Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ген ключевого белка деления FtsZ микоплазмы Acholeplasma laidlawii

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кукекова, Анна Валерьевна, Санкт-Петербург

/ ч.

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи УДК.577.218:57 9.8 87.121

КУКЕКОВА Анна Валерьевна

Ген ключевого белка деления FtsZ микоплазмы Acholeplasma laldlawll: клонирование, экспрессия в клетках E.coli и эволюционный консерватизм

03.00.25 - Клеточная биология

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1999

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

IPTG - изопропилтио-р-Б-галактозид

SSC - стандартный цитратно-солевой буффер

SDS - додецилсульфат натрия

PAAG - полиакриламидный гель

GST - глютатион S-трансфераза

DHFR - дегидрофалатредуктаза

BSA - бычий сывороточный альбумин

orf - участок ДНК с открытой рамкой считывания

ORF - продукт, кодируемый ДНК с открытой рамкой считывания

SOS-ответ - система реперации Е.coli

ОГЛАВЛЕНИЕ стр.

I. ВВЕДЕНИЕ..........................................5

II. ОБЗОР ЛИТЕ РАТУРЫ................................12

1. Размножение клеток

бактерий..........................................12

2. Формирование сайта инициации сборки кольца деления...........................................

3. Белок FtsZ.....................................2 6

4. Ингибирование деления клеток бактерий..........34

5. Цитоскелет-подобные элементы й деление клеток микоплазм...................-У . ...............37

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................4 6

1. Штаммы и условия культивирования...............46

2. Плазмиды. Трансформация........................4 6

3. Амплификация и клонирование....................4 7

4. Гибридизация...................................4 7

5. Скрининг бактериальных библиотек...............4 8

6. Сиквенс........................................4 8

7 . Компьютерный анализ............................4 9

8. Получение и очистка химерного полипептида..... 4 9

9. Получение и очистка антител....................50

10 . Иммуноблотинг...................................51

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ.......................................52

1. Клонирование гена ftsZ A.laidlawii.............53

2. Получение поликлональных антител и

характеристика белков FtsZ A.laidlawii и S.citri.. 62

3. Экспрессия белка FtsZ A.laidlawii в клетках

Е. coli............................................65

V. ОБСУЖДЕНИЕ.......................................69

1. Клонирование и анализ гена и белка FtsZ микоплазмы А. 1а1с11ам1±..............................69

2. Сравнение последовательностей белка может использоваться для филогенетического анализа прокариот.................................80

VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................84

VII. СПИСОК ЛИТЕ РАТУРЫ..............................85

I. ВВЕДЕНИЕ

Представители класса Mollicutes - мельчайшие прокариотические организмы, способные к самостоятельному воспроизведению. Отсутствие клеточной стенки, минимальный размер генома и ограниченный метаболизм являются основными характеристиками, отличающими представителей класса от других групп прокариот. Всех представителей Mollicutes называют микоплазмами, несмотря на то, что Mycoplasma является только одним из родов класса. К Mollicutes относятся шесть родов: Spiroplasma, Ureaplasma, Anaeroplasma, Asteroplasma и Acholeplasma и собственно Mycoplasma (Maniloff, 1992). Большинство микоплазм узкоспециализированные паразиты, живущие в организмах практически всех животных и растений (Lee, Davis, 1992; Simecka et al. 1992; Krause, Taylor-Robinson, 1992).

Роду Acholeplasma принадлежит 10 видов, широко распространенных в природе. Образцы Acholeplasma laidlawii выделены из почвы, сточных вод, тканей растений, человека и животных (Dybvig, Voelker, 1996). Ахолеплазмы отличаются от других микоплазм рядом особенностей. Размер генома ахолеплазм (около 1600 т.п.н.) всего в два с половиной раза меньше Escherichia coli, но в то же время почти в три раза превышает геном самой мелкой микоплазмы - Mycoplasma genitalium, 580 т.п.н. (Herrmann, 1992). Содержание G+C в ДНК ахолеплазм выше, чем в геномах большинства видов микоплазм и составляет в среднем 32%. A.laidlawii единственная микоплазма, обладающая универсальным генетическим кодом. Все представители Mollicutes

используют измененный аминокислотный код, при этом триплет TGA кодирует триптофан, а TA(A/G) - стоп-кодон (Tanaka et al., 1989; Inamine et al., 1990; Muto et al., 1992). Трансляционный аппарат эубактерий позволяет

экспрессировать белки A.laidlawii в клетках E.coli V/ (Jarhede et al. , 1995) . В отличи^ от других микоплазм х/ ахолеплазмы способны расти в отсутствии стйролов, они сами синтезируют насыщенные жирные кислоты (Pollack, Tourtellotte, 1967). Желтый цвет осадка клеток A.laidlawii v обусловлен присутствием в их мембране каратиноидов (McElhaney, 1992). Ахолеплазмы используют, как минимум, две системы репарации ДНК бактерий - фотореактивацию и темновую репарацию (Das et al. , 1972). Непосредственное патогенное действие ахолеплазм на организм человека не обнаружено, однако, in vitro показано, что диглюкозилдиацилглицерол, выделенный из мембраны

A.laidlawii, способствует репликации ВИЧ (Arai et al., 1998) .

Геномы двух видов микоплазм M.genitalium и Mycoplasma pneumoniae секвенированы полностью. Почти полностью определена нуклеотидная последовательность ДНК Ureaplasma urealiticum и частично Mycoplasma mycoides, Spiroplasma citry (Herrmann, 1992; Fräser et al., 1995; Himmelreich et al., 1997; Glass et al., 1998; Westberg et al., 1998). Анализ секвенированных последовательностей и определение продуктов открытых рамок считывания (orf) позволили

получить множество новых сведений о биологии и эволюционных отношениях микоплазм. Сравнение прочитанных геномов разных микоплазм подтвердило их высокую

вариабельность. В составе минимального генома М. genitalium идентифицировано 4 70 генов, тогда как у М.pneumoniae -677. Основные различия генного состава найдены между системами рестрикции, модификации и энергетического метаболизма. В ДНК М.pneumoniae обнаружено 90 orf, отсутствующих в геноме М. genitalium.

Поиск orf, кодирующих белки клеточного деления, выявил в ДНК микоплазм только три гена деления при том, что аппарат деления E.coli и других эубактерий включает не менее 15 белков (Lutkenhaus, Addinall 1997).

О механизме действия генов деления ftsH, ftsY, идентифицированных у микоплазм и других эубактерий, в процессе клеточного деления практически ничего не известно. Исследования продукта гена ftsZ, обнаруженного также в клетках эубактерий, архебактерий и в пластидах растений, показали, что FtsZ является ключевым белком деления прокариот. Полимеризация молекул FtsZ в подмембранные тяжи, опоясывающие бактериальную клетку в области, где затем образуется перегородка, рассматривается как первое событие процесса клеточного деления (Begg, Donachie, 1985; Bi, Lutkenhaus, 1991). FtsZ является тубулин-подобным белком, обладающим ГТФ-связывающей и ГТФазной активностью (de Boer et al. , 1992 ) . Повышение уровня FtsZ в клетках E.coli вызывает нарушения клеточного цикла и приводит к образованию мини-клеток или полинуклеоидных тяжей (сильно удлиненных клеток), называемых в англоязычной литературе филаментами (Lutkenhaus, Addinall, 1997).

Кроме белков, непосредственно отвечающих за клеточное деление, у E.coli известны также системы, предотвращающие размножение бактерий. Белок ингибитор SulA при действии на клетку повреждающих агентов прямо взаимодействует с FtsZ, блокируя пролиферацию клеток (Huang et al., 1996). Белки MinCD, участвующие в формировании кольца деления, вероятно, конкурируют с FtsZ за один и тот же сайт связывания (Lutkenhaus, Addinall, 1997). В геномах микоплазм последовательности, кодирующие белки SOS ответа и системы Min, не обнаружены.

Идентификация ftsZ у микоплазм подтверждает эволюционный консерватизм функции этого гена в процессе деления бактериальных клеток. Микоплазмы, как мельчайшие и наиболее просто устроенные самовоспроизводящиеся организмы, лишенные клеточной стенки и даже пептидогликанового синтеза, являются хорошими объектами для исследования фундаментальных основ деления клеток прокариот.

Нуклеотидные последовательности белков,

непосредственно взаимодействующих с FtsZ в процессе формирования перегородки деления в геномах микоплазм не найдены. Как формируется кольцо деления в клетках микоплазм - неизвестно. Какие районы FtsZ являются эволюционно консервативными и необходимыми для функционирования белка? Существуют ли принципиальные различия между FtsZ микоплазм и бактерий с клеточной стенкой? Нам представляется, что для исследования важнейших этапов деления клеток бактерий и роли белка FtsZ в этом процессе одним из наиболее интересных объектов

является A.laidlawii, обладающая как характерными особенностями минимальных клеток микоплазм, так и и рядом биохимических систем эубактерий с клеточной стенкой. Характеристика белка FtsZ A.laidlawii, исследование его структурной организации и эволюционного консерватизма были основными задачами работы.

В литературном обзоре подробно охарактеризован ген и белок FtsZ эубактерий. Описан механизм сборки кольца FtsZ в процессе деления прокариотических клеток, исследованный наиболее полно на E.coli.

Для изучения белка FtsZ A.laidlawii и его эволюционного консерватизма мы клонировали ген ftsZ A.laidlawii. Ген был найден в ДНК A.laidlawii методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с вырожденными праймерами. Амплифицированный фрагмент ftsZ длиной 520 н.п. был использован в качестве зонда для гибридизации с геномной ДНК A.laidlawii. HindiII фрагмент ДНК A.laidlawii, содержащий полноразмерную копию гена, был клонирован в низкокопийном векторе pBeloBAC 11 и секвенирован.

В составе клонированного фрагмента находился ген ftsZ, а также последовательности orf 1 и orf 2, фланкирующие ген ftsZ на хромосоме A.laidlawii. С помощью программы BLAST показано сходство ORF1, нуклеотидная последовательность которой предшествует ftsZ, с тРНК гуанин трансгликозилазой, a ORF2 - с гипотетическим 4 0,1 кДа ГТФ-связывающим белком E.coli.

Амплифицированный фрагмент ftsZ A.laidlawii, содержащий в своем составе эволюционно консервативные

участки гена, был реклонирован в экспрессирующий вектор pGEX3X. В клетках E.coli, трансформированных

рекомбинантной плазмидой pGEXl7-5, при индукции экспрессировался химерный белок 4 5 кДа, состоящий из пептида глютатион S-трансферазы (GST) и консервативного участка белка FtsZ A.laidlawii. Рекомбинантный белок был использован для получения поликлональных кроличьих антител. С помощью моноспецифически очищенной

антисыворотки анализировали клеточные экстракты

A.laidlawii и микоплазм других видов.

Методом Вестерн-блотинга был выявлен белок FtsZ A.laidlawii, мигрировавший в полиакриламидном геле на уровне 4 0 кДа белка. При анализе белковых экстрактов четырех видов микоплазм, Bacillus subtilis и E.coli положительный ответ был получен только на клетках S.citri. Молекулярная масса идентифицированного белка также соответствовала 4 0 кДа.

При сравнительном анализе транслированной

последовательности ftsZ A.laidlawii и FtsZ ряда прокариот был выявлен низкий уровень идентичности белка A.laidlawii с FtsZ микоплазм M.genitalium и М.pneumoniae и значительно более высокий с FtsZ других видов эубактерий. Наибольшее сходство обнаружено между FtsZ A.laidlawii и грам-положительных кокков. Полученные результаты согласуются с теорией полифилетического происхождения микоплазм.

В составе белка FtsZ выявлен консервативный N-конец и высоко вариабельный С-концевой домен. Консервативный участок С-конца, найденный у эубактерий, обладающих клеточной стенкой, в белке А.laidlawii не обнаружен. С

помощью поликлональных антител показано, что ген ftsZ A.laidlawii, клонированный в низкокопийном векторе, успешно экспрессируется в E.coli, не оказывая негативного влияния на морфологию клеток.

При сравнении FtsZ A.laidlawii, клонированного нами, с опубликованной транслированной последовательностью фрагмента FtsZ A.laidlawii длиной 100 аминокислот (Wang, Lutkenhaus, 1996) было обнаружено три замены и одна делеция аминокислоты. Существование межштаммовых различий в последовательностях FtsZ было также показано при сравнении белков прокариот других видов (Werren et al., 1995; Ofir et al., 1998). Представленные данные свидетельствуют, что в составе белка FtsZ наряду с консервативными участками присутствуют также районы высокой вариабельности. Сравнение последовательностей FtsZ может быть использовано как чувствительный метод для изучения филогенетического родства прокариот.

II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

II. 1. Размножение клеток бактерий

Наиболее полно размножение бактерий исследовано на клетках культуры E.coli. Есть все основания предполагать, что поддержание стабильных популяций бактериальных клеток обеспечивается работой хорошо регулируемого клеточного цикла, ключевыми событиями которого являются репликация ДНК, нуклеоидная сегрегация и клеточное деление.

В течение клеточного цикла экспрессия генов E.coli, отвечающих за пролиферацию бактерий изменяется (Zhou et al., 1997). Лимитирующим фактором репликации ДНК является белок DnaA (Vinella, de'Ari, 1995), который, связываясь с сайтом начала репликации OriC, делает дуплекс ДНК доступным для инициации репликации (Bramhill et al., 1988) . Терминация при встрече двух репликационных вилок происходит на участке диаметрально противоположном OriC (Vinella, de'Ari, 1995). Сразу после окончания процесса репликации транскрипция гена dnaA в клетках E.coli ингибируется (Theisen et al., 1993). Ген dnaA найден в ДНК всех групп бактерий (Skarstad, Boye, 1994)

Образующиеся в результате деления дочерние клетки должны получить полный реплицированный геном. Между процессами клеточного деления и сегрегацией нуклеоида существует непосредственная связь (Vinella, de'Ari, 1995). Мехенизм сегрегации хромосом до конца не известен, однако несколько белков сегрегации идентифицировано (Vicente, Errington, 1996). Ключевую роль в этом процессе играет

белок MukB - механофермент, способный генерировать механическую силу для разделения нуклеоидов. Белок MukB с молекулярным весом 177кДа обладает структурой, сходной с миозином и рассматривается как первый цитоскелетный элемент, найденный в клетках прокариот (Niki et al., 1991; Niki et al., 1992; Vinella, de'Ari, 1995).

Деление бактериальной клетки - сложный процесс, включающий образование перегородки деления (септы) в середине клетки на определенной стадии клеточного цикла и формирование эквивалентных дочерних клеток (Addinall, Lutkenhaus, 1996). Гены клеточного деления E.coli были идентифицированы при исследовании клеток с условными летальными мутациями. Мутации, вызывавшие формирование длинных мультинуклеоидных несептированных филаментов при непермиссивных температурах, были названы fts filamentation temperature sensitive (Hirota et al. , 1968; Vinella, de'Ari, 1995). Отсутствие деления в культуре мутантных клеток не влияет на процессы репликации и сегрегации ДНК. У E.coli известно как минимум 15 генов клеточного деления (Lutkenhaus, Addinall, 1997). Большинство из них объединено в кластер dew (division and cell wall), расположенный на 2x минутном участке хромосомы (Lutkenhaus et. al., 1980). Подобные кластеры найдены и в геномах других бактерий. У грам-положительной B.subtilis гены кластера dew расположены на участке хромосомы, соответствующем 135° (Beall et al. , 1988; Errington, 1993). В большинстве групп бактерий последовательность генов ftsQAZ является постоянной, однако в геноме грам-положительных кокков (и некоторых других групп) ген ftsQ

отсутствует. Ген ftsl, кодирующий специфический для деления пенициллин-связываклций белок РВРЗ расположен в начале кластера dew, а ген деления ftsZ - близко к дистальному концу. Промоторы в кластере dew часто локализованы внутри предшествующих структурных генов, что одинаково справедливо как для ftsQAZ участка, так и для mraZWR региона, расположенного в передней части кластера (Vicente, Errington, 1996) .

Температур-чувствительные мутанты E.coli по гену ftsA при непермиссивных температурах образуют длинные филаменты с зачатками септы и межклеточной перетяжки. Подобные мультинуклеарные тяжи формируют также клетки, мутантные по гену ftsl (Taschner et al., 1988). В отличие от филаментов с недостроенной перегородкой деления, мутанты E.coli по ftsZ при непермиссивных температурах образуют филаменты без следов перетяжки и перегородки (Begg, Donachie, 1985; Dai, Lutkenhaus, 1991) В результате исследования мутаций, влияющих на форму клеток E.coli была описана последовательность событий клеточного деления и определены гены, действующие на ранних и на поздних стадиях формирования септы (Begg, Donachie, 1985; Khattar et al., 1994; Begg et al., 1995).

Продукт гена ftsZ необходим для самого раннего описанного этапа деления бактериальных клеток. In vitro показано, что белок FtsZ взаимодействует с N-терминальным доменом MukB (Lockhart, Kendrick-Jones, 1998). В течение роста клетки FtsZ диспергирован в цитоплазме (Bi, Lutkenhaus, 1991). Уровень содержания белка изменяется в течение клеточного цикла и зависит от скорости и фазы

роста бактерий (Aldea et al., 1990). Транскрипция гена ftsZ происходит в течение 1/3 клеточного цикла (Garrido et al., 1993). В клетках E.coli идентифицировано пять промоторов ftsZ, расположенных на предшествующем гену участке длиной 3 т.н.п. Однако, количественные рассчеты показывают, что при активации известных промоторов экспрессируется только 60-70% белка FtsZ, представленного в клетке (Aldea et al., 1990; Dai, Lutkenhaus, 1991). Основные сведения, сформировавшие современные

представления о делении бактериальных клеток, были получены в результате электронно-микроскопических исследований срезов E.coli, обработанных антителами к FtsZ (Bi, Lutkenhaus, 1991).

Перед появлением видимой инвагинации между будущими дочерними клетками белок FtsZ полимеризуется в протофиломенты, опоясывающие клетку (Lutkenhaus, 1993; Sun, Margolin, 1998). Сборка кольца FtsZ является первым этапом процесса деления в клетках разных, филогенетически далеких, видов бактерий. Предполагают, что сжатие перетяжки регулируется сборкой кольца, и подобная регуляция консервативна среди Eubacteria (Addinall, Lutkenhaus, 1996; Quardokus et al., 1996). Анализ делящихся клето