Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение функций различных доменов нового транскрипционного коактиватора SAYP (E(y)3) Drosophila melanogaster и поиск взаимодействующих с ним белков

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение функций различных доменов нового транскрипционного коактиватора SAYP (E(y)3) Drosophila melanogaster и поиск взаимодействующих с ним белков"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4

Николенко Юлия Владимировна

Изучение функций различных доменов нового транскрипционного коактиватора вАУР (Е(у)3) Пгоъор/гИа melanogaster и поиск взаимодействующих с ним белков

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Института биологии гена РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук Георгиева София Георгиевна кандидат биологических наук Краснов Алексей Николаевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Шпаковский Георгий Вячеславович кандидат биологических наук Головнин Антон Клеменсович

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Защита диссертации состоится Я октября 2005 года, в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова. Д.32.

Автореферат разослан £6 сентября 2005 года. Ученый секретарь

диссертационного совета

канд. фарм. наук л с

i/0<C3

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Реализация наследственной информации клетки является объектом пристального изучения современной науки. Этот сложный многостадийный процесс лежит в основе жизнедеятельности и развития всех живых организмов. Механизмы экспрессии генов активно изучаются с помощью методов молекулярной биологии и генетики Молекулярный аппарат клетки, осуществляющий чтение и реализацию генетической информации, необычайно сложно устроен Помимо фундаментального значения, исследования в данной области имеют обширное практическое применение в медицине, фармакологии, биотехнологии, селекции.

Считается, что именно первый этап экспрессии генов - транскрипция -является наиболее важным в регуляции всего процесса. У эукариот различные наборы генов транскрибируются специализированными РНК-полимеразами; гены, кодирующие мРНК, транскрибируются РНК-полимеразой И. Многочисленные исследования показали, что на активацию транскрипции РНК-полимеразой П влияют несколько дискретных, контролируемых процессов: изменение структуры хроматина, изменение локализации гена внутри ядра и привлечение на промотор гена мультибелковых комплексов, активность которых определяется специфическими межмолекулярными взаимодействиями. К настоящему моменту исследовано большое количество разнообразных факторов, формирующих аппарат транскрипции. Выделяют общие факторы транскрипции - консервативные в эволюции белки, необходимые для экспрессии большинства генов, специфические факторы транскрипции (активаторы и репрессоры) и так называемые корегуляторы (коактиваторы и корепрессоры). Последние осуществляют связь между специфическими и общими факторами транскрипции, а гакже изменяют структуру хроматина (Emerson, 2002).

Большое количество исследований в настоящее время посвящено описанию новых и детальному изучению уже известных факторов

J РОС. НАЦИбНЛЛЬИАя] I БИБЛИОТЕКА I

фанскрипции Имеющаяся на данный момент картина работы молекулярного аппарата транскрипции постоянно детализируется и корректируется.

В данной работе были изучены функции нового мультидоменного коактиватора транскрипции РНК полимеразы II высших эукариот SAYP (Е(у)З) и проведен поиск взаимодействующих с ним белков, обнаружено взаимодействие указанного коактиватора с высококонсервативным транскрипционным фактором Нг46, относящимся к суперсемейству ядерных рецепторов.

Цель и задачи исследования

Основной целью данной работы являлось изучение функций различных доменов нового транскрипционного коактиватора SAYP и поиск взаимодействующих с ним белков. В ходе исследования предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

-изучить влияние консервативного SAY-домена белка SAYP на транскрипцию репортерных генов HIS3 и LacZ в дрожжах;

-изучить влияния SAY-домена на выживаемость D melanogaster и транскрипцию in vivo-,

-изучить роль белка SAYP и его доменов в регуляции транскрипции генов, локали юванных в гетерохроматине;

-произвести поиск белков, взаимодействующих с доменами SAYP в дрожжевой двухгибридной системе;

-подтвердить результаты, полученные в дрожжевой двухгибридной системе, с помощью других методов.

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе изучены функции консервативных доменов SAY и PHD нового коактиватора транскрипции РНК-полимеразы II SAYP (Е(у)З) Показано, что SAYP является бифункциональным фактором и участвует в активации фанскрипции в эухроматине и репрессии транскрипции в гетерохроматине

Показано, что SAY-домен белка SAYP способен активировать транскрипцию репортерных генов в дрожжах. Показано, что in vivo SAY-домен отвечает за активацию транскрипции в эухромашне, a PHD-домены - за репрессию транскрипции в гетерохроматине. В дрожжевой двухгибридной системе обнаружен ряд белков, взаимодействующих с SAYP, среди них -транскрипционный регулятор Нг46 Взаимодействие SAYP и Нг46 подтверждено методами гель-фильтрации, иммуноокрашивания на политенных хромосомах и генетическими методами. Оба белка, SAYP и №46, необходимы для жизнеспособности D melanogaster, консервативны в эволюции и имеют гомологов в протеоме человека (Shidlovskii et al , 2005; King-Jones & Thummel, 2005), которые не изучены (в случае гомолога SAYP), или изучены недостаточно. Поэтому изучение функций белков SAYP и Нг46 на примере модельного объекта D melanogaster может иметь практическое значение.

В работе изучен новый важный участник процесса регуляции транскрипции высших эукариот.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на Международной конференции "Molecular Genetics of Eucaryotes" (Москва, 2003), на Конференции молодых ученых по молекулярной биологии и генетике (Киев, 2003), на Международной конференции "Advances in Molecular Cell Biology" (Москва, 2004), на Международной конференции «¡st EMBL Monterotondo (6th EMBL) International PhD Symposium» (Rome, 2005).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Из них статей - 4, тезисов докладов и материалов конференций - 4

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на f2/0 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, объект и задачи исследования, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Диссертация содержит 9 рисунков и 1 таблицу Библиография включает /*/£ источников

И. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение

Ранее в нашей лаборатории был клонирован и секвенирован ген е(у)3 D melanogaiter, кодирующий транскрипционный кофактор SAYP (Supporter

AT-hook SAY rllD

Рго-богатый Ьег-богатый Ser-богатый Scr-6oj атый Scr-богэтый

район район район p.iiinn район

ноли Olli

SP JJ3P _

■ —0-

Рис 1 Структура SAYP (F(>)3) Указаны AT-hook, консервативный SAY-домен. PHD-домены, участки, обогащенные остатками серина и пролила, полиглутаминовые последовательности, ПЗР - положительно заряженные районы, NLSs - сигналы ядерной локализации. EMS и ul - сайты терминации грансляции в мутантах efy)3FMSI и eiyji"', соответственно.

of Activation of yellow Protein), необходимый для активированной экспрессии гена yellow и ряда других (Shidlovskii et al , 2005) Было показано, что SAYP является ядерным белком, экспрессируется во всех тканях на всех стадиях развития D melanogaiter и необходим для жизнеспособности насекомот о

Были получены две мутации гена е(у)3• гипоморфная мутация е(у)3"', вызванная иисерцией мобильного элемента Stalker, и летальная в гомодаготе мутация e(y)3EMSI Компьтерный анализ последовательности мРНК показал, что белок SAYP содержит 2008 аминокислотных остатков (Рис 1) На С-конце

6

белка имеется два консенсуса консервативного домена PHD (предположительно этот домен участвует в белок-белковых взаимодействиях) В середине молекулы имеется участок AT-hook (предположительно этот мотив обладает способностью связываться с АТ-богатыми последовательностями ДНК). В белке имеются 7 предположительных сигналов ядерной локализации В составе белка также был обнаружен новый консервативный домен SAY (Supporter of Activation of yellow).

При помощи протраммы BLAST (NCBI) в базе данных у всех многоклеточных животных с секвенированным геномом были найдены полипептиды, имеющие значительную гомологию с SAYP в области SAY (а.о 1340-1573) и PHD, что говорит о важности наличия обоих доменов для функционирования этих белков (Shidlovskii et al., 2005). В то же время аминокислотная последовательность N-концевой часги разных гомологов SAYP видоспецифична.

Изучение роли SAY-домена белка SAYP в активации транскрипции а дрожжах

Ранее в генетических экспериментах было показано, что ген е(у)3 является активатором транскрипции Частичная инактивация гена е(у)3 у мутантов eiy)3"' вызывает снижение транскрипции эухроматиновых генов yellow, white и cut (Georgiev & Gerasimova. 1989). Кроме того, методом иммуноокрашивания было показано, что большая часть сайтов связывания SAYP на политенных хромосомах из слюнных желез личинок D melanogaster совпадает с сайтами локализации РНК-полимеразы II - сайтами активной транскрипции (Shidlovskii et al., 2005).

