Идентификация и характеристика IbpA, малого белка теплового шока микоплазмы (Acholeplasma laidlawii)

Вишняков, Иннокентий Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация и характеристика IbpA, малого белка теплового шока микоплазмы (Acholeplasma laidlawii)
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и характеристика IbpA, малого белка теплового шока микоплазмы (Acholeplasma laidlawii)"

вишняков

Иннокентий Евгеньевич

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА 1ЬрА, МАЛОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА МИКОПЛАЗМЫ (Ас1го1ер1атш ШШапт)

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011

4841876

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Борхсениус Сергей Николаевич Институт цитологии РАН

доктор биологических наук Снигиревская Екатерина Сергеевна

Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Ермилова Елена Викторовна

Санкт-Петербургский государственный университет

доктор биологических наук Барлев Николай Анатольевич Институт цитологии РАН

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казань

✓3

Защита состоится «8» апреля 2011 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4. Сайт института: http://www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Факс института: (812)297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан «5> марта 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е.В. Каминская

Список сокращений

БТШ - белки теплового шока

а-БТШ - малые белки теплового шока а-кристаллинового типа

АТФ - аденозинтрифосфат

ОРС - открытая рамка считывания

PPLO - pleuropneumonia-like organisms (устаревшее название микоплазм)

LB - питательная среда Лурия-Бертани для культивирования микроорганизмов

IPTG- isopropyl P-D-1-thiogalactopyranoside (изопропил-Р-0-1-тпогалактопиранозид)

PBS - phosphate buffered saline (натрий-фосфатный буфер)

ДДС-ПААГ - додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель

DAB - diamino-benzidine (диаминобензидин)

BSA - bovine serum albumin (бычий сывороточный альбумин)

OD - optical density (оптическая плотность)

КОЕ - колониеобразующая единица

DTT - dithiotrietol (дитиотриэтол)

Актуальность проблемы

Давно известно, что при подъеме температуры до сублетальных значений клетки как прокариот, так и эукариот приостанавливают синтез большинства обычных белков и увеличивают скорость синтеза особого набора белков, называемых БТШ. БТШ были обнаружены у многих эукариот и бактерий (Ьтёяшв^ 1986). Микоплазмы (класс МоШсШев) не составили исключение. БТШ микоплазм впервые были выявлены в Лаборатории структурной организации генома Института цитологии РАН (ВогсЬчсшиз с1 а1., 1990). Было показано, что при увеличении температуры культуральной среды с 32 до 44 °С на 2 ч клетки АсИо1ер1а$та \aidlawii ускоряют синтез девяти полипептидов на фоне подавления синтеза остальных белков, причем в наибольшей степени возрастает количество полипептидов с молекулярной массой 72, 65, 17 и 10 кДа. Наличие БТШ у микоплазм, при том, что геномы этих микроорганизмов значительно редуцированы, указывает на фундаментальное значение БТШ для жизнеобеспечения клетки, в том числе «минимальной». Синтез БТШ у ряда микоплазм независимо показан и другими авторами (ОазсЬсг е! а1., 1990).

Позже синтез БТШ у микоплазм нескольких видов был исследован методом V

иммуноблотинга с использованием поликлональных антител к БТШ 70 человека

Общая характеристика работы

бактериальным белкам GroEL и GroES. При этом полипептид с молекулярной массой 72 кДа, синтезируемый клетками A. laidlawii, был идентифицирован как шаперон DnaK (бактериальный аналог БТШ70 человека), а полипептиды 65 и 10 кДа - как аналоги известных бактериальных шаперонов GroEL и GroES, соответственно (Вонский и др., 1993). Ген, кодирующий DnaK A. laidlawii, был секвенирован (Вонский и др., 1998). Малый БТШ (17кДа), условно обозначенный как р17, не был идентифицирован и охарактеризован, однако были прочитаны 15 аминокислот с его N-конца. Уровень синтеза р17 в условиях теплового шока возрастал многократно, и количество р17 увеличивалось до 7,2 % от общего количества белков в клетке. Другие БТШ накапливались в клетках A. laidlawii в меньшем количестве (Вонский, 2001). Отсюда следует, что роль р 17 в ответе на тепловой шок чрезвычайно важна для клеток A. laidlawii. Мы предположили, что, судя по размеру, р17 может относиться к семейству белков теплового шока а-кристаллинового типа (а-БТШ).

а-БТШ исследованы у многих бактерий, животных, растений и некоторых архей. Известно, что размер полипептидной цепи а-БТШ у разных организмов варьирует от 10 до 43 кДа, причем молекулярная масса большинства из них 14-27 кДа. Члены многочисленного семейства а-БТШ обладают общими свойствами: 1) наличием а-кристаллинового домена, 2) способностью к формированию олигомеров, 3) шаперонной активностью олигомерной формы (Narberhaus, 2002). В условиях стресса а-БТШ связываются с частично денатурированными полипептидными цепями, предотвращая их необратимую денатурацию и агрегацию (Horwitz, 1992). В отличие от шаперонов GroEL и DnaK, а-БТШ не нуждаются в АТФ (Jakob et al., 1993). Предполагают, что а-БТШ интегрированы в мультишаперонную сеть, строго контролирующую качество белков в клетке (Wong, Houry, 2004). Кроме того, а-БТШ играют роль в регуляции текучести клеточных мембран: они способны стабилизировать жидкокристаллическое состояние бислоя и поддерживать целостность мембраны во время термических флуктуаций (Horvath et al., 1998; Tsvetkova et al., 2002). Некоторые а-БТШ эукариот взаимодействуют с белками цитоскелета и защищают их в условиях стресса (Mounier, Arrigo, 2002; Day et al., 2003).

персистнрующими патогенными микроорганизмами. Клетки фитопатогена A. laidlawii при неблагоприятных условиях способны образовывать так называемые ультрамикроформы, отличающиеся от обычных клеток меньшим размером, повышенной устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессовым факторам и фитопатогенностью (Chernov et al., 2007). Мы предполагаем, что основная роль при этом принадлежит системе ответа на стресс, в состав которой должен входить исследуемый нами малый белок теплового шока.

Цели и задачи работы

Целью данной работы было идентифицировать и охарактеризовать малый белок теплового шока (р17)Л. laidlawii. В рамках поставленной цели были определены следующие задачи:

1) найти в геноме A. laidlawii ОРС, соответствующую гену, кодирующему белок р17, и проверить аминокислотную последовательность предсказанного продукта этого гена на наличие консервативных участков;

2) выполнить поиск последовательностей, гомологичных полноразмерному р17, в геномах всех полностью секвенированных к настоящему времени микоплазм;

3) клонировать ген, кодирующий р17, в экспрессирующем векторе, получить рскомбинантньш белок и поликлональные антитела к нему;

4) проверить, образует ли исследуемый белок олигомерные формы;

5) проверить наличие у белка р17 шаперонной активности;

6) исследовать локализацию малого белка теплового шока в клетках A. laidlawii с применением методов иммуно-электронной микроскопии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. pi 7 из A. laidlawii (переименован нами в IbpA) является белком теплового шока а-кристаллинового типа, поскольку обладает характерными для этого семейства белков свойствами: 1) наличием консервативного а-кристаплинового домена; 2) способностью к спонтанной олигомеризации in vitro; 3) шаперонной активностью по отношению к инсулину как модельному субстрату.

2. Рекомбинантный а-БТШ из A. laidlawii защищает некоторые белки клеточного экстракта Е. coli от денатурации и агрегации при воздействии высокой температуры, и повышает устойчивость трансформированных клеток Е. coli к тепловому шоку.

3. В условиях теплового шока значительная часть молекул IbpA в клетке А. laidlawii ассоциирована с элементами клеточных структур.

Научная новизна полученных результатов

Свойства и функции малого БТШ из микоплазмы исследованы впервые. Показано, что этот белок принадлежит к семейству шаперонов а-кристаллинового типа и обладает основными свойствами белков этого семейства. Впервые исследована локализация БТШ в клетке микоплазмы и показана его ассоциация с элементами клеточных структур.

Теоретическое и практическое значение работы

Исследование механизмов жизнеобеспечения наиболее просто устроенной клетки, способной к самостоятельному воспроизведению (каковыми являются клетки микоплазм), в т. ч. системы ответа на стресс, имеет фундаментальное значение для понимания основных принципов функционирования любой клетки. Протективная роль белка IbpA, обнаруженная в модельных экспериментах с клетками Е. coli, позволяет утверждать, что он способен выполнять защитную функцию в клетках. Данные по локализации IbpA в клетке микоплазмы являются существенным вкладом в исследование свойств а-БТШ прокариот, так как в мировой литературе есть всего несколько подобных работ, выполненных на других микроорганизмах (Lünsdorf et al., 1995; Cunningham, Spreadbury, 1998). Результаты работы могут быть полезны при дальнейших исследованиях механизмов ответа на стресс у микоплазм. Для получения результатов по локализации а-БТШ в клетках A. laidlawii были адаптированы методы иммуно-электронной микроскопии, которые могут быть использованы для исследования микоплазм и других мини-клеток, изучение которых методами световой и фазово-контрастной микроскопии невозможно из-за их маленького размера.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 журнальные статьи. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Mycoplasmology - a review of developments over the last decade» (Гран-Канария, Испания, 10-12 июня 2009 г.); 17-м (Тяньцзинь, Китай, 6-11 июля 2008 г.) и 18-м (Кьянчано Терме, Италия, 11-16 июля 2010 г.) Международных конгрессах ЮМ (International Organization for Mycoplasmology); XXII (Черноголовка, 2-6 июня 2008 г.) и XXIII (31 мая - 4 июня 2010 г.) Российских конференциях по электронной микроскопии (РКЭМ); II Конференции молодых учёных Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 15-16 февраля 2010 г.); 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.); Политехническом симпозиуме «Молодые учёные -промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 20 мая 2010 г.) и на заседании объединённого научного семинара Лаборатории структурной организации генома, Лаборатории цитологии опухолевого роста, Лаборатории регуляции экспрессии генов,

Отдела клеточных культур и Группы ультраструктуры клеточных мембран Института цитологии РАН 29 ноября 2010 г.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на -JO& страницах машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего "fSo ссылок. Иллюстративный материал содержит 20 рисунков и 1 таблицу.

Материалы и методы

Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей. Поиск ОРС, соответствующей гену, кодирующему белок р17 (IbpA), был выполнен в полностью секвенированном геноме Acholeplasma laidlawii (GenBank: СР000896). Проверку аминокислотной последовательности р17 на наличие консервативных доменов проводили с помощью базы данных CDD (Conserved Domain Database) на сервере NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Поиск гомологичных последовательностей в базах данных EMBL, GenBank и SWISS-PROT был выполнен с помощью программ BLAST и PROSITE. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей выполняли с помощью программы BLAST.

Бактериальные штаммы. А. laidlawii PG8 (Коллекция клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург) культивировали на модифицированной среде для PPLO с добавлением 10% лошадиной сыворотки (Freundt, 1983). Клетки штамма Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (Novagen, США) выращивали в жидкой среде LB с добавлением антибиотиков: хлорамфеникола (25 мкг/мл), ампициллина (100мкг/мл) - для культивирования штаммов Е. coli, трансформированных вектором рЕТ-15Ь.

Клонирование гена. Были сконструированы (Vector NTI, Invitrogen, США) и синтезированы (ЛИТЕХ, Россия) праймеры, фланкирующие ОРС ACL 0421: 5'-TTCTTATCATggattcTTAAGTTC-3 ' и 5 '-AGTGTAAAAcatatgTTGAGTTTATTG-3 ' (сайты для рестриктаз BamHI и Ndel обозначены строчными буквами). Амплификацию проводили с Taq полимеразой (ЛИТЕХ, Россия). В качестве матрицы использовали тотальную ДНК A. laidlawii и проводили 30 циклов ПЦР: 93 °С - Юс, 44 °С - Юс, 72 °С - Юс. Амплифицированный фрагмент длиной 411 п.н. был клонирован в экспрессирующем векторе pET-15b (Novagen, США) согласно методике, описанной в рЕТ System Manual с использованием ферментов BamHI, Ndel и ДНК-лигазы фага Т4 (Fermentas, Литва). Корректность вставки была проверена секвенированием. Плазмиду назвали pibpA.

Получение рекомбинантного белка. Синтез белка в трансформированных клетках Е. coli, выращенных в жидкой среде до достижения культурой оптической плотности 0,6 (ODwo) (экспоненциальная фаза роста), индуцировали добавлением 0,1 мМ IPTG. Через 2 ч культивирования в присутствии индуктора клетки собирали центрифугированием (3000 об/мин, 20 мин), надосадок сливали, осадок ресуспендировали в буфере (1/10 от объёма культуры), содержащем Tris-HCl (pH 7,4), 300 мМ NaCl и 20 мМ имидазола. После обработки клеток ультразвуком (22 кГц, 5 раз по 10 с) и осветления суспензии (40000 об/мин, Beckman TL-100 (США), 45 мин) полученный надосадок наносили на колонку с Ni-сефарозой (GE Healthcare, США). Связавшийся белок элюировали тем же буфером с 300 мМ имидазола, и очищали от примесей методом гель-фильтрации на колонке Superdex-200 PrepGrade Tricorn 10/30 (хроматографическая система АКТА FPLC, GE Healthcare, США), уравновешенной PBS. На всех этапах работы выполняли электрофоретический контроль.

Получение поликлональиых антител. Кроликов иммунизировали в соответствии с методикой, разработанной в Институте цитологии РАН (Ivanov, Fei, 1984). Полученную иммунную сыворотку наносили на колонку с nProtein А Sepharose (GE Healthcare, США), затем колонку промывали буфером, содержащим 20 мМ NaH2P04 (pH 7,0), после чего связавшиеся с белком А иммуноглобулины элюировали 0,1 М глицином (pH 3,0). Для предотвращения выпадения иммуноглобулинов в осадок в собранную фракцию добавляли необходимое количество 1 М Tris-OH для сдвига pH раствора до нейтральных значений, затем проводили гель-фильтрацию на колонке Superdex-200 PrepGrade Tricorn 10/30, уравновешенной PBS.

Иммуноблотииг. Белковые фракции разделяли электрофоретически (15 % ДДС-ПААГ, Laemmli, 1970) и переносили на нитроцеллюлозу Hybond С (GE Healthcare, США). Мембрану блокировали 3 %-ным обезжиренным молоком в течение 30 мин. Антитела к IbpA разводили 1:1000. В качестве вторых антител использовали козьи анти-кроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, в разбавлении 1:10000. Как с первыми, так и со вторыми антителами мембрану инкубировали в PBS в течение 1 ч, перед добавлением вторых антител мембрану тщательно промывали. Блоты окрашивали DAB (Sigma, США) в соответствии со стандартным протоколом.

Тепловой шок. Синтез IbpA в клетках A. laidlawii инициировали повышением температуры во время экспоненциальной фазы роста культуры с 30 до 42 °С на 90 мин, затем температуру понижали до 37 °С и продолжали культивирование ещё в течение 90 мин. Такие условия роста способствовали максимальному накоплению белка.

Молекулярную массу олиюмеров оценивали методом гель-фильтрации в PBS на колонке Superdex-200 PrepGrade Tricorn 10/30 со скоростью 1 мл/мин. Для калибровки колонки использовали стандартные белки-маркеры молекулярной массы (Sigma, США).

Для определения шаперонной активности рекомбинантного IbpA в качестве модельного субстрата был использован бычий инсулин, любезно предоставленный проф. К.К. Туроверовым (ИНЦ РАН), в концентрации 0,45 мг/мл, а в качестве контроля - BSA в концентрации 0,5 мг/мл. Для разрушения дисульфидных мостиков между цепями инсулина добавляли дигиотриетол до конечной концентрации 0,15 мг/мл. Использовали реактивы фирмы Sigma (США). Эксперимент проводили при 25 °С и 43 °С в течение 30 мин в PBS (pH 7,0) в объёме 100 мкл. Пробы (1 мкл) отбирали каждые 3 мин и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 360 нм на спектрофотометре NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, США). Измерения повторяли трижды, статистическую обработку результатов выполняли по программе Excel.

Оценка влияния рекомбинантного белка на агрегацию белков Е. coli in vitro при нагреве. Клетки штамма Е. coli pibpA, выращенные с добавлением (в экспоненциальной фазе роста) или без добавления IPTG, осаждали центрифугированием (8000 об/мин, 10 мин) и промывали в PBS. Суспензию клеток обрабатывали ультразвуком и центрифугировали (16000 об/мин, 10 мин). Для получения фракций растворимых белков надосадки собирали и дополнительно центрифугировали при 300000 об/мин 30 мин на ультрацентрифуге Beckman TL-100 с ротором TLA 100.3 (США). Концентрацию белка измеряли по методу Бредфорд (Bradford, 1976). Из полученных фракций отбирали часть материала, нагревали до 55 °С в течение 30 мин и центрифугировали (16000 об/мин, 10 мин) для удаления агрегировавших белков из раствора. Затем определяли концентрацию белка в осадке и надосадке и анализировали фракции (как подвергнутые, так и не подвергнутые воздействию температуры) методом электрофореза в ДЦС-ПААГ. Денситометрию и анализ белковых профилей выполняли в программе TotalLab Quant (Nonlinear Dynamics, США).

Оценка теплоустойчивости клеток Е. coli, продуцирующих рекомбинантнын IbpA. К культуре клеток штамма Е. coli pibpA добавляли 0,1 мМ IPTG в середине логарифмической фазы роста (OD«mi=0,6) и продолжали инкубацию в течение 2 ч при 37 "С. Затем индуцированную и не индуцированную культуры, выращенные в одинаковых условиях, разбавляли средой до 5,0 х 106 кл/мл, отбирали по 1 мл суспензии и культивировали при 48 °С в течение 120 мин. Пробы (100 мкл) отбирали перед изменением температуры культивирования и, на 30, 45, 60, 90 и 120-й минуте после её повышения,

делали серийные разведения и высевали на чашки Петри с L-агаром. Чашки инкубировали при 37 °С в течение 12 ч, после чего подсчитывали количество КОЕ.

Электронная микроскопия. Клетки A. laidlawii фиксировали добавлением в жидкую среду формальдегида и глутаральдегида (до конечной концентрации 2% и 0,1-0,2%, соответственно) при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего собирали центрифугированием (10000 об/мин, 10 мин). Осадки дегидратировали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и заливали в смолу LR-White (Polyscience, INC, США). Смолу полимеризовали при 50 °С. Иммуноцитохимические эксперименты проводили на ультратонких срезах клеток в соответствии со стандартным протоколом (Миронов и др., 1994). Антитела против IbpA разводили (1:50) в PBS, содержащем 0,1 % BSA. Козьи анти-кроличьи антитела, конъюгированные с частицами коллоидного золота диаметром 15 нм (EY Laboratories, INC, США), использовали в качестве вторых антител. Срезы окрашивали спиртовым раствором уранилацетата и раствором цитрата свинца, образцы просматривали в электронном микроскопе JEM-100U. В контроле либо опускали специфические антитела, либо использовали вместо них кроличью неиммунную сыворотку. Распределение метки в клетках A. laidlawii анализировали в 20 полях зрения (13000 х).

С целью исследования ультраструктуры клетки A. laidlawii собирали центрифугированием (10000 об/мин, 10 мин), осадок фиксировали 1 %-ным раствором 0s04, обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне, пропитывали и заливали в смесь эпон - аралдит (Миронов и др., 1994). Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме LKB-III, окрашивали спиртовым раствором уранилацетата и раствором цитрата свинца и просматривали в электронном микроскопе JEM-100U.

При исследовании олигомерных форм рекомбинантного белка на сеточки, покрытые коллодиевой плёнкой и обработанные ультрафиолетом для снятия заряда статического электричества, наносили по 5 мкл раствора белка в PBS (10 мкг/мл, рН 7,4). Спустя 1-2 мин раствор белка удаляли, а связавшийся материал окрашивали водным раствором уранилацетата (2 %, 1 мин) и просматривали в электронном микроскопе Libra 120 (Zeiss, Германия), 50000 х.

Результаты

Идентификация белка р17 и анализ его аминокислотной последовательности.

Поиск ОРС, кодирующей белок р17, был осуществлён после того, как нашими коллегами из НИИ физико-химической медицины (ФМБА, Москва) был полностью секвенирован геном A. laidlawii. Последовательность 15 N-концевых аминокислот, идентичная N-концу белка р17, была найдена в составе предсказанного продукта только одной ОРС - otfill (после

аннотации генома АСЬ_0421). Рассчитанная молекулярная масса полноразмерного продукта ОРС АСЬ_0421 15,2кДа, что примерно соответствует молекулярной массе р 17 (17кДа), определённой электрофоретически. Предсказанная аминокислотная последовательность р 17 была проверена на наличие в её составе консервативных доменов. При этом в центральной области молекулы белка была выявлена последовательность, гомологичная главному структурному домену всех представителей а-БТШ - а-кристаллиновому домену, а в М-концевой области - предполагаемый \¥ОРР-мотив, участвующий в мультимеризации а-БТШ. а-Кристаллиновый домен р17 состоит из 90 аминокислот, фланкирован с И-конца участком из 33 аминокислот, а с С-конца - коротким участком из 14 аминокислот. В результате поиска аминокислотных последовательностей, гомологичных р 17 из А. \aidlami, во всех полностью секвенированных на сегодняшний день геномах прокариот было выявлено 2066 последовательностей, из которых 1715 соответствуют белкам, обозначенным как БТШ. или стрессовые белки. Для ряда из них либо известна, либо предсказана функция молекулярных шаперонов. Для наглядности мы сравнили аминокислотную последовательность р 17 из А. \aidlami с последовательностями а-БТШ 4 выбранных нами >убактерий и археи МеМапососсш /аппаясЬИ (рис.1).

р17 A.laídlawii Hspl8 С.acetobutyhcum LBA0205 L.acidophilus IbpA E.coli !'2 2 IfcpA B.subtilis Hsp20 M. jannaschii

pl7 A.laidlavrii Hspl8 C.acetobutylicum LBA0205 L.acidophilus IbpA E.coli K12 IbpA B.subtilis Hsp20 M. jannaschii

pl7 A. laidlawii Hspld C.acetobutylicvm LBA0205 L.acidophilus IbpA E.coli К12 IbpA B.subtilis Hsp20 M.jannaschii

Рис. 1. Сравнение аминокислотной последовательности р17 из A. laidlawii с последовательностями а-БТШ 4 эубактерий и археи М. jannaschii.

Чёрным цветом обозначены аминокислотные остатки а-БТШ, совпадающие но местоположению с аминокислотными остатками р17. Рамкой выделена область консервативного а-кристаллинового домена.

Поиск генов и белков, гомологичных р17 A. laidlawii, был отдельно выполнен во всех 29 полностью секвенированных к настоящему времени геномах микоплазм, представленных в GeneBank. Было обнаружено три предсказанных белка, обладающих 44 %-ным (IbpA AYWB), 45 %-ным (IbpA OY-M) и 41 %-ным (Hsp20 из Candidatus Phytoplasma australiense)

12 '^^^^DWFC-Q I. 5 E'^SPHmrqwigI

F S DDF FI9TB3FBCNAGF К D D К fl'Г V A

|cfls El--------ЕЩ1 — -JJq ^аШоко

- - - KLANALQNAGESQSF РРУЩ EfflSD D^HJJRIT

23 KQVFDEDQKTP§MTNGQSPFPFAQQDQRGKGDASFPSI-fin-ynnVAEVOFL 11 FERMFKEFFAT PMTGTTMIGSSTGIQISGKGF- igpljsyigGDQHIKVI

QAT КЩЯЯЩ-Х^ЕТЩК; 95 DMMMFV"F™SYSELF. IIG

ШгВнт@кы s

•IgKRDDI\ \GTRKAFKD|_

<GT P EQP KgEg------- - Eü HQBDJJM

\GQRF SYFNEqJ----F Ro|g3|GKYgSFE

-g!\RgPLMITESERII0SEIPEEEEIYR

111 101

119 10 8

^RGJlhld—¡3

¡RLpfwAN-QPFSLSFTLAENMj К KIPLS DHLHG— КМЩА-11 TIKLPATVKEE— NASA-id

№'10

KV^GKDNGgRID .GDDDNSIQI |lRtJE- -g^PIAAQ CgDEGQAKTIVIDD [Й^Е S SI KKGINI¡3

135 150 139 130 158 147

сходством с продуктом рамки считывания ACL 0421 A. laidlawii (рис.2). Все три белка принадлежат фитоплазмам (семейство Acholeplasmataceae), находящимся в близком родстве с микоплазмой A. laidlawii. По мнению авторов, они могут выполнять функции молекулярных шаперонов (Oshima et al., 2004; Bai et al., 2006; Tran-Nguyen et al., 2008). Так как p 17 обладает высоким уровнем сходства с предсказанными шаперонами IbpA фитоплазм, мы переименовали его в IbpA.

pl7 A. laidlawii IbpA AYWB IbpA OY-M

Hsp2Q P .austi-aliense

pl7 A. laidlawii 49 IbpA AYWB 53

IbpA OY-M 53

Hsp20 P.australiense Al

pl7 A. laidlawii 97

IbpA AYWB 99

IbpA OY-M 99

Hsp20 P.australiense 93

|K fflRS H0DgF ЩШГ I VLNgVT T SjMpJ

fflüD I L TN S LTNNNj

JQD Ï|L ENLB^MK TN S LT NNNj

IDS E KD10e2l||AG -| - -1 QgïN Lfi HK¡jj * -'

JSgTraDQATKYj

gKN^KTQIHS—AKF Kf îfflKNQljs - - AKE'I

96 98 98 92

137 140 14 0 135

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей предсказанных а-БТШ микоплазм: р 17 из А. laidlawii, IbpA из Aster yellows witches '-broom phytoplasma (AYWB), IbpA из Onion yellows phytoplasma (OY-M) и Hsp20 из Cundidatus Phytoplasma australiense.

Чёрным цветом обозначены аминокислотные остатки а-БТШ, совпадающие но местоположению с аминокислотными остатками р17. Рамкой выделены вероятный WDPF-мотив (показан стрелкой) и область консервативного a-кристалл и нового домена.

Рекомбинантный белок IbpA и поликлональные антитела против него. На

рис. 3, а (дорожка 3) показано появление в клеточном экстракте Е. coli, трансформированных плазмидой pibpA, полипептида с молекулярной массой около 20 кДа, соответствующего рекомбинантному IbpA из A. laidlawii, через 2 ч после индукции.

3 M

sw il кДа

—» 45

— m ■ 20

ЩШ Wti. m 15

4 5 6 7

Рис. 3. Рекомбинантный IbpA А. laidlawii (а) и поликлональные антитела против него (б).

