Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы активации транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой II

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Механизмы активации транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой II"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4

Набирочкина Елена Николаевна

Механизмы активации транскрипции, осуществляемой РНК-пол имеразой П

03.00.26 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Института биологии гена РАН.

Научный консультант:

доктор биологических наук Георгиева С.Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАН Жимулев И.Ф.

доктор биологических наук, профессор Крамеров Д.А.

доктор биологических наук, профессор Шпаковский Г.В.

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится Ь апреля 2006 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.37.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан марта 2006 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат фармацевтических наук _ Грабовская Л.С.

löOQ Д AlZG

I. Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Одним из важнейших молекулярно-биологических процессов является транскрипция, которая представляет собой первый этап реализации генетической информации. В связи с этим изучение транскрипции у эукариот является одной из главных проблем молекулярной генетики. В настоящее время факторы транскрипции принято делить на три большие группы: активаторы и репрессоры (специфичные регуляторы), корегуляторы и общие факторы транскрипции (General Transcription Factors, GTT7). Назначение первых - контроль работы определенного гена или группы генов на определенной стадии развития или при наличии определенных сигналов. Корегуляторы связываются с энхансерами и затем вовлекают GTF, которые необходимы для транскрипции всех генов. Общие факторы транскрипции представляют собой белки и комплексы, участвующие в транскрипции большинства генов. В частности, в области промотора собирается большой преинициаторный комплекс, в свою очередь состоящий из нескольких мультибелковых комплексов, основным из которых является комплекс TFIID. TFIID-комплекс содержит в своем составе белок ТВР и ассоциированные с ним белки TAF (ТВР associated factors). TAF-белки условно подразделяют на основные компоненты TFIID, присутствующие в каждом комплексе, и на TAF, которые входят в состав только части комплексов TFIID, участвуя в регуляции транскрипции определенных групп генов. Наконец, некоторые TAF присутствуют и в других белковых комплексах, помимо TFIID.

Белки-регуляторы транскрипции (транскрипционные факторы) исключительно важны для жизнедеятельности организма. Это подтверждает тот факт, что более 5 % генов высших эукариот кодирует транскрипционные факторы. У дрожжей их количество составляет около 300 (в среднем один фактор на 20 генов), у дрозофилы - 1000 (один фактор на 14 генов), у человека - около 3000 (один фактор на 10 генов).

Ядро клетки высших эукариот содержит нескольких десятков тысяч структурных генов, каждый из которых обладает определенным набором цис-регуляторных последовательностей, определяющих его функционирование на различных этапах развития организма, в определенных условиях внешней и внутренней среды. Аппарат транскрипции, обеспечивающий функционирование подобной сложной системы, представляется в настоящее время как чрезвычайно сложная многоуровневая система взаимодействующих факторов и их комплексов, тесно интегрированная с другими системами клетки. Однако механизмы действия аппарата транскрипции in vivo до сих пор остаются во многом неизученным, в частности, очень мало известно о деталях механизма активации и репрессии

конкретных генов.

ДНК эукариот упакована в хроматин, который препятствует взаимодействию транскрипционных факторов с ДНК и тем самым блокирует транскрипцию генов. В клетке имеется целый ряд комплексов, которые, изменяя структуру хроматина, участвуют в регуляции транскрипции. Такие комплексы можно подразделить на две основные группы: АТФ-зависимые комплексы, локально изменяющие физическую структуру хроматина (ремоделирующие комплексы) и комплексы, осуществляющие различные химические модификации N-концов гистонов (модифицирующие комплексы).

В общем случае для инициации транскрипции необходимы модификация и ремоделирование хроматина в области промотора и регуляторных последовательностей, что обеспечивает доступность ДНК-матрицы для основных факторов транскрипции и разнообразных активаторов.

Ацетилирование высоко консервативных N-концов гистонов гистонацетилтрансферазами (Histone Acethyl Transferase, HAT) является одной из наиболее хорошо изученных модификаций.

Существуют две теории, объясняющие, как ацетилирование гистонов может влиять на активность транскрипции. Первая теория предполагает, что ацетилирование нейтрализует положительный заряд гистонов, ослабляя таким образом их взаимодействие с ДНК и делая хроматин более «рыхлым», а ДНК - доступной для транскрипционных факторов. Вторая гипотеза не исключает первую, но предполагает также, что существует «гистоновый код» и рисунок ацетилирования может служить эпигенетическим маркером для экспрессии гена, создавая сайты узнавания для факторов, вовлеченных как в активацию, так и в репрессию транскрипции.

Результаты многочисленных исследования продемонстрировали прямую связь между ацетилированием гистонов и активацией транскрипции. Таким образом, исследование белков и комплексов, обладающих HAT активностью, имеет большое значения для понимания процессов, проходящих при активации транскрипции у эукариот.

Одним из наиболее хорошо изученных комплексов является SAGA-комплекс дрожжей, содержащий в своем составе гиетонацетилтрансферазу GCN5 (GCN5 HAT), белки Ada, Spt, а также некоторые из белков TAF, которые, как было указано выше, одновременно являются компонентами TFIID - основного преинициаторного комплекса. Комплекс, содержащий GCN5 HAT (TFTC), был охарактеризован у человека. Недавно были получены данные, что GCN5 НАТ-комплекс, подобный TFTC существует и у дрозофилы.

Настоящая работа посвящена изучению факторов транскрипции РНК-полимеразы II и характеристике TFTC комплекса у Drosophila melanogasler.

Цель и задачи исследования

Основной целью работы являлось изучение структуры и механизмов действия факторов транскрипции РНК-полимеразы II у Drosophila melanogaster, а также выявление комплексов, в которые они входят. В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1) клонировать и изучить структуру гена enhancer of yellow 1 (е(у)1), а также белок, кодируемый этим геном;

2) изучить in vivo действие мутаций t(y)l"', e(y)lri;

3) выявить домены, ответственные за функции транскрипционного фактора TAF9;

4) охарактеризовать новые белки Drosophila melanogaster, ADA2a и ADA2b, являющиеся гомологами адапторного белка ADA2 Saccharomyces cerevisiae - компонента GCN5 НАТ-содержащего комплекса дрожжей;

5) выяснить, являются ли ADA2a и ADA2b компонентами GCN5 НАТ-содержащего комплекса Drosophila melanogaster, выделить и охарактеризовать данный комплекс;

6) клонировать и изучить структуру гена enhancer of yellow 3 (е(у)3), а также белок, кодируемый этим геном;

7) изучить in vivo действие мутаций е(у)3"' и е(у)3';

8) определить, какие домены ответственны за функции нового транскрипционного фактора SAYP;

Научная новизна и практическая ценность работы

Впервые клонирован и изучен ген enchancer of yellow I (e(y)l), участвующий в организации взаимодействия между энхансерами и промоторами у Drosophila melanogaster. Показано, что е(у)1 кодирует общий фактор транскрипции эукариот TAF9, входящий в состав TFIID, основного преинициаторного комплекса РНК полимеразы II. Ген е(у)1 транскрибируется на всех стадиях развития и во всех клетках дрозофилы, однако, наиболее активно - в трофоцитах и является геном с материнским эффектом. Впервые с помощью мутаций по гену e(y)l/taf9 проведено исследование in vivo последствий мутации одного из компонентов комплекса TFIID. Показано, что даже четырехкратное снижение уровня транскрипции гена e(y)l/taf9 приводит к нарушению оогенеза и стерильности самок дрозофилы, а ингибирование экспрессии гена e(y)l/tafl летально для организма.

Изучена стадие- и тканеспецифичность экспрессии гена dd4 D melanogaster, гомолога гена d4. Ген d4 позвоночных кодирует транскрипционный фактор, спефичный для нервной системы. Показано, что ген dd4 транскрибируется во многих тканях дрозофилы. Самый

высокий уровень содрежания мРНК dd4 детектируется в эмбрионах и репродуктивной системе самок (трофоцитах, в первичных и зрелых ооцитах).

Клонирован ген enchancer of yellow 3 (е(у)3) D. melanogaster и охарактеризован его белковый продукт, названный SAYP. Показано, что этот новый, повсеместно экспрессирующийся, эволюционно консервативный мультидоменный белок незаменим в развитии. Инактивация гена е(у)3 приводит к гибели эмбрионов на ранней стадии развития. Гомологи SAYP были обнаружены у разных организмов, в том числе и у человека. SAYP содержит PHD домены и новый эволюционно консервативный домен SAY. Установлено, что SAY-домен участвует в активации транскрипции генов эухроматина. Кроме того, белок SAYP был обнаружен в районах гетерохроматина на политенных хромосомах D melanogaster. Генетически методами показано, что SAYP участвует в подавлении транскрипции генов, расположенных в гетерохроматине. За репрессию генов в гетерохроматине отвечают PHD домены, расположенные на С-конце белка. Таким образом, SAYP обладает двумя противоположными функциями, за которые отвечают его различные домены. Предложена модель, объясняющая механизм действия различных доменов SAYP в активации и репрессии транскрипции. Показано, что SAYP является компонентом мультибелкового комплекса. Профиль элюции SAYP значительно перекрывается с профилем элюции компонентов TFIID и GCN5 НАТ-содержащего комплексов.

Обнаружены и охарактеризованы два новых белка ADA2a и ADA2b, являющиеся гомологами ADA2 дрожжей. Показано, что эти гомологи ADA2 присутствуют в различных GCN5 НАТ-содержащих мультибелковых комплексах, которые могут участвовать в транскрипции различных геномных локусов. Впервые охарактеризованы GCN5 НАТ-содержащие комплексы Drosophila melanogaster и показано, что они гетерогенны по своему составу.

Решение многих фундаментальных и прикладных проблем современной биологии требует знания общих принципов организации и функционирования генетического аппарата. Это имеет большое значение не только для решения теоретических проблем, но и является основой практических разработок (например, в онкологии). Ген ALLI человека является одним из гомологов е(у)3. Структурные нарушения этого гена были обнаружены при некоторых формах лейкоза. Также известно, что TAF9 взаимодействует с опухолевым супрессором р53. Следовательно, изучение генов e(y)l/taJ9 и е(у)3 и их белковых продуктов, возможно, будет иметь применение в медицине.

Кроме того, в представленной работе разработан быстрый и удобный способ получения перекрывающихся фрагментов ДНК для последующего секвенирования

Также в работе предложен простой способ значительного повышения уровня экспрессии генов, находящихся под контролем цитомегаловирусного раннего промотор/энхансера (CMV) в трансформированных клетках. Показано, что обработка клеточной культуры метилметансульфонатом (MMS) повышает уровень транскрипции на два порядка. Описанный метод может найти практическое применение во многих системах, в которых CMV-промотор используют для максимальной экспрессии трансгенных белков.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. "Mechanism of transcription" (Cold Spring Harbor, 1998), симпозиум "Current problems of molecular genetics and cell biology" (Moscow, 2000), П1 съезд биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), конференция "Molecular genetics of eukaryotes" (Moscow, 2003), конференция "Advances in molecular cell biology" (Moscow, 2004), конференция "6th EMBL Transcription Meeting EMBL» (Heidelberg, 2004), EMBO/FEBS Conference on nuclear structure and dynamics (La Grande Motte, 2005)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 27 печатных работ, из которых 19 статей в российских и международных журналах и 8 тезисов докладов и материалов конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 228 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, объект и задачи исследования, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Диссертация содержит 35 рисунков и 4 таблицы. Библиография включает 389 ссылок.

П. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ПЛ. Характеристика гена е(у)l/taf9, его мутантных аллелей и белка, кодируемого геном e(y)l/tqf9

Клонирование гена е(у)1 и определение его структуры

В данной работе был клонирован новый ген е(у)1, найденный ранее методами классической генетики. Для клонирования гена был использован его мутантного аллель, вызванный внедрением мобильного элемента Сталкер. Однако, поскольку в геноме мутантной линии содержалось примерно 35 копий данного мобильного элемента,

клонирование гена представлялось достаточно трудной задачей. Для этого был разработан специальный подход, который был успешно применен, как для клонирования гена е(у)1, так и для клонирования гена е(у)3 (описание метода - в диссертации). Далее была клонирована кДНК гена е(у)1. Методом Нозерн гибридизации в линии дикого типа был обнаружен один транскрипт, длиной 1200 нт (Рис.1) соответствующий гену е(у)1.

Рис. 1. Анализ транскрипции гена е(у)1 в нормальном е(у)1* и мутантном аллеле е(у)1"'. Нозерн блот-гибридизация фрагмента показанного на (Рис.2,А) с мРНК из: самцов Oregon R (1), эмбрионов Oregon R (2), самцов e(y)l"'/Y (3), самок е(у)Г'/е(у)1"' (4), самок е(у)1"'/е(у)1* (5), эмбрионов из потомства от скрещивания 9 е(у)1и'/е(у)Г 3 e(y)l"'/Y (6), C(I)RM, yf самок (7), эмбрионов из потомства от скрещивания $ C(1)RM, yf х ¿e(y)I"'/Y (8). Ниже показан тот же блот, гибридизованный с Ras2 зондом и относительный уровень транскрипции аллелей мутантного и дикого типа. Сигналы нормализованы относительно уровня гибридизации Ras2. Уровень транскрипции самцов у e(y)l"'/Yпринят за 1.

Было получено несколько кДНК клонов гена е(у)1. Один из них соответствовал полноразмерному транскрипту е(у)1. Сравнение последовательностей геномной копии и кДНК позволило установить экзон-интронную структуру гена е(у)1. Он содержит два экзона и кодирует белок, содержащий 278 аминокислотных остатков (Рис. 2, А).

Поиск в базе данных показал, что белок является общим транскрипционным фактором TAF9 (TAF//40 согласно прежней номенклатуре) Ген taß клонирован нами впервые.

Для того, чтобы доказать, что нарушение функции клонированного гена действительно является причиной возникновения мутации е(у)Г', геномный район, содержащий промоторную и кодирующую область e(y)ltaß (Рис. 2, А), был встроен в вектор CaSpeR3. Полученная конструкция была введена в мутантную линию y*w е(у)1"'

Восстановление дикого фенотипа произошло в пяти независимо полученных трансгенных линияхy2w е(у)1"' P{w+, е(у)Г}.

1 2 3 4 5 6 7 8

1400 нт 1200 нт

е(у)Г'

е(у)1' 2.5 3.2

1.0 1.1 0.5 0.2 0.3 2.0 1.5 3.7 2.8

Тем самым было показано, что клонированный ген действительно является геном е(у)1. Таким образом, ген е(у)1 кодирует транскрипционный фактор TAF9.

Мутация е(у)1и' является первой изолированной мутацией данного гена. Более того, ранее у высших эукариот не было изолировано ни одной мутации генов, кодирующих ТВР и ассоциированные с ним факторы (TAF). Мутации в генах, кодирующих важные транскрипционные факторы, зачастую летальны на ранних стадиях развития, что затрудняет использование мутаций для изучения транскрипционных факторов. Полученная мутация давала возможность изучить функции TAF9 in vivo. Для этого на первой стадии нами был изучен паттерн экспрессии гена и молекулярная природа изолированной мутации.

1Дтин

*<У» 1Лтпн

0.1 тли

НХН

^элемент

UÍ

е(у)1

J е(у)1*

е(у)1

pi

.. SGSGAGSASGGGG2MGGGSSGVGVAVKREREEEEFEFVTN278 .. SGSGAGSASGGGG254CNRCNRFAFRAQNLCSV2»

Рис. 2. (А) Структура гена e(y)l/taß. Тёмным цветом обозначены транслируемые области гена, светлым - нетранслируемые. Стрелка указывает направление транскрипции. Н - Hind III, X - Xho I, G - Bgl II. Линия показывает область е(у) l/taß) кДНК, использованную в качестве зонда для Нозерн блот гибридизаций. Карты е(у)1"' и е(у)1р' мутаций представлены соответственно вверху и внизу (для них использован в 10 раз больший масштаб). (Б) С-концевые аминокислотные остатки белка дикого типа (вверху) и мутантного белка (внизу).

Экспрессия e(y)1/taf9 у Drosophila melanogaster

Данные Нозерн блот-гибридизации с мРНК, выделенной из линии Oregon R, показали, что ген е(у)1 транскрибируется на всех стадиях развития (Рис. 3). Необходимо

отметить, что наибольшее количество РНК детектируется у самок (примерно, в 5 раз больше, чем у самцов), куколок и эмбрионов.

Для дальнейшего изучения экспрессии ТАР9 были получены поликлональные антитела к полноразмерному белку ТАР9. Методом Вестерн блот-гибридизации было показано, что аффинно очищенные антитела, полученные независимо в двух различных кроликах, узнают один и тот же белок с электорофоретической подвижностью, соответствующей описанной ранее для ТАР9 (42 кДа). Антитела не показывали неспецифической гибридизации и были использованы в экспериментах по иммуноокрашиванию.

личинки

2.7 0.5 1.0 1.4 1.6 3.2 2.6 1.7 1.0 5.0

Рис. 3. Транскрипция гена е(у)1 на различных стадиях развития D. melanogaster (линия Oregon R). В качестве зонда для Норзерн-гибридизации был использован фрагмент, показанный на Рис.2. Ниже показан тот же блот, гибридизованный с Ras2-зондом и относительный уровень транскрипции e(y)I/tqf9. Сигналы нормализованы относительно уровня гибридизации Ras2. Уровень транскрипции у самцов принят за 1.

TAF9 был детектирован примерно в 100 сайтах политенных хромосом слюнных желез, выделенных из личинок III возраста дикой линии Oregon R . Следует отметить, что TAF9 колокализуется с РНК-полимеразой II в большинстве сайтов.

Поскольку высокий уровень транскрипции е(у)1 был обнаружен у самок, была изучена экспрессия гена в тканях взрослой самки.

Эксперименты гибридизации in situ на срезах тканей взрослых самок показали значительное содержание мРНК гена е(у)1 в клетках гонад: в цитоплазме трофоцитов, фолликулярных клеток и ооцитов. Уровень транскрипции в других тканях был

существенно ниже (Рис. 4А). Иммунноокрашивание срезов тканей дрозофилы выявило высокое содержание белка ТАР9 в цитоплазме ооцита (Рис. 4В, Г).

Таким образом, наиболее высокий уровень экспрессии гена был обнаружен в половой системе самок. Присутствие мРНК е(у)1 и белка ТАР9 в цитоплазме ооцита указывает на то, что ген обладает материнским эффектом и необходим для раннего эмбрионального развития.

Рис. 4. Гибридизация in situ и иммунноокрашивание срезов тканей самок. (А, Б) гибридизация in situ с DIG-меченным зондом. (А) зонд - «антисмысловая» РНК; (Б) зонд -«смысловая» РНК. (В, Г) Иммуноокрашивание с использованием антител против TAF9. Стрелками обозначены трофоциты (1), созревающие ооциты (2), зрелые ооциты (3) (х130 увеличение).

Параллельно с изучением TAF9 была исследована экспрессию гена dd4 D. melanogaster, гомолога гена d4 позвоночных. У позвоночных он кодирует транскрипционный фактор, специфичный для нервной системы. Было проведено сравнение экспрессии этого тканеспецифичного фактора с экспрессией общего транскрипционного фактора. Результаты Нозерн-гибридизации с мРНК, выделенной из дрозофилы на различных стадий развития, показали, что ген dd4, также как и e(y)l/taf9, активно транскрибируется у эмбрионов и самок

In situ гибридизация на срезах тканей самцов и самок со специфическим зондом показала, что dd4 экспрессируется во многих тканях (мышцах, кишечнике, мальпигиевых сосудах). Высокий уровень транскрипции наблюдали в грудном и головном ганглиях, а также в глазах (периоптикон). Полученные результаты указывают на то, что, также как и у позвоночных, транскрипционный фактор dd4 играет важную роль в нервной системе D melanogaster. Представляет особый интерес тот факт, что самый значительное содержание РНК dd4 детектировали в эмбрионах и репродуктивной системе самок (трофоцитах, фолликулярных клетках, первичных и зрелых ооцитах).

(Рис. 5)

12345678 9 10

1900 нт

dd4

Ras2

Рис. 5. Нозерн блот-анализ мРНК dd4 на разных стадиях развития D. melanogaster. Этот же блот был гибридизован с Ras2 в качестве контроля. Обозначения: 1- эмбрионы; 2-личинки I возраста; 3- личинки II возраста; 4- личинки раннего П1 возраста; 5 - личинки позднего III возраста; 6 - куколки I возраста;7- куколки II возраста; 8 - куколки III возраста; 9- самцы; 10 - самки.

Проведенные исследования показали, что ген dd4, также как и ген е(у)1, является геном с материнским эффектом. Эти данные подтверждают полученные нами результаты исследования других транскрипционных факторов, которые показали, что транскрипционные факторы, даже если они являются тканеспецифическими, необходимы на самых ранних стадиях развития, еще до того, как началась зиготическая транскрипция и формирование тканей.

Мутация е(у) Iй': молекулярная природа и фенотипическое проявление

Мутация е(у)1"' вызвана вставкой мобильного элемента Сталкер во второй экзон в направлении, противоположном транскрипции гена (Рис. 2А). Инсерция расположена в позиции, соответствующей 25-ой аминокислоте С-конца белка. По данным Нозерн блот-гибридизации, мРНК мутантного аллеля примерно на 200 нт длиннее, чем мРНК дикого типа (Рис.1). Для изучения природы мутации была клонирована 3'-область мРНК мутантного гена е(у)1"'. Сиквенс полученной последовательности показал, что транскрипция мРНК е(у)Г' терминируется на нескольких близко расположенных сайтах внутри З'-ДКП (длинного концевого повтора) Сталкера.

Следовательно, мутантный TAF9 может представлять собой химерный белок, содержащий чужеродные аминокислоты на С-конце. Поскольку терминирующий кодон находится внутри последовательности Сталкера, химерный белок должен иметь длину 270 аминокислот. Таким образом, в линии е(у)1"' 25 С-концевых аминокислот заменены 17 аминокислотами, кодируемыми Сталкером (Рис. 2Б), и молекулярная масса химерного белка должна быть на 0.65 кДа меньше.

Вестерн-анализ показал, что действительно молекулярная масса мутантного белка меньше молекулярной массы нормального TAF9. Обнаруженное различие больше предсказанного и составляет около 5 кДа (Рис. 6), что можно объяснить аномальной подвижностью TAF9 при электрофорезе в полиакриламидном геле.

Инсерция мобильного элемента Сталкер также привела к частичному подавлению транскрипции гена. Пониженное содержание мРНК е(у)1 в мутантной линии наблюдается на всех стадиях развития (Рис. 1). У гетерозиготных самок е(у)1и'/е(у)1* уровень транскрипции нормального аллеля в 4 раза выше, чем мутантного (Рис.1, дорожка 5). У гемизиготных мутантных самцов транскрипция гена понижена в 2.5 раза по сравнению с нормой (Рис. 1, дорожки 1 и 3).

Or e(y)lul e(y)f г

Рис. 6. Вестерн-анализ e(y)l/TAF9. Результат иммунноосаждения е(у)1 и e(y)lul из ядерных экстрактов имаго линий: Oregon R (Or), е(у)Г' и е(у)Г. (Р) - рекомбинантный белок. Положения белков e(y)lul и е(у)1+ обозначены стрелками.

Мутация е(у)Г' не вызывает морфологических изменений и не влияет на жизнеспособность особей. Однако, гомозиготные е(у)1"' самки стерильны: строение их гонад нарушено, а размер значительно уменьшен. Количество ооцитов у мутантных самок также значительно уменьшено, а зрелые ооциты отсутствуют.

Введение в мутантную линию е(у)1"' конструкции Р {w~, е(у)Г), кодирующей полноразмерный белок TAF9, восстанавливает нормальную морфологию гонад и фертильность гомозиготных самок е(у)1"'. Таким образом, TAF9 играет важную роль в оогенезе дрозофилы.

Как было показано выше, на молекулярном уровне мутация е(у)1имеет два проявления. Поэтому возможны две причины возникновения стерильности е(у)1"' самок: пониженный уровень экспрессии е(у)1 и/или изменение С-концевых аминокислот белка. Для того, чтобы выяснить, какая из этих причин является более значимой, были получены трансформанты, несущие мутантный аллель е(у)1"' и конструкцию Р {м>*, Ае(у)1). Эта конструкция содержала последовательность гена е(у)1, кодирующую белок TAF9, аналогичный белку, кодируемому мутантным аллелем е(у)1"', т.е. белок, не содержащий 25 С-концевых аминокислотных остатков (Рис. 2Б). Таким образом, был восстановлен нормальный уровень белка TAF9 в мутантных особях. Однако этот белок содержал существенно измененный состав аминокислотных остатков С-конца. Было получено пять независимых вставок конструкции в различные участки аутосом. Во всех случаях

фертильность самок е(у)1"' была восстановлена. Следовательно, именно снижение уровня транскрипции гена е(у)1 является причиной стерильности самок.