Летальная в гомозиготе мутация е(у)3ЕШ приводит к укорочению белка SAYP и делеции SAY-домена. В настоящей работе было исследовано влияние SAY-домена на активацию транскрипции. Для этой цели были созданы 3 конструкции, которые кодировали рекомбинантные полипептиды, состоящие из

ДТПС-свяэывающего белка ЬехА и фрагментов белка в АУР в единой открытой рамке трансляции (ОРТ) (Рис 2А).

AT-hook

PHD

Рис 2 Консервативный домен SAY участвует в активации транскрипции в дрожжах. А) Рекомбинантные полипептиды, использованные для анализа: 1. LexA-SAYP (1273-1629); 2, LexA-SAYP (1273-1493); 3, LexA-SAYP (1366-1629); 4, LexA-GAL4AD; Б) Анализ экспрессии репортерных генов HIS3 и Lad. Детекция активации гена LacZ при помощи субстрата CPRG.

1'++' - быстрый рост,'+' - слабый рост,- отсутствие роста;

2 активность ß-галактозидазы измеряли по формуле: U=1000 х OD57g / (t х 0,5 х OD60(I), г де t - время инкубации в минутах;

В) Детекция активация гена ImcZ при помощи субстрата X-gal.

Были использованы три перекрывающихся фрагмента 8АУР: фрагмент, содержащий полноразмерный 8АУ-домен (а.о. 1273-1629), и два более коротких фрагмента (а.о. 1366-1629 и а.о. 1273-1493). В качестве положительного контроля была использована конструкция, которая кодировала слитный полипептид ЬехА-ОАЬ4_А13, содержащий активационный домен транскрипционного фактора ОАЬ4 в единой ОРТ с ЬехА.

Было изучено влияние полученных конструкций на транскрипцию репортерных генов, содержащих ЬехА-связывающие сайты (операторы) в промоторной области. В данной работе был использован штамм дрожжей Ь40, дефектный по биосинтезу лейцина, триптофана и гистидина и несущий

репортерные гены HIS3 и LacZ В результате активации репортерного гена H1S3, дрожжи L40 получают способность расти на селективной среде, не содержащей гистидин. Активацию репортерного гена LacZ детектировали при помощи субстрата X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-р-0-галактозид): благодаря активности Р-галактозидазы, дрожжевые колонии приобретали синий цвет.

Экспрессия полипептида LexA-SAYP (1273-1629) вызывала заметную активацию обоих репортерных генов. Делеция первых 26 а.о. SAY-домена в полипептиде LexA-SAYP (1366-1629) приводила к резкому снижению активации репортерных генов, а полипептид LexA-SAYP (1273-1493) без 80 С-концевых а о. SAY-домена не способен активировать транскрипцию (Рис. 2Б, 2В).

Для более точного определения уровня активации репортерного гена LacZ, активность р-галактозидазы была измерена количественно при помощи субстрата CPRG (хлорфеноловый красный-р-О-галактопиранозид) (Рис. 2Б). Активность р-галактозидазы в клетках, экспрессировавших полипептид LexA-SAYP (1273-1629) с полноразмерным SAY-доменом, была примерно в 10 раз ниже, чем в клетках, экспрессировавших контрольный полипептид LexA-GAL4 AD. Делеция первых 26 а.о. SAY-домена в полипептиде LexA-SAYP (1366-1629) приводила к резкому снижению активности Р-галактозидазы (в 80 раз).

Эти результаты показывают, что полноразмерный SAY-домен белка SAYP активирует транскрипцию в дрожжах. Другие домены белка SAYP не способны активировать транскрипцию в данной системе (см. ниже).

Изучение влияния белка SA YP на транскрипцию в гетерохроматине

SAYP на политенных хромосомах в основном локализуется в сайтах активной транскрипции. Однако также было показано наличие SAYP в гетерохроматине хромоцентра и четвертой хромосомы, где он колокализуется с основным белком гетерохроматина НР1 (Shidlovskii et al., 2005). Для изучения функции SAYP в гетерохроматине, был исследован эффект мутации е(у)3"' на

9

экспрессию трансгенов, расположенных в различных районах гетерохроматина четвертой хромосомы и в хромоцентре (линия 118Е-10). Мутация в(у)3"' приводит к снижению уровня экспрессии гена е(у)3 и синтезу укороченного белка SAYP, лишенного PHD-доменов. В эксперименте были использованы трансгенные линии мух, несущих конструкцию P[hsp26-pt, hsp70-w\, предоставленные лабораторией S. Elgin (Sun et al., 2000). У мух этих линий отсутствовала экспрессия эндогенного локуса white и наблюдалась мозаичная пигментация глаз, обусловленная репрессией трансгена в ряде клеток из-за возникновения эффекта положения мозаичного типа (МЭП). Уровень экспрессии трансгена определяли спектрофотометрически путем измерения содержания красного пигмента в глазах мух.

118F75-5 39С12 3SC42 11 ВЕЗ 3«С82 118Е10 11SE19

Рис 3 вАУР участвует в репрессии транскрипции в гетерохроматине. Номер трансгенной линии указан под парными столбцами вдоль горизонтальной линии По оси ординат указано отношение уровня пигментации глаз у самцов у1 м'е(у)3"'/У, Р[Изр-2б-р1, И5р70-ю]/+ (светлые столбцы) и самок у' н>'е(у)3"'/X, Р[Н$р-26-р1, Ивр70-

(темные столбцы) к уровню пигментации глаз у контрольных самцов у'ю1/ У; Р[11.чр-26-р1, И5р70-\м]/+ и самок у'и»'/X; Р[И.чр-26-р1, Ьзр70--м]/+, соответственно. Крайний правый столбец показывает соотношение уровней пигментации в гетерозиготных самках у'к1е(у)3"!/\м"""' и контрольных гетерозиготных самках у'и>'/

т4Н

В эксперименте для скрещивания были использованы самки у е(у)3 /РМ4, в контрольном скрещивании - самки ум>]/РМ4. Влияние мутации е(у)3"' на экспрессию трансгена было исследовано у самок Б!,

гетерозиготных по мутации е(у)Зи1 и инсерции Р-элемента, и у самцов F1, гемизиготных по мутации е(у)Зи1 и гетерозиготных по инсерции Р-элемента. Было обнаружено значительное повышение уровня экспрессии трансгена у самцов (в 5-16 раз) в скрещиваниях с большинством исследуемых линий по сравнению с контрольными скрещиваниями (Рис. 3). Сходный эффект наблюдался и у самок, но был менее заметен (повышение уровня экспрессии трансгена в 3-7 раз), что объясняется наличием в геноме самок аллеля е(у)3 дикого типа.

Такой же эффект мутация е(у)3"' оказывает на экспрессию гена white в линии с природной мутацией wm4h Эта мутация представляет собой инверсию Х-хромосомы, которая переносит ген white в область, граничащую с перицентромерным гетерохроматином, в результате чего возникает МЭП. У самок F1, гетерозиготных по мутациям е(у)3"' и wm4h, экспрессия гена white возрастала в 3 раза (Рис. 3) по сравнению с контрольным скрещиванием.

Таким образом, мутация е(у)3"' является супрессором МЭП - Su(var), что характерно для мутаций в генах, кодирующих репрессоры транскрипции и белки, принимающие участие в формировании гетерохроматина, например, НР1.

Изучение влияния SA Y-домена белка SA YP на выживаемость и активацию транскрипции In vivo

Полученные данные свидетельствуют о том, что SAYP имеет двоякую функцию и участвует в активации транскрипции в эухроматине и репрессии транскрипции в гетерохроматине. Для выяснения функции консервативных доменов SAY и PHD в этих процессах были использованы две ранее полученные мутации гена е(у)3. Мутация e(y)3EMSl, приводящая к делении SAY-домена, влияет на жизнеспособность D melanogaster намного сильнее, чем мутация е(у)3"' Это позволяет предположить, что именно SAY-домен играет важную роль в развитии D melanogaster

Для проверки этого предположения, была создана конструкция Р{е(у)ЗйИ1Ю}, которая экспрессировала укороченный белок БАУР

! 1снотип Наличие доменов SAY и PHD (РР) Фсртильность самок Жизнеспособность Экспрессия аллелей ✓ и У" Экспрессия трансгена в гетерохроматине

¡ е(у)3' SAY+PP Фертильны Норма Норма Репрессирован

е(у)3'т - Деталь

\ Ф)3Ш SAYa Стерильны Снижена Снижена Активирован

\ е(у)3^> Р{е(у)3*} SAY+PP Фертильны Норма

1 e(yj3ÍMM \P{e(y)3iP"D } SAY Фертильны Норма

¡ е(у)3"' | Р№Г} SAY' SAY+PP Фертильны Норма Норма Репрессирован

, ety)3" j P{e(y)3APHD} SAY" SAY Фертильны Норма Норма Активирован

Табл 1 Изучение роли консервативных доменов SAY и PHD в основных фенотипических проявлениях мутаций е(у)3 и е(у)3"' SAY -домен необходим для жи ¡неспособности и активации транскрипции In vivo, а РНГ)-домсны отвечают за репрессию транскрипции в гетерохроматине Объяснения см в тексте " Уровень экспрессии SAYP у мутантов е(у)Зи1 снижен

(а.о 1-1665), содержащий SAY-домен, но не содержащий PHD-домены В качестве положительного контроля была использована полученная ранее конструкция Р{е(у)3*}, экспрессирующая полноразмерный белок SAYP.