а - электрофорез в 12 %-ном ДДС-ПААГ: / -рекомбинантный IbpA; 2 - клеточный экстракт Е. coli BL21 (DE3); 3 - экстракт клеток Е. coli, трансформированных плазмидой pibpA и индуцированных IPTG. б -иммуноблотинг: 4 - клеточный экстракт Е. coli; 5 -рекомбинантный белок IbpA (19,65 кДа); 6 - клеточный экстракт А. laidlawii (нормальные условия роста); 7 -клеточный экстракт А. laidlawii (тепловой шок). На дорожках б и 7 видны полосы, соответствующие нативному белку IbpA (15,2 кДа).

Рекомбинантный белок представляет собой полипептидную цепь, соответствующую полноразмерному нативному 1ЬрА (15,2 кДа), с экспрессируемой частью вектора рЕТ-15Ь, в

состав которой входит последовательность нуклеотидов, кодирующая гистидиновый «хвост». Рассчитанная молекулярная масса рекомбинантного IbpA составляет 19,65 кДа. Белок был выделен и очищен (рис. 3, дорожка 1). Препарат белка использовали для получения кроличьих поликлональных антител, специфичность которых проверяли методом иммуноблотинга (рис. 3, б). Антитела узнают как рекомбинантный, так и нативный IbpA из A. laidlawii. После теплового шока количество а-БТШ, продуцируемого клетками микоплазмы, возрастает (дорожка 7).

Олигомерные формы рекомбинантного белка IbpA. Очищенный рекомбинантный белок IbpA спонтанно формирует олигомеры in vitro (1 мг/мл в PBS, рН 7,0). С помощью электронной микроскопии высокого разрешения были получены изображения олигомеров (проекций глобул) IbpA (рис. 4, а).

Рис. 4. Олнгомеры рекомбинантного белка IbpA,

а - электронные изображения олигомеров белка IbpA из A. laidlawii. Негативное окрашивание (1 %-ный водный раствор уранилацетата). На верхней части рисунка представлена панорамная фотография олигомерных частиц [ЬрА. На нижней части - фотографии индивидуальных олигомеров (диаметром около 15 нм), располагающихся под разными углами к поверхности сеточки. Масштабная линейка соответствует 20 нм. 6 - оценка мол. массы олигомеров методом гель-фильтрации (PBS, 1 мл/мин); 1 - хроматографическая кривая гель-фильтрации сразу после выделения рекомбинантного IbpA из клеточного экстракта Е. coli; II - то же, через 24 ч (хранение при + 4 °С). Пик I соответствует фракции мономеров; пик 2 - фракции тетрамеров; пик 3 -олигомерам. в состав которых входит 12 субъединиц; пик 4 - олигомерам, состоящим из 24 субъединиц.

Размер белковых частиц варьировал от 3 до 20 нм, большинство из них было 15-20 нм в диаметре. Сразу после выделения белка из клеточного экстракта Е. coli оценивали молекулярную массу олигомеров IbpA методом гель-фильтрации. Наблюдали три хроматографических пика (рис. 4, б, /). Пик 1 соответствует фракции мономеров IbpA, пик 2 - фракции тетрамеров. Пик 3 был сформирован из олигомеров, состоящих из 12 субъединиц. При гель-фильтрационном анализе того же образца спустя 24 ч (хранение при + 4 °С)

Ч» 1 ЙЯ MR Я И» iw>&ü -¡« 'Sm ШИ - Я ft« время удержания, мин

хроматографическая кривая (рис. 4, б, II) заметно отличалась от кривой, представленной на рис. 4, б, /. Почти полностью исчез пик, соответствующий фракции мономеров; интенсивность пиков 2 и 3 значительно уменьшилась; до 80 % от общего количества белка формировало пик 4, который представлен олигомерами IbpA, в состав каждого из которых входят 24 субъединицы рекомбинантного белка.

Шаперонная активность рекомбинантного белка IbpA in vitro. Мы исследовали влияние рекомбинантного IbpA A. laidlawii на агрегацию бычьего инсулина, спровоцированную добавлением в реакционную смесь DTT, при разных температурах. В качестве положительного контроля использовали чистый инсулин, а в качестве других контролей - смесь инсулина с BSA, а также чистые IbpA и BSA. IbpA как при 25 °С (рис.5, а), так и при 43 °С (рис.5, 6) не денатурировал и не агрегировал. BSA не агрегировал при 25 °С (рис.5, а), тогда как при 43 °С происходила постепенная агрегация BSA, очевидно, связанная с тепловой денатурацией белковых молекул (рис. 5, б). Интересным фактом явилось отсутствие ожидаемой агрегации инсулина при 25 °С в составе смеси с BSA (рис.5, в), тогда как при 43 °С она происходила (рис. 5, г). Что касается влияния рекомбинантного IbpA из A. laidlawii на агрегацию инсулина при указанных температурах, мы наблюдали следующее: при 25 "С IbpA слабо подавлял агрегацию инсулина (рис. 5, в), тогда как при 43 "С и молярном соотношении, близком к 1:1, полностью препятствовал его денатурации и агрегации (рис. 5, г). Подобное различие в характере влияния IbpA и BSA на агрегацию модельного субстрата указывает на наличие специфической, зависимой от температуры шаперонной активности у исследуемого белка. Кроме того, влияние IbpA на агрегацию инсулина зависело и от концентрации шаперона (рис. 5, д, е), причём при 43 °С эта зависимость проявлялась значительно ярче (рис.5, е).

Влияние рекомбинантного белка IbpA на агрегацию белков Е. coli in vitro при нагреве. Нами было исследовано влияние IbpA из А. laidlawii, синтезируемого в клетках Е. coli, на агрегацию белков клеточного экстракта Е. coli при кратковременном воздействии высокой температуры (55 °С, 30 мин). На рис. 6, а представлены электрофореграммы фракции растворимых белков Е. coli, как не содержащей (дорожки 1, 3), так и содержащей (дорожки 2, 4) рекомбинантный IbpA. На рис. 6, б видно, что в присутствии IbpA не происходит изменения белкового профиля фракции (исчезновение ряда пиков или появление новых, за исключением пика, соответствующего рекомбинантному белку) по сравнению с контрольным штаммом (графики 1 и 2). Однако уровень синтеза остальных белков при синтезе IbpA клетками Е. coli снижался. Это можно объяснить тем, что в синтез рекомбинантного белка вовлечено значительное количество ресурсов клетки, и происходит

Рис.5. Влияние рекомбинантиого IbpA на агрегацию инсулина.

1 - инсулин; 2 - инсулин + BSA; 3 - инсулин + IbpA (0,1 мг/мл); 4 - инсулин + IbpA (0.45 мг/мл); 5 -BSA; 6 - IbpA (0,45 мг/мл). Реакцию проводили при 25 "С (а, в, д) и 43 "С (о, г, е).

закономерное изменение уровня синтеза остальных белков. Профиль фракции растворимых белков из клеток штамма, не синтезировавшего рекомбинантный белок IbpA, существенно меняется после прогрева (дорожка 3). Более наглядно это демонстрируют денситометрические графики 1 и 3. Исчезают пики, соответствующие белкам с молекулярной массой 122, 113, 110, 107, 65, 54, 25 и 16 кДа (белки полностью агрегируют и

1 2 М 3 4

■ из «

110 Г р-

f/w A/vyvVUH^

Wik

АЛ

100 90 80 70 60 SO 4(1 30 20

молекулярная масса, кДа

Рис. 6. Влияние рекомбинантного белка IbpA на агрегацию растворимых белков Е. coli в клеточном экстракте при нагреве.

а - электрофореграммы фракции растворимых белков клеточных 'экстрактов Е. coli: 1 - pibpA; 2 -pibpA + IPTG; 3 - pibpA (55 °C, 30 мин); 4 - pibpA + IPTG (55 °C, 30 мин); M - маркеры молекулярной массы (кДа). На рисунке отмечены термолабильные белки (молекулярная масса, кДа), агрегирующие и полностью выпадающие в осадок при воздействии повышенной температуры, б - сравнительный анализ соответствующих дорожкам денсигограмм. Стрелками обозначен рекомбинантный IbpA.

выпадают в осадок), а также уменьшается площадь пиков, соответствующих большинству остальных белков. Что касается аналогичной фракции белков при наличии в её составе рекомбинантного IbpA из А. laidlawii, то её профиль после прогрева изменяется в меньшей степени (кривые 3 и 4). После тепловой обработки исчезают только пики, соответствующие белкам с молекулярной массой 65, 54 и 16 кДа, а площадь пиков, соответствующих другим белкам, уменьшается не так значительно. В присутствии рекомбинантного IbpA 70 % тотального белка фракции оставалось в растворе после тепловой обработки и только 52 % - в отсутствие IbpA. Таким образом, рекомбинантный IbpA препятствует денатурации и агрегации некоторых растворимых белков в клеточном экстракте Е. coli при нагреве. Вероятно, IbpA способен выполнять защитную функцию и в клетках А. laidlawii.

Теплоустойчивость клеток Е. coli в присутствии рекомбинантного IbpA. При сильном тепловом шоке через 30 мин теплоустойчивость клеток Е. coli (доля жизнеспособных клеток в культуре), продуцирующих рекомбинантный IbpA, была выше в три раза по сравнению с неиндуцированными клетками, однако через 45 мин этот эффект исчезал (рис. 7). Почти все клетки Е. coli погибали через 90 мин экспонирования при 48 °С.

rf-

1 Ün BS-,

О 30 45 60 90 120 ...........

Рис. 7. Влияние рекомбннантного IbpA А. laidlawii на теплоустойчивость

трансформированных клеток Е. coli.

Сравнение теплоустойчивости клеток Е. coli pibpA, продуцирующих (1ЬрА+) и не продуцирующих (IbpA-) рекомбинантный белок из А. luiJluwii. подвергнутых воздействию сильного теплового шока. 0 мин - момент изменения температуры с 37 до 48 °С.

Таким образом, рекомбинантный IbpA оказывал влияние на теплоустойчивость клеток Е. coli в условиях сильного теплового шока.

Локализация IbpA в клетке Л. laidlawii. В обычных условиях роста лишь небольшое количество метки обнаруживали на периферии клеток микоплазмы. На срезах клеток, подвергнутых воздействию теплового шока, частицы коллоидного золота обнаруживали в большем количестве (рис. 8). 40 % метки визуально невозможно было ассоциировать с какими-либо клеточными структурами. Ассоциация остальных 60 % метки со структурами клетки была очевидной, и наблюдавшиеся картины распределения частиц золота условно разделили на 4 варианта. 1) Метка на неидентифицированных упорядоченных структурах (10%); при этом заметны «цепочки» из частиц метки (а-г. е. ж), иногда разветвлённые (б) или изогнутые (а. г, е, ж), некоторые из них располагаются вблизи полюсов клетки (е. ж). Иногда структуры отчётливо видны (а, з, и). Когда плоскость среза проходила поперёк этих структур, на их сечении наблюдали скопления метки (з. и). 2) Метка в электронно-плотных областях клетки - «гранулярных тельцах» (65 %) (к-о). В некоторых случаях частицы золота обнаруживали в виде кластеров (м). 3) В области плазматической мембраны (20 %) (п-с). 4) В зоне перетяжек между делящимися клетками микоплазм (5%) (т-х). За 100% принимали общее количество частиц золота, ассоциированных с клеточными структурами. Ни в одном из вариантов метку не обнаруживали в области нуклеоида.

Ультраструктурные исследования А. laidlawii (рис. 9) подтвердили наличие в клетках штамма PG8 упорядоченных структур, напоминающих элементы цитоскелета (а, о), «гранулярных телец» (в. г), рибосом (д-з), и, вероятно, полирибосом, собранных в цепочки (ж) и кластеры (е. з). Кроме того, показано, что во время цитокинеза в области перетяжки между дочерними клетками обнаруживаются электронно-плотные участки, напоминающие по структуре так называемые «гранулярные тельца» (г/); на завершающей стадии деления

Рис. 8. Локализация белка 1ЬрА в клетках А. 1шй1ат\, подвергнутых воздействию теплового шока.

а-и - на неидентифицированных упорядоченных структурах (обозначены стрелками); к-о - в электронно-плотных областях клетки («гранулярных тельцах»), стрелки указывают на «тельца» (к) и кластеры из частиц метки (л/); п-с - в области мембраны; т-х - на перетяжках между делящимися клетками (стрелки указывают на область перетяжки). Масштабная линейка соответствует 100 нм.

Рис.9. Ультраструктура клеток Л. 1шс11ам>И.

Стрелками отмечены: а, б - упорядоченные структуры (вероятно, цитоскелет-иодобные элементы); в, г - электронно-нлотные области («гранулярные тельца»); д, е, ж, з - частицы диаметром около 20 нм (вероятно, рибосомы); и - электронно-нлотные области на перетяжках между делящимися клетками и в дочерних клетках на финальной стадии деления (внизу фотографии). Масштабная линейка соответствует 100 нм.

клеток можно наблюдать уже два электронно-плотных участка, симметрично располагающихся в каждой дочерней клетке.