TAF9 незаменим на эмбриональной стадии развития

Для исследования значения TAF9 в развитии дрозофилы использовали генетическую систему, в которой транскрипция гена е(у)1 была значительно подавлена Для этого использовали мутацию е(у)1Р1. Эта мутация была получена в системе Р-М гибридного дисгенеза и вызвана инсерцией Р-элемента в транскрибируемую, но не транслируемую область гена в ориентации, одинаковой с ориентацией гена е(у)1 (Рис. 2А). Таким образом, кодирующая часть гена не была нарушена, а Нозерн блот-анализ показал незначительное изменение уровня его транскрипции. Мутация имеет слабое фенотипическое проявление: наличие тонких укороченных щетинок.

Мутация e(y)lpl позволила продемонстрировать незаменимость белка TAF9 in vivo. Для этого была использована мутация pif1, описанная нами ранее. Мутация р)не влияет на фенотип, однако способна значительно усиливать проявление мутаций, вызванных инсерцией Р элемента в других генах. Механизм этого явления заключается в следующем. Мутация pif' вызвана инсерцией Р-элемента в ген polyhomeotic (ph), что приводит к экспрессии химерного P-Ph белка, состоящего из ДНК связывающего домена транспозазы Р-элемента и почти полной последовательности белка Ph. Химерный белок связывается с копиями /"-элемента, далее на нем собираются другие белки группы Polycomb, образующие мультимерный белковый комплекс, нарушающий транскрипцию генов, расположенных рядом.

Оказалось, что комбинация e(y)¡FI с аллелем phF1, вызывает подавление транскрипции гена е(у)1 и возникновение летального фенотипа. Гибель происходит на средней и поздней стадиях эмбрионального развития (стадии 9-14). Было показано, что гибель можно предотвратить введением в геном e(y)lF' ppf' мутантов конструкции P{w*, е(у)Г}.

Таким образом, TAF9 является незаменимым белком, необходимым для раннего эмбрионального развития.

То, что мутантные эмбрионы развиваются до 9-14 стадий, а не гибнут сразу после начала зиготической транскрипции (стадия 4) можно объяснить высокой концентрацией материнской мРНК и белка TAF9 в ооцитах. Следует отметить, что позднее аналогичные результаты были получены для транскрипционных факторов TAF4 и TAF6. Нуль-мутации генов, кодирующих данные белки, приводили к гибели на эмбриональной стадии, однако высокое содержание материнского белка поддерживало эмбриогенез до 15-16 стадии развития.

Мутация е(у)1"' оказывает различное влияние на функционирование энхансеров

гена yellow

Ранее генетическими методами было обнаружено, что ген е(у)1 влияет на взаимодействие энхансера с промотором Кроме того, было показано, что TAF9 необходим для активатор-зависимой гранскрипции in vitro Поэтому было исследовано влияние мутации е(у)1"' на функционирование различных энхансеров гена yellow. Ген yellow (у), определяющий цвет дрозофилы, содержит три энхансера, отвечающих за экспрессию гена в крыльях, теле и щетинках имаго (энхансеры тела, крыльев и щетинок)

Представлялось интересным исследовать, одинаково ли чувствительна транскрипция гена yellow, контролируемая различными энхансерами, к мутации е(у)1"'. Использованная ранее мутация у2 не позволяла дать ответ на этот вопрос. В аплеле у2 транскрипция гена yellow в теле и крыльях подавлена из-за инсерции в регуляторную область гена мобильного элемента gypsy/MJlf-4, содержащего последовательности для взаимодействия с белком-инсулятором Su(Hw) Вставка мобильного элемента отделила энхансеры тела и крыльев от промотора гена. Расположенный в интроне гена yellow энхансер щетинок остался активным, в то время как энхансеры тела и крыльев блокированы инсулятором. Поэтому было исследовано влияние мутации е(у)1"' на другие аллели гена yellow (Рис. 7).

Существует целый ряд у+2-ревертантов с полностью или частично восстановленной транскрипцией гена yellow в теле и крыльях. Аллели у*мс и у*шс утратили %уряу/МДГ-4, сохранив лишь его длинный концевой повтор (ДКП). В аллеле у+2МС произошла замена большей части gypsy/МДГ-4, включая инсулятор, на последовательность мобильного элемента jockey и участок гена scute. Аллели y2FR1 и у2РЯ2 вызваны частичной инактивацией gypsy/MMr-4 за счет инсерции в него других мобильных элементов.

Введение мутации e(y)Iul никак не меняло пигментацию ревертантов, у которых сохранился один ДКП мобильного элемента gypsy/МДГ-4. Однако аллель e(y)Iul, введенный в другие вышеперечисленные линии, влиял на экспрессию yellow в щетинках (уменьшал пигментацию щетинок, как и в исходном у2-аллеле), но не влиял на транскрипцию гена в теле и крыльях.

Результат, аналогичный предыдущему, был получен и в комбинации е(у)1"' с аллелем y76d2S, в котором произошло встраивание /"-элемента в 5'-транскрибируемую, но не транслируемую область гена yellow. Таким образом, в отличие от энхансера щетинок, энхансеры тела и крыльев не чувствительны к относительно слабой мутации е(у)1и>.

аллель структура фенотип

1 tu

mv

аГт^

/ *г

ш

J.

2+ШС

Jtdtqr m

VLx* а> Т I

-Ъг

>еЦгагМ>

Т-ХПШЖ1

Y 8 é

Ш ^

■ Ls

^jwflwr

Рис. 7. Генетический анализ взаимодействия у аллеля с е(у)1"' мутацией. Схема у-аллеля представлена не в масштабе. Транскрипты yellow показаны стрелками; энхансеры транскрипции показаны темными овалами. Энхансеры, контролирующие транскрипцию yellow в крыльях и кутикуле, расположены в 5'-области гена yellow, в то время как энхансер, контролирующий транскрипцию yellow в щетинках, расположен в интроне гена. Район связывания с Su(Hw) указан белыми прямоугольниками; вставки в различные аллели представлены треугольниками. Число кружков в колонках, характеризующих фенотип, означает уровень пигментации тела и крыльев (колонка 1), грудных щетинок (колонка 2), ножных щетинок (колонка 3) и брюшных щетинок (колонка 4). Количество черных кружков показывает ингибирующий эффект мутации е(у)1"' на транскрипцию гена yellow в различных v-аллелях. Каждый кружок означает единицу по шкале, описанной в подписи к таблице 1.

TAF9 участвует в организации широкого класса энхансер-промоторных взаимодействий

С целью изучения насколько широк круг энхансеров, в регуляции работы которых участвует TAF9, была использована конструкция, содержащая ген white, который определяет цвет глаз дрозофилы. У гена white существует энхансер, расположенный выше области начала транскрипции. В отсутствии энхансера окраска глаз становится желтой. Ранее было показано, что мутация е(у)1"' супрессирует энхансер-зависимую транскрипцию гена white в отсутствии белка zeste: комбинация мутаций zv77h и е(у)Г', каждая из которых не оказывает

значительного влияния на транскрипцию гена white, снижает пигментацию глаз до уровня, характерного для мутантов, несущих ген white без энхансера.

Для изучения роли мутации е(у)1"' в активации промотора white различными энхансерами, была использована линия y'ac'w",а , содержащая ген mini-white без энхансера в конструкции CaSpeR3 Мутанты y'ac'w"18 CaSpeR3 имеют желтые глаза: такая окраска обусловлена промотор-зависимой транскрипцией В результате перемещения конструкции mini-white в другие места генома (скрещиванием с линией Д2-3(99В)), были получены 17 линий с различными одиночными инсерциями во вторую и третью хромосомы и цветом глаз от темно-оранжевого до красного (Таблица 1). Вероятно, активация транскрипции гена mini-white в новых положениях была вызвана расположенными поблизости энхансерами.

Оказалось, что у 12 из 17 полученных линий введение мутации e(y)lul уменьшает уровень пигментации глаз.

Для подтверждения полученных результатов была использована конструкция SUPor-Р, содержащая ген mini-white и энхансер, окруженные областями связывания Su(Hw). Область связывания Su(Hw) (BR) имеет свойства инсулятора: она прерывает взаимодействие между энхансером и промотором, если расположена между ними. Заключение гена white вместе с энхансером между двумя BR-областями делает экспрессию гена white независимой от положения в геноме.

Комбинации конструкции SUPor-P с мутациями е(у)1и zv77h не влияли на окраску глаз. Однако введение мутаций su(Hw)2/ su(Hw)v, инактивирующих ген, кодирующий белок Su(Hw), участвующий в инсуляции, приводит к ингибированию экспрессии white гена в присутствии мутаций е(у)1"' и zllh. В трех случаях мутации su(Hw)2/ su(Hw)v сами незначительно ингибировали экспрессию гена white.

Чтобы исключить возможность активации транскрипции гена white белком su(Hw) в присутствии мутаций е(у)1и' и zy77h, была использована конструкция RR97, в которой BR был расположен между промотором и энхансаром гена white. Особи из трех независимо полученных трансгенных линий, несущих единстенную копию RR97, имели коричневые глаза. Введение мутаций е(у)!"' и zv77A усиливало мутантный фенотип white (Таблица 1), следовательно, белок su(Hw) не может непосредственно активировать транскрипцию гена white.

Таким образом, полученные результаты показали, что белок TAF9 участвует в функционировании значительной части энхансеров.

Таблица 1. Влияние е(у)1"' мутации на экспрессию white гена в различных white-

конструкциях.

Конструкция №* Мутации Цвет глаз**

P(white) 5 + красный

e(y)lUI красный (3), коричневый (1), жёлто-оранжевый( 1)

8 + коричневый

e(y)l"J коричневый (2), оранжевый(2), жёлто-оранжевый (3) жёлтый (1)

4 + оранжевый

eMl" жёлтый (4)

P(BR/Eye/wte/BR) 5 + красный

su(Hw)2/su(Hw)v красный

z^e(y)lJ красный

zv"" e(y)lUJ-MHw//su(Hwr жёлтый-оранжевый

3 + красный

su(Hw)2/su(Hw)v коричнево-оранжевый

zv77/l e(v)l"' красный

zv77h e(y)lu'\su(Hwf/su(Hwr жёлтый

P(EyeZBRJwhite) 3 + коричневый

zv"HeMl"' жёлто-оранжевый

P(BR/Eye/w/?í7e/BR) - Я-транспозон с двумя сайтами связывания su(Hw), фланкирующими энхансер гена white (Eye) и CaSpeR mini-white ген (white). ?{EyefBRlwhite) -Р-транспозон с сайтом связывания su(Hw) расположенным между энхансером (Eye) и mini-white геном.

* Количество линий.

** В скобках указано количество линий, имеющих указанный цвет глаз.

В данной работе бьио впервые охарактеризовано участие TAF9 в активации транскрипции in vivo. В трансгенных линиях, несущих конструкции, содержащие ген white без энхансера, активация транскрипции гена white происходила благодаря действию «случайных» энхансеров, рядом с которыми встроилась конструкция Введение мутации е(у)1"' в эти трансгенные линии значительно снижало уровень транскрипции гена white Полученные результаты показали, что ген е(у)1 вовлечен в регуляцию взаимодействий между широким спектром энхансеров и промоторов. Это подтверждается и данными иммуноокрашивания политенных хромосом, показавшими, что TAF9 присутствует во многих сайтах эухроматина, которые совпадают с сайтами локализации РНК-полимеразы II.

Ранее другими авторами в системе in vitro было показано существование нового неканонического промоторного элемента (DPE), который расположен на 30 нуклеотидов ниже старта транскрипции. Исследование инициации транскрипции на DPE промоторе in vitro показали, что в узнавании и связывании промотора комплексом TFIID основную роль

играют TAF9 и TAF6. Эти результаты позволили предположить, что in vivo TAF9 также играет важную роль в транскрипции с DPE промоторов.

Из предыдущих исследований известно, что комбинация мутаций zv77h и e(y)lul влияет на экспрессию гена white, который содержит DPE промотор и не содержит ТАТА-бокс промотора. Результаты, полученные в данной работе, также показали, что мутация е(у)1и' снижает уровень экспрессии гена yellow в щетинках, но не влияет на экспрессию этого гена в кутикуле тела и крыльях. Ген yellow содержит два промотора: канонический ТАТА-промотор, взаимодействующий с энхансерами тела и крыльев, и внутренний промотор, который активируется энхансером щетинок Именно внутренний промотор оказывается чувствительным к снижению концентрации ТАГ9. Предполагаемый внутренний промотор гена yellow не имеет гомологии с DPE элементом и относится к группе еще не охарактеризованных промоторов.

Однако нельзя утверждать, что только DPF-coдержащие промоторы чувствительны к слабой мутации гена е(у)1 Сам по себе мутантный аллель е(у)1и1 не оказывает влияния на промоторы пи гена white, ни гена yellow Fro действие сказывается либо в комбинации с мутацией гена zeste (в случае гена white), либо при нарушении регуляторной области гена (например, гена yellow)

Следовательно, можно предположить участие TAF9 m vivo в активации транскрипции генов, содержащих как TATA- так и DPE-промоторы.

Наличие С-концееых аминокислотных остатков ТАF9 не является необходимым для активации транскрипции гена yellow in vivo

Данные экспериментов, описанных выше, позволили сделать вывод, что причиной фенотипического проявления мутации е(у)1"' является понижение транскрипции гена, т.к. фертильность мутантных самок была восстановлена введением в мутантнцю линию конструкции P{w*, Ле(у)!}. Были проведены дальнейшие эксперименты, чтобы исследовать влияние мутации на активацию транскрипции

Как упоминалось выше, мутация е(у)1"' значительно подавляет транскрипцию некоторых генов, при условии, что она уже частично нарушена за счет встраивания мобильного элемента, частичной делеции энхансера или ингибирования другого регуляторного элемента. Поэтому для изучения роли продукта гена е(у)1"' в регуляции транскрипции использовали мутантный аллель у2 гена yellow. Мутация е(у)1усиливает фенотип ^-мутации (чёрные щетинки становятся золотисто-жёлтыми).

Были проведены эксперименты, позволяющие сравнить эффект конструкций P{w*, Ае(у)1} и P{w* ,е(у)1*} на пигментацию щетинок мутантов у2 w е(у)1"' (Таблица 2).

Для этого были отобраны 5 трансгенных линий с одной Р{м>*, Ае(у) 1}-конструкцией и 5 линий с одной Р [\<г* ,е(у) 1* ¡-конструкцией, расположенной на 2-ой или 3-ей хромосоме. Как показал Нозерн блот-анализ, уровень транскрипции гена е(у)1 в этих в трансгенных линиях был примерно одинаков. Однако, одна копия конструкции Р{м>*,е(у)1*} полностью супрессировала мутантный фенотип аллеля е(у)1"1, в то время как каждая из пяти Р{и~, Де(у)1} -конструкций в гетерозиготе (одна копия конструкции на геном) только частично восстанавливала пигментацию щетинок у мутантов^ у/ е(у)Г'.

Таблица 2. Взаимодействие между конструкциями е(у)1" и мутациями у2,

е(у)/»'ие(у)3"'

пигментация щетинок

грудь лапки крылья брюшкв выживаемость

1 2 5 5 НИ

5 5 НИ

2 3 5 5 НИ

3 3 5 < ни

4 5 5 5 ни

4 4 5 5 ни

5 5 5 < ни

3 4 5 5 ни

1 4 ч ни

3 3 5 5 54

0

3 4 5 42-51

1 1 1 2 7

0 1 2 2 15

1 2 2 3 11

1 2 2 3 11

2 2 4 5 17

/

/e<y)l-'J>{.

У» е(у)Г'ф)Г'Ри<у)Г)Л-Ы+

fw ,(y)l"ltty)?>J>{i*(y)lhV+ fw r(yll"*<y)r'J>(lx<y)t )-VPiM)H)-i

" - Обозначения: P{ e(y)l*}-1-5 или P{Ae(y)l}-\-S - различные единичные инсерции P{w\ е(у)1+} или P{w*, Ае(у)1} в пяти линиях; Р{Ае(у)1}-2 - единичная инсерция во вторую хромосому; Р{Ае(у)1}-Ъ - единичная инсерция в третью хромосому;

ь - Уровень пигментации у 3-5-дневных самцов, развивающихся при 25°С, измеренный по шкале от 0 (пигментация у у' мутантов) до 5 (пигментация у у* особей).

с - Процент выживших самцов с данным фенотипом, посчитанный как соотношение данных самцов и самцов FM4. НИ- не измеряли

Компенсирующий эффект значительно усиливался при использовании двух конструкций P{w*, Ае(у)1]. Из полученных результатов следует, что для активации транскрипции гена yellow в щетинках достаточен более короткий белок.

Далее было изучено, является ли необходимым наличие аминокислот С-конца TAF9 для взаимодействия с транскрипционным фактором, кодируемым геном е(у)3. Ранее было

показано, что мутации е(у)1"' и е(у)3"' взаимодействуют между собой. Мутация е(у)Зи' вызывает незначительное снижение жизнеспособности. Однако комбинация е(у)1"' и е(у)3"' мутаций является летальной на поздней личиночной и ранней куколочных стадиях развития.

Жизнеспособность и пигментация щетинок особей, несущих е(у)1"' и е(у)3"' мутации, были полностью восстановлены скрещиванием с тремя независимыми трансгенными линиями, несущими P{w* ,е(у) Г}-конструкцию. Наоборот, конструкция P{w*, Ле(у)1} только частично восстанавливала жизнеспособность мутантов е(у)1"' е(у)3"', а выжившие е(у)!и1 е(у)3"'\ P{w\ Ле(у)1}/+ особи имели щетинки мутантного фенотипа. Комбинация двух различных P{w*, Ле(у)1] -конструкций приводила к заметной супрессии мутантного фенотипа.

Белок TAF9 состоит из 278 аминокислотных остатков. Однако как было показано ранее in vitro 222 аминокислотных остатков N-конца белка, по-видимому, являются наиболее важными для его функции: они содержат домены, взаимодействующие с основными транскрипционными факторами, активаторами транскрипции и другими TAF-белками. Белок TAF9 дрозофилы и его гомолог у человека (hTAF9) имеют значительную гомологию только в N-концевой области. Полученные в работе данные показали, что большинство проявлений мутантного фенотипа аллеля e(y)lul можно комплементировать введением дополнительного количества укороченного белка TAF9. Следовательно, 25 аминокислотных остатков С-конца белка не являются необходимыми для функции белка in vivo, что согласуется с результатами, полученными in vitro.

Однако, конструкция P{w*, Ае(у)1} не компенсировала полностью ни действие мутации е(у)1"' на у2 фенотип, ни летальный фенотип комбинации мутаций е(у)1"' и е(у)3"'. Введение двух копий конструкции для повышения количества трансгенного белка комплементировало влияние е(у)1"' на ^-фенотип и увеличивала жизнеспособность комбинации мутаций е(у)Г' и е(у)3"'. С другой стороны, даже одна копия конструкции P{w\ е(у)1+], экспрессирующей полный белок, комплементировала выше указанные проявления мутации е(у)1"'.

Полученные результаты позволили сделать вывод, что аминокислоты С-конца TAF9 не являются необходимыми для его участия в активации транскрипции гена yellow. Таким образом, делеция аминокислот С-конца белка приводит к тому, что транскрипция генов-«мишеней» становится более чувствительной к понижению концентрации белка TAF9. Можно предположить, что С-концевая часть TAF9 способствует его более эффективному взаимодействию с другими белками TFIID-комплекса или белками-активаторами.

Существует и другая гипотеза, объясняющая значение аминокислот С-конца TAF9. В результате наших исследований, не вошедших в данную работу, был охарактеризован белок Е(у)2, кодируемый геном enhancer of yellow 2 (е(у)2). Е(у)2 - короткий, повсеместно экспрессирующийся, эволюционно высококонсервативный белок хроматина, участвующий в активации транскрипции. Было показано, что комбинация мутации е(у)1"' со слабой мутацией е(у)2 приводящей к снижению уровня транскрипции гена, является летальной. В нашей работе методом иммунносоосаждения белков было также показано взаимодействие Е(у)2 с TAF9. Возникал вопрос, участвуют ли аминокислоты С-конца TAF9 в функциональном взаимодействии с Е(у)2. Для ответа на этот вопрос были получены линии, в которых комбинацию мутаций е(у)1"' и е(у)2и1 совмещали с одной или двумя копиями выше указанных конструкций, экспрессирующих нормальный или мутантный TAF9. Оказалось, что конструкция P{w\ е(у)Г) восстанавливает жизнеспособность особей. Однако даже две конструкции P{w+, Ле(у)1} не оказывали никакого эффекта: гибель потомства происходила на эмбриональной стадии развития. Следовательно, при низкой концентрации белка Е(у)2 мутантный TAF9 не способен выполнять свои функции в активации транскрипции.

Недавно полученные нами данные, указывают на то, что белок Е(у)2 является компонентом TFTC-комплекса дрозофилы. Можно предположить, что аминокислоты С-концевой части белка участвуют во взаимодействии TAF9 с компонентами TFTC-комплекса дрозофилы.

II.2. Изучение TFTC комплекса D. melanogaster

Многие белки TAF, помимо комплекса TFIID, входят также в состав комплекса, содержащего гистонацетилтрансферазу GCN5. В частности, TAF9 дрожжей входит в состав SAGA-комплекса. У человека было обнаружено несколько подобных комплексов: TFTC, PCAF, STAGA.

Ранее нами у Drosophila melanogaster были изучены два гомолога белка TAF10 человека - TAF10 и TAFlOb. В ходе выполнения этой работы было впервые продемонстрировано существование GCN5 НАТ-комплекса у дрозофилы. Этот комплекс был назван TFTC по аналогии с соответствующим комплексом человека Исследования, представленные в данной работе, были направлены на более подробную характеристику компонентов TFTC-комплекса дрозофилы, в частности, необходимо было определить, входит ли в его состав TAF9.

Фракционирование эмбрионального экстракта дрозофилы в градиенте глицерина и последующий Вестерн-анализ полученных фракций на наличие TAF9 показали, что белок присутствует в двух пиках, один из которых совпадает с пиком компонентов TFIID. Другой

пик совпадает с пиком гистонацетилтрансферазы GCN5 и, предположительно, соответствует комплексу TFTC дрозофилы.

В лаборатории Л.Тора (IGBMC, Страсбург), с которой мы поддерживаем научное сотрудничество, были обнаружены и клонированы два новых гена дрозофилы: Ada2a и Ada2b. Они кодируют предсказанные белки, гомологичные белку Ada2, компоненту SAGA комплекса дрожжей. Поэтому характеристика TFTC-комплекса дрозофилы была продолжена исследованием этих белков.

Анализ экспрессии генов Айа2а и А^а2Ь у Л melanogaster

На первом этапе была охарактеризована транскрипция генов Ada2a и А<1а2Ь на различных стадиях развития дрозофилы (Рис. 8). Методом Нозерн блот-гибридизации было показано, что оба гомолога транскрибируются на всех стадиях развития, однако уровни транскрипции этих генов различаются: Ada2b равномерно транскрибируется на всех стадиях развития, в то время как Ada2a наиболее активно транскрибируется на стадии куколки.

Таким образом, у £> melanogaster транскрибируются оба гена, но то время как Ada2b обладает конститутивной транскрипцией, транскрипция Ada2a зависит от стадии развития.

яш < Rae 2

М 123466789 10

Рис. 8. Нозерн блот-анализ транскрипции генов Ada2a и Ada2b на разных стадиях развития D melanogaster Этот же блот был гибридизован с Ras2 в качестве контроля. Обозначения: 1- эмбрионы; 2- личинки I возраста; 3- личинки II возраста; 4- личинки раннего III возраста; 5 - личинки позднего III возраста; 6 - куколки I возраста;7- куколки II возраста; 8 - куколки III возраста; 9- самцы; 10 - самки. М - маркер РНК.

Для дальнейшего изучения АОА2а и АГ)А2Ь были получены поликлональные антитела к пептидам, специфичным для этих белков. При фракционировании ядерного экстракта в вОЗ-полиакриламидном геле антитела узнавали белки с молекулярной массой, соответствующей предсказанной (бОкД - АОА2а и 44кД - АОА2Ь). Таким образом, гены Ada2 действительно кодируют соответствующие белки.

Анализ комплексов, в состав которых входят АйА2а и АЬА2Ь

Далее было исследовано, входят ли белки АЭА2а и АОА2Ь в состав вСЫ5 НАТ-содержащего комплекса дрозофилы. Анализ проводили методом коиммуннопреципитации (иммунносоосаждения) из ядерного экстракта в нативных условиях. Белки, связавшиеся с антителами, разделяли в ЗВБ-полиакриламидном геле и переносили на мембрану, которую последовательно гибридизовали с антителами против белков, предположительно являющимися компонентами ТРТС (по аналогии с НАТ-содержащими комплексами человека): ТАР4, СгСМ5, ТАР9, ТАР 10 (Рис. 9).

ТА? 10 TAFlOb ADA2» «DA» КОНТРОЛЬ

п п п п п

я» ип ат ип ат ип «т ип ат нпат

1 ~*-d»T*F4

-«-dQCNB

~*-lgGH -«-сПВР -4-dRDit -«-dAW»

-«-dmTAFIO

-*-dmTAF10b

1 234 58 78 9 10 11

Рис. 9. Результаты иммунносоосаждения компонентов GCN5 НАТ-содержащего комплекса с белками ADA2a и ADA2b. На дорожки нанесены: ядерный экстракт из эмбрионов дрозофилы (яэ); антитела с белками, осажденными иммунопреципитацией (ип), и те же антитела до иммунопреципитации. Были использованы афинно очищенные антитела против ADA2a и ADA2b. На верхней панели указаны антитела, использованные для иммуннопреципитации, иммуннопреципитация преиммунной сывороткой (контроль). Стрелками указаны белки, идентифицированные Вестерн блот-анализом.

Иммунносоосаждение проводили антителами к ADA2a и ADA2b. В качестве контроля была проведена иммуннопреципитация антителами к белкам TAF10 и TAFlOb. Ранее нами было показано, что оба данных белка входят в состав преинициаторного комплекса TFTID. Но, в отличие от TAFlOb, TAF10 в иммуннопреципитации также соосаждается с GCN5. Проведенные эксперименты показали, что антитела к TAF10 соосаждают белки TAF, ТВР и GCN5, в то время как антитела к TAFlOb соосаждают только компоненты TFIID-комплекса (белки TAF, ТВР), что указывает на специфичность условий иммуннопреципитации.

Необходимо отметить, что ADA2b соосаждается антителами к TAF10, но не к TAFlOb (присутствие ADA2a в данной иммунопреципитации не детектировали). Кроме того, антитела к ADA2b соосаждали из ядерного экстракта компоненты GCN5 НАТ-содержащего комплекса (GCN5 и некоторые TAF-белки), но не специфический компонент TFTID комплекса - TAFlOb. Антитела против ADA2a соосаждали ADA2b, GCN5 и TAF9, но не TAF10. Интересно, что в отличие от антител к ADA2b они не соосаждали TAF4 (Рис. 9, дорожка 6). В контрольных экспериментах по иммунопреципитации преиммунной сывороткой (Рис. 9, дорожка 10) или на дорожках, где были нанесены аликвоты антител (Рис. 9, дорожки 3, 5, 7, 9, 11), ни один из этих белков не был детектирован.

ADA2a и ADA2b соосаждали некоторое количество ТВР, что указывает на присутствие в эмбриональных экстрактах D melanogaster некоторого количества ТВР, ассоциированого с ADA2-COдержащими комплексами, что согласуется с литературными данными.

Из полученных результатов следует, что ADA2 белки дрозофилы входят в состав мультибелкового TFTC-комплекса (-ов), содержащего GCN5 HAT и белки TAF, аналогично соответствующим комплексам дрожжей и человека. Кроме того, т.к. состав белков, ассоциированных с ADA2a и ADA2b, отличается, можно предположить, что у D melanogaster существуют различные GCN5 НАТ-содержащие комплексы,

Необходимо отметить, что TAF9 присутствует в обоих комплексах TFTC, что свидетельствует о его важной функции в составе комплексов.

У D. melanogaster существует несколько TFTC-комплексов, отличающихся по составу

Для дальнейшей характеристики ADA2a- и АПА2Ь-содержащих комплексов была проведена хроматография белков ядерного экстракта, полученного из эмбрионов дрозофилы. Белки связывали с гепарином Ultragel в буфере, содержащем 0.1М KCl.

Для последовательной элюции использовали буфера, содержащие 0.24, 0.5 и 1 М KCl. Полученные фракции тестировали на присутствие белков ADA2a и ADA2b с помощью Вестерн-анализа. Интересно, что основная часть ADA2a присутствовала в 0.24 М KCl элюате (Нер0.24), в то время как ADA2b элюировали солью большей концентрации - 0.5 KCl (Нер0.5) Далее для определения размеров разделенных ADA2a- и АОА2Ь-содержащих комплексов, Нер0.24 и Нер0.5 фракции были разделены на колонке с Superóse 6 (гель-фильтрация) Присутствие белка во фракциях детектировали Вестерн блот-анализом (Рис. 10).

Белок ADA2b вместе с другими компонентами GCN5 НАТ-содержащего комплекса (белками TAF и GCN5) сходил с колонки во фракции с молекулярной массой более 2 МДа

(Рис. 10). Однако пик АОА2а сходил с колонки во фракциях, соответствующих молекулярной массе 0.2-0.8 МДа. В этих фракциях белок АОА2а коэлюировался с ОСК5. Таким образом, наши данные указывают на то, что АБА2а и АОА2Ь присутствуют в различных комплексах.

0.67 0.1« 0.04 МДа

I I (

dGCN5

dmTAFS

1 3 S 7 9 11 13151719 21 ЯЭ

Рис. 10. Хроматографическое разделение ADA2a- и АОА2Ь-содержащих комплексов. Белки эмбрионального ядерного экстракта связывали с гепарином Ultragel в 0 1 М KCl и последовательно элюировали буфером, содержащим возрастающие концентрации KCl. Фракции, элюированные 0.24 М KCl (гепарин 0.24) и 0.5 М KCl (гепарин 0.5) фракционировали далее на Superóse 6 гель-фильтрационной колонке. Ядерный экстракт (ЯЭ) (10 мкл) и каждую вторую фракцию (номера фракций указаны под нижней панелью), сошедшую с колонки (20 мкл), анализировали с помощью Вестерн блот-анализа. Позиции маркеров молекулярной массы указаны над верхней панелью.

Чтобы подтвердить полученные результаты и выяснить, обладают ли два dADA2 белка сходными или различными функциями in vivo, было изучено их распределение на политенных хромосомах личинок дрозофилы. Показано, что ADA2a и ADA2b связываются со многими сайтами на политенных хромосомах и имеют как общие, так и специфические сайты связывания (Рис. 11).

Полученные данные свидетельствуют о том, что ADA2 белки имеют пересекающиеся, но не идентичные функции, а, следовательно, у D melanogaster существуют функционально различные АОА2-содержащие комплексы

Таким образом, результаты проведенных экспериментов совместно с результатами иммунопреципитации указывают на то, что гомологи ADA2 дрожжей у D. melanogaster присутствуют в различных GCN5 НАТ-содержащих комплексах.

dADA2a

dADA2b

Рис. 11. Локализация белков ADA2a и ADA2b в дистапьном районе Х-хромосомы D. melanogaster. Иммуноокрашивание политенных Х-хромосом личинок линии Oregon R антителами против ADA2a (верхняя панель) и антителами против ADA2b (нижняя панель) и вторичными Су-З-коньюгированными антителами. ADA2a и ADA2b имеют как общие (1В, IE, 2С, ЗА, ЗС, 3D), так и специфические (1А, 1D и 1С, 2В, 3F соответственно) сайты связывания.

II. 3. Структура гена е(у)3, характеристика его мутантных аллелей и белка SAYP, кодируемого геном е(у)3

Клонирование гена е(у)3

В работе были использованы две мутации гена е(у)3: одна из них - е(у)Зи' - описана ранее, другая - деталь e(y)3EMSI - получена при воздействии этилметансульфоната (EMS). В работе был клонирован ген е(у)3, изолированы соответствующие кДНК клоны и были охарактеризованы на молекулярном уровне мутантные аллели гена.

С использованием мутантной линии е(у)Зи1 был клонирован фрагмент гена е(у)3, в который произошла инсерция мобильного элемента Сталкер. Так как линия е(у)Зи1 содержит 35 копий мобильного элемента Сталкер, для клонирования гена был использован тот же метод, что и для клонирования гена e(y)l/taf9.

Ген е(у)3 имеет большой размер (более 12 тпн), поэтому анализ его нуклеотидной последовательности являлся достаточно объемной работой. В связи с этим, нами был предложен новый быстрый метод получения перекрывающихся фрагментов гена для последующего секвенирования. В основе метода лежит случайная инсерция в плазмидную ДНК, содержащую участок исследуемого гена, гена устойчивости к антибиотику. В результате получается набор плазмид со вставками гена устойчивости к антибиотику в различные участки исследуемого гена. Такого набора достаточно, чтобы секвенировать каждый участок гена в двух направлениях с праймеров, находящихся во вставке, содержащей ген устойчивости к антибиотику. Для секвенирования участков, прилегающих к вектору, были использованы праймеры, находящиеся в векторе.

ДНК гена е(у)3 была клонирована в вектор pBluescript SKII(+). Длина вставок варьировала от 3 до 5 тпн. Описанный выше метод позволил установить первичную нуклеотидную последовательность гена е(у)3.

Для подтверждения того, что мутация е(у)3действительно произошла в клонированный нами ген е(у)3, район геномной ДНК, включающий ген и фланкирующие области (Рис. 12), был клонирован в вектор pCaSpeR3 и использован для комплементации мутаций е(у)3"' и е(y)3EMSI. Все пять независимо полученных трансгенных линий, содержащие трансген в различных участках генома, полностью комплементировали мутантный фенотип. Полученные результаты продемонстрировали, что мутации е(у)3"' и e(y)3FMSI произошли в гене е(у)3.

Несколько кДНК клонов, соответствующих е(у)3, были изолированы из библиотеки кДНК, полученной из линии Oregon R. Сравнение последовательностей изолированных кДНК клонов с геномной последовательностью е(у)3 позволило определить структуру гена. Он содержит 12 экзонов (Рис. 12, А) и содержит открытую рамку считывания для белка длиной 2008 аминокислотных остатков. Нозерн-анализ выявил основную мРНК е(у)3, которая имеет длину 10000 нт. Были выявлены и три дополнительных более слабых транскрипта с меньшим молекулярным весом (Рис. 12, Б). Анализ кДНК клонов показал, что все три мРНК е(у)3 имеют одинаковую кодирующую последовательность, но различные 3'-нетранслируемые районы.

Транскрипт длиной 6.5 т.н. имеет альтернативный старт транскрипции во 2-м экзоне и, таким образом, кодирует белок на 163 аминокислоты короче (стиль!).

Белковый продукт гена е(у)3 был назван SAYP (Supporter of Activation of Yellow Protein), благодаря способности гена e(y)3 поддерживать активированную транскрипцию yellow.

Ras2

Рис. 12. . Структура гена е(у)3 и молекулярная характеристика мутации е(у)3"'. (А) Молекулярная структура гена е(у)3. Серым цветом обозначены кодирующие районы. Черным цветом указаны 5'- и З'-нетранслируемые районы. Два альтернативных старта транскрипции показаны изогнутыми стрелками. Сайты альтернативного полиаденилирования указаны стрелками. Место встраивания мобильного элемента Сталкер в аллеле е(у)Зи1 и делеция 11 нуклеотидов в аллеле e(y)3FMSI указана не в масштабе. Обе мутации приводят к формированию стоп-кодона. ДНК 2-го экзона была использована в качестве зонда для Нозерн-гибридизации. (Б) Транскрипты е(у)3 в линии дикого типа и мутантной линии е(у)Т'. Уровень транскрипции е(у)3 снижен у мутантных самцов и самок. Ras2 был использован для нормализации сигналов. (В) Вестерн блот-анализ SAYP в ядерном экстракте. (1) - неочищенная сыворотка 1; (2) - сыворотка 1 после 1 часа инкубации с пептидом, использованным для иммунизации; (3, 4) - аффинно очищенные AT 1 и AT 2; (5, 6) - преиммунная сыворотка

SAYP был обнаружен в ядерном экстракте, выделенном из эмбрионов дрозофилы. Для этого были получены поликлональные антитела против двух различных пептидов N-проксимального района SAYP (ATI, АТ2, Рис.13, А). Сыворотка и аффинно очищенные

антитела детектировали в эмбриональном ядерном экстракте два высоко молекулярных варианта белка - ~270 и 250кДа (Рис. 12 В, дорожки 1, 3 и 4), которые не детектировались при использовании преиммунной сыворотки (Рис. 12, В, дорожки 5 и 6). Кроме того, полосы гибридизации, соответствующие этим белкам, исчезали, если сыворотку инкубировали с пептидом, использованным для иммунизации (Рис. 12, В, дорожка 2). Нижняя полоса, вероятно, соответствует изоформе SAYP, синтезированной с транскрипта длиной 6,5 т.н. Нельзя исключить, что две полосы, детектируемые Вестерн блот-анализом представляют собой различно модифицированный белок SAYP.

Доменная структура SA YP

Анализ аминокислотной последовательности SAYP показал, что он содержит четыре серии-богатых района, пролин-богатый район, два глутамин-богатых района и два положительно заряженных кластера. Этот белок также содержит семь предполагаемых сигналов ядерной локализации в различных частях молекулы (Рис 13, А). В центральной части белка находится AT-hook домен, небольшой ДНК-связывающий мотив, узнающий АТ-богатые последовательности. Многочисленные или единичные AT-hook домены были обнаружены в различных белках, включая белки, ассоциированные с хроматином и участвующие в активации или репрессии транскрипции.

В С-концевой области SAYP находятся два PHD домена. Эти домены найдены у многих белков, ассоциированных с хроматином, включая некоторые транскрипционные факторы, например, TrxG и PcG, ацетилтрансферазу СВР/рЗОО, компонент гистон-деацетилирующего комплекса Mi-2 и хроматин-ремодулирующий белок Acfl.

В базе данных были обнаружены гомологи SAYP у человека (гипотетический белок XAP135/PHF10) и у некоторых других видов многоклеточных (Рис. 13, Б). Белки позвоночных очень схожи по последовательности (75% идентичных аминокислот у белков человека и рыбы).

Все гомологи содержат высоко консервативный домен, названный нами SAY-доменом (Supporter of Activation of Yellow, 30% идентичных и 45% схожих аминокислот у белков дрозофилы и человека). Высокая консервативность SAY-домена указывает на его возможное взаимодействие с эволюционноконсервативным аппаратом транскрипции, в частности, с общими транскрипционными факторами.

tATl

AT-hooh

SAY

PHO

AT2

It-

rop ПЗР

СЯЛ

ID «¡дайвяшиимгаига»

(1) 4 „* 4.>LYHKEKLYbR-

(42) №OCeVCEYUVnrm»I)I.M№LniHKLl|R-

(1) ^j^sBnWnrflfW-^illtlLsiltlKLir

Hon Mus Rat

Den ______________________________________. -

Uro (1340) ШИЖАМИрГИИ«»»!«?!»™

Ano (197) kHlMl <rrUI>7MnrvmEll<>ril---lo<iuHMb||9nh'Yk<IIL

Cae (131) rtgEQIGELLDII f-F .'AÍIT PTRRy.VlBEEREFLEWIIFIIVHKLLIETLLRCMSjmRASElH

Horn (03) QRfTOK«®lYS- —QMQQQITi

Mua (63) QR|TOK|||YS---QMQQÇSTi

Rat (124) QRtTOlΕS---QHQQQST1

Dan (83) QRtTHEtHVSTLSVÛHQQQIPQU.

Dro (1422) MiEAKUM.......— иф _ .

Ano (279) ffiLSIRQRQQQ---EAISAWAAAPVDRAQIAKEf|lESl|lȤCSFtl

С.» (216) ЕЭДЬЕМвС.........XlHDSVMLRRttVe«JTO|»U)I4I!l!ilÏ!

i líe: 'IlqI

KRA£tS,/:LQBfi&R '*DrFDÍ«Ej¡¡KEYIRljfaL юф|«ЕВтТЯПН

SDrtK:iYHE*KKWSÇRER

т/гтютгха^штитшт тгтвгчъяг*

Нош (153) ----------------ffî

Mus (153) ----------------ft

Rat (194) ----------------H

Dan (156) .............—Ff-.....РИкг0Ргеу»1Мщлти1

Dro (1497) DLXRAVAEEA>IPAPPVIi||ProYI№AF§HSDYAY0LTWPIlQrRMAYI<QF^

Ano Ca«

В

(349) (260)

^GHQQTfPMQPTrnN^vföffsBYfrT|t,

-W*......pM»epw»»ipoe»eiwi

____...QGKY------------

|fT§llçIl^RTAPTCTRbERSTS

|УРИЙ«Е............

illllSRRIgir------------

fYtPlHTAlYrPPI^rFLP

BYLP»TAÏYrrrtG№P!

RtlPTITU »PIMK.P: HYLP1ITALFEPPLDPEI.P

ayUjituidkíptbi.mío

Sc P I- P- nvss (409) ^ftLPbGZVIESSHLYPAVREP (334)

гоо> Dro «m Ano

-МЫ——

— пм Cae

1w4orrÎ "о Нот

Рис. 13. SAYP - мультидоменный белок, имеющий гомологов у различных видов.

(А) Структура Е(у)3. Указаны AT-hook, консервативный домен (1340-1573 а.о.), PHD домены (1692-1796), S - участки, обогащенные серином (293-345, 1018-1117, 1629-1693, 1960-1970), Р - участок, обогащенный пролином (119-126), G - глутаминовые стретчи (93976 375-379), ПЗР - положительно заряженные районы (1146-11606 1297-1303), СЯЛ -сигналы ядерной локализации (770-777, 805-811, 991-997, 1297-1305, 1417-1420, 1610-1616). Стрелкой показано начало короткой альтернативной формы белка (164 а.о.). Пептиды, использованные для получения антител, подчеркнуты.

(Б) Сравнение аминокислотных последовательностей консервативного домена из различных видов. Нот, Homo sapiens, NP_060758; Mus, Mus musculus, NP_077212; Rat, Rattus norvégiens, XP 214780; Dan, Danio rerio, AAH57492; Dro, Drosophila melanogaster; Ano, Anopheles gambiae, XP_321190; Cae, Caenorhabditis elegans, NP_503173; аминокислоты,

гомологичные последовательности человека, выделены серым цветом, если они присутствуют у более чем четырех видов.

(В) Сравнение доменной структуры SAYP у гомологов - A gambiae (Ano), С elegans (Cae) и позвоночных (Нот). Серые прямоугольники — SAY-домен, светлые - PHD-домены, овалы - серин-богатые участки.

За этим доменом после района с низкой гомологией расположены PHD-домены. Необходимо отметить, что два предполагаемых PHD-домена SAYP перекрываются по консервативному остатку цистеина, поэтому в действительности в каждый момент времени может функционировать только один из них. То же самое наблюдается и у гомологов SAYP других видов, кроме белка комара, который имеет только один PHD-домен (Рис. 13, В).

По литературным данным PHD присутствует у многих белков, ассоциированных с хроматином. Было показано, что PHD участвует в белок-белковых взаимодействиях. Однако последовательности PHD-доменов значительно различаются, из чего можно сделать вывод, что их молекулярные функции могут также различаться. Недавние исследования показали, что бромодомен и PHD-домен коактиватора транскрипции рЗОО кооперативно взаимодействуют с ацетилированными гистонами, находящимися в составе нуклеосом. Этот факт указывает на возможность участия PHD в узнавании гистонового кода.

Однако делеция PHD-доменов не сказывается на способности SAYP связываться с политенными хромосомами в районах эухроматина и гетерохроматина. Таким образом, PHD-домены SAYP, скорее всего, опосредуют некоторые специфические белок-белковые взаимодействия, а не взаимодействие SAYP с хроматином.

Белок дрозофилы, как и белки позвоночных, имеет серин-богатый район между SAY-и PHD-доменами Высокая эволюционная консервативность доменной структуры SAYP позволяет предположить, что SAY- и PHD-домены необходимы для функционирования белка. Интересно, что белок позвоночных самый короткий и практически содержит только эти два домена, в то время как белок дрозофилы содержит длинную N-концевую часть, не имеющую гомологии с другими видами. Вероятно, данная область нужна для взаимодействия с некоторыми факторами, специфическими для отдельных промоторов дрозофилы.

Таким образом, SAYP представляет собой эволюционно высоко консервативный белок высших эукариот.

SA YP -убиквитарный ядерный белок, необходимый в оогенезе и раннем развитии

мРНК гена е(у) 3, размером 10 т.н. обнаружена на всех стадиях развития также, как и более слабые транскрипты (Рис. 14, А). Однако наиболее интенсивная транскрипция

наблюдается у самок. Методом in situ гибридизации наибольшее содержание мРНК е(у)3 было обнаружено в гонадах самок: в питающих клетках (трофоцитах) и в ооцитах, что указывает на то, что ген обладает материнским эффектом (Рис. 14, Б).

Методом иммунноокрашивания SAYP был обнаружен в ядрах синцитиапьной бластодермы ранних эмбрионов (Рис. 14 Г), а также в ядрах различных тканей поздних эмбрионов (Рис. 14, И-Л), личинок (Рис. 14 Ж, 3) и имаго (Рис. 14 Д и данные не представлены). Значительное количество SAYP выявлено в ядрах клеток гонад, что согласуется с данными гибридизации in situ

SAYP является убиквитарным ядерным белком, экспрессирующимся на всех стадиях развития и в различных тканях. Необходимо отметить, что кДНК XAP135/PHF10, гомолога SAYP у человека, была обнаружена нами в базах данных EST, полученных из различных тканей. Полученные данные позволяют предположить, что XAP135/PHF10 также является убиквитарным белком.

Т.к. гомолог SAYP существует у человека, было интересно, используя культуру клеток, изучить его локализацию в клетке. Для этого был применен метод, позволяющий увеличить уровень трансгенного белка. Было показано, что миллимолярные концентрации метилметансульфоната более чем в 100 раз увеличивают уровень транскрипции с цитомегаловирусного (CMV) промотора, широко используемого в экспрессирующих конструкциях.

Фрагмент ДНК, содержащий ОРС гена гомолога е(у)3 у человека, полученный с помощью RT-PCR, был клонирован в вектор pEGFP-Nl и введен в культуру клеток человека HeLa. Нам не удалось увидеть под флуоресцентным микроскопом слитный белок he(y)3-EGFP в стабильной линии клеток. Однако после добавления MMS (концентрация 35 мкг/мл) слитный белок был детектирован в клетках. Оказалось, что белок е(у)3 человека, также как и белок дрозофилы, имеет ядерную локализацию (данные не представлены).

Для дальнейшего изучения значения SAYP в развитии было исследованы фенотипические проявления мутаций гена е(у)3. Как было показано ранее, мутация е(у)Зи1 является слабой: она приводит к снижению экспрессии yellow в мутантной линии у2, но не влияет на yellow^ аллель. Мутантные особи е(у)3"' имеют укороченное тело и расставленные крылья. Проведенные нами исследования показали, что самки, гомозиготные по мутации е(у)3"', стерильны, а их выживаемость снижена на 50 %. У гемизиготных самцов мутация е(у)3"' приводит к 20 % снижению выживаемости и нарушению в развитии бедра (15% самцов имеют нарушения).

О» Ш м„ '

33

f

личинки

и

IIIs? . . — !!! 11111 i 1

куколки Д имаго

1.4 0.4 0.2 0.3 0.8 2 2 1.5 1 14

е(у)3

Ras2

Рис. 14. SAYP является убиквитарным ядерным белком. (А) Транскрипция гена е(у)3 на различных стадиях развшия D melanogaster. Стрелкой указана мРНК, размером 10 тн. Ниже показан тот же блот, гибридизованный с Яя.г2-зондом, и относительный уровень транскрипции е(у)3. Сигналы нормализованы относительно уровня гибридизации Ras2. Уровень транскрипции у самцов принят за 1. Нижняя панель - результата гибридизации той же мембраны с RAS2. (Б, В) Гибридизация in situ фронтальных срезов брюшка самок с «антисмысловой» (Б) и «смысловой» (В) мРНК пробами. Стрелками указаны питающие клетки и ооциты на разных стадиях развития. (Г) Участок эмбриона (4-ая стадия развития), окрашенного антителами против SAYP (слева) и DAPI (справа). SAYP локализуется в ядрах синцитиальной бластодермы. (Д) Распределение SAYP в гонадах самок. Окрашивание антителами против SAYP (сверху), DAPI (снизу). SAYP присутствует в ядрах стволовых клеток гермариума (stc), фолликулярных клетках (fc) и питающих клетках (nc). (Е, Ж) SAYP

находится в клетках - предшественниках омматидий глазо-антеннального диска (Е) и в клетках - предшественниках глиальных клеток мозга (Ж) личинок III стадии развития. (3-К) Иммунноокрашивание эмбрионов 4-ой стадии развития (3), 14-ой стадии развития, дорсальный вид (И) и 16-ой стадии развития, вентролатеральный вид (К), hb, головной мозг; hg, задняя кишка; go, гонады; mt, мапьпигиевые сосуды; mg, средняя кишка; рс, полярные клетки; psp, задние дыхательные отверстия; sflg, слюнные железы; sm, соматическая мезодерма; spc, спинной мозг. Все эмбрионы ориентированы налево. Были использованы аффинно очищенные ATI и FITC-конъюгированные вторичные антитела.

Гомозиготные самки е(у)3ЕМЯ и гемизиготные самцы гибнут на средней эмбриональной стадии развития. Их выживаемость на ранних стадиях развития можно объяснить «материнским эффектом» е(у)3 гена.

Результаты проведенных исследований позволили предположить, что SAYP является белком, имеющим широкие функции в онтогенезе. Кроме того, полученные результаты свидетельствуют о важной роли SAYP в оогенезе и на ранних стадиях развития.

Молекулярная характеристика мутаций е(у)3

Мутация е(у)Зи' вызвана вставкой мобильного элемента Сталкер в 10 экзон (встраивание произошло на расстоянии 4956 нуклеотидов от начала длинной рамки считывания), что привело к образованию стоп кодона в кодирующей области гена ниже места инсерции (Рис. 12, А). Таким образом, в мутантном SAYP отсутствуют последние 349 аминокислоты, включающие PHD-домены. Кроме того, у мутантов транскрипция е(у)3 значительно снижена (Рис. 12, Б). Однако транскрипты е(у)3 не изменили своего размера, т.к. в результате сплайсинга между З'-концом 9-го экзона и 5'-последовательностью ДКП Сталкера произошла замена 24 нуклеотидов 10-го экзона на 23 нуклеотида Сталкера.

В летальной аллели e(y)3EMSl стоп-кодон образуется в результате делеции 11 нуклеотидов в позиции, соответствующей 3525 нуклеотиду, что приводит к отсутствию SAY- и PHD-доменов у мутантного SAYP.

Укороченный SAYP был обнаружен в ядерных экстрактах эмбрионов дрозофилые^З"' и е(у)3// e(y)3EMSI линий с помощью Вестерн блот-анализа (Рис. 15, А), что подтвердило полученные данные. В экстрактах белков, выделенных из гомозиготной линии е(у)3антитела узнают два белка размером 240 и 220 кДа, соответствующие SAYP без PHD-доменов. Количество SAYP в мутантной линии е(у)3"' понижено, что согласуется с данными по транскрипции.

В гетерозиготной линии е(у)3/ e(y)3EMSI кроме SAYP дикого типа (270 и 250 кДа), были обнаружены белки размером 180 и 160 кДа, соответствующие укороченным формам SAYP.

SAYP был также обнаружен в эмбрионах линии е(у)3ЕШ! e(y)3EMSl, содержащей конструкцию, экспрессирующую SAYP без PHD (см. ниже). Были выявлены две полосы, соответствующие белку без SAY-домена, а также 2 полосы, соответствующие трансгенному SAYP (230 и 210 кДа). Аналогичные результаты были получены с использованием антител, полученных против другого района SAYP (АТ2) (Рис. 15, Б).

А Б

ДТ U1 Л/ДТ Л/ДР дт Л/ДТ Л/ДР

270> 250s

270у 250s

Щ mi — 2зо

„ , - --ли " „.»^210

220 * V

«*• —180 х -—180

* » -—160 —160

Рис. 15. (А, Б) Вестерн блот-анализ тотального белка из эмбрионов различных линий: Oregon R (ДТ), е(у)3"'/ e(y)3ul (U1) и e(y)3FMS'/ е(у)3 (L/ДТ). Использованы аффинно очищенные антитела ATI (А) и AT (Б). Молекулярный вес указан в кДа.

Обобщая полученные результаты, можно сделать вывод о функциях SAYP in vivo. SAYP является ядерным белком: его можно детектировать в ядрах, начиная с ранней эмбриональной стадии. Он также обнаружен в различных тканях личинок Drosophila melanogaster Также как и TAF9, кодируемый геном е(у)1. высокий уровень содержания SAYP наблюдается в трофоцитах и ооцитах, в то время как в других тканях имаго уровень белка одинаков. Аналогично гену е(у)! ген е(у)3 также является геном с «материнским эффектом». Молекулярная характеристика двух мутантных линий е(у)3 позволила выявить роль белка в развитии дрозофилы. Было показано, что понижение содержания белка в мутантной линии е(у)3"' приводит к некоторым нарушениям в развитии имаго, снижению выживаемости, а также к стерильности самок, что свидетельствуют о важной роли SAYP в оогенезе. Отсутствие SAY- и PHD-доменов у белка SAYP в мутантном летальном аллеле приводит к гибели эмбрионов на ранней эмбриональной стадии развития (6 стадия). Следовательно, SAYP необходим не только в процессе оогенеза, но и в раннем эмбриональном развитии.

Мутации генов, кодирующих некоторые транскрипционные факторы, имеют сходное проявление, что позволяет предположить их взаимодействие с SAYP в развитии. Представляет интерес cut- локус, белковый продукт которого необходим для дифференцировки клеток различных тканей. Ранее было показано генетическое взаимодействие е(у)3 и cut-локусов. Генетическими и молекулярно-биологическими методами было показано взаимодействие SAYP с одним из важных транскрипционных факторов TAF (TAF9) (см. ниже).

SA YP связан с эухроматином и гетерохроматином

Для изучения связывания SAYP с хроматином, были выполнены эксперименты по иммунноокрашиванию политенных хромосом слюнных желез личинок III возраста дрозофилы. Было обнаружено около 150 сайтов связывания SAYP (Рис. 16).

Аффинно очищенные антитела ATI и АТ2 к различным пептидам SAYP узнавали одни и те же сайты в плечах политенных хромосом (Рис. 16, Б, В). Большинство из них совпадали с сайтами связывания РНК-полимеразы II (Pol П) (Рис. 16, А, Б, В) и были локализованы в менее компактных районах хроматина, слабо окрашенных DAPI - в эухроматине.

С другой стороны, РНК полимераза II была обнаружена в значительно большем количестве сайтов, чем SAYP. Полученные данные свидетельствуют о том, что SAYP участвует в регуляции только части транскрибируемых генов.

Иммунноокрашивание также выявило присутствие SAYP в районах гетерохроматина (Рис. 16, Г, Д). У D melanogaster гетерохроматин представлен перицентрическими районами хромосом, которые ассоциированы в хромоцентр, и большей частью небольшой 4-ой хромосомы. Антитела против Pol II очень слабо окрашивают эти участки, свидетельствуя о наличии небольшого количества транскрибируемых генов в гетерохроматине (Рис. 16, Г). Природа сайтов связывания SAYP подтверждается и сравнением распределения SAYP с распределением НР1, основного белка гетерохроматина (Рис. 16, Д). Полученные результаты позволяют предположить, что SAYP вовлечен в организацию гетерохроматина и, следовательно, в регуляцию экспрессии генов, расположенных в гетерохроматине.

SA YP репрессирует экспрессию трансгенов, расположенных в гетерохроматине

Для изучения функции SAYP в гетерохроматине, мы исследовали эффект мутации е(у)3"' на экспрессию трансгена, расположенного в различных районах гетерохроматина 4 хромосомы и в хромоцентре. Трансгенные линии дрозофилы, несущие вектор с Р элементом - P[hsp26-pt, hsp70-w], были предоставлены С. Элгин (США).

SAYP ATI наложение AT2 наложение

Рис. 16. Иммуноокрашивание политенных хромосом D melanogaster. (A) SAYP колокализуется с Pol II на политенных хромосомах D. melanogaster. окрашивание антителами против SAYP, Pol II и наложение (Б, В) Фрагмент хромосомы 2R, окрашенный антителами против SAYP (ATI или АТ2), Pol II, DAPI и наложение. Стрелками указаны сайты 47А, 47С, 48В, 49Е и 50С (слева направо), которые окрашивают как антитела к SAYP, так и антитела против Pol II. (Г) Хромоцентр (указан укороченными стрелками на рис. Г, Д) и 4 хромосома (указана стрелкой), окрашенные антителами против SAYP, Pol II и наложение. (Д) Хромоцентр и 4 хромосома, окрашенные антителами против SAYP (ATI или АТ2), НР1 и наложение.

В этих линиях отсутствовала экспрессия эндогенного гена white и наблюдалась мозаичная пигментация глаз, обусловленная репрессией транскрипции трансгена в ряде клеток, т.е. проявлялся мозаичный эффект положения (МЭП). Уровень экспрессии трансгена определяли визуально и спектрофотометрически, путем измерения содержания красного пигмента в глазах мух.

Действие мутации е(у)Т' на экспрессию трансгена было исследовано у самок, гетерозиготных по мутации е(у)3"' и инсерции f-элемента, и у самцов, гемизиготных по е(у)3"' и гетерозиготных по инсерции /'-элемента. Было обнаружено значительное увеличение экспрессии трансгена у самцов, в скрещиваниях с большинством исследуемых линий (Рис. 17). Этот эффект проявлялся даже у гетерозиготных самок е(у)3"'/ е(у)3,

несмотря на наличие у них аллеля дикого типа. Такой же эффект мы наблюдали у потомства, полученного в результате скрещивания мутации е(у)3"' с природной мутацией white-mottled (wm4h)y которая приводит к вариациям в окраске глаз в результате инверсии в Х-хромосоме (Рис. 17). Степень эффекта, оказываемого мутацией е(у)3"', была сравнима с эффектом мутации НР1 (Su(var)2-5).

1 i

II HUT

118Е25 39С12 39С42 118ЕЗ 39С52 118Е10 118Е1Э wm4h

Рис. 17. Влияние мутации е(у)3"' на транскрипцию генов, встроенных в различные гетерохроматиновые районы 4 хромосомы. (А) Результаты количественного анализа содержания пигмента в глазах. Номер трансгенной линии указан под парными столбцами вдоль горизонтальной линии. По оси ординат указано соотношение уровня пигментации глаз у самцов у2 к'е(у)У'/У; Р[Ъвр-26-р1, (светлые столбцы) и самок у2 м'е^У/Х;

Р[Ьзр-26-р1, к.чр70^]/+ (темные столбцы) к уровню пигментации соответственно у контрольных самцов у'ж'/ У; Р[Ыр-26-р1, и самок ум'/ У и1'; Р\}ир-26-ри Ь$р70-

w]/+. Крайний правый столбец показывает соотношение уровня пигментации глаз гетерозиготных самок е(у)Т^т41 + и контрольных гомозиготных самок м1"4.

Таким образом, как и известные мутации НР1 и других генов, участвующих в сайленсинге в гетерохроматине, мутация е(у)Зи' является доминантным супрессором МЭП. Она активирует транскрипцию генов эухроматина, локазизованных в гетерохроматине и действуя на трансгены также как и на природную мутацию

Были проведены эксперименты по изучению влияния мутации е(у)3на экспрессию той же самой конструкции, расположенной в теломерах аутосом - 2L, 2R и 3R, в которых также был обнаружен SAYP. Результаты проведенных исследований не выявили значительных изменений в уровне экспрессии white и позволили сделать вывод, что SAYP участвует в репрессии транскрипции в перецентрическом гетерохроматине и гетерохроматине 4 хромосомы, но не в теломерах.

SAY домен необходим для выживаемости и активации транскрипции in vivo

Целью дальнейших исследований являлось изучение функции консервативных доменов SAYP. Для этого использовали имеющиеся мутантные линии e(y)3ms> и е(у)Зи'. Мутация е(у)Зеш является летальной (в отличие от е(у)3"'\ что позволяет предположить, что именно SAY-домен необходим для функции белка. Для проверки этого предположения была создана конструкция P{e(y)3ápHD}, которая экспрессировала укороченный белок без PHD-доменов, но содержащий SAY-домен и серин-богатый район, т.е. такой же белок, как в мутантной линии е(у)3"'. В качестве контроля была использована конструкция Р{е(у)3*}, экспрессирующая полноразмерный SAYP (Таблица 3).

Обе конструкции были использованы в экспериментах по комплементации летального аллеля - е(у)ЗГМК1. Полученные результаты представлены в таблице 3. В экспериментах были использованы восемь независимых линий, несущих инсерцию P{efy)3*} и 5 независимых линий, содрежащих инсерцию Р{е(у)3АРНП}. Экспрессия Р{е(у)3ЛРН"} в трансгенных линиях была подтверждена Весгерн-анализом (Рис. 15). Как и ранее описанная конструкция Р{е(у)3*}, экспрессирующая полноразмерный белок, трансген Р{е(у)Злрн"} полностью комплементировал фенотип мутантов е(у)3ЕШ'.

Также было исследовано действие трансгена P{e(y)3ÍPHD} на фенотип мутантов е(у)3"'. Как было показано выше, эта мутация приводит к синтезу белка без PHD. Кроме того, в мутантной линии снижен уровень экспрессии гена е(у)Зи1. Введение конструкции Р{е(у)ЗЛРИ1>} увеличивало количество белка, однако этот белок не содержал PHD. Как и консгрукция, экспрессирующая полноразмерный SAYP, P{e(y)34PHD} комплементировала основные фенотипические проявления мутации е(у)3"', восстанавливая фертильность самок и выживаемость в линии е(у)3"' (Таблица 3). Следовательно, низкое содержание SAY-домена, а не отсутствие PHD является главной причиной, вызывающей нарушения в линии е(у)3"'.

Таблица 3. Изучение роли консервативных доменов SAY и PHD в основных фенотипических проявлениях мутаций e(y)3EMSI и е(у)3"'.

Генотип Наличие доменов SAY и PHD (РР) Фертильность самок Жизнеспособность Экспрессия аллелей Экспрессия трансгена в гетерохроматине

е(у)3+ SAY+PP Фертильны Норма Норма Репрессирована

е(у)Зшя - Деталь

е(у)Зи' SAY2 Стерильны Снижена Снижена Активирована

e(y)3m!Sl Р{е(у)3\} SAY+PP Фертильны Норма

P{e(y)3éPHD } SAY Фертильны Норма

е(у)Г Р{е(у)3+} SAY" SAY+PP Фертильны Норма Норма Репрессирована

е(у)Г P{e(y)3áPHD} SAYa SAY Фертильны Норма Норма Активирована

" - У мутантной линии е(у)3"' уровень экспрессии SAYP понижен.

Было также проверено влияние SAY-домена на экспрессию генов in vivo. Одним из проявлений е(у)Зи1 мутации является влияние на экспрессию некоторых генов. В частности, как было сказано выше, она подавляет экспрессию аллеля у2 в щетинках. Мутация у2 вызвана инсерцией мобильного элемента gypsy. Чтобы исключить роль gypsy в регуляции гена yellow, опосредованной е(у)3, был использован другой аллель гена yellow, , в котором отсутствует элемент корового промотора (Initiator). В то время как мутация )tm имела фенотип дикого типа, введение мутации е(у)3"' значительно снижало экспрессию в щетинках аллеля. Таким образом SAYP непосредственно участвует в регуляции

экспрессии yellow.

Далее было исследовано, будет ли введение конструкции P{e(y)3ÓPHD) в у2е(у)3"' или у/"' е(у)3"1 линии влиять на экспрессию yellow. Было получено полное восстановление исходного / и У* фенотипа в трансгенных у2е(у)3"'/У; Р{е(у)3АР,т) и y2e(y)3,nr/Y; P{e(y)3áPHD} самцах. Таким образом, SAY домен участвует в активации транскрипции гена yellow in vivo.

PHD необходимы для репрессии транскрипции в гетерохроматине

Проведенные эксперименты показали, что SAYP участвует в репрессии транскрипции в гетерохроматине. Поэтому было проверено, будет ли введение конструкции P{e(y)3iPHD} комплементировать влияние мутации е(у)3"' на экспрессию трансгенов в эухроматине. В линии е(у)3"' мутация SAYP не препятствует связыванию мутантного SAYP с политенными хромосомами. Следовательно, либо слабая транскрипция е(у)3, либо отсутствие PHD доменов, либо оба эти фактора супрессируют МЭП.

Для того чтобы выяснить, которое из предположений верно, конструкции Р{е(у)3/1рт}} и Р{е(у)3*} были введены в линии, несущие мутацию е(у)3"' и содержащие трансген P[hsp26-pt, hsp70-w] в различных сайтах гетерохроматина. Контрольная конструкция Р{е(у)3*}, экспрессирующая полноразмерный белок, приводила к понижению уровня окраски глаз. В то же время конструкция, экспрессирующая укороченный белок без PHD-доменов, не оказывала супрессирующего влияния на действие е(у)3"' на экспрессию P[hsp26-pt, hsp70-w] трансгенов в трех исследуемых линиях (Таблица 3). У трансгенных самок, гетерозиготных по е(у)Зи>, не происходило понижения экспрессии репортерного гена white после введения одной или двух копий Р{е(у)3/1РИ"}. То же самое наблюдали и у самцов гемизиготных по е(у)Зи1. Следовательно, именно PHD участвует в репрессии транскрипции в гетерохроматине.

SAY домен участвует в активации транскрипции

Ранее генетические эксперименты показали, что ген е(у)3 необходим для активации некоторых генов. В данной работе было исследовано участие отдельных доменов в активации транскрипции. Для этой цели были созданы 3 конструкции, которые кодировали рекомбинантные полипептиды, состоящие из ДНК-связывающего белка LexA и фрагментов белка SAYP в единой открытой рамке трансляции (ОРТ). Были использованы три перекрывающихся фрагмента SAYP: фрагмент (1273-1629 а.о.), содержащий полноразмерный SAY-домен, и два более коротких фрагмента (1366-1629а.о.) и (1273-1493 а.о.). В качестве положительного контроля была использована конструкция, кодирующая слитный полипептид LexA-GAL4, содержащий активационный домен транскрипционного фактора GAL4 (Таблица 4).

Было изучено влияние полученных конструкций на транскрипцию репортерных генов HIS3 и LacZ, содержащих [.ехЛ-связывагощие сайты (операторы) в промоторной области.

Экспрессия полипептида LexA-SAYP (1273-1629) вызывала заметную активацию обоих репортерных генов. Делеция первых 26 аминокислот SAY-домена в полипептиде LexA-SAYP (1366-1629) приводила к резкому снижению активации репортерных генов, а

полипептид 1.ехА-ЯАУР (1273-1493) без 80 аминокислот С-конца ЭАУ-домена не способен активировать транскрипцию.

РНО-домены и другие области 8АУР также были исследованы на способность активировать транскрипцию, однако данного эффекта обнаружено не было (данные не представлены). Следовательно, полный консервативный вАУ-домен необходим для активации транскрипции репортерных генов в клетках дрожжей, в то время как другие домены не обладают такой функцией.

Таблица 4. Консервативный домен в АУР активирует репортерные гены Я/53 и Ьас2 в клетках дрожжей.

LexA-fiision Рост без гистидина Активность /í-галактозидазы (£/)"

LexA-S A YP( 1273-1629 а.о.) ++ 31+2

LexA-SAYP( 1366-1629а.о.) + 0,4+0,1

LexA-SAYP(1273-1493 а.о.) - —

LexA-GAL4 activation domain ++ 317+30

"-'++' значительный рост,'+' слабый рост,' -' отсутствие роста ь - активность Р-галактозидазы (U) определяли, используя следующую формулу: U= 1000 х OD57g/(í х 0.5 х ODeoo), где t - время инкубации (в минутах).

Итак, результаты исследований функций отдельных доменов SAYP показали, что SAY-домен является активатором транскрипции. Он активирует транскрипцию репортерных генов в клетках дрожжей и участвует в активации транскрипции гена yellow in vivo. Кроме того, SAYP присутствует во многих сайтах эухроматина, где он колокализуется с РНК полимеразой II. Однако SAYP имеет меньшее количество сайтов связывания с хроматином, чем РНК полимеразой II, что говорит о том, что SAYP не является фактором, необходимым для транскрипции всех генов. Тем не менее SAY-домен белка играет важную роль в активации транскрипции. На это указывает тот факт, что отсутствие этого домена в мутантном белке приводит к гибели уже на эмбриональной стадии. Более того, почти все проявления мутации е(у)Зи] комплементируются белком, имеющим SAY домен.

Полученные данные позволяют предположить, что PHD-домены не важны для функционирования SAYP в эухроматине. В то же время, PHD необходимы для регуляции экспрессии генов в гетерохроматине. Мутация е(у)3"' является супрессором МЭП и активирует транскрипцию генов эухроматина, встроенных в гетерохроматин.

Для объяснения функции репрессора, которую играет SAYP в гетерохроматине, можно предложить несколько моделей. Возможно, мутация е(у)3"' вызывает снижение уровня экспрессии генов, участвующих в репрессии транскрипции в гетерохроматине и, таким образом, мутация косвенно активирует транскрипцию. Эта модель подразумевает участие PHD в активации транскрипции, так как увеличение количества SAY-домена в мутаптных трансгенных особях не изменяет влияния мутации е(у)3"' на МЭП. Однако не было выявлено участия PHD в активации транскрипции в двугибридной системе дрожжей или в экспериментах по комплементации мутантных аллелей. Значительное содержание SAYP в гетерохроматине также позволяет предположить, что SAYP непосредственно участвует в репрессии транскрипции.

SAYP репрессирует транскрипцию генов эухроматина, встроенных в гетерохроматин. Однако действие SAYP на экспрессию генов, исходно расположенных в гетерохроматине, может быть иным. Он может активировать их, как основной белок гетерохроматина НР1 активирует транскрипцию генов гетерохроматина - light и rolled. Необходимо отметить, что недавние исследования позволяют предположить, что НР1 позитивно и негативно регулирует несколько генов эухроматина.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что SAYP является белком, связанным с хроматином и обладающим двойной функцией, которая зависит от окружающего хроматина. Можно предположить, что белок действует в регуляции транскрипции позитивно или негативно посредством различных доменов, которые могут взаимодействовать с различными транскрипционными факторами или белковыми комплексами.

SA YP входит в состав мультибелкового комплекса

Было проведено фракционирование ядерного экстракта из эмбрионов дрозофилы методом гель-фильтрации. Вестерн блот-анализ полученных фракций показал, что SAYP присутствует в высокомолекулярных фракциях, массой около 2 МДа (Рис. 17).

Полученные результаты позволили предположить, что SAYP является компонентом мультибелкового комплекса. Интересно, что профиль элюции SAYP значительно перекрывается с профилем элюции компонентов комплекса TF1TD и GCN5 НАТ-содержащего комплекса.

Генетическими методами было исследовано взаимодействие SAYP с другими компонентами аппарата транскрипции. У самцов, гомозиготных по мутации е(у)У' и гетерозиготных по летальным мутациям в генах tafl, taf4 и taf6, происходило усиление мутантного фенотипа. Кроме того, в случае комбинации мутаций е(у)3"' и taf4l наблюдалось

снижение выживаемости (в 4 раза). Полученные результаты продемонстрировали взаимодействие SAYP с транскрипционными факторами TAF1, TAF4, TAF6.

Также было обнаружено взаимодействие мутации е(у)3"' с линиями дрозофилы, имеющими делеции генов, кодирующих TAF5, TAF7, TAF10, TAF12, Spt3, TFIIEa, TFIIFP, Med6 (необходимо отметить, что делеции затрагивают и ряд других генов). Показано отсутствие взаимодействия с геном, кодирующим фактор Mi-2 - главной субъединицей компонента комплекса NuRD, репрессирующего транскрипцию.

2МДа 660 кДа 440 кДа

1,2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

SAYP

ТВР

Gcn5 TAF9

Mi-2 **• «•» \

Рис. 17. Хроматографическое разделение 8 АУР-со держащих комплексов. Позиции маркеров молекулярной массы и номера фракций указаны над верхней панелью. Указаны белки, идентифицированные Вестерн блот-анализом.

Полученные результаты позволили предположить, что вАУР взаимодействует с определенными субфракциями комплексов ТИГО и ТРТС.

Для изучения партнеров ЯАУР в составе комплекса были проведены опыты по ко-иммунопреципитации (Шидловский Ю., неопубликованные данные). Согласно генетическим данным, 8АУР участвует как в активации, так и в репрессии транскрипции, поэтому было проверено взаимодействие 8АУР как с общими факторами транскрипции, так и с белками, участвующими в репрессии. Результаты экспериментов показали, что БАУР взаимодействует с ТВР и рядом ТАР (компонентами ТПШ-комплекса), а также - с (ЗСЫ5, АОА2Ь и ТЯЯАР (компонентами ТРТС-комплекса). В данной работе было выявлено генетическое взаимодействие между е(у)3 и генами, кодирующими ТВР, ТАР6 и ТАР4. Таким образом, данные по коиммунопреципитации подтвердили результаты генетических экспериментов.

Нами не было обнаружено генетического взаимодействия между SAYP и Mi-2 -главной субъединицей компонента NuRD комплекса, репрессирующего транскрипцию. Метод иммунносоосаждения также не показал взаимодействия SAYP с данным белком. Однако обнаружено взаимодействие с другим белком - ISWI (Шидловский Ю, личное сообщение), который также присутствует в гетерохроматине и участвует в репрессии транскрипции. Не исключена возможность взаимодействия SAYP с другими комплексами, ответственными за репрессию транскрипции.

Поиск белков, взаимодействующих с различными доменами SAYP в двугибридной системе дрожжей, показал взаимодействие N-концевой области белка с консервативным транскрипционным фактором Hr46 (DHR3) (данные Ю. Николенко). Этот белок имеет ДНК-связывающий домен, относится к суперсемейству ядерных рецепторов и необходим для развития и жизнеспособности. Нг46 вовлечен как в активацию, так и репрессию транскрипции. Взаимодействие SAYP и Нг46 было подтверждено биохимическими и генетическими методами Кроме того, было обнаружено, что PHD-домен белка SAYP взаимодействует с гистонметилтрансферазой Mes-4 (данные Ю.Николенко).. Полученные данные позволили предложить модель действия SAYP в регуляции транскрипции.

Модель участия различных доменов SA YP в активации и репрессии транскрипции

Для объяснения способности SAYP выполнять противоположные функции в регуляции транскрипции, которые зависят от статуса окружающего хроматина, можно предположить, что в каждом случае действует только один из доменов SAYP. Например, SAY-домен, взаимодействуя с белками эухроматина, изменяет структуру PHD-доменов, блокируя их взаимодействие с гипотетическими репрессорами транскрипции (или репрессорными комплексами). И, наоборот, в гетерохроматине отсутствуют белки, связывающиеся с SAY-доменом, и он остается свободным, либо блокируется белками гетерохроматина и, таким образом, не препятствует связыванию PHD-доменов с репрессорами.

На основании данных о белках, взаимодействующих с SAYP, можно выдвинуть следующую гипотезу. Вариабельный N-концевой домен белка SAYP участвует в связывании со специфическими факторами транскрипции, в том числе Hr46 (DHR3), и таким образом SAYP рекрутируется на промоторы генов-мишеней. AT-hook домен связывается с ДНК. Консервативный SAY-домен участвует в активации транскрипции, вероятно, посредством взаимодействия с консервативными общими факторами транскрипции: ТВР, TAF, Gcn5. PHD-домены опосредуют участие SAYP в репрессии транскрипции в гетерохроматине

предположительно через взаимодействия с гистоновым кодом и/или с репрессорами, например с белком Mes-4.

III. ВЫВОДЫ

1. Впервые клонирован ген enchancer of yellow 1 (е(у)1 Drosophila melanogaster Установлено, что е(у)1 кодирует общий фактор транскрипции эукариот TAF9, входящий в состав TFITD, основного преинициаторного комплекса РНК полимеразы И. Впервые in vivo показана функция TAF-белка, компонента комплекса TFITD. Ген e(y)l/taf9 транскрибируется повсеместно, однако наиболее высокий уровень транскрипции характерен для питающих клеток гонад самок дрозофилы. Ген e(y)l/taf9 обладает материнским эффектом. Снижение уровня транскрипции гена е(у)1 приводит к нарушению оогенеза и к стерильности самок. С помощью инактивации гена в мутантном аллеле in vivo показано, что TAF9 незаменим на эмбриональной стадии развития.

2. Впервые охарактеризовано участие TAF9 в транскрипции in vivo. Показано, что белок участвует в регуляции широкого спектра энхансер-промоторных взаимодействий.

3. Впервые продемонстрировано, что у D melanogaster существуют два TFTC-комплекса, отличающихся по своему составу и участвующих в транскрипции различных геномных локусов. Обнаружены и охарактеризованы два новых белка ADA2a и ADA2b, гомологи ADA2 дрожжей, являющиеся компонентами TFTC-комплекса D melanogaster.

4. Клонирован ген enchancer of yellow 3 (е(у)3) D melanogaster, показана его убиквитарная транскрипция Установлено, что ген е(у)3 кодирует белок, названный SAYP (2008 а.о.) и являющийся новым транскрипционным фактором РНК полимеразы II D melanogaster. Показано, что SAYP является эволюционно консервативным мультидоменным белком эукариот. Обнаружен новый эволюционно консервативный домен, названный SAY-доменом. Установлено единство доменной структуры гомологов SAYP у эукариот. Показана функция SAYP in vivo. Пониженное по сравнению с нормой количество белка в мутантных линиях вызывает снижение выживаемости, нарушения в развитии и стерильность самок. Отсутствие в мутантной линии SAY-домена белка приводит к гибели эмбрионов на ранней стадии развития.

5. Установлено, что SAYP входит в состав большого ДНК-связывающего комплекса D melanogaster. Профиль элюции SAYP значительно перекрывается с профилем элюции компонентов TFIID и GCN5 НАТ-содержащего комплексов. SAYP является корегулятором транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой II, функция которого зависит от структуры окружающего хроматина: он активирует транскрипцию генов, расположенных в эухроматине, и репрессирует транскрипцию генов в гетерохроматине. В активации

транскрипции участвует SAY-домен, в то время как за репрессию отвечают PHD-домены. Предложена модель, объясняющая механизм действия различных доменов SAYP в активации и репрессии транскрипции.

IV. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Солдатов А.В., Набирочкина Е.Н., Дзитоева С.Г., Матюнина Л.В. Георгиев П.Г. Молекулярное клонирование районов локализации генов е(у)1 и е(у)2 Drosophila melanogaster. Генетика. 1996, Т. 32, с. 1714-1716.

2. Солдатов А.В., Набирочкина Е.Н. Новый метод клонирования генов Drosophila melanogaster, маркированных высококопийным мобильным элементом. Генетика. 1996, Т. 32, с. 1717-1720.

3. Soldatov A., Nabirochkina Е„ Georgieva S., Belenkaja Т., Georgiev P. TAFn40 protein is encoded by the e(y)l gene: biological consequences of mutations. Mol. Cell Biol.. 1999, V.19(5), p.3769-3778.

4. Георгиева С.Г., Набирочкина E.H., Георгиев П.Г., Шварц Ю.В., Солдатов А.В. Исследование гена e(y)l/TAFu40 у Drosophila melanogaster in vivo. Мол, биол- 2000, Т.34, с.788-794.

5. Георгиева С.Г., Набирочкина Е.Н., Георгиев П.Г., Солдатов А.В. Ген enhancer of yellow 1 (е(у)1) Drosophila melanogaster кодирует белок TAFH40. Докл.АН.. 2000, Т. 375, с.401-403.

6. Nabirochkina E.N, Ivanov A.V. Treatment by methil methanesulfonate induces up-regulation of cytomegalovirus immediate/early promoter. BioTecchniques. 2000, V. 29 (4), p.732-736.

7. Набирочкина E.H., Иванов A.B., Солдатов А.В. Миллимолярные концентрации метилиетансульфоната увеличивают уровень транскрипции с CMV-промотора более чем в 100 раз. Мол .биол.. 2000, Т.З, с.771-774.

8 Nabirochkina Е., Georgieva S., Krasnov A., Soldatov A Rapid construction of sequencing templates by random insertion of antibiotic resistance genes. BioTechniques, 2002, V. 32(2), p.300, 302-304.

9. Nabirochkina E.N., Simonova OB, Mertsalov IB, Kulikova, DA, Ladigina NG, Korochkin LI, Buchman VL Expression pattern of dd4, a sole member of the d4 family of transcription factors in Drosophila melanogaster. Mechanisms of Development. 2002, V.l 14, p. 119-123.

10. Ермолаева M.A., Солдатов А В., Набирочкина Е.Н. Способ приготовления матриц для определения нуклеотидных последовательностей протяженных фрагментов ДНК. Мол.биол . 2002, Т.36, с.1021-1025

11. Muratoglu S., Georgieva S., Papai Gabor, Scheer E,.Enunlu I, Komonyi O., Cserpa I.,

.Lebedeva L, Nabirochkina E., Udvardy A.,.Tora L, Boros I. Two different Drosophila ADA2 homologues are present in distict GCN5 histone acetyltransferase-containing complexes. Mol.Cell.Biol.. 2003, V. 23, p. 306-321.

12. Лебедева JT. А., Георгиева С.Г., Набирочкина E.H. Исследование свойств двух гомологов ADA2 дрожжей у Drosophila melanogaster. Докл. АН. 2004, Т. 398, с. 297-299.

13. Yulii V. Shidlovskii, Aleksey N. Krasnov, Julia V. Nikolenko, Ljubov A. Lebedeva, Marina Kopantseva, Maria A. Ermolaeva, Yurij V. Ilyin, Elena N. Nabirochkina, Pavel G. Georgiev and Sofia G. Georgieva. A novel multidomain transcription coactivator SAYP can also repress transcription in heterochromatin. EMBO J.. 2005. V. 24, p. 97-107.

14. Шидловский Ю.В., Николенко Ю.В., Краснов А. Н.,.Копанцева M.P, Георгиева С. Г., Набирочкина Е. Н. Ген е(у)3 кодирует эволюционно консервативный белок SAYP необходимый в онтогенезе. Генетика. 2005, Т. 41, с. 1027-1032.

15. Николенко Ю.В.,.Шидловский Ю.В, Лебедева Л.А.,. Краснов А. Н, Георгиева С. Г., Набирочкина Е. Н. Транскрипционный коактиватор SAYP может репрессировать транскрипцию в гетерохроматине. Генетика. 2005, Т. 41, с. 1033-1037.

16. Шидловский Ю.В., Краснов А.Н., Николенко Ю.В., Георгиева С.Г., Набирочкина Е.Н. Характеристика нового активатора транскрипции РНК-полимеразы II. Докл. АН, 2005, Т.40, с. 272-274.

Обзоры:

17. Шидловский Ю В., Марданов П.В., Федорова О Н , Набирочкина Е.Н. Молекулярный аппарат инициации транскрипции РНК- полимеразой II Генетика. 2005, 41: 493-507.

18. Шидловский Ю.В., Набирочкина Е.Н. Влияние ремоделирования и модификации хроматина на процесс инициации транскрипции РНК-полимеразой II. Генетика. 2005, 41: 884-893.

19. Шидловский Ю.В., Копытова Д.В., Куршакова М.М., Набирочкина Е.Н. Принципы функционирования аппарата инициации транскрипции РНК- полимеразой II. Генетика. 2005, 41: 1157-1169.

Тезисы конференций:

20. Gejrgieva S., Soldatov A., Nabirochkina Е., Georgiev P. Studies on the role of e(y) genes in transcriptional control. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. "Mechanism of transcription". Cold Spring Hart>or, 1998: 55.

21. Georgieva S., Nabirochkina E., Soldatov A. The enhancers of yellow, e(y)l, e(y)2 and

e(y)3. Role of newly described functionally related genes in transcriptional control. Symp. "Current problems of molecular genetics and cell biology". Moscow, 2000, p.2.

22. Георгиева С.Г., Набирочкина Е.Н., Краснов А.Н., Солдатов А.В., Георгев ГТ.Г. Новые транскрипционные факторы РНК полимеразы П. III съезд биохимического общества. Санкт-Петербург, 26.06-01.07. 2002: 393-394.

23. Shidlovskii Shidlovskii Nabirochkina E.N., Krasnov A.N. E(y)3, the novel transcription factor of Drosophila melanogaster. International conference "Molecular genetics of eukaryotes." Moscow, 4-7 Febrary, 2003: 16.

24. Nikolenko J.V., Lebedeva L.A., Krasnov A.N., Nabirochkina E.N. Novel transcription

factor of Drosophila melanogaster E(y)3 participates in position effect variegation. International conference "Molecular genetics of eukaiyotes." Moscow, 4-7 Febrary, 2003: 19.

25. Shidlovskii J.V., Lebedeva L.A., Akhmetollaev I.A., Nabirochkina E.N., Krasnov A.N. E(y)3 the novel transcription factor of Drosophila melanogaster. Abstract book, Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, 25-27 September, Kyiv, Ukraine, 2003:125.

26. Yu. Shidlovskii, A. Krasnov, J. Nikolenko, L.Lebedeva, M. Kopanceva, S.Georgieva and E.Nabirochkina. Molecular characterization of a novel transcription factor. Conference "Advances in molecular cell biology", Moscow, 17-18 June, 2004: 202-212.

27. Shidlovskii Y., Nikolenko J., Krasnov A., Lebedeva L., Kopantceva M., Nabirochkina E., Georgieva.S. "A novel multidomen coactivator SAYP can also repress transcriprion in heterochromatin", EMBO/FEBS Conference on nuclear structure and dynamics, La Grande Motte, France, 24-28 September, 2005, P-162.

Заказ № 167/02/06 Подписано в печать 2102.2006 Тираж 100 экз Уел п л 2

ООО "Цифровичок", тел. (095) 797-75-76; (095) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таН: info@cfr.ru

ZQOG ft V72-G

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Набирочкина, Елена Николаевна

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. АППАРАТ ТРАНСКРИПЦИИ У ЭУКАРИОТ.

1. Транскрипция у эукариот. РНК-полимеразы.

2. РНК-полимеразы.

3. Области контроля транскрипции.

4. Инициация транскрипции РНК-полимеразой II.

II. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАКТОРЫ.

I .Компоненты транскрипционного аппарата.

2. Общие факторы транскрипции.

3. Активаторы и репрессоры.

4. Корегуляторы транскрипции.

III ХРОМАТИН.

1. Участие хроматина в процессе транскрипции.

2. Гетерохроматин и эухроматин.

3. Хроматин-ремоделирующие комплексы.

4. Комплексы, модифицирующие хроматин.

5. Взаимодействие хроматин-ремоделирущих и модифицирующих комплексов. .71 IV. ПРИНЦИПЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ АППАРАТА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ II.

1. Стадии транскрипции. Модель последовательной сборки PIC.

2. Модульная структура транскрипционного аппарата.

AT-hook.

3.Комбинаторная модель регуляции транскрипции. Синергизм действия и контекст-зависимая активность факторов транскрипции.

4. Регуляция транскрипции.

5. Регуляция активности транскрипционных факторов.

6. Репрессия транскрипции.

7. Инициация транскрипции in vivo.

8. Организация ядра и транскрипция.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

I. Объекты и задачи исследования.

II. Материалы и методы.

1. Реактивы.

2. Работа с линиями Drosophila melanogaster.

3. Программное обеспечение. Базы данных.

4. Работа с ДНК.

5. Работа с РНК.

6. Работа с белками.

7. Гибридизация in situ и иммуноокрашивание.

8. Эксперименты в двугибридной системе дрожжей.

9. Работа с культурами клеток.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ.

III. 1. Характеристика гена e(y)l/taf9, его мутантных аллелей и белка, кодируемого этим геном.

Клонирование гена е(у)1 и создание нового метода клонирования генов Drosophila melanogaster, маркированных высоко копийным мобильным элементом.

Изучение структуры гена е(у)1.

Характеристика экспрессии геноа е(у)1 и dd4 у D. melanogaster.

Изучение молекулярной природы мутации е(у)1и1.

Фенотипические проявления мутации e(y)lul.

Исследование последствий инактивации транскрипции гена e(y)l/taf9.

Изучение влияния аминокислот С - конца белка TAF9Ha активацию транскрипции гена yellow in vivo.

Изучение влияния мутации е(у)1"' на действие энхансеров гена yellow.

Исследование участия TAF9 в энхансер-промоторных взаимодействиях.

111.2. Изучение TFTC комплекса D. melanogaster.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы активации транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой II"

Анализ траснкрипции генов Ada2a и Ada2b у D. melanogaster.151

Анализ комплексов, в состав которых входят ADA2a и ADA2b.152

Характеристика TFTC комплексов у D. melanogaster.154

111.3. Структура гена е(у)3, характеристика его мутантных аллелей и белка SAYP, кодируемого геном е(у)3.157

Клонирование гена е(у)3 и определение его первичной нуклеотидной последовательности. Метод получения перекрывющихся фрагментов для последующего секвенирования.157

Характеристика структуры гена е(у)3.159

Определение доменной структуры S AYP и его гомологов у различных видов.162

Изучение экспрессии гена е(у)3. Новый метод увеличения уровня транскрипции с CMV-промотора.164

Молекулярная характеристика мутаций гена е(у)3.171

Иммунноокрашивание политенных хромосом D. melanogaster.173

Исследование влияния SAYP на экспрессию трансгенов, расположенных в гетерохроматине.175

Изучение функций SAY-домена in vivo.177

Изучение функций PHD-домена in vivo.r„v.v.179

Исследование участия SAY-домена SAYP в активации транскрипции в двугибридной системе дрожжей.180

Определение комплекса, в состав которого входит SAYP.182

IV. ОБСУЖДЕНИЕ.184

Ген е(у)1 кодирует белок TAF9. 184

Биологическая функция TAF9.185

Участие TAF9 в транскрипции in vivo.187

Роль аминокислотных остатков С-конца TAF9 in vivo.188

Характеристика состава TFTC-комплекса у D. melanogaster.190

TFTC комплексзы D. melanogaster. 191

Ген е(у)3 D. melanogaster кодирует новый транскрипционный фактор

SAYP: структура белка.192

Биологическая функция SAYP.193

SAYP является ко-регулятором РНК-полимеразы II, функция которого зависит от структуры хроматина.194

SAYP является компонентом большого мультибелкового комплекса.196

Модель участия доменов SAYP в активации и репрессии тарнскрипции.197

ВЫВОДЫ.199

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

ВВЕДЕНИЕ

Одним из важнейших молекулярно-биологических процессов является транскрипция, которая представляет собой первый этап реализации генетической информации. В связи с этим изучение транскрипции у эукариот является одной из главных проблем молекулярной генетики. В настоящее время факторы транскрипции принято делить на три большие группы: активаторы и репрессоры (специфичные регуляторы), корегуляторы и общие факторы транскрипции (General Transcription Factors, GTF). Назначение первых — контроль работы определенного гена или группы генов на определенной стадии развития или при наличии определенных сигналов. Корегуляторы связываются с энхансерами и затем вовлекают GTF, которые необходимы для транскрипции всех генов. Общие факторы транскрипции представляют собой белки и комплексы, участвующие в транскрипции большинства генов. В частности, в области промотора собирается большой преинициаторный комплекс, в свою очередь состоящий из нескольких мультибелковых комплексов, основным из которых является комплекс TFIID. TFIID-комплекс содержит в своем составе белок ТВР и ассоциированные с ним белки TAF (ТВР associated factors). TAF-белки условно подразделяют на основные компоненты TFIID, присутствующие в каждом комплексе, и на TAF, которые входят в состав только части комплексов TFIID, участвуя в регуляции транскрипции определенных групп генов. Наконец, некоторые TAF присутствуют и в других белковых комплексах, помимо TFIID.

Белки-регуляторы транскрипции (транскрипционные факторы) исключительно важны для жизнедеятельности организма. Это подтверждает тот факт, что более 5 % генов высших эукариот кодирует транскрипционные факторы. У дрожжей их количество составляет около 300 (в среднем один фактор на 20 генов), у дрозофилы -1000 (один фактор на 14 генов), у человека - около 3000 (один фактор на 10 генов).

Ядро клетки высших эукариот содержит нескольких десятков тысяч структурных генов, каждый из которых обладает определенным набором цис-регуляторных последовательностей, определяющих его функционирование на различных этапах развития организма, в определенных условиях внешней и внутренней среды. Аппарат транскрипции, обеспечивающий функционирование подобной сложной системы, представляется в настоящее время как чрезвычайно сложная многоуровневая система взаимодействующих факторов и их комплексов, тесно интегрированная с другими системами клетки. Однако механизмы действия аппарата транскрипции in vivo до сих пор остаются во многом неизученным, в частности, очень мало известно о деталях механизма активации и репрессии конкретных генов.

ДНК эукариот упакована в хроматин, который препятствует взаимодействию транскрипционных факторов с ДНК и тем самым блокирует транскрипцию генов. В клетке имеется целый ряд комплексов, которые, изменяя структуру хроматина, участвуют в регуляции транскрипции. Такие комплексы можно подразделить на две основные группы: АТФ-зависимые комплексы, локально изменяющие физическую структуру хроматина (ремоделирующие комплексы) и комплексы, осуществляющие различные химические модификации N-концов гистонов (модифицирующие комплексы).

В общем случае для инициации транскрипции необходимы модификация и ремоделирование хроматина в области промотора и регуляторных последовательностей, что обеспечивает доступность ДНК-матрицы для основных факторов транскрипции и разнообразных активаторов.

Ацетилирование высоко консервативных N-концов гистонов гистонацетилтрансферазами (Histone Acethyl Transferase, HAT) является одной из наиболее хорошо изученных модификаций.

Существуют две теории, объясняющие, как ацетилирование гистонов может влиять на активность транскрипции. Первая теория предполагает, что ацетилирование нейтрализует положительный заряд гистонов, ослабляя таким образом их взаимодействие с ДНК и делая хроматин более «рыхлым», а ДНК - доступной для транскрипционных факторов. Вторая гипотеза не исключает первую, но предполагает также, что существует «гистоновый код» и рисунок ацетилирования может служить эпигенетическим маркером для экспрессии гена, создавая сайты узнавания для факторов, вовлеченных как в активацию, так и в репрессию транскрипции.

Результаты многочисленных исследования продемонстрировали прямую связь между ацетилированием гистонов и активацией транскрипции. Таким образом, исследование белков и комплексов, обладающих НАТ-активностью, имеет большое значения для понимания процессов, проходящих при активации транскрипции у эукариот.

Одним из наиболее хорошо изученных комплексов является SAGA-комплекс дрожжей, содержащий в своем составе гистонацетилтрансферазу GCN5 (GCN5 HAT), белки Ada, Spt, а также некоторые из белков TAF, которые, как было указано выше, одновременно являются компонентами TFIID - основного преинициаторного комплекса. Комплекс, содержащий гистонацетилтрансферазу GCN5 (TFTC), был охарактеризован у человека. Недавно были получены данные, что GCN5 НАТ-комплекс, подобный TFTC существует и у дрозофилы.

Настоящая работа посвящена изучению факторов транскрипции РНК-полимеразы II и характеристике TFTC-комплекса у Drosophila melanogaster.

Список сокращений

AD (activation domain) — Активационный домен

BSA (bovine serum albumine) — Бычий сывороточный альбумин

CoIP (coimmunoprecipitaition) — Коиммунопреципитация

CTD (C-terminal domain) — С-концевой домен Pol II

DAB (TFIID-A-B complex) — Комплекс TFIID-A-B

DBD (DNA-binding domain) — ДНК-связывающий домен

DPE (downstream promoter element) — Нижележащий элемент промотора

EST (expressed sequence tag) Фрагмент экспрессирующейся последовательности

GTF (general transcription factor) — Общий фактор транскрипции

HAT (histone-acetyltransferase) — Гистонацетилтрансфераза

HDAC (histone-deacetylase) — Гистондеацетилаза

Inr (initiator) — Инициатор

IP (immunoprecipitation) — Иммунопреципитация

LCR (locus control region) — Область контроля локуса

MAR (matrix attachment region) Участок прикрепления к матриксу

NC (negative cofactor) — Репрессирующий кофактор

NLS (nuclear localization signal) — Сигнал ядерной локализации

NR (nuclear receptor) — Ядерный рецептор

P-CTD (phosphorylated CTD) — Фосфорилированный CTD

PC (positive cofactor) — Активирующий кофактор

PEV (position effect variegation) — Мозаичный эффект положения

PHD (plant homeodomain) — Гомеодомен растений

PIC (preinitiaitory complex) — Преинициаторный комплекс

Pol II (RNA polymerase II) — РНК-полимераза II

RD (repression domain) — Репрессорный домен

SAYP (supporter of activation of yellow protein) Белок, поддерживающий активацию yellow

Su (var) (suppressor of variegation) — Супрессор МЭП

TAF (TBP-associated factor) — Фактор, ассоциированный с ТВР

TBP (TATA-binding protein) — ТАТА-связывающий белок

TCR (transcription control region) — Область контроля транскрипции

TFIIA.H (transcription factor for Pol II) — Транскрипционный фактор Pol II

TRF (TBP-related factor) — ТВР-подобный фактор

UAS (upstream activator sequence) Вышележащая активирующая последовательность

USA (universal stimulatory activity) Универсальная стимулирующая активность

UTR (untranslated sequence) Нетранслируемая последовательность

МЭП Мозаичный эффект положения a.o. — Аминокислотный остаток

П.Н. - Пары нуклеотидов

Т.П.Н. - Тысяча пар нуклеотидов

HT Нуклеотиды г., й

Q г < ^Ь

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. АППАРАТ ТРАНСКРИПЦИИ У ЭУКАРИОТ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Набирочкина, Елена Николаевна

III. выводы

1. Впервые клонирован ген enhancer of yellow 1 (e(y)l Drosophila melanogaster. Установлено, что e(y)l кодирует общий фактор транскрипции эукариот TAF9, входящий в состав TFIID, основного преинициаторного комплекса РНК полимеразы И. Впервые in vivo показана функция TAF-белка, компонента комплекса TFIID. Ген e(y)l/taf9 транскрибируется повсеместно, однако наиболее высокий уровень транскрипции характерен для питающих клеток гонад самок дрозофилы. Ген e(y)l/taf9 обладает материнским эффектом. Снижение уровня транскрипции гена е(у)1 приводит к нарушению оогенеза и к стерильности самок. С помощью инактивации гена в мутантном аллеле in vivo показано, что TAF9 незаменим на эмбриональной стадии развития.

2. Впервые охарактеризовано участие TAF9 в транскрипции in vivo. Показано, что белок участвует в регуляции широкого спектра энхансер-промоторных взаимодействий.

3. Впервые продемонстрировано, что у D. melanogaster существуют два TFTC-комплекса, отличающихся по своему составу и участвующих в транскрипции различных геномных локусов. Обнаружены и охарактеризованы два новых белка ADA2a и ADA2b, гомологи ADA2 дрожжей, являющиеся компонентами TFTC-комплекса D. melanogaster.

4. Клонирован ген enhancer of yellow 3 (е(у)3) D. melanogaster, показана его убиквитарная транскрипция. Установлено, что ген е(у)3 кодирует белок, названный SAYP (2008 а.о.) и являющийся новым транскрипционным фактором РНК полимеразы IID. melanogaster. Показано, что SAYP является эволюционно консервативным мультидоменным белком эукариот. Обнаружен новый эволюционно консервативный домен, названный SAY-доменом. Установлено единство доменной структуры гомологов SAYP у эукариот. Показана функция SAYP in vivo. Пониженное по сравнению с нормой количество белка в мутантных линиях вызывает снижение выживаемости, нарушения в развитии и стерильность самок. Отсутствие в мутантной линии SAY-домена белка приводит к гибели эмбрионов на ранней стадии развития.

5. Установлено, что SAYP входит в состав большого ДНК-связывающего комплекса!). melanogaster. Профиль элюции SAYP значительно перекрывается с профилем элюции компонентов TFIID и GCN5 НАТ-содержащего комплексов. SAYP является корегулятором транскрипции, осуществляемой РНК-полимеразой И, функция которого зависит от структуры окружающего хроматина: он активирует транскрипцию генов, расположенных в эухроматине, и репрессирует транскрипцию генов в гетерохроматине. В активации транскрипции участвует SAY-домен, в то время как за репрессию отвечают PHD-домены. Предложена модель, объясняющая механизм действия различных доменов SAYP в активации и репрессии транскрипции.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Набирочкина, Елена Николаевна, Москва

1. Structure and functional organization of the nuclear matrix. Academic Press. International review of cytology & survey of cell biology.

2. Nonradioactive in situ hybridization application manual. .(1996). Bochringer Manheim GmbH, Biochemica. p211

3. Aasland, R., Gibson, T.J., Stewart, A.F. (1995) The PHD finger: implications for chromatin-mediated transcriptional regulation. Trends Biochem Sci 20,56-9

4. Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W., Lipman, D.J. (1990) Basic local alignment search tool. JMol Biol 215,403-10

5. Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W., Lipman, D.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25, 3389-402

6. Alvarez, M., Rhodes, S.J., Bidwell, J.P. (2003) Context-dependent transcription: all politics is local. Gene 313,43-57

7. Anderson, M.G., Scoggin, K.E., Simbulan-Rosenthal, C.M., Steadman, J.A. (2000) Identification of poly(ADP-ribose) polymerase as a transcriptional coactivator of the human T-cell leukemia virus type 1 Tax protein. J Virol 74, 2169-77

8. Aoyagi, N., Wassarman, D.A. (2000) Genes encoding Drosophila melanogaster RNA polymerase II general transcription factors: diversity in TFIIA and TFIID components contributes to gene-specific transcriptional regulation. J Cell Biol 150, F45-50

9. Aravind, L., Iyer, L.M., Koonin, E.V. (2003) Scores of RINGS but no PHDs in ubiquitin signaling. Cell Cycle 2,123-6

10. Aravind, L., Landsman, D. (1998) AT-hook motifs identified in a wide variety of DNA-binding proteins. Nucleic Acids Res 26,4413-21

11. Armache, K.J., Mitterweger, S., Meinhart, A., Cramer, P. (2005) Structures of complete RNA polymerase II and its subcomplex, Rpb4/7. J Biol Chem 280,71314

12. Ashburner M. (1989) Drosophila. A laboratory manual. CSH laboratory press, Cambridge

13. Asturias, F.J. (2004) RNA polymerase II structure, and organization of the preinitiation complex. Curr Opin Struct Biol 14,121-9

14. Asturias, F.J., Jiang, Y.W., Myers, L.C., Gustafsson, C.M., Kornberg, R.D. (1999) Conserved structures of mediator and RNA polymerase II holoenzyme. Science 283, 985-7

15. Ayoubi, T.A., Van De Ven, W.J. (1996) Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB /10,453-60

16. Babb, R., Cleary, M.A., Herr, W. (1997) OCA-B is a functional analog of VP16 but targets a separate surface of the Oct-1 POU domain. Mol Cell Biol 17,7295305

17. Baek, H.J., Malik, S., Qin, J„ Roeder, R.G. (2002) Requirement of TRAP/mediator for both activator-independent and activator-dependent transcription in conjunction with TFIID-associated TAF(II)s. Mol Cell Biol 22, 2842-52

18. Balasubramanian, R., Pray-Grant, M.G., Selleck, W., Grant, P.A., Tan, S. (2002) Role of the Ada2 and Ada3 transcriptional coactivators in histone acetylation. J Biol Chem 277, 7989-95

19. Barlev, N.A., et al (2003) A novel human Ada2 homologue functions with Gcn5 or Brgl to coactivate transcription. Mol Cell Biol 23, 6944-57

20. Baskar J.F., Smith, P.P., Ciment G.S., Hoffman S., et.al. (1996) Developmental analysis of the cytomegalovirus enhancer in transgenic animals. J Virol 70,3215-26

21. Bateman, A., et al (2004) The Pfam protein families database. Nucleic Acids Res 32 Database issue, D138-41

22. Becker, P.B., Horz, W. (2002) ATP-dependent nucleosome remodeling. Annu Rev Biochem 71, 247-73

23. Belenkaya, Т., Barseguyan, K., Hovhannisyan, H., Biryukova, I., Kochieva, E.Z., Georgiev, P. (1998) P element sequences can compensate for a deletion of the yellow regulatory region in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet 259, 79-87

24. Belmont, A. (2003) Dynamics of chromatin, proteins, and bodies within the cell nucleus. Curr Opin Cell Biol 15,304-10

25. Berezney, R. (2002) Regulating the mammalian genome: the role of nuclear architecture. Adv Enzyme Regul 42, 39-52

26. Berger, S.L. (2002) Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev 12, 142-8

27. Bhaumik, S.R., Green, M.R. (2002) Differential requirement of SAGA components for recruitment of TATA-box-binding protein to promoters in vivo. Mol Cell Biol 22, 7365-71

28. Bhaumik, S.R., Raha, Т., Aiello, D.P., Green, M.R. (2004) In vivo target of a transcriptional activator revealed by fluorescence resonance energy transfer. Genes Dev 18,333-43

29. Bjorklund, S., Almouzni, G., Davidson, I., Nightingale, K.P., Weiss, K. (1999) Global transcription regulators of eukaryotes. Cell 96, 759-67

30. Boehm, A.K., Saunders, A., Werner, J., Lis, J.T. (2003) Transcription factor and polymerase recruitment, modification, and movement on dhsp70 in vivo in the minutes following heat shock. Mol Cell Biol 23, 7628-37

31. Bordoli, L., Netsch, M., Luthi, U., Lutz, W., Eckner, R. (2001) Plant orthologs of рЗОО/CBP: conservation of a core domain in metazoan рЗОО/CBP acetyltransferase-related proteins. Nucleic Acids Res 29, 589-97

32. Borggrefe, Т., Davis, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Kornberg, R.D. (2002) A complex of the Srb8, -9, -10, and -11 transcriptional regulatory proteins from yeast. J Biol Chem 277,44202-7

33. Boube, M., Faucher, C., Joulia, L., Cribbs, D.L., Bourbon, H.M. (2000) Drosophila homologs of transcriptional mediator complex subunits are required for adult cell and segment identity specification. Genes Dev 14, 2906-17

34. Boube, M., Joulia, L., Cribbs, D.L., Bourbon, H.M. (2002) Evidence for a mediator of RNA polymerase II transcriptional regulation conserved from yeast to man. Cell 110,143-51

35. Boudreault, A.A., et al (2003) Yeast enhancer of polycomb defines global Esal-dependent acetylation of chromatin. Genes Dev 17,1415-28

36. Brady, M.E., Ozanne, D.M., Gaughan, L., Waite, I., Cook, S., Neal, D.E., Robson, C.N. (1999) Tip60 is a nuclear hormone receptor coactivator. J Biol Chem 274,17599-604

37. Brand, M., Yamamoto, K., Staub, A., Tora, L. (1999) Identification of TATA-binding protein-free TAFII-containing complex subunits suggests a role in nucleosome acetylation and signal transduction. J Biol Chem 274, 18285-9

38. Brandeis, M., Frank, D., Keshet, I., Siegfried, Z., Mendelsohn, M., Nemes, A., Temper, V., Razin, A., Cedar, H. (1994) Spl elements protect a CpG island from de novo methylation. Nature 371,435-8

39. Brehm, A., Langst, G., Kehle, J., Clapier, C.R., Imhof, A., Eberharter, A., Muller, J., Becker, P.B. (2000) dMi-2 and ISWI chromatin remodelling factors have distinct nucleosome binding and mobilization properties. EMBO J19,4332-41

40. Brou, C., Chaudhary S., Davidson I., Lutz Y., Wu J., Egly J., Tora L., Chambon P. (1993) Distinct TFIID complexes mediate the effect of different transcriptional activators. EMBO J12,489-99

41. Brown, C.E., Lechner, Т., Howe, L., Workman, J.L. (2000) The many HATs of transcription coactivators. Trends Biochem Sci 25,15-9

42. Brownell, J.E., Zhou, J., Ranalli, Т., Kobayashi, R., Edmondson, D.G., Roth, S.Y., Allis, C.D. (1996) Tetrahymena histone acetyltransferase A: a homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84, 843-51

43. Burke, T.W., Cook, J.G., Asano, M., Nevins, J.R. (2001) Replication factors MCM2 and ORC1 interact with the histone acetyltransferase HBOl. J Biol Chem 276,15397-408

44. Burke, T.W., Kadonaga, J.T. (1996) Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters. Genes Dev 10,711-24

45. Burke, T.W., Kadonaga, J.T. (1997) The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. Genes Dev 11, 3020-31

46. Burley, S.K., Roeder, R.G. (1996) Biochemistry and structural biology of transcription factor IID (TFIID). Annu Rev Biochem 65, 769-99

47. Bushmeyer, S., Park, K., Atchison, M.L. (1995) Characterization of functional domains within the multifunctional transcription factor, YY1. J Biol Chem 270, 30213-20

48. Candau, R., Moore, P.A., Wang, L., Barlev, N., Ying, C.Y., Rosen, C.A., Berger, S.L. (1996) Identification of human proteins functionally conserved with the yeast putative adaptors ADA2 and GCN5. Mol Cell Biol 16, 593-602

49. Cang, Y., Prelich, G. (2002) Direct stimulation of transcription by negative cofactor 2 (NC2) through TATA-binding protein (TBP). Proc Natl Acad Sci USA 99, 12727-32

50. Capili, A.D., Schultz, D.C., Rauscherlll, F.J., Borden, K.L. (2001) Solution structure of the PHD domain from the KAP-1 corepressor: structural determinants for PHD, RING and LIM zinc-binding domains. EMBO J 20, 165-77

51. Carey, M. (1998) The enhanceosome and transcriptional synergy. Cell 92 , 5-8

52. Carey, M. and Smale, S.T. (2000) Transcriptional regulation in eucariotes CSHL Press, New York

53. Carrozza, M.J., Utley, R.T., Workman, J.L., Cote, J. (2003) The diverse functions of histone acetyltransferase complexes. Trends Genet 19,321-9

54. Champagne, N., Bertos, N.R., Pelletier, N., Wang, A.H., Vezmar, M., Yang, Y., Heng, H.H., Yang, X.J. (1999) Identification of a human histone acetyltransferase related to monocytic leukemia zinc finger protein. J Biol Chem 274,28528-36

55. Chan, H.M., La Thangue, N.B. (2001 ) p300/CBP proteins: HATs for transcriptional bridges and scaffolds. J Cell Sci 114,2363-73

56. Chen, B.S., Hampsey, M. (2002) Transcription activation: unveiling the essential nature of TFIID. Curr Biol 12, R620-2

57. Chen, J.L., Attardy L.D., Verrijzer, C.P., Yokomori, K., Tjin, R. (1994) Assembly of recombinant TFIID reveals differential coactivator requirements for distinct transcriptional activators. Cell 19, 93-105

58. Chestkov, A.V., Baka I.D., Kost, M.V., Georgiev, G.P., Buchman, V.L. (1996) The d4 gene family in the human genome Genomics 36,174-177.

59. Chen, B.S., Mandal, S.S., Hampsey, M. (2004) High-resolution protein-DNA contacts for the yeast RNA polymerase II general transcription machinery. Biochemistry 43,12741-9

60. Chen, D., Dundr, M., Wang, C., Leung, A., Lamond, A., Misteli, Т., Huang, S. (2005) Condensed mitotic chromatin is accessible to transcription factors and chromatin structural proteins. J Cell Biol 168,41-54

61. Chen, H.T., Hahn, S. (2004) Mapping the location of TFIIB within the RNA polymerase II transcription preinitiation complex: a model for the structure of the PIC. Cell 119, 169-80

62. Chinenov, Y. (2002) A second catalytic domain in the Elp3 histoneacetyl transferases: a candidate for histone demethylase activity? Trends Biochem Sci 27,115-7

63. Corona, D.F., Tamkun, J.W. (2004) Multiple roles for ISWI in transcription, chromosome organization and DNA replication. Biochim Biophys Acta 1677,1139

64. Corpet, F. (1988) Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res 16,10881-90

65. Cosma, M.P. (2002) Ordered recruitment: gene-specific mechanism of transcription activation. Mol Cell 10,227-36

66. Cryderman, D.E., Cuaycong, M.H., Elgin, S.C., Wallrath, L.L. (1998) Characterization of sequences associated with position-effect variegation at pericentric sites in Drosophila heterochromatin. Chromosoma 107,277-85

67. Cryderman, D.E., Morris, E.J., Biessmann, H., Elgin, S.C., Wallrath, L.L. (1999) Silencing at Drosophila telomeres: nuclear organization and chromatin structure play critical roles. EMBO J18, 3724-35

68. Currie, R.A. (1998) NF-Y is associated with the histone acetyltransferases GCN5 and P/CAF. J Biol Chem 273,1430-4

69. Dasgupta, A., Darst, R.P., Martin, K.J., Afshari, C.A., Auble, D.T. (2002) Motl activates and represses transcription by direct, ATPase-dependent mechanisms . Proc Natl Acad Sci USA 99,2666-71

70. DeCamillis, M„ Cheng, N.S., Pierre, D., Brock, H.W. ( 1992) The polyhomeotic gene of Drosophila encodes a chromatin protein that shares polytene chromosome-binding sites with Polycomb. Genes Dev 6,223-32

71. Dellino, G.I., Schwartz, Y.B., Farkas, G., McCabe, D., Elgin, S.C., Pirrotta, V. (2004) Polycomb silencing blocks transcription initiation. Mol Cell 13, 887-93

72. Deng, W.G., Wu, K.K. (2003) Regulation of inducible nitric oxide synthase expression by p300 and p50 acetylation. J Immunol 171, 6581-8

73. Dilworth, F.J., Seaver, K.J., Fishburn, A.L., Htet, S.L., Tapscott, S.J. (2004) In vitro transcription system delineates the distinct roles of the coactivators pCAF and p300 during MyoD/E47-dependent transactivation. Proc Natl Acad Sci USA 101, 11593-8

74. Dimova, D., Nackerdien, Z., Furgeson, S., Eguchi, S., Osley, M.A. (1999) A role for transcriptional repressors in targeting the yeast Swi/Snf complex. Mol Cell 4, 75-83

75. DiRenzo, J., Shang, Y., Phelan, M., Sif, S., Myers, M., Kingston, R., Brown, M. (2000) BRG-1 is recruited to estrogen-responsive promoters and cooperates with factors involved in histone acetylation. Mol Cell Biol 20, 7541-9

76. Doyon, Y., Selleck, W., Lane, W.S., Tan, S., Cote, J. (2004) Structural and functional conservation of the NuA4 histone acetyltransferase complex from yeastto humans. Mol Cell Biol 24,1884-96

77. Dubrovskaya V., Lavigne A.-C., Davidson I., Acker J., Staub, A., Tora L (1996) Distinct domains of hTAFIIlOO are reqired for functional interaction with transcription factor TFIIFb(RAP30) and incorporation into the TFIID complex. EMBOJ15, 3702-12

78. Eberharter, A., Becker, P.B. (2002 ) Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. Second in review series on chromatin dynamics . EMBO Rep 3,224-9

79. Eberharter, A., Becker, P.B. (2002 ) Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. Second in review series on chromatin dynamics. EMBO Rep 3,224-9

80. Eberharter, A., Sterner, D.E., Schieltz, D., Hassan, A., Yates, J.R. 3rd, Berger, S.L., Workman, J.L. (1999) The ADA complex is a distinct histone acetyltransferase complex in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 19,6621-31

81. Ehling, U.H., Cumming, R.B., Mailing, H.V. (1968) Induction of dominant lethal mutations by alkylating agents in male mice. Mutat Res 5,417-428

82. Ehrenhofer-Murray, A.E., Rivier, D.H., Rine, J. (1997) The role of Sas2, an acetyltransferase homologue of Saccharomyces cerevisiae, in silencing and ORC function. Genetics 145, 923-34

83. Eisen, A., Utley, R.T., Nourani, A., Allard, S., Schmidt, P., Lane, W.S., Lucchesi, J.C., Cote, J. (2001) The yeast NuA4 and Drosophila MSL complexes contain homologous subunits important for transcription regulation. J Biol Chem 276, 3484-91

84. Eissenberg, J.C., Elgin, S.C. (2000) The HP1 protein family: getting a grip on chromatin. Curr Opin Genet Dev 10,204-10

85. Eissenberg, J.C., Elgin, S.C. (2000) The HP1 protein family: getting a grip on chromatin. Curr Opin Genet Dev 10,204-10

86. Emami, K.H., Jain, A., Smale, S.T. (1997) Mechanism of synergy between TATA and initiator: synergistic binding of TFIID following a putative TFILA-induced isomerization. Genes Dev 11, 3007-19

87. Emerson, B.M. (2002) Specificity of gene regulation. Cell 109,267-70

88. Erkine, A.M. (2004) Activation domains of gene-specific transcription factors: are histones among their targets? Biochem Cell Biol 82, 453-9

89. Ezzat, S., Yu, S., Asa, S.L. (2003) Ikaros isoforms in human pituitary tumors: distinct localization, histone acetylation, and activation of the 5' fibroblast growth factor receptor-4 promoter. Am J Pathol 163,1177-84

90. Fazzio, T.G., Kooperberg, C., Goldmark, J.P., Neal, C., Basom, R., Delrow, J., Tsukiyama, T. (2001) Widespread collaboration of Isw2 and Sin3-Rpd3 chromatin remodeling complexes in transcriptional repression. Mol Cell Biol 21, 6450-60

91. Featherstone, M. (2002) Coactivators in transcription initiation: here are your orders. Curr Opin Genet Dev 12, 149-55

92. Fourel, G., Magdinier, F., Gilson, E. (2004) Insulator dynamics and the setting of chromatin domains. Bioessays 26, 523-32

93. Fox, C.A., McConnell, K.H. (2004) Toward biochemical understanding of a transcriptionally silenced chromosomal domain in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem

94. Galarneau, L., et/ al (2000) Multiple links between the NuA4 histone acetyltransferase complex and epigenetic control of transcription. Mol Cell 5,92737

95. Ge, H., Roeder, R.G. (1994) Purification, cloning, and characterization of a human coactivator, PC4, that mediates transcriptional activation of class II genes. Cell 78, 513-23

96. Geer, L.Y., Domrachev, M., Lipman, D.J., Bryant, S.H. (2002) CDART: protein homology by domain architecture. Genome Res 12,1619-23

97. Georgiev, P., Kozycina, M. (1996) Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations. Genetics 142,425-36

98. Georgiev, P.G. (1994) Identification of mutations in three genes that interact with zeste in the control of white gene expression in Drosophila melanogaster. Genetics 138,733-9

99. Georgiev, P.G., Gerasimova, T.I. (1989) Novel genes influencing the expression of the yellow locus and mdg4 (gypsy) in Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet 220, 121-6

100. Georgiev, P.G., Kiselev, S.L., Simonova, O.B., Gerasimova, T.I. (1990) A novel transposition system in Drosophila melanogaster depending on the Stalker mobile genetic element. EMBO J9,2037-44

101. Georgieva, S., et al (2000) Two novel Drosophila TAF(II)s have homology with human TAF(II)30 and are differentially regulated during development. Mol Cell Biol 20, 1639-48

102. Georgieva, S.G., Nabirochkina, E.N., Georgiev, P.G., Soldatov, A.V. (2000) Gene enhancer of yellow 1 of Drosophila melanogaster codes for protein TAFII40. Dokl Biochem 375, 228-30

103. Geyer, P.K. (1997) The role of insulator elements in defining domains of gene expression. Curr Opin Genet Dev 7, 242-8

104. Geyer, P.K., Corces, V.G. (1987) Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genes Dev 1, 996-1004

105. Geyer, P.K., Green, M.M., Corces, V.G. (1988) Reversion of a gypsy-induced mutation at the yellow (y) locus of Drosophila melanogaster is associated with the insertion of a newly defined transposable element. Proc Natl Acad Sci USA 85, 3938-42

106. Geyer, P.K., Green, M.M., Corces, V.G. (1988) Mutant gene phenotypes mediated by a Drosophila melanogaster retrotransposon require sequences homologous to mammalian enhancers. Proc Natl Acad Sci US ASS, 8593-7

107. Geyer, P.K., Richardson, K.L., Corces, V.G., Green, M.M. (1988) Genetic instability in Drosophila melanogaster: P-element mutagenesis by gene conversion. Proc Natl Acad Sci US ASS, 6455-9

108. Geyer, P.K., Spana, C., Corces, V.G. (1986) On the molecular mechanism of gypsy-induced mutations at the yellow locus of Drosophila melanogaster. EMBO J 5,2657-62

109. Giaccia, A.J., Kastan, M.B. (1998) The complexity of p53 modulation: emerging patterns from divergent signals. Genes Dev 12, 2973-83

110. Gill, G. (2003) Post-translational modification by the small ubiquitin-related modifier SUMO has big effects on transcription factor activity. Curr Opin Genet Devil, 108-13

111. Goodrich, J.A., Hoey, Т., Thut, C.J., Admon, A., Tjian, R. (1993) Drosophila TAFII40 interacts with both a VP 16 activation domain and the basal transcription factor TFIIB. Cell 75, 519-30

112. Gotzmann, J., Foisner, R. (1999) Lamins and lamin-binding proteins in functional chromatin organization. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 9, 257-65

113. Grant, P.A., Eberharter, A., John, S., Cook, R.G., Turner, B.M., Workman, J.L. (1999) Expanded lysine acetylation specificity of Gcn5 in native complexes. J Biol Chem 274,5895-900

114. Grant, P.A., Schieltz, D., Pray-Grant, M.G., Yates, J.R. 3rd, Workman, J.L. (1998) The ATM-related cofactor Tral is a component of the purified SAGA complex. Mol Cell 2, 863-7

115. Green, M.R. (2000) TBP-associated factors (TAFIIs): multiple, selective transcriptional mediators in common complexes. Trends Biochem Sci 25, 59-63

116. Grunstein, M. (1992) Histones as regulators of genes. SciAm 267, 68-74B

117. Gu, W., Szauter, P., Lucchesi, J.C. (1998) Targeting of MOF, a putative histone acetyl transferase, to the X chromosome of Drosophila melanogaster. Dev Genet 22,56-64

118. Gustafsson, C.M., Myers, L.C., Beve, J., Spahr, H., Lui, M., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Kornberg, R.D. (1998) Identification of new mediator subunits in the RNA polymerase II holoenzyme from Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 273,30851-4

119. Gustafsson, C.M., Samuelsson, T. (2001) Mediator-a universal complex in transcriptional regulation. Mol Microbiol 41,1-8

120. Hall, I.M., Shankaranarayana, G.D., Noma, K., Ayoub, N., Cohen, A., Grewal, S.I. (2002) Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science 297,2232-7

121. Halle, J.P., Stelzer, G., Goppelt, A., Meisterernst, M. (1995) Activation of transcription by recombinant upstream stimulatory factor 1 is mediated by a novel positive cofactor. J Biol Chem 270,21307-11

122. Hansen, J.C., Tse, C., Wolffe, A.P. (1998) Structure and function of the core histone N-termini: more than meets the eye. Biochemistry 37, 17637-41

123. Hapgood, J.P., Riedemann, J., Scherer, S.D. (2001) Regulation of gene expression by GC-rich DNA cis-elements. Cell Biol Int 25,17-31

124. Harvey, D.M., Levine, A.J. (1991) p53 alteration is a common event in the spontaneous immortalization of primary BALB/c murine embryo fibroblasts. Genes Dev 5, 2375-85

125. Hassan, A.H., Neely, K.E., Vignali, M., Reese, J.C., Workman, J.L. (2001) Promoter targeting of chromatin-modifying complexes. Front Biosci 6, D1054-64

126. Hayes, J.J., Hansen, J.C. (2001) Nucleosomes and the chromatin fiber. Curr Opin Genet Dev 11, 124-9

127. Hengartner, C.J., Thompson, C.M., Zhang, J., Chao, D.M., Liao, S.M., Koleske, A.J., Okamura, S., Young, R.A. (1995) Association of an activator with an RNA polymerase II holoenzyme. Genes Dev 9, 897-910

128. Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S.A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. (1997) Nucleic Acids Res 25, 395758.

129. Henry, K.W., et al (2003) Transcriptional activation via sequential histone H2B ubiquitylation and deubiquitylation, mediated by SAGA-associated Ubp8. Genes Devil, 2648-63

130. Henry, K.W., et al (2003) Transcriptional activation via sequential histone H2B ubiquitylation and deubiquitylation, mediated by SAGA-associated Ubp8. Genes Dev 17, 2648-63

131. Hilfiker, A., Hilfiker-Kleiner, D., Pannuti, A., Lucchesi, J.C. (1997) mof, a putative acetyl transferase gene related to the Tip60 and MOZ human genes and to the SAS genes of yeast, is required for dosage compensation in Drosophila. EMBO J16, 2054-60

132. Hochheimer, A., Tjian, R. (2003) Diversified transcription initiation complexes expand promoter selectivity and tissue-specific gene expression. Genes Dev 17, 1309-20

133. Hofmann, W.A., et al (2004) Actin is part of pre-initiation complexes and is necessary for transcription by RNA polymerase II. Nat Cell Biol 6,1094-101

134. Holstege, F.C., Jennings, E.G., Wyrick, J.J., Lee, T.I., Hengartner, C.J., Green, M.R., Golub, T.R., Lander, E.S., Young, R.A. (1998) Dissecting the regulatory circuitry of a eukaryotic genome. Cell 95,717-28

135. Horn, P.J., Peterson, C.L. (2002) Molecular biology. Chromatin higher order folding—wrapping up transcription. Science 291, 1824-7

136. Howe, L., Kusch, Т., Muster, N., Chateiji, R., Yates, J.R. 3rd, Workman, J.L. (2002) Ynglp modulates the activity of Sas3p as a component of the yeast NuA3 Hhistone acetyltransferase complex. Mol Cell Biol 22,5047-53

137. Huisinga, K.L., Pugh, B.F. (2004) A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae . Mol Cell 13, 573-85

138. Iizuka, M., Stillman, B. (1999) Histone acetyltransferase HBOl interacts with the ORC1 subunit of the human initiator protein. J Biol Chem 214,23027-34

139. Ikura, Т., Ogryzko, V.V., Grigoriev, M., Groisman, R., Wang, J., Horikoshi, M., Scully, R., Qin, J., Nakatani, Y. (2000) Involvement of the TIP60 histone acetylase complex in DNA repair and apoptosis. Cell 102,463-73

140. Jacobs, S.A., Taverna, S.D., Zhang, Y., Briggs, S.D., Li, J., Eissenberg, J.C., Allis, C.D., Khorasanizadeh, S. (2001) Specificity of the HP1 chromo domain for the methylated N-terminus of histone H3. EMBO J 20, 5232-41

141. Jacq, X., Brou, C., Lutz,Y., Davidson, I., Chambon P., Tora L. (1994) Human TAFII30 is present in a distinct TFIID complex and is required for transcriptional activation by the estrogen receptor. Cell 19,107-117

142. Jenuwein, Т., Allis, C.D. (2001) Translating the histone code. Science 293,107480

143. Johnson, S.A., Dubeau, L., White, R.J., Johnson, D.L. (2003) The TATA-binding protein as a regulator of cellular transformation. Cell Cycle 2,442-4

144. Jones, D.O., Cowell, I.G., Singh, P.B. (2000) Mammalian chromodomainproteins: their role in genome organisation and expression. Bioessays 22, 124-37

145. Kadonaga, J.T. (2004) Regulation of RNA polymerase II transcription by sequence-specific DNA binding factors. Cell 116,247-57

146. Kaiser, K., Meisterernst, M. (1996) The human general co-factors. Trends Biochem Sci 21, 342-5

147. Kalkhoven, E. (2004) СВР and p300: HATs for different occasions. Biochem Pharmacol 68, 1145-55

148. Kalkhoven, E., Teunissen, H., Houweling, A., Verrijzer, C.P., Zantema, A. (2002) The PHD type zinc finger is an integral part of the СВР acetyltransferase domain. Mol Cell Biol 22, 1961-70

149. Kamine, J., Elangovan, В., Subramanian, Т., Coleman, D., Chinnadurai, G. (1996) Identification of a cellular protein that specifically interacts with the essential cysteine region of the HIV-1 Tat transactivator. Virology 216,357-66

150. Karpova, T.S., Chen, T.Y., Sprague, B.L., McNally, J.G. (2004) Dynamic interactions of a transcription factor with DNA are accelerated by a chromatin remodeller. EMBO Rep 5, 1064-70

151. Kelly, W.G., Fire, A. (1998) Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans. Development 125,2451-6

152. Kim, Т.К., Maniatis, T. (1997) The mechanism of transcriptional synergy of an in vitro assembled interferon-beta enhanceosome. Mol Cell 1,119-29

153. Kim, Т.К., Zhao, Y., Ge, H., Bernstein, R., Roeder, R.G. (1995) TATA-binding protein residues implicated in a functional interplay between negative cofactor NC2 (Drl) and general factors TFIIA and TFIIB. J Biol Chem 270,10976-81

154. Kingston, R.E., Bunker, C.A., Imbalzano, A.N. (1996) Repression and activation by multiprotein complexes that alter chromatin structure. Genes Dev 10, 905-20

155. Kleff, S„ Andrulis, E.D., Anderson, C.W., Sternglanz, R. (1995) Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase. J Biol Chem 270,24674-7

156. Klemm, R.D., Goodrich, J.A., Zhou, S., Tjian, R. (1995) Molecular cloning and expression of the 32-kDa subunit of human TFIID reveals interactions with VP16 and TFIIB that mediate transcriptional activation. Proc Natl Acad Sci USA 92, 5788-92

157. Kouskouti, A., Scheer, E., Staub, A., Tora, L., Talianidis, I. (2004) Gene-specific modulation of TAF10 function by SET9-mediated methylation. Mol Cell 14,17582

158. Kouzarides, T. (2003) Wellcome Trust Award Lecture. Chromatin-modifyingenzymes in transcription and cancer. Biochem Soc Trans 31, 741-3

159. Kouzarides, T. (2003) Wellcome Trust Award Lecture. Chromatin-modifying enzymes in transcription and cancer. Biochem Soc Trans 31, 741-3

160. Kretzschmar, M., Meisterernst, M., Roeder, R.G. (1993) Identification of human DNA topoisomerase I as a cofactor for activator-dependent transcription by RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci USA 90, 11508-12

161. Kuo, M.H., Allis, C.D. (1998) Roles of histone acetyltransferases and deacetylases in gene regulation. Bioessays 20, 615-26

162. Kurdistani, S.K., Grunstein, M. (2003) Histone acetylation and deacetylation in yeast. Nat Rev Mol Cell Biol 4,276-84

163. Kusch, Т., Guelman, S., Abmayr, S.M., Workman, J.L. (2003) Two Drosophila Ada2 homologues function in different multiprotein complexes. Mol Cell Biol 23, 3305-19

164. Kusch, Т., Guelman, S., Abmayr, S.M., Workman, J.L. (2003) Two Drosophila Ada2 homologues function in different multiprotein complexes. Mol Cell Biol 23, 3305-19

165. Kwan, A.H., Gell, D.A., Verger, A., Crossley, M., Matthews, J.M., Mackay, J.P. (2003) Engineering a protein scaffold from a PHD finger. Structure (Camb) 11, 803-13

166. Lai, E., Darnell, J.E. (1991) Transcriptional control in hepatocytes: a window on development. Trends Biochem Sci 16, 427-30

167. Lam, G., Hall, B.L., Bender, M., Thummel, C.S. (1999) DHR3 is required for the prepupal-pupal transition and differentiation of adult structures during Drosophila metamorphosis. Dev Biol 212, 204-16

168. Lam, G.T., Jiang, C., Thummel, C.S. (1997) Coordination of larval and prepupal gene expression by the DHR3 orphan receptor during Drosophila metamorphosis. Development 124,1757-69

169. Lee, D.Y., Hayes, J.J., Pruss, D., Wolffe, A.P. (1993) A positive role for histone acetylation in transcription factor access to nucleosomal DNA. Cell 72 ,73-84

170. Lee, D.Y., Teyssier, C., Strahl, B.D., Stallcup, M.R. (2004) Role of Protein Methylation in Regulation of Transcription. Endocr Rev

171. Lee, T.I., et al (2002) Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science 298, 799-804

172. Lee, Y., Kim, M., Han, J., Yeom, K.H., Lee, S., Baek, S.H., Kim, V.N. (2004) MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J23,4051-60

173. Legube, G., Linares, L.K., Tyteca, S., Caron, C., Scheffiier, M., Chevillard-Briet, M., Trouche, D. (2004) Role of the histone acetyl transferase Tip60 in the p53 pathway. J Biol Chem 279,44825-33

174. Lemon, В., Tjian, R. (2000) Orchestrated response: a symphony of transcription factors for gene control. Genes Dev 14,2551-69

175. Leresche, A., Wolf, V.J., Gottesfeld, J.M. (1996) Repression of RNA polymerase II and III transcription during M phase of the cell cycle. Exp Cell Res 229, 282-8

176. Levine, M., Tjian, R. (2003) Transcription regulation and animal diversity. Nature 424, 147-51

177. Levis, R., Hazelrigg, Т., Rubin, G.M. (1985) Separable cis-acting control elements for expression of the white gene of Drosophila. EMBO J4,3489-99

178. Lewis, B.A., Reinberg, D. (2003) The mediator coactivator complex: functional and physical roles in transcriptional regulation. J Cell Sci 116,3667-75

179. Lewis, B.A., Reinberg, D. (2003) The mediator coactivator complex: functional and physical roles in transcriptional regulation. J Cell Sci 116,3667-75

180. Li, X., Zhao, X., Jiang, X. et.al. (1998) Generation of destabilized green fluorescent protein as a transcription reporter. J Biol Chem 273, 34970-75

181. Li, Y., Danzer, J.R., Alvarez, P., Belmont, A.S., Wallrath, L.L. (2003) Effects of tethering HP1 to euchromatic regions of the Drosophila genome. Development 130, 1817-24

182. Lim, C.Y., Santoso, В., Boulay, Т., Dong, E., Ohler, U., Kadonaga, J.T. (2004) The MTE, a new core promoter element for transcription by RNA polymerase II. Genes Dev 18,1606-17

183. Lin, H., Spradling, A.C. (1993) Germline stem cell division and egg chamber development in transplanted Drosophila germaria. Dev Biol 159, 140-52

184. Linder, В., Newman, R., Jones, L.K., Debernardi, S., Young, B.D., Freemont, P., Verrijzer, C.P., Saha, V. (2000) Biochemical analyses of the AF10 protein: the extended LAP/PHD-finger mediates oligomerisation. J Mol Biol 299, 369-78

185. Lindsley D., Zimm G. The genome of Drosophila melanogaster. (1992) Academic Press, New-York. (GENERIC)

186. Lodish, H., Berk, A., Matsudaira, P., Kaiser, C.A., Krieger, M., Scott, M.P., Zipursky, L., and Darnell, J. (2003 ) Molecular Cell Biology W.H.Freeman & Co.,

187. Loewith, R., Meijer, M., Lees-Miller, S.P., Riabowol, K., Young, D. (2000) Three yeast proteins related to the human candidate tumor suppressor p33(INGl) are associated with histone acetyltransferase activities. Mol Cell Biol 20,3807-16

188. Lorch, Y., Beve, J., Gustafsson, C.M., Myers, L.C., Kornberg, R.D. (2000) Mediator-nucleosome interaction. Mol Cell 6, 197-201

189. Lu, B.Y., Emtage, P.C., Duyf, B.J., Hilliker, A.J., Eissenberg, J.C. (2000)

190. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Genetics 155, 699-708

191. Lu, H., Levine, A.J. (1995) Human TAFII31 protein is a transcriptional coactivator of the p53 protein. Proc Natl Acad Sci USA 92, 5154-8

192. Luger, K., Mader, A.W., Richmond, R.K., Sargent, D.F., Richmond, T.J. (1997) Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature 389, 251-60

193. Lusser, A., Kadonaga, J.T. (2003) Chromatin remodeling by ATP-dependent molecular machines. Bioessays 25,1192-200

194. Maile, Т., Kwoczynski, S., Katzenberger, R.J., Wassarman, D.A., Sauer, F. (2004) TAF1 activates transcription by phosphorylation of serine 33 in histone H2B. Science 304, 1010-4

195. Majello, В., De Luca, P., Lania, L. (1997) Sp3 is a bifimctional transcription regulator with modular independent activation and repression domains. J Biol Chem 272, 4021-6

196. Maldonado, E., Hampsey, M., Reinberg, D. (1999) Repression: targeting the heart of the matter. Cell 99,455-8

197. Malik, S., Gu, W., Wu, W., Qin, J., Roeder, R.G. (2000) The USA-derived transcriptional coactivator PC2 is a submodule of TRAP/SMCC and acts synergistically with other PCs. Mol Cell 5,753-60

198. Malik, S., Roeder, R.G. (2000) Transcriptional regulation through Mediator-like coactivators in yeast and metazoan cells. Trends Biochem Sci 25, 277-83

199. Marinescu, V.D., Kohane, I.S., Riva, A. (2005) The MAPPER database: a multi-genome catalog of putative transcription factor binding sites. Nucleic Acids Res 33 Database Issue, D91-7

200. Martin, M., Meng, Y.B., Chia, W. (1989) Regulatory elements involved in the tissue-specific expression of the yellow gene of Drosophila. Mol Gen Genet 218, 118-26

201. Martinez, E., Ge, H., Tao, Y., Yuan, C.X., Palhan, V., Roeder, R.G. (1998) Novel cofactors and TFIIA mediate functional core promoter selectivity by the human TAFII150-containing TFIID complex. Mol Cell Biol 18, 6571-83

202. Mason, P.B., Struhl, K. (2003) The FACT complex travels with elongating RNApolymerase II and is important for the fidelity of transcriptional initiation in vivo. Mol Cell Biol 23, 8323-33

203. Mazo, A.M., Huang, D.H., Mozer, B.A., Dawid, I.B. (1990) The trithorax gene, a trans-acting regulator of the bithorax complex in Drosophila, encodes a protein with zinc-binding domains. Proc Natl Acad Sci US A 87, 2112-6

204. Melnikova, L., Kulikov, A., Georgiev, P. (1996) Interactions between cut wing mutations and mutations in zeste, and the enhancer of yellow and Polycomb group genes of Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet 252, 230-6

205. Melnikova, L., Kulikov, A., Georgiev, P. (1996) Interactions between cut wing mutations and mutations in zeste, and the enhancer of yellow and Polycomb group genes of Drosophila melanogaster. Mol Gen Genet 252,230-6

206. Mertsalov I.V., Kulikova D.A., Alimova-Kost, M.V., Ninkina N.N., Korochkin, L.I., Buchman V.L. (2000) Structure and expression of two members of the d4 gene family in mouse. Mamm. Genome 11, 72-4.

207. Mitsiou, D.J., Stunnenberg, H.G. (2003) p300 is involved in formation of the TBP-TFIIA-containing basal transcription complex, TAC. EMBO J22,4501-11

208. Mizzen, C.A., et al (1996) The TAF(II)250 subunit of TFIID has histone acetyltransferase activity. Cell 87,1261-70

209. Moazed, D. (2001) Common themes in mechanisms of gene silencing. Mol Cell 8,489-98

210. Moqtadery Z., Keaveney M., Struhl K. (1998) The histone H3-like TAF is broadly required for the transcription in yest. Mol Cell 2,675-682

211. Morales, V., Giamarchi, C., Chailleux, C., Moro, F., Marsaud, V., Le Ricousse, S., Richard-Foy, H. (2001) Chromatin structure and dynamics: functional implications. Biochimie 83,1029-39

212. Morris, J.R., Geyer, P.K., Wu, C.T. (1999) Core promoter elements can regulate transcription on a separate chromosome in trans. Genes Dev 13,253-8

213. Morris, J.R., Petrov, D.A., Lee, A.M., Wu, C.T. (2004) Enhancer choice in cis and in trans in Drosophila melanogaster: role of the promoter. Genetics 167,173947

214. Muller, F., Tora, L. (2004) The multicoloured world of promoter recognition complexes. EMBO J 23,2-8

215. Muratani, M., Tansey, W.P. (2003) How the ubiquitin-proteasome system controls transcription. Nat Rev Mol Cell Biol 4, 192-201

216. Muth, V., Nadaud, S., Grummt, I., Voit, R. (2001) Acetylation of TAF(I)68, a subunit of TIF-IB/SL1, activates RNA polymerase I transcription. EMBO J 20, 1353-62

217. Naar, A.M., Lemon, B.D., Tjian, R. (2001) Transcriptional coactivator complexes. Annu Rev Biochem 70,475-501

218. Naar, A.M., Lemon, B.D., Tjian, R. (2001) Transcriptional coactivator complexes. Annu Rev Biochem 70,475-501

219. Naar, A.M., Lemon, B.D., Tjian, R. (2001) Transcriptional coactivator complexes. Annu Rev Biochem 70,475-501

220. Nagaich, A.K., Hager, G.L. (2004) UV laser cross-linking: a real-time assay to study dynamic protein/DNA interactions during chromatin remodeling. Sci STKE 2004, pU3

221. Nakamura, Т., et al (2002) ALL-1 is a histone methyltransferase that assembles a supercomplex of proteins involved in transcriptional regulation. Mol Cell 10,111928

222. Nakatani, Y., Bagby, S., Ikura, M. (1996) The histone folds in transcription factor TFIID. J Biol Chem 271, 6575-8

223. Narlikar, G.J., Fan, H.Y., Kingston, R.E. (2002) Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription. Cell 108,475-87

224. Narlikar, G.J., Fan, H.Y., Kingston, R.E. (2002) Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription. Cell 108,475-87

225. Narlikar, G.J., Fan, H.Y., Kingston, R.E. (2002) Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription. Cell 108,475-87

226. Nash, W.G., Yarkin, R.J. (1974) Genetic regulation and pattern formation: a study of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genet Res 24, 19-26

227. Nedialkov, Y.A., Triezenberg, S.J. (2004) Quantitative assessment of in vitro interactions implicates TATA-binding protein as a target of the VP16C transcriptional activation region. Arch Biochem Biophys 425, 77-86

228. Nelson, D.E., See, V., Nelson, G., White, M.R. (2004) Oscillations in transcription factor dynamics: a new way to control gene expression. Biochem Soc Trans 32,1090-2

229. Nibu, Y., Senger, K., Levine, M. (2003) CtBP-independent repression in the Drosophila embryo. Mol Cell Biol 23,3990-9

230. Nikolov, D.B., Burley, S.K. (1997) RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proc Natl Acad Sci USA94, 15-22

231. Noma, K., Allis, C.D., Grewal, S.I. (2001) Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293,11505

232. Nourani, A., Howe, L., Pray-Grant, M.G., Workman, J.L., Grant, P.A., Cote, J. (2003) Opposite role of yeast ING family members in p53-dependent transcriptional activation. J Biol Chem 278,19171-5

233. Nourani, A., Utley, R.T., Allard, S., Cote, J. (2004) Recruitment of the NuA4 complex poises the PH05 promoter for chromatin remodeling and activation. EMBO J 23,2597-607

234. O'Connell, S., Wang, L., Robert, S., Jones, C.A., Saint, R., Jones, R.S. (2001) Polycomblike PHD fingers mediate conserved interaction with enhancer of zeste protein. J Biol Chem 276,43065-73

235. Ogryzko, V.V., Kotani, Т., Zhang, X., Schiltz, R.L., Howard, Т., Yang, X.J., Howard, B.H., Qin, J., Nakatani, Y. (1998) Histone-like TAFs within the PCAF histone acetylase complex. Cell 94, 35-44

236. Ogryzko, V.V., Schiltz, R.L., Russanova, V., Howard, B.H., Nakatani, Y. (1996) The transcriptional coactivators p300 and СВР are histone acetyltransferases . Cell 87,953-9

237. Ohler, U., Liao, G.C., Niemann, H., Rubin, G.M. (2002) Computational analysis of core promoters in the Drosophila genome. Genome Biol 3, RESEARCH0087

238. Oki, M., Valenzuela, L., Chiba, Т., Ito, Т., Kamakaka, R.T. (2004) Barrier proteins remodel and modify chromatin to restrict silenced domains. Mol Cell Biol 24,1956-67

239. Orphanides, G., Lagrange, Т., Reinberg, D. (1996) The general transcription factors of RNA polymerase II. Genes Dev 10,2657-83

240. Orphanides, G., Reinberg, D. (2002) A unified theory of gene expression . Cell 108, 439-51

241. Orphanides, G., Reinberg, D. (2002) A unified theory of gene expression . Cell 108,439-51

242. Pal-Bhadra, M., Leibovitch, B.A., Gandhi, S.G., Rao, M., Bhadra, U., Birchler, J.A., Elgin, S.C. (2004) Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery. Science 303, 669-72

243. Panagopoulos, I., Fioretos, Т., Isaksson, M., Samuelsson, U., Billstrom, R., Strombeck, В., Mitelman, F., Johansson, B. (2001) Fusion of the MORF and СВР genes in acute myeloid leukemia with the t(10;16)(q22;pl3). Hum Mol Genet 10, 395-404

244. Parthun, M.R., Widom, J., Gottschling, D.E. (1996) The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism. Cell 87, 85-94

245. Parvin, J.D., Young, R.A. (1998) Regulatory targets in the RNA polymerase II holoenzyme. Curr Opin Genet Dev 8, 565-70

246. Pascual, J., Martinez-Yamout, M., Dyson, H.J., Wright, P.E. (2000) Structure of the PHD zinc finger from human Williams-Beuren syndrome transcription factor. J Mol Biol 304, 723-9

247. Pelletier, N., Champagne, N., Lim, H., Yang, X.J. (2003) Expression,purification, and analysis of MOZ and MORF histone acetyltransferases. Methods 31,24-32

248. Pelletier, N. Champagne, N., Stifani, S., Yang, X.J. (2002) MOZ and MORF histone acetyltransferases interact with the Runt-domain transcription factor Runx2. Oncogene 21, 2729-40

249. Persengiev, S.P., Zhu, X., Dixit, B.L., Maston, G.A., Kittler, E.L., Green, M.R. (2003) TRF3, a TATA-box-binding protein-related factor, is vertebrate-specific and widely expressed. Proc Natl Acad Sci USA 100, 14887-91

250. Piacentini, L., Fanti, L., Berloco, M., Perrini, В., Pimpinelli, S. (2003) Heterochromatin protein 1 (HP1) is associated with induced gene expression in Drosophila euchromatin. J Cell Biol 161, 707-14

251. Piacentini, L., Fanti, L., Berloco, M., Perrini, В., Pimpinelli, S. (2003) Heterochromatin protein 1 (HP1) is associated with induced gene expression in Drosophila euchromatin. J Cell Biol 161, 707-14

252. Pirrotta, V. (1988) Vectors for P-mediated transformation in Drosophila. Biotechnology 10,437-56

253. Pirrotta, V. (1999) Transvection and chromosomal trans-interaction effects. Biochim Biophys Acta 1424, Ml-8

254. Pirrotta, V., Steller, H., Bozzetti, M.P. (1985) Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene. EMBO J 4, 3501-8

255. Pollard, W., Walker, J (1990) Methods in molecular Biology. Animal cell culture. Humana press. 718 p.

256. Pugh, B.F. (2000) Control of gene expression through regulation of the TATA-binding protein. Gene 255,1-14

257. Qian, S., Vaijavand, В., Pirrotta, V. (1992) Molecular analysis of the zeste-white interaction reveals a promoter-proximal element essential for distant enhancer-promoter communication. Genetics 131, 79-90

258. Ragvin, A., et al (2004) Nucleosome binding by the bromodomain and PHD finger of the transcriptional cofactor p300. J Mol Biol 337, 773-88

259. Rebhan, M., Chalifa-Caspi, V., Prilusky, J., Lancet, D. (1997) GeneCards: encyclopedia for genes, proteins and diseases. Weizmann Institute of Science, Bioinformatics Unit and Genome Center (Rehovot, Israel). GeneCard for PHF10 (2003).

260. Rebhan, M., Chalifa-Caspi, V., Prilusky, J., Lancet, D. (1997) GeneCards: encyclopedia for genes, proteins and diseases. Weizmann Institute of Science, Bioinformatics Unit and Genome Center (Rehovot, Israel). GeneCard for PHF10 (2003).

261. Redi, C.A., Garagna, S., Zacharias, H., Zuccotti, M., Capanna, E. (2001) The other chromatin. Chromosoma 110, 136-47

262. Reese, J.C., Apone, L., Walker, S.S., Griffin, L.A., Green, M.R. (1994) Yeast TAFIIS in a multisubunit complex required for activated transcription. Nature 371, 523-7

263. Reid, J.L., Moqtaderi, Z., Struhl, K. (2004) Eaf3 regulates the global pattern of histone acetylation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 24, 757-64

264. Reifsnyder, C., Lowell, J., Clarke, A., Pillus, L. (1996) Yeast SAS silencing genes and human genes associated with AML and HIV-1 Tat interactions are homologous with acetyltransferases. Nat Genet 14,42-9

265. Rekdal, C., Sjottem, E., Johansen, T. (2000) The nuclear factor SPBP contains different functional domains and stimulates the activity of various transcriptional activators. J Biol Chem 275,40288-300

266. Rendic, S. (2002) Summary of information on human CYP enzymes: human P450 metabolism data. Drug Metab Rev 34, 83-448

267. Richards, E.J., Elgin, S.C. (2002) Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects. Cell 108,489-500

268. Richards, E.J., Elgin, S.C. (2002) Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects. Cell 108,489-500

269. Rochette-Egly, C., Adam, S., Rossignol, M„ Egly, J.M., Chambon, P. (1997) Stimulation of RAR alpha activation function AF-1 through binding to the general transcription factor TFIIH and phosphorylation by CDK7. Cell 90, 97-107

270. Roeder, R.G. (1996) The role of general initiation factors in transcription by RNA polymerase II. Trends Biochem Sci 21, 327-35

271. Roeder, R.G. (1996) The role of general initiation factors in transcription by RNA polymerase II. Trends Biochem Sci 21, 327-35

272. Roseman, R.R., Johnson, E.A., Rodesch, C.K., Bjerke, M., Nagoshi, R.N., Geyer, P.K. (1995) A P element containing suppressor of hairy-wing binding regions has novel properties for mutagenesis in Drosophila melanogaster. Genetics 141,106174

273. Roseman, R.R., Pirrotta, V., Geyer, P.K. (1993) The su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects. EMBOJ12,435-42

274. Rosen, C., Dorsett, D., Jack, J. (1998) A proline-rich region in the Zeste protein essential for transvection and white repression by Zeste. Genetics 148, 1865-74

275. Rothwell, W.F. and Sullivan, W. (2000) Fluorescent Analysis of Drosophila Embryos. Drosophila Protocols (Sullivan, W., Ashburner, M., and Harwley R.S., eds) pp. 141-159, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York1. Rec #:

276. Rouleau, M., Aubin, R.A., Poirier, G.G. (2004) Poly(ADP-ribosyl)ated chromatin domains: access granted. J Cell Sci 117, 815-25

277. Rubin, G.M., Spradling, A.C. (1982) Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science 218,348-53

278. Ruiz-Garcia, A.B., Sendra, R., Galiana, M., Pamblanco, M., Perez-Ortin, J.E., Tordera, V. (1998) HAT1 and HAT2 proteins are components of a yeast nuclear histone acetyltransferase enzyme specific for free histone H4. J Biol Chem 273, 12599-605

279. Saleh, A., Schieltz, D., Ting, N. McMahon, S.B., Litchfield, D.W., Yates, J.R. 3rd, Lees-Miller, S.P., Cole, M.D., Brandl, C.J. (1998) Tralp is a component of the yeast Ada.Spt transcriptional regulatory complexes. J Biol Chem 273,26559-65

280. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (2001) Molecular Cloning. A laboratory manual. CSHL Press,

281. Samuelsen, C.O., Baraznenok, V., Khorosjutina, O., Spahr, H., Kieselbach, Т., Holmberg, S., Gustafsson, C.M. (2003) TRAP230/ARC240 and TRAP240/ARC250 Mediator subunits are functionally conserved through evolution. Proc Natl Acad Sci USA 100,6422-7

282. Sandaltzopoulos, R., Quivy, J.P., Becker P.B. (1995) Analysis of protein/DNA interactions by solid-phase footprinting. Methods Mol. Cell. Biol. 5,176-181

283. Sauer, F., Fondell, J.D., Ohkuma, Y., Roeder, R.G., Jackie, H. (1995) Control of transcription by Kruppel through interactions with TFIIB and TFIIE beta. Nature 375,162-4

284. Sauer, F., Wassarman, D.A., Rubin, G.M., Tjian, R. (1996) TAF(II)s mediate activation of transcription in the Drosophila embryo. Cell 87,1271-84

285. Saurin, A.J., Shao Z., et. al. (2001) A Drosophila Polycomb group complex includes Zeste and dTAFII protein. Nature 412, 655-660

286. Seeler, J.S., Dejean, A. (2003) Nuclear and unclear functions of SUMO. Nat Rev Mol Cell Biol A, 690-9

287. Sendra, R., Tse, C., Hansen, J.C. (2000) The yeast histone acetyltransferase A2 complex, but not free Gcn5p, binds stably to nucleosomal arrays. J Biol Chem 275, 24928-34

288. Shamay, M., Barak, O., Shaul, Y. (2002) HBXAP, a novel PHD-finger protein, possesses transcription repression activity. Genomics 79, 523-9

289. Shen, W.C., Bhaumik, S.R., Causton, H.C., Simon, I., Zhu, X., Jennings, E.G.,

290. Wang, Т.Н., Young, R.A., Green, M.R. (2003) Systematic analysis of essential yeast TAFs in genome-wide transcription and preinitiation complex assembly. EMBO J22, 3395-402

291. Shikama, N., Chan, H.M., Krstic-Demonacos, M., Smith, L., Lee, C.W., Cairns, W., La Thangue, N.B. (2000) Functional interaction between nucleosome assembly proteins and p300/CREB-binding protein family coactivators. Mol Cell Biol 20, 8933-43

292. Shimono, Y., Murakami, H., Kawai, K., Wade, P.A., Shimokata, K., Takahashi, M. (2003) Mi-2 beta associates with BRG1 and RET finger protein at the distinct regions with transcriptional activating and repressing abilities. J Biol Chem 278, 51638-45

293. Shimono, Y., Murakami, H., Kawai, K., Wade, P.A., Shimokata, K., Takahashi, M. (2003) Mi-2 beta associates with BRG1 and RET finger protein at the distinct regions with transcriptional activating and repressing abilities. J Biol Chem 278, 51638-45

294. Shuen, M., Awakumov, N., Torchia, J., Mymryk, J.S. (2003) The El A proteins of all six human adenovirus subgroups target the рЗОО/CBP acetyltransferases and the SAGA transcriptional regulatory complex. Virology 316,75-83

295. Sims, R.J. 3rd, Belotserkovskaya, R., Reinberg, D. (2004) Elongation by RNA polymerase II: the short and long of it. Genes Dev 18, 2437-68

296. Sims, R.J. 3rd, Mandal, S.S., Reinberg, D. (2004) Recent highlights of RNA-polymerase-II-mediated transcription. Curr Opin Cell Biol 16,263-71

297. Smale, S.T., Kadonaga, J.T. (2003 ) The RNA polymerase II core promoter. Annu Rev Biochem 72,449-79

298. Smith, E.R., Belote, J.M., Schiltz, R.L., Yang, X.J., Moore, P.A., Berger, S.L., Nakatani, Y., Allis, C.D. (1998) Cloning of Drosophila GCN5: conserved features among metazoan GCN5 family members. Nucleic Acids Res 26,2948-54

299. Smith, E.R., Eisen, A., Gu, W., Sattah, M., Pannuti, A„ Zhou, J., Cook, R.G., Lucchesi, J.C., Allis, C.D. (1998) ESA1 is a histone acetyltransferase that is essential for growth in yeast. Proc Natl Acad Sci US A 95,3561-5

300. Smith, E.R., Pannuti, A., Gu, W., Steurnagel, A., Cook, R.G., Allis, C.D., Lucchesi, J.C. (2000) The drosophila MSL complex acetylates histone H4 at lysine 16, a chromatin modification linked to dosage compensation. Mol Cell Biol 20, 312-8

301. Spector, D.L. (2001) Nuclear domains. J Cell Sci 114,2891-3

302. Spradling, A.C., Rubin, G.M. (1982) Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science 218, 341-7

303. Sterner, D.E., Berger, S.L. (2000) Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiol Mol Biol Rev 64, 435-59

304. Studitsky, V.M., Walter, W., Kireeva, M., Kashlev, M., Felsenfeld, G. (2004)

305. Chromatin remodeling by RNA polymerases. Trends Biochem Sci 29, 127-35

306. Sudarsanam, P., Iyer, V.R., Brown, P.O., Winston, F. (2000) Whole-genome expression analysis of snf/swi mutants of Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci USA91, 3364-9

307. Sun, F.L., Cuaycong, M.H., Craig, C.A., Wallrath, L.L., Locke, J., Elgin, S.C. (2000) The fourth chromosome of Drosophila melanogaster: interspersed euchromatic and heterochromatic domains. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 5340-5

308. Svejstrup, J.Q. (2004) The RNA polymerase II transcription cycle: cycling through chromatin. Biochim Biophys Acta 1677, 64-73

309. Svejstrup, J.Q., Vichi, P., Egly, J.M. (1996) The multiple roles of transcription/repair factor TFIIH. Trends Biochem Sci 21, 346-50

310. Syntichaki, P., Topalidou, I., Thireos, G. (2000) The Gcn5 bromodomain coordinates nucleosome remodelling. Nature 404, 414-7

311. Taatjes, D.J., Naar, A.M., Andel, F. 3rd, Nogales, E., Tjian, R. (2002) Structure, function, and activator-induced conformations of the CRSP coactivator. Science 295, 1058-62

312. Taatjes, D.J., Marr, M.T., Tjian, R. (2004) Regulatory diversity among metazoan co-activator complexes. Nat Rev Mol Cell Biol 5,403-10

313. Takechi, S., Nakayama, T. (1999) Sas3 is a histone acetyltransferase and requires a zinc finger motif. Biochem Biophys Res Commun 266, 405-10

314. Tansey, W.P., Herr, W. (1997) TAFs: guilt by association? Cell 88, 729-32

315. Thiagalingam, S., Cheng, K.H., Lee, H.J., Mineva, N., Thiagalingam, A., Ponte, J.F. (2003) Histone deacetylases: unique players in shaping the epigenetic histone code. Ann NY Acad Sci 983, 84-100

316. Thiel, G., Lietz, M., Bach, K., Guethlein, L., Cibelli, G. (2001) Biological activity of mammalian transcriptional repressors. Biol Chem 382, 891-902

317. Thut, C.J., Chen, J.L., Klemm, R., Tjian, R. (1995) p53 transcriptional activation mediated by coactivators TAFII40 and TAFII60. Science 267,100-4

318. Tjian, R., Maniatis, T. (1994) Transcriptional activation: a complex puzzle with few easy pieces. Cell 11, 5-8

319. Tora, L. (2002) A unified nomenclature for TATA box binding protein (TBP)-associated factors (TAFs) involved in RNA polymerase II transcription. Genes Dev 16, 673-5

320. Tsukiyama, T. (2002) The in vivo functions of ATP-dependent chromatin-remodelling factors. Nat Rev Mol Cell Biol 3, 422-9

321. Tupler, R., Perini, G., Green, M.R. (2001) Expressing the human genome. Nature 409, 832-3

322. Tyler, J.K. (2002) Chromatin assembly. Cooperation between histone chaperones223and ATP-dependent nucleosome remodeling machines. Eur J Biochem 269, 226874

323. Veenstra, G.J., Wolffe, A.P. (2001) Gene-selective developmental roles of general transcription factors. Trends Biochem Sci 26, 665-71

324. Veenstra, G.J., Wolffe, A.P. (2001) Gene-selective developmental roles of general transcription factors. Trends Biochem Sci 26, 665-71

325. Verrijzer, C.P., Chen, J.L., Yokomori, K., Tjian, R. (1995) Binding of TAFs to core elements directs promoter selectivity by RNA polymerase II. Cell 81,1115-25

326. Verrijzer, C.P., Tjian, R. (1996) TAFs mediate transcriptional activation and promoter selectivity. Trends Biochem Sci 21, 338-42

327. Vettese-Dadey, M„ Grant, P.A., Hebbes, T.R., Crane- Robinson, C., Allis, C.D., Workman, J.L. (1996) Acetylation of histone H4 plays a primary role in enhancing transcription factor binding to nucleosomal DNA in vitro. EMBO J15, 2508-18

328. Vignali, M., Hassan, A.H., Neely, K.E., Workman, J.L. (2000) ATP-dependent chromatin-remodeling complexes. Mol Cell Biol 20,1899-910

329. Vogel, J.L., Kristie, T.M. (2000) Autocatalytic proteolysis of the transcription factor-coactivator CI (HCF): a potential role for proteolytic regulation of coactivator function. Proc Natl Acad Sci USA91, 9425-30

330. Waga, S., Mizuno, S., Yoshida, M. (1990) Chromosomal protein HMG1 removes the transcriptional block caused by the cruciform in supercoiled DNA. J Biol Chem 265,19424-8

331. Wallrath, L.L. (1998) Unfolding the mysteries of heterochromatin. Curr Opin Genet Dev 8, 147-53

332. Wallrath, L.L., Elgin, S.C. (1995 ) Position effect variegation in Drosophila is associated with an altered chromatin structure. Genes Dev 9,1263-77

333. Wanker, E.E., Rovira, C., Scherzinger, E., Hasenbank, R., Walter, S., Tait, D., Colicelli, J., Lehrach, H. (1997) HIP-I: a huntingtin interacting protein isolated by the yeast two-hybrid system. Hum Mol Genet 6,487-95

334. Wassarman, D.A., Aoyagi, N., Pile, L.A., Schlag, E.M. (2000) TAF250 is required for multiple developmental events in Drosophila. Proc Natl Acad Sci JJ S A 91, 1154-9

335. Weiler, K.S., Wakimoto, B.T. (1995) Heterochromatin and gene expression in Drosophila. Annu Rev Genet 29, 577-605

336. Wery, M., Shematorova, E., Van Driessche, В., Vandenhaute, J., Thuriaux, P., Van Mullem, V. (2004) Members of the SAGA and Mediator complexes are partners of the transcription elongation factor TFIIS. EMBO J 23, 4232-42

337. Whitmarsh, A.J., Davis, R.J. (2000) Regulation of transcription factor function by phosphorylation. Cell Mol Life Sci 57, 1172-83

338. Wieczorek, E., Brand, M., Jacq, X., Tora, L. (1998) Function of TAF(II)-containing complex without TBP in transcription by RNA polymerase II. Nature 393,187-91

339. Winkler, G.S., Kristjuhan, A., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Svejstrup, J.Q. (2002) Elongator is a histone H3 and H4 acetyltransferase important for normal histone acetylation levels in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 99, 3517-22

340. Winkler, G.S., Petrakis, T.G., Ethelberg, S., Tokunaga, M., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Svejstrup, J.Q. (2001) RNA polymerase II elongator holoenzyme is composed of two discrete subcomplexes. J Biol Chem 276, 32743-9

341. Winston, F., Sudarsanam, P. (1998) The SAGA of Spt proteins and transcriptional analysis in yeast: past, present, and future. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 63, 553-61

342. Wittschieben, B.O., Fellows, J., Du, W., Stillman, D.J., Svejstrup, J.Q. (2000) Overlapping roles for the histone acetyltransferase activities of SAGA and elongator in vivo. EMBO J19,3060-8

343. Woychik, N.A., Hampsey, M. (2002) The RNA polymerase II machinery: structure illuminates function. Cell 108,453-63

344. Wyrick, J.J., Young, R.A. (2002) Deciphering gene expression regulatory networks. Curr Opin Genet Dev 12, 130-6

345. Xu, W., Edmondson, D.G., Roth, S.Y. (1998) Mammalian GCN5 and P/CAF acetyltransferases have homologous amino-terminal domains important for recognition of nucleosomal substrates. Mol Cell Biol 18, 5659-69

346. Yamagoe, S., et al (2003) Interaction of histone acetylases and deacetylases in vivo. Mol Cell Biol 23, 1025-33

347. Yamamoto, Т., Horikoshi, M. (1997) Novel substrate specificity of the histone acetyltransferase activity of HIV-1-Tat interactive protein Tip60. J Biol Chem 272, 30595-8

348. Yanagisawa, J., et al (2002) Nuclear receptor function requires a TFTC-type histone acetyl transferase complex. Mol Cell 9, 553-62

349. Yang, X.J. (2004) The diverse superfamily of lysine acetyltransferases and their roles in leukemia and other diseases. Nucleic Acids Res 32, 959-76

350. Yang, X.J., Ogryzko, V.V., Nishikawa, J., Howard, B.H., Nakatani, Y. (1996) A рЗОО/CBP-associated factor that competes with the adenoviral oncoprotein El A. Nature 382, 319-24

351. Yudkovsky, N., Ranish, J.A., Hahn, S. (2000) A transcription reinitiation intermediate that is stabilized by activator. Nature 408,225-9

352. Zhang, Y. (2003) Transcriptional regulation by histone ubiquitination and deubiquitination. Genes Dev 17, 2733-40

353. Zhao, C., Meng, A. (2005) Spl-like transcription factors are regulators of embryonic development in vertebrates. Dev Growth Differ 47, 201-11

354. Zhen, L., Swank, R.T. (1993) A simple and high yeld method for recovering DNA from agarose gels. BioTech 14, 894-8

355. Zurita, M., Merino, C. (2003) The transcriptional complexity of the TFIIH complex. Trends Genet 19, 578-84

356. Георгиева, С.Г., Набирочкина, E.H., Ладыгина, Н.Г., Георгиев, П.Г., Солдатов, А.В. (2001) Ядерный белок е(у)2 Drosophila melanogaster участвует в контроле транскрипции. Генетика 37, 24-8

357. Георгиева С.Г., Е.Н.Набирочкина, М.В.Пустовойтов, А.Н.Краснов,.А.В.Солдатов (2001) Молекулярная характеристика нового эволюционно консервативного ядерного белка е(у)2. Генетика 37(1), 18-23

358. Голл, Дж. (2003) Роль телец Кахала в сборке ядерного аппарата транскрипции. Цитология 45, 971-5

359. Набирочкина Е.Н., А.В.Солдатов, С.Г.Георгиева. Два гомолога человеческого TAFII30 у Drosophila melanogaster имеют различающиеся функции. Доклады Академии наук 376,423-425

360. Набирочкина Е.Н., А.В.Солдатов, С.Г.Георгиева (2000) Молекулярная характеристика двух новых гомологов TAFII30 у Drosophila melanogaster. Молекулярная биология 34(5), 783-787(Abstract)

361. Жимулев, И.Ф., Беляева, Е.С. (2003) Гетерохроматин, эффект положения гена и сайленсинг гена. Генетика 39,187-201

362. Козицына, М.В., Георгиев, П.Г. (1992) Получение и анализ новых мутаций гена mod(mdg4) у Drosophila melanogaster. Генетика 28, 75-82

363. Лебедева, Л.А., Тиллиб, С.В. (2003) Глобальный фактор поддержания тканеспецифичного активного состояния генов Drosophila melanogaster, белок Tritorax, ассоциирован с ядерным матиксом. Генетика 39,250-8

364. Патрушев, Л.И. (2000) Экспрессия генов Наука, Москва

365. Солдатов А.В., Набирочкина Е.Н., Дзитоева С.Г., Матюнина JI.B., Георгиев П.Г. (1996) Генетика 32,1714-1716

366. Сьяксте, Н.И., Сьяксте, Т.Г. (2001) Транскрипционные факторы и ядерный матрикс. Молекулярная биология 35, 739-49

367. Фрешни Р. (1989) Культура животных клеток. Методы, Москва, издательство «Мир», 331 стр.1. БЛАГОДАРНОСТИ

368. Отдельно хочется поблагодарить дирекцию Института биологии гена РАН за обеспечение условий для научных исследований, а также коллектив института за создание атмосферы доброжелательности и взаимопомощи.