Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия транскрипционного фактора Оct3/4 в сперматогенезе мыши. Выявление эмбриональных и тестикулярных белков - потенциальных коактиваторов Оct3/4

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия транскрипционного фактора Оct3/4 в сперматогенезе мыши. Выявление эмбриональных и тестикулярных белков - потенциальных коактиваторов Оct3/4"

и..

АНВ ^37

На правах рукописи УДК 277.218

ТОМИЛИН Алексей Николаевич

Экспрессия транскрипционного фактора ОстЗ/4 в

сперматогенезе мыши.

Выявление эмбриональных и тестикулярных белков -

потенциальных коактиваторов ОСТЗ/4.

03.00.25-Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1996

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург, и Институте биохимии и прикладной биологии (IBBA) Университета г. Кап (Франция) в рамках соглашения между этими учреждениями, включающего совместное руководство настоящей диссертационной работой (программа "Co-tutelle de thèse").

Научные руководители: д.б.н., проф. В.И. Воробьев,

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург.

проф. G.-E. Seralini и проф. М.А. Drosdowsky, IBBA, подразделение 009 Национального Центра Научных Исследований (CNRS), г. Кан, Франция.

Официальные оппоненты: чл.-корр. РАМН, проф. К.П. Хансон,

Научно-; сследовательский институт онкологии им. Н.И.Петрова РАМН, Санкт-Петербург

д.б.н., проф. С.Н. Борхсениус Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Ведущее учреждение: Биолого-почвенный факультет Санкт-

Петербургского государственного университета

Защита состоится часов на заседании Диссер-

тационного совета Д.002.73.01 Института цитологии РАН но адресу: Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Реферат разослан " декабря 1996г.

Учёный секретарь Диссертационного совета д.б.н. Л.Н. Писарева

Актуальность проблемы

Экспрессия гена Oct3/4 из семейства POU-доменных транскрипционных факторов исследована на зародышах и на культивируемых эмбриокарциномных (ЭК) и эмбриональных стволовых (ЭС) клетках мыши (Okamoto et al., 1990; Rosner et al., 1990; Scholer et al., 1990; Yeom et al., 1996). Совокупность феноменологических, а также молекулярно-генетических данных позволила выдвинуть ряд предположений относительно роли Oct3/4 в поддержании полипотент-ного клеточного фенотипа, детерминировании и спецификации линии половых клеток.

В раннем эмбриогенезе мыши ген Oct3/4 транскрибируется в тотипотентных (бластомеры) и плюринотентных (ВКМ, эпибласт) клетках, но в ходе диффе-ренцировки указанных клеток происходит последовательная дезактивация гена (Рис. 1). После 9 суток развития продукты гена Oct3/4 обнаружить в каких-либо соматических клетках зародыша уже невозможно. Экспрессия Oct3/4 прослеживается только в первичных половых клетках (ППК) по ходу их миграции и заселения ими презумтивных гонад (Рис. 1). Программа дальнейшего развития половых клеток включает пролиферацию и дифференцировку гоний в направлении двух высокоспециализированных клеточных типов, ооцитов и сперматозоидов, слияние гамет и регенерацию линии половых клеток в эмбриогенезе потомства. Ооциты на стадии диктиотены характеризуются заторможенным метаболизмом и, в частности, репрессированным состоянием гена Oct3/4, однако по мере роста этих клеток наблюдается постепенное усиление синтеза мРНК Oct3/4. Таким образом, в онтогенетическом плане экспрессия Oct3/4 по линии развития женских гамет носит циклический характер (ооцит -> бластомеры -» ВКМ -* эпибласт -> ППК -> ооцит) (Рис. 1).

По неизвестным причинам практически вне рамок исследований осталась экспрессия Oct3/4 в пост-натальном периоде развития мужских гамет (сперматогенезе). В связи

Экспрессия

V............. ••-■.!—и—1|-1.......1 белка 0^3/4

:СпсрмийНВСЧКСН иНпСН СГ : (показано в

............ .....1 1'...... J настоящей

работе)

Рис. 1. Экспрессия гена Ос13/4 в онтогенезе мыши.

ВКМ - внутренняя клеточная масса бластоцисты, ТЭ -трофэктодерма, ППК - первичные половые клетки, СГ - сперматогонии, ПС - пахитенные сперматоциты, II -вторичные сперматоциты, КС - круглые сперматиды, ВС - вытянутые сперматиды.

с этим интересным представляется выяснить, имеет ли место в семенниках синтез продуктов гена ОссЗ/4, если да, то в каких именно клеточных популяциях этого органа. Это, как нам кажется, сделает более полным описание картины экспрессии ОаЗ/4 в онтогенезе, и, тем самым, позволит расширить сложившиеся представления о регуляторных функциях этого гена.

Сложные сочетания взаимодействий сравнительно небольшого числа факторов транскрипции с промоторнымиУэнхансерными последовательностями ДНК координируют экспрессию десятков тысяч эукариотических генов. Фундаментальная роль в организации точного контроля генной экспрессии принадлежит белок-белковым взаимодействиям между транскрипционными факторами, которые по способу вхождения в аппарат РНК-полимеразы II и выполнямым регуля-торным функциям делятся на три класса: базальные, сайт-специфические (в их числе ОслЗМ) и коактиваторные. Последние, не обладая каким-либо сродством к ДНК, способны оказывать регуляторный эффект посредством кооперации с белками двух других классов. Функции коактиваторов весьма разнообразны: они могут быть вирусного (Е1А, УР16) или клеточного происхождения (ШР140, РС1-4), входить во все прединициирующие комплексы с РНК-полимеразой И (ТАРб) или действовать избирательно к определенным промоторам (ОСА-В, УР16). Однако во всех случаях коактиваторы необходимы для модуляции активированной, обусловленной сайт-специфическими факторами транскрипции.

Белок Ос13/4 при попадании из среды ЭК-клеток (фенотип Ос13/4+) в эктопическое окружение, каковым являются дифференцированные клетки (ОаЗ/4~), теряет способность стимулировать транскрипцию репортерных генов, контролируемых за счет сайта связывания Ос13/4 (т. н. октамерного сайта, АТГЦа/тААТ). Такой дезактивации Ос13/4 не сопутствуют ни утрата октамер-связывающиех свойств, ни какие-либо внутрибелковые изменения. М-концевой транс-активирующий домен Ос13/4 необходим, но не достаточен для стимуляции

транскрипции в системе дифференцированных клеток. Оказалось, что потенциал указанного домена существенно возрастает в присутствии аденовирусного белка Е1А. Биохимические тесты показали способность Е1А осуществлять функциональные белок-белковые контакты с Ос13/4 и общим транскрипционным комплексом (Рис. 2). В ходе эм-

Рнс. 2. Механизм активации транскрипции посредством Oct3/4 и коактиваторов.

КоА - экзогенный белок El А (в дифференцированных клетках, Oct3/4") или гипотети- бриогенеза мыши 0ct3/4 и Е1А экс-ческии Е1А-подобныи эндогенный коактива- г тор (для клеток с фенотипом Oct3/4+); ОТК

- общий транскрипционный комплекс; pol II

- РНК- полимераза II.

прессируются реципрокно, отсюда белок El А может быть рассмотрен

в качестве коактиватора Ос13/4, но лишь с формальной точки зрения. Однако исходя из того, что эндогенный Ос13/4 активирует октамер-содержащие конструкции, постулировано, что клетки с фенотипом Ос13/4+ (Рис. 1) содержат активность, выполняющую те же функции что и Е1А в дифференцированных клетках (Ос13/4~) по отношению к экзогенному Ос!3/4, и что вероятней всего, эта активность представлена одним или несколькими коактиваторами (Рис. 2) (5сЬо1ег « а1„ 1991).

Указанное направление исследований представляет значительный интерес в плане понимания молекулярных основ работы белка 0^3/4 как транскрипционного фактора. Тем не менее, какие-либо белки со свойствами и функциями эндогенных коактиваторов ОаЗ/4 пока еще не идентифицированы. Часть диссертационной работы связана с решением этого вопроса.

Цели и задачи исследования

1) Проверить данные ИоБпег е1 а1. (1990) по экспрессии Ос13/4 мРНК в семенниках взрослой мыши. Показать, в каких клеточных популяциях семенников взрослых мышей синтезируются мРНК и белок Ос(3/4.

2) Установить, происходят ли изменения в уровне экспрессии Ос13/4 в процессе сперматогенеза, и соотносятся ли эти изменения с фазами развития спермато-генных клеток.

3) Исследовать плюрипотентиые, дифференцированные и сперматогенные клетки на предмет экспрессии в них ОаЗМ-Связывающнх Белков (ОСБ) - потенциальных коактиваторов белка Ос13/4. Установить тканеспецифичность экспрессии, спектр и молекулярные веса ОСБ. Исследовать, сохраняется ли взаимодействие ОСБ с белком Ос13/4, связанным с октамерной последовательностью ДНК.

Научная новизна полученных результатов

Подтверждены данные, касающиеся экспрессии Ос13/4 мРНК в семенниках половозрелых мышей. Работа содержит новые сведения, свидетельствующие об экспрессии белка и мРНК Ос13/4 в ограниченных популяциях сперматогенных клеток.

Выявлена корреляция между содержанием белка ОсЧЗ/4 и процессом развития половых клеток в ходе сперматогенеза. Синтез белка ОйЗ/4 заметно усиливается в поздней профазе, поддерживается на высоком уровне в ходе мейотических делений, а затем постепенно угасает в гаплоидной фазе развития сперматогенных клеток. Показано, что предмейотические, ранние мейотические и соматические клетки полового эпителия семенников содержат следовые количества белка ОйЗ/4.

Установлено, что снижение уровня белка Ос13/4 в постмейотической фазе сперматогенеза не сопровождается снижением уровня соответствующей мРНК, и что Ос13/4 мРНК, несмотря на тотальное блокирование транскрипции, присутствует в цитоплазме гаплоидных клеток вплоть до завершения цикла сперматогенеза.

Получен продуцент биологически активного рекомбинантного белка Ос13/4 (гОс13/4), использованный затем для выявления ОСБ в плюрипотентных (Р9, Ос13/4+) и сперматогенных (пахитенных сперматоцитах, ОаЗ/4+) клетках мыши. Основываясь на ряде признаков, высказано предположение, что некоторые из обнаруженных ОСБ могут являться коактиваторами белка ОсНЗ/4, существование которых было постулировано ранее.

Практическая ценность работы

Предложен простой и эффективный способ повышения иммунореактивности парафиновых срезов ткани (фиксированной параформальдегидом), позволяющий обнаруживать низкокопийные ядерные белки. Сочетание интактной морфологии ткани и сильного иммунологического сигнала позволяет применять этот метод и в диагностических целях.

Белок гОс13/4 может быть в дальнейшем использован в качестве зонда при клонировании эмбриональных и тестикулярных ОСБ из экспресснонных Я.-библиотек. Возможность обнаружить гОаЗ/4-ОСБ контакты на мембранах дает все шансы для успешного осуществления такой работы. Мутанты ЮаЗ/4 могут быть весьма полезны при изучении белок-белковых взаимодействий Ос13/4 с ОСБ и компонентами общего транскрипционного аппарата ядра.

Апробация работы

Материалы работы представлялись на 1Х-м европейском симпозиуме по молекулярной и клеточной эндокринологии тестиса (Норвегия, 1996), ХП-м Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (1996), а также неоднократно на научных семинарах Института цитологии РАН и Университета г. Кан.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, содержащего ^^/йублика-ций. Диссертация иллюстрирована УРрисунками и таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Клеточные линии. Недифференцированные клетки линии F9 (ИНЦ РАН) культивировали (5% СОг, 37°С) на обработанных желатином чашках в питательной среде DME с добавлением 10%-ной сыворотки плодов коровы. В целях получения дифференцированных клеток F9 (F9D) в культуральную среду вводили ретиноевую кислоту (RA) и дибутирил-цАМФ (Sigma) до конечных концентраций 5x10'7 М и 10"3 М, соответственно. Клетки снимали с подложки механическим способом после 48-часовой инкубации с RA и дибугирил-цАМФ.

суспензия приготовлялась из семенников половозрелых мышей (линия Swiss, возраст 90 дней, вес тела -30 г) трипсин-ДНКазным методом и подвергалась фракционированию методом элютриации (Meistrich, 1976) с использованием ротора JE-5 (Beckman). Фракции пахитенных сперматоцитов (39-53 мл/мин), продолговатых сперматид (12,5 мл/мин) и остаточных телец (10 мл/мин) были раздельно собраны при 2.000 об/мин. Две фракции (19 и 22 мл/мин) объединяли и подвергали второму раунду элютриации при 2.500 об/мин с целью получения фракции круглых сперматид (29-34,5 мл/мин). Методом ДНК проточной цитометрии проводили оценку степени гомогенности двух полученных фракций, пахитенных сперматоцитов (-80%) и круглых сперматид (-73%). Обогащение остальных фракций определенными клеточными типами оценивалось визуально и составляло -70-80%.

(п.1) или сперматогенные клетки, полученные методом элютриации (п.2), промывали в буфере PBS рН 7,1 (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCI, 4,3 мМ Na2HP04, 1,4 мМ КН2Р04), ресуспендировали в высокоионном буфере (20 мМ Hepes-KOH рН 7,8, 450 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотрейтол (ДТТ), 25% глицерин и 1 мМ фенилметилсульфонил-флуорид (PMSF)), озвучивали на льду и центрифугировали (2 мин, 12.000 g). Суперна-тант, включающий клеточные белки, хранили при -80°С. Для получения ядерных экстрактов исходные клетки промывали в PBS, инкубировали в гипотоническом буфере (10 мМ Hepes-KOH рН 7,8, 10 мМ KCI, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ PMSF, 0,6% Nonidet Р-40) и центрифугировали (30 сек, 12.000 g). Осадок ядер экстрагировали высокоионным буфером (без глицерина) при интенсивном встряхивании (15 мин, 4°С). Суспензию центрифугировали (5 мин, 12.000 g); супернатант, содержащий ядерные белки, хранили при -80°С.

4. Иммуногистохимия. Семенники половозрелой мыши (п.2) вырезали после перфузии в левую сердечную камеру охлажденным раствором 4%-го параформальдеги-да (ПФА) в буфере PBS (п.З). Семенники декапсулировали, фиксировали 1 ч (4°С) в 4%-ном ПФА, обезвоживали этанолом и заключали в парафин. Серийные срезы семенников (8 мкм) обрабатывали ксиленом, этанолом (100, 95, 80, 65 и 30%) и промывали в PBS. Срезы помещали на 5-20 мин в водный раствор 3 М мочевины (25°С) и обрабатывали 1%-ным молоком на буфере PBS (2 ч, 37°С). Препараты инкубировали в течение ночи (4°С) с поликлональными антителами против Oct3/4 (Shimazaky et al., 1993) в разведении 1:200. В контрольных опытах перед нанесением на препараты данные антитела предварительно инкубировали в течение 4-5 ч (4°С) с рекомбинантными

белками: глюгатион S-трансферазоп (GST) или rOct3/4 (п.8). После мечения первичными антителами и нескольких 1-2 минутных отмывок PBS, содержащим 0,1%-ный T\veen-20, препараты обрабатывали (1 ч, 25°С) FITC-коныогированными IgG (Sigma), промывали и заключали в смесь глицерина и поливинилового спирта. После анализа с использованием флуоресцентной оптики препараты промывали в PBS и окрашивали раствором Гимза. Клетки F9 (п.1) фиксировали на подложке культуральных чашек в (30 мим, смесью ацетон-метанол (1:1) затем обрабатывали молоком и окраши-

вали антителами так же, как препараты семенников.

5. Лигандный блотинг. Двухцепочечный олигонуклеотид ОКТ (5'-ГАТЦАГГА ЦТАДИАШДГГАТАААГГАТЦ-З') метили достраиванием укороченных З'-концов фрашешом Кленова в присутствии

(а-33Р]дАТФ. Белки из клеточных экстрактов (п.З) фракционировали в 10%-ном ПААГ в присутствии 0,1%-ro SDS, переносили на нитроцеллюлозу в буфере, содержщем 192 мМ глицин, 0,01%-ный SDS и 0,05%-ный Nonidet Р-40. Фильтры насыщали в течение ночи 5%-ным обезжиренным молоком на буфере Н (25 мМ Hepes-KOH рН 7,7, 25 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ), помещали в раствор 6 М гуашщин-HCl на буфере Н и путем нескольких 2-кратных разбавлений буфером Н понижали концентрацию гуанидина до 0,187 М. Фильтры промывали, а затем блокировали (2 ч) 5%-ным молоком на буфере для связывания (20 мМ Hepes-KOH рН 7,7, 1 мМ спермидин, 75 мМ КС1, 2,5 мМ MgCh, 1 мМ ДТТ, 9% глицерин, 85 мкг/мл поли-д(ИЦ)) и инкубировали (15 ч, 4°С) в этом же буфере с меченым олигонуклеоти-дом ОКТ (5х106 cpm/мл). После нескольких отмывок фильтры подсушивали и экспонировали против рентгеновской плёнки.

ли(А)+-содержащая РНК, выделенная из F9 и сперматогенных клеток мыши, была обратно транскрибирована с использованием (дТ)ю-20 гомополимерной затравки и ДНК-полимеразы M-MLV. Одноцепочечную ДНК подвергали ПЦР-амплификации (24 цикла) с Taq ДНК-полимеразой (параметры цикла: 94 С, 45 с; 55°С, 30 с; 72°С, 60 с) в буфере, включающем 67 мМ трис-HCl рН 8,3, 16,6 мМ сульфат аммония, 1 мМ р-меркаптоэтанол и 4,5 MgCh. Для инициации синтеза использовали праймеры, 5'-ГААЦАГТТТГЦЦААГЦТГЦТГ-3' и 5•-ЦЦГTTTAЦAГAAЦЦATAЦTЦГ-3,, комплементарные пограничным участкам POU-домена Oct3/4 кДНК (405 пи). Продукты ПЦР разделяли в 1%-ном агарозном геле, переносили на нейлоновую мембрану, затем гиб-ридизовали с флуоресцеин(Р1)-меченой кДНК Oct3/4 и визуализировали хемшноми-несцентным способом (ECL System, Amersham). ПЦР-амплифицированный (35 циклов) фрагмент длиной 405 пн из половых клеток экстрагировали из геля и секвенировали в обоих направлениях (Cycle Sequencing Kit, Pharmacia) с использованием тех же прай-меров и Taq ДНК-полимеразы. Количесто исходного материала поли(А)* РНК оценивали по результатам амплификации ~1 кпн фрагмента кДНК р-актина (праймеры 5'-АТГТАТГАЦГАТАТЦГЦТГЦ-3' и 5ЧТ1.ТГТААПТГГАЦАПТАГ-3') и последущей гибридизации с Fl-меченой гомологичной кДНК. Чтобы исключить всевозможные загрязнения препаратов, каждый эксперимент включал контрольные препараты, куда не входила РНК-матрица или обратная транскриптаза.

7. Гибридизация in situ. Hindlll-Pstl (302 пн) фрагмент кДНК гена Oct-3/4 (Okamoto et al., 1990) субклонировали в плазмиду pBluescriptKS+; корректность лиги-рования подтверждали секвенпровапием. Меченые по [а-3 3]УТФ сенс- и анти-сенс РНК были получены с использованием РНК-полимераз фагов Т7 и ТЗ в реакции

транскрипции in vitro после линеаризации рекомбинангного вектора по HindllI или ВатН\ рестрикцнонным сайтам, соответственно. Парафиновые срезы семенников мыши (7 мкм) обрабатывали и гибридизовали с сенс- или анти-сенс РНК-пробами (2,5x10s сргп/стекло) по стандартной методике (Zeller, Rogers, 1991).

8. Получение рекомбипантного меченого Oct3/4. Ncol-F.coRl (1290 пи) фрагмент кДНК гена Ос(3/4 лигировали в вектор pGEX-2TK (Pharmacia) по ВатШ и ЕсоШ сайтам в присутствии ВатШ-Ncol двухцепочечного адаптора (5'-ГАТЦЦГТ-3', 5'-ЦАТГАЦГ-3'). Корректность субклонирования подтверждали секвенирозанием ре-комбинантнон плазмиды с использованием стандартного праймера GEX5' и Т7 ДНК-полимеразы (Pharmacia). Ночную культуру клеток E.coli (JM109), трансформированных рекомбинантной плазмвдой, разводили в 10 раз свежей средой LB (10 мкг/мл ампициллина), после чего клетки растили (37°С) при интенсивной аэрации до оптической плотности 0,85 (600 им). Синтез белка GST-Oct3/4 индуцировался в течение 1 ч после введения в питательную среду изопропил-Р-тиогалактозида (ИПТГ) до 1 мМ. Последующие манипуляции проводили при 4°С по известной схеме (Kaelin et а!., 1991; Cavailles et al., 1994). GST-Oct3/4 из лизатов озвученных клеток адсорбировали на глютатион-Сефарозе, метили [у-32Р]АТФ (125 MKCi, >5000 Ci/ммоль, Amersham) при помощи каталитической субъединицы протеинкиназы A (Sigma). GST-Oct3/4 элюпро-вали раствором 20 мМ глютагиона (Sigma). Белок rOct3/4 выщеатяли путем инкубации иммобилизованного GST-Oct3/4 с тромбином (50 NIH ед. на мл Сефарозы) в течение ночи в буфере, содержащем 50 мМ тркс-HCl рН 7,5, 150 мМ NaCl, 2,5 мМ СаСЬ. Продуценты хранили не более недели при 4°С в упомянутых растворах, в которые были введены ДТТ и Nonidet Р-40 до 1 мМ и 0,05%, соответственно. Белок GST для иммунологии (п.4 и п.9) получали посредством индукции вектора pGEX-2TK без Еставки и последовательной очистки белка на глютатион-Сефарозе.

9. Иммуноблотинг. Белки разделяли в SDS-ПААГ и переносили на мембрану как описано выше (п.6). Фильтры насыщали 5%-ным обезжиренным молоком и обрабатывали в течение ночи (4°С) анти-Ос!3/4 IgG (1:1000), предварительно инкубированными с GST (4-5 ч, 4°С). В качестве вторичных использовали конъюгированные с пероксидазой антитела, что позволило применить хемнлюминисцентный метод детекции (ECL Detection Reagents, Amersham).

10. Ретардация. Ядерный экстракт из клеток F9 (п.З) или белок rOct3/4 (п.8) инкубировали (15 мин, 4°С) с меченым ОКТ в буфере для связывания (п.5) и разделяли в 4%-ном ПААГ на 0,25-кратном трис-боратном буфере. Гель высушивали и экспонировали против рентгеновской пленки в течение ночи.

11. Фарвестерн блотинг. Ядерные экстракты (-35 мкг) из клеток F9, F9D и па-хитенных сперматоцнтов (п.З) выдерживали при 45°С (10 мин) в SDS-буфере для проб. Белки фракционировали в SDS-ПААГ, переносили на нитроцеллюлозу и дена-турировали/ренатурировапи раствором хлорида гуанидина (п.5). Мембраны насыщали 5%-ным молоком и промывали в буфере, содержащем 20 мМ Hepes-KOIl рН 7,7, 75 мМ КС1, 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мМ ЭДТА, 0,05% Nonidet Р-40 и 1% молока. На заключительном этапе фильтры инкубировали (15 ч, 4°С) с 32Р-меченым белком rOct3/4 (2х105 cpm/мл) или с ним же но в присутствии немеченого олигонуклеотида ОКТ (п.5) в конечной концентрации 5 нМ. После инкубации мембраны промывали, подсушивали и экспонировали 2-4 ч (-80°С) против рентгеновской пленки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспрессия белка Oct3/4 в сперматогенезе

Семенники взрослой мыши фиксировали параформальдегидом в мягких условиях (1ч вместо обычных 4-24 ч), а затем, уже по стандартной схеме, проводили по спиртам и заключали в парафин. Клетки в препаратах, приготовленных по указанной методике, имели интактную морфологию (Рис. 5, б, г, е, з, к),

но низкую иммуно-реактивность, что показало дальнейшее окрашивание срезов антителами (Рис. 3, а). Известны несколько способов повышения ангигенности, среди них обработка 0,2 N HCl, денатурация-

ренатурация гуанидином-НС1 и др. Применительно к нашим препаратам, наилучший результат был получен при использовании мочевины (Рис. 3, б). (а) - без специальной обработки; (б) - обработка моче- Этот метод быд е

винон до нанесения первичных антител. Увеличение

150х. апробирован на парафи-

новых срезах зародышей

X.laevis, фиксированных этанолом (Hausen, Dreyer, 1982). Результаты, представленные далее (Рис. 4 и Рис. 5,,а-к), были получены на препаратах, обработанных 3 М мочевиной (5-20 мин) перед нанесением первичных антител.

Антитела, использованные в настоящей работе, выработаны на N-концевой участок Oct3/4 в составе химерного белка GST-OcÜ/4 (предоставлены д-ром X. Хамада; Shimazaki et al., 1993). У грызунов известны несколько изозимов GST, экспрессирующихся в семенниках, поэтому нельзя было априори исключить происхождение иммунологического сигнала (Рис. 3, б; Рис. 4, а) от GST-подобных белков. Специальные тесты, однако, опровергли подобную возможность: предварительная инкубация Oct3/4 антител с GST не меняет распределение или интенсивность флуоресцентного сигнала (Рис. 4, ср. в и а), тогда как инкубация с рекомбинантным белком rOct3/4 полностью подавляет флуоресценцию в половом эпителии (Рис. 4, б).

Некоторые участки интертубулярных островков, представляющих собой скопления лейдиговских, кровяных и других соматических клеток, генерируют

Рис. 3. Повышение иммунореактивности срезов семей-

Рис. 4. Гистологическое тестирование антител против Oct3/4.

Срезы семенников инкубировали либо с нативными анти-Осв/4 IgG (а), либо с анти-Oct3/4 IgG, предварительно адсорбированными с белком rOct3/4 (б) или с полипептидом GST (в). ПК - интертубулярные клетки. Увеличение 150х

сильный сигнал в жёлтом диапазоне волн (Рис. 4). Вероятней всего, данный сигнал вызван неспецифической адсорбцией FITC-конъюгатов, поскольку он наблюдается даже прн отсутствии первичных антител (данные не приведены). Прокрашивание Oct3/4 антителами клеток ЭК линии F9 (фенотип Oct3/4+) показало сильный флуоресцентный сигнал в ядрах (Рис. 5, л).

Результаты контрольных опытов по нашему мнению позволяют утверждать, что сигнал, выявляемый в половом эпителии семенников при окрашивании исходными антителами (Рис. 3, б\ Рис. 4, о; и далее Рис. 5, а-к), обусловлен белком Oct3/4.

Характер распределения позитивного сигнала в популяциях сперматогенных клеток разных семенниковых канальцев качественно и количественно варьирует (Рис. 5, а, в, д, ж, и) и, более того, однозначно соотносится со стадиями сперматогенеза (Рис. 6). Последние были определены по Russell et al. (1990) на основании анализа тех же участков срезов, окрашенных раствором Гимза (Рис. 5; б, г, е, з, к). Можно видеть (Рис. 5, а-к), что флуоресценция наиболее интенсивна в специфических популяциях сперматогенных клеток, включающих пахитен-ные сперматоциты на стадиях VIII (<), е) и IX (ж, э); делящиеся и вторичные сперматоциты на стадии XII (и, к); а также круглые сперматиды на стадии I (а, б). Более слабый сигнал обнаруживается в круглых сперматидах на стадиях VI (<?, г) и VIII (<), е), в пахитенных сперматоцитах на стадии VI (в, г) и продолговатых сперматидах на стаднн IX (ж, з). Относительно слабо метились спермато-гонии (ff, г), прелептотенные (<), с), лептотенные (ж, з), зиготенные (и, к) и ран-I ние пахитенные сперматоциты до стадии VI (а, б), равно как и соматический

компартмент полового эпителия - клетки Сертоли (а-к). Наконец, сигнала нет в сперматидах, достигших или продвинутых далее стадии XII (ы, к). В согласии с данными других авторов (5сЬо1ег « а1., 1989), белок Ос13/4 не обнаруживается в сперматозоидах, которые высвобождаются в посвет канальца между стадиями VIII и IX (д-з).

Сравнительный анализ результатов указывает на то, что в ходе развития сперматогенных клеток происходят изменения в уровне экспрессии Ос13/4 (Рис. 6). В митотической и ранней мейотической фазах сперматогенеза, по-видимому, синтезируется незначительное количество ОаЗ/4. Экспрессия белка начинает усиливаться примерно в середине профазы I мейоза (в пахитенных спермагоци-тах на стадии VI), т. е. за 5-7 сут до вступления сперматоцитов в первое мейо-тическое деление (полный цикл сперматогенеза у мышей занимает -35 сут). Содержание белка Ос13/4 возрастает по мере дальнейшего развития сперматоци-тов, достигает самой высокой отметки в поздней профазе I и сохраняется высоким в ходе мейотических делений. Спермиогенез - процесс преобразования ранних гаплоидных клеток в сперматозоиды - сопровождается постепенным снижением уровня ОаЗ/4 на начальных его этапах, а затем полным исчезновением белка между IX и XII стадиями (7-9 суг постмейотической фазы), т. е. с началом процесса кардинальной компактизации хроматина гаплоидных клеток. Полученные данные дают основание для ранее не высказывавшегося предположения об участии белка ОаЗ/4 в регуляции мейотических делений.

Примечательно, что при сопоставлении наших результатов с данными по экспрессии Ос13/4 в оогенезе (Яобпсг е1 а1., 1990) возникает некоторая аналогия. В ооцнтах на стадии заторможенной генетической активности (диктиотены) ген ОаЗ/4 супрессирован. Однако уже последующему росту ооцитов, предшествующему их вхождению в метафазу первого мейотичсского деления, сопутствует возрастание транскрипционной активности гена Ос1Ъ14. Возможно, ССТФ ОыЗ/4 выполняет единую для обоих полов функцию, необходимую для осуществления делений мейоза.

Безотносительно к типу клеток, белок ОаЗ/4 локализуется при окрашивании антителами в ядрах, кроме очевидного случая со сперматоцитами по ходу делений. Как следствие разрушения ядерной мембраны, эти клетки показывают более диффузный сигнал (Рис. 5, и, к). Субклеточная локализация белка Ос(3/4 согласуется с известной функцией ОаЗ/4 как регулятора транскрипции, работающего в ядре. При большем увеличении можно также отметить неравномерность в распределении молекул белка ОаЗ/4 в ядрах половых клеток, что также видно в ядрах ЭК-клеток (Рис. 5, л), и что было ранее показано в ядрах ЭС-клеток (Ра1пиеп й а1., 1994). Подобный характер прокрашивания клеточных ядер антителами вероятно указывает на ассоциацию белка ОйЗ/4 с какими-то ядерными структурами.

8 шж

а

Рнс. 5. Стадиосиецифическая экспрессия белка Ос!3/4 в сперматогенезе мыши.

Срезы семенников (я, в, д, ж, и) и клетки Р9 (л), меченые ннтактными анти-ОсО/4 ^О; (б, г, е, з, к) - окрашивание тех же срезов раствором Гимза. СГ - сперматогонии; ПЛ -сперматоциты в прелептотене; ЛС - сперматоциты в лептотене; ЗС - сперматоциты в зиготене; ПС - сперматоциты в пахитене; МС - сперматоциты в ходе мейотнческих делений; II - вторичные сперматоциты; КС - круглые сперматиды; ВС - вытянутые сперматиды; С - клетки Сертоли. Увеличение: а-к - ЗООх; л - 900х.

ва вс 1 ВС 1 1 ВС 1 1 1 1 ВС| ВС| СПЕРМИН — от 1 ВС- к с к) 1 1 1 - ! / ¡4 1'С вс! ВС

1 КС1, КС 1 рс[ ПС КС % КС ' 1 КС| кс{ КС

ф ПС ё ПС •* 1 N----' ) . ¿у' пс| пс| ^ ПС ПС ф, 11 ДС| II

1 сг (в) С1 (<3й сг сг} пл[ пл ЛС ш ЛС

I 11-111 IV V VI VII VIII IX X XI XII

Рис. 6. Стадии сперматогенеза мыши. Суммируются результаты иммуногистохимн-ческих опытов.

Оттенки серого цвета в полоске (под клетками) отражают уровень белка ОаЗ/4 в соответствующих популяциях сперматогенных клеток. Римскими цифрами обозначены 12 стадий сперматогенеза. СГ - сперматогонии; ПЛ - сперматоциты в прелептотене; ЛС - сперматоциты в лептотене; ЗС - сперматоциты в зиготене; ПС - сперматоциты в пахитене; ДС - сперматоциты в диплотене; II - вторичные сперматоциты; КС - круглые сперматиды; ВС - вытянутые сперматиды; ОТ - остаточное цельце.

Результаты иммуногистохимических опытов были подтверждены независимым способом, опирающимся на свойство белка Ос(3/4 ассоциировать с октамерной последовательностью в ДНК (АТГЦТААТ). Белки из экстрактов сперматогенных клеток, полученных методом элютриации, фракционировали в БОЗ-ПААГ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и денатурировали-ренатурировали при помощи гуанидина-НС1. Мембраны обрабатывали радиоактивно меченым олигонуклеотидом ОКТ, содержащим копию октамерного сайта. В инкубационной смеси присугствовала поли-д(Н-Ц) ДНК в 2000-кратном молярном избытке над меченым сайтом, что обеспечивало специфичность ДНК-белкового связывания.

В половых клетках семенников мыши экспрессируются, как и ожидалось, несколько октамер-связывающих белков (рисунок не показан). Один из них, с молекулярной массой -45 кД, присутствует в пахитенных сперматоцитах, круглых и вытянутых сперматидах. Можно с высокой долей уверенности утверждать, что этот белок представляет собой ОаЗ/4, поскольку: (1) молекулярная масса этого

белка совпадает с уже показанной для Ос13/4 величиной молекулярной массы, (2) ни один из известных факторов, способных образовывать комплексы с ок-тамерпым сайтом (т. н. Ос(-белки), не имеет сходной молекулярной массы; наконец, (3) электрофоретические подвижности 45-кД белка из половых клеток и рекомбинантного белка гОс13/4 совпадают.

Октамер-связывающий белок массой 100-110 кД, присутствующий в пахитен-ных спермзтоцитах и круглых сиерматидах, вероятно является фактором ОсИ. Продукты гена Ос11 были обнаружены практически во органах мыши, включая и семенники. В зрелых сперматозоидах был ранее показан Ос1-фактор, идентифицированный по подвижности как Ос(2. Вполне возможно, что белок (-80 кД), следовые количества которого выявляются в остаточных тельцах на лн-гандном блоте, соответствует Ос12. Остаточные цельца, как известно, являются фрагментами цитоплазмы поздних сперматид после высвобождения спермиев.

Экспрессия мРНК ОсгЗ!4 в сперматогенезе

Чтобы проверить данные 11о$псг й а1. (1990) по экспрессии мРНК ОаЗ/4 в тестикулах взрослых мышей, а также с целью выявить корреляцию между экспрессией белка и мРНК Ос13/4 в спермато1енезе, был проведен ОТ-ПЦР анализ (обратная транскрипция-ПЦР) половых клеток тсстиса. Поли(А)+- & содержащую РНК экстрагировали из клеток фракций, обогащенных в процедуре элютриацни пахнтепнымп сперматоцитами, круглыми спермати-дами, вытянутыми спсрматидами и остаточными тельцами. Выделенную РНК анализировали методом ОТ-ПЦР с использованием праймеров на Р011-домен кДНК Ос13/4 (Рис. 7, а). Число циклов Г1ЦР подбиралось с тем условием, чтобы обеспечить экспоненциальную амплификацию (данные не приведены), и тем самым, провести количественную оценку уровня мРНК ОаЗ/4 в клетках различных типов. Специфичность ОТ-ПЦР была подтверждена секвенированием ампликона (405 пн). мРНК Р-актина экспрес-сируется на всех стадиях сперматогенеза, поэтому ее использовали для

Ос(3/4

Р-а

Рис. 7. Количественный ОТ-ПЦР анализ.

(а) - детекция продуктов ОТ-ПЦР; (б) -уровень ОаЗ/4 мРНК относительно (5-актиновон мРНК. ПС - пахитенные спер-матоциты, КС - круглые сперматиды, ВС -вытянутые сперматиды, ОТ - остаточные тельца.

нормировки исходного количества поли(А)+ РНК.

Сравнительный анализ результатов ОТ-ПЦР (Рис. 7, б) показал, что (1) транскрипты Oct3/4 присутствуют во всех анализированных клеточных типах; (2) сперматогенные клетки экспрессируют по крайней мере в 4-14 раз меньше мРНК Oct3/4 чем ЭК-клетки F9 (Oct3/4+); (3) имеют место количественные изменения содержания мРНК Oct3/4 в ходе развития сперматогенных клеток от низкого в пахитенных сперматоцитах до наиболее высокого в вытянутых спер-матидах и остаточных тельцах.

Уровень экспрессии мРНК Oct3/4 в предмейотических и соматических клетках семенников мыши анализировали методом гибридизации in situ. В реакции транскрипции in vitro был получен 358-меченый РНК-зонд, комплементарный 5'-концевому участку мРНК Oct3/4. Выбор этого участка обусловлен тем, что участки вне POU-домена являются высокодивергентными в семействе POU-генов. Кроме того, компьютерное сканирование (программа BLAST) базы данных GenBank (N1H) нуклеотидной последовательностью 5'-Oct3/4 не выявило гомологии, превышающей 40%.

Срезы семенников взрослой мыши гибридизовали с указанной РНК или с ее комплементарной копией (в контрольных опытах). Результаты гибридизации in situ показали, что транскрипты Oct3/4 аккумулируются главным образом в апикальной части полового эпителия, занятой круглыми и вытянутыми сперматида-ми (рисунок не показан). Меньшее число гранул серебра локализуется ближе к базальной мембране - в участках, заселенных преимущественно митотическими сперматогониями, ранними сперматоцитами и клетками Сертоли. Сигнал в ин-тертубулярных клетках неотличим на срезах, гибридизованных с антисмысловым или смысловым РНК-зондом, что свидетельствует об отсутствии транскрипции гена Oct3/4 в этих клетках.

Результаты гибридизации in situ согласуются с выводами ОТ-ПЦР анализа, касающихся мейотических и постмейотических клеток. Полученные данные позволяют также говорить о низком, но сравнимом с таковым в пахитенных сперматоцитах, уровне экспрессии Oct3/4 гена в сперматогониях, ранних спермато-. цитах (лептотенных и зиготенных; стадии VII-XII) и соматическом компартмен-те полового эпителия - клетках Сертоли.

Сравнительный анализ данных иммуногистохимии (Рис. 6) и ОТ-ПЦР (Рис. 7) указывает на отсутствие прямой зависимости содержания белка Oct3/4 от содержания мРНК Oct3/4 в пост-мейотической фазе сперматогенеза. Ядра вытянутых сперматид характеризуются репрессированием транскрипции генома (Kierszenbaum, Tres, 1975), тем не менее, мРНК Oct3/4 присутствует на высоком уровне в цитоплазме этих клеток и даже в остаточных тельцах (Рис. 7). Оценка показывает, что Oct3/4 мРНК, наследуемая из цитоплазмы круглых сперматид, может сохраняться в вытянутых спермагидах по крайней мере в течение ~9 су-

ток (отсчитано от начала элонгации до стадии спермиации). Для сравнения, Ос13/4 мРНК исчезает в течение 2-х суток в ходе дифференцировки ЭК-клеток (Окатою е1 а1., 1990). Белок Ос13/4 невозможно обнаружить в поздних сперма-тидах (Рис. 5), поэтому неясно, какой биологический смысл несет в себе накопление в ходе спермиогенеза нетранслируемой мРНК Ос13/4. Возможно, что некоторые количества этой мРНК передаются через сперматозоид в зиготу, а затем траскрибируются на ранних этапах эмбриогенеза.

Можно предполагать, что полученные результаты в совокупности отражают наличие в половых клетках семенников специальных механизмов контроля над стабильностью и процессивностью мРНК ОаЗ/4.

Получение и биохимическое тестирование rOct3/4

Фрагмент кДНК Oct3/4, предоставленной Dr. Н. Hamada (Okamoto et al., 1990), встраивали в экспрессионный вектор pGEX-2TK таким образом, чтобы обеспечить непрерывность рамки считывания химерного белка GST-Oct3/4. Сайты расщепления тромбином и фосфорилирования протеинкиназой А расположены между полипептидами

ТК ТГА

<Д= _ix_J.

—I GST I I Oct3/4 |-

GST и rOct3/4. Терминация трансляции обеспечивалась за счет ТГА-кодона в Oct3/4 вставке (Рис. 8, а).

В присутствии индуктора ИПТГ в бактериальных клетках, трансформированных плазмидой pGEX2TK-Oct3/4, нарабатывается белок GST-Oct3/4 (-75 кД) (Рис. 8, б). Этот белок растворяли, адсорбировали на глютатион-Сефарозе, метили с использованием [у-32Р]АТФ и каталитической субъединицы протеинкина-зы А по известной схеме (Smith, Johnson, 1988; Cavailles et al., 1994), а затем элюировали свободным глютатионом (Рис. 8, б-

ВатН\ / Ncoí

1-EcoRi

- 106

• SE 3m ■: ZZL. 2SE •!* ......

i г

Mw, ■ кд

Рис. 8. Получение rOct3/4 в клетках E.coli.

(а) - схема плазмиды pGEX2TK-Oct3/4; сайты:

3, в-1). Для получения меченого tac - начала транскрипции, Т - для тромбина, К

о - - для протеинкиназы А. (б) - SDS-ПААГ; 1 -

rOct3/4, молекулярный вес кото- £ шщукц1ш_ 2 _ ¿¿^ после ицд^ции

poro составляет -45 кД (Рис. 8, ИПТГ, 3 - элюция глютатионом, 4 - выщепле-

6-4, в-2), этап элюции заменяли НИЕ тромбином, 5 - элюция SDS. (в) Радиоаето-

„ „ „ „ граф дорожек 3-5 геля из (б). (О) - GST-Oct3/4,

обработкой иммобилизованного (») _ rOct3/4.

»

— GST-Oct3/4 тромбином (Smith,

Johnson, 1988). Сефарозу после обработки тромбином кипятили в присутствии SDS, а элюат анализировали в SDS-ПААГ. Помимо немеченого полипептида GST (-30 кД) в SDS-содержащий раствор выходит значительное количество rOct3/4 (Рис. 8, 6-5, в-3). Мы полагаем, что данный эф-12 фект связан с преципитацией

Рис. 9. Тестирование продуцента rOct3/4. r0ct3/4 в ходе ночной инкубации

. . „ , , _ .... .- с тромбином. Несколько поли-

са) Весгерн блот: 1 - rOct3/4 (45 кД), 2 - ядер- г

ный экстракт из клеток F9 (Oct3/4+). (б) Проце- пептидов с молекулярными мас-дура ретардации; анализировались те же пробы, сами от 28 до 40 кД (Рис. 8, б-З, что и в (а). (•) - rOct3/4, (*) - nOct3/4, (<=) -

свободный OKT. ü-]) веР°ятн0 являются протеоли-

тическими фрагментами GST-Oct3/4 или продуктами преждевременной терминации трансляции.

Природа rOct3/4 как рекомбинантиого белка Oct3/4 была подтверждена на иммуноблоте с использованием Oct3/4 антител, предварительно адсорбированных с полипептидом GST. Как видно на Рис. 9 (а), эти антитела эффективно реагируют и с природным Oct3/4 (nOct3/4) из ядерного экстракта клеток F9, и с полученным нами rOct3/4.

Биологаческую активность белка rOct3/4 (фосфорилированного в присутствии нерадиоактивного АТФ) тестировали методом ретардации, используя в качестве субстрата меченый олигонуклеотид OKT. Чтобы создать условия специфического ДНК-белкового связывания, в икубационную смесь вводили конкурирующую поли-д(И-Ц) ДНК (см. выше). Видно, что белки rOct3/4 и nOct3/4 образуют с ОКТ специфические комплексы (Рис. 9, б). Известно, что Octl, присутствующий в верхнем ДНК-белковом ассоциате (Рис. 9, 6-2), а также Oct3/4 являются наиболее представленными в клетках F9 Oct-факторами (Okamoto et al., 1990).

Следует отметить, что взаимодействие Oct-факторов с ДНК обеспечивается целиком за счёт POU-домека. У белков Octl и Oct3/4 этот же консервативный участок отвечает и за белок-белкоЕые контакты с коактиваторами ОСА-B и Е1А, соответственно (Scholer et al., 1991 и обзор Verrijzcr, Van der Vliet, 1993). Таким образом, способность rOct3/4 образовывать специфические комплексы с ДНК позволяет ожидать проявления также и белок-связывающей активности этого белка.

Идентификация ОСБ в ядерных экстрактах

При выявлении эндогенных коактиваторов Oet3/4, мы опирались на свойство, которое должно быть присуще белкам этого класса, - способность осуществлять прямой физический контакт с белком Oct3/4 (Рис. 2). Ядерные экстракты скри-нировапи в процедуре Фарвестерн (Cavailles et al., 1994), используя в качестве зонда радиоактивно меченый (Рис. 8) биологически активный (Рис. 9, б) белок rOct3/4.

В ЭК-клетках F9 мыши идентифицированы несколько ОСБ (р200, р120, рЮО, р86, рЗб, р34) (Рис. 10, 1). Из имеющихся литературных данных следует, что эндогенная Е1А-подобная клеточная активность, представленная коактива-торами белка Oct3/4, существует в плюрипотентных ЭК-клетках (Oct3/4+), и что она должна супрессироваться (вместе с Oct3/4) при дифференцировке этих клеток (Scholer et al., 1991; Shimazaki et al., 1993). Наши результаты показывают, что обработка ретиноевой кислотой и цАМФ ЭК-клеток F9, индуцирующая дифференцировку в направлении энтодермалыюго фенотипа (клетки F9D, Ocî3/4~) приводит к исчезновению нескольких ОСБ (р200, р86, рЗб, р34) (Рис. 10, 1 н 2). На основании полученного результата и литературных источников можно предположить, что по крайней мере некоторые из этих ОСБ являются ранее постулированными эндогенными коактиваторами белка Oct3/4 (Рис. 2).

Данные по иммуношстологической локализации Qct3/4 в семенниках мыши свидетельствуют о том, что этот белок экспрессируется в мейотических и ранних гаплоидных клетках (Рис. 5 и Рис. б). В связи с этим казалось правомерным ожидать экспрессию в этих клетках коактиваторов Oct3/4. Действительно, в ядерных экстрактах из пахитенных сперматоцитов (Рис. 10, 3) и круглых сперматид (идентичные результаты, не приведены), присутствуют несколько ОСБ, часть из которых (р120, рЮО, р86, р34) уже показаны в клетках F9 (Рис. 10, 1), остальные же (р250, р54, р51, рЗ 1 ) - являются специфическими для сперматогенных клеток. Указанные ОСБ (р250, р54, р51, р31) не экспрессиру-ются в дифференцированных клетках F9D, на основании чего можно предполагать коактиваторную природу и этих белков.

Характер Oct3/4-OCB контактов существенно не меняется в присутствии оли-гонуклеотида ОКТ (Рис. 10, ср. / с 4, 3 с 5). Следовательно, ассоциированный с октамерным сайтом Oct3/4 имеет тот же потенциал для взаимодействий с ОСБ что и свободный. Аналогичные заключения были сделаны по взаимодействиям октамер-связывающих белков Octl и Oct2 с коактиватором ОСА-В из лнмфоид-ных клеток (Luo, Roeder, 1995).

Следует отметить, что ОСБпо не подпадает под критерий коактиватора Oct3/4, т. к. этот ОСБ экспрессируется-в дифференцированных клетках F9D (Рис. 10, 2). Можно даже предположить, что ОСБ 120 представляет собой общеклеточный POU-доменный фактор Octl. Во-первых, экспрессия Octl была ра-

1 2 3 4 5

Рис. 10. Выявление ОСБ методом Фарвестерн.

Анализировались ядерные экстракты из: / и 4 - клеток Р9, 2 - этих же клеток после дифференцировки (РУО), 3 и 5 - пахитенных сперматоцитов (Г1С); мембраны инкубировали: 1-3 - с радиоактивным белком ЮаЗ/4; 4-5 - с ним же, но в присутствии немеченого ОКТ, Справа указаны э/ф подвижности и молекулярные веса ОСБ (кД).

нее показана во всех тестированных на Фарвестерн блоте клетках (БсЬокг е1 а1., 1989; Окатою е1 а1., 1990). Во-вторых, ОСБ120 совпадает по подвижности с мажорным октамер-связывающим белком, если фильтры после Фарвестерн-детекции обработать радиоактивным олигонуклеотидом ОКТ (данные не приведены). Хотя взаимодействие Ос13/4 с Оси ранее не исследовалось, такая возможность кажется вполне реальной ввиду способности ОсП образовывать гете-родимеры с РОи-доменными факторами Ос12 (Кеш1ег е! а1„ 1989; РоеШ^ег ег а1., 1989) и Ра1 (Уозб е1 а1„ 1989).

Совокупность данных о клеточно-специфическом характере экспрессии эндогенных коактиваторов ОаЗ/4, равно как и сама возможность анализа прямых ОсгЗ/4-ОСБ контактов в наших опытах, позволяют думать, что по крайней мере некоторые из обнаруженных ОСБ (за исключением ОСБ по) могут являться аутентическими эндогенными коактиваторами белка ОаЗ/4 (Рис. 2).

выводы

1) Ген Oct3/4 экспрессируется в специфических популяциях половых клеток семенников, что подтверждает имеющиеся литературные данные.

2) Экспрессия белка Oct3/4 сопряжена с фазами развития сперматогенных клеток. Синтез белка Oct3/4 усиливается на стадии средней пахитены, достигает максимальной отметки на стадии профазы I, сохраняется на таком уровне в процессе делений мейоза, а затем снижается по ходу дифференцировки гаплоидных клеток. Полученные данные позволяют предположить, что белок Oct3/4 принимает участие в регуляции мейотических делений.

3) Ослаблению и полной супрессии синтеза белка Oct3/4 в постмейотической фазе сперматогенеза не сопутствуют такие же изменения в содержании мРНК Oct3/4. Блокирование транскрипции генома поздних сперматид не ведет к снижению уровня этой мРНК, что свидетельствует о существовании в сперматогенных клетках механизмов регулирования стабильности и процессивности мРНК Oct3/4, отличающихся от таковых в эмбриональных клетках.

4) В плюрипотентных эмбриональных и мейотических сперматогенных клетках экспрессируются несколько как общих для этих типов клеток, так и кле-точно-специфических белков (ОСБ), способных ассоциировать с рекомбинант-ным белком Oct3/4 in vitro. Связанный с октамерной последовательностью в ДНК белок Oct3/4 обладает тем же потенциалом для взаимодействия с ОСБ, что и свободный.

5) Ни один из обнаруженных ОСБ (кроме ОСБ^о) не присутствует в дифференцированных (под действием ретиноевой кислоты и цАМФ) клетках эмбрио-карциномы, что свидетельствует в пользу коактиваторной природы этих белков.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Томилин А.Н., Костьшева Е.И., Серапини Ж.-Э., Дроздовский М.А., Воробьёв

B.И. Иммуногистохимическое исследование экспрессии транскрипционного фактора Oct3/4 в сперматогенезе мыши// Цитология. 1996. Т. 38. N. 12. С. 1274-1279.

Томилин А.Н., Костьшева Е.И., Чихиржина Е.В., Серапини Ж.-Э., Дроздовский М.А., Воробьев В.И. Белки из эмбриональных и половых клеток мыши, взаимодействующие in vitro с Oct3/4// Доклады Академии Наук. 1997 (в печати).

Томилин А.Н., Костьшева Е.И., Воробьев В.И. Экспрессия гена Oct3/4 в сперматогенезе мыши// Тезисы ХН-го Всероссийского симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". СПб. Октябрь 1996. Цитология. 1996. Т. 39. N. 1.

C.

Томилин А.Н., Воробьев В.И. Коактиваторы белка Oct3/4 из клеток эмбриокар-циномы и сперматогенных клеток мыши// Тезисы XII-го Всероссийского симпозиума "Структура и функции клеточного ядра". СПб. Октябрь 1996. Цитология. 1996. Т. 39. N. 1. С.

Tomiline A., Vorob'ev V., Scralini G.-E., Drosdowsky, M. Oct3/4-associated proteins in the mouse embryonal carcinoma cells and pachytene spermatocytes// Mol. Biol. Rep. 1997 (в печати).

Tomiline A., Vorob'ev V., Seralini G.-E., Drosdowsky, M. Immunohistochemical studies of Oct3/4 expression in mouse testis// In: Abstracts of the 9th European Workshop on Molecular and Cellular Endocrinology of the Testis. Norway, April 1996.

Заказ 320« Тираж IOB Объем 1.25 п.л. ЦОП СИГУ.