Обсуждение

Общим свойством а-БТШ прокариот и эукариот является присутствие в аминокислотной последовательности участка из 80-100 аминокислот, называемого а-кристаллиновым доменом. Этому домену предшествует Ы-концевой участок, варьирующий и по длине, и по составу. Вслед за последовательностью домена располагается короткий С-концевой участок (Саврегэ е1 а1., 1995). Полипептид, продуцируемый клетками А. 1а'к11а\уи в условиях теплового шока ("белок р 17"), был выделен из геля и идентифицирован как а-БТШ в результате прочтения 15 аминокислот с его 1М-конца, поиска соответствующей ему ОРС в геноме А. ЫсИсти РО-8А и обнаружения в центральной области аминокислотной последовательности предсказанного продукта ОРС АС1__0421 консервативного а-

кристаллинового домена. N-концевая область молекулы белка р17, переименованного в IbpA, обладает низким уровнем гомологии с представителями а-БТШ прокариот (рис. 1, 2), тогда как С-концевая область обнаруживает высокую степень сходства с аналогичной областью предсказанных а-БТШ фитоплазм (рис. 2). Известно, что уровень гомологии между а-БТШ ниже такового для шаперонов других классов (Caspers et al., 1995). Тем не менее, IbpA из A. laidlawii обладает значительным сходством с а-БТШ фитоплазм AYWB, OY-M и Candidatus Р. australiense (рис. 2). а-БТШ выявлены лишь у четырёх представителей класса Mollicutes и, очевидно, отсутствуют у остальных изученных микоплазм.

Возникает вопрос, почему у одних микоплазм а-БТШ имеются, a у других - нет. Можно было бы предположить, что у большинства микоплазм а-БТШ отсутствуют в связи с более значительной степенью редукции их геномов. Однако гены, кодирующие а-БТШ, не найдены не только у Mycoplasma genitalium, известной своим самым маленьким геномом (0,58 Мб) среди организмов, способных к самостоятельному воспроизведению (Fraser et al., 1995), но и у Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC str. PG1 (Westberg et al., 2004) и Mycoplasma penetrans HF-2 (Sasaki et al., 2002) с геномами 1,2 Мб и 1,36 Мб, соответственно. В геноме (1 Мб) внутриклеточного паразита Chlamydia trachomatis (Stephens et al., 1998) a-БТШ также отсутствуют. В то же время, в маленьких геномах внутриклеточных паразитов Buchnera aphidicola str. APS (0,64 Мб) и Rickettsia prowazekii (1,1 Мб), обитающих большую часть жизненного цикла на поикилотермных насекомых, гены, кодирующие а-БТШ, обнаружены (Shigenobu, 2000; Andersson, 1998). Представляется вероятным, что для наличия или отсутствия a-БТШ решающее значение имеет не размер генома, а температурный режим существования организма. Так, большинство микоплазм, у которых a-БТШ отсутствует, являются паразитами животных и человека, занимая изотермические ниши. Представители же семейства Acholeplasmataceae, в отличие от других микоплазм, обитают, главным образом, в тканях растений.

Мы предполагаем, что IbpA в клетках A. laidlawii выполняет функцию шаперона. Известно, что шаперонная функция присуща только олигомерным формам а-БТШ (Narberhaus, 2002). При этом а-БТШ способны взаимодействовать с ново-синтезированными или частично денатурировавшими полипептидами в клетке, препятствуя их необратимой денатурации и агрегации. Благодаря а-БТШ субстратные белки поддерживаются в фолдинг-компетентном состоянии. Защита белков от агрегации шаперонами из семейства а-БТШ наглядно продемонстрирована в модельных экспериментах (Yuan et al., 1996; Sun et al., 2004). В наших опытах рекомбинантный белок IbpA, выделенный из клеточного экстракта, обнаруживал способность к спонтанной олигомеризации in vitro (рис. 4, а). До 80 % от

общего количества IbpA находилось в растворе в форме олигомеров, состоящих из 24 субъединиц (рис. 4, б). Похожие по размеру и структуре олигомеры формирует в растворе рекомбинантный а-БТШ Hsp26 дрожжей (White et al., 2006). Из 24 субъединиц состоит Hspl6,5 археи М. jannaschii (Kim et al., 1998). Олигомеры ряда бактериальных а-БТШ также состоят из 24 субъединиц (Narberhaus, 2002). Вероятно, существует динамическое равновесие между мультимерными формами IbpA из A. laidlawii, что объясняет присутствие олигомеров с разной молекулярной массой в растворе рекомбинантного белка (рис. 4, б). К примеру, гексадекамер (16 субъединиц) мышиного Hsp25 находится в зависимом от концентрации белка равновесии с тетрамерами и димерами (Ehrnsperger et al., 1999). Так как строительным блоком олигомеров всех изученных а-БТШ является димер (Nakamoto, Vigh, 2007), любые интермедиа™ в процессе олигомеризации должны быть кратными двум.

Результаты многих экспериментов хорошо демонстрируют свойства а-БТШ как. молекулярных шаперонов, их взаимодействие с белками-мишенями и предотвращение необратимой денатурации и агрегации этих белков. Причём многие а-БТШ являются эффективными шаперонами не только в отношении белков, подверженных тепловой денатурации, но и в отношении химически денатурированных субстратов при низких температурах in vitro (Narberhaus, 2002). Примером химического «пускового механизма», приводящего к последующей денатурации белка, служит воздействие DTT на инсулин. Характерной особенностью инсулина является то, что при разрушении дисульфидных связей между а- и р-цепью последняя агрегирует в широком диапазоне температур (Sanger, 1949). При этом повышение температуры слабо влияет на кинетику агрегации инсулина, лишь ускоряя протекание реакции, что делает инсулин весьма удобным модельным субстратом для изучения не только шаперонной активности исследуемого белка, но и зависимости этой функции от температуры (Haslbeck et al., 1999).

Отсутствие ожидаемой агрегации бычьего инсулина при 25 °С в составе смеси с бычьим сывороточным альбумином (рис. 5, в) в нашем эксперименте можно объяснить образованием комплексов, устойчивых к денатурации. Недавно было выявлено, что так называемая фракция «свободного инсулина» человека на самом деле транспортируется в крови при участии инсулин-связывающего фактора, транспортного комплекса, в состав которого у здоровых людей входит а-фетопротеин, трансферин и около 26 % альбумина (Гарипова и др., 2007; Елисеева и др., 2009). Альбумин и инсулин, вероятно, образуют непрочные комплексы (Касаткина, 1996). Тепловое воздействие вполне может способствовать их диссоциации. Это приводит к высвобождению инсулина и его дальнейшей агрегации (рис. 5, г). Что касается рекомбинантного IbpA из A. laidlawii, то он

обнаруживал специфическую шаперонную активность по отношению к инсулину, зависящую от температуры, и это напоминает шаперонные свойства Hsp26 из 5. cerevisiae (Haslbeck et al,, 1999). Hsp26 является эффективным шапероном только в условиях повышенной температуры (Haslbeck et al., 1999). По аналогии с Hsp26 из дрожжей, IbpA из A. laidlawii обнаруживал гораздо более высокий уровень активности в подавлении агрегации инсулина при 43 "С по сравнению с 25 °С (рис. 7, в-е). На основании полученных результатов можно предположить, что эти два шаперона обладают сходным температуро-зависимым механизмом действия.

Рекомбинантный белок IbpA из А. laidlawii защищает ряд растворимых белков Е. coli in vitro от агрегации при повышенной температуре (рис. 6). Похожий эффект наблюдали авторы, исследовавшие влияние рекомбинантного а-БТШ 16,9 кДа из риса на растворимые белки клеточного экстракта Oryza sativa (Yeh et al., 1995). При этом рекомбинантный IbpA из А. laidlawii влиял на теплоустойчивость трансформированных клеток Е. coli при 48 °С (рис. 7). Спустя 30 мин с момента начала теплового шока количество жизнеспособных клеток Е. coli pibpA, продуцировавших рекомбинантный белок, в три раза превышало количество клеток, не продуцировавших IbpA. В аналогичном эксперименте с рекомбинантным белком 16,9 кДа из риса (Yeh et al., 1997) количество жизнеспособных клеток Е. coli, продуцировавших рекомбинантный а-БТШ, через 30 мин экспонирования при 47,5 °С в 30 раз превышало количество живых клеток в контроле. Таким образом, рекомбинантный IbpA защищает клетки Е. coli от гибели в условиях теплового шока, но сравнительно слабо, а-БТШ разных организмов обладают сходной, но не идентичной структурой, что может влиять на уровень их шаперонной активности в одинаковых условиях.

Известно, что а-БТШ способны взаимодействовать со многими мишенями в клетке: ферментами (Ehrnsperger et al., 1997), мембранами (Tsvetkova et al., 2002), элементами цитоскелета (Mounier, Arrigo, 2002; Day et al., 2003). Для того, чтобы понять, с какого рода мишенями взаимодействует IbpA из А. laidlawii, мы исследовали локализацию белка в клетке микоплазмы методами иммуно-электронной микроскопии. Наблюдавшиеся картины распределения метки в клетках, подвергнутых воздействию теплового шока, мы условно разделили на 4 варианта. В первом варианте молекулы IbpA располагались вдоль неидентифицированных регулярных структур (рис. 8, а-ж): подобный вариант локализации был описан для а-БТШ 16 кДа из Mycobacterium bovis BCG (Cunningham, Spreadbury, 1998). Авторы предположили, что а-БТШ М. bovis взаимодействует с пептидогликаном микобактерий. Но у микоплазм отсутствует пептидогликановый слой вследствие утраты этими бактериями клеточной стенки. Ранее в клетках штамма А. laidlawii NCTC 10116 были

обнаружены элементы, напоминающие микротрубочки (Meloni et al., 1980). Мы показали наличие похожих элементов в клетках штамма A. laidlawii PG8 (рис. 9, а, о), ив ряде случаев очевидно, что метка ассоциирована с этими элементами (рис. 8, а, з, и). Мы предполагаем, что IbpA способен взаимодействовать с внутриклеточными структурами (вероятно, цитоскелет-подобными элементами) и может защищать эти структуры в условиях стресса.

Локализация IbpA в электронно-плотных областях клетки, так называемых «гранулярных тельцах», продемонстрирована на рис. 8, к-о. В некоторых случаях метка была организована в кластеры (.к). Кластеры располагались внутри клетки и были ассоциированы с «гранулярными тельцами». Внутри «гранулярных телец» отсутствуют какие-либо частицы, которые можно было бы идентифицировать как рибосомы. Таким образом, ассоциация IbpA с «гранулярными тельцами», вероятно, не связана с de novo синтезом этого белка в условиях теплового шока. Кластеры, образуемые а-БТШ в цитоплазме, были обнаружены также в клетках М. bovis (Cunningham, Sprcadbury, 1998) и Sligmatella aurantiaca (Lunsdorf et al., 1995). Природа «гранулярных телец», описанных в клетках ахолеплазм много лет назад, до сих пор остаётся неизученной. Предполагалось (Maniloff, 1970), что эти структуры могут представлять собою вариант септы (так как обнаруживаются и в области перетяжек между делящимися клетками микоплазм; наши данные - рис. 9, и), либо служат кладовыми для каких-либо продуктов клетки. В любом случае, IbpA может принимать участие в защите содержимого «гранулярных телец» в условиях стресса.

Частицы коллоидного золота наблюдали в области плазматической мембраны (рис. 8, п-с). Это не противоречит предположению о роли а-БТШ в поддержании целостности мембран: некоторые а-БТШ могут играть роль в регуляции текучести клеточных мембран и способны стабилизировать жидкокристаллическое состояние бислоя во время термических флуктуаций (Horvath et al., 1998; Tsvetkova et al., 2002). Подобная роль а-БТШ в клетках микоплазм, лишённых клеточной стенки, может быть тем более актуальной.

Помимо вышеописанных вариантов локализации IbpA, были обнаружены примеры распределения специфической метки в области перетяжек между делящимися клетками A. laidlawii (рис. 8, т-х). Мы предполагаем, что IbpA во время стресса может участвовать в стабилизации белков, вовлечённых в процесс деления клеток A. laidlawii. Известно, что у микоплазм отсутствуют практически все гены, кодирующие бактериальные белки, участвующие в цитокинезе. Исключением является ген ключевого белка деления прокариот - FtsZ (Вишняков, Борхсениус, 2007). Мы исследовали локализацию белка FtsZ в клетках М hominis и в основном этот белок обнаруживали в области перетяжки между делящимися

клетками микоплазм (Вишняков и др., 2009). Возможно, IbpA взаимодействует с филаментами FtsZ наподобие а-БТШ и тубулина эукариот.

Во всех случаях метку не обнаруживали в области нуклеоида, что соответствует данным для других а-БТШ (Lünsdorf et al., 1995; Cunningham, Spreadbury, 1998).

Выводы

1. Белок IbpA (pi7) является продуктом OPC ACL_0421 A. laidlawii. Последовательность белка состоит из 137 аминокислотных остатков, и центральная её часть содержит консервативный а-кристаллиновый домен.

2. Среди микоплазм гены, кодирующие гомологи а-БТШ, найдены только в геномах представителей семейства Acholeplasmataceae.

3. Рекомбинантный белок IbpA спонтанно формирует олигомерные комплексы in vitro (PBS lx, pH 7,4). В этом растворе IbpA представляет собой смесь мономеров и олигомеров, находящихся, вероятно, в динамическом равновесии, и состоящих из 2,4, 12 и 24 мономерных субъединиц.

4. Рекомбинантный белок IbpA in vitro обнаруживает зависимую от температуры шаперонную активность по отношению к инсулину п предотвращает агрегацию ряда растворимых белков из клеточного экстракта Е. coli при тепловой обработке (55 "С).

5. Продукция рекомбинантного белка IbpA клетками Е. coli повышает их теплоустойчивость в условиях сильного теплового шока (48 °С).

6. При тепловом шоке значительная часть молекул IbpA в клетке А. laidlawii ассоциирована с элементами клеточных структур.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Борхсениус С. Н., Вишняков И. Е., Буданцева Е. В., Вонский М. С., Якобе Е., Лазарев В. Н. Белок теплового шока а-кристаллинового типа из микоплазмы (Acholeplasma laidlawii) II Цитология. - 2008. - Т.50. - №7. - С.613-618.

2. Вишняков U.E., Борхсениус С.Н., Басовский Ю.И., Левицкий С.А., Лазарев В.Н., Снигиревская Е.С., Комиссарчик Я.Ю. Локализация белка деления FtsZ в клетках микоплазмы // Цитология. - 2009. - Т.51. - №3. - С.247-256.

3. Вишняков И.Е., Левицкий С.А., Лазарев В.Н., Айала Х.А., Иванов В.А., Снигиревская Е.С., Комиссарчик Я.Ю., Борхсениус С.Н. Олигомерные формы, функции и локализация в клетке белка а-кристаллинового типа из микоплазмы // Цитология. - 2010. - Т.52. - №11. - С.948-955.

Тезисы:

1. Вишняков И.Е., Снигиревская Е.С., Борхсениус С.Н., Комиссарчик Я.10. Модификация методов электронной микроскопии для структурного 'и иммуноцитохимического анализа микоплазм // XXII Российская конференция по электронной микроскопии, г. Черноголовка, 2-6 июня 2008 г., Тезисы докладов, с.260.

2. Вишняков И.Е., Иванов В.А., Левицкий С.А., Лазарев В.Н., Айала Х.А., Снигиревская Е.С., Комиссарчик Я.Ю., Борхсениус С.Н. Белок теплового шока а-кристаллинового типа из микоплазмы // 14-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология - наука XXI века», Пущино, 19-23 апреля 2010 г., Сборник тезисов, с. 121.

3. Вишняков И.Е., Борхсениус С.Н. О возможной роли белка а-кристаллинового типа в устойчивости клеток микоплазмы Acholeplasma laidlawii к стрессам // Политехнический симпозиум «Молодые учёные - промышленности Северо-Западного региона», 20 мая 2010 г., Материалы конференций, с.231.

4. Вишняков И.Е., Борхсениус С.Н., Иванов В.А., Левицкий С.А., Лазарев В.Н., Айала Х.А., Снигиревская Е.С., Комиссарчик Я.Ю. Структура, функции и локализация малого белка теплового шока а-кристаллинового типа в клетках микоплазмы Acholeplasma laidlawii /I Цитология. - 2010. - Т.52. -№6. - С.495.

5. Вишняков И.Е., Снигиревская Е.С., Борхсениус С.Н., Комиссарчик Я.Ю. Исследование малого белка теплового шока а-кристаллинового типа микоплазмы методами электронной микроскопии // XXIII Российская конференция по электронной микроскопии, г. Черноголовка, 31 мая - 4 июня 2010 г., Тезисы докладов, с.338-339.

6. Borchsenius S.N., Vonskii M.S., Budantseva E.V., Vishnyakov I.E., Jacobs E., Lazarev V.N. The heat shock protein of a-crystallin type from mycoplasma (Acholeplasma laidlawii) II 17"' International Congress of the International Organization for Mycoplasmology, Tianjin, China, July 6- ll'\ 2008, Abstracts, p. 126.

7. Borchsenius S.N., Vishnyakov I.E., Vonskii M.S., Ivanov V.A., Snigirevskaya E.S., Komissarchik Ya.Yu. The 17 kDa heat-shock protein in mycoplasma // Mycoplasmology - a review of developments over the last decade, Gran Canaria, Canary Islands, Spain, June, 10-12"', 2009, p.66.

8. Vishnyakov I.E., Levitskii S.A., Lazarev V.N., Ayala J.A., Ivanov V.A., Snigirevskaya E.S., Komissarchik Ya.Yu., Borchsenius S.N. A small heat-shock protein of a-crystallin type from Acholeplasma: oligomeric forms, functions and localization in the cell // 18"' International Congress of the International Organization for Mycoplasmology, Chianciano Terme, Italy, July 11-16"', 2010, Abstracts, p. 188.

Список цитируемой литературы

Вишняков И.Е., Борхсениус С.Н. 2007. Цитология. 49 (5): 421-429.

Вишняков И.Е., Борхсениус С.Н., Басовский Ю.И., Левицкий С.А.. Лазарев В.Н., Снигиревская Е.С., Комиссарчик Я.Ю. 2009. Цитология. 51 (3): 247-256.

Венский М.С., Аствацатурянц Г.В., Борхсениус С.Н. 1993. ДАН, 331 (1): 112-115. Вонский М.С., Усоскин Д.Г., Борхсениус С.Н. 1998. ДАН, 359 (2): 270-273. Венский М.С. 2001. Кандидатская диссертация. СПб. 121 стр.

Гарипова М.И., Киреева Н.А., Моругова Т.В., Елисеева О.Н., Перишна А.С. 2007. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А.Овчинникова, 3 (3): 27-32. Елисеева О.Н., Киреева Н.А., Першина А.С., Буторина О.Л., Бикбулатова СМ.. Гарипова МИ. 2009. Вестник ОГУ, 6: 476-478.

Касаткина Э.П. ¡996. Сахарный диабет у детей и подростков. М.: Медицина. 240 стр.

Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. 1994. СПб.: Наука. 400 стр.

Andersson S.G., Zomorodipour A., Andersson J.О.. Sicheritz-Ponten Т., Alsmark U.C., PodowskiR.M.,

NaslimdA.K., Eriksson A.S., Winkler H.H., KurlandC.G. 1998. Nature. 396(6707): 133-140.

Bai X., Zhang J., Ewing A., Miller S.A., Radek A.J., Shevchenko D.V., Tsukerman K., Walunas Т., Lapidus

A.. Campbell J.W., Hogenhout S.A. 2006. J. Bacterid. 188 (10): 3682-3696.

Borchsenius S. N„ Budantseva E. V.. Vonsky M. S. 1990. Stuttgart, New York: Gustav Fisher Verlag. 962 p.

Bradford М. 1976. Anal. Boichem. 72: 248-254.

Caspers G. J, LeimissenJ. A. M.. de Jong W. W. 1995. J. Mol. Evol. 40: 238-248.

Chernov V.M., Moukhametshina N.E., Gogolev Yu. V., Nesterova T.N., Trushin M. V., Chernova O.A. 2007.

TheScientificWorldJOURNAL. 7: 1-6.

Cunningham A.F., Spreadbury C.L. 1998. J. Bacteriol. 180: 801-808.

Dascher C.C., PoddarS.K.. ManiloffJ. 1990. J. Bacteriol. 172: 1823-1827.

DayR.M., Gupta J.S.. MacRae Т.Н. 2003. Cell Stress & Chaperones. 8: 183-193.

Ehrnsperger M, GräberS.. Gaestel M„ Büchner J. 1997. EMBO J. 16:221-229.

Ehrnsperger, M„ H. Lilie, M. Gaestel, and J. Büchner. 1999. J. Biol. Chem. 274: 14867-14874.

Fräser C.M., Gocayne J.D., НЪИе О.. Adams M.D., Clayton R.A., Fleischmann R.D., Bult C.J., Kerlavage

A.R., Sutton G„ KelleyJ.M., Fritchman R.D., Weidman J.F., Small K.V., Sandusky M„ Fuhrmann J., Nguyen

D„ Utterback T.R., SaudekD.M., Phillips C.A., Merrick J.M., Tomb J.F., Dougherty В. A., Bott K.F., Ни

P.C., Luder T.S., Peterson S.N., Smith И.О., Hutchison C.A. 3rd, Venter J.C. 1995. Science. 270 (5235):

397-403.

FreundtE. 1983. New York: Acad. Press. 1: 127—136.

Haslbeck M„ Walke S„ Stromer Т., Ehrnsperger M„ White H. E„ ChenS. X., Saibil H. R„ Buchner J. 1999. EMBO J. 18: 6744-6751.

HorväthL, GlatzA., Varvasovszki V., TörökZ., Pali Т., Balogh G„ Koväcs E„ NadasdiL., Benkö S„ Jod F., VighL. 1998. Proc. Natl. Acad. Sei. США 95: 3513-3518. HorwitzJ. 1992. Proc. Natl. Acad. Sei. США. 89: 10449-10453. Ivanov V. A.. Fei V. J. 1984. Neoplasma. 27: 745-750.

Jakob U„ Gaestel M„ Engel K.. Büchner J. 1993. J. Biol Chem. 268: 1517-1520.

Kim К. K, Kim R„ Kim S. H. 1998. Nature. 394: 595-599.

Laemmli U. K. 1970. Nature (London). 227: 680-685.

LindquistS. 1986. Ann. Rev. Biochem. 55:1151-1191.

LünsdorfH., Schairer H.U., Heidelbach M. 1995. J. Bacteriol. 177:7092-7099.

Meloni G.A.. Bertoloni G„ Busolo F.. Conventi L. 1980. J. General Microbiol. 116: 435-443.

ManiloffJ. 1970. J. Bacteriol. 102: 561-572.

Mounier N.. Arrigo A.-P. 2002. Cell Stress & Chaperones. 7: 167-176.

Nakamoto H„ Vlgh L. 2007. Cell. Mol. Life Sei. 64: 294-306.

Narberhaus F. 2002. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. 66: 64-93.

Oshima K„ Kakizawa S., Nishigawa H., Jung H. Y„ Wei W„ Suzuki S., Arashida R.., Nakata D„ Miyata S„ Ugaki M„ Namba S. 2004. Nat. Genet. 36: 27-29.

Sasaki Y„ Ishikawa J., Yamashita A., Oshima K„ Kenri Т., Furuya K., Yoshino С., Horino A., Shiba T„ Sasaki Т., Hattori M. 2002. Nucleic Acids Res. 30 (23): 5293-5300.

Shigenobu S„ Watanabe H„ Hattori M„ Sakaki Y„ Ishikawa H. 2000. Nature. 407 (6800): 81-86. Stephens R.S., Kaiman S., Lammel C.. Fan J, Marathe R„ AravindL., Mitchell W„ Olinger L., Tatusov R.L., Zhao Q„ Koonin E. V, Davis R. W. 1998. Science. 282 (5389): 754-759.

Sun Y„ Mansour M„ Crack J.A., Gass G.L.. MacRae Т.Н. 2004. J. Biol. Chem. 279 (38): 39999-40006. Tran-Nguyen L. Т., Kube M„ Schneider В.. Reinhardt R„ Gibb KS. 2008. J. Bacteriol. 190 (11): 3979-91. Tsvetkova N. M„ Horväth I.. Török Z., Wolkers W. F., Balogi Z., Shigapova N., Crowe L. M„ Tablin F., Vierling E., Crowe J. H„ Vlgh L. 2002. Proc. Natl. Acad. Sei. США. 99: 13504-13509. Westberg J., PerssonA., Holmberg A„ Goesmann A., Lundeberg J., Johansson K.E., Pettersson В., Uhlen M. 2004. Genome Res. 14 (2): 221-227.

White H. E„ Orlova E. V., Chen S„ Wang L„ Ignatiou A., Gowen В., Stromer Т., Franzmann Т. M„ Haslbeck М„ Buchner J., Saibil H. R. 2006. Structure. 14: 1197-1204. Wong P., Homy W. A. 2004. J. Struct. Biol. 146: 79-89.

Yeh C.-H, ChangP.-F. L„ Yeh K.-W, Lin W.-C., Chen Y.-M.. Lin C.-Y. 1997. Proc. Natl. Acad. Sei. США. 94: 10967-10972.

Yeh C.-H., Yeh K.-W., Wu S.-H., Chang P.-F., Chen Y.-M., Lin C.-Y. 1995. Plant Cell Physiol. 36: 1341-8. Yuan Y„ Crane D.D.. Bany C.E. 1996. J. Bacteriol. 178 (15): 4484-4492.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 03.03.2011. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 7263Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.:(812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вишняков, Иннокентий Евгеньевич

Введение.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна полученных результатов.

Теоретическое и практическое значение работы.

Апробация работы.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Контроль за качеством белков в бактериальной клетке.

1.2. Основные БТШ бактерий.

1.3. БТШ микоплазм: история открытия.

1.4. БТШ микоплазм: «гены и геномы».

1.5. Регуляция экспрессии генов БТШ в клетках микоплазм.

1.6. Структура, свойства и функции БТШ микоплазм.

1.7. Семейство БТШ а-кристаллинового типа (а-БТШ).

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей.

2.2. Бактериальные штаммы.

2.3. Клонирование гена.

2.4. Получение рекомбинантного белка.

2.5. Получение поликлональных антител.

2.6. Иммуноблотинг.

2.7. Тепловой шок.

2.8. Оценка молекулярной массы олигомеров.

2.9. Шаперонная активность рекомбинантного белка in vitro.

2.10. Оценка влияния рекомбинантного белка на агрегацию белков Е. coli in vitro при нагреве.

2.11. Оценка теплоустойчивости клеток Е. coli, продуцирующих рекомбинантный белок.

2.12. Электронная микроскопия.

Глава 3. Результаты.

3.1. Идентификация белка р17 и анализ его аминокислотной последовательности.

3.2. Рекомбинантный белок IbpA и поликлональные антитела против него.

3.3. Олигомерные формы рекомбинантного белка IbpA.

3.4. Шаперонная активность рекомбинантного белка IbpA in vitro.

3.5. Влияние рекомбинантного белка IbpA на агрегацию белков Е. coli in vitro при нагреве.

3.6. Теплоустойчивость клеток Е. coli в присутствии рекомбинантного IbpA.

3.7. Локализация белка IbpA в клетке A. laidlawii.

Глава 4. Обсуяадение.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и характеристика IbpA, малого белка теплового шока микоплазмы (Acholeplasma laidlawii)"

При подъеме температуры до сублетальных значений клетки как прокариот, так и эукариот приостанавливают синтез большинства обычных белков и увеличивают скорость синтеза особого набора белков, называемых БТШ. БТШ были обнаружены у многих эукариот и бактерий (Опс^шв^ 1986). Микоплазмы (класс МоШсЩсб) не составили исключение. БТШ микоплазм впервые были выявлены в Лаборатории структурной организации генома Института цитологии РАН (ВогсИзешиз е! а1., 1990). Было показано, что при увеличении температуры с 32 до 44 °С на 2 ч клетки Ас1го1ер1ахта 1аШ1а\ш ускоряют синтез девяти полипептидов на фоне подавления синтеза остальных белков, причем в наибольшей степени возрастает количество полипептидов с молекулярной массой 72, 65, 17 и 10 кДа. Наличие БТШ у микоплазм, при том, что геномы этих микроорганизмов значительно редуцированы, указывает на фундаментальное значение БТШ для жизнеобеспечения клетки, в том числе «минимальной». Синтез БТШ у ряда микоплазм был независимо показан и другими авторами (БазсЬег ег а1., 1990).

1 Позже синтез БТШ у микоплазм нескольких видов был исследован методом иммуноблотинга с использованием поликлональных антител к БТШ 70 человека и бактериальным белкам ОгоЕЬ и СгоЕБ. При этом полипептид с молекулярной массой 72 кДа, синтезируемый клетками А. кйс11а\\'П, был идентифицирован как шаперон БпаК (бактериальный аналог БТШ 70 человека), а полипептиды 65 и 10 кДа - как аналоги известных бактериальных шаперонов вгоЕЬ и ОгоЕБ, соответственно (Вонский и др., 1993). Ген, кодирующий БпаК Л. ШсНаюИ, был секвенирован. Малый БТШ (17кДа), условно обозначенный как р17, не был идентифицирован и охарактеризован, однако были прочитаны 15 аминокислот с его М-конца (Вонский, 2001). Уровень синтеза р17 в условиях теплового шока возрастал многократно, количество р17 увеличивалось до 7,2 % от общего количества белков в клетке. Другие БТШ накапливались в клетках А. 1тй1а\чи в меньшем количестве (Вонский и др., 1993). Вероятно, роль р17 в ответе на тепловой шок весьма важна для клеток А. 1шс11аыИ. Мы предположили, что в соответствии с молекулярной массой р17 может относиться к семейству белков теплового шока а-кристаллинового типа (а-БТШ). а-БТШ исследованы у многих бактерий, животных, растений и некоторых архей. Известно, что молекулярная масса а-БТШ у разных организмов варьирует от 10 до 43 кДа, причем размер большинства из них 14-27 кДа. Члены многочисленного семейства а-БТШ обладают общими свойствами: 1) наличием а-кристаллинового домена, 2) способностью к формированию олигомеров, 3) шаперонной активностью олигомерной формы (КагЬегЬаиэ,

2002). В условиях стресса а-БТШ связываются с частично денатурированными полипептидными цепями, предотвращая их необратимую денатурацию и агрегацию (Horwitz, 1992). В отличие от шаперонов GroEL и DnaK, а-БТШ не нуждаются в АТФ (Jakob et al., 1993). Предполагают, что а-БТШ интегрированы в мультишаперонную сеть, строго контролирующую качество белков в клетке (Wong, Houry, 2004). Кроме того, а-БТШ играют роль в регуляции текучести клеточных мембран: они способны стабилизировать жидкокристаллическое состояние бислоя и поддерживать целостность мембраны во время термических флуктуаций (Horváth et al., 1998; Tsvetkova et al., 2002). Некоторые а-БТШ эукариот взаимодействуют с белками цитоскелета и защищают их в условиях стресса (Mounier, Arrigo, 2002; Day et al., 2003).

Интересно, что среди прокариот значительная часть исследованных а-БТШ была обнаружена у микроорганизмов, образующих покоящиеся стадии. Например, гомолог а-БТШ с молекулярным весом 16кДа считается маркером латентных форм Mycobacterium tuberculosis (Cunningham, Spreadbury, 1998). Понимание роли, которую играют а-БТШ у прокариот в покоящихся стадиях, в состоянии повышенной устойчивости к различным стрессам, может привести к разработке новых стратегий лечения болезней, вызываемых персистирующими патогенными микроорганизмами. Клетки A. laidlawii при неблагоприятных условиях способны образовывать так называемые ультрамикроформы, отличающиеся от обычных клеток меньшим размером, повышенной устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессовым факторам и фитопатогенностью (Chernov et al., 2007). Мы предполагаем, что основная роль при этом принадлежит системе ответа на стресс, в состав которой должен входить исследуемый нами малый белок теплового шока.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было идентифицировать и охарактеризовать малый белок теплового шока (р17) A. laidlawii. В рамках поставленной цели были определены следующие задачи:

3) клонировать ген, кодирующий р17, в экспрессирующем векторе, получить рекомбинантный белок и поликлональные антитела к нему;

4) проверить, образует ли исследуемый белок олигомерные формы;

5) проверить наличие у белка р17 шаперонной активности;

Научная новизна полученных результатов

Свойства и функции малого белка теплового шока из микоплазмы исследованы впервые. Показано, что этот белок принадлежит к семейству шаперонов а-кристаллинового типа и обладает основными свойствами белков этого семейства: 1) наличием консервативного а-кристаллинового домена; 2) способностью к спонтанной олигомеризации in vitro; 3) температуро-зависимой шаперонной активностью in vitro. Кроме того, установлено, что рекомбинантный а-БТШ A. laidlawii защищает некоторые белки клеточного экстракта Е. coli от агрегации при воздействии высокой температуры и повышает устойчивость трансформированных клеток Е. coli к тепловому шоку. Впервые исследована локализация а-БТШ в клетке микоплазмы и показана его ассоциация с элементами клеточных структур.

Теоретическое и практическое значение работы

Исследование механизмов жизнеобеспечения наиболее просто устроенной клетки, способной к самостоятельному воспроизведению (каковыми являются клетки микоплазм), в т. ч. системы ответа на стресс, имеет фундаментальное значение для понимания основных принципов функционирования любой клетки. Протективная роль белка IbpA, обнаруженная в модельных экспериментах с клетками Е. coli, позволяет утверждать, что он способен выполнять защитную функцию в клетках. Данные по локализации IbpA в клетке микоплазмы являются существенным вкладом в исследование свойств а-БТШ прокариот, так как в мировой литературе есть всего несколько подобных работ, выполненных на других микроорганизмах. Результаты работы могут быть полезны при дальнейших исследованиях механизмов ответа на стресс у микоплазм. Для получения результатов по локализации а-КТТТТ в клетках А. laidlawii были адаптированы методы иммуно-электронной микроскопии, которые могут быть использованы для исследования микоплазм и других мини-клеток, изучение которых методами световой и фазово-контрастной микроскопии невозможно из-за их маленького размера.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 журнальные статьи. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Mycoplasmology - a review of developments over the last decade» (Гран-Канария, Испания, 10-12 июня 2009 г.); 17-м (Тяньцзинь, Китай, 6-11 июля 2008 г.) и 18-м (Кьянчано Терме, Италия, 11-16 июля 2010 г.) Международных конгрессах ЮМ (International Organization for Mycoplasmology); XXII (Черноголовка, 2-6 июня 2008 г.) и ХХШ (31 мая - 4 июня 2010 г.) Российских конференциях по электронной микроскопии (РКЭМ); П Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 15-16 февраля 2010 г.); 14-й Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.); Политехническом симпозиуме «Молодые учёные — промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 20 мая 2010 г.) и на заседании объединённого научного семинара Лаборатории структурной организации генома, Лаборатории цитологии опухолевого роста, Лаборатории регуляции экспрессии генов, Отдела клеточных культур и Группы ультраструктуры клеточных мембран Института цитологии РАН 29 ноября 2010 г.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Вишняков, Иннокентий Евгеньевич

Выводы:

1. Белок IbpA (р17) является продуктом ОРС ACL0421 A. laidlawii. Последовательность белка состоит из 137 аминокислотных остатков, и центральная её часть содержит консервативный а-кристаллиновый домен.

3. Рекомбинантный белок IbpA спонтанно формирует олигомерные комплексы in vitro (PBS lx, pH 7,4). В этом растворе IbpA представляет собой смесь мономеров и олигомеров, находящихся, вероятно, в динамическом равновесии, и состоящих из 2, 4, 12 и 24 мономерных субъединиц.

4. Рекомбинантный белок IbpA in vitro обнаруживает зависимую от температуры шаперонную активность по отношению к инсулину и предотвращает агрегацию ряда растворимых белков из клеточного экстракта Е. coli при тепловой обработке (55 °С).

Заключение

IbpA (р 17) из А. laidlawii является малым белком теплового шока а-кристаллинового типа, поскольку обладает характерными для этого семейства белков свойствами: 1) наличием консервативного а-кристаллинового домена; 2) способностью к спонтанной олигомеризации in vitro; 3) шаперонной активностью по отношению к инсулину как модельному субстрату. При этом а-БТШ из микоплазмы является эффективным шапероном только в условиях повышенной температуры, наподобие Hsp26 из дрожжей S. cerevisiae.

Рекомбинантный а-БТШ из А. laidlawii защищает некоторые белки клеточного экстракта Е. coli от денатурации и агрегации при воздействии высокой температуры и повышает устойчивость трансформированных клеток Е. coli к тепловому шоку. Вероятно, IbpA А. laidlawii выполняет шаперон-подобную функцию и в клетках микоплазм.

В условиях теплового шока значительная часть молекул IbpA в клетке А. laidlawii ассоциирована с элементами клеточных структур. Мы предполагаем, что а-БТШ из микоплазмы может иметь множественные мишени в клетке и участвовать в стабилизации различных структур во время теплового шока. С какими именно мишенями взаимодействует IbpA в клетках А. laidlawii, ещё предстоит установить.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вишняков, Иннокентий Евгеньевич, Санкт-Петербург

1. Вишняков И.Е., Борхсениус С.Н. 2007. Белок FtsZ и цитокинез у бактерий. Цитология. 49 (5): 421-429.

2. Вишняков И.Е., Борхсениус С.Н., Басовский Ю.И., Левицкий С.А., Лазарев В.Н., Снигиревская Е.С., Комиссарчик Я.Ю. 2009. Локализация белка деления FtsZ в клетках микоплазмы. Цитология. 51 (3): 247-256.

3. Вонский М.С., Аствацатурянц Г.В., Борхсениус С.Н. 1993. Экспрессия белков теплового шока у микоплазм. ДАН, 331 (1): 112-115.

4. Вонский М.С. 2001. Белки теплового шока микоплазм: клонирование и экспрессия гена dnaK. Кандидатская диссертация. СПб. 121 стр.

5. Медведева Е.С. 2010. Адаптация Acholeplasma laidlawii PG8 к условиям среды: морфологические, ультраструктурные, патогенные и молекулярно-генетические аспекты. Кандидатская диссертация. Казань. 181 стр.

6. Миронов А. А., Комиссарчик Я. Ю., Миронов В. А. 1994. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине: Методическое руководство. СПб.: Наука. 400 с.

7. Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. 2003. Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биологической химии. 43: 59-98.

8. Akiyama Y., Ehrmann M., Kihara A., Ito K. 1998. Polypeptide binding of Escherichia coli FtsH (HflB). Mol. Microbiol. 28: 803-812.

9. Albanese V., Yam A.Y., Baughman J., Parnot C., Frydman J. 2006. Systems analyses reveal two chaperone networks with distinct functions in eukaryotic cells. Cell. 124: 75-88.

10. Allen S.P., Polazzi J.O., Gierse J.K., Easton A.M. 1992. Two novel heat shock genes encoding proteins produced in response to heterologous protein expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174: 6938-6947.

11. Arai H., Atomi Y. 1997. Chaperone Activity of aB-crystallin Suppresses Tubulin Aggregation through Complex Formation. Cell Structure and Function. 22: 539-544.

12. Barbirz S., Jakob U., Glocker M.O. 2000. Mass spectroscopy unravels disulfide bond formation as the mechanism that activates a molecular chaperone. J. Biol. Chem. 275: 1875918766.

13. Barker E.N., Helps C.R., Peters I.R., Darby A.C., Radford A.D., Tasker S. 2011. Complete genome sequence of Mycoplasma haemofelis, a hemotropic mycoplasma (Direct Submittion).

14. Bencina D., Slavec B., Narat M. 2005. Antibody response to GroEL varies in patients with acute Mycoplasma pneumoniae infection. FEMS Immun. Med. Microbiol. 43(3): 399-406.

15. Bercic R.L., Slavec B., Lavric M., Narat M., Bidovec A., Dove P., Bencina D. 2008. Identification of major immunogenic proteins of Mycoplasma synoviae isolates. Vet Microbiol. 127(1-2): 147-54.

16. Birren B.W., Stange-Thomann N. Hafez N. DeCaprio D., Fisher S., Butler J., Elkins T., Kodira C.D., Major J., Wang S., Nicol R„ Nusbaum C„ Knight T. Jr., Fournier G. 2004. The complete genome sequence of Mesoplasma florum LI (Direct Submission).

17. Boelens W.C., Croes Y., de Jong W.W. 2001. Interaction between aB-crystallin and the human 20S proteasomal subunit C8/alpha7. Biochim. Biophys. Acta 1544: 311-319.

18. Boelens W.C., Croes Y„ de Ruwe M., de Reu L., de Jong W.W. 1998. Negative charges in the C-terminal domain stabilize the alphaB-crystallin complex. J. Biol. Chem. 273: 28085-28090.

19. Borchsenius S.N., Budantseva E.V., Vonsky M.S. 1990. The heat-shock proteins of Acholeplasma laidlawii. Zentralbl. Bakteriol. Suppl. 20: 657-658. In: Stuttgart, New York: Gustav Fisher Verlag. 962 p.

20. Bradford M. 1976. A rapid and sencitive method for quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Boichem. 72: 248-254.

21. Buchner J. 1999. Hsp90 & Co. a holding for folding. Trends Biochem. Sei. 24: 136-141.

22. Bukau B., Deuerling E., Pfund C., Craig E.A. 2000. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101: 119-122.

23. Bukau B., Horwich A.L. 1998. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell. 92: 351-366.

24. Calderon-Copete S.P., Wigger G., Wunderlin C., Schmidheini T., Frey J., Quail M.A., Falquet L. 2009. The Mycoplasma conjunctivae genome sequencing, annotation and analysis. BMC Bioinformatics. 10(Suppl 6): S7.

25. Caspers G.J., Leunissen J.A.M., de Jong W.W. 1995. The expanding small heat-shock protein family, and structure predictions of the conserved "alpha-crystallin domain". J. Mol. Evol. 40: 238-248.

26. Chang L.J., Chen W.H., Minion F.C., Shiuan D. 2008. Mycoplasmas regulate the expression of heat-shock protein genes through CIRCE-HrcA interactions. Biochem Biophys Res Commun. 367(1): 213-8.

27. Chattin-Kacouris B.R., Ishihara K., Miura T., Okuda K., Ikeda M., Ishikawa T., Rowland R. 2002. Heat shock protein of Mycoplasma salivarium and Mycoplasma orale strains isolated from HIV-seropositive patients. Bull Tokyo Dent Coll. 43(4): 231-6.

28. Chen Y.-L., Wang S.-N., Yang W.-J., Chen Y.-J., Lin H.-H., Shiuan D. 2003. Expression and Immunogenicity of Mycoplasma hyopneumoniae Heat Shock Protein Antigen P42 by DNA Vaccination. Infect. Immun. 71(3): 1155-1160.

29. Chernov V.M., Moukhametshina N.E., Gogolev Yu.V., Nesterova T.N., Trushin M.V., Chernova O.A. 2007. Acholeplasma laidlawii PG8 culture adapted to unfavorable growth conditions shows an expressed phytopathogenicity. The Scientific World Journal. 7: 1-6.

30. Clark G.W., Tillier E.R. 2010. Loss and gain of GroEL in the Mollicutes. Biochem Cell Biol. 88: 185-194.

31. Cloward J.M., Krause D.C. 2010. Functional domain analysis of the Mycoplasma pneumoniae co-chaperone TopJ. Mol Microbiol. 77(1): 158-69.

32. Csermely P., Korcsmaros T., Kovacs LA., Szalay M.S., Soti C. 2007. Systems biology of molecular chaperone networks. Novartis Foundation Symposium 291: The biology of extracellular molecular chaperones. Wiley, Chichester, p.45-58.

33. Cunningham A.F., Spreadbury C.L. 1998. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton a-crystallin homolog. J. Bacteriol. 180: 801-808.

34. Dascher C.C., Poddar S.K., Maniloff J. 1990. Heat shock response in mycoplasmas, genome-limited organisms. J. Bacteriol. 172: 1823-1827.

35. Derre I., Rapoport G., Msadek T. 1999. CtsR, a novel regulator of stress and heat shock response, controls clp and molecular chaperone gene expression in Gram-positive bacteria. Mol. Microbiol. 31: 117-131.

36. Deuerling E., Schulze-Specking A., Tomoyasu T., Mogk A., Bukau B. 1999. Trigger factor and DnaK cooperate in folding of newly synthesized proteins. Nature. 400: 693-696.

37. Dybvig K., Zuhua C., Lao P., Jordan D.S., French C.T., Tu A.H., Loraine A.E. 2008. Genome of Mycoplasma arthritidis. Infect. Immun. 76 (9): 4000-4008.

38. Ehrnsperger M., Graber S., Gaestel M., Buchner J. 1997. Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EMBO J. 16: 221-229.

39. Ehrnsperger, M., Lilie H., Gaestel M., and Buchner J. 1999. The dynamics of Hsp25 quaternary structure. Structure and function of different oligomeric species. J. Biol. Chem. 274: 14867-14874.

40. Ellis R.J. 2005. Chaperomics: in vivo GroEL function defined. Curr. Biol. 15(17): R661-663.

41. Falah M., Gupta R.S. 1997. Phylogenetic analysis of mycoplasmas based on Hsp70 sequences: cloning of the dnaK (hsplO) gene region of Mycoplasma capricolum. Int. J. Syst. Bacteriol. 47(1): 38-45.

42. Farnsworth P.N., Singh K. 2000. Self-complementary motifs (SCM) in alpha-crystallin small heat shock proteins. FEBS Lett. 482: 175-179.

43. Fayet O., Ziegelhofer T., Georgopoulos C. 1989. The groES and groEL heat shock gene products of Escherichia coli are essential for bacterial growth at all temperatures. J. Bacteriol. 171: 1379-1385.

44. Franzmann T.M., Wuhr M., Richter K., Walter S., Buchner J. 2005. The activation mechanism of Hsp26 does not require dissociation of the oligomer. J. Mol. Biol. 350: 10831093.

45. Fräser C.M., Gocayne J.D., White O., Adams M.D., Clayton R.A., Fleischmann R.D., Bult

46. Freundt E. 1983. Culture media for classical mycoplasmas. In: Methods in mycoplasmology. New York: Acad. Press. 1: 127-136.

47. Fujiwara K., Ishihama Y., Nakahigashi K., Soga T., Taguchi H. 2010. A systematic survey of in vivo obligate chaperonin-dependent substrates. EMBO J. 29: 1552-1564.

48. Gil R., Silva F.J., Perety J., Moya A. 2004. Determination of the Core of a Minimal Bacterial Gene Set. Microbiol Mol Biol Rev. 68 (3): 518-537.

49. Ginalski K., Elofsson A., Fischer D., Rychlewski L. 3D-Jury: a simple approach to improve protein structure predictions. Bioinformatics. 2003. 19(8): 1015-1018.

50. Glass J.I., Durkin A.S., Hostetier J., Jackson J., Johnson J., May M.A., Paralanov V., Radune

51. D., Szczypinski B., Brown D.R. 2010. The complete genome sequence of Mycoplasma crocodyli MP 145 (Direct Submission).

52. Glass J.I., Lartigue C., Pfannkoch C., Baden-Tillson H., Smith H.O., Venter J.C., Roske K., Wise K.S., Calcutt M.J., Nelson W.C., Nierman W.C. 2005. The complete sequence of Mycoplasma capricolum subsp. capricolum ATCC 27343 (Direct Submission).

53. Glass J.I., Lefkowitz E.J., Glass J.S., Heiner C.R., Chen E.Y., Cassell G.H. 2000. The complete sequence of the mucosal pathogen Ureaplasma urealyticum. Nature. 407(6805): 757-62.

54. Glover J.R., Lindquist S. 1998. Hspl04, Hsp70, and Hsp40: A novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell 94: 73-82.

55. Gottesman S., Wickner S., Maurizi M.R. 1997. Protein quality control: triage by chaperones and proteases. Genes Dev. 11: 815-823.

56. Guo Z., Cooper L.F. 2000. An N-terminal 33-amino-acid-deletion variant of hsp25 retains oligomerization and functional properties.Biochem. Biophys. Res. Commun. 270: 183-189.

57. Hartl F.U., Hayer-Hartl M. 2009. Converging concepts of protein folding in vitro and in vivo. Nat. Struct. Mol. Biol. 16: 574-581.

58. Haslbeck M., Walke S., Stromer T., Ehrnsperger M., White H. E., Chen S. X., Saibil H. R., Buchner J. 1999. Hsp26: a temperature-regulated chaperone. EMBO J. 18: 6744-6751.

59. Hecker M., Schumann W., Volker U. 1996. Heat-shock and general stress response in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 19: 417-428.

60. Henriques A.O., Beall B.W., Moran C.P. 1997. CotM of Bacillus subtilis, a member of the a-crystallin family of stress proteins, is induced during development and participates in spore outer coat formation. J. Bacteriol. 179: 1887-1897.

61. Herman, C., Thevenet, D., Bouloc, P., Walker G.C., D'Ari R. 1998. Degradation of carboxy-terminal-tagged cytoplasmic proteins by the Escherichia coli protease HflB (FtsH). Genes Dev. 12: 1348-1355.

62. Himmelreich R., Hilbert H„ Plagens H„ Pirkl E., Li B.C., Herrmann R. 1996. Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae. Nucleic Acids Res. 24: 4420-4449.

63. Himmelreich R., Plagens H., Hilbert H. et al. 1997. Comparative analysis of the genome of the bacteria Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma genitalium II Nucl. Acids Res. Vol. 25. P. 701-712.

64. Horwich A.L., Weber-Ban E.U., Finley D. 1999. Chaperone rings in protein folding and degradation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 11033-11040.

65. Horwitz J. 1992. a-Crystallin can function as a molecular chaperone. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89: 10449-10453.

66. Hutchison C.A., HI, Petterson S.N., Gill S.R., Cline R.T., White O., Fräser C.M., Smith H.O., Venter J.C. 1999. Global transposon mutagenesis and a minimal Mycoplasma genome. Science. 286(5447): 2165-2169.

67. Ishikawa T., Beuron F., Kessel M., Wickner S., Maurizi M.R., Steven A.C. 2001. Translocation pathway of protein substrates in ClpAP protease. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 4328-4333.

68. Ivanov V.A., Fel V.J. 1984. On some similarity between membrane antigens of the cell of Zajdela hepatoma and liver of rats subjected to a single 4-dimethylaminoazobenzene injection. Neoplasma. 27: 745-750.

69. Jakob U., Gaestel M., Engel K., Buchner J. 1993. Small heat shock proteins are molecular chaperones. J. Biol Chem. 268: 1517-1520.

70. Jakob U., Lilie H., Meyer I., Buchner J. 1995. Transient interaction of Hsp90 with early unfolding intermediates of citrate synthase. Implications for heat shock in vivo. J. Biol. Chem. 270: 7288-7294.

71. Jiao W., Li P., Zhang J., Zhang H., Chang Z. 2005. Small heat-shock proteins function in the insoluble protein complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 335: 227-231.

72. Kandror O., Busconi L., Sherman M., Goldberg A.L. 1994. Rapid degradation of an abnormal protein in Escherichia coli involves the chaperones GroEL and GroES. J Biol Chem. 269: 23575-23582.

73. Kannan T.R., Musatovova O., Gowda P., Baseman J.B. 2008. Characterization of a Unique ClpB Protein of Mycoplasma pneumoniae and Its Impact on Growth. Infect. Immun. 76(11): 5082-5092.

74. Kedersha N.L., Gupta M., Li W„ Miller I., Anderson P. 1999. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2a to the assembly of mammalian stress granules. J. Cell Biol. 147: 1431-1442.

75. Kennaway C.K., Benesch J.L., Gohlke U., Wang L., Robinson C.V., Orlova E.V., Saibil H.R., Keep N.H. 2005. Dodecameric structure of the small heat shock protein Acrl from Mycobacterium tuberculosis. J. Biol. Chem. 280: 33419-33425.

76. Kerner M.J., Naylor D.J., Ishihama Y., Maier T., Chang H.C., Stines A.P., Georgopoulos C., Frishman D., Hayer-Hartl M., Mann M., Hartl F.U. 2005. Proteome-wide analysis of chaperonin-dependent protein folding in Escherichia coli. Cell. 122(2): 209-220.

77. Kim K. K., Kim R., Kim S. H. 1998. Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature. 394: 595-599.

78. Kim R., Kim K.K., Yokota H., Kim S.H. 1998a. Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9129-9133.

79. Kobayashi K. et al. 2003. Essential Bacillus subtilis genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 4678^1683.

80. Kokke B.P., Leroux M.R., Candido E.P., Boelens W.C., de Jong W.W. 1998. Caenorhabditis elegans small heatshock proteins Hspl2.2 and Hspl2.3 form tetramers and have no chaperone-like activity. FEBS Lett. 433: 228-232.

81. Kube M., Schneider B., Kuhl H., Dandekar T., Heitmann K., Migdoll A.M., Reinhardt R., Seemuller E. 2008. The linear chromosome of the plant-pathogenic mycoplasmas «Candidatus Phytoplasma mali». BMC Genomics. 9: 306.

82. Kuczynska-Wisnik D., Laskowska E., Taylor A. 2001. Transcription of ibpB heat shock gene is under control of a32- and o54-promoters, a third regulon of heat-shock response. Biochem. Biophys. Res. Commun. 284: 57-64.

83. Kusukawa N., Yura T., Ueguchi C., Akiyama Y., Ito K. 1989. Effects of mutations in heat-shock genes groES and groEL on protein export in Escherichia coli. EMBO J. 8: 3517-3521.

84. Laemmli U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (London). 227: 680-685.

85. Lambert H., Charette S.J., Bernier A.F., Guimond A., Landry J. 1999. HSP27 Multimerization Mediated by Phosphorylation-sensitive Intermolecular Interactions at the Amino Terminus. J. Biol. Chem. 274(14): 9378 -9385.

86. Lee S.Y., Prochaska D.J., Fang F., Barnum S.R. 1998. A 16.6-kilodalton protein in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 plays a role in the heat shock response. Curr. Microbiol. 37: 403-407.

87. Leroux M.R., Ma B.J., Batelier G., Melki R., Candido E.P.M. 1997. Unique structural features of a novel class of small heat shock proteins. J. Biol. Chem. 272: 12847-12853.

88. Lindner R.A., Treweek T.M., Carver J.A. 2001. The molecular chaperone alpha-crystallin is in kinetic competition with aggregation to stabilize a monomeric molten-globule form of alpha-lactalbumin. Biochem. J. 354: 79-87. •

89. Lindquist S. 1986. The heat-shock response. Ann. Rev. Biochem. 55: 1151-1191.

90. Liu W., Fang L., Li S., Li Q., Zhou Z., Feng Z, Luo R., Shao G., Wang L., Chen H., Xiao S. 2010. Complete genome sequence of Mycoplasma hyorhinis strain HUB-1. J. Bacteriol. 192(21): 5844-5845.

91. Lluch-Senar M., Querol E., Pinol J. 2010. Cell division in a minimal bacterium in the absence offtsZ. Mol. Microbiol. 78(2): 278-289.

92. Liinsdorf H., Schairer H.U., Heidelbach M. 1995. Localization of the stress protein SP21 in indole-induced spores, fruiting bodies, and heat shocked cells of Stigmatella aurantiaca. J. Bacteriol. 177: 7092-7099.

93. Madsen M.L., Nettleton D„ Thacker E.L., Edwards R., Minion F.C. 2006. Transcriptional Profiling of Mycoplasma hyopneumoniae during Heat Shock Using Microarrays. Infect. Immun. 74(1): 160-166.

94. Macario A.J., Conway de Macario E. 2001. The molecular chaperone system and other antistress mechanisms in archaea. Frontiers Biosci. 6: 262-283.

95. Maniloff J. 1970. Ultrastructure of Mycoplasma laidlawii during culture development. J. Bacteriol. 102: 561-572.

96. Meloni G.A., Bertoloni G., Busolo F., Conventi L. 1980. Colony morphology, ultrastructure and morphogenesis in Mycoplasma hominis, Acholeplasma laidlawii and Ureaplasma urealyticum. J. General Microbiol. 116: 435-443.

97. Minion F.C., Lefkowitz E.J., Madsen M.L., Cleary B.J., Swartzell S.M., Mahairas G.G. 2004. The genome sequence of Mycoplasma hyopneumoniae strain 232, the agent of swine mycoplasmosis. J. Bacteriol. 186 (21): 7123-7133.

98. Mogk A., Tomoyasu T„ Goloubinoff P., Rudiger S., Roder D., Langen H., Bukau B. 1999. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18: 6934-6949.

99. Moran N.A. 2002. Microbial minimalism: genome reduction in bacterial pathogens. Cell. 108(5): 583-586.

100. Mounier N., Arrigo A.-P. 2002. Actin cytoskeleton and small heat shock proteins: how do they interact? Cell Stress & Chaperones. 7: 167-176.

101. Munchbach M., Nocker A., Narberhaus F. 1999. Multiple small heat shock proteins in rhizobia. J. Bacteriol. 181: 83-90.

102. Musatovova O., Dhandayuthapani S., Baseman J.B. 2006. Transcriptional heat shock response in the smallest known self-replicating cell, Mycoplasma genitalium. J. Bacteriol. 188(8): 2845-2855.

103. Nakamoto H., Vigh L. 2007. The small heat shock proteins and their clients. Cell. Mol. Life Sci. 64: 294-306.

104. Narberhaus F. 1999. Negative regulation of bacterial heat shock genes. Mol. Microbiol. 31(1): 1-8.

105. Narberhaus F. 2002. a-Crystallin-type heat shock proteins: socializing minichaperones in the context of a multichaperone network. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. 66: 64-93.

106. Netzer W.J., Hartl F.U. 1998. Protein folding in the cytosol: chaperonin-dependent and -independent mechanisms. Trends Biochem. Sci. 23(2): 68-73.

107. Nocker A., Hausherr T., Balsiger S., Krstulovic N.P., Hennecke H., Narberhaus F. 2001. A mRNA-based thermosensor controls expression of rhizobial heat shock genes. Nucleic Acids Res. 29: 4800-4807.

108. Oshima K., Kakizawa S., Nishigawa H., Jung H.Y., Wei W., Suzuki S., Arashida R., Nakata D., Miyata S., Ugaki M., Namba S. 2004. Reductive evolution suggested from the complete genome sequence of a plant-pathogenic phytoplasma. Nat. Genet. 36: 27-29.

109. Paek K.H., Walker G.C. 1987. Escherichia coli clnaK mutants are inviable at high temperatures. J. Bacteriol. 169: 283-290.

110. Panaretou B., Prodromou C., Roe S.M., Obrien R., Ladbury J.E., Piper P.W., Pearl L.H. 1998. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. EMBO J. 17: 4829-4836.

111. Plesofsky-Yig N., Brambl R. 1995. Disruption of the gene for hsp30, an a-crystallin-related heat shock protein of Neurospora crassa, causes defects in thermotolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 5032-5036.

112. Raman B., Ramakrishna T., Rao C.M. 1995. Temperature dependent chaperone-like activity of alpha-crystallin. FEBS Lett. 365: 133-136.

113. Razin S.H., Herrmann R. 2002. Molecular Biology and Pathogenicity of Mycoplasmas. Plenum Publishers, New York, NY.

114. Razin S., Yogev D., Naot Y. 1998. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(4): 1094-1156.

115. Richmond C.S., Glasner J.D., Mau R., Jin H., Blattner F.R. 1999. Genome-wide expression profiling in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 27: 3821-3835.

116. Schulz A., Tzschaschel B., Schumann W. 1995. Isolation and analysis of mutants of the dnaK operon of Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 15:421-429.

117. Segal G., Ron E.Z. 1998. Regulation of heat-shock response in bacteria. Ann. N. Y. Acad. Sci. 851: 147-151.

118. Schonfeld H.J., Schmidt D„ Schroder H., Bukau B. 1995. The DnaK chaperone system of Escherichia coli: quaternary structures and interactions of the DnaK and GrpE components. J Biol Chem. 270 (5): 2183-9.

119. Servant P., Grandvalet C., Mazodier P. 2000. The RheA repressor is the thermosensor of the HSP18 heat shock response of Streptomyces albus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 35383543.

120. Shearstone J.R., Baneyx F. 1999. Biochemical characterization of the small Heat shock protein IbpB from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 274: 9937-9945.

121. Shigenobu S., Watanabe H., Hattori M., Sakaki Y., Ishikawa H. 2000. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407 (6800): 81-86.

122. Shrivastava S., Methe B.A., Glass J., White K., Duffy L.B. 2008. Genome sequence of Ureaplasma urealyticum serovar 10 ATCC-33699 (Direct Submission).

123. Smykal P., Masin J., Hrdy I., Konopasek I., Zarsky V. 2000. Chaperone activity of tobacco HSP18, a small heat-shock protein, is inhibited by ATP. Plant J. 23: 703-713.

124. S0ndergiird-Andersen J., Jensen J.S., Uldum S.A., Lind K. 1990. Heat-shock protein in Mycoplasma pneumoniae shown by immunoblotting to be related to the bacterial common antigen. J. Infect. Dis. 161(5): 1039-1040.

125. Soti C., Pal C., Papp B., Csermely P. 2005. Chaperones as regulatory elements of cellular networks. Curr Opin Cell Biol. 17: 210-215.

126. Spiess C., Beil A., Ehrmann M. 1999. A temperature-dependent switch from chaperone to protease in a widely conserved heat shock protein. Cell. 97: 339-347.

127. Squires C.L., Pedersen S„ Ross B.M., Squires C. 1991. ClpB is the Escherichia coli heat shock protein. J. Bacteriol. 173: 4254-4262.

128. Studer S., Narberhaus F. 2000. Chaperone activity and homo- and hetero-oligomer formation of bacterial small heat shock proteins. J. Biol. Chem. 275: 37212-37218.

129. Su H.-C., Hutchison C.A, III, Giddings M.C. 2007. Mapping phosphoproteins in Mycoplasma genitalium and Mycoplasma pneumoniae. BMC Microbiology. 7(1): 63.

130. Sun T.X., Liang JJ.N. 1998. Intermolecular exchange and stabilization of recombinant human aA- and aB-crystallin. J. Biol. Chem. 273: 286-290.

131. Sun Y., Mansour M., Crack J.A., Gass G.L., MacRae T.H. 2004. Oligomerization, chaperone activity, and nuclear localization of p26, a small heat shock protein from Artemia franciscana. J. Biol. Chem. 279 (38): 39999-40006.

132. Tsvetkova N. M„ Horváth I., Torok Z., Wolkers W. F., Balogi Z., Shigapova N. Crowe L. M., Tablin F., Vierling E., Crowe J. H., Vígh L. 2002. Small heat-shock proteins regulate membrane lipid polymorphism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 13504-13509.

133. Veinger L., Diamant S., Buchner J., Goloubinoff P. 1998. The small heat-shock protein IbpB from Escherichia coli stabilizes stress-denatured proteins for subsequent refolding by a multichaperone network. J. Biol. Chem. 273: 11032-11037.

134. Walsh P., Bursac D., Law Y.C., Cyr D., Lithgow T. 2004. The J-protein family: modulating protein assembly, disassembly and translocation. EMBO Rep. 5: 567-571.

135. Weiner J., EI, Zimmerman C.U., Gohlmann H.W., Herrmann R. 2003. Transcription profiles of the bacterium Mycoplasma pneumoniae grown at different temperatures. Nucleic Acids Res. 31: 6306-6320.

136. Williams T.A., Fares M.A. The Effect of Chaperonin Buffering on Protein Evolution. Genome Biol. Evol. 2: 609-619.

137. Wise K., Calcutt M.J., Foecking M.F., Madupu R., DeBoy R.T., Roske K., Martin T.R., Hvinden M.L., Durkin A.S., Glass J., Methe B.A. 2010. Genome Sequence of Mycoplasma leachii PG50 MU clone A8 (Direct Submittion).

138. Wise K.S., Calcutt M.J., Foecking M.F., Roske K., Madupu R., Methe B.A. 2011. Complete Genome Sequence of Mycoplasma bovis Type Strain PG45 (ATCC 25523). Infect. Immun. 79(2): 982-983.

139. Wolf-Jäckel G.A., Jäckel C„ Museux K., Hoelzle K., Tasker S., Lutz H., Hofmann-Lehmann R. Identification, Characterization, and Application of a Recombinant Antigen for the

140. Serological Investigation of Feline Hemotropic Mycoplasma Infections. 2010. Clinical and Vaccine Immunology. 17(12): 1917-1925.

141. Wong P., Houry W. A. 2004. Chaperone networks in bacteria: analysis of protein homeostasis in minimal cells. J. Struct. Biol. 146: 79-89.

142. Wu W.F., Zhou Y., Gottesman S., 1999. Redundant in vivo proteolytic activities of Escherichia coli Lon and the ClpYQ (HslUV) protease. J. Bacteriol. 181: 3681-3687.

143. Yeh C.-H., Chang P.-F. L., Yeh K.-W., Lin W.-C., Chen Y.-M., Lin C.-Y. 1997. Expression of a gene encoding a 16.9-kDa heat-shock protein, Oshspl6.9, in Escherichia coli enhances thermotolerance. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 94: 10967-10972.

144. Yeh C.-H., Yeh K.-W., Wu S.-H., Chang P.-F., Chen Y.-M., Lin C.-Y. 1995. A recombinant rice 16.9-kDa heat shock protein can provide thermoprotection in vitro. Plant Cell Physiol. 36: 1341-8.

145. Yuan Y., Crane D.D., Barry C.E. 1996. Stationary phase-associated protein expression in Mycobacterium tuberculosis: function of the mycobacterial a-Crystallin homolog. J. Bacteriol. 178 (15): 4484-4492.

146. Yura T., Kanemori M., Morita M. 2000. The heat shock response: regulation and function, p. 3-18. In Storz R., Hengge-Aronis R., Eds. Bacterial stress response. ASM Press, Washington, D.C.

147. Zhu X., Zhao X., Burkholder W.F., Gragerov A., Ogata C.M., Gottesman M.E., Hendrickson W.A. 1996. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK. Science. 272: 1606-1614.

Информация о работе

Вишняков, Иннокентий Евгеньевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.03.04

Диссертация

Идентификация и характеристика IbpA, малого белка теплового шока микоплазмы (Acholeplasma laidlawii) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы