Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка векторов для молекулярного клонирования с позитивной селекцией, основанных на использовании летального эффекта гена барназы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Язынин, Сергей Анатольевич, Москва



РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта

На правах рукописи УДК 577.113.5:577.113.4

ЯЗЫНИН СЕРГЕЙ АНАТОЛЬЕВИЧ

Разработка векторов для молекулярного клонирования с позитивной селекцией, основанных на использовании летального эффекта гена барназы

Специальность 03.00.03. — молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук С.М. Деев

МОСКВА 1999 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Список использованных сокращений....................................................................4

Введение ....................................................................................................................6

ГЛАВА 1. Литературный обзор............................................................................9

1.1. Вектора с позитивной селекцией.....................................................9

1.2. РНКаза барназа как фактор летальности....................................26

1.2.1. Характеристика фермента................................................................28

1.2.2. Внутриклеточный ингибитор барназы — барстар.......................32

ГЛАВА 2 Материалы и методы..........................................................................36

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение................................................................60

3.1. Разработка на основе гена барназы вектора

рМТ440 с позитивной селекцией....................................................60

3.1.1. Изучение влияния уровня индукции tac—промотора на выживаемость различных штаммов E.coli,

трансформированных плазмидой рМТ416...................................62

3.1.2. Клонирование с помощью плазмиды рМТ416 ПЦР— продукта,

кодирующего вариабельные регионы легкой цепи антитела к белку р24 вируса HIV— 1................................................................63

3.1.3. Введение полилинкера в ген барназы и конструкция векторов рМТ438, рМТ438а и рМТ440............................................................66

3.1.4. Использование вектора рМТ440 с позитивной селекцией для клонирования фрагментов чужеродной ДНК ............................70

3.2. Конструирование вектора рВа —7 с позитивной селекцией...70 3.2.1. Конструирование плазмид рВа —2, рВа — 3s и рВа —6.................73

3.2.2. Сайт — специфический мутагенез для удаления .повторяющихся

сайтов рестрикции и конструкция вектора рВа —7..................78

3.2.3. Использование вектора рВа —7 для клонирования фрагментов чужеродной ДНК.................................................................................81

3.2.4. Использование вектора рВа — 7 для клонирования генов иммуноглобулинов мыши ................................................................85

3.3. Исследование с помощью иммуноблотинга рекомбинантной барназы и ее мутантов, продуцируемых с помощью плазмид рМТ440 и рВа-7.................................................................................88

3.4. Характеристика вклада ряда мутаций в ферментативную активность модифицированной барназы...................................90

Заключение ................................................................................................................92

ГЛАВА 4. ВЫВОДЫ.................................................................................................93

Приложение 1............................................................................................................96

Приложение 2............................................................................................................98

Приложение 3..........................................................................................................102

Приложение 4..........................................................................................................104

Список литературы...............................................................................................109

Список использованных сокращений

В* — барстар

Ва — рибонуклеаза барназа

САР — транскрипционный фактор, регулирующий траскрипцию генов, ответственных за катаболизм в клетке E.coli

ccdB — ген белка CcdB — ингибитора топоизомеразы II E.coli, регулирующего жизнеспособность бактериальных клеток, утративших F' — эписому.

ccdA — ген белка CcdA, ингