка нормальной формы Р53. Шарики показывают положение в нормальном (синий) и потенциальных (зеленый) сайтах.

Анализ конформационных различий мутантных и нормальной форм белка Р53. Сравнение сходства и различий между профилями /-статистики мутантных форм белка, не связанных с ионом цинка, со сходством и различиями между профилями комплексов мутантных форм, находящихся комплексе с ионом, позволяет сделать вывод, что замены 0245С и 02450. встречающиеся при синдроме Ли-Фраумени, в белке Р53 оказывают существенное влияние на конформацию сайта связывания ДНК.

Связывание иона цинка частично компенсирует влияние замен на конформацию некоторых структурных фрагментов мотива связывания ДНК, тогда как влияние замен на конформацию сайта связывания ДНК у мутантных форм, не связанных с ионом, достаточно выражено. Особенно стоит отметить С-

концевую а-спираль мотива «петля-лист-спираль», также называемого 1,81 [ Ооор-зИее^ЬеПх), которая находится в сходной конформации у всех четырех исследованных комплексов, но имеет различную конформацию у мутантных форм, свободных от иона.

Конформации мутантных форм 0245С и С2450, свободных от иона цинка, в наибольшей степени различаются в области мотива «петля-лист-спираль» или ЬвН, участвующего в связывании большой бороздки ДНК, и структурной петли ЬЗ, связывающей малую бороздку ДНК (рис. 2).

Петля и (3-лист мотива 1-5Н а-спираль мотива ЬБН Петля 13

Рисунок 2. Домен связывания ДНК белка Р53. Синим выделены структурные элементы сайта связывания ДНК, конформация которых затронута мутациями.

Сравнение профилей /.-статистики отклонения от нормы атомов основной цепи двух мутантных форм показывает, что обе замены влияют на конформацию сайта связывания ДНК. Тем не менее, замена 0245С, в отличие от замены (¡2450. не проявляет значимого влияния на конформацию а-спирали, связывающей ДНК. В противоположность этому, петля ЬЗ, связывающая большую бороздку ДНК, подвержена влиянию именно замены в245С (рис. 3).

■ 02450 ■в245С

□ □ и □

N 0

238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 номер аминокислоты

■62450 •С245С

133 134 135 136 137 номеР аминокислоты

4 а-спираль мотива ЦЗН

и.

ж Ж

£2 Вша Чмг^ и -«-С2450

¿0 -»02450

275 277 279 281 283 285 287 289 291 номеР аминокислоты Рисунок 3. Профили 2-статистики для аминокислот структурных элементов белка Р53, свободного от иона цинка, конформация которых изменяется в результате аминокислотных замен С245С и 02450.

Таким образом, профили статистики позволяют предположить, что в белке Р53 конформационная подвижность кармана связывания цинка оказывает аллостерическое влияние на сайт связывания ДНК.

Конформации мутантных форм 0245С и 02450, связывающих ион цинка в нормальном и потенциальном сайтах, в наибольшей степени различаются в области структурной петли Ь2, непосредственно участвующей в связывании иона цинка. Это согласуется с общим представлением, что связывание иона цинка влияет на конформацию петли Ь2 (рис. 4).

6 петля 12

-о-6245С нормальный сайт □ 6245С потенциальный сайт -Лг 62450 нормальный сайт 62450 потенциальный сайт

номер аминокислоты

-Ф-6245С нормальный сайт

□ 6245С потенциальный сайт -А- 62450 нормальный сайт

62450 потенциальный сайт номер аминокислоты

-0-6245С нормальный сайт

□ 6245С потенциальный сайт -А-62450 нормальный сайт

62450 потенциальный сайт номер аминокислоты

238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 1 _ [5-лист мотива ЦЗН

1-1

N 133

134

135

136

137

а-спираль мотива ЬБН

-«-6245С нормальный сайт □ 6245С потенциальный сайт -А-62450 нормальный сайт 62450 потенциальный сайт

275 277 279 281 283 285 287 289 291 номер аминокислоты Рисунок 4. Профили '¿-статистики для аминокислот структурных элементов белка Р53, связанного с ионом цинка, конформация которых изменяется в результате аминокислотных замен С245С и 02450.

Из профиля 2-статистики видно, что, в случае связывания иона цинка нормальным сайтом, конформация петли Ь2 подвержена влиянию обеих замен в гораздо меньшей степени, нежели в случае связывания иона потенциальными сайтами. Это позволяет сделать вывод, что связывание иона цинка потенциальными сайтами приводит к отклонению конформации домена связывания ДНК от нормы.

Согласно профилям ^статистики (рис. 4), влияние мутаций в245С и 02450 на конформацию сайта связывания ДНК в белке, связанном с ионом

цинка, заметно отличаются от влияния этих же мутаций на конформацию сайта связывания ДНК в белке, свободном от иона цинка. Интересно, что конформация петли L3 не подвержена значимому влиянию замены G245D, независимо от того, связан ион цинка нормальным или потенциальным сайтом. Напротив, замена G245C, в случае связывания иона цинка потенциальным сайтом, значимо изменяет конформацию петли L3, связывающей ДНК (по сравнению с нормальной формой белка, связанной с ионом цинка), в то время как, в случае связывания цинка нормальным сайтом, конформация петли L3 мутантной формы G245C сходна с конформацией, характерной для нормальной формы белка Р53, связанного с ионом цинка.

Также, в случае связывания иона цинка мутантными формами, а-спираль, связывающая большую бороздку ДНК, подвержена сильному влиянию обоих замен, вне зависимости от положения иона цинка (рис. 4). Тем не менее, замена G245C, в случае связывания иона цинка в нормальном сайте, оказывает наименьшее влияние на конформацию а-спирали мотива «петля-лист-спираль» белка, связанного с ионом.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что влияние замен в кармане связывания иона цинка G245C и G245D проявляется, в основном, в изменении конформации сайта связывания ДНК, необходимого для выполнения белком функции задержки пролиферации клетки. Кроме того, из полученных результатов следует, что влияние замен на сайт связывания ДНК, в случае связывания иона цинка нормальным сайтом, ниже, чем в случае связывания его потенциальными сайтами, возникающими в результате замен. Тем не менее, связывание иона цинка, как нормальным сайтом, так и потенциальными сайтами, частично компенсирует влияние замен на конформацию сайта связывания ДНК, то есть стабилизирует его.

Молекулярная эволюция белка Р53 и родственных ему белков Р63 и

Р73.

Адаптивная эволюиия семейства белков Р53. В результате применения модели движущего отбора в кодирующей последовательности гена р53 были обнаружены позиции, в которых происходили преимущественно несинонимичные замены. В белке Р53 человека этим позициям соответствуют аминокислотные остатки 6S, 35L, 38Q, 47Р, 51Е, 52Q, 59G, 65R, 73V, 106S, 129А. Всего в результате применения этой модели было обнаружено 85 консервативных аминокислот, 297 аминокислот, подверженных нейтральному режиму эволюции и 11 аминокислот, подверженных движущему отбору, что составило для человеческого белка Р53 21,63%, 25,57% и 2,8%, соответственно. Было обнаружено, что аминокислота 245G, для замен которой в белке Р53 человека было обнаружено возникновение потенциальных сайтов связывания Zn2+, высоко консервативна, также как и аминокислоты, входящие в сайт связывания иона Zn2+ у человека: 176С, 179Н, 238С, 242С.

Аминокислотные остатки 106S и 129А участвуют в образовании структурных петель в белке Р53. Петля, содержащая 106S, связывает неструктурный участок 105S — 104Q с ß-листом 110R - 112G, а петля LI, содержащая 129А, соединяет ß-листы 124С - 127S и 132К - 135С, которые входят в число 9-ти ß-листов, образующих структурный «бочонок» (ß-barrel),

который несет на себе основные структурные компоненты ДНК-связывающего домена — сайт связывания с ДНК и регулирующий его работу сайт связывания цинка. Аминокислотные замены в позициях 106 и 129, таким образом, могли влиять на пространственную структуру «бочонка» и, как следствие, на особенности работы ДНК-связывающего домена в ходе эволюции. Полученные результаты также свидетельствуют о мощном стабилизирующем отборе по аминокислоте 2450 в белке Р53. Это согласуется с ассоцированностью генеративных замен по этой позиции с развитием опухолей, в частности семейным синдромом Ли-Фраумени, а также с полученным результатом по возникновению в мутантных формах С245С и 02451) потенциальных сайтов связывания цинка.

Физико-химические свойства адаптивных замен. Проводился анализ физико-химических свойств аминокислотных замен, происходивших во время образования различных видов, в том числе замен, затрагивающих аминокислотные сайты, вообще подверженные движущему отбору в эволюционной истории белка Р53. Для нескольких аминокислотных сайтов трансактивационного домена, в которых происходили мутации на стадии происхождения амниот, характерна коадаптация с аминокислотными сайтами белка МБМ2, с которым физически взаимодействует трансактивационный домен белка Р53. Эти аминокислотные сайты относятся к участкам взаимодействия белков Р53 и М0М2, что позволяет предположить, что часть эволюционных изменений в белке Р53 может быть объяснена коадаптацией функциональных сайтов белок-белковых взаимодействий.

Адаптивная эволюция семейства белков Р63. Были получены свидетельства того, что в эволюционной истории белка Р63 происходил движущий отбор на стадии дивергенции амниот. Были найдены позиции кодирующих последовательностей, подверженные движущему отбору на данном этапе эволюционной истории белка Р63. На основании предсказания вторичной структуры белка Р63 было обнаружено, что большинство аминокислот (13 из 17-ти), подверженных движущему отбору, входят в состав неструктурных элементов белка Р63. Это может быть объяснено большей подвижностью неструктурных элементов (петель, поворотов), по сравнению со структурными элементами (спиралями, листами). Изменение конформационной подвижности этих элементов, в результате мутаций, в свою очередь, может влиять на относительное положение в пространстве соединяемых ими структурных элементов белка, не разрушая его. Такое изменение структуры белка может оказаться выгодным, и соответствующая мутация может зафиксироваться в результате движущего отбора.

Адаптивная эволюция семейства белков Р73. Было обнаружено, что эволюция белка Р73 сопровождалась движущим отбором на стадии дивергенции общего предка хищников и непарнокопытных. В последовательности белка Р73 были найдены две аминокислоты, подверженные движущему отбору. На основании предсказания вторичной структуры белка Р73 было обнаружено, что обе аминокислоты относятся к неструктурным элементам, что является дополнительным свидетельством в пользу движущего отбора по этим аминокислотам, аналогично белку Р63.

Филогенетический анализ группы семейств PS3. РбЗ и Р73 в целом. Для всей группы семейств Р53, Р63 и Р73 было построено общее филогенетическое древо (рис. 5). Из полученного филогенетического древа видно, что со времени радиации тетрапод Р63 и Р73 накапливали сравнительно немного мутаций, тогда в белке Р53 за это же время фиксировалось заметно больше мутаций.

Увеличение скорости фиксации замен в белке Р53 на стадии радиации тетрапод, обусловленной выходом позвоночных на сушу, может быть связано с усилением роли Р53 как супрессора опухолей, что было необходимо для выживания организмов в новой, богатой кислородом, а следовательно, более агрессивной, по сравнению с водной, средой обитания.

Также из рис. 5 следует более высокая скорость фиксации замен в белке Р73, по сравнению с белком Р63, на ранних стадиях эволюционной истории, что может быть объяснено специализацией белка Р73 на выполнении функций гомеостаза. Это позволяет предположить, что естественный отбор, направленный на усиление гомеостаза, был причиной обособления белка Р73.

Crlcetulus griseus рэЗ Mesocrlcetus auratus р53 Rattus norveçicus p53 "Mus rijscutus p53 Cavia corcel!us p53 Túpala cninensis J>s3 Oryctolagus cunlculus p53 »•Homo sapiens p53 I «Cercopithecus aethiops p53 ЧМасзса fascicularis p53 INacaca mulatta p53 •«ataca fuscata p53 —Spernophilus beecheyi p53 ■"•Marmota шопах p53 r-Equus asinus p53 lEquus caballus p53

Ovis arles p53 iBos inOicus p53 Ses taurus pS3 Sus scrofa p53 -»Canis famliaris p53 Fells catus p53

■c

■Gallus gallus p53 »Xenopus laevis p53

■Oncorhynchus irykiss p53

Ictalurus punctatus p53

i Danio rerio p53 ————■ Barbus barbus p53

-Tetraodon mlurus p53

Platichthys flesus p53

Oryzias latines p53 jXiphophorus saculatus p53 • XlDhouh'

Xiphophorus hellerl p53

¡■Mus nusculus p73 Rattus norveglcus p73 Cercopithecus aethiops p73 Canis ramiliarls p73 Bos taurus p73 Gallus gallus p73

Danic rerio p63 Pan troglodytes p63 Canis fanilla ris p63

-Barbus barbus p73 P73

Danio rerio p7:

|Mus nusculus p63 «Il

lp Ie

ffRattus norvégiens p63 I »Hono sapiens p63 •«48c s taurus pfi3

•-Gallus gallus p63 Xenopus laevis p63

6,66 замен на одну аминокислоту

Рисунок 5. Филогенетическое древо белков Р53, Р63 и Р73.

Частоты встречаемости наследуемых мутаций гена р53, имеющих различное фенотипическое проявление, в консервативных позициях его кодирующей последовательности. Оценивалось, против какого из фенотипических эффектов мутаций гена р53 направлен наиболее мощный стабилизирующий отбор, для чего сравнивались частоты наследуемых (генеративных) и возникающих de novo (соматических) мутаций, аннотированных в базе данных IARC (Olivier et al, 2002). Для наследуемых (генеративных) мутаций кодирующей последовательности гена р53, а также мутаций, возникающих de novo в кодирующей последовательности р53 (соматических), было подсчитано, с какой частотой те и другие мутации изменяют аминокислотные позиции белка Р53, подверженные стабилизирующему отбору, в зависимости от фенотипического проявления этих мутаций. Для статистического анализа предрасположенности мутаций с различным фенотипическим проявлением к аминокислотным позициям, подверженным стабилизирующему отбору, использовался критерий Пирсона для многопольных таблиц.

Значение критерия %2, рассчитанное для различий между заменами потери, приобретения функции и заменами с доминантно-негативным эффектом, составило 4.47 (р < 0,11, df = 2), то есть различия недостоверны.

Тем не менее, из рис. 6 видно, что различия между частотами соматическими и генеративными мутаций, приходящихся на аминокислотные позиции, подверженные стабилизирующему отбору, наиболее заметны для эффекта приобретения функции.

потери приобр. дом.-нег.

Рисунок 6. Гистограмма частот мутаций потери, приобретения функции, а также мутаций с доминантно-негативным эффектом, приходящихся на аминокислотные позиции, подверженные стабилизирующему отбору, в процентах от общего числа мутаций с данным фенотипическим эффектом.

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

В генератизные □ соматические

ВЫВОДЫ

которая включает: активные центры ферментов, сайты связывания ионов металлов, низкомолекулярных соединений, белков, РНК, ДНК, сайты посттрансляционной модификации белков.

2. Разработан новый метод анализа конформационных различий между нормальной и мутантными формами белка, основанный на методе молекулярной динамики и статистическом анализе траекторий молекулярной динамики с помощью Z-статистики. Метод позволяет оценивать влияние мутаций на конформацию отдаленных участков белков.

3. С помощью разработанных методов предсказано возникновение нового сайта связывания иона цинка в результате мутаций, вызывающих замены G245C и G245D в белке Р53, ассоциированные с синдромом Ли-Фраумени и рядом других опухолевых заболеваний. Новый сайт располагается в непосредственной близости от нормального цинк-связывающего сайта и, предположительно, может конкурировать с ним за связывание иона цинка — аллостерического регулятора связывания ДНК белком Р53.

4. Показано, что наибольшее влияние замены G245C и G245D оказывают на конформацию удаленных участков белка, расположенных в ядре домена связывания ДНК. Эти данные указывают на то, что механизм действия мутаций G245C и G245D реализуется через изменение конформационных свойств ДНК-связывающего домена белка Р53. Показано, что связывание иона цинка с новым сайтом обеспечивает уменьшение конформационных различий ДНК-связывающего мотива в мутантной и нормальной форме белка Р53, что служит дополнительным свидетельством функциональности нового сайта.

5. Впервые обнаружено, что в белке Р53 движущему отбору подвергались позиции, соответствующие аминокислотным остаткам S106 и А129, важным для функциональных перестроек конформации при взаимодействии белка Р53 с ДНК.

6. В результате сравнительного анализа частот различных аминокислотных замен, приходящихся на кодоны с различными режимами отбора, установлено, что наиболее жесткий стабилизирующий отбор направлен против мутаций с эффектом приобретения функции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ ИЗДАНИЯХ:

1. Ivanisenko V.A., Pintus S.S., Grigorovich D.A., Kolchanov N.A. PDBSiteScan: a program for search of the active, binding and posttranslational modification sites in the 3D structures of proteins // Nucleic Acids Research. 2004. V.32. P.W549-W554. (Перечень ВАК)

2. Ivanisenko V.A., Pintus S.S., Grigorovich D.A., Kolchanov N.A. PDBSite: a database of the 3D structure of protein functional sites // Nucleic Acids Research. 2005. V.33. P.D1-D5. (Перечень ВАК)

3. Пинтус С.С., Фомин Э.С., Иванисенко В.А., Колчанов Н.А. Филогенетический анализ семейства р53 // Биофизика. 2006. Т.51. С.640-649. (Перечень ВАК)

4. Pintus S.S., Fomin E.S., Oshurkov I., Ivanisenko V.A. Phylogenetic analysis of the p53 and p63/p73 gene families // In Silico Biology. 2007. V.7 P.319-332.

5. Пинтус C.C. Коэволюция доменов ключевых белков апоптоза р53 и mdm2 // Информационный вестник ВОГиС. 2009. Т.13. №1 С.128-136. (Перечень ВАК)

6. Ivanisenko V.A., Debelov V.A., Pintus S.S., Matsokin A.M., Nikolaev S.V., Grigorovich D.A., Kolchanov N.A. PDBSitescan: a tool for search for the best-matching superposition in the database PDBSite. Proceedings of the third international conference on bioinformatics of genome regulation and structure. V.3. Novosibirsk: IC&G. 2002. p.150.

7. Pintus S.S., Ivanisenko V.A. A molecular mechanism for the structure-functional alterations in mutant forms of human p53 protein. Proceedings of the fourth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure. V.l.Novosibirsk: IC&G. 2004. p.338

8. Ivanisenko V.A., Pintus S.S., Krestyanova M.A., Demenkov P.S., Znobisheva E.K.,Ivanov E.E., Grigorovich D.A. PDBSite, PDBLigand and PDBSiteScan: a computational workbench for the recognition of the structural and functional determinants in protein tertiary structures combined with protein draft docking. Proceedings of the fourth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure.V.l. Novosibirsk: IC&G. 2004. p.269.

9. Pintus S.S., Ivanisenko V.A. Phylogenetic analysis of the p53 and p63/p73 gene families. Proceedings of the fifth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure.V.l. Novosibirsk: IC&G. 2006. p.207.

10. Pintus S.S., Ivanisenko V.A. Coevolution of protein domains of p53 and mdm2 - key proteins of apoptosis. Proceedings of the sixth international conference on bioinformatics of genome regulation and structure. Novosibirsk: IC&G. 2008. p. 188.

Благодарности: Автор выражает благодарность сотрудникам отдела системной биологии ИЦиГ СО РАН и лично научному руководителю В.А. Иванисенко, а также Н.А. Колчанову, Н.Л. Подколодному, К.В. Гунбину, В.В. Суслову, С.В. Николаеву, Э.С. Фомину и И.И. Титову за плодотворные дискуссии и сотрудничество; H.JI. Подколодному за всестороннюю помощь в предоставлении доступа к вычислительным мощностям СО РАН и НГУ; Д.А. Афонникову, А.В. Катохину, А.В. Кочетову, С.И. Бажану и И.В. Макунину за ценные критические замечания; А.Н. Фадеевой за профессиональный перевод на английский язык текстов статей, опубликованных по теме диссертации; Л.П. Кондриной, Л.В. Шумной и Т.М. Хлебодаровой за помощь в подготовке документов.

Подписано к печати 04.08.2010 г.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. 1. Уч. изд 0,7

Тираж 110 экз. Заказ 69.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пинтус, Сергей Сергеевич

Оглавление.

Перечень условных обозначений.

Введение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Компьютерный анализ структуры и эволюции функциональных сайтов белка P53"

Цель и задачи исследования.8

Научная новизна работы.9

Практическая значимость работы.9

Положения, выносимые на защиту.10

Апробация работы и публикации.10

Структура и объем диссертации.11

Вклад автора.11

1. Обзор литературы.13

1.1. Белок Р53 и родственные ему белки Р63 и Р73.13

1.1.1. Участие Р53 в клеточных функциях.13

1.1.2. Первичная, вторичная, третичная структура Р53.18

1.1.3. Мутации гена Р53.20

1.1.4. Классификация мутаций гена Р53.21

1.1.5. Белки Р63, Р73, их структура, функции, эволюция и происхождение Р53.23

1.1.6. Заключение к обзору литературы по белку Р53 и родственным ему белкам Р63 и Р73.25

1.2. Методы поиска функциональных сайтов в белках.27

1.2.1. Методы, основанные на сходстве фрагментов структур белков.30

1.2.2. Методы, основанные на обучении.37

1.2.3. Методы, основанные на особенностях функциональных сайтов.40

1.2.4. База данных по функциональным сайтам белков PDBSite.42

1.3. Методы реконструкции филогенетических деревьев.44

1.3.1. Метод максимального правдоподобия для построения филогенетических деревьев.50

1.3.2. Метод байесовской статистики.56

1.3.3. Программные пакеты для реконструкции филогенетических деревьев.'.58

1.3.4. Метод исследования режимов отбора в эволюционной истории и среди позиций кодирующих последовательностей генов.60

1.4. Заключение по обзору литературы.62

2. Материалы и методы.66 1

2.1. Филогенетический анализ.66

2.1.1. Получение последовательностей.66

2.1.2. Выравнивания последовательностей.69

2.1.3. Построение филогенетических деревьев.70

2.1.4. Поиск аминокислот, подверженных движущему отбору.71

2.1.5. Предсказание вторичной и третичной структуры белков

Р63 и Р73.73

2.1.6. Реконструкция предковых последовательностей и анализ адаптивных замен.75

2.2. Поиск новых функциональных сайтов в мутантных формах белка Р53.75

2.3. Молекулярная динамика.77

2.4. Анализ частот мутаций.81

2.5. Реконструкция предковых последовательностей и анализ адаптивных замен.82

3. Результаты и обсуждение.83

3.1. Методы, разработанные для исследования структуры функциональных сайтов белков.83

3.1.1. Пространственное выравнивание сайтов с белками.83

3.1.2. Классификация функциональных сайтов в базе PDBSite.88

3.1.3. Заключение.90

3.2. Поиск функциональных сайтов в пространственной структуре белка Р53.91

3.2.1. Заключение.97

3.3. Анализ конформационных различий мутантных и нормальной форм белка Р53.98

3.3.1. Динамика комплексов мутантных форм белка с ионом Zn2+.99

3.3.2. Динамика мутантных форм белка, не связанных с ионом Zn2+.106

3.4. Молекулярная эволюция белка Р53 и родственных ему белков Р63 и Р73.110

3.4.1. Адаптивная эволюция семейства белков Р53.111

3.4.2. Физико-химические свойства адаптивных замен.ИЗ

3.4.3. Адаптивная эволюция семейства белков Р63.117

3.4.4. Адаптивная эволюция семейства белков Р73.120

3.4.5. Филогенетический анализ группы семейств Р53, Р63 и Р73 в целом.123

3.4.6. Заключение.127

3.5. Предрасположенность наследуемых мутаций гена р53, имеющих различное фенотипическое проявление, к консервативным позициям его кодирующей последовательности.127

Заключение.133

Выводы.136

Библиографический список.138

Перечень условных обозначений

DBD — домен связывания ДНК

LSH — loop-sheet-helix, белковый мотив «петля-лист-спираль»

SAM — sterile alpha motif, а-спиральный мотив белков

TAD — transcription activation domain, домен активации транскрипции

TAD — домен транскрипционной активности

ППД — пиримидин-пиримидоновые димеры

ТЭРН — эксцизионная репарация нуклеотидов, сопряженная с транскрипцией

ЦПД — циклобутан-пиримидиновые димеры ЭРЫ — эксцизионная репарация нуклеотидов ЭРО — эксцизионная репарация основании

Введение

Актуальность работы

Основной функцией белка Р53, являются предотвращение деления клеток, имеющих повреждения в своей ДНК, и участие в формировании органов у эмбрионов большинства позвоночных животных. В случае повреждения клеточной ДНК, белок Р53 вызывает либо задержку клеточного цикла в одной из контрольных точек, либо вызывает апоптоз данной * клетки. При этом белок может выступать как в качестве фактора транскрипции, так и активировать продукты других генов напрямую. Как правило, для задержки клеточного цикла необходима транскрипционная активность гена р53, тогда как апоптоз может проходить и посредством белок-белковых взаимодействий (Levine, 1997). Противоопухолевые функции Р53 включают также его непосредственное участие в прямой и эксцизионной репарации ДНК. (Donehower, 1997). Белок Р53 также играет важную роль и в эмбриональном развитии у позвоночных, регулируя пролиферацию и апоптоз клеток (Prochazkovaet al, 2004). Таким образом, исследование структуры, функции и эволюции Р53 является актуальным и представляет как чисто теоретический, так и прикладной интерес.

Белку Р53 родственны белки Р63 и Р73. Белки Р63 и Р73 способны вызывать остановку клеточного цикла и апоптоз, но имеют большее значение в эмбриогенезе, чем Р53. Оба гена имеют множество функциональных продуктов альтернативного сплайсинга, в отличие от Р53 (William et al, 1999). Организация функциональных доменов белков Р53, Р63, Р73 эволюционно консервативна, за исключением того, что Р63 и Р73 отличаются наличием^ С-концевого домена, обозначаемого как SAM (sterile alpha motif).

У млекопитающих обнаружены гены всех трех семейств: р53,рб3,р73. У костистых рыб найдены только гены р53 и р73, а у земноводных и птиц — ранее были обнаружен только лишь р53. На этом основании, ранее было предположено, что ген р53 произошел от предка, общего с предком генов рбЗ и р73 и, впоследствии, потерял SAM-домен. (Saccone et al, 2002). При этом» его функции* претерпели значительную специализацию, что в работе (Yang et al, 2002) было предположительно связано с отбором, направленным на уменьшение риска образования опухолей, который повышен у позвоночных, в связи с тем; что у них повышена скорость регенерации тканей. Итак, для^ полного понимания всех аспектов функционирования белка Р53 в клетке необходимо детальное изучение родственных ему белков Р63 и R73.

Функциональные характеристики сайта, в белке непосредственно зависят от символьной» последовательности входящих в него аминокислот и от стереометрии образующих его атомов белковой макромолекулы. Также свойства функционального сайта зависят от свойств его непосредственного-окружения, при этом последние также могут быть, определены через аминокислотную последовательность и пространственную структуру. В*' настоящее время в области биоинформатики разработаны мощные методы компьютерного анализа, позволяющие исследовать взаимосвязи, функции- и эволюции белка с его5 первичной, вторичной и третичной структурой

С другой стороны, изучение взаимосвязи структуры и функции белка требует анализа большого количества аминокислотных последовательностей* и пространственных структур его мутантных форм. В настоящее время накоплено довольно много экспериментальных данных по первичной последовательности, структуре и функции белка Р53 не только у человека, но и у других видов, представленных в электронных, базах данных. Такие базы предполагают использование компьютера для обработки содержащейся в них информации. Таким образом, представляется актуальным установление взаимосвязей между структурой, функцией и эволюцией белка Р53 с привлечением методов компьютерного анализа.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования было выявление закономерностей структурно-функциональной организации белка Р53 на основе анализа пространственных структур мутантных форм белка и определения режимов его эволюции.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода предсказания функциональных сайтов белков на основе структурного выравнивания шаблонов сайтов из базы данных пространственных структур функциональных сайтов белков PDBSite с пространственными структурами анализируемых белков.

3. Анализ влияния мутаций на структурно-функциональную организацию белка Р53 с помощью моделирования пространственных структур его1 мутантных форм и разработанных методов предсказания функциональных сайтов, а также определения участков белка, подверженных статистически значимым конформационным изменениям в результате мутаций.

4. Изучение влияния естественного отбора на эволюционную историю и структуру белка Р53: поиск этапов движущего отбора в эволюционной истории белков Р53, Р63, Р73, определение позиций в кодирующих последовательностях соответствующих генов, замены в которых давали кодируемым белкам селективное преимущество.

5. Сравнительный анализ частот аминокислотных замен, приходящихся на позиции гена/>55, подверженных различным режимам естественного отбора.

Научная новизна работы

Разработан метод оценки влияния мутаций на конформационные свойства белков на основе анализа траекторий молекулярной динамики с помощью метода Z-статистики. Предложенный подход является новым и ранее не применялся другими авторами. Впервые показано возникновение нового функционального сайта связывания катиона цинка в мутантной форме белка Р53 человека, возникающей в результате аминокислотной замены G245C. Предположен новый механизм влияния данной замены на функцию соответствующей мутантной формы; белка. Механизм основан на предположении, что катион цинка может смещаться из нормального положения во вновь; образованный сайт, нарушая конформационные свойства белка. Впервые обнаружено выраженное действие стабилизирующего отбора против мутантных форм белка Р53 с фенотипическим эффектом приобретения функции

Практическая значимость работы

Полученные результаты по анализу молекулярных механизмов нарушения • функции мутантных форм белка Р53 могут быть использованы при создании противоопухолевых лекарственных препаратов, направленных на коррекцию вновь созданного сайта связывания катиона цинка. Такой подход к фармакологической коррекции генетических нарушений может быть применен и к другим; заболеваниям, вызванных возникновением новых сайтов в мутантных белках.

База данных функциональных сайтов белков может быть использоваться при решении широкого круга задач функциональной аннотации белков-планировании генно-инженерных экспериментов и конструировании лекарственных препаратов.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан метод анализа конформационных различий между мутантными и нормальной формой белка, основанный на методе молекулярной динамики и статистическом анализе траекторий молекулярной динамики с помощью Z-статистики. Метод позволяет оценивать влияние мутаций на, конформацию отдаленных участков белков.

2. Возникновение нового потенциального сайта связывания катиона цинка в мутантной форме белка Р53 человека обусловлено аминокислотной замене G245C. Связывание иона цинка новым сайтом,. обеспечивает уменьшение конформационных различий ДНК-связывающего мотива в мутантной и нормальной форме белка Р53

3. Получены свидетельства этапов движущего отбора в эволюционной истории семейства Р53. Установлено выраженное действие стабилизирующего отбора против мутантных форм белка Р53 с фенотипическим эффектом приобретения функции.

Апробация работы и публикации

По материалам диссертации, опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах, 2 статьи в монографиях, а также 9 сообщений в трудах научных конференций.

Результаты работы были представлены автором, на следующих российских и международных конференциях: «BGRS'III-VI - International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure» (Новосибирск, 2002, 2004, 2006, 2008), «МССМВ'2005 - International Moscow Conference On Computational Molecular Biology» (Москва, 2005), «МНСК'2003-2006

Международная Научная Студенческая Конференция» (Новосибирск, 20032006).

По материалам диссертации опубликованы следующие статьи в рецензируемых журналах:

2. Ivanisenko V.A., Pintus S.S., Grigorovich D.A., Kolchanov N.A. PDBSite: a database of the 3D structure of protein functional sites // Nucleic Acids Research. 2005. V.33. P.D1-D5.

3. Пинтус C.C., Фомин Э.С., Иванисенко B.A., Колчанов Н.А. Филогенетический анализ семейства Р53 // Биофизика. 2006. Т.51. С.640-649.

4. Pintus SS, Fomin ES, Oshurkov I, Ivanisenko VA. Phylogenetic analysis of the P53 and p63/p73 gene families. In Silico Biology. 2007 7(3):319-332

5. Пинтус C.C. Коэволюция доменов ключевых белков апоптозаР53 и mdm2 // Информационный вестник ВОГиС. 2009. Т.13. №1 С.128-136.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела "Результаты и обсуждение", заключения, выводов, библиографического списка (164 источника). Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, включает 48 формул, 13 таблиц и 11 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Математическая биология, биоинформатика", Пинтус, Сергей Сергеевич

Выводы

1. Разработаны новые методы поиска и автоматической классификации функциональных сайтов в третичных структурах белков на основе генетического алгоритма и структурного выравнивания сайтов из базы данных PDBSite. Проведена классификация сайтов в базе данных PDBSite, включая активные центры ферментов, сайты связывания ионов металлов, низкомолекулярных соединений, белков, РНК, ДНК, сайты посттрансляционной модификации белков.

Показано, что связывание иона цинка с новым сайтом обеспечивает уменьшение конформационных различий ДНК-связывающего мотива в мутантной и нормальной форме белка Р53, что служит дополнительным свидетельством функциональности нового сайта.

Заключение

Белки Р53, Р63 и Р73 образуют одно семейство и произошли от общего предка. Наиболее узкоспециализированным является белок Р53, который разделяет функции активации транскрипции и активации апоптоза от своих предков, но потерял способность к самоингибированию,. лишившись С-концевого SAM-домена. Свой набор функций, сформировавшийся в ходе эволюции, белок Р53 использует для защиты целостности генома клетки, препятствуя передаче повреждений ДНК по наследству и способствуя уничтожению бесконтрольно делящихся клеток.

Некоторые районы белков Р53, Р63 и Р73 высоко консервативны. Как правило, это районы, отвечающие за выполнение этими белками характерных для них молекулярных функций. В частности, к ним относятся функциональные сайты: связывания промоторной ДНК и олигомеризации при активации транскрипции, белок-белковых взаимодействий при передаче сигнала в клетке, посттрансляционной модификации при регулировании активности и времени жизни белка. Тем не менее, для всех трех белков характерно наличие аминокислотных позиций, подвергавшихся преимущественно движущему отбору в эволюционной истории. Довольно значительные участки белков семейства не подвержены направленной эволюции и являются.нейтральными, в соответствии с теорией М. Кимуры о нейтральной эволюции.

Установленная связь между режимами естественного отбора и конкретными аминокислотными остатками Р53 позволяет установить эволюционную, а, следовательно, и функциональную значимость различных молекулярных эффектов мутаций гена Р53. Наиболее серьезные из них касаются сети взаимодействий Р53 с другими генами. При этом стоит учесть, что, как было сказано выше, белок Р53 утерял способность к саморегуляции, а значит, большую важность для гомеостаза положения клетки в окружающей ее ткани приобрели взаимодействия между несколькими генами. Добавление новых генов-мишеней к соответствующей сети может приводить даже к более серьезным изменениям, нежели потеря некоторых регуляторных событий. Следовательно, можно предположить, что гены-мишени Р53 эволюционируют в режиме коадаптации, причем отбор скорее вызывает изменения структуры промоторных районов, нежели белковых продуктов этих генов. Примером таких эволюционных изменений служит недавнее обнаружение свидетельств того что промотор гена pig3, приобрел свойство мишени белка Р53 только у приматов (Contente et al, 2003).

Предполагаемое возникновение нового сайта связывания иона Zn2+ в белке Р53 в результате замен G245C и G245D приводит к эволюционно значимому доминантно негативному эффекту, при котором белок теряет часть своих генов-мишеней. Отбор против такого эффекта выражен довольно сильно. Полная потеря способности белка к связыванию цинка приводит лишь к менее значимому эффекту потери функции белка, отбор против которого слабее (в случае гомозиготы по мутации, так как в гетерозиготе может возникать доминантно-негативный эффект.). Это явление может служить примером того, как возникновение, а не потеря молекулярной функции влияет на эволюционную судьбу соответствующих мутаций.

Полученные результаты применения разработанного метода оценки конформационных различий мутантных и нормальной форм белка показали, что замены в области сайта связывания иона цинка G245C и G245D сходным образом изменяют конформацию структурного ядра глобулы домена связывания ДНК белка Р53 человека, причем наиболее существенными являются изменения конформации структурных петель, соединяющих р-листы структурного бочонка, образующего это ядро. Тем не менее, замены различаются по влиянию на конформацию С-концевой а-спирали мотива петля-лист-спираль (LSH), связывающейся с ДНК, если белок Р53 не связан с ионом цинка. Интересно, что согласно полученным результатам, связывание Zn2+, с одной стороны, не влияет на конформацию ядра глобулы домена связывания ДНК белка Р53, а с другой стороны, частично компенсирует влияние замен в сайте связывания на конформацию структурных элементов мотива связывания ДНК, особенно С-концевой а-спирали мотива петля-лист-спираль.

Можно заключить, что связывание иона цинка потенциальным сайтом, найденным в мутантной форме G245C белка Р53, так же компенсирует влияние данной замены на конформацию а-спирали мотива транскрипционного фактора, связывающейся с ДНК, как и связывание иона цинка нормальным сайтом той же мутантной формы, что предполагает работоспособность этого потенциального сайта.

Разработанный метод оценки конформационных различий может быть применен для исследования функции мутантных форм белков, а также для проектирования белков с заранее заданными свойствами.

Таким образом, белок Р53 служит хорошим примером тесной связи между эволюцией гена и структурой, а также, функцией кодируемого им белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пинтус, Сергей Сергеевич, Новосибирск

1. Adimoolam S., Ford J.M. p53 and regulation of DNA damage recognitionduring nucleotide excision repair // DNA Repair (Amst). 2003. - Vol. 2. - P. 947-954.

2. Ahuja R.K, Magnanti T.L., Orlin J.B. Network Flows: Theory, Algorithms and Applications. Prentice Hall, 1992.

3. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. - Vol. 25. - P. 33893402.

4. Amariglio F., Tchang F., Prioleau M.N., Soussi Т., Cibert C., Mechali M.A. Functional analysis of p53 during early development of Xenopus laevis // Oncogene. 1997. - Vol. 15. - P. 2191-2199.

5. Aurelio O.N., Kong X.T., Gupta S., Stanbridge E.J. P53 mutants have selectivedominant-negative effects on apoptosis but not growth arrest in human cancer cell lines // Mol Cell Bioh 2000. - Vol. 20. - P. 770-778.

6. Babenko V.N., Basu M.K., Kondrashov F.A., Rogozin I.B., Koonin E.V. Signsof positive selection of somatic mutations in human cancers detected by EST sequence analysis. BMC Cancer. 2006. - Vol. 6. - P. 36.

7. Barrow H.G., Burstall R.M. Subgraph isomorphism, matching relationalstructures and maximal cliques // Inf. Process. Lett. 1976. - Vol. 4. - P. 83-84.

8. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L.

9. GenBank //Nucleic Acids Res. 2006. - Vol. 34. - P. D16-D20.

10. Bertram HM, Westbrook J, Feng Z, Gilliland G, Bhat T.N., Weissig H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. The Protein Data Bank // Nucleic Acids Res. -2000. Vol. 28. - P. 235-242.

11. Beroud C., Soussi T. p53 gene mutation: software and database // Nucleic Acids Res. 1998 . - Vol. 26. - P. 200-204.

12. Bian J., Sun Y. p53CP, a putative p53 competing protein that specifically binds to the consensus p53 DNA binding sites: a third member of the p53 family? // Proc Natl Acad Sci USA.- 1997. Vol. 94. - P. 14753-14758.

13. Blagosklonny M.V. p53 from complexity to simplicity: mutant p53 stabilization, gain-of-function, and dominant-negative effect. // FASEB J. -2000. Vol. 14. - P. 1901-1907.

14. Blandino G., Levine A .J., Oren M. Mutant p53 gain of function: differential effects of different p53 mutants on resistance of cultured cells to chemotherapy // Oncogene. 1999. - Vol. 18. - P. 477-485.

15. Bradford J.R., Westhead D.R. Improved prediction of protein-protein binding sites using a support vector machines approach // Bioinformatics. 2005. - Vol. 21.-P. 1487-1494.

16. Bush R.M., Fitch W.M., Bender C.A., Cox NJ. Positive selection on the H3 hemagglutinin gene of human influenza virus A// Mol Biol Evol. 1999. - Vol. 16. - 1457-1465.

17. Cai W., Pei J., Grishin N.V. Reconstruction of ancestral protein sequences and its applications // BMC Evol Biol. 2004. - P. Vol. 4.-33.

18. Casari G., Sander C., Valencia A. A method to predict functional residues in proteins //Nat Struct Biol. 1995. - Vol. 2. - P. 171-178.

19. Cavalli-Sforza L.L., Edwards A.W. Phylogenetic analysis. Models and estimation procedures //Am J Hum Genet. 1967. - Vol. 19. - 233-257.

20. Chan T.A., Hermeking H., Lengauer C., Kinzler K.W., Vogelstein B. 14-33 Sigma is required to prevent mitotic catastrophe after DNA daniage // Nature. 1999. - Vol. 401. - P. 616-620.

21. Chang D.T., Oyang YJ., Lin J.H. MEDock: a web server for efficient prediction of ligand binding sites based on a novel optimization algorithm // Nucleic Acids Res. 2005. - Vol. 33. - P. W233-W238.

22. Chavez-Reyes A., Parant J.M., Amelse L.L., de Oca Luna R.M., Korsmeyer S.J., Lozano G. Switching mechanisms of cell death in mdm2- and mdm4-null mice by deletion of p53 downstream targets // Cancer Res. 2003. - Vol. 63. -P. 8664-8669.

23. Chene P., Bechter E. Cellular characterisation of p53 mutants with a single missense mutation in the beta-strand 326-333 and correlation of their cellular activities with in vitro properties // J Mol Biol. 1999. - Vol. 288. - 891-897.

24. Chevenand F., Brun C., Banuls A.L., Jacq В., Christen R. TreeDyn: towards dynamic graphics and annotations for analyses of trees // BMC Bioinformatics. -2006.-Vol. 7.-P. 439.

25. Cho Y., Gorina S., Jeffrey P.D., Pavletich N.P. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations // Science. -1994. Vol. 265. -P. 346-355.

26. Comband C., Blanchand C., Geourjon C., Deleage G. NPS@: network protein sequence analysis // Trends Biochem Sci. 2000. - Vol. 25. - P. 147-150.

27. Dameron K.M., Volpert O.V., Tainsky M.A., Bouck N. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation ofthrombospondin-1 // Science. -1994. Vol. 265. - R 1582-1584.

28. Dayhoff M.O., R.M., Schwartz, B.C. Orcutt. A model of evolutionary change in proteins. //M.O. Dayhoff. Atlas of Protein Sequence and Structure. -Washington DC, 1978. Vol. 5. - Suppl. 3. - P. 345-352.

29. Derbyshire D.J., Basu B.P., Serpell L.C., Joo W.S., Date Т., Iwabuchi K., Doherty AJ. Crystal structure of human 53BP1 BRCT domains bound to p53 tumour suppressor // EMBO J. 2002. - Vol. 21. - P. 3863-3872.

30. Donehower L.A. Genetic instability in animal tumorigenesis models. Cancer Surv. 1997. - Vol. 29. - P. 329-352.

31. D'Sa-Eipper C., Leonard J.R., Putcha G., Zheng T.S., Flavell R.A., Rakic P., Kuida K., Roth K.A. DNA, damage-induced neural precursor cell apoptosis requires p53 and caspase 9 but neither Bax nor caspase 3 // Development. -2001.-Vol. 128.-P. 137-146.

32. Felsenstein J. Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach // J Mol Evol. 1981. - Vol. 17. - P. 368-376.

33. Firestein G.S., Echeverri F., Yeo M., Zvaifler N.J., Green D.R. Somatic mutations in the p53 tumor suppressor gene in rheumatoid arthritis synovium // Proc Natl Acad Sci USA.- 1997. Vol. 94. - P. 10895-10900.

34. Fiser A., Sali A. Modeller: generation and refinement of homology-based protein structure models // Methods Enzymol. 2003. - Vol. 374. - P. - 461491.

35. Fitch W.M., Bush R.M., Bender C.A., Cox N.J. Long term trends in the evolution of H(3) HA1 human influenza type A // Proc Natl Acad Sci U S A. -1997. Vol. 94. - P. 7712-7718.

36. Fitch W.M., Markowitz E. An improved method for, determining codon variability in a gene and its application to the rate of fixation of mutations in evolution // Biochem Genet. 1970. - Vol. 4. - P. 579-593.

37. Ford J.M. Regulation of DNA damage recognition and nucleotide excision repair: another role for p53 // Mutat Res. 2005. - Vol. 577. - P. 195-202.

38. Gaiddon C., Lokshin M., Ahn J., Zhang Т., Prives C. A subset of tumor-derived mutant forms of p53 down-regulate p63 and p73 through a direct interaction with the p53 core domain. Mol Cell Biol. - 200. - Vol. 21. - P. 1874-1887.

39. Glazko G.V., Koonin E.V., Rogozin I.B. Mutation hotspots in the p53 gene in tumors of different origin: correlation with evolutionary conservation and signs of positive selection // Biochim Biophys Acta. 2004. - Vol. 1679. - P. 95-106.

40. Goldman N., Yang Z.A. A codon-based model of nucleotide substitution for protein-coding DNA sequences // Mol Biol Evol. 1994. - Vol. 11. - P. 725736.

41. Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., Harris C.C. Mutations in,the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis // Cancer Res. 1994. - Vol. 54. - P. 4855-4878.

42. Gualberto A., Aldape K., Kozakiewicz K., Tlsty T.D. An oncogenic form of p53 confers a dominant, gain-of-function phenotype that disrupts spindle checkpoint control // Proc Natl Acad Sci USA.- 1998. Vol. 95. - P. 51665171.

43. Guillot J1P, Gonnand J.F., Clement C., Faccini J.M. Comparative study of methods chosen by the Association Francaise de Normalisation (AFNOR) forevaluating sensitizing potential intthe albino,guinea-pig // FoodGhemToxicol. 1983;-Vol. 21.-P. 795-805.

44. Guindon S., Gascuel O; A simple, fast, and . accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood // Syst Biol. 2003. - Vol. 52. - P.: 696-704.

45. GuiridoniS;, EethiecrF:, Duroux P., GascueKOlPHYlVffi Online^ a web server for' fast maximum likelihood-basedVpKylogenetic inference // Nucleic Acids, Res:,- 2005: Voli 33; - P W557-W5591

46. Но1гшЕ., Sander, G. New,structure—novel?fold?:// Structure: 1997Г - V61I.5L -P. 165-171.57! HolimE., , Sander* G. Protein structure comparison by alignment of distance: matrices // J'MoliBioU.- 1993; Vol: 233. - P. 123-38;

47. Holmquist R. Theoretical? foundations for a quantitative approach to paleogenetics. Part I: DNA// JMolEvol.- 1971. Vol. 1. - P. 115-133.

48. Holmquist R. Theoretical foundations for a quantitative approach to paleogenetics. Part II: proteins // J Mol Evol. -1971. Vol. 1. -Р/134-149.

49. Hsu H.W., Su H.Y., Huang P.H., Lee B.L., Liu H.J. Sequence and phylogenetic analysis of P10- and P17-encoding genes of avian reovirus //Avian Dis. 2005. - Vol. 49. - P. 36-42.

50. Hu W., Feng Z., Atwal G.S., Levine A.J. p53: a new player in reproduction // Cell Cycle. 2008. - Vol. 7. - P. 848-852.

51. Huelsenbeck J.P., Ronquist F. MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees // Bioinformatics. 2001. - Vol. 17. - P. 754-755.

52. Hurst L.D. The Ka/Ks ratio: diagnosing the form of sequence evolution // Trends Genet. 2002. - Vol. 18. - P. 486.

53. Ivanisenko V.A., Pintus S.S., Grigorovich D.A., Kolchanov N.A. PDBSite: a database of the 3D structure of protein functional sites // Nucleic Acids Res. -2005. Vol. 33. - P. D183-D 187.

54. Iwanaga Y., Jeang K.T. Expression of mitotic spindle checkpoint protein hsMADl correlates with cellular proliferation and is activated by a gain-of-function p53 mutant // Cancer Res. 2002. - Vol. 62. - P. 2618-2624.

55. Jambon M., Andrieu O., Comband C., Deleage G., Delfaud F., Geourjon C. The SuMo server: 3D search for protein functional sites // Bioinformatics. -2005. Vol. 21. - P. 3929-3930.

56. Jambon M., Imberty A., Deleage G., Geourjon C. A new bioinformatic approach to detect common 3D sites in protein structures. Proteins // 2003. -Vol. 52. P. 137-145.

57. Joerger A.C., Ang H.C., Veprintsev D.B, Blair C.M., Fersht A.R. Structures of p53 cancer mutants and mechanism of rescue by second-site suppressor mutations // J Biol Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 16030-16037.

58. Jorgensen W.L., Chandrasekhar J., Madura J.D., Impey R.W., Klein M.L. Comparison of simple potential functions for simulating liquid water // J Chem Phys. 1983. - Vol. 79. - P. 926-935.

59. Jorgensen W.L., Tirado-Rives J. The OPLS potential functions for proteins: energy minimizations for crystals of cyclic peptides and crambin // J Am Chem Soc. 1988. - Vol. 110. - P. 1657-1666.

60. Jukes Т.Н., Cantor C.R. Evolution of protein molecules // H.N. Munro. Mammalian Protein Metabolism. New York, 1969. - Vol. 3. - P. 21-132.

61. Jurisicova A., Latham K.E., Casper R.F., Casper R.F., Varmuza S.L. Expression and regulation of genes associated with cell death during murine preimplantation embryo development // Mol Reprod Dev. 1998. - Vol. 51. -243-253.

62. Kabsch W., Sander C. Dictionary of protein secondary structure: pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features // Biopolymers. -1983. Vol. 22. - P. 2577-2637.

63. Kaelin W.G. The p53 gene family // Oncogene. 1999. - Vol. 18. - P. 77017705.

64. Kalinina O.V., Rassel R.B., Rakhmaninova AB, Gel'fand MS. Computational method for prediction of protein functional sites using specificity determinants // Mol Biol (Mosk). 2007. - Vol. 41. - P. 151-162.

65. Karon J.M. The covarion model for the evolution of proteins: parameter estimates and comparison with Holmquist, Cantor, and Jukes' stochastic model. J Mol Evol. 1979. - Vol. 12. - P. 197-218.

66. Kashyap R.L., Subas S. Statistical estimation of parameters in a phylogenetic tree using a dynamic model of the substitutional process // J Theor Biol. -1974.-Vol. 47.-P. 75-101.

67. Kastan M.B., Onyekwere O., Sidransky D., Vogelstein В., Craig R.W. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage // Cancer Res. 1991.-Vol. 51.-P. 6304-6311.

68. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // J Mol Evol.- 1980.-Vol. 16.-P. 111-120.

69. Kimura M. The Neutral Theory of Molecular Evolution: Cambridge, 1983.

70. Kinoshita K., Murakami Y., Nakamura H. eF-seek: prediction of the functional sites of proteins by searching for similar electrostatic potential and molecular surface shape // Nucleic Acids Res. 2007. - Vol. 35. - P. W398-W402.

71. Kinoshita K., Nakamura H. eF-site and PDBjViewer: database and viewer for protein functional sites //Bioinformatics. 2004. - Vol. 20. - P. 1329-1330.

72. Kinoshita K., FuruiJ., Nakamura H. Identification of protein functions from a molecular surface database, eF-site // J Struct Funct Genomics. 2002. - Vol. 2. - P. 9-22.

73. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Brief Bioinform. 2004.-Vol. 5.-P. 150-163.

74. Laskowski R.A., Hutchinson E.G., Michie A.D., Wallace A.C., Jones M.L., Thornton J.M. PDBsum: a Web-based database of summaries and analyses of all PDB structures // Trends Biochem Sci. 1997. - Vol. 22. - P. 488-490.

75. Lawler J., Detmar M. Tumor progression: the effects of thrombospondin-1 and -2 // Int J Biochem Cell Biol. 2004. - Vol. 36. - P. 1038-1045.

76. Levine A.J, Finlay C.A., Hinds P.W. P53 is a tumor suppressor gene. Cell. -2004. - Vol. 116. - P. S67-S69.

77. Levine A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and. division // СеШ -1997.-Vol. 88. -P. 323-331.

78. Le Quesne W.J. 1974. The uniquely evolved character concept and its cladistic application // Systematic Zoology. Vol. 28. - P. 92-94.

79. Liang M.P., Banatao D.R., Klein Т.Е., Brutlag D.L., Altman R.B. WebFEATURE: An interactive web tool for identifying and visualizing functional sites on macromolecular structures // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31.-P. 3324-327.

80. Lindahl E., Hess В., van der Spoel D. GROMACS 3.0: A package for molecular simulation and trajectory analysis // J.Mol.Mod. 2001. - Vol. 7. - P. 306-317.

81. Lowe S.W., Ruley H.E., Jacks Т., Housman D.E. p53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents // Cell. 1993. - Vol: 74. - P. 957-967.

82. Май В., Newton M.A., Largand B. Bayesian phylogenetic inference via Markov chain Monte Carlo methods // Biometrics. 19991 - Vol. 55. - P. 1-12.

83. McLachlan A.D. Three-fold structural pattern in the soybean trypsin inhibitor (Kunitz) // J Mol Biol. 1979. - Vol. 133. - P. 557-563

84. McLachlan Т.К., Takimoto R., El-Deiry W.S. BRCA1 directs a selective p53-dependent transcriptional response towards growth, arrest and DNA repair targets. Mol Cell Biol. - 2002. - Vol. 22. - P. 4280-4292.

85. May P., May E. Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 protein // Oncogene. 1999. - Vol. 18. - P. 7621-7636.

86. McClendon C.L., Friedland G., Mobley D.L., Amirkhani H., Jacobson M.P. Quantifying Correlations Between Allosteric Sites in Thermodynamic Ensembles // J Chem Theory Comput. 2009. - Vol. 5. - P. 2486-2502.

87. Metropolis N., Rosenbluth A.W., Rosenbluth M.N., Teller A.H., Teller E. Equation of state calculations by fast computing machines. J. Chem. Phys. -1953. - Vol. 21. - P. 1087-1092.

88. Meinnel' Т., Blanquand S., Dardel F. A new subclass of the zinc metalloproteases superfamily revealed by the solution structure of peptide deformylase // J Mol Biol. 1996. - Vol. 262. - P. 375-386.

89. Miyata Т., Yasunaga T. Molecular evolution of mRNA: a method for estimating evolutionary rates of synonymous and amino acid substitutions from homologous nucleotide sequences and its application // J Mol Evol. -1980.-Vol. 16.-P. 23-36.

90. Miyazawa S., Jernigan R.L. Residue-residue potentials with a favorable contact pair term and an unfavorable high packing density term, for simulation and threading // J Mol Biol. 1996. - Vol. 256. - P. 623-44.

91. Moussaoui M., Cuchillo C.M., Nogues M.V. A phosphate-binding subsite in bovine pancreatic ribonuclease A can be converted into a very efficient catalytic site // Protein Sci. 2007. - Vol. 16. - P. 99-109.

92. Miiller Т., Vingron M. Modeling amino acid replacement // J Comput Biol. -2000.-Vol. 7.-P. 761-776.

93. Murphy K.L., Rosen J.M. Mutant p53 and genomic instability in a transgenic mouse model of breast cancer // Oncogene. 2000. - Vol. 19. - P. 1045-1051.

94. Nei M., Gojobori T. Simple methods for estimating the numbers of synonymous and nonsynonymous nucleotide substitutions // Mol Biol Evol. -1986.-Vol.3.-P. 418-426.

95. Neyman J.L. Molecular studies of evolution: a source of novel statistical problems // S.S. Gupta, J. Yackel. Statistical decision theory and related topics. -New York, 1971.-P. 1-27.

96. Nielsen R., Yang Z. Likelihood models for detecting positively selected amino acid sites and applications to the HTV-1 envelope gene // Genetics. -1998.-Vol. 148. P. 929-936.

97. Russell R.B. Detection of protein three-dimensional side-chain patterns: new examples of convergent evolution // J Mol Biol. 1998. - Vol. 279. - P. 12111227.

98. Ohki R., Nemoto J., Murasawa H., Oda E., Inazawa J., Tanaka N., Taniguchi T. Reprimo, a new candidate mediator of the p53-mediated cell cycle arrest at the G2 phase // J Biol Chem. 2000. - Vol. 275. - 22627-22630.

99. Olivier M., Eeles R., Hollstein M., Khan M.A., Harris C.C., Hainaut P. The IARC TP53 database: new online mutation analysis and recommendations to users // Hum Mutat. 2002. - Vol. 19. - P. 607-614.

100. Paranjpe S., Banerjee K. Phylogenetic analysis of the envelope gene of Japanese encephalitis virus // Virus Res. 1996. - Vol. 42. - P. 107-117.

101. Peterson C., Soderberg B.A. A new method for mapping optimization problems onto neural networks // Int. J. Neural. Syst. 1989. - Vol. 1. - P. 3-22.

102. Porter C.T., Bartlett G.J., Thornton J.M. The Catalytic Site Atlas: a resource of catalytic sites and residues identified in enzymes using structural data // Nucleic Acids Res. 2004. - Vol. 32. - P. D129-D133.

103. Press H.W., Teukolsky S.A., Vetterling W.T., Flannery B.P. Numerical recipes in C: the art of scientific computing. Cambridge, 1997.

104. Prochazkova J., Lichnovsky V., Kylarova D., Erdosova В., Vranka P. Involvement of p53 and Bcl-2 family proteins in regulating programmed cell death and proliferation in human embryogenesis // Gen Physiol Biophys. -2004. Vol. 23. - P. 209-229.

105. Procter J.B., Perry A.J., Torda A.E. Comparing objects of different sizes: treating proteins as strings //Aust. J. Chem. 2001. - Vol. 54. - P. 367-373.

106. Saccone C., Barome P.O., D'Erchia A.M., D'Errico I., Pesole G., Sbisa E, Tullo A. Molecular strategies in Metazoan genomic evolution. Gene. - 2002. -Vol. 300.-P. 195-201.

107. Schlosshauer M., Ohlsson M. A novel approach to local reliability of sequence alignments //Bioinformatics. 2002. - Vol. 18. - 847-854.

108. Schwede Т., Kopp J., GuexN., Peitsch M.C. SWISS-MODEL: An automated protein homology-modeling server // Nucleic Acids Res. 2003. - Vol. 31. - P. 3381-3385.

109. Shackney S.E., Shankey T.V. Common patterns of genetic evolution in human solid tumors // Cytometry. 1997. - Vol. 29. - P. 1-27.

110. Sharp P.M. In search of molecular darwinism // Nature. 1997. - Vol. 385. -P. 111-112.

111. Shindyalov I.N., Bourne P.E. Protein structure alignment by incremental combinatorial extension (CE) of the optimal path. Protein Eng. 1998. 11. - P. 739-747.

112. Shindyalov I.N., Kolchanov N.A., Sander C. Can three-dimensional contacts in protein structures be predicted by analysis of correlated mutations? // Protein Eng. 1994. - Vol. 7. - P. 349-358.

113. Sigal A., Rotter V. Oncogenic mutations of the p53 tumor suppressor: the demons of the guardian of the genome // Cancer Res. 2000. - Vol. 60. - 67886793.

114. Whelan S. Goldman N. A general empirical model of protein evolution derived from multiple protein families using a maximum-likelihood approach // Mol. Biol. Evol. 2001. - Vol. 18. - P. 691-699.

115. Smith M.L., Chen I.T., Zhan Q.M., Bae I.S., Chen C.Y., Gilmer T.M., Kastan M.B., O'Connor P.M., Fornace AJ. Interaction of the p53-regulated protein gadd45 with proliferating cell nuclear antigen // Science. 1994. - Vol. 266. - P. 1376-80.

116. Stiewe Т., Putzer B.M. Role of p73 in malignancy: tumor suppressor or oncogene? // Cell Death Differ. 2002 Mar. - Vol. 9. - P. 237-245.

117. Song S.Y., Lee S.K., Kim D.H., Son H.J., Kim H.J., Lim Y.J., Lee W.Y., Chun H.K., Rhee J.C. Expression of maspin in colon cancers: its relationship with p53 expression and microvessel density // Dig Dis Sci. 2002. - Vol. 47. -P. 1831-1835.

118. Soussi Т., Dehouche K., Beroud C. p53 website and analysis of p53 gene mutations in human cancer: forging a link between epidemiology and carcinogenesis // Hum Mutat. 2000. - Vol. 15. - P. 105-113.

119. Soussi T. The p53 tumor suppressor gene: from molecular biology to clinical investigation //Ann NY Acad Sci. 2000. - Vol. 910. - P. 121-137.

120. Springer M.S., Murphy WJ., Eizirik E., O'Brien S.J. Placental mammal diversification andsthe Cretaceous-Tertiary boundary // Proc Natl Acad Sci USA.- 2003. Vol. 100. - P. 1056-1061.

121. Stark A., Russell R.B. Annotation in three dimensions. PINTS: Patterns in Non-homologous Tertiary Structures // Nucleic Acids Res. 2003. - Vol. 31. -P. 3341-3344.

122. Suzuki Y., Gojobori T. A method for detecting positive selection at single amino acid sites // Mol Biol Evol. 1999. - Vol. 16. - P. 1315-1328.

123. Vogelstein В., Lane D., Levine A.J. Surfing the p53 network // Nature.2000. Vol. 408. - P. 307-310.

124. Vousden K.H., Lu X. Live or let die: the cell's response to p53. Nat Rev Cancer. - 2002. - Vol. 2. - P. 594-604.

125. Waddell P.J., Kishino H., Ota R. A phylogenetic foundation for comparative mammalian genomics // Genome Inform Ser Workshop Genome Inform.2001.-Vol. 12.-P. 141-154.

126. Wallace A.C, Borkakoti N., Thornton J.M. TESS: a geometric hashing algorithm for deriving 3D coordinate templates for searching structural databases. Application to enzyme active sites // Protein Sci. 1997. - Vol. 6. - P. 2308-2323.

127. Wallingford J.B, Seufert D.W, Virta V.C., Vize P.D. p53 activity is essential for normal development in Xenopus // Curr Biol. 1997. - Vol. 7. - P. 747-757.

128. Wong K.B., DeDecker B.S., Freund S.M., Proctor M.R., Bycroft M., Fersht A.R. Hot-spot mutants of p53 core domain evince characteristic local structural changes // Proc Natl Acad Sci USA.- 1999. Vol. 96. - P. 8438-8442.

129. Wright J.D., Lim C. A fast method for predicting amino acid mutations that lead to unfolding // Protein Eng. 2001. - Vol. 14. - P. 479-486.

130. Wyllie F., Haughton M., Bartek J., Rowson J., Wynford-Thomas D. Mutant p53 can delay growth arrest and loss of CDK2 activity in senescing human fibroblasts without reducing p21(WAFl) expression // Exp Cell Res. 2003. -Vol. 285. - P. 236-242.

131. Yang A., Kaghad M., Caput D., McKeon F. On the shoulders of giants: p63, p73 and the rise of p53 // Trends Genet. 2002. - Vol. 18. - P. 90-95.

132. Yang X., Pater A., Tang S.C. Cloning and characterization of the human BAG-1 gene promoter: upregulation by tumor-derived p53 mutants // Oncogene. 1999. - Vol. 18. - 4546-4553.

133. Yang Z. Likelihood ratio tests for detecting positive selection and application to primate lysozyme evolution // Mol Biol Evol. 1998. - Vol. 15. - P. 568-573.

134. Yang Z., Bielawski J.P. Statistical methods for detecting molecular adaptation // Trends Ecol Evol. 2000. - Vol. 15. - P. 496-503.

135. Yang Z., Nielsen R., Goldman N., Pedersen A.M. Codon-substitution modelsfor heterogeneous selection pressure at amino acid sites // Genetics. 2000. t1.Vol. 155.-P. 431-449.'

136. Yang Z., Nielsen R. Codon-substitution models for detecting molecular adaptation at individual sites along specific lineages // Mol Biol Evol // 2002. -19.-P. 908-917.

137. Yang Z. PAML: a program package for phylogenetic analysis by maximum likelihood // Comput Appl Biosci. 1997. - Vol. 13. - 555-556.

138. Yonish-Rouach E., Resnitzky D., Lotem J., Sachs L., Kimchi A., Oren M. Wild-type p53 induces apoptosis of myeloid leukaemic cells that is inhibited by interleukin-6 //Nature. 1991. - Vol. 352. - P. 345-347.

139. Zhang M., Volpert O., Shi Y.H., Bouck N. Maspin is an angiogenesis inhibitor // Nat Med. 2000. - Vol. 6. - P. 196-199.

Информация о работе

Пинтус, Сергей Сергеевич
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 03.01.09

Диссертация

Компьютерный анализ структуры и эволюции функциональных сайтов белка P53 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы