Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизма действия нового коактиватора транскрипции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизма действия нового коактиватора транскрипции"

На правах рукописи УДК 575.22:595.773.4

003470041

Воробьева Надежда Евгеньевна

Изучение механизма действия нового коактиватора транскрипции

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003470041

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН,

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

кандидат физико-математических наук

Георгиева София Георгиевна Шидловский Юлий Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Чуриков Николай Андреевич

доктор биологических наук, профессор Сащснко Лидия Павловна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН.

Защита диссертации состоится ^ июня 2009 года в 11— часов

на заседании Диссертационного совета Д 002.37.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А.Энгелыардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан 29 апреля 2009 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат фармацевтических наук

вская Л.С.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Физиологическое состояние клетки определяется внешними сигналами и в большинстве случаев конечной точкой действия этих сигналов является изменение уровня транскрипции гена. Изучение сложных механизмов, позволяющих клетке распознавать и реагировать на внешние факторы, является одной из основных задач современной молекулярной биологии.

Знание законов, по которым функционирует молекулярный аппарат клетки, координировано запускающий в нужный момент экспрессию одного спектра генов и подавляющий другой, и своевременно реагирующий на приходящие извне импульсы, имеет не только большое фундаментальное значение. Оно является незаменимым для разработки новейших методик лечения заболеваний, моделирования действия новых лекарственных препаратов, выведения новых видов сельскохозяйственных растений и животных.

Первым этапом экспрессии большинства генов высших эукариот является транскрипция, осуществляемая РНК-полимсразой II. Этот процесс контролируется многоуровневым аппаратом, состоящим из нескольких тысяч белковых факторов. Для инициации транскрипции какого-либо гена требуется воздействие различных коактиваторных комплексов, которые привлекаются гсн-спсцифическими активаторами (Roscnfcld M., Lunyak V., 2006) Основной задачей коактиваторных комплексов является осуществление взаимной связи между активаторами и общими факторами транскрипции, а также изменение состояния хроматина в районе гена. За последнее десятилетие было описано множество мультибелковых комплексов, которые биохимически и функционально были отнесены к коактиваторам транскрипции. Однако, вес их можно разделить на два больших класса: адаптеры и комплексы, модифицирующие хроматин. В свою очередь коактиваторы, изменяющие состояние хроматина, делятся на коактиваторы, ковалентно посттрансляционно модифицирующие гистоны, и коактиваторы, обладающие АТФ-зависимой активностью расплетать хроматинизированную ДНК, участвуя в скольжении нуклеосом.

Ранее в нашей лаборатории был впервые охарактеризован новый коактиватор транскрипции SAYP, кодируемый геном е(у)3 (Shidlovskii et al, 2005). Первоначально этот белок был описан как фактор, необходимый для активированной экспрессии гена yellow у дрозофилы (Georgiev P., Gcrasimova Т., 1989). В дальнейшем были обнаружены его гомологи у других многоклеточных животных. Гомолог SAYP, PHF10 играет важную роль в регуляции экспрессии генов млекопитающих (Lessard et al, 2007). Обнаруженные гомологи

SAYP имеют в своем составе область высокой гомологии характерную для всех. Она была названа SAY доменом, и для нее было обнаружено свойство активировать транскрипцию в дрожжевой системе. Этот консервативный домен белка SAYP представляет интерес, так как, возможно, его свойствами, изученными на примере белка дрозофилы, будут обладать и белки-гомологи.

В данной работе были изучены свойства основного консервативного домена белка SAYP: показано, что именно он отвечает за способность этого белка активировать транскрипцию, а также обнаружены взаимодействующие с ним белковые комплексы, которые и осуществляют механизм активации, регулируемый SAYP. Таким образом, показан новый механизм функционирования коактиватора транскрипции посредством объединения двух больших транскрипционных комплексов в единый.

Цель и задачи исследования

Целыо настоящей работы являлось изучение механизма действия нового коактиватора транскрипции D. melanogaster белка SAYP. Для этого в ходе исследований предполагалось решить следующие экспериментальные задачи:

- выявить домен SAYP, отвечающий за активацию транскрипции в системе клеток S2 D. melanogaster;

- изучить влияние различных коактиваторов на SAYP-зависимую активацию транскрипции;

- выявить коактиваторы, взаимодействующие с SAYP, изучить, какие домены SAYP необходимы для взаимодействия с коактиваторами;

- в составе коактиваторов, взаимодействующих с SAYP, обнаружить белки, непосредственно связанные с активацнонным доменом белка.

Научная новизна и практическая ценность работы

В данной работе в системе S2 клеток D. melanogaster показано, что основным доменом белка SAYP, отвечающим за активацию транскрипции является новый эволюционно высоко консервативный домен SAY. Обнаружено, что способность этого домена активировать транскрипцию определяется его взаимодействием с транскрипционными коактиваторами TFIID и Brahma.

Впервые описан новый механизм действия коактиватора транскрипции путем непосредственного объединения комплексов, осуществляющих ремоделинг хроматина и инициацию транскрипции, а значит ключевые этапы процесса активации экспрессии гена.

Более того, показано, что основным ядром, связывающим транскрипционные комплексы, являйся эволюционно высоко консервативный домен SAY. Принимая во внимание, что именно этот домен является высоко консервативной областью всех гомологов SAYP различных организмов, в том числе и человека, можно предположить, что механизм функционирования этих гомологов будет во многом сходным с описанным нами механизмом.

Способность SAYP соединять на промоторе комплексы, осуществляющие ключевые этапы активации транскрипции, может быть использована в практической области, например, для активации транскрипции локусов, репрессированных в результате генетических заболеваний или для поддержки функционирования высоко активных промоторов при получении трансгснных животных.

Апробация работы

Результаты работы были представлены автором на следующих конференциях: международная конференция «Генетика в России и в мире» (Москва; 2006), XIX зимняя школа молодых ученых «Перспективные направления в физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва; 2007), Workshop "Protcin-nuclcic acid interactions" of the International Research Training Group Giessen/Marburg-Moscow (Russia, Suzdal; 2007),

FEBS workshop "The biology of modular protein domains" (Austria, Tirol; 2007).

Результаты этой работы были представлены также на многих международных конференциях соавторами данной работы.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Из них статей - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 4.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена страницах и состоит из следующих разделов: введение,

объект и задачи исследования, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, благодарности и список литературы. Диссертация содержит 8 рисунков. Библиография включает 144 источника.

II. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Определение домена белка SAYP, отвечающего за его способность активировать транскрипцию в системе S2 клеток D. melanogaster

Для определения способности доменов белка SAYP активировать транскрипцию была создана плазмидная конструкция pTrAssay, которая содержала репортерный ген lacZ под контролем минимального промотора гена hsp70 и 10 сайтов связывания для GAL4 ДНК-связывающего домена (UAS сайты). Кроме того, в состав конструкции входила последовательность, кодирующая ДНК-связывающий домен GAL4, маркированный тройным FLAG - эпитопом под контролем конститутивного актинового промотора (Рис. 1А). Для проведения теста на способность активировать транскрипцию фрагменты ДНК, кодирующие различные домены SAYP, были встроены в эту конструкцию, чтобы после экспрессии в S2 клетках образовывать слитный белок с GAL4 ДНК-связывающим доменом. Экспрессированный таким образом слитный белок при помощи ДНК-связывающсго домена привлекался на UAS-сайты и изучаемый домен оказывался в непосредственной близости от укороченного hsp70 промотора и, если обладал необходимыми свойствами, активировал транскрипцию репортерного гена. Полученные конструкции использовали для проведения временной трансфекции S2 клеток I), melanogaster. По истечение двух суток после трансфекции из клеток получали лизат, который анализировали на активность (i-галактозидазы, а также измеряли количество экспрессированного исследуемого домена SAYP при помощи иммуноферментного анализа. Делением значения активности |3-галактозидазы на относительное количество экспрессированного домена получали удельную активность, отражающую способность этого домена активировать транскрипцию.

Учитывая распределение внутри SAYP консервативных белковых доменов, белок был разделен на несколько фрагментов для дальнейшего изучения. Среди них был выделен АТ-домсн, содержащий так называемый AT-hook, который, возможно, отвечает за связывание этого белка с А/Т богатыми районами ДНК, N-концевой домен, специфический для D. melanogaster, а также два расположенных рядом PHD домена. В последнее время было опубликовано много работ, описывающих специфическое взаимодействие доменов этого типа с модифицированными N-концевыми остатками гистонов. Предполагается, что они способны участвовать в распознавании гистонового кода.

Ранее в составе SAYP был обнаружен новый эволюционно консервативный домен SAY и показана его способность самостоятельно активировать транскрипцию в дрожжевой двугибридной системе (Shidlovskii et al., 2005). Гомологи SAYP, содержащие этот специфический домен, присутствуют у многих высших эукариот. Примером такого гомолога 6

является, например, человеческий белок PHF10, который также содержит домен, высоко гомологичный домену SAY и два расположенных рядом PHD домена.

Из всех исследованных доменов SAYP только домен SAY обладал способностью активировать транскрипцию репортерного гена в S2 клетках (Рис.1 Б). Однако изучение в нашей системе слитного домена, содержащего оба консервативных домена SAY и PHD, показало в 3 раза большую активацию транскрипции репортерного гена, чем при использовании только SAY домена. Таким образом, PHD домен, по-видимому, важен для эффективной активации транскрипции посредством SAY в S2 клетках дрозофилы. Так как для этого типа доменов характерно свойство специфически распознавать модификации гистонов, возможно, они путем взаимодействия с нуклеосомами стабилизируют активационный домен SAY на рспортерном гене или ориентируют образуемый им комплекс более благоприятно для активации транскрипции.

Рис 1. Определение домена белка SAYP, отвечающего за свойство белка активировать транскрипцию в системе S2 клеток D. melanogaster:

А - Схема работы конструкции pTrAssay, применявшейся для поиска активационного домена. Под контролем конститутивного промотора актина изучаемый домен экспрессировался слитно с ДНК-связывающим доменом Gal4. Экспрессированный подобным образом слитный белок привлекался за счет ДНК-связывающего домена к UAS сайтам, оказываясь в непосредственной близости от укороченного hsplO промотора и исследуемый домен активировал транскрипцию репортерного гена, если был на это способен;

Б - Относительная активность отдельных доменов белка SAYP в системе для изучения способности белков активировать транскрипцию в S2 клетках. Относительная активность представляет собой значение равное отношению относительной активности репортерного белка (Р-галактозидазы) к относительному количеству исследуемого домена, измеренному при помощи иммуноферментного анализа.

N-специфический для D.melanogaster домен белка; АТ-домен, содержащий AT-hook; SAY-консервативный домен, характерный для всех гомологов; PHD-два рядом расположенных PHD домена; SAY-PHD - домен, объединяющий домены SAY и PHD; Gal4 - активатор транскрипции Gal4, содержащий ДНК-связывающий и активационный домены, был взят нами в качестве положительного контроля; Gal4-BD — ДНК-связывающий домен GAL4, был взят в качестве отрицательного контроля.

ftfаивгер

«АК Г»» '.1'ъ*-:.--*** oedfai пш SAYP

Определение коактиваторов, обеспечивающих способность SAY домена активировать транскрипцию репортерного гена

Для обнаружения коактиваторов, при помощи которых домен SAY осуществляет свою активаторную функцию в S2 клетках D. melanogaster было изучено, как снижение уровня различных компонентов комплексов-коакгиваторов транскрипции при помощи РНК-интерференции оказывает влияние на активацию при помощи SAY репортерного гена в описанной системс(Рис. 2А). Для большей стабильности результатов, а также для сохранения влияния организации хроматина в области промотора на его работу (так в некоторых работах было показано, что ДНК плазмид при временной трансфскции в клетку не несст нуклсосом) были получены две линии S2 клеток, стабильно экспрессирующие SAY и SAY-PHD домены в составе конструкции pTrAssay. В дальнейших экспериментах была использована линия, несущая SAY домен, однако стоит отметить, что и линия SAY-PHD обладала схожими свойствами.

Для определения роли различных коактиваторов транскрипции на активацию при помощи SAY домена была изучена экспрессия репортерного гена в клетках стабильной линии, несущей SAY домен, в условиях снижения уровня различных компонентов комплексов-коактиваторов транскрипции при помощи РНК-интерференции. Значительное снижение активации экспрессии репортерного гена SAY доменом было обнаружено при РНК-интерференции компонентов общего фактора транскрипции TFIID и хроматин ремоделирующего комплекса Brahma. В тоже время, снижение уровня GCN5-гистонацетилтрансферазы и ISWI-ремоделирующей АТФазы, которые также являются компонентами комплексов-коактиваторов транскрипции (семейств комплексов SAGA и ISWI соответственно), не оказало влияния на способность SAY-домена активировать транскрипцию.

Для подтверждения взаимодействия консервативного домена SAY и коактиваторов TFIID и Brahma были проведены эксперименты по осаждению домена SAY из лизата клеток стабильно трансфицированной линии при помощи aimi-FLAG-агарозы (Sigma) (Рис.2б).

Полученные результаты показали, что домен SAY способен соосаждать компоненты коактиваторов TFIID и Brahma и не способен соосаждать ОС^5-ацстилтрансферазу (компонент семейства комплексов SAGA) и ISWI-ремодслирующую АТФ-азу (компонент семейства комплесов ISWI) из лизата S2 клеток. Как и стоило ожидать такими же свойствами обладал и участок белка, содержащий SAY и PHD домены, в то время, как сами по себе PHD домены оказались не способными соосаждать ни один из изучаемых белков.

Таким образом, в результате проведенного эксперимента было показано, что способность изучаемого нами домена SAY активировать транскрипцию репортерного гена В

зависит от уровня компонентов общего фактора транскрипции TF1ID и хроматин ремоделирующсго коактиватора Brahma. По-видимому, коактиваторы TFIID и Brahma и определяют способность SAY домена активи]

140

SAY

ИФ ил

РВ MOR TAFI TAF4

TBP щ ^

TAF9

TAFI 0 <***•»»

GCN5

ISWI

PHD SAY-PHD Ga14BD

ИФ ИП ИФ ИП ИФ ИП

if 4-

1#

m

»V

^ a-FLAG «HB «Ц «»Ж

А Б

Рис. 2 Изучение влияния компонентов различных коактиваторов транскрипции на способность SAY активировать транскрипцию репортерного гена в S2 клетках:

А - Уровень активации репортерного гена в системе pTrAssay при помощи домена SAY на фоне снижения уровня различных компонентов комплексов-коактиваторов транскрипции. TAFI, TAF4 - компоненты общего фактора транскрипции TFIID; РВАР, ВАР 170 - компоненты хроматин-ремоделирующего комплекса Brahma; GCN5 - гистоацетшпрансфераза; ISWI - ремоделирующая АТФаза; pSK - последовательность плазмиды pBluescriptSK2(-) - взята нами в качестве отрицательного контроля. За 100% принято значение активации репортерного гена доменом SAY без снижения уровня каких-либо коактиваторов в клетке.

Б - Соосаждение белков - компонентов транскрипционных комплексов из клеточного лизата доменами SAYP. Все изученные домены были маркированы тройным FLAG-эпитопом, поэтому коиммунопреципитацию проводили с использованием агарозы с иммобилизованными анти-FLAG антителами. TAFI, TAF4, TAF9, TAF10, ТВР - компоненты общего фактора транскрипции TFIID; РВАР, MOR - компоненты хроматин-ремоделирующего комплекса Brahma; GCN5 -гистоацетшпрансфераза; ISWI ремоделирующая АТФаза, a-FLAG антитела к FLAG эпитопу.

Колоколизация компонентов комплексов-коактиваторов транскрипции на репортерном гене, активируемом SA Y доменом в ядре клетки

Взаимодействие SAY домена с комплексами TFIID и Brahma было также подтверждено экспериментами по иммуноокрашиванию клеток стабильно трансфицированных плазмидой pTrAssay, несущей в своем составе последовательность, кодирующую SAY домен (Рис. 3). Известно, что трансгены в стабильных линиях S2 клеток встраиваются в геном, образуя локусы с большим количеством повторов (обычно порядка нескольких тысяч). Описанная выше и используемая в этом эксперименте конструкция pTrAssay содержит не только последовательность для экспрессии исследуемого SAY домена,

но также и сайты для связывания слитного белка, состоящего из ДНК-связывающего домена GAL4 и SAY домена. Поэтому, при встраивании в геном, локус трансгена будет нести сайты для посадки экспрессируемого домена. В результате иммуноокрашивания клеток такой стабильной линии ожидалось обнаружить скопление гиперэкспрессированного домена внутри ядра в одной точке, а именно в локусе встраивания трансгена. Как и предполагалось при иммуноокрашивании клеток стабильной линии, экспрессирующей SAY домен, с использованием анти-FLAG антител было обнаружено скопление изучаемого домена в одной точке внутри ядра.

Вначале были проведены эксперименты по совместному иммуноокрашиванию клеток анти-FLAG антителами с гибридизацией in situ последовательности GAL4 DBD для подтверждения локализации скопления SAY домена именно в локусе встраивания трансгена. В результате было показано, что SAY домен локализуется именно в локусе трансгенов, вероятнее всего, находясь на промоторе репортерного гена, чью транскрипцию он активирует. Далее, проводя иммуноокрашивание клеток стабильной линии специфическими антителами к компонентам коактиваторов TFIID и Brahma, было показано, что эти комплексы настолько активно привлекаются к активированному репортерному гену при помощи SAY домена, что также образуют скопление в виде точки, которое хорошо

Рис. 3. Колокализация компонентов комплексов-коактиваторов транскрипции на репортерном гене в клетках линии, стабильно экспрессирующей SAY домен в составе конструкции pTrAssay:

А - совместное иммуноокрашивание антителами к FLAG SAY домену и гибридизация in situ последовательности GAL4 BD:

Б-Е - иммуноокрашивание с использованием антител к FLAG (показывает локализацию в клетке SAY домена, маркированного FLAG эпитопом), компонентам общего фактора транскрипции TFIID (ТВР и TAF1) и хроматин ремоделирующего комплекса Brahma (РВ), а также антителами к ацетилтрансферазе GCN5 (компоненту SAGA-комплекса), взятыми в качестве контроля.

колокализуется с изучаемым доменом.

SAY GAL4 BD наложение

Таким образом, было подтверждено взаимодействие SAY домена с различными компонентами общего фактора транскрипции TFIID и хроматин ремоделирующего комплекса Brahma в результате колокализации белков на репортерном гене, активированном SAY доменом, внутри ядра клетки.

Экспрессированный в S2 клетках SAY домен способен образовывать белковый комплекс, характерный для полноразмерного SA YP

Параллельно с настоящей работой в нашей лаборатории проводилась биохимическая очистка комплекса, образуемого белком SAYP из ядерного экстракта эмбрионов D. melanagaster. Было обнаружено, что полноразмерный белок SAYP способен формировать белковый комплекс размером порядка 2 МДа и состоящий из коактиваторов TFIID и Brahma (Сошникова et al, 2008).

Приведенные выше эксперименты показали, что основным доменом белка SAYP, отвечающим за взаимодействие с коактиваторами TFIID и Brahma является SAY домен. Было решено проверить, способен ли SAY домен сам по себе формировать полноразмерный комплекс характерный для SAYP.

Для определения размера белкового комплекса, образуемого доменом SAY, его гипсрэкспрессировали в S2 клетках D. melanagaster в составе конструкции pTrAssay. По истечении двух суток после трансфекции клетки лизнровали и клеточный лизат был фракционирован при помощи гель-фильтрации (Superóse 6). Распределение экспрессированного домена по фракциям детектировали при помощи вестерн-блот анализа с использованием анти-FLAG антител (Рис. 4). Так как изучаемый домен экспрессировался в клетках на очень высоком уровне, то вполне объяснимо его распределение по фракциям широким пиком. Для образования полноразмерного комплекса размером 2 МДа, SAY домену, вероятно, не хватило эндогенных партнеров. Однако, как видно на разделении, SAY домен присутствует в высоких фракциях, соответствующих 2-2,5 МДа. Чтобы выяснить, с какими транскрипционными коактиваторами объединяется SAY домен для образования комплекса размером 2 МДа было выполнено соосаждение анти-FLAG антителами из различных фракций компонентов транскрипционных комплексов. Основываясь на приведенных выше экспериментах, основными претендентами были компоненты основного фактора транскрипции TFIID и ремоделирующего комплекса Brahma, тем более, что если суммировать массу их компонентов, они способны образовывать единый комплекс искомого размера.

Только из высоких фракций, соответствующих размеру комплекса 2МДа, SAY домен оказался способным сооеаждать компоненты комплексов TFIID и Brahma, а из более низких фракций, взятых в качестве контроля, SAY их не преципитировал.

Таким образом, изучаемый SAY домен, при экспрессии его в S2 клетках способен образовывать комплекс, характерный для полноразмерного белка размером порядка 2МДа и состоящий из основного фактора транскрипции TFI1D и хроматин ремоделирующего комплекса BRM.

Фракционирований лизата клеток, траксфицировэнных pTrAssay конструкцией, содержащей SAY домен

ИО 2,0 0.67 0 44 M Да

4 * * *

4 5 6 7 8 S 10 11 12 13 14 15 IS 17 18 19 20 21 22 23 24 SAY-FLAG .. • ^ ^

ИЛ акти-RAG AT

Moire

TAF10

Рис. 4. Фракционирование лизата клеток, экспрессирующих SAY домен в составе конструкции pTrAssay при помощи гель-фильтрации. Соосаждение SAY доменом компонентов (а) основного фактора транскрипции TFilD (TAPIO) и хроматин ремоделирующего комплекса Brahma (Moira) из различных фракций.

ИО - исключенный объем колонки, ИФ - исходная фракция, ИП - иммунопреципитация.

Определение белка-партнера в составе коактиватора Brahma,

взаимодействующего с SA У

Основываясь на полученных ранее данных (Сошникова et al, 2008) о том, что SAYP взаимодействует именно с подтипом РВАР комплекса Brahma, в качестве предполагаемых партнеров выступало всего два белка, характерных для этого комплекса. В выделенном комплексе, образуемом SAYP, не было обнаружено компонента Osa, зато были обнаружены оба специфических компонента для РВАР комплекса (ВАР170 и РВАР).

Чтобы выяснить, какая же из этих специфических субъединиц непосредственно взаимодействует с SAYP, предположили, что, понизив уровень белка-партнера, можно нарушить ассоциацию SAYP с коровыми компонентами комплекса, если конечно при этом не нарушается стабильность самого комплекса. Для этого в клетках линии, стабильно экспрессирующсй SAY домен, методом РНК интерференции понижали уровень РВАР и

\ \ i

фрб+7 Ф ИП

фр11-И2 ИО ИП

фр17+18 m ип

ВАР 170 компонентов комплекса Brahma (его подтипа РВАР). Затем из грубого клеточного лизата антителами к FLAG эпитопу соосаждали коровые компоненты Brahma (Рис.5А).

На рисунке хорошо видно, что именно снижение уровня компонента ВАР 170 комплекса Brahma значительно нарушает взаимодействие SAY домена с основными субъединицами комплекса, в то время как РНК интерференция РВАР такого влияния не оказывала.

Кроме того, непосредственное взаимодействие домена SAY с ВАР 170 было подтверждено соосаждением их из клеточного лизата после совместной гиперэкспрессии их в S2 клетках (Рис.5Б). Для этого, ранее полученная клеточная линия, стабильно экспрессирующая SAY была трансфицирована конструкцией, несущей последовательность, кодирующую ВАР170, маркированный гемагглютинином, под контролем конститутивного актинового промотора. Гиперэкспрсссированный ВАР170 белок соосаждался вместе с SAY доменом из клеточного лизата при помощи анти-FLAG антител. По-видимому, в этом (эксперименте гиперэкспрсссированный компонент ВАР170 замещал эндогенный белок в составе транскрипционного комплекса, образуемого SAY, так как в результате осаждения I SAY домена при гиперэкспрессии ВАР170 не было обнаружено ни одного другого компонента Brahma комплекса (его подтипа РВАР).

В качестве контроля для этого эксперимента была использована клеточная линия, стабильно экспрессирующая ДНК-связывающий домен GAL4. Она также было трансфицирована конструкцией с последовательностью ВАР 170. Однако, в отличие от SAY домена, контрольный белок GAL4 DBD не взаимодействовал с ВАР 170.

Результаты двух различных экспериментов показали, что SAY домен белка SAYP ! взаимодействует с ВАР 170 компонентом комплекса Brahma (его варианта РВАР).

РИК-и

SAW 73 (Ш.

РВ

ВАР 170 8RM MOR FLAG-SAY tubulin

V

ИФ ИП FLAG-SAY

+

т iSSt ТШ UStt - ' *ЙЙЙЙ

ot-FLAG

НА-ВАР170

FLAG-SAY

ИФ СН

ИП

РВ

BRM ЯННШ

MORS

ss?

Рис. 5. Определение непосредственного партнера SAY в составе хроматин ремоделирующего комплекса РВАР:

А - Соосаждение SAY доменом коровых компонентов Brahma комплекса (его подтипа РВАР) при РНК интерференции его субъединиц РВАР и ВАР 170;

Б - Соосаждение доменом SAY белка ВАР170 при совместной гиперэкспрессии в S2 клетках дрозофилы.

ИФ - исходная фракция; ИП - иммунопреципитация; СН - супернатант.

Определение белка-партнера в составе общего фактора транскрипции TFIID,

взаимодействующего с SAY

При поиске предположительных кандидатов на непосредственного партнера SAY в составе общего фактора транскрипции TFIJD мы также опирались на полученные ранее данные (Сошникова et al, 2008). Стоит отметить, что выделенный комплекс SAYP не имел четкой стехиометрии и отдельные компоненты коактиватора TFIID в его составе были представлены в различном количестве (для комплекса TFIID это свойство уже было описано другими авторами ранее (Sanders et al, 2002)). Поэтому, для исследования в качестве партнера домена SAY были выбраны мажорные компоненты комплекса. По такой же, как и в случае с комплексом Brahma, схеме определения белкового партнера были исследованы несколько TAF белков. Однако основным кандидатом являлся белок TAF5, так как он был представлен в очищенном комплексе белка SAYP наиболее полно и, кроме того, при использовании ядерного экстракта эмбрионов дрозофилы и соосаждении антителами к SAYP истощался с самой высокой эффективностью. Также, как и для ВАР170, при помощи РНК-интерференции в линии клеток, стабильно экспрессирующих SAY домен в конструкции pTrAssay, был снижен уровень белков TAF4 и TAF5. Затем была проведена иммунопреципитация клеточного лизата, антителами к FLAG эпитопу. На рисунке 6А видно, что при пониженном уровне белка TAF5 SAY домен теряет способность соосаждать коровый компонент TFIID комплекса TAF4. Стоит отмстить, что РНК-интерференция TAF5 практически не влияет на клеточный уровень TAF4. По данным, полученным другими авторами, TAF4 является основной субъединицей комплекса TFI1D, при снижение его уровня в клетке сильнее всего нарушается стабильность комплекса и уровень других компонентов комплекса в клетке (Wright et al, 2006). В контрольных экспериментах при РНК-интерференции ОСЫ5-гистонацстилтрансфсразы и pSK, SAY домен соосаждал все изученные компоненты TFIID комплекса. Таким образом, TAF5 является важным белком для ассоциации SAY домена с общим фактором транскрипции TFIID.

Так как, TAF5 является одним из коровых компонентов TFIID, и снижение его уровня экспрессии оказывает влияние на несколько TAF, полученные данные было решено подтвердить экспериментами по непосредственному соосаждснию белков TAF5 и SAY домена после гиперэкспрсссии их в S2 клетках. Для этого линию S2 клеток, стабильно экспрессирующую SAY домен в составе конструкции pTrAssay, трансфицировали плазмидой, несущей последовательность TAF5 под контролем актинового промотора. На рисунке 6Б видно, что SAY домен связывает значительную часть TAF5, экспрессированного в клетке. Кроме того, отдельно нами было изучено взаимодействие SAY домена с WD-40 доменом, входящим в состав TAF5. Ранее другие авторы предсказывали для WD-40 TAF5 14

функцию домена, обеспечивающего взаимодействие TFIID с транскрипционными факторами (Dubrovskaya et al, 1996). Для изучаемого в данной работе SAY домена это предположение подтвердилось. Действительно, WD-40 домен, экспрессируемый в клеточной линии несущей SAY домен в конструкции pTrAssay полностью соосаждался антителами к FLAG эпитопу. Стоит отметить, что ранее была показана неспособность WD-40 домена TAF5 встраиваться в состав эндогенного комплекса TFI1D, так что наблюдаемое нами взаимодействие не может быть опосредовано какими-либо другими компонентами комплекса.

Таким образом, непосредственным белковым партнером SAY домена в составе комплекса TF1ID является TAF5, а именно его WD-40 домен.

РНК-И

TAF4 TAF5 GCN5 pSK

т FLAG-SAY

«-•НА

PLAG-SAY HA-TAFS

«-FLAG

TAF4 ♦ »-НА a-FLAG

TAF5 1

№СН ИП ИФСН ИП

TAF8 FLAG-SAY «г

Tubulin * HA-WD-40

Рис. 6. Определение непосредственного партнера SAYP в составе основного фактора транскрипции TFIID:

А - Соосаждение SAY доменом коровых компонентов TF1ID комплекса при РНК-интерференции субъединиц TAF4 и TAF5;

Б - Соосаждение доменом SAY белка TAF5 и его WD-40 домена при их совместной гиперэкспрессии в S2 клетках.

ИФ - исходная фракция; ИП - иммунопреципитация; СН - суггернатант.

III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изначально коактнватор SAYP был описан как транскрипционный фактор, необходимый для активированной экспрессии гена yellow у Dr. melanogaster (Georgiev P., Gcrasimova Т., 1989). Позднее, в нашей лаборатории он был более детально охарактеризован, а также были обнаружены его гомологи у других организмов (Sliidlovskii et al, 2005). Обнаруженные гомологи SAYP значительно различаются по длине белка даже среди родственных видов, а гомолог SAYP у человека - белок PHF10 (BAF45a) имеет приблизительно в 5 раз меньшую длину. Обнаруженные белки имеют в своем составе область высокой гомологии характерную для всех белков-гомологов, которая была названа SAY доменом, и для которой были обнаружены свойства активировать транскрипцию в дрожжевой системе. Этот консервативный домен белка SAYP представляет интерес, так как, вероятно, его свойства, изученные для белка дрозофилы, будут характерны и для белков-гомологов. В задачи данного исследования входило изучение способности доменов белка SAYP активировать транскрипцию в S2 клетках дрозофилы, а также выявление механизма, по которому осуществляется данная активация.

В результате проведенной работы был изучен консервативный домен SAY транскрипционного коактиватора SAYP, имеющий гомологов во многих организмах. Была показана его способность активировать транскрипцию репортерного гена в природной для него системе S2 клеток D.melanogaster, а также обнаружены взаимодействующие с ним коактиваторы транскрипции, которые и определяют его свойства. Также для SAY домена была описана способность формировать белковый комплекс, характерный для полноразмерного белка, взаимодействуя одновременно с транскрипционными комплексами TFI1D и Brahma (вариант РВАР). В составе этих комплексов были обнаружены белки с которыми домен взаимодействует: ВАР170 - в случае Brahma комплекса (его РВАР варианта) и WD-40 домен белка TAF5 - в случае фактора TFIID.

Таким образом, впервые был описан новый механизм функционирования коактиватора транскрипции, который заключается в непосредственном объединении на промоторе в общий стабильный комплекс общего фактора транскрипции TFIID и хроматин ремодслирующего комплекса Brahma, то есть транскрипционных комплексов, отвечающих за ключевые этапы активации транскрипции. Неоднократно было показано, что рсмодслированис хроматина на промоторе и посадка общего фактора транскрипции TFIID это зависимые процессы. Представленный выше общий комплекс коактиваторов способен сам по себе обеспечивать выполнение двух важнейших этапов подготовки промотора для формирования ггрсинициаторного комплекса, а значит и последующей активации

транскрипции. В результате экспериментов был также локализован SAY домен белка, отвечающий за формирование общего комплекса, который является областью высокой гомологии этого белка у других организмов. Исходя из этого, можно предположить наличие сходного механизма функционирования коактиватора и для его белков-гомологов в других организмах, в частности белка PHF10 (BAF45a) человека.

IV. ВЫВОДЫ

1. Способность белка SAYP активировать транскрипцию определяется консервативным SAY доменом, присутствующим у всех гомологов SAYP, в том числе и в белке PHF10 человека.

2. Способность SAY домена активировать рспортерный ген в клетке зависит от уровня компонентов общего фактора транскрипции TFIID и хроматин ремоделирующего комплекса Brahma.

3. Показано, что SAY домен взаимодействует с коастивагорами TFIID и Brahma и способен формировать комплекс размером приблизительно 2МДа, включающий данные коактиваторы.

4. В составе коактиваторов TFIID и Brahma идентифицированы белки, с которыми взаимодействует SAY домен. Это белки ВАР 170 комплекса Brahma и белок TAF5 комплекса TFIID. Показано, что SAY домен взаимодействует с доменом WD-40 белка TAF5.

5. Впервые описан новый механизм функционирования коактиватора транскрипции, который заключается в непосредственном объединении на промоторе в общий стабильный комплекс общего фактора транскрипции TFIID и хроматин ремоделирующего комплекса Brahma, го есть транскрипционных комплексов, отвечающих за ключевые этапы активации транскрипции

V. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

Статьи:

1. Воробьева Н.Е.. Сошникова Н.В., Николенко Ю.В., Набирочкина E.H., Георгиева С.Г., Шидловекий Ю.В. «Новый эволюционно консервативный белковый домен, активирующий транскрипцию» Доклады Академии Наук 2008 том 423, №5, стр. 694-696

2. Сошникова Н.В., Воробьева Н.Е.. Краснов А.Н., Георгиева С.Г., Набирочкина E.H., Ильин Ю.В., Шидловекий Ю.В. «Взаимодействие коактиваторов на промоторе» Доклады Академии Наук 2008, том 423, №4, стр. 561-563

Тезисы конференций:

1. Vorobveva N.E.. Soshnikova N.V., Georgieva S.G., Shidlovskii Y.V., llyin Y.V. Structural and functional study of domains of novel transcription coactivator SAYP.FEBS workshop "The biology of modular protein domains", Austria, Tirol, 8-13 September, 2007, Abstract book, p. 122

2. NE Vorobveva. NV Soshnikova, YV Shidlovskii and SG Georgieva Studying structure and function of SAYP domains. Workshop "Protein-nucleic acid interactions" of the International Research Training Group Giessen/Marburg-Moscow, Suzdal, 20-24 June, 2007, р.31

3. Воробьева H.E.. Шидловекий Ю.В., Николенко Ю.В., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г. Структурный и функциональный анализ транскрипционного коактиватора SAYP. XIX зимняя школа молодых ученых «Перспективные направления в физикохимичсской биологии и биотехнологии». Москва, 7-9 Февраля, 2007: 25

4. Воробьева Н.Е.. Шидловекий Ю.В., Николенко Ю.В., Набирочкина Е.Н., Георгиева С.Г. Роль доменов транскрипционного коактиватора SAYP при активации транскрипции в эукариотической системе. Международная конференция «Генетика в России и в мире» Москва, 28 июня-2 июля, 2006: 37

Подписано в печать 27 апреля 2009 г. Объем 1,2 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 486 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Воробьева, Надежда Евгеньевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Классификации корегуляторов транскрипции

II. Корегуляторы, обладающие способностью модифицировать гистоны

1. Семейство корегуляторных комплексов SAGA

2. MYST семейство

III. АТФ-зависимые хроматин-ремоделирующие комплексы

1. SWI2/SNF2 семейство

2. Семейство ремоделирующих комплексов ISWI

3. Семейство комплексов CHD

IV. Медиаторный комплекс

V. Ядерные рецепторы

VI. Динамика обмена коактиваторных комплексов на промоторе 40 ОБЪЕКТ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 46 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

I. Материалы

II. Методы

РЕЗУЛЬТАТЫ

I. Определение домена белка SAYP, отвечающего за его способность активировать транскрипцию в системе S2 клеток D. Melanogaster

II. Определение коактиваторов, обеспечивающих способность SAY домена активировать транскрипцию репортерного гена

III. Колокализация компонентов комплексов-коактиваторов транскрипции на репортерном гене, активируемом SAY доменом в ядре клетки

IV. Экспрессированный в S2 клетках SAY домен способен образовывать белковый комплекс, характерный для полноразмерного SAYP

V. Определение белка-партнера в составе коактиватора Brahma, взаимодействующего с SAY доменом

VI. Определение белка-партнера в составе общего фактора транскрипции TFIID, взаимодействующего с SAY

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизма действия нового коактиватора транскрипции"

Физиологическое состояние клетки определяется внешними сигналами и в большинстве случаев конечной точкой действия этих сигналов является изменение уровня транскрипции гена. Изучение сложных механизмов, позволяющих клетке распознавать и реагировать на внешние факторы, является одной из основных задач современной молекулярной биологии.

Первым этапом экспрессии большинства генов высших эукариот является транскрипция, осуществляемая РНК-полимеразой И. Этот процесс контролируется многоуровневым аппаратом, состоящим из нескольких тысяч транскрипционных факторов. Для инициации транскрипции какого-либо гена требуется воздействие различных коактиваторных комплексов, которые привлекаются ген-специфическими активаторами (Rosenfeld, Lunyak et al. 2006).

В настоящее время факторы транскрипции принято делить на три большие группы: активаторы и репрессоры (специфичные регуляторы), корегуляторы и общие факторы транскрипции (GTFs-General Transcriptional Factors). Назначение первых - контроль работы определенного гена или группы генов на определенной стадии развития или при наличии определенных сигналов. Основной задачей корегуляторных комплесов (коактиваторов и корепрессоров) является осуществление взаимной связи между активаторами и общими факторами транскрипции, а также изменение состояние хроматина в районе гена.

За последнее десятилетие было описано множество мультибелковых комплексов, которые биохимически и функционально были отнесены к коактиваторам транскрипции. Однако все их можно разделить на два больших класса: адаптеры и хроматин-модифицирующие и ремоделирующие комплексы (Lemon and Tjian 2000). В свою очередь коактиваторы, изменяющие состояние хроматина делятся на ковалентно модифицирующие гистоны и хроматин ремоделирующие.

Подобная классификация является достаточно условной. Так, TAFs (ТВР-ассоциированные факторы) рассматриваются и как GTFs, и как корегуляторы. Фактор SPBP является специфическим регулятором гена стромелизина-1 и одновременно -корегулятором, усиливающим действие ряда других специфических активаторов (Rekdal, Sjottem et al. 2000). В то же время известны специфические факторы транскрипции, осуществляющие взаимодействие с GTFs без участия корегуляторов. Так, активатор VP16C непосредственно взаимодействует с ТВР, TAF9, TFIIA и TFIIB (Nedialkov and Triezenberg 2004)

В настоящее время известно около 100 белков, составляющих основу транскрипционного аппарата (Pol II, GTFs, основные коактиваторы). В то же время количество известных специфических активаторов и репрессоров составляет несколько тысяч (Kadonaga 2004). Однако механизмы, по которым функционируют корегуляторы транскрипции, все еще остаются недостаточно изученными и представляют несомненный интерес.

В данной работе были изучены свойства основного консервативного домена коактиватора транскрипции SAYP: показано, что именно он отвечает за способность этого белка активировать транскрипцию, а также обнаружены взаимодействующие с ним белковые комплексы, которые и осуществляют механизм активации, регулируемый SAYP. Таким образом, показан новый механизм функционирования коактиватора транскрипции посредством объединения двух больших транскрипционных комплексов в единый.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AD (activation domain) — Активационный домен

СВР (CREB binding protein) — Белок, связывающийся с CREB

ChIP (chromatin immunoprecipitation) Иммунопреципитация роматина

CTD (C-terminal domain) — С-концевой домен Pol II

DBD (DNA-binding domain) — ДНК-связываюгций домен e(y)3 (enhancer of yellow 3) — Энхансер тепа yellow 3

ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) Иммуноферментный анализ

FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) Восстановление флуоресценции поле фотообесцвечивания

GTF (general transcription factor) — Общий фактор транскрипции

HAT (hi stone-acety ltransferase) — Гистонацетилтрансфераза

HDAC (hi stone-deacety lase) — Гистондеацетилаза

HMT (histone-methyltransferase) — Гистонметилтрансф ераза

IP (immunoprecipitation) — Иммунопреципитация

LBD (ligand-binding domain) — Лиганд-связываюпшй домен

NR (nuclear receptor) — Ядерный рецептор

PHD (plant homeodomain) — Гомеодомен растений

PIC (preinitiaitory complex) — Преинициаторный комплекс

Pol II (RNA polymerase II) — РНК-полимераза II

RING (Really Interesting New Gene) Белковый домен типа цинковых пальцев Cys3HisCys4

SAYP (supporter of activation of yellow protein) Белок, поддерживающий активацию yellow

TAF (TBP-associated factor) — Фактор, ассоциированный с TBP

TBP (TATA-binding protein) — ТАТА-связывающий белок

TFIIA.H (transcription factor for Pol II) — Транскрипционный фактор Pol II

UAS (upstream activator sequence) Вышележащая активирующая последовательность a.o. — Аминокислотный остаток п.н. — Пары нуклеотидов т.п.н. — Тысяча пар нуклеотидов

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. Классификации корегуляторов транскрипции

За последнее десятилетие было описано множество мультибелковых комплексов, которые биохимически и функционально были отнесены к выполняющим коактиваторную/корепрессорную функцию в процессе регуляции транскрипции.

Эти комплексы обладают большим количеством разнообразных энзиматических активностей, по которым их можно разделить на два класса:

- первый класс состоит из комплексов, способных ковалентно модифицировать N-концевые остатки пистонов, то есть обладающих ацетилирующей/деацетилирующей активностью (HATs и HDACs), метилирующей/деметилирующей активностью (например, НМТ и LSD1), протеинкиназной, протеинфосфатазной, полиАДФрибозилазной, а также убиквитин и SUMO-лигазной активностями;

- второй класс включает в себя члены большого семейства АТФ-зависимых комплексов ремоделинга хроматина (например, SWI/SNF ремоделирующий комплекс), которые обладают АТФ-зависимой активностью и расплетают хроматинизированную ДНК, участвуя в скольжении нуклеосом. (Peterson 2002).

Также в отдельный класс адаптеров можно выделить коактиваторы-члены семейства TRAP/DRIP/Mediator/ARC комплекса. Это белки связываются непосредственно с транскрипционным фактором, рекрутируют РНК полимеразу II и взаимодействуют с общими факторами транскрипции.

Кроме приведенной выше классификации имеется также общая классификация корегуляторов транскрипции, основанная на наличии у корегулятора энзиматической активности. По этой классификации корегуляторы делятся на первичные и вторичные:

- первичные связываются непосредственно с фактором транскрипции и обладают собственной характерной энзиматической активностью,

- вторичные же после взаимодействия с транскрипционным фактором служат матрицей для привлечения других белков, обладающих специфическими энзиматическими активностями.

Отдельные белки-коактиваторы, такие как СВР, сами обладают гистонацетилтрансферазной активностью, а также способны рекрутировать другие HAT, такие как SRC-1 и pCAF. В тоже время СВР может выступать и как вспомогательный белок для вторичного коактиватора, такого как PGC-1 а, который связывается с транскрипционным фактором, но для энзиматической модификации хроматина он привлекает другие белки, такие как СВР, SRC-1 и другие факторы (Рис.1).

Рис.1 Многофункциональная природа коактиваторных белков (Spiegelman and Heinrich 2004). TF-1, TF-2 - транскрипционные факторы, СВР, PGC-lct — белки -коактиваторы для транскрипционных факторов I и 2 соответственно.

Ранее предполагалось, что регуляция активности гена на транскрипционном уровне осуществляется в основном за счет изменения количества или уровня активности транскрипционных факторов. В зависимости от внешних условий активаторные белки могут быть сами по себе транскрипционно индуцированы или репрессированы, а также активированы или дезактивированы посредством протеолиза, ковалентных модификаций или связывания с лигандом. Контроль ядерного NFkB в сигнальном пути реакции на воспаление, а также индукция миогенных b-HLH белков, таких как MyoD, во время мышечной дифференцировки являются классическими примерами подобного биологического контроля за счет изменения количества транскрипционных факторов. (Filvaroff and Derynck 1996; Lentsch and Ward 1999)

Однако недавние данные показали, что важный физиологический контроль системы регуляции генов осуществляется не только активаторами и репрессорами. Корегуляторные белки могут участвовать в регуляции гена не только как необходимое «колесо» в транскрипционной «машине», но также и являться первичными целями физиологических сигналов или сигналов при развитии организма. Самый простой сценарий регулирования экспрессии при помощи коактиваторов, это когда профиль экспрессии коактиватора имеет тканевую специфичность или присущ какой-то стадии развития, в то время, как транскрипционный фактор экспрессируется гораздо более широко. Примером такого механизма является действие коактиватора миокардина, который обеспечивает специфическую активацию генов клеток гладких мышц с участием SRF фактора. В этом процессе тканеспецифическим профилем экспрессии обладает именно коактиватор. В то время как сам SRF транскрипционный фактор не только не обладает специфичностью экспрессироваться в клетках гладких мышц, но даже не обладает тканевой специфичностью к мышцам. По похожему механизму функционируют белки коактиваторы ОСА-B и FOG, обеспечивая специфичность экспрессии на определенной стадии развития для более широко распространенных транскрипционных факторов Oct и GATA соответственно. (Spiegelman and Heinrich 2004)

П. Корегуляторы, обладающие способностью модифицировать гистоны

Кроме участия в упаковке ДНК в ядре, нуклеосомные а также более высокого порядка хроматиновые структуры участвуют в регуляции процесса транскрипции в клетке, так как представляют собой барьер для транскрипционной «машины». Эксперименты с удалением гистонов в дрожжах подтверждают общую репрессирующую функцию для гистонов, а также показывают, что действие многих активаторов направлено на преодоление репрессирующих свойств гистонов, в том числе и путем удаления гистонов из активно транскрибируемого участка ДНК. (Han and Grunstein 1988)

За последнее десятилетие было проведено множество исследований, которые показали, что большое количество разнообразных модификаций (ацетилирование, метилирование, • фосфорилирование и убиквитинилирование) N-концевых «хвостов» гистонов не только коррелирует, но, по-видимому, и является причиной специфической активации и репрессии генов. (Berger 2002). Причем было показано, что N-концевые хвосты гистонов НЗ и Н4 зачастую принимают участие в механизме активации транскрипции, в отличие от N концов гистонов Н2А и Н2В. (An, Palhan et al. 2002)

Существует две модели, которые объясняют, как модификации с изменением зарядов хвостовых остатков могут влиять на взаимодействия гистонов с ДНК или белком, тем самым, изменяя структуру хроматина. Например, ацетилирование нейтрализует положительный заряд на лизине, тем самым уменьшая силу взаимодействия нуклеосомы с отрицательно заряженными фосфатными остатками ДНК, делая ДНК более доступной для таких активных процессов как транскрипция. (Wade, Pruss et al. 1997) Альтернативная, более сложная модель, учитывающая недавно открытые функции и партнеров для связывания многочисленных модификаций гистонов известна как «гистоновый код». В этой модели гистоновые модификации, действующие как специфические сайты (поодиночке и координировано, или последовательно на одном или многих гистонах), способны формировать «гистоновый код», распознаваемый транскрипционными факторами и корегуляторами и определяющий специфическое функционирование хроматина. (Turner 2000)

К настоящему времени описано множество кофакторов, которые вызывают вышеперечисленные модификации гистонов и которые связывают с различными механизмами активации и репрессии транскрипции. К сожалению, большинство исследований показывает только корреляцию между модификацией гистонов и регуляцией генов, но не доказывает, что они являются ее причиной.

Кроме того, у многоклеточных, имеются случаи, когда сами факторы регуляции транскрипции также являются субстратами для действия кофакторов, модифицирующих гистоны, примером такого действия является р53 (Gu and Roeder 1997).

Несмотря на то, что в достаточно короткое время накопилось множество информации о разнообразных модификациях гистонов, до сих пор еще не совсем ясно какие отношения возникают между механизмом регуляции транскрипции и различными модификациями. Однако уже ясно, что эти отношения цикличны и взаимозависимы. Например, корегуляторы, модифицирующие гистоны не способны достигнуть своих субстратов, пока они не «помечены» соответствующей модификацией.

Правильно организованный порядок привлечения коактиваторов диктуется комбинацией промотор-специфичных транскрипционных факторов. В этом контексте белковые домены этих факторов, такие как бромодомены, хромодомены, RING домены, PHD домены, F-боксы и SANT домены, а также узнающие последовательности для SUMO лигаз, протеинкиназ, и протеинфосфатаз способны распознавать специфические модификации и играть важную роль в процессе позиционирования корегуляторов на хроматине. Каждый из этих белковых доменов способен обладать двумя функциями: служить для узнавания специфической модификации гистонов, а также для осуществления этой модификации. Кроме того, известно, что хроматин-связывающие домены могут играть центральную роль в установлении периодичности транскрипционных состояний или достижении длительного транскрипционного состояния, когда это необходимо. Зачастую корегуляторы несут несколько таких узнающих/модифицирующих доменов. Например, не смотря на то, что СВР имеет бромодомен, для выполнения своей функции гистонацетилтрансферазы ему также необходим и PHD домен. В тоже время, Tip60 и MOF имеют хромодомены, но не обладают PHD или бромодоменами. Присутствие различных доменов в ацетилтрансферазах согласуется с взглядом на специфическое, своевременное вовлечение их в цикл активации. При репрессии наблюдаются сходные механизмы. Например, хромодомен белка НР1 узнает метилированный К9 гистона НЗ и запускается механизм длительного транскрипционного молчания гена (Volpe, Kidner et al. 2002). Кроме того, недавние исследования продемонстрировали, как некоторые хроматин-связывающие факторы могут изменять субстратную специфичность хроматин-модифицируюгцих ферментов. Примером служит привлечение LSD1 на промотор с помощью COREST, где диметил К4 гистона НЗ является субстратом для действия деметилазы (Lee, Wynder et al. 2005). В другом случае, когда LSD1 привлекается при помощи андрогенового рецептора, она функционирует как К9-НЗ деметилаза, а ее действие стимулирует лиганд-зависимую транскрипцию (Metzger, Wissmann et al. 2005).

Существование специфического порядка действия гистон/фактор-модифицирующих комплексов представляет собой сигнальный путь, определяющий активное/репрессированное состояние гена, а для сенсоров, действие которых специфично во времени, существуют дополнительные сигнальные пути, изменяемые через периодические интервалы обмена корегуляторными комплексами. Эта циклическая система зависит от системы упреждения, в которой какая либо метка, вызывающая преимущественное рекрутирование какого-то одного комплекса, может быть изменена, чтобы разрешить последующее привлечение следующих комплексов каскада, вызывая изменение в промоторном комплексе и гистоновых модификациях, которые стимулируют следующую когорту корегуляторов. Этот обмен также требует специальной стратегии для быстрого очищения промотора от предыдущего в цикле кофакторного комплекса, которая достигается или его быстрой деградацией и/или быстрым перемещением. Результатом такого циклического обмена является то, что постоянно изменяемый набор гистоновых модификаций и коакгиваторных комплексов является платформой для привлечения следующего кофакторного комплекса, основываясь на действии каждого предыдущего.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Воробьева, Надежда Евгеньевна

выводы

1. Способность белка SAYP активировать транскрипцию определяется консервативным SAY доменом, присутствующим у всех гомологов SAYP, в том числе и в белке PHF10 человека.

2. Способность SAY домена активировать репортерный ген в клетке зависит от уровня компонентов общего фактора транскрипции TFIID и хроматин ремоделирующего комплекса Brahma.

3. Показано, что SAY домен взаимодействует с коактиваторами TFIID и Brahma и способен формировать комплекс размером приблизительно 2МДа, включающий данные коактиваторы.

4. В составе коактиваторов TFIID и Brahma идентифицированы белки, с которыми взаимодействует SAY домен. Это белки ВАР 170 комплекса Brahma и белок TAF5 комплекса TFIID. Показано, что SAY домен взаимодействует с доменом WD-40 белка TAF5.

5. Впервые описан новый механизм функционирования коактиватора транскрипции, который заключается в непосредственном объединении на промоторе в общий стабильный комплекс общего фактора транскрипции TFIID и хроматин ремоделирующего комплекса Brahma, то есть транскрипционных комплексов, отвечающих за ключевые этапы активации транскрипции

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воробьева, Надежда Евгеньевна, Москва

1. Allard, S., R. Т. Utley, et al. (1999). "NuA4, an essential transcription adaptor/histone H4 acetyltransferase complex containing Esalp and the ATM-related cofactor Tralp." EMBO J 18(18): 5108-19.

2. An, W., V. B. Palhan, et al. (2002). "Selective requirements for histone H3 and H4 N termini in p300-dependent transcriptional activation from chromatin." Mol Cell 9(4): 811-21.

3. Armstrong, J. A., O. Papoulas, et al. (2002). "The Drosophila BRM complex facilitates global transcription by RNA polymerase II." Embo J 21(19): 5245-54.

4. Beisel, C., A. Imhof, et al. (2002). "Histone methylation by the Drosophila epigenetic transcriptional regulator Ashl." Nature 419(6909): 857-62.

5. Belotserkovskaya, R., D. E. Sterner, et al. (2000). "Inhibition of TATA-binding protein function by SAGA subunits Spt3 and Spt8 at Gcn4-activated promoters." Mol Cell Biol 20(2): 634-47.

6. Berger, S. L. (2002). "Histone modifications in transcriptional regulation." Curr Qpin Genet Dev 12(2): 142-8.

7. Bhaumik, S. R. and M. R. Green (2002). "Differential requirement of SAGA components for recruitment of TATA-box-binding protein to promoters in vivo." Mol Cell Biol 22(21): 7365-71.

8. Bird, A. W., D. Y. Yu, et al. (2002). "Acetylation of histone H4 by Esal is required for DNA ■ double-strand break repair." Nature 419(6905): 411-5.

9. Borrow, J., A. M. Shearman, et al. (1996). "The t(7;ll)(pl5;pl5) translocation in acute myeloid leukaemia fuses the genes for nucleoporin NUP98 and class I homeoprotein HOXA9." Nat Genet 12(2): 159-67.

10. Bouazoune, K., A. Mitterweger, et al. (2002). "The dMi-2 chromodomains are DNA binding modules important for ATP-dependent nucleosome mobilization." Embo J 21(10): 243040.

11. Boudreault, A. A., D. Cronier, et al. (2003). "Yeast enhancer of polycomb defines global Esal-dependent acetylation of chromatin." Genes Dev 17(11): 1415-28.

12. Burke, T. W., J. G. Cook, et al. (2001). "Replication factors MCM2 and ORC1 interact with the histone acetyltransferase HBOl." J Biol Chem 276(18): 15397-408.

13. Carrozza, M. J., R. T. Utley, et al. (2003). "The diverse functions of histone acetyltransferase complexes." Trends Genet 19(6): 321-9.

14. Champagne, N., N. R. Bertos, et al. (1999). "Identification of a human histone acetyltransferase related to monocytic leukemia zinc finger protein." J Biol Chem 274(40): 28528-36.

15. Chawla, A., J. J. Repa, et al. (2001). "Nuclear receptors and lipid physiology: opening the X-files." Science 294(5548): 1866-70.

16. Cheung, P., K. G. Tanner, et al. (2000). "Synergistic coupling of histone H3 phosphorylation and acetylation in response to epidermal growth factor stimulation." Mol Cell 5(6): 905-15.

17. Clarke, A. S., J. E. Lowell, et al. (1999). "Esalp is an essential histone acetyltransferase required for cell cycle progression." Mol Cell Biol 19(4): 2515-26.

18. Col, E., C. Caron, et al. (2005). "HIV-1 Tat targets Tip60 to impair the apoptotic cell response to genotoxic stresses." EMBO J 24(14): 2634-45.

19. Collins, R. T. and J. E. Treisman (2000). "Osa-containing Brahma chromatin remodeling complexes are required for the repression of wingless target genes." Genes Dev 14(24): 3140-52.

20. Corona, D. F., C. R. Ciapier, et al. (2002). "Modulation of ISWI function by site-specific histone acetylation." EMBO Rep 3(3): 242-7.

21. Dechetid, R., F. Hirano, et al. (1999). "The Bcl-3 oncoprotein acts as a bridging factor between NF-kappaB/Rel and nuclear co-regulators." Oncogene 18(22): 3316-23.

22. Delmas, V., D. G. Stokes, et al. (1993). "A mammalian DNA-binding protein that contains a chromodomain and an SNF2/SWI2-like helicase domain." Proc Natl Acad Sci U S A 90(6): 2414-8.

23. Deuring, R., L. Fanti, et al. (2000). "The ISWI chromatin-remodeling protein is required for gene expression and the maintenance of higher order chromatin structure in vivo." Mol Cell 5(2): 355-65.

24. Doyon, Y., W. Selleck, et al. (2004). "Structural and functional conservation of the NuA4 histone acetyltransferase complex from yeast to humans." Mol Cell Biol 24(5): 1884-96.

25. Dubrovskaya, V., A. C. Lavigne, et al. (1996). "Distinct domains of hTAFIIlOO are required for functional interaction with transcription factor TFIIF beta (RAP30) and incorporation into the TFIID complex." EMBQ J 15(14): 3702-12.

26. Durant, M. and B. F. Pugh (2007). "NuA4-directed chromatin transactions throughout the Saccharomyces cerevisiae genome," Mol Cell Biol 27(15): 5327-35.

27. Eberharter, A. and P. B. Becker (2004). "ATP-dependent nucleosome remodelling: factors and functions." J Cell Sci 117(Pt 17): 3707-11.

28. Ehrenhofer-Murray, A. E., D. H. Rivier, et al. (1997). "The role of Sas2, an acetyltransferase homologue of Saccharomyces cerevisiae, in silencing and ORC function." Genetics 145(4): 923-34.

29. Eisen, J. A., K. S. Sweder, et al. (1995). "Evolution of the SNF2 family of proteins: subfamilies with distinct sequences and functions." Nucleic Acids Res 23(14): 2715-23.

30. Elfring, L. K., C. Daniel, et al. (1998). "Genetic analysis of brahma: the Drosophila homolog of the yeast chromatin remodeling factor SWI2/SNF2." Genetics 148(1): 251-65.

31. Filvaroff, E. H. and R. Derynck (1996). "Induction of myogenesis in mesenchymal cells by MyoD depends on their degree of differentiation." Dev Biol 178(2): 459-71.

32. Flanagan, J. F., L. Z. Mi, et al. (2005). "Double chromodomains cooperate to recognize the methylated histone H3 tail." Nature 438(7071): 1181-5.

33. Flanagan, P. M., R. J. Kelleher, 3rd, et al. (1991). "A mediator required for activation of RNA polymerase II transcription in vitro." Nature 350(6317): 436-8.

34. Fondell, J. D., H. Ge, et al. (1996). "Ligand induction of a transcriptionally active thyroid hormone receptor coactivator complex." Proc Natl Acad Sci U S A 93(16): 8329-33.

35. Fraga, M. F.} E. Ballestar, et al. (2005). "Loss of acetylation at Lysl6 and trimethylation at Lys20 of histone H4 is a common hallmark of human cancer." Nat Genet 37(4): 391-400.

36. Frank, S. R., T. Parisi, et al. (2003). "MYC recruits the TIP60 histone acetyltransferase complex to chromatin." EMBO Rep 4(6): 575-80.

37. Georgiev, P. G. (1994). "Identification of mutations in three genes that interact with zeste in the control of white gene expression in Drosophila melanogaster." Genetics 138(3): 733-9.

38. Georgiev, P. G. and T. I. Gerasimova (1989). "Novel genes influencing the expression of the yellow locus and mdg4 (gypsy) in Drosophila melanogaster." Mol Gen Genet 220(1): 121-6.

39. Grant, P. A., L. Duggan, et al. (1997). "Yeast Gcn5 functions in two multisubunit complexes to acetylate nucleosomal histones: characterization of an Ada complex and the SAGA (Spt/Ada) complex." Genes Dev 11(13): 1640-50.

40. Grienenberger, A., B. Miotto, et al. (2002). "The MYST domain acetyltransferase Chameau functions in epigenetic mechanisms of transcriptional repression." Curr Biol 12(9): 7626.

41. Grane, T., J. Brzeski, et al. (2003). "Crystal structure and functional analysis of a nucleosome recognition module of the remodeling factor ISWI." Mol Cell 12(2): 449-60.

42. Gu, W. and R. G. Roeder (1997). "Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain." Cell 90(4): 595-606.

43. Hager, G. L., A. K. Nagaich, et al. (2004). "Dynamics of nuclear receptor movement and transcription." Biochim Biophvs Acta 1677(1-3): 46-51.

44. Han, M. and M. Grunstein (1988). "Nucleosome loss activates yeast downstream promoters in vivo." Cell 55(6): 1137-45.

45. Hartlepp, K. F., C. Fernandez-Tornero, et al. (2005). "The histone fold subunits of Drosophila CHRAC facilitate nucleosome sliding through dynamic DNA interactions." Mol Cell Biol 25(22): 9886-96.

46. Henry, K. W., A. Wyce, et al. (2003). "Transcriptional activation via sequential histone H2B ubiquitylation and deubiquitylation, mediated by SAGA-associated Ubp8." Genes Dev 17(21): 2648-63.

47. Hilfiker, A., D. Hilfiker-Kleiner, et al. (1997). "mof, a putative acetyl transferase gene related to the Tip60 and MOZ human genes and to the SAS genes of yeast, is required for dosage compensation in Drosophila." Embo J 16(8): 2054-60.

48. Kadonaga, J. T. (2004). "Regulation of RNA polymerase II transcription by sequence-specific DNA binding factors." Cell 116(2): 247-57.

49. Kal, A. J., T. Mahmoudi, et al. (2000). "The Drosophila brahma complex is an essential coactivator for the trithorax group protein zeste." Genes Dev 14(9): 1058-71.

50. Kamine, J., B. Elangovan, et al. (1996). "Identification of a cellular protein that specifically interacts with the essential cysteine region of the HIV-1 Tat transactivator." Virology 216(2): 357-66.

51. Kang, J. G., A. Hamiche, et al. (2002). "GAL4 directs nucleosome sliding induced by NURF." EmboJ 21(6): 1406-13.

52. Kang, Z., A. Pirskanen, et al. (2002). "Involvement of proteasome in the dynamic assembly of the androgen receptor transcription complex." J Biol Chem 277(50): 48366-71.

53. Katsumoto, T., Y. Aikawa, et al. (2006). "MOZ is essential for maintenance of hematopoietic stem cells." Genes Dev 20(10): 1321-30.

54. Kennison, J. A. and J. W. Tamkun (1988). "Dosage-dependent modifiers of polycomb and antennapedia mutations in Drosophila." Proc Natl Acad Sci U S A 85(21): 8136-40.

55. Kim, Y. J., S. Bjorklund, et al. (1994). "A multiprotein mediator of transcriptional activation and its interaction with the C-terminal repeat domain of RNA polymerase II." Cell 77(4): 599-608.

56. Kimura, A. and M. Horikoshi (1998). "Tip60 acetylates six lysines of a specific class in core histones in vitro." Genes Cells 3(12): 789-800.

57. Kimura, A., T. Umehara, et al. (2002). "Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing." Nat Genet 32(3): 370-7.

58. King-Jones, K. and C. S. Thummel (2005). "Nuclear receptors—a perspective from Drosophila." Nat Rev Genet 6(4): 311-23.

59. Ma, J. (2005). "Crossing the line between activation and repression." Trends Genet 21(1): 54-9.

60. Malik, S., H. J. Baek, et al. (2005). "Structural and functional characterization of PC2 and RNA polymerase II-associated subpopulations of metazoan Mediator." Mol Cell Biol 25(6): 2117-29.

61. Maniatis, T., E. F. Fritsch, et al. (1982). Molecular cloning : a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory.

62. Marenda, D. R., C. B. Zraly, et al. (2004). "The Drosophila Brahma (SWI/SNF) chromatin remodeling complex exhibits cell-type specific activation and repression functions." Dev Biol 267(2): 279-93.

63. Marks, P. A., T. Miller, et al. (2003). "Histone deacetylases." Curr Qpin Pharmacol 3(4): 344-51.

64. Marr, M. T., 2nd, Y. Isogai, et al. (2006). "Coactivator cross-talk specifies transcriptional output." GenesDev20(11): 1458-69.

65. Maravada, P., С. Т. Baumann, et al. (2003). "Dynamic shuttling and intranuclear mobility of nuclear hormone receptors." J Biol Chem 278(14): 12425-32.

66. McNally, J. G., W. G. Muller, et al. (2000). "The glucocorticoid receptor: rapid exchange with regulatory sites in living cells." Science 287(5456): 1262-5.

67. Metivier, R., G. Penot, et al. (2003). "Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter." Cell 115(6): 751-63.

68. Metivier, R., G. Reid, et al. (2006). "Transcription in four dimensions: nuclear receptor-directed initiation of gene expression." EMBO Rep 7(2): 161-7.

69. Metzger, E., M. Wissmann, et al. (2005). "LSD1 demethylates repressive histone marks to promote androgen-receptor-dependent transcription." Nature 437(7057): 436-9.

70. Mizuguchi, G., A. Vassilev, et al. (2001). "ATP-dependent nucleosome remodeling and histone hyperacetylation synergistically facilitate transcription of chromatin." J Biol Chem 276(18): 14773-83.

71. Mohrmann, L. and C. P. Verrijzer (2005). "Composition and functional specificity of SW12/SNF2 class chromatin remodeling complexes." Biochim Biophvs Acta 1681(2-3): 59-73.

72. Morse, R. H. (2007). "Transcription factor access to promoter elements." J Cell Biochem 102(3): 560-70.

73. Moshkin, Y. M., J. A. Armstrong, et al. (2002). "Histone chaperone ASF1 cooperates with the Brahma chromatin-remodelling machinery." Genes Dev 16(20): 2621-6.

74. Murati, A., J. Adelaide, et al. (2004). "Variant MYST4-CBP gene fusion in a t(10;16) acute myeloid leukaemia." Br J Haematol 125(5): 601-4.

75. Nairn, J., S. Smith, et al. (1995). "Cloning and sequencing of a gene encoding pyruvate kinase from Schizosaccharomyces pombe; implications for quaternary structure and regulation of the enzyme." FEMS Microbiol Lett 134(2-3): 221-6.

76. Narlikar, G. J., H. Y. Fan, et al. (2002). "Cooperation between complexes that regulate chromatin structure and transcription." Cell 108(4): 475-87.

77. Nedialkov, Y. A. and S. J. Triezenberg (2004). "Quantitative assessment of in vitro interactions implicates TATA-binding protein as a target of the VP16C transcriptional activation region." Arch Biochem Biophvs 425(1): 77-86.

78. Neigeborn, L. and M. Carlson (1984). "Genes affecting the regulation of SUC2 gene expression by glucose repression in Saccharomyces cerevisiae." Genetics 108(4): 845-58.

79. Ogiwara, H., A. Ui, et al. (2007). "Actin-related protein Arp4 functions in kinetochore assembly." Nucleic Acids Res 35(9): 3109-17.

80. Ornaghi, P., P. Ballario, et al. (1999). "The bromodomain of Gcn5p interacts in vitro with specific residues in the N terminus of liistone H4." J Mol Biol 287(1): 1-7.

81. Owen, D. J., P. Ornaghi, et al. (2000). "The structural basis for the recognition of acetylated histone H4 by the bromodomain of histone acetyltransferase gcn5p." Embo J 19(22): 6141-9. ,

82. Park, K. J., V. Krishnan, et al. (2005). "Formation of an IKKalpha-dependent transcription complex is required for estrogen receptor-mediated gene activation." Mol Cell 18(1): 7182.

83. Patel, J. H., Y. Du, et al. (2004). "The c-MYC oncoprotein is a substrate of the acetyltransferases hGCN5/PCAF and TIP60." Mol Cell Biol 24(24): 10826-34.

84. Peterson, C. L. (2002). "Chromatin remodeling: nucleosomes bulging at the seams." Curr Biol 12(7): R245-7.

85. Peterson, C. L. and I. Herskowitz (1992). "Characterization of the yeast SWI1, SWI2, and SWI3 genes, which encode a global activator of transcription." Cell 68(3): 573-83.

86. Pray-Grant, M. G., J. A. Daniel, et al. (2005). "Chdl chromodomain links histone H3 methylation with SAGA- and SLIK-dependent acetylation." Nature 433(7024): 434-8.

87. Pray-Grant, M. G., D. Schieltz, et al. (2002). "The novel SLIK histone aeetyltransferase complex functions in the yeast retrograde response pathway." Mol Cell Biol 22(24): 8774-86.

88. Rayasam, G. V., C. Elbi, et al. (2005). "Ligand-specific dynamics of the progesterone receptor in living cells and during chromatin remodeling in vitro." Mol Cell Biol 25(6): 2406-18.

89. Reid, G., M. R. Hubner, et al. (2003). "Cyclic, proteasome-mediated turnover of unliganded and liganded ERalpha on responsive promoters is an integral feature of estrogen signaling." Mol Cell 11(3): 695-707.

90. Reid, J. L., V. R. Iyer, et al. (2000). "Coordinate regulation of yeast ribosomal protein genes is associated with targeted recruitment of Esal histone acetylase." Mol Cell 6(6): 1297-307.

91. Reifsnyder, C., J. Lowell, et al. (1996). "Yeast SAS silencing genes and human genes associated with AML and HIY-1 Tat interactions are homologous with acetyltransferases." Nat Genet 14(1): 42-9.

92. Rekdal, C., E. Sjottem, et al. (2000). "The nuclear factor SPBP contains different functional domains and stimulates the activity of various transcriptional activators." J Biol Chem 275(51): 40288-300.

93. Rosenfeld, M. G., V. V. Lunyak, et al. (2006). "Sensors and signals: a coactivator/corepressor/epigenetic code for integrating signal-dependent programs of transcriptional response." Genes Dev 20(11): 1405-28.

94. Sanders, S. L., J. Jennings, et al. (2002). "Proteomics of the eukaryotic transcription machinery: identification of proteins associated with components of yeast TFIID by multidimensional mass spectrometry." Mol Cell Biol 22(13): 4723-38.

95. Schwanbeck, R., H. Xiao, et al. (2004). "Spatial contacts and nucleosome step movements induced by the NURF chromatin remodeling complex." J Biol Chem 279(38): 39933-41.

96. Segraves, W. A. and D. S. Hogness (1990). "The E75 ecdysone-inducible gene responsible for the 75B early puff in Drosophila encodes two new members of the steroid receptor superfamily." Genes Dev 4(2): 204-19.

97. Shang, Y., X. Hu, et al. (2000). "Cofactor dynamics and sufficiency in estrogen receptor-regulated transcription." Cell 103(6): 843-52.

98. Shareef, M. M., C. King, et al. (2001). "Drosophila heterochromatin protein 1 (HPl)/origin recognition complex (ORC) protein is associated with HP1 and ORC and functions in heterochromatin-induced silencing." Mol Biol Cell 12(6): 1671-85.

99. Sharma, D. and J. D. Fondell (2002). "Ordered recruitment of histone acetyltransferases and the TRAP/Mediator complex to thyroid hormone-responsive promoters in vivo." Proc Natl Acad Sei U S A 99(12): 7934-9.

100. Shidlovskii, Y. V., A. N. Krasnov, et al. (2005). "A novel multidomain transcription coactivator SAYP can also repress transcription in heterochromatin." EMBO J 24(1): 97-107.

101. Shogren-Knaak, M., H. Ishii, et al. (2006). "Histone H4-K16 acetylation controls chromatin structure and protein interactions." Science 311(5762): 844-7.

102. Smith, E. R., A. Eisen, et al. (1998). "ESA1 is a histone acetyltransferase that is essential for growth in yeast." Proc Natl Acad Sei U S A 95(7): 3561-5.

103. Soshnikova, N. V., N. E. Vorobyeva, et al. (2008). "Interaction of coactivators with promoter." Dokl Biochem Biophvs 423: 346-8.

104. Spiegelman, B. M. and R. Heinrich (2004). "Biological control through regulated transcriptional coactivators." CeU 119(2): 157-67.

105. Srinivasan, S., J. A. Armstrong, et al. (2005). "The Drosophila trithorax group protein Kismet facilitates an early step in transcriptional elongation by RNA Polymerase II." Development 132(7): 1623-35.

106. Steller, H. and V. Pirrotta (1985). "Expression of the Drosophila white gene under the control of the hsp70 heat shock promoter." EMBO J 4(13B): 3765-3772.

107. Stern, M., R. Jensen, et al. (1984). "Five SWI genes are required for expression of the HO gene in yeast." J Mol Biol 178(4): 853-68.

108. Strohner, R., M. Wachsmuth, et al. (2005). "A 'loop recapture' mechanism for ACF-dependent nucleosome remodeling." Nat Struct Mol Biol 12(8): 683-90.

109. Suka, N., K. Luo, et al. (2002). "Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine 16 and spreading of heterochromatin." Nat Genet 32(3): 378-83.

110. Taipale, M., S. Rea, et al. (2005). "hMOF histone acetyltransferase is required for histone H4 lysine 16 acetylation in mammalian cells." Mol Cell Biol 25(15): 6798-810.,

111. Tamkun, J. W., R. Deuring, et al. (1992). "brahma: a regulator of Drosophila homeotic genes structurally related to the yeast transcriptional activator SNF2/SWI2." Cell 68(3): 561-72.

112. Therrien, M., D. K. Morrison, et al. (2000). "A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila." Genetics 156(3): 1231-42.

113. Thomas, T., L. M. Corcoran, et al. (2006). "Monocytic leukemia zinc finger protein is essential for the development of long-term reconstituting hematopoietic stem cells." Genes Dev 20(9): 1175-86.

114. Thomas, T., A. K. Voss, et al. (2000). "Querkopf, a MYST family histone acetyltransferase, is required for normal cerebral cortex development." Development 127(12): 2537-48.

115. Thompson, C. M., A. J. Koleske, et al. (1993). "A multisubunit complex associated with the RNA polymerase IICTD and TATA-binding protein in yeast." CeU 73(7): 1361-75.

116. Torok, M. S. and P. A. Grant (2004). "Histone acetyltransferase proteins contribute to transcriptional processes at multiple levels." Adv Protein Chem 67: 181-99.

117. Turner, B. M. (2000). "Histone acetylation and an epigenetic code." Bioessays 22(9): 836-45.

118. Vaisanen, S., T. W. Dunlop, et al. (2005). "Spatio-temporal activation of chromatin on the human CYP24 gene promoter in the presence of 1 alpha,25-Dihydroxyvitamin D3." J Mol Biol 350(1): 65-77.

119. Verreault, A., P. D. Kaufman, et al. (1998). "Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hatl acetyltransferase." Curr Biol 8(2): 96-108.

120. Vogelauer, M., L. Rubbi, et al. (2002). "Histone acetylation regulates the time of replication origin firing." Mol Cell 10(5): 1223-33.

121. Volpe, T. A., C. Kidner, et al. (2002). "Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi." Science 297(5588): 1833-7.

122. Wade, P. A., D. Pruss, et al. (1997). "Histone acetylation: chromatin in action." Trends Biochem Sci 22(4): 128-32.

123. Wallberg, A. E., S. Yamamura, et al. (2003). "Coordination of p300-mediated chromatin remodeling and TRAP/mediator function through coactivator PGC-1 alpha." Mol Cell 12(5): 1137-49.

124. Wright, K. J., M. T. Marr, 2nd, et al. (2006). "TAF4 nucleates a core subcomplex of TFIID and mediates activated transcription from a TATA-less promoter." Proc Natl Acad Sci U S A 103(33): 12347-52.

125. Xiao, H., R. Sandaltzopoulos, et al. (2001). "Dual functions of largest NURF subunit NURF301 in nucleosome sliding and transcription factor interactions." Mol Cell 8(3): 531-43.

126. Yang, X. J. and E. Seto (2003). "Collaborative spirit of histone deacetylases in regulating chromatin structure and gene expression." Curr Opin Genet Dev 13(2): 143-53.

127. Yudkovsky, N., J. A. Ranish, et al. (2000). "A transcription reinitiation intermediate that is stabilized by activator." Nature 408(6809): 225-9.

128. Zhang, Y., R Iratni, et al. (1997). "Histone deacetylases and SAP 18, a novel polypeptide, are components of a human Sin3 complex." Cell 89(3): 357-64.

129. Zhang, Y., G. LeRoy, et al. (1998). "The dermatomyositis-specific autoantigcn Mi2 is a component of a complex containing histone deacetylase and nucleosome remodeling activities." Cell 95(2): 279-89.

130. Zou, Y. and X. Bi (2008). "Positive roles of SAS2 in DNA replication and transcriptional silencing in yeast." Nucleic Acids Res 36(16): 5189-200.1. БЛАГОДАРНОСТИ

131. Искреннюю благодарность автор выражает оппонентам и рецензентам даннойработы.

132. Конечно же, хочется поблагодарить всех близких и друзей, которые так или иначе мне помогали.I