Обе конструкции были трансформированы в эмбрионы D melanogaster и использованы в экспериментах по спасению фенотипа летального аллеля e(y)fMSl. Результаты эксперимента приведены в Табл. 1. Были проанализированы пять независимо полученных трансформантов, экспрессировавших конструкцию Р{е(у)Зтю}, и восемь независимо полученных трансформантов, экспрессировавших конструкцию Р{е(у)3" } Обе конструкции полностью восстанавливали дикий фенотип мутантов e(y)3hMSI

После этого было исследовано влияние конструкции Р{е(у)3лрип} на фенотипические проявления мутации е(у)3"' (стерильность самок и снижение выживаемости на 20% у гемизиготных самцов и на 50% у гомозиготных самок) Как уже было сказано, мутация е(у)3"' приводит к синтезу укороченного белка SAYP без PHD-доменов, кроме того, уровень экспрессии SAYP снижается Экспрессия укороченного белка у мутантов е(у)Зи1 была повышена за счет встраивания трансгена Р{е(у)3*'ни} Экспрессия трансгенного белка была подтверждена методом Western-анализа (данные не представлены). Это позволило исследовать фенотипический эффект утраты PHD-доменов белка SAYP Было обнаружено, что конструкция P{e(y)3AI'HÜ}, как и конструкция Р{е(у)Зг}, комплементирует основные фенотипические проявления мутации е(у)3"', восстанавливая фертильность самок и жизнеспособность линии.

Было также исследовано влияние SAY-домена на экспрессию генов in vivo Важным проявлением мутации е(у)Зи1 является снижение уровня экспрессии некоторых генов. В частности, мутация е(у)3"' влияет на экспрессию гена yellow, вызывая снижение уровня экспрессии аллелей у2 и у1пг в щетинках. Было исследовано влияние конструкции P{e(y)3áPHD} на экспрессию гена yellow в мухах линий у2е(у)Зи1 и у1пге(у)Зи1. Было обнаружено полное восстановление фенотипов у и ут в трансгенных самцах у2е(у)Зи'/У, Р{е(у)?рт} и ynre(y)3u'/Y, Р{е(у)Зтю), соответственно.

Таким образом, низкое содержание SAY-домена вследствие снижения уровня экспрессии белка SAYP, а не утрата PHD-доменов, является причиной основных фенотипических проявлений мутации е(у)3"'.

Полученные результаты в совокупности указывают на то, что SAY-домсн очень важен для функционирования SAYP. Снижение его содержания у мутантов е(у)3"' вызывает нарушения в обеспечении нормального развития и жизнеспособности мух, а утрата SAY-домена у мутантов e(y)3EWI детальна. Участие SAY-домена в активации транскрипции гена yellow in vivo согласуется с обнаруженной нами способностью SAY-домена активировать транскрипцию

репортерных генов в дрожжах В то же время присутствие РНТЭ-доменов не является необходимым для этих функций ЯАУР.

Изучение роли PHD-доменов белка SAYP в репрессии транскрипции в гетерохроматине

Так как SAYP участвует в репрессии транскрипции в гетерохроматине, было решено проверить, какой из доменов белка отвечает за эту функцию.

В линии е(у)3отсутствие PHD-доменов не препятствует связыванию мутантного SAYP с политенными хромосомами (Shidlovskii et al, 2005). Следовательно, либо снижение уровня экспрессии гена, либо отсутствие PHD-доменов, либо оба эти фактора вызывают супрессию МЭП.

Для того, чтобы выяснить, которое из этих предположений верно, конструкции Р{е(у)3ЛРН0} и Р{е(у)3*} были введены в геном мух е(у)3"'\ P{hip26-pt, hsp70-wj. Конструкция, экспрессирующая укороченный белок без PHD-доменов, в отличие от контрольной конструкции, не комплсментировала влияния мутации е(у)3"' на экспрессию трансгенов P{hsp26-pt, hsp70-w} в гетерохроматине в трех исследованных линиях (118Е25-5, 39С42, 39С52). У трансгенных самок, гетерозиготных по мутации е(у)3"', сохранялась экспрессия трансгена P{hsp26-pt, hsp70-w} на прежнем уровне после введения одной или двух копий конструкции Р{е(у)Злрт}. Тот же эффект наблюдали и у самцов, гемизиготных по мутации е(у)3"' (Табл. 1).

Эти данные говорят о том, что отсутствие PHD-доменов SAYP у мутантов е(у)3"', а не снижение содержания белка, вызывает супрессию МЭП. Следовательно, SAYP участвует в репрессии транскрипции в гетерохроматине именно посредством PHD-доменов

Поиск белков, взаимодействующих с SAYP в двухгибридной системе

Для дальнейшего изучения функций белка SAYP был предпринят поиск белков, взаимодействующих с ним. С этой целью был проведен скрининг

библиотеки кДНК из эмбрионов D melanogaster в дрожжевой двухгибридной системе.

Белок SAYP имеет большие размеры, что затрудняет его экспрессию в дрожжах, кроме того, SAY-домен, как было показано, способен активировать транскрипцию. Район а о 1273-1629, содержащий SAY-домен, в составе одного полипептида с LexA является «автоактиватором», т.е. не пригоден для анализа в двухгибридной системе, поэтому он был заведомо исключен из эксперимента. Для анализа был использован район SAYP, содержащий PHD домены, а также N-концевая часть белка. Поскольку N-концевой район SAYP не содержит известных доменов, он был произвольно разделен на части длиной от 250 до 390 а.о. (Рис. 4). Было создано 5 конструкций в векторе рВТМ117с (далее эти конструкции будут называться pBaitJ, которые кодировали рекомбинантные полипептиды, состоящие из LexA и фрагментов белка SAYP в единой ОРТ. Для уменьшения числа ложноположительных результатов все конструкции были проверены на «автоактивацию». pBait, кодирующая район а.о. 888-1273, при котрансфекции с плазмидой рАСТ2, вызывала «автоактивацию» репортерных генов и была исключена из дальнейшего анализа. В итоге, 4 конструкции pBail, кодирующие разные районы SAYP, в том числе конструкция,

Al-hook SAY PHD

Pro богатый Ser богатый Ser-богатый Ser богатый Ser-богатый

район район район район район

ТТ~7—

NLSs

CMS

Рис 4. Фрагменты белка БАУР, использованные для скрининга в двухгибридной системе 1, (а о. 1-362); 2, (а о, 361-644); 3, (а о 643-889); 4, (а о. 1628-2008)

содержащая РНО-домены, оказались пригодными для скрининга в двухгибридной системе (Рис. 4).

В данной работе был использован штамм дрожжей L40, дефектный по биосинтезу лейцина, триптофана и гистидина Взаимодействие белков «bait» и «ргеу» в клетках этого штамма вызывает активацию двух репортерных генов, дрожжевого гена HIS3 и бактериального гена LacZ Оба репортерных гена экспрессируются под контролем операторов бактериального ДНК-связывающего белка LexA.

Дрожжи штамма L40 были трансформированы смесью из четырех плазмид pBait Полученные трансформанты были отобраны на селективной среде и затем трансформированы библиотекой кДНК из эмбрионов D melanogaster в векторе рАСТ2. Плазмиды с клонами библиотеки кДНК далее будут обобщённо называться рРгеу. В сумме было проскринировано около 2x106 клонов, что в 2 раза превосходит представительность данной библиотеки

После исключения всех ложноположитсльных и повторяющихся результатов, отобранные клоны кДНК, позитивные по активации обоих репортерных генов, были секвенированы. Анализ нуклеотидных последовательностей клонов проводился при помощи программы BLAST на сервере NCBI.

