Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация, клонирование и биохимическая характеристика нового сердечно-специфического белка Сердина-1

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Идентификация, клонирование и биохимическая характеристика нового сердечно-специфического белка Сердина-1"

На правах рукоЬис^ Адамейко Игорь Игоревич ^

ИДЕНТИФИКАЦИЯ, КЛОНИРОВАНИЕ И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО СЕРДЕЧНО-СПЕЦИФИЧНОГО БЕЛКА

СЕРДИНА-1.

03.00.04 - биохимия 03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород - 2005

Работа выполнена в ННГУ им. Н.И. Лобачевского и в Dartmouth Medical School, Dartmouth College, Hanover, NH, USA.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Веселое А.Л.

Научный руководитель:

профессор Тевосян С.Г.

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук, Тереитьев А. А.

доктор биологических наук, профессор Мухина И. В.

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии имени Энгельгардта Российской Академии Наук.

заседании диссертационного совета Д 212.166.15 при Нижегородском Государственном Университете по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Га1арина, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского.

Защита диссертации состоится 29 декабря 2005 г. в час. 2l2

мин. на

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета Корягин А. С.

мое-у

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы; Сердце - одна из первых структур, возникающих в органогенезе. Несмотря на то, что к настоящему времени известно большое количество регуляторных и структурных белков, специфично экспрессирунмцихся в развивающемся сердце, точные механизмы формирования эмбрионального сердца позвоночных остаются загадочными. Более глубокое понимание механизмов дифференцировки и органогенеза подразумевает идентификацию и анализ белков, играющих специфическую роль в эмбриональном сердечном развитии. Сложность процесса кардиогенеза отражает высокий процент врожденных дефектов у человека: 5-8 случаев из 10 ООО новорожденных. Множественные внутриклеточные взаимодействия и морфогенетические механизмы необходимы для полноценного своевременного реформирования примитивного эмбрионального сердца в зрелый четырехкамерный орган (МаЫу and Liew, 1996; Olson and Shneider, 2003). Идентификация новых сердечно-специфических белков и выяснение их функции являются необходимым подходом для углубления наших знаний о природе и механизмах эмбрионального кардиогенеза, экспрессии и регуляции определенных генов в течение этого сложного процесса (Small and Kreig, 2004).

Все вышесказанное обуславливает расширение количества транскриптомных баз данных из сердца, доступных для открытого анализа, а также развитие разнообразных in silico (компьютерных) алгоритмов, направленных на идентификацию сердечно-специфических белков.

Несмотря на постоянно увеличивающееся количество работ, посвященных вопросам клонирования новых сердечно-специфичных белков, тем или иным способом участвующих в процессах кардиогенеза, вопрос о множественных механизмах, лежащих в основе сердечного развития, остается открытым, что обуславливает высокую актульность проведенного исследования.

Цели я задачи исследования: Основной целью данной работы был поиск и идентификация новых сердечно-специфических генов современными методами анализа транскриптома, как биоинформатическими, так и экспериментальными, а также последующее изучение молекулярной роли отобранного белка Сердина-1. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать алгоритм компьютерного (от silico) скрининга доступных транскриптомных баз данных на предмет выделения сердечно-специфичных EST тагов.

2. Идентифицировать белок, обладающий уникальной экспрессией в сердце.

3. Подтвердить сердечно-специфическую экспрессию этого белка (названного впоследствии Сердин-1) с помощью In Situ гибридизации на целых мышиных эмбрионах. Проанализировать профиль экспрессии Сердина-1 на уровне мРНК.

1Р0С. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА I

. ггтай!

4. Создать специфичные антитела и исследовать локализацию белка на тканевом и внутриклеточном уровнях.

5. Клонировать и охарактеризовать ближайщего гомолога Сердина-1 из генома мыши и других видов млекопитающих.

6. Оценить схему регуляции сердечно-специфической экспрессии Сердина-1 на уровне промотора.

7. Получить представление о функции Сердина-1 с помощью идентификации взаимодействующих с ним партнеров благодаря использованию метода дрожжевой двухгибридной системы.

Основные положения, выносимые на защиту;

1. Разработан компьютерный алгоритм, позволяющий скринировать транскриптомные библиотеки для идентификации новых тканеспецифичных белков.

2. Сердин-1 является новым сердечно-специфичным белком, экспрессия которого характерна исключительно для кардиомиоцитов начиная со стадии образования примитивной сердечной трубки.

3. Сердин-1 имеет в своем составе несколько LRR-доменов, сигнал ядерной локализации и является эволюционно консервативным белком, характерным для сердца позвоночных начиная с уровня рыбы и заканчивая человеком.

4. Ближайший гомолог Сердина-1 Сердин-R демонстрирует гораздо более широкую локализацию на организменном уровне - экспрессия данного белка наблюдается в целом ряде тканей и органов, включая легкие, селезенку, мозг, сердце и скелетную мускулатуру.

5. В эмбриональных стволовых клетках, клеточных линиях Р19 и HL-1 экспрессия мРНК Сердина-1 начинает наблюдаться одновременно со стартом дифференцировки этих клеток по пути кардиомиоцитов, при этом белок проявляет в основном ядерную локализацию. С помощью экспериментов по иммунофлуоресцентному окрашиванию культуры эмбриональных мышиных кардиомиоцитов и криосрезов взрослого сердца были получены данные о локализации Сердина-1 в N2A области титана I-диска в составе саркомера.

6. 5'-Область длиной 7.5 тысяч пар нуклеотидов перед старт-кодоном Сердина-1 достаточна для полноценой стимуляции и поддержания сердечно-специфичной экспрессии трансгена. Данный регион содержит небольшой 80-ти нуклеотидный участок, содержащий сайты узнавания сердечно-специфических транскрипционных фаторов GATA, MEF-2 и SRF, отстоящий от начала трансляции Сердина-1 на 3 тысячи пар нуклеотидов. Сердечно-специфическая регуляция работы промотора Сердина-1 является консервативной между мышью и человеком на уровне генома.

Научная новизна работы: Впервые проведен компьютерный анализ мышиного транскриптома с использованием предложенного в данной работе оригинального алгоритма для выявления сердечно-специфичных EST-тагов. Идентифицирован, клонирован и охарактеризован новый сердечно-специфичный белок Сердин-1, клонирован его ближайший гомолог Сердин-R.

*»» >

Внесены поправки в геномный сиквенс Danio reno в месте, соответствующем 5'- фрагменту кодирующей области гена Сердина-1.

Впервые получены поликлональные кроличьи антитела против Сердина-1, подтверждена их высокая специфичность. Продемонстрирована ранняя эмбриональная экспрессия Сердина-1, специфичная для кардиомиоцитов. Показана корреляция между созреванием недифференцированных клеток по кардиомиоцитному пути с началом экспрессии Сердина-1 и других молекулярных кардиальных маркеров. Проведенное исследование выявило способность Сердина-1 к внутриклеточному транспорту из цитоплазмы в ядро, при этом впервые была установлена его локализация в зрелых кардиомиоцитах в составе №А-региона титина I-диска саркомера.

В экспериментах на трансгенных мышах показано, что область длиной 7.5 тысяч пар нуклеотидов перед первым ATG кодоном Сердина-1 достаточна для полного восстановления сердечно-специфичной экспрессии lacZ-репортера. Компьютерный анализ позволил идентифицировать 80-ти нуклеотидную область гомологии между человеческим и мышиным геномом, отстоящую от начала трансляции Сердина-1 на 3 тысячи пар нуклеотидов и содержащую сайты узнавания сердечно-специфических транскрипционных фаторов GATA, MEF-2 и SRF. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что Сердин-1 глубоко интегрирован в пути регуляции, контролирующие развитие сердца позвоночных на протяжении эмбрионального развития. Таким образом, в дополнение к особенностям экспрессии белка, установлено, что сердечно-специфическая регуляция работы промотора Сердина-1 является консервативной между мышью и человеком на уровне генома.

Практическая значимость работы; Создан новый биоинформатический алгоритм для скрининга баз данных с целью поиска тканеспецифично экспрессирующихся белков, способный применяться на любом объекте, для которого существуют доступные транскриптомные библиотеки. Данный подход был успешно опробирован на библиотеке из эмбрионального мышиного сердца, в результате чего впервые был идентифицирован и клонирован новый сердечно-специфичный LRR-содержащий белок, получивший название Сердин-1. Идентифицирован минимальный промотор гена Сердина-1, подтвердивший теорию о специфичной организации сердечного проксимального регуляторного элемента и способный использоваться для создания трансгенов с ранней (начиная со стадии 7.5 DPC), исключительно сердечной экспрессией.

Апробация работы: Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Кейстоун Симпозиуме «Сердечное развитие и врожденные сердечные заболевания» (Keystone Symposia, Cardiac Development and Congenital Heart Disease), USA, 2004 и Симпозиуме Биологов Развития «Developmental Biology Symposia», USA, 2005.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 139 страницах

и включает 19 рисунков. Список литературы содержит 210 источников, из них 205 зарубежных.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследований и постановка экспериментов. Эмбриональный сердечный мышиный транскриптом, из которого в результате компьютерного анализа был выделен Сердин-1, являлся главными объектом исследований. Эксперименты проводились на мышином (Mus musculm) сердце и крадиомиоцитах, иммортализованных клеточных линиях (NIH ЗТЗ мышиные фибробласты, НЕС293) и клеточных линиях HL-1 и Р19, способных к дифференцировке в кардиомиоциты.

/я .«У/со процедура. 16 ООО EST тагов из библиотеки 13-ти дневного эмбрионального сердца (Lib. NCB1 ID 5466) были проскринированы с помощью методов биоинформатики на предмет сердечной специфичности соотвествующей мРНК против всех доступных EST-библиотек, полученных из мыши. Для процедур выравнивания и поиска по гомологии были использованы программы с сервера NCBI, находящиеся в открытом доступе: http://www.ncbi.nih.gov/BLAST. Отобранные последовательности были использованы в последующем экспериментальном анализе.

Молекулярное клонирование Сердина-1 и Сердина-R. Тотальная РНК была изолированна из различных взрослых тканей с использованием TRlzol реагента (lnvitrogen) в соответствии с протоколом производителя. РНК из эмбриональных тканей была изолированна с помощью Quiagen RNeasy колонок. Все РНК-образцы были предварительно обработаны DNAsel (Promega), экстрагированы фенолом и преципитированы этанолом. На следующей стадии кДНК библиотеки были получены из РНК фракций эмбриональных сердец и мозга на стадии развития 13.5 DPC с помощью SuperScript First Strand Sinthesis System for RT-PCR (lnvitrogen) в соответствии со стандартным протоколом. мРНК Сердина-1 была амплифицирована из сердечной библиотеки и клонирована в ТОРО-вектор (pCR ТОРО-ТА), как описано выше с использованием специфичных праймеров: LRP1-5 (5-САС ICC С ГС! АСА GAG ITG GTG-3); LRP1-3 (5-GOT AGA GTT GTC CCT TIC AGG-"}'). Сердин-R был получен аналогичным образом из эмбриональной мозговой библиотеки с использованием следующей пары праймеров: LRP2-5 (1 -CCI GGA ТСС AGA GCT GGA AGG AAG-3 ); LRP2-3 (5-ТСА GGT GCC CAA I CC TGG AGG-3 ).

In Situ гибридизация на целых мышиных эмбрионах. Для получения dig-PHK-пробы для гибридизации была использована плазмида pCR ТОРО-Serdin. Эмбрионы изолировались из самок Swiss Webster на соответствующем сроке беременности, после чего обрабатывались и гибридизовались с полученной заранее dig-PHK-пробой в соответствии со стандартным протоколом. Предварительно эмбрионы фиксировались раствором 4% параформальдегида в течение 12 часов при температуре +4°С с последующей дсч идратацией в растворах метанола восходящих концентраций.

Непосредственно перед отбеливанием пероксидом и обработкой протеиназой К эмбрионы переводились обратно в водную фазу, после чего подвергались самом процедуре гибридизации. В дальнейшем эмбрионы дегидратировались в спиртах, заливались в парафиновые секции, после чего готовились срезы на микротоме с толщиной среза 10 микрометров.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В данной работе для идентификации новых сердечно-специфических генов был применен нестандартный биоинформатический подход, связанный в первую очередь с компьютерным анализом транскриптома. На стадии планирования эксперимента было сделано предположение, что несколько сердечно-специфических белков, играющих важную роль в сердечном морфогенезе, могут быть обнаружены по причине отсутствия в них функционального мотива, которым исследователи могли бы воспользоваться в большинстве скринов. Поэтому в данной работе приоритеты отбора клонов сконцентрировались на специфичной сердечной экспрессии и только потом уже на наличии известных функциональных доменов.

Для идентификации белков с выраженной и специфичной сердечной экспрессией была произведена процедура in silico скрининга EST-содержащих баз данных системы UniGene. В частности, для первичного отбора клонов мы проанализировали библиотеку кДНК из эмбрионального сердца NCBI dbEST Library ID.5466 (RIKEN full-length enriched 13-day embryo heart library), содержащую 8308 независимых клонов.

Технически эксперимент выглядел как объединение от 3 до 7 тагов в единый генетический текст (в зависимости от их индивидуальной длины) с последующим поиском последовательностей по гомологии среди всех находящихся в открытом доступе мышиных EST-содержащих библиотек (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/lbrowse2.cgi?TAXID=10090). Данная стадия исследования проводилась с использованием программы BLAST, размещенной в открытом доступе на сайте NCBI (http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/).

В результате такого скрининга можно получать информацию о профиле экспрессии каждого тага, встречающегося в главной библиотеке из эмбрионального сердца dbEST Library ID.5466. В ходе первой части процедуры сегрегации подвергались EST-таги, встречающиеся только в данной библиотеке и других, исключительно сердечных библиотеках. Также в этот лист было включено несколько последовательностей с преимущественно сердечной экспрессией, которые впоследствии отсеялись на последующих этапах отбора. Последовательности, демонстрирующие экспрессию не только в сердце, но и в других тканях и органах, не проходили на дальнейшие стадии эксперимента (рис. 1).

Среди полученных последовательностей отбирались только те таги, которые имели открытые рамки считывания и были представлены в геноме в составе кодирующих областей. На этом уровне отсекались уже известные белки

и некодирующие кандидаты. Так как первоначальная цель состояла в идентификации белков преимущественно с ядерной локализацией (потенциальных регуляторов транскрипции), то в ходе работы был проведен анализ на наличие сигнала ядерной локализации.

Клоны, прошедшие все вышеперечисленные процедуры, заносились в лист кандидатов для дальнейшей проверки экспрессии in vivo с помощью метода In Situ РНК гибридизации на целых мышиных эмбрионах (Thisse et al., 2004). Одним из наиболее сердечно-специфичных и хорошо экспрессирующихся клонов оказался АК084466.1 EST, соответствующие ему гомологичные 23 тага на 04/27/2003 образовали UniGene кластер с номером 37320. Все эти отсеквенированные последовательности были изолированы исключительно из сердечно-специфичных библиотек, что говорило о чрезвычайно высокой тканевой специфичности экспрессии данной мРНК.

Концептуальная трансляция отсеквенированной последовательности показала наличие открытой рамки считывания, кодирующей белок, состоящий из 274-х аминокислот с предсказанным молекулярным весом в 35 KDa. В составе этого белка был обнаружен сигнал ядерной локализации PRxARR и несколько лейцин-богатых повторов - LRR (Cokol et al., 2000).

Основываясь на высокой сердечной специфичности, мы назвали данный ген Сердин-1 (Serdinl). Используя полученную белковую последовательность в качестс запроса для поиска по гомологии против транслированной базы данных EST из ряда организмов (программа TBLASTN, http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/), были идентифицированы EST из человека {Homo sapiens sapiens), свиньи (Sus scrofá), крысы (Rattus norvegicus), курицы (Gallus gallus) и лягушки (Xenopus laevis), наиболее вероятно являющиеся продуктами генов-ортологов в этих видах (рис.2, А). Показательно, что все эти последовательности также были отсеквенированы исключительно из сердечно-специфичных библиотек. Также в результате скрининга баз данных EST обнаружились продукты экспрессии гена-ортолога в рыбе: в геноме фугу (Fugu ruhripes), был идентифицирован высокогомологичный ортолог, а впоследствии с помощью метода RACE получена и отсеквенирована мРНК, соответствующая Ссрдину-1 в Danio rerio (AY775182, Danio rerio Serdinl mRNA, complete cds. Adameyko,I.I., Siegal,G., Tevosian,S.G. and Yelon,D.L.).

Для выполнения эксперимента no in Situ гибридизации получена DIG-меченая РНК-проба, комплементарная мРНК Сердина-1, при этом в качестве мафицы для пробы был выбран 700 нуклеотидный фрагмент, клонированный под Т7 промотор РНК-полимеразы и полученный с помощью метода обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией. Также для оксперимета использовались мышиные эмбрионы разных возрастов, начиная от 7-го дня эмбрионального развития (стадия поздней гаструлы), когда начинается детерминация линий прекардиальных клеток. В ходе эксперимента была обнаружена исключительно сердечная экспрессия мРНК Сердина-1, которая впервые была детектирована на эмбрионах 7.5-8.0 DPC и усиливалась на всех более поздних стадиях (рис.2, А-С). Для того чтобы выявить, в каком из трех сердечных листков локализуется Сердин-1, анализу подвергались

парифинизированные срезы 10-ти дневных эмбрионов, окрашенных в ходе in situ гибридизации (рис. 3, D). Данный подход позволил сделать вывод, что экспрессия данного белка наблюдается исключительно в миокарде и отсутствует в эндо- и эпикарде. Также было заключено, что Сердин-1 специфичен для кардиомиоцитов.

Следующим этапом стало выявление профиля экспрессии Сердина-1 в тканях взрослого мышиного организма, что было осуществлено благодаря эксперименту по Нозерн-блот гибридизации. Нозерн-блот гибридизация является одним из самых первых методов, разработанных для анализа транскриптома, который до сих пор не потерял своей актуальности. Именно процесс гибридизации между одноцепочечными полинуклеотидными молекулами позволяет в определенных условиях удержать в месте локализации на мембране определенных фракций РНК комплементарные меченые молекулы и тем самым выявить первые. В данном случае была использована радиоактивная метка для повышения чувствительности системы.

В подтверждение информации, полученной из EST-баз данных, в результате Нозерн-блоттинпа была получена единственная полоса в дорожке с сердечной РНК, соответствующая длине РНК маркера в 1.35 тысяч пар нуклеотидов (рис. 3, Е). Важно, что в дорожке, соотвествующей РНК, выделенной из склетных мышц, равно как и во всех остальных местах кроме сердца, подобная полоса обнаружена не была.

RT-PCR анализ обладает наибольшей на сегодняшний день чувствительностью и позволяет детектировать даже отдельные молекулы РНК. Полученные в результате этого эксперимента данные не отличались от предыдущих (рис. 3, F). Во всех случаях Сердин-1 выявлялся исключительно в сердце и в линиях клеток, дифференцирующихся в кардиомиоциты.

Для продолжения анализа профиля экспрессии Сердина-1 на уровне белка, необходимым шагом являлось получение анти-Сердин-1 антител. Специфичность полученных антител подтвердилась благодаря ряду экспериментов, таких, как эксперимент по блокированию узнавания Сердина-1 на мембране анти-Сердин-1-антителом с помощью добавления в инкубационный раствор чистого рекомбинантного белка, выделенного на GST-сефарозе из бактериальной культуры. Добавление растворенного Сердина-1 в различных концентрациях полностью или частично блокировало связывание анти-Сердин-1 антитела с Сердином-1, сорбированным мембраной, в то время как совершенно не интерферировало со способностью анти-тропонин-1 антител связываться со своим соответствующим антигеном, что было использовано в качестве положительного контроля (рис. 4, В).

Следующей стадией исследования стало использование полученного антитела для иммунофлуоресцентного анализа срезов эмбрионального (12.5 дневного) и взрослого сердца (рис. 5, рис. 6). Для этого криосрезы были подвергнуты двойному окрашиванию. В качестве сердечного маркера на кардиомиоциты были использованы анти-Тропонин-Т антитела, в качестве

Рис. 3 (А-С) In Situ РНК-гибридизационный анализ экспрессии Сердина-1 на мышиных эмбрионах разных возрастов. (D) Окрашенный ЕЮ 5 >мбрион бы I использоваи для получения срезов с целью демонсфации экспрессии Сердина-1 в миокарде (гп), но не в эндокарде (стрелочка). (Е) Нозерн-блот анализ экспрессии Сердина-1 во взрослых тканях мыши. Источники РНК: ht -сердце; Ьг - мозг; sp - селезенка; lg - легкие; li - печень; sk - скелетная мышца; kd - почки; ts - семенники. (F) RT-PCR анализ экспрессии Сердина-1. (G-H-I) Конфокальный иммунофлуоресцентный анализ замороженных срезов взрослого крысиного миокарда, окрашенного антителами к Сердину-1 (G) и Ы2А-региону титина в I-диске саркомера (Н). (J-K-L) 7.5 тысяч пар нуклеотидов 5'-регуляторного элемента Сердина-1 достаточны для стимуляции сердечно-специфической экспрессии. (J) Латеральный вид представленного F(, трансгенного Е10.5 эмбриона и (К) трансверсивный срез другого эмбриона. Сердечно-специфическая экспрессия в F| новорожденных животных (I) показана одновременно с контролем в виде легочной ткани, где отсутствует окрашивание.

5 кО

kD

' 1 В 1

1 1 *5

* ****

ЩШ ^NP

Рис. 4. (А-С) Экспрессия Сердина-1, детектированная полученными ант-Серлин-1 поликлональными кроличьими антителами Во всех счучаях полоса ныявляется только в белковых экстрактах И1 сердца, кардиомиоци юн или трансфецированных клегок. (В) Эксперимент по блокированию анти-Сердин-1 ангитсла антитеном Позиции Сердина-1 и Troponin I на блоте, окрашенном раствором двух антител после инкубации с рекомбинантным лигандом, указаны соответственно треугольничком и стрелочкой

8ЕРЮ1Ж РЕСАМ-1 ЗЕВ011Ч1 РЕСАМ-1 ОАР1

Рис. 5. Сердин-1 (а, с, (1, £ ¡) не экспрессируется в эпикарде (е, стрелочка) так же как и в эндокарде (И, треугольнички) взрослого мышиного сердца.

в.

SERDIN1 РЕСАМ-1 SERDIN1 РЕСАМ-1 DAPI

Рис.6. Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии Сердина-1 на замороженных срезах эмбриональною (А,В) и взрослого сердца (С). (А) Сердин-I (зеленый, а), колокализуется с сердечным маркером cardiac Troponin Т (сТпТ) (красный, Ь). Линейка = 200цМ. (В) Сердин-1 (красный; а, с, d, f) не колокализуется с •>нд0|елиалы1ым маркером РЕСАМ-1 (зеленый; Ь, с, е, 0 на эмбриональных сердечных срезах.

)11дотелиального маркера использовались антитела против молекулы клеточной адгезии РЕСАМ-1. Эти эксперименты подтвердили уникальную экспрессию Сердипа-1 в кардиомиоцитах.

Так как установление внутриклеточной локализации белка часто помогает определить его молекулярную функцию, то мы предприняли жеиерименгы по выяснению внутриклеточного профиля экспрессии Сердина-1. Для этого был применен метод транзиентных трансфекций с последующим иммунофлуоресцентным окрашиванием клеток линии NIH ЗТЗ. В результате

этого эксперимента выявилась диффузная экспрессия Сердина-1 (рис. 7, А-В-С-D).

Дальнейшие эксперименты по выяснению внутриклеточной локализации были переведены в систему с эндогенной экспрессией Сердина-1, то сеть в клетки эмбриональной карциномы Р19, способные дифференцироваться в сокращающиеся кардиомиоцитоподобные клегки под влиянием 1% диметилсульфоксида в качес1ве морфогена и нейроны в присутствии ретиноевой кислоты. При этом дифференцирующиеся Р19 экспрессиируют ряд сердечно-специфических маркеров, например, GATA4, CARP, сердечный |ропонин-1 (рис. 7 E-F-G-H-I-J). Экспрессия Сердина-1 и кардиальных маркеров в процессе дифференцировки данной линии клеток была подтверждена с помощью RT-PCR.

В дифференцированных Р19 Ссрдин-1 аккумулирован преимущественным образом в ядре и совпадает с окрашиванием анти-САТА4 антителом, который является проверенным ядерным белком. В качестве цитоплазматического маркера был исиользован сердечный тропонин-1, являющийся мажорным компонентом сократительных фибрилл Чтобы распространить анализ на более гомогенную популяцию, чем Р19, была иелледована экспрессия Сердина-1 в иммортали юванной линии мышиных кардиомиоцитов HL-1 и в первичной культуре выделенных эмбриональных мышиных кардиомиоцитов. Клеточная линия HL-1 является дериватом АТ-1 мышиной атриальной опухолевой линии и может быть последовательно пассирована в культуре без потери кардиомиоцитного фенотипа (Claycomb et al., 1998; White et al., 2004). Так же как и в Р19, в клетках HL-1 Сердин-1 локализован в ядре (рис 8, К-М) Дополнительно, проведены наблюдения ядерной экспрессии Сердина-1 в первичной культуре эмбриональных кардиомиоцитов, выделенных из мышиных сердец на стадии разви1ия 12 П S дней (рис 8, N-O-P-Q-R-S). Интересно, чго во взрослом миокарде Сердин-1 жснрессируегся совершенно особым образом Как было установлено в результате экспериментов по иммунофлуоресцентному окрашиванию криосрезов взрослого сердца, Сердин-1 в зрелых кардиомиоцитах локализован в N2B-perHOHe I-линии в составе саркомера (рис.3, G-H-I). В качестве маркера Z-линии, совместно с которым был проведено коокрашивание, был использован мажорный белок саркомера альфа-актинин. Также цитоплазматический тип локализации Сердина-1 восстанавливался после длительной культивации (более 10-ти дней) первичной культуры эмбриональных мышиных кардиомиоцитов (рис. 8, А-С). Дрожжевая двухгибридная система (yeast two-hybrid system) является одним из основных способов поиска и исследования белок-белковых взаимодействий. Полноразмерный Сердин-1 был клонирован в составе соответствующею вектора как С-концевой фьюжн с активаторным доменом Gal4, после чего котрансформирован в дрожжевой штамм АН 109 с библиотекой кДНК из взрослого мышиного сердца. Результирующий титр котрансформантов (5*ЮА) оказался удовлетворительным для проведения эксперимента, в результате которого наиболее часто. встречающимся клоном,

зтз

Р19

Рис. 7. Иммунофлуоресцешный анализ экспрессии Сердина-1 в культивируемых клетках млекопитающих. (А, В, С, D) NIH ЗТЗ кле1ки были фашиснтно трансфецированы SERDIN1-экспрессионной плазмидой, после чего окрашены анти-Сердин-1 ашителом (А, В) и анти-FLAG антителом (С, D) Ядра прокрашены DAPI. (Е, F, G) Дифференцированные (сокращающиеся) клаки PI9 окрашены SERD1N1 (кролик) и GATA4 (коза) антителами с последующими вторичными куриными анти-кроличьими (зеленый флуорофор, Santa C'iu/) и ослиными анти-козлиными Alexa 555 (красный флуорофор, Alexa) SI RDINI (I ) и GATA4 (F) локализованы в ядре (G) в згих клетках (Н-)) Дифференцированные (сокращающиеся) клетки PI9 окрашены SKRDIN1 (кролик) и с I г Г (мышь) антителами. Для четкого различения цитоплазма! ического и ядерного компартментов показана группа отдельно лежащих дифференцированных клеток (H-J). Сердин-1 (Н) локализован преимущественно в ядре (J), тогда как локализация сТпТ наблюдается исключи 1ельно в цитоплазме (I).

HL-1 Embryonic cardiomyocytes

и

Рис. 8. (K-M). HL-1 кардиомиоциты окрашены и сфотографированы как описано выше для контрастирования цитоплазматической экспрессии сТпТ (К, М; красный) с ядерной локализацией Сердина-1 (L; зеленый). (N-S) В сТгТ-позитивных клетках (красный; N and Р), Сердин-l (зеленый; О и R) находится в ядре (DAPI; Р и S). Точно также как и в Р19 клетках Сердин-1 локализуется с GATA4 (Q, красный), который является ядерным транскрипционным фактором Изолированные мышиные фетальные кардиомиоциты после двух недель культивирования демонстрируют четкий полосатый (стрелочка) паттерн внутриклеточной экспрессии Сердина-1 (а, Ь). В контроле (преимунная сыворотка) никакого окрашивания, превышающего фон вторичных антител, обнаружено не было (с).

специфично взаимодействующим с Сердином-1, оказалась кДНК, кодирующая а-актинин, что вполне соответствует положению Сердина-1 в составе саркомера и подтверждается близкой локализацией этих белков.

Анализ генов-соседей Сердина-1 в геноме мыши показал, что ближайший 5'-ген находится на 20 тысяч пар нуклеотидов выше старт-сайта трансляции Сердина-1. Для выявления цис-регуляторных элементов, ответственных за сердечно-специфическую экспрессию Сердина-1, предпринят эксперимент по созданию трансгенных мышей, имеющих в своем геноме встроенный Ьасг -репортер под контролем фрагментов разной длины 5'- регуляторной области Сердина-1. Для получения векторов, содержащих 5"-регуляторные фрагменты различной длины перед репортерным геном, была изолирована исходная геномная последовательность из мышиных бактериальных искусственных хромосом (ВАСв), после чего сгенерированы несколько трансгенных конструкций, содержащих фрагменты сердечно-специфического промотора Сердина-1.

Трансгенные вектора были инжектированы в мужской пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток, после чего трансгенные Р0 эмбрионы были собраны (на стадии развития 12.5 дней) и проанализированы на предмет экспрессии бактериальной бета-галактзидазы. Фрагмент, содержащий 7.5 тысяч пар нуклеотидов непосредственно перед старт-сайтом трансляции Сердина-1, оказался достаточным, чтобы обеспечивать сердечно-специфическую экспрессию репортерного гена. В Р| новорожденных мышах экспрессия также оставалось сердечно-специфической (рис.3,

Высокая консервативность гена Сердина-1 между разными видами позвоночных логически подвела к выполнению гомологичного анализа (выравнивания) промоторной области между человеческим геномом и мышиным. В результате этого эксперимента была выявлена консервативная область (80 пар нуклеотидов), находящаяся примерно за 3 тысячи пар нуклеотидов до первого АТС-кодона Сердина-1, содержащая эволюционно консервативные сайты для таких специфичных транскрипционных регуляторов сердечного развития, как САТА4, БЯЯ и МЕР-2 (рис. 9).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Кроме сигнала ядерной локализации и нескольких ИШ-повторов, Сердии-1 не обладает какими-либо очевидными доменами или пептидными регионами с известным функциональным смыслом, способными объяснить его роль на микро (внутриклеточном) и макро (организменном) уровне. Большим количеством исследователей было предположено, что ЬЮ^-модули служат манным образом связующими звеньями, позволяющими специфично контактировать соответствующим белкам, в том числе с образованием | |а дм ол с ку л я рн ы х ком п лексов.

МОМ^Р- 1

Human 1

Hou" е 47

Hi imán 01

Unir-* Ш6

Hi lliuri lib

Moi г-'Ч 16 е.

Huma n 165

üGGjjqpЛтеННЯд^ттдттен •ЯиаНИИЯВЮ; g

и

Рис. 9. Выравнивание peí иона, консервативного между мышью и человеком, формирующею проксимальный регулятор» ый элемент в сосгаве обласш. восстанавливающей сердечно-специфическую экспрессию трансгена. Сайты связывания для транскрипционных факторов GATA (-), SRF(^) and MIT"-2 (*) соответственно подчеркнуты.

Несмотря на присутствие сигнала ядерной локализации (мотив PRxARR), Сердин-1 не локализуется в ядерном компартменте в гетерологичных клетках Напротив, окрашивание эндогенного белка анти-Сердин! поликлональным антителом демонстрирует преимущественно ядерную локализацию, например, в бьющихся клетках линии Р19, предсердных иммортализованныч кардиомиоцитах HL-1 и свежеизолированных мышиных эмбриональных кардиомиоцитах. Во взрослом крысином сердце и эмбриональных мышиных кардиомиоцитах, долго выдержанных в культуре (больше 10-ти дней), экспрессия Сердина-1 снова обнаруживается в Ы2А-регионе титина в составе I-линии, фланкирующей Z-диск. Всего восемь лет назад альфа-актинин был единственным хорошо охарактеризованным белком, входящим в состав Z-диска. Однако недавний прогресс в молекулярной биологии открыл то, что Z-линия включает в себя целый мультимолекулярный комплекс, образующий сложную структурно-функциональную сеть взаимодействующих белков (Faulkner et al. 2001). Интересно, что многочисленные компоненты системы транедукции сигнала в ядро способны локализоваться в Z и 1-линии, помогая выполнять роль биомеханического сенсора, способного отвечать на натяжения и напряжения, возникающие в системе (рис. 10).

В случае Сердина-1 причины наблюдаемой экспрессии, перемежающейся между ядром и цитоплазмой, не установлены, однако, последняя четко коррелирует с пролиферативной активностью культивируемых клеток. Степень созревания кардиомиоцитов и сердечной ткани в целом также может влиять на внутриклеточное положение Сердина-1. Известно, что растущие и созревающие фибриллы скелетной мускулатуры имеют гораздо более транскрипционно активные ядра по сравнению со зрелой тканью (Newlands et al., 1998), таким образом, вполне возможно, что подобную ситуацию мы имеем и в сердечной мышце, когда Сердин-1 транспортируется из ядра в цитопла !м\ в

r -b

Рис. 10. (Л-В) 11редполагаемое положение Сердина-1 в составе саркомера по данным фл>орссцстной микроскопии и дрожжевой двухгибридной системы. Во взрослом крысином сердце и эмбриональных мышиных кардиомиоцитах, долго выдержанных в кулмуре (больше 10-ти дней), экспрессия Сердина-1 обнаруживается в Ы2А-регионе imiuia в составе I-линии, фланкирующей Z-диск. (С) Результат поиска партнера Сердина-1 но инуч рикл сточному взаимодействию в дрожжевой двухгибридной сиисче. На данной чашке (-His, -Ade, -Tip, -Leu, +X-a-Gal) продемонстрирована проверка в>аимодействия Сердина! с а-актинином одновременно с положительным и 01рица(с.1м1ым контролями, а также контролем на автоактивацию. Клоны, демонстрирующие сильный рост и синее окрашивание, являются положительными, а, Ь. с pACT2- a-actinin + pGBKT7-Serdinl (эксперимент); е, g - pACT-GATA4 + pGHK 17-1OG2 (положительный контроль); d - pACT-Serdinl + pGBKT7-Serdinl (нронерка олшомеризации) f - pACT-GATA4 + pGBKT7-Serdinl (отрицательный кош роль на авгоактивацию Сердина!); b - pACT- a-actinin + pGBKT7-FOG2 ((нри1Ш1СЛЫ1ЫЙ контроль на автоактивацию а-актинина).

более зрелых и терминально дифференцированных клетках. При этом после экспериментов, выявляющих более тонкое положение Сердина-1 в составе I-лииии саркомера, стало известно более конкретное место его локализации - им окаюлась N2A область молекулы титина, где, как известно из данных лигсршуры, ассоциировано значительное количество белков, потенциально формирующих механический сенсор саркомера (stretch sensor),

координирующий сократительную и транскрипционную активность мышечного волокна.

Хотя ядерная локализация Сердина-1 в культивируемых эмбриональных кардиомиоцитах и иммортализованных линиях (Р19 и HL-1) может быгь результатом in vitro дифференцировки или просто особенностью однослойной культуры (Schaub et al., 1997; Armstrong et al., 2000), было предположено, что в определенных физиологических условиях in vivo, как, например, при механическом стрессе, Сердин-1 может транслоцироваться из цитоплазмы в ядро, выполняя при этом сигнальные функции, координирующие сократительную активность аппарата миофибрилл и соответствующую транскрипционную активность ядра. Таким образом, местонахождение Сердина-1 в I-линии саркомера во взрослых волокнах и ядерная локализация в эмбриональных сердечных клетках могут служить указателем на потенциальную роль Сердина-1 как сигнальной молекулы, потенциально осуществляющей перенос сигнала и транскрипционную регуляцию определенных генов в ядре. Данные, последовательно полученные в эгой работе, указывают на вероятную возможность того, что Сердин-1 является как раз тем самым мобильным звеном сложного саркомерного механо-рецепторного комплекса, основная роль которого сводится к трансдукции сигнала в ядро.

Для понимания основы сердечно-специфической экспрессии Сердина-1 в ходе данного исследования был выполнен анализ регуляторных областей с помощью создания соответствующего ряда трансгенных мышей. Семь с половиной тысяч пар нуклеотидов из 5'- области перед началом гена Сердина-1 оказались достаточны для индукции сердечно-специфической экспрессии репортерного гена, в качестве которого в данном случае был использован ген бактериальной ß-галактозидазы (LacZ reporter).

Гомологичное выравнивание этой «достаточной» области между мышиным и человеческим геномом показало наличие короткой консервативной 80-ти нуклеотидной области, лежащей примерно на 3 тысячи пар нуклеотидов выше старт-кодона Сердина-1 и содержащей ряд необходимых сайтов для сердечно-специфических транскрипционных факторов. Данный регион оказался весьма похож на сердечный проксимальный промотор ("proximal heart element"), известный своей способностью индуцировать сердечно-специфическую пан-миокардиальную экспрессию репортерных генов (Latinkic et al., 2004).

Таким образом, необходимо отметить, что сердечная специфичность и общий паттерн локализации Сердина-1 свидетельствуют о том, что данный белок глубоко интегрирован в молекулярные пути и события, контролирующие органогенез сердца и его функционирование в позвоночных животных.

выводы

1. С помощью компьютерного анализа мышиного транскриптома идентифицирован и клонирован новый сердечно-специфичный белок, получивший название Сердин-1. Клонирована мРНК Сердина-1 из Danio rerio благодаря использованию системы RACE-PCR, внесены исправления в геномный сиквенс.

2. Произведено исследование экспрессии Сердина-1 (мРНК и белка) на организменном, тканевом и внутриклеточном уровнях, включая набор ранних эмбриональных стадий. Экспериментально подтверждена специфичность экспрессии Сердина-1 для кардиомиоцитов.

3. Созданы поликлональные высокоспецифичные антитела против Сердина-1.

4. Идентифицирован и клонирован ближайший гомолог Сердина-1, получивший название Сердин-R. С помощью RT-PCR-анализа определен профиль экспрессии Сердина-R.

5. Исходя из результатов, полученных методом дрожжевой двухгибридной системы, определен потенциальный партнер по внутриклеточному взаимодействию с Сердином-1 - белок саркомера а-актинин.

6. Клонирован минимальный промотор Сердина-1, способный обеспечивать сердечно-специфичную экспрессию и включающий классический сердечный проксимальный регуляторный элемент, содержащий сайты I вячцнания для транскрипционных факторов GATA, MEF и SRF.

7. Созданы пять линий трансгенных мышей, содержащих ген р-галактозидазы под контролем клонированного промотора Сердина-1, достаточного для восстановления исключительно сердечной экспрессии LacZ трансгена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Адамейко И.И., Веселое А.П., Хьюстон-Камингс Н., Тевосиан С.Г. Клонирование и характеризация Сердина-1 - нового LRR-содержащего сердечно-специфического белка // Вестник Нижегородского Университета, серия Биология, 2004. - в печати.

2. Adameyko I., Mudry R., Houston-Cummings N., Veselov A., Gregorio C., Tevosian S. The Expression and Regulation of Mouse SERDIN1, a Highly Conserved Cardiac-specific Leucine-Rich Repeat Protein // Developmental Dynamics, 233:540-552, 2005.

3. Adameyko 1., Veselov A., Tevosian S. Regulation and function of mouse Serdin, a highly conserved cardiac-specific leucine rich reach protein // Keystone Symposia, Cardiac Development and Congenital Heart Desease. Keystone Resort, Keystone, Colorado, March 7-12, 2004.

4. Siegal G., Adameyko I., Tevosian S., Yelon D. Molecular Anatomy of the Embryonic Zebrafish Heart // Developmental Biology Symposia, August 25-19, 2005.

5. Jacobsen C., Mannisto S., Porter-Tinge S., Genova E., Parviainen H., Heikinheimo M, Adameyko I., Tevosian S., Wilson D. GATA-4: FOG Interactions Regulate Gastric Epithelial Development in the Mouse // Developmental Dynamics, 236:340347, 2005.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

EST - expressed sequence tag, экспрессированная короткая последовательность.

PCR - polymerase chain reaction, полимеразная цепная реакция.

RT-PCR - обратная транскрипция с последующей полимеразной цепной

реакцией.

SDS-PAGE - денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с

додецил-сульфатом натрия.

DPC - days post coitus, дней после совокупления.

RACE - rapid amplification of cDNA ends, быстрая амплификация концов кДНК. LRR - leucine rich repeat, лейцин-богатый повтор. DMSO - диметилсульфоксид CMV -цитомегаповирус.

FCS - fetal calf serum, эмбриональная сыворотка.

DMEM - минимальная среда для культивирования эукаритических клеток. LRP - leucine-rich protein, лейцин-богатый белок. BSA - бычий сывороточный альбумин. PBS - фосфатный буфер.

Подписано в печать 15.11.2005. Формат 60x84 I /16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1. Зак. 1583. Тир. 100.

Типография Нижегородского госуниверситета. Лиц. ПД № 18-0099 от 04.05.2001. 603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

»24677

РНБ Русский фонд

2006-4 25709

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Адамейко, Игорь Игоревич

L Введение

II.Обзор литературы

2.1. Лейцин-богатые белки, содержащие LRR-домен

2.1.1. Структура и функции LRR-белков 8 2.1.2 Разнообразие LRR-содержащих белков

2.2. Развитие сердца млекопитающих 17 2.2.1 Предшественники различных сердечных клеточных 17 типов локализованы в эпибласте

2.2.2. Паттернизация и детерминация клеток- 19 предшественниц к фенотипу, характерному для кардиомиоцитов

2.2.3. Формирование проводящей системы сердца в 25 развивающемся органе

2.2 4. Формирование системы сосудов в сердце

2.2 5. Транскрипционная регуляция развития сердца

2.2.5.1. Механизмы индукции и основные 32 молекулярные события раннего развития сердца беспозвоночных и позвоночных животных

2.2.5.2. Основные транскрипционные факторы 41 сердечного развития

2.2.5.3 Транскрипционная регуляция процессов 52 пространственного морфогенеза сердца, паттернизации и формирования дифференцированных регионов в составе сердца

III. Экспериментальная часть.

3.1. Объекты и методы исследований 54 3.1.1 Объекты исследований 54 3.1.2. Основные методы исследований

3.2. Результаты и их обсуждение

3.2.1. Идентификация Сердина-1 методами 72 компьютерного (In Silico) анализа

3.2.2. Экспериментальное подтверждение уникальной 79 экспрессии Сердина-1 в сердце на уровне мРНК

3.2.3. Анализ экспрессии Сердина-1 на уровне белка 85 3.2.4 Поиск белкового партнера, взаимодействующего с 93 Сердином

3.2.5. Идентификация геномных регуляторных областей, 99 отвечающих за специфичность экспрессии Сердина

3.2.6. Обсуждение потенциальной функции Сердина-1 в 102 контексте полученных данных

IV. Выводы 112 V Цитированная литература

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация, клонирование и биохимическая характеристика нового сердечно-специфического белка Сердина-1"

Сердце - одна из первых структур, возникающих в органогенезе (DeRuiter et al., 1992; Icardo, 1996). Несмотря на то, что к настоящему времени известно большое количество регуляторных и структурных белков, специфично экспрессирующихся в развивающемся сердце, точные механизмы формирования эмбрионального сердца позвоночных остаются загадочными. Более глубокое проникновение в суть подобных механизмов дифференцировки и органогенеза подразумевает идентификацию и анализ белков, играющих специфическую роль в эмбриональном сердечном развитии. Сложность процесса кардиогенеза отражает высокий процент врожденных дефектов у человека 5-8 случаев из 10 ООО новорожденных (Bower, Ramsey, 1994; Wren, O'Sullivan. 2001; McConnell. Elixson, 2002: Трисветова, 2003). Множественные внутриклеточные взаимодействия и морфогенетические стратегии необходимы для полноценного своевременного реформирования примитивного эмбрионального сердца в зрелый четырехкамерный орган (Mably, Liew, 1996; Olson, Shneider, 2003).

Идентификация новых сердечно-специфических белков и выяснение их функции являются необходимым подходом для углубления наших знаний о природе и механизмах эмбрионального кардиогенеза, экспрессии и регуляции определенных генов в течение этого сложного процесса (Small. Kreig, 2004). Наиболее стандартным подходом для идентификации новых генов позвоночных является позиционное клонирование или изоляция по принципу интересующей исследователя гомологии с последующим анализом специфичности экспрессии и обратной генетики (Федоров, 2004). И, хотя позиционное клонирование остается актуальным до сих пор, технологии обратной генетики (генный таргетинг, трансгенные мыши) являются сложными, дорогостоящими и зарезервированы, как правило, для генов с хорошо охарактеризованными функциональными доменами. Необходимо отметить, что в качестве относительно недорогой и производительной альтернативы для поиска и идентификации новых генов несомненно выгодно использование ключевого преимущества доступных компьютерных баз данных, содержащих случайно отсеквеннированные короткие экспрессирующиеся последовательности (EST) (Marra et al., 1999).

Все вышесказанное обуславливает развитие разнообразных In Silico (компьютерных) алгоритмов, направленных на идентификацию белков, обладающих заданными свойствами, и расширению количества транскриптомных баз данных, доступных для открытого анализа.

В последние несколько лет исследования в области кардиогенеза были сфокусированы в основном на изучении роли нескольких семейств транскрипционных факторов, вовлеченных в комбинированную регуляцию развития сердца, а также белков, имеющих в своем составе определенные домены или области, охарактеризованные функционально.

Таким образом, логично предположить, что некоторые белки, не имеющие в своем составе охарактеризованных структур, остались неидентифицированными, хотя их важность для кардиогенеза может быть весьма велика. Именно поэтому разработка методов, позволяющих идентифицировать подобные белки, весьма актуальна. В конкретном случае сердца важность роли белка для процесса кардиогенеза может быть отражена через высокую пространственно-временную специфичность экспрессии, а отсутствие известных к настоящему времени доменов может приводить к характеризации принципиально новых структур, ответственных за неизвестные на сегодняшний день функции. Несмотря на постоянно увеличивающееся количество работ, посвященных вопросам клонирования новых сердечно-специфичных белков, тем или иным способом участвующих в процессах кардиогенеза. вопрос о множественных механизмах, лежащих в основе сердечного развития. остается открытым, что обуславливает высокую актуальность проведенного исследования.

Цели и задачи исследования: Основной целью данной работы был поиск и идентификация новых сердечно-специфических белков современными методами анализа транскриптома, как биоинформатическими, так и экспериментальными. а также характеризация и изучение молекулярной роли отобранного белка Сердина-1. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать алгоритм In Silico скрининга доступных баз данных на предмет идентификации тканеспецифичных EST тагов.

2. Проанализировать эмбриональные сердечные библиотеки для получения набора кандидатов с высокой степенью сердечно-специфичной экспрессии.

3. Подтвердить сердечно-специфическую экспрессию отобранных кандидатов с помощью In Situ гибридизации на целых мышиных эмбрионах Отобрать наиболее подходящего кандидата, где сильная экспрессия проявляется исключительно в сердце.

4. Проанализировать профиль экспрессии полученного кандидата (Сердина-I) на уровне мРНК и белка. Исследовать его внутриклеточную локализацию в гетерологичных и паралогичных клеточных системах.

5. Клонировать и охарактеризовать ближайшего гомолога в геноме млекопитающих.

6. Оценить схему регуляции экспрессии Сердина-1 на уровне промотера.

7. Получить представление о функции Сердина-1 с помощью идентификации взаимодействующих партнеров благодаря методу дрожжевой двухгибридной системы.

Научная новизна работы: Впервые проведен In Silico анализ мышиного транскриптома с целью выявления сердечно-специфичных ESTтагов с использованием предложенного в данной работе алгоритма. Идентифицирован, клонирован и охарактеризован новый сердечно-специфичный белок Сердин-1, клонирован его ближайший гомолог Сердин-R. Внесены поправки в геномный сиквенс Danio rerio в месте, соответствующем 5 - фрагменту кодирующей области гена Сердина-1

Впервые получены поликлональные кроличьи антитела против Сердина-1, с помощью ряда экспериментов подтверждена их высокая специфичность. Продемонстрирована ранняя эмбриональная экспрессия Сердина-1, специфичная исключительно для кардиомиоцитов. Показана корреляция между созреванием недифференцированных клеток по кардиомиоцитному пути с началом синтеза Сердина-1 и других молекулярных кардиальных маркеров.

Проведенное исследование выявило способность Сердина-1 к внутриклеточному транспорту из цитоплазмы в ядро, при этом впервые была установлена его локализация в зрелых кардиомиоцитах в составе N2A-perHOHa титина 1-диска саркомера

В экспериментах на полученных трансгенных мышах было показано, что область длиной 7.5 тысяч пар нуклеотидов перед первым ATG кодоном Сердина-1 достаточна для полного восстановления сердечно-специфичной экспрессии lacZ-репортера. Компьютерный анализ позволил идентифицировать 80-ти нуклеотидную область гомологии между человеческим и мышиным геномом, отстоящую от начала трансляции Сердина-1 на 3 тысячи пар нуклеотидов и содержащую сайты узнавания сердечно-специфических транскрипционных факторов GATA, MEF-2 и SRF. Полученные данные подтверждают гипотезу о том. что Сердин-1 глубоко интегрирован в пути регуляции, контролирующие развитие сердца позвоночных на протяжении эмбрионального развития.

Таким образом, в дополнение к особенностям экспрессии белка, было показано, что сердечно-специфическая регуляция работы промотора Сердина-1 является консервативной между мышью и человеком на уровне генома. В настоящее время исследования продолжаются в направлении изучения конкретной роли Сердина-1 в процессе эмбрионального кардиогенеза.

Практическая значимость работы: Создан новый биоинформатический алгоритм для скрининга баз данных с целью поиска тканеспецифично экспрессирующихся белков, способный применяться на любом объекте, для которого существуют доступные транскриптомные библиотеки. Данный подход был успешно апробирован на эмбриональной сердечной библиотеке, в результате чего впервые был идентифицирован и отклонирован новый сердечно-специфичный ЫЩ-содержащий белок, получивший название Сердин-1. Впервые был получен минимальный промотер гена Сердина-1, подтвердивший теорию о специфичной организации сердечного проксимального регуляторного элемента и способный использоваться для создания трансгенов с ранней (начиная со стадии 7.5 ОРС), исключительно сердечной экспрессией.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы И приложения. Работа изложена на 135 страницах и включает 19 рисунков и схем. Список литературы содержит 210 источников, из них 205 зарубежных.