На последнем этапе эксперимента отобранные белки проверялись на специфичность взаимодействия с SAYP Для этого соответствующие плазмиды рРгеу ^трансформировали в дрожжи L40 с четырьмя использованными плазмидами pBait по отдельности.

В итоге было идентифицировано 11 клонов, кодирующих белки, взаимодействующие с разными районами SAYP. В основном это гипотетические белки, предсказанные по последовательности кДНК (данные не представлены). Большинство найденных белков (9 из 11) взаимодействуют с районом SAYP, содержащим PHD-домены, что онласуется с предположением, что PHD-домены отвечают за белок-белковые взаимодействия. Среди белков, взаимодействующих с PHD-доменами SAYP, наибольший интерес представляет белок Mes-4, вовлеченный в репрессию транскрипции в клетках зародышевой линии и предположительно обладающий гистон-

метилтрансферазной активностью (Ketel et al, 2002; Ketel et al., 2003) Для проверки взаимодействия SAYP и Mes-4 in vivo проводятся дальнейшие исследования.

С фрагментом а.о. 643-889 белка SAYP взаимодействует клон, соответствующий кДНК гена Нг46, который посчитали наиболее важным для дальнейшего анализа.

Ген Hr46 (DHR3) кодирует консервативный белок, который относится к суперсемейству ядерных рецепторов и экспрессируется во многих тканях в эмбриогенезе, во время линек и в начале метаморфоза D. melanogaster, v необходим для развития и жизнеспособности насекомого и вовлечен как в

активацию, так и в репрессию транскрипции (Koelle et al., 1992; Carney et al., 1997; Lam et al., 1997). Белок №46 (DHR3) имеет строение, характерное для ядерных рецепторов, содержит консервативный ДНК-связывающий домен (DBD), вариабельный линкерный участок и менее консервативный лиганд-связывающий домен (LBD). Найденный кДНК клон кодирует 376 С-концевых а о. белка Нг46 из 487, содержит линкерный участок и LBD. Именно эта часть молекулы ядерных рецепторов отвечает за взаимодействие с транскрипционными корегуляторами (McKenna & O'Malley, 2002). В молекуле корегулятора за взаимодействие с ядерным рецептором отвечает короткий мотив, называемый NR-бокс, образующий амфипатическую а-спираль, имеющую гидрофобную поверхность на одной стороне. NR-бокс может быть вариабельным по последовательности, часто встречаются мотивы типа LxxLL, ÏXXTI или LXXI/HIXXXI/L (Sanglier et al., 2004). Взаимодействующий с Hr46 и район белка SAYP (а.о 643-889), содержит последовательность

LnkHLQîIHkLA (а.о. 723-734), отвечающую описанным критериям.

Подтверждение взаимодействия SA YP и Hr46(DHR3)

Полученные результаты двухгибридного анализа выглядят достоверно, т к. было выявлено взаимодействие между двумя ядерными белками, имеющими перекрывающиеся временные и пространственные профили экспрессии и

участвующими в регуляции транскрипции. Однако, поскольку дрожжевая двухгибридная система является гетерологичной для й melanogaster, данные результаты требуют проверки с помощью других методов

Для этой цели были получены поликлональные антитела мыши к Нг46(П)Н113) Методами Шез1еш-анализа и иммунопреципитации было показано, что антитела, полученные от двух разных животных, специфично узнают в экстракте из эмбрионов О melarгogaster белок с предсказанной для Нг46(ОНЯЗ) молекулярной массой (49 к Да).

Ранее в нашей лаборатории для изучения 8АУР-содержащего комплекса был проведен ряд хроматографических очисток эмбрионального ядерного экстракта (Шидловский Ю., личное сообщение) Методом гель-фильтрации было показано, что Б АУР входит в состав комплекса массой около 2 МДа. Этот комплекс присутствует в наибольшей концентрации во фракциях № 2-4 и практически отсутствует во фракции №1, содержащей, в частности, различные крупные неспецифические агрегаты. Эти данные указывают на то, что детектируемый комплекс не является продуктом неспецифической агрегации. Было исследовано распределение Нг46 во фракциях с нечетными номерами и обнаружено, что он присутствует только во фракции №3, содержащей основную часть БАУР-содержащего комплекса, и отсутствует в остальных фракциях, где содержание 8АУР низкое или он вообще отсутствует (Рис 5).

По литературным данным №46 связывается примерно со 150 сайтами на политенных хромосомах из слюнных желез D. melanogaster на стадии предкуколки (Lam et al, 1997). Была исследована локализация белков Нг46 и SAYP на данной стадии развития и обнаружена колокализация этих двух

2 МДа

ббОкДа

Рис 5 Хроматографическое разделение эмбрионального ядерного экстракта методом гель-фильтрации. Указаны номера фракций, масса элюируемых комплексов (сверху). Нг46 присутствует только во фракции с максимальным содержанием ЯАУР

1 3 5 7 9 11

SAYP г- Ц S

нг4б т

белков во многих сайтах (Рис. 6), в том числе, в экдизоновых пуфах (62Е, 63F, 70Е, 76D, 98F, 100Е и др.). Картированные сайты совпали с ранее опубликованными сайтами локализации Hr46 (Lam et al., 1997).

Взаимодействие SAYP и Нг46 также было подтверждено методом генетического анализа Было обнаружено генетическое взаимодействие между мутацией е(у)3"' и гипоморфной мутацией СВ-5644-3, которая вызвана

Рис. 6 Колокализация SAYP и Нг46 на политенных хромосомах из слюнных желез предкуколок D melanogaster А) Окрашивание DAPI; Б) Окрашивание а-Нг46; В) Окрашивание a-SAYP.

инсерцией конструкции P{RS3} в интрон гена Иг46 (Golic & Golic, 1996).

Для скрещивания использовали самок y2wae(y)3u'/FM4, и самцов линии СВ-5644-3 (Szeged Stockcenter) Сочетание мутаций в генах с(у)3 и Нг46 у самцов FI с генотипом y*wae(y)3u'/Y;CB-5644-3/+ усиливало влияние мутации е(у)Зи1 на экспрессию аллеля у2 в щетинках. У этих самцов щетинки были окрашены в желтый цвет, как у мутантов у1, у которых экспрессия гена yellow отсутствует полностью (данные не представлены) Таким образом, было показано, что наличие мутации в гене Нг4б усиливает фенотипический эффект мутации е(у)Зи>, что подтверждает взаимодействие белков SAYP и Hr46(DHR3)

Итак, взаимодействие белков SAYP и Hr46(DHR3) было подтверждено четырьмя разными методами Hr46(DHR3) играет важную роль в эклизон-регулируемых процессах онтогенеза D melanogaster (Lam et al, 1999). В то же время SAYP экспрессируется на всех стадиях развития и во всех тканях D melanogaster, а значит, играет более общую роль

На основании полученных данных можно выдвинуть следующую гипотезу. Вариабельный N-концевой домен белка SAYP участвует в связывании со специфическими факторами транскрипции, в т ч Hr46(DHR3), и таким образом SAYP рекрутируется на промоторы генов-мишеней. Консервативный SAY-домен участвует в основной функции SAYP - активации 'транскрипции -например, через взаимодействие с консервативными общими факторами транскрипции: ТВР, TAFs, Gcn5. (В нашей лаборатории было показано (Шидловский Ю., личное сообщение), что SAYP коиммунопрепипигируется с компонентами комплексов TFIID и SAGA.) PHD-домены опосредуют участие SAYP в репрессии транскрипции в гетерохроматине предположительно через взаимодействия с гистоновым кодом и/или с репрессорами, например с белком Mes-4

Для подтверждения данной гипотезы необходимы дальнейшие эксперименты.

III. ВЫВОДЫ

1 Показано, что консервативный SAY-домен транскрипционного кофактора SAYP обеспечивает активацию транскрипции репортерных генов в дрожжах.

2 Установлено, что консервативный SAY-домен белка SAYP необходим для жизнеспособности D melanogaster и участвует в активации транскрипции in vivo

3. Показано, что SAYP участвует в репрессии транскрипции в гетерохроматине За репрессию транскрипции отвечают PHD-домены белка.

4 В дрожжевой двухгибридной системе обнаружено взаимодействие белка SAYP с консервативным транскрипционным фактором Hr46(DHR3) Обнаруженное взаимодействие подтверждено другими биохимическими и генетическими методами (гель-фильтрация, иммуноокрашивание на

политенных хромосомах, генетический анализ мутантных линий D melanogaster).

5 Предложена модель, объясняющая участие SAYP в активации и репрессии транскрипции посредством разных консервативных доменов белка

IV. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи:

1. Yulii V. Shidlovskii, Aleksey N. Krasnov, Julia V. Nikolenko, Ljubov A. Lebedeva, Marina Kopantseva, Maria A. Ermolaeva, Yurij V. Ilyin, Elena N. Nabirochkina, Pavel G Georgiev and Sofia G Georgieva. A novel multidomain transcription coactivator SAYP can also repress transcription in heterochromatin EMBO J., 2005, V.24: 97-107

2 Ю В. Шидловский, Ю. В. Николенко, A. H. Краснов, М. Р. Копанцева, С. Г. Георгиева, Е. Н. Набирочкина. Ген е(у)3 кодирует эволюционно консервативный белок SAYP, необходимый в онтогенезе. Генетика, 2005, 41 1027-1032

3. Ю. В. Николенко, Ю. В. Шидловский, JT. А. Лебедева, А Н. Краснов, С. Г. Георгиева, Е. Н. Набирочкина. Транскрипционный коактиватор SAYP может репрессировать транскрипцию в гетерохроматине. Генетика, 2005, 41: 1033-1037

4. Шидловский Ю. В , Краснов А. Н., Николенко Ю. В., Георгиева С Г.. Набирочкина Е. Н. Характеристика нового активатора транскрипции РНК-полимеразы IT ДАН, 2005, 40- 272-274

Тезисы конференций:

1 Nikolenko J. V., Lebedeva L. A , Krasnov A. N., Nabirochkina E. N Novel transcription factor of Drosophila melanogaster E(y)3 participates in position effect variegation International conference "Molecular genetics of eukaryotes " Moscow, 4-7 February, 2003: 19

2 Nikolenko J. V., Lebedeva L. A , Krasnov A. N., Nabirochkina E N Novel transcription factor of Drosophila melanogaster E(y)3 participates in position effect variegation Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, Kyiv, Ukraine, 25-27 September 2003: 110.

3. Yu. Shidlovskii, A. Krasnov, J. Nikolenko, L. Lebedeva, M Kopanceva, S. Georgieva and E. Nabirochkina Molecular characterization of a novel transcription factor. Conference "Advances in molecular cell biology", Moscow, 17-18 June, 2004 202-212

4 Shidlovskii Y , Nikolenko J., Krasnov A., Fedorova O, Lebedeva L, Nabirochkina E., Georgieva S. Novel transcription coactivator SAYP. 'T' EMBL Monterotondo (6th EMBL) International PhD Symposium", Rome, Italy, 12-14 May, 2005: 54.

Отпечатано в копицентре « СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 19. 09. 2005 г.

Hi 1 7 0 70

PH Б Русский фонд

2006-4 11613

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Николенко, Юлия Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙIIУ ЭУКАРИОТ.

1.1 РНК-полимераза П.

1.2 Локусы контроля транскрипции генов класса II.

1.3 Базальная транскрипция. Общие факторы транскрипции.

1.4 Специфические факторы транскрипции: активаторы и репрессоры.

1.5 Корегуляторы.

2. ХРОМАТИН.

2.1 Структура хроматина. Модификации гистонов.

2.2 Структурные и биохимические особенности гетерохроматина.

2.3 Гетерохроматин и транскрипция. Эффект положения гена.

2.4 Белковые комплексы, изменяющие структуру хроматина.

3. ЯДЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ.

3.1 Строение и механизмы действия ядерных рецепторов.

3.2 Ядерные рецепторы и гормональная сигнализация у D. melanogaster.

3.3 Корегуляторы ядерных рецепторов.

ОБЪЕКТ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. МАТЕРИАЛЫ.

1.1 Штаммы и вектора S. cerevisiae и Е. coli, использованные в работе.

1.2 Библиотека кДНК.

1.3 Дрожжевые и бактериальные среды.

1.4 Ферменты и реактивы.

1.5 Праймеры.

1.6 Конструкции для анализа активации репортерных генов в дрожжах.

1.7 Конструкции pBait для двухгибридного анализа.

1.8 Конструкция для экспрессии фрагмента белка Нг46 для получения поликлональных антител.

1.9 Конструкции для анализа функций доменов белка SAYP in vivo.

2. МЕТОДЫ.

2.1 Работа с дрожжами. Скрининг библиотеки кДНК в двухгибридной системе.

2.2 Работа с ДНК.

2.3 Работа с белками.

2.4 Работа с D. melanogaster.

2.5 Использованное программное обеспечение.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Изучение роли SAY-домена белка SAYP в активации транскрипции в дрожжах.

2. Изучение влияния белка SAYP на транскрипцию в гетерохроматине.

3. Изучение влияния SAY-домена белка SAYP на выживаемости и активацию транскрипции in vivo.

4. Изучение роли PHD-доменов белка SAYP в репрессии транскрипции в гетерохроматине.

5. Поиск белков, взаимодействующих с SAYP в двухгибридной системе.

6. Подтверждение взаимодействия SAYP и Hr46(DHR3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение функций различных доменов нового транскрипционного коактиватора SAYP (E(y)3) Drosophila melanogaster и поиск взаимодействующих с ним белков"

Реализация наследственной информации клетки является объектом пристального изучения современной науки. Этот сложный многостадийный процесс лежит в основе жизнедеятельности и развития всех живых организмов. Механизмы экспрессии генов активно изучаются с помощью методов молекулярной биологии и генетики. Молекулярный аппарат клетки, осуществляющий чтение и реализацию генетической информации, необычайно сложно устроен. Помимо фундаментального значения, исследования в данной области имеют обширное практическое применение в медицине, фармакологии, биотехнологии, селекции.

Считается, что именно первый этап экспрессии генов - транскрипция - является наиболее важным в регуляции всего процесса. У эукариот различные наборы генов транскрибируются специализированными РНК-полимеразами; гены, кодирующие мРНК, транскрибируются РНК-полимеразой И. Многочисленные исследования показали, что на активацию транскрипции РНК-полимеразой II влияют несколько дискретных, контролируемых процессов: изменение структуры хроматина, изменение локализации гена внутри ядра и привлечение на промотор гена мультибелковых комплексов, активность которых определяется специфическими межмолекулярными взаимодействиями. К настоящему моменту исследовано большое количество разнообразных факторов, формирующих аппарат транскрипции. Выделяют общие факторы транскрипции - консервативные в эволюции белки, необходимые для экспрессии большинства генов, специфические факторы транскрипции (активаторы и репрессоры) и так называемые корегуляторы (коактиваторы и корепрессоры). Последние осуществляют связь между специфическими и общими факторами транскрипции, а также изменяют структуру хроматина (Emerson, 2002).

Большое количество исследований в настоящее время посвящено описанию новых и детальному изучению уже известных факторов транскрипции. Имеющаяся на данный момент картина работы молекулярного аппарата транскрипции постоянно детализируется и корректируется.

В данной работе были изучены функции нового мультидоменного коактиватора транскрипции РНК полимеразы II высших эукариот SAYP (Е(у)З) и проведен поиск взаимодействующих с ним белков. Показано, что SAYP является бифункциональным фактором и участвует в активации транскрипции в эухроматине и репрессии транскрипции в гетерохроматине. Показано, что SAY-домен белка SAYP отвечает за активацию транскрипции в эухроматине, а PHD-домены - за репрессию транскрипции в гетерохроматине. В дрожжевой двухгибридной системе обнаружен ряд белков, взаимодействующих с SAYP, среди них — транскрипционный регулятор Нг46. Взаимодействие SAYP и Нг46 подтверждено при помощи других биохимических и генетических методов. Т.о. в работе изучен новый важный участник процесса регуляции транскрипции высших эукариот.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Николенко, Юлия Владимировна

выводы

1. Показано, что консервативный SAY-домен транскрипционного кофактора SAYP обеспечивает активацию транскрипции репортерных генов в дрожжах.

2. Установлено, что консервативный SAY-домен белка SAYP необходим для жизнеспособности D. melanogaster и участвует в активации транскрипции in vivo.

3. Показано, что SAYP участвует в репрессии транскрипции в гетерохроматине. За репрессию транскрипции отвечают PHD-домены белка.

4. В дрожжевой двухгибридной системе обнаружено взаимодействие белка SAYP с консервативным транскрипционным фактором Hr46(DHR3). Обнаруженное взаимодействие подтверждено другими биохимическими и генетическими методами (гель-фильтрация, иммуноокрашивание на политенных хромосомах, генетический анализ мутантных линий D. melanogaster).

5. Предложена модель, объясняющая участие SAYP в активации и репрессии транскрипции посредством разных консервативных доменов белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Николенко, Юлия Владимировна, Москва

1. Беленькая, Т., Георгиев, П. (1999) Роль генов enhancer of yellow в регуляции экспрессии гена yellow у Drosophila melanogaster, Генетика 35, 432-37.

2. Жимулев, И.Ф. (2002) Общая и молекулярная генетика. Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та: Сиб. унив. изд-во. 459 стр.

3. Карпов B.JI. (2005) От чего зависит судьба гена. Природа, 3, 34-43.

4. Патрушев, Л.И. (2000) Экспрессия генов. М.: Наука. 528 стр.

5. Савина, Н.В., Даливеля, О.В., Никитченко, Н.В., Кужир, Т.Д. (2003) Биологический эффект низких доз алкилирующих агентов на развитие дрозофилы. Цитология. Генетика 37,48-55.

6. Aasland, R., Gibson, Т.J., Stewart, A.F. (1995) The PHD finger: implications for chromatin-mediated transcriptional regulation. Trends Biochem Sci 20, 56-9.

7. Aoyagi, N., Wassarman, D.A. (2000) Genes encoding Drosophila melanogaster RNA polymerase II general transcription factors: diversity in TFIIA and TFIID components contributes to gene-specific transcriptional regulation. J Cell Biol 150, F45-50.

8. Ashburner, M., Chihara, C., Meltzer, P., Richards, G. (1974) Temporal control of puffing activity in polytene chromosomes. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 38, 655-62.

9. Asturias, F.J. (2004) RNA polymerase II structure, and organization of the preinitiation complex. Curr Opin Struct Biol 14,121-9.

10. Bateman, A., et al (2004) The Pfam protein families database. Nucleic Acids Res 32 Database issue, D13 8-41.

11. Becker, P.B., Horz, W. (2002) ATP-dependent nucleosome remodeling. Annu Rev Biochem 71,247-73.

12. Berger, S.L. (2002) Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev 12,142-8.

13. Bialecki, M., Shilton, A., Fichtenberg, C., Segraves, W.A., Thummel, C.S. (2002) Loss of the ecdysteroid-inducible E75A orphan nuclear receptor uncouples molting from metamorphosis in Drosophila. Dev Cell 3,209-20.

14. Boube, M., Faucher, C., Joulia, L., Cribbs, D.L., Bourbon, H.M. (2000) Drosophila homologs of transcriptional mediator complex subunits are required for adult cell and segment identity specification. Genes Dev 14, 2906-17.

15. Bushmeyer, S., Park, K., Atchison, M.L. (1995) Characterization of functional domains within the multifunctional transcription factor, YY1. J Biol Chem 270,30213-20.

16. Capili, A.D., Schultz, D.C., Rauscherlll, F.J., Borden, K.L. (2001) Solution structure of the PHD domain from the KAP-1 corepressor: structural determinants for PHD, RING and LIM zinc-binding domains. EMBOJ. 20, 165-77.

17. Carney, G.E., Wade, A.A., Sapra, R., Goldstein, E.S., Bender, M. (1997) DHR3, an ecdysone-inducible early-late gene encoding a Drosophila nuclear receptor, is required for embryogenesis. Proc Natl Acad Sci USA 94,12024-9.

18. Carey, M., Smale, S.T. (2000) Transcriptional regulation in eucaryotes. N. Y.: CSHL Press, 640 pp.

19. Champagne, N., Bertos, N.R., Pelletier, N., Wang, A.H., Vezmar, M., Yang, Y., Heng, H.H., Yang, X.J. (1999) Identification of a human histone acetyltransferase related to monocytic leukemia zinc finger protein. J Biol Chem 274,28528-36.

20. Chawla, A., Repa, J.J., Evans, R.M., Mangelsdorf, D.J. (2001) Nuclear receptors and lipid physiology: opening the X-files. Science 294,1866-70.

21. Chen, B.S., Hampsey, M. (2002) Transcription activation: unveiling the essential nature of TFiro. Curr Biol 12, R620-2.

22. Corona, D.F., Tamkun, J.W. (2004) Multiple roles for ISWI in transcription, chromosome organization and DNA replication. Biochim Biophys Acta 1677, 113-9.

23. Cryderman, D.E., Cuaycong, M.H., Elgin, S.C., Wallrath, L.L. (1998) Characterization of sequences associated with position-effect variegation at pericentric sites in Drosophila heterochromatin. Chromosoma 107,277-285.

24. Cryderman, D.E., Morris, E.J., Biessmann, H., Elgin, S.C., Wallrath, L.L. (1999) Silencing at Drosophila telomeres: nuclear organization and chromatin structure play critical roles. EMBOJ. 18,3724-3735.

25. Detich, N., Bovenzi, V., Szyf, M. (2003) Valproate induces replication-independent active DNA demethylation. J Biol Chem 278, 27586-92.

26. Dimova, D., Nackerdien, Z., Furgeson, S., Eguchi, S., Osley, M.A. (1999) A role for transcriptional repressors in targeting the yeast Swi/Snf complex. Mol Cell 4, 75-83.

27. DiRenzo, J., Shang, Y., Phelan, M., Sif, S., Myers, M., Kingston, R., Brown, M. (2000) BRG-1 is recruited to estrogen-responsive promoters and cooperates with factors involved in histone acetylation. Mol Cell Biol 20, 7541-9.

28. Eberharter, A., Becker, P.B. (2002) Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. Second in review series on chromatin dynamics. EMBO Rep 3, 224-9.

29. Eissenberg, J.C., Elgin, S.C. (2000) The HP1 protein family: getting a grip on chromatin. Curr Opin Genet Dev 10, 204-10.

30. Emerson, B.M. (2002) Specificity of gene regulation. Cell 109,267-70.

31. Fazzio, T.G., Kooperberg, C., Goldmark, J.P., Neal, C., Basom, R., Delrow, J., Tsukiyama, T. (2001) Widespread collaboration of Isw2 and Sin3-Rpd3 chromatin remodeling complexes in transcriptional repression. Mol Cell Biol 21, 6450-60.

32. Featherstone, M. (2002) Coactivators in transcription initiation: here are your orders. Curr Opin Genet Dev 12,149-55.

33. Georgiev, P.G. (1994) Identification of mutations in three genes that interact with zeste in the control of white gene expression in Drosophila melanogaster.Gewer/cs 138, 733-9.

34. Georgiev, P.G., Gerasimova, T.I. (1989) Novel genes influencing the expression of the yellow locus and mdg4 (gypsy) in Drosophila melanogaster. Mol. Gen. Genet. 220, 121126.

35. Georgiev, P.G., Kiselev, S.L., Simonova, O.B., Gerasimova, T.I. (1990) A novel transposition system in Drosophila melanogaster depending on the Stalker mobile genetic element. EMBO J 9, 2037-2044.

36. Golic, K.G., Golic, M.M. (1996) Engineering the Drosophila genome: chromosome rearrangements by design. Genetics 144,1693-711.

37. Gotzmann J, Foisner R. (1999) Lamins and lamin-binding proteins in functional chromatin organization. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 9,257-65.

38. Gozani, O., et al (2003) The PHD finger of the chromatin-associated protein ING2 functions as a nuclear phosphoinositide receptor. Cell 114,99-111.

39. Green, M.R. (2000) TBP-associated factors (TAFIIs): multiple, selective transcriptional mediators in common complexes. Trends Biochem Sci 25, 59-63.

40. Grunstein, M. (1992) Histones as regulators of genes. Sci Am 267,68-74B.

41. Gu, J.Y., Park, J.M., Song, E.J., Mizuguchi, G., Yoon, J.H., Kim-Ha, J., Lee, K.J., Kim, Y.J. (2002) Novel Mediator proteins of the small Mediator complex in Drosophila SL2 cells. J Biol Chem 277, 27154-61.

42. Hall, I.M., Shankaranarayana, G.D., Noma, K., Ayoub, N., Cohen, A., Grewal, S.I. (2002) Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297,2232-7.

43. Henikoff, S., Comai, L. (1998) A DNA methyltransferase homolog with a chromodomain exists in multiple polymorphic forms in Arabidopsis. Genetics 149,307-18.

44. Henry, K.W., et al (2003) Transcriptional activation via sequential histone H2B ubiquitylation and deubiquitylation, mediated by SAGA-associated Ubp8. Genes Dev 17, 2648-63.

45. Holstege, F.C., Jennings, E.G., Wyrick, J.J., Lee, T.I., Hengartner, C.J., Green, M.R., Golub, T.R., Lander, E.S., Young, R.A. (1998) Dissecting the regulatory circuitry of a eukaryotic genome. Cell 95, 717-28.

46. Huet, F., Ruiz, C., Richards, G. (1995) Sequential gene activation by ecdysone in Drosophila melanogaster: the hierarchical equivalence of early and early late genes. Development 121, 1195-204.

47. Huisinga, K.L., Pugh, B.F. (2004) A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell 13, 573- 9.

48. Hur, E., Pfaff, S.J., Payne, E.S., Gron, H., Buehrer, B.M., Fletterick, R.J. (2004) Recognition and accommodation at the androgen receptor coactivator binding interface. PLoS Biol 2, E274.

49. Ito, M., Yuan, C.X., Okano, H.J., Darnell, R.B., Roeder, R.G. (2000) Involvement of the TRAP220 component of the TRAP/SMCC coactivator complex in embryonic development and thyroid hormone action. Mol Cell 5, 683-93.

50. Jacobs SA, Taverna SD, Zhang Y, Briggs SD, Li J, Eissenberg JC, Allis CD, Khorasanizadeh S. (2001) Specificity of the HP1 chromo domain for the methylated N-terminus of histone H3. EMBOJ20, 5232-5241.

51. Jenuwein, Т., Allis, C.D. (2001) Translating the histone code. Science 293,1074-80

52. Jones DO, Cowell IG, Singh PB. (2000) Mammalian chromodomain proteins: their role in genome organisation and expression. Bioessays 22,124-37.

53. Kadonaga, J.T. (2004) Regulation of RNA polymerase II transcription by sequence-specific DNA binding factors. Cell 116,247-57.

54. Kaiser, K., Meisterernst, M. (1996 ) The human general co-factors. Trends Biochem Sci 21, 342-5.

55. Kelly, W.G., Fire, A. (1998) Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans. Development 125, 2451-6.

56. Ketel, C.S., Fang, J., Miller, E.L., Zhang, Y., Simon, J.A. (2003) Analysis of histone methyltransferases in Drosophila. A. Dros. Res. Conf. 44, 211 A.

57. King-Jones, K., Thummel, C.S. (2005) Nuclear receptors a perspective from Drosophila. Nat Rev Genet 6,311-23.

58. Koelle, M.R., Segraves, W.A., Hogness, D.S. (1992) DHR3: a Drosophila steroid receptor homolog. Proc Natl Acad Sci USA 89, 6167-71.

59. Kouzarides, T. (2003) Wellcome Trust Award Lecture. Chromatin-modifying enzymes in transcription and cancer. Biochem Soc Trans 31, 741-3.

60. Kozlova, Т., Thummel, C.S. (2002) Spatial patterns of ecdysteroid receptor activation during the onset of Drosophila metamorphosis. Development 129,1739-50.

61. Kurdistani, S.K., Grunstein, M. (2003) Histone acetylation and deacetylation in yeast. Nat Rev Mol Cell Biol 4,276-84.

62. Kusch, Т., Guelman, S., Abmayr, S.M., Workman, J.L. ( 2003) Two Drosophila Ada2 homologues function in different multiprotein complexes. Mol Cell Biol 23, 3305-19.

63. Kwan, A.H., Gell, D.A., Verger, A., Crossley, M., Matthews, J.M., Mackay, J.P. (2003) Engineering a protein scaffold from a PHD finger. Structure (Camb) 11, 803-13.

64. Lam, G.T., Jiang, C., Thummel, C.S. (1997) Coordination of larval and prepupal gene expression by the DHR3 orphan receptor during Drosophila metamorphosis. Development 124, 1757-69.

65. Lam, G., Hall, B.L., Bender, M., Thummel, C.S. (1999) DHR3 is required for the prepupal-pupal transition and differentiation of adult structures during Drosophila metamorphosis. Dev Biol 212,204-16.

66. Lee, J.E., Kim, K., Sacchettini, J.C., Smith, C.V., Safe, S. (2005) DRIP150 coactivation of estrogen receptor alpha in ZR-75 breast cancer cells is independent of LXXLL motifs. J Biol Chem 280,8819-30.

67. Lemon, В., Tjian, R. (2000) Orchestrated response: a symphony of transcription factors for gene control. Genes Dev 14,2551-69.

68. Levine, M., Tjian, R. (2003) Transcription regulation and animal diversity. Nature 424, 147-51.

69. Leresche, A., Wolf, V.J., Gottesfeld, J.M. (1996) Repression of RNA polymerase II and III transcription during M phase of the cell cycle. Exp Cell Res 229,282-8.

70. Lewis, B.A., Reinberg, D. (2003) The mediator coactivator complex: functional and physical roles in transcriptional regulation. J Cell Sci 116, 3667-75.

71. Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C.A., Krieger, M., Scott, M.P., Zipursky, L., and Darnell, J. (2004) Molecular Cell Biology, 5th ed. N. Y.: W.H.Freeman, 973 pp.

72. Lu, B.Y., Emtage, P.C., Duyf, B.J., Hilliker, A.J., Eissenberg, J.C. (2000) Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics 155,699-708.

73. Luger, K., Mader, A.W., Richmond, R.K., Sargent, D.F., Richmond, T.J. (1997) Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 389,251-60.

74. Lusser, A., Kadonaga, J.T. (2003) Chromatin remodeling by ATP-dependent molecular machines. Bioessays 25,1192-200.

75. Majello, В., De Luca, P., Lania, L. (1997) Sp3 is a bifunctional transcription regulator with modular independent activation and repression domains. J Biol Chem 272,4021-6.

76. Maldonado, E., Hampsey, M., Reinberg, D. (1999) Repression: targeting the heart of the matter. Cell 99,455-8.

77. McKenna, N.J., Lanz, R.B., O'Malley, B.W. (1999) Nuclear receptor coregulators: cellular and molecular biology. Endocr Rev 20, 321-44.

78. McKenna, N.J., O'Malley, B.W. (2002) Minireview: nuclear receptor coactivators~an update. Endocrinology 143, 2461-5.

79. Miller, J. H. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory Press, p 74.

80. Morales V, Giamarchi C, Chailleux C, Moro F, Marsaud V, Le Ricousse S, Richard-Foy H. (2001) Chromatin structure and dynamics: functional implications. Biochimie 83, 102939. Review.

81. Morris, J.R., Geyer, P.K., Wu, C.T. (1999) Core promoter elements can regulate transcription on a separate chromosome in trans. Genes Dev 13, 253-8.

82. Muller, F., Tora, L. (2004) The multicoloured world of promoter recognition complexes. EMBOJ 23,2-8.

83. Myers, L.C., Gustafsson, C.M., Bushnell, D.A., Lui, M., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Romberg, R.D. (1998) The Med proteins of yeast and their function through the RNA polymerase II carboxy-terminal domain. Genes Dev 12,45-54.

84. Naar, A.M., Lemon, B.D., Tjian, R. (2001) Transcriptional coactivator complexes. Annu Rev Biochem 70,475-501.

85. Narlikar, G.J., Fan, H.Y., Kingston, R.E. (2002) Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription. Cell 108,475-87.

86. Nedialkov, Y.A., Triezenberg, S.J. (2004) Quantitative assessment of in vitro interactions implicates TATA-binding protein as a target of the VP16C transcriptional activation region. Arch Biochem Biophys 425, 77-86.

87. Nikolov, D.B., Burley, S.K. (1997) RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proc Natl Acad Sci USA 94, 15-22.

88. Noma K, Allis C.D, Grewal S.I. (2001) Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293, 1150-1155.

89. Pal-Bhadra, M., Leibovitch, B.A., Gandhi, S.G., Rao, M., Bhadra, U., Birchler, J.A., Elgin, S.C. (2004) Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303,669-72.

90. Pascual, J., Martinez-Yamout, M., Dyson, H.J., Wright, P.E. (2000) Structure of the PHD zinc finger from human Williams-Beuren syndrome transcription factor. J Mol Biol 304, 723-9.

91. Piacentini, L., Fanti, L., Berloco, M., Perrini, В., Pimpinelli, S. (2003) Heterochromatin protein 1 (HP1) is associated with induced gene expression in Drosophila euchromatin. J Cell Biol 161, 707-14.

92. Orphanides, G., Lagrange, Т., Reinberg, D. (1996) The general transcription factors of RNA polymerase II. Genes Dev 10, 2657-83.

93. Orphanides, G., Reinberg, D. (2002 ) A unified theory of gene expression. Cell 108, 43951.

94. Ragvin, A., et al. (2004) Nucleosome binding by the bromodomain and PHD finger of the transcriptional cofactor p300. J Mol Biol 337, 773-88.

95. Rebhan, M., Chalifa-Caspi, V., Prilusky, J., Lancet, D. (1997) GeneCards: encyclopedia for genes, proteins and diseases. Weizmann Institute of Science, Bioinformatics Unit and Genome Center (Rehovot, Israel). GeneCard for PHF10 (2003).

96. Rekdal, C., Sjottem, E., Johansen, T. (2000) The nuclear factor SPBP contains different functional domains and stimulates the activity of various transcriptional activators. J Biol Chem 275,40288-300.

97. Richards, E.J., Elgin, S.C. (2002) Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects. Cell 108, 489-500.

98. Rochette-Egly, C., Adam, S., Rossignol, M., Egly, J.M., Chambon, P. (1997) Stimulation of RAR alpha activation function AF-1 through binding to the general transcription factor TFIIH and phosphorylation by CDK7. Cell 90, 97-107.

99. Roeder, R.G. (1996) The role of general initiation factors in transcription by RNA polymerase II. Trends Biochem Sci 21, 327-35.

100. Rouleau, M., Aubin, R.A., Poirier, G.G. (2004) Poly(ADP-ribosyl)ated chromatin domains: access granted. J Cell Sci 117, 815-25.

101. Sandaltzopoulos, R., Quivy, J.P., Becker P.B. (1995) Analysis of protein/DNA interactions by solid-phase footprinting. Methods Mol. Cell. Biol. 5,176-181.

102. Sanglier, S., Bourguet, W., Germain, P., Chavant, V., Moras, D., Gronemeyer, H., Potier, N., Van Dorsselaer, A. (2004) Monitoring ligand-mediated nuclear receptor-coregulator interactions by noncovalent mass spectrometry. Eur J Biochem 271, 4958-67.

103. Sauer, F., Fondell, J.D., Ohkuma, Y., Roeder, R.G., Jackie, H. (1995) Control of transcription by Kruppel through interactions with TFIIB and TFIIE beta. Nature 375, 162-4.

104. Segraves, W.A., Hogness, D.S. (1990) The E75 ecdysone-inducible gene responsible for the 75B early puff in Drosophila encodes two new members of the steroid receptor superfamily. Genes Dev 4,204-19.

105. Selker, E.U., Freitag, M., Kothe, G.O., Margolin, B.S., Rountree, M.R., Allis, C.D., Tamaru, H. (2002) Induction and maintenance of nonsymmetrical DNA methylation in Neurospora. Proc Natl Acad Sci USA 99 Suppl 4, 16485-90.

106. Shamay, M., Barak, O., Shaul, Y. (2002) HBXAP, a novel PHD-finger protein, possesses transcription repression activity. Genomics 19, 523-9.

107. Shidlovskii, Y.V., Krasnov, A.N., Nikolenko, J.V., Lebedeva, L.A., Kopantseva, M., Ermolaeva, M.A., Ilyin, Y.V., Nabirochkina, E.N., Georgiev, P.G., Georgieva, S.G. (2005)

108. A novel multidomain transcription coactivator SAYP can also repress transcription in heterochromatin. EMBO J. 24, 97-107.

109. Shimono, Y., Murakami, H., Kawai, K., Wade, P.A., Shimokata, K., Takahashi, M. (2003) Mi-2 beta associates with BRG1 and RET finger protein at the distinct regions with transcriptional activating and repressing abilities. J Biol Chem 278, 51638-45.

110. Schubiger, M., Truman, J.W. (2000) The RXR ortholog USP suppresses early metamorphic processes in Drosophila in the absence of ecdysteroids. Development 127, 1151-9.

111. Smale, S.T., Kadonaga, J.T. (2003) The RNA polymerase II core promoter. Annu Rev Biochem 72, 449-79.

112. Soldatov, A., Nabirochkina E., Georgieva S. Belenkaja T, Georgiev P. (1999) TAFII40 protein is encoded by the e(y)l gene: biological consequences of mutations. Mol Cell Biol 19, 3769-78.

113. Sterner, D.E., Berger, S.L. (2000) Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiol Mol Biol Rev 64, 435-59.

114. Sun, F.L., Cuaycong, M.H., Craig, C.A., Wallrath, L.L., Locke, J., Elgin, S.C. (2000) The fourth chromosome of Drosophila melanogaster: interspersed euchromatic and heterochromatic domains. Proc Natl Acad Sci USA97,5340-5.

115. Sun, F.L., Haynes, K., Simpson, C.L., Lee, S.D., Collins, L., Wuller, J., Eissenberg, J.C., Elgin, S.C. (2004) cis-Acting determinants of heterochromatin formation on Drosophila melanogaster chromosome four. Mol Cell Biol 24, 8210-20.

116. Svejstrup, J.Q. (2004) The RNA polymerase II transcription cycle: cycling through chromatin. Biochim Biophys Acta 1677,64-73.

117. Syntichaki, P., Topalidou, I., Thireos, G. (2000) The Gcn5 bromodomain co-ordinates nucleosome remodelling. Nature 404,414-7.

118. Taatjes, D.J., Naar, A.M., Andel, F. 3rd, Nogales, E., Tjian, R. (2002) Structure, function, and activator-induced conformations of the CRSP coactivator. Science 295,1058-62.

119. Takeyama, K., Masuhiro, Y., Fuse, H., Endoh, H., Murayama, A., Kitanaka, S., Suzawa, M., Yanagisawa, J., Kato, S. (1999) Selective interaction of vitamin D receptor with transcriptional coactivators by a vitamin D analog. Mol Cell Biol 19, 1049-55.

120. Thiagalingam, S., Cheng, K.H., Lee, H.J., Mineva, N., Thiagalingam, A., Ponte, J.F. (2003) Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code. Ann N YAcad Sci 983, 84-100.

121. Thornton, J.W. (2003) Nonmammalian nuclear receptors: evolution and endocrine disruption. Pure Appl Chem 75,1827-1839.

122. Tsukiyama, T. (2002) The in vivo functions of ATP-dependent chromatin-remodelling factors. Nat Rev Mol Cell Biol 3,422-9.

123. Tupler, R., Perini, G., Green, M.R. (2001) Expressing the human genome. Nature 409, 832-3.

124. Veenstra, G.J., Wolffe, A.P. (2001 ) Gene-selective developmental roles of general transcription factors. Trends Biochem Sci 26, 665-71.

125. Verrijzer, C.P., Chen, J.L., Yokomori, K., Tjian, R. (1995) Binding of TAFs to core elements directs promoter selectivity by RNA polymerase II. Cell 81,1115-25.

126. Verrijzer, C.P., Tjian, R. (1996) TAFs mediate transcriptional activation and promoter selectivity. Trends Bioch em Sci 21,338-42.

127. Vignali, M., Hassan, A.H., Neely, K.E., Workman, J.L. (2000) ATP-dependent chromatin-remodeling complexes. Mol Cell Biol 20, 1899-910.

128. Wallrath, L.L., Elgin, S.C. (1995) Position effect variegation in Drosophila is associated with an altered chromatin structure. Genes Dev 9, 1263-1277.

129. Wallrath, L.L. (1998) Unfolding the mysteries of heterochromatin. Curr Opin Genet Dev 8,147-53.

130. Wanker, E.E., Rovira, С., Scherzinger, E., Hasenbank, R., Walter, S., Tait, D., Colicelli, J., Lehrach, H. (1997) HIP-I: a huntingtin interacting protein isolated by the yeast two-hybrid system. Hum. Mol. Genet. 6,487-495.

131. Wassarman, D.A., Aoyagi, N. Pile, L.A., Schlag, E.M. (2000) TAF250 is required for multiple developmental events in Drosophila. Proc Natl Acad Sci US A 97, 1154-9.

132. Weiler, K.S., Wakimoto, B.T. (1995) Heterochromatin and gene expression in Drosophila. Annu Rev Genet. 29, 577 605.

133. White, K.P., Hurban, P., Watanabe, Т., Hogness, D.S. (1997) Coordination of Drosophila metamorphosis by two ecdysone-induced nuclear receptors. Science 276,114-7.

134. Woychik, N.A., Hampsey, M. (2002) The RNA polymerase II machinery: structure illuminates function. Cell 108,453-63.

135. Yao, T.P., Forman, B.M., Jiang, Z., Cherbas, L., Chen, J.D., McKeown, M., Cherbas, P., Evans, R.M. (1993) Functional ecdysone receptor is the product of EcR and Ultraspiracle genes. Nature 366,476-9.

136. Zhang, Y. (2003) Transcriptional regulation by histone ubiquitination and deubiquitination. Genes Dev 17,2733-40.

137. Zheng, C., Brownlie, R., Babiuk, L.A., van Drunen Littel-van den Hurk, S. (2004) Characterization of nuclear localization and export signals of the major tegument protein VP8 of bovine herpesvirus-1. Virology 324, 327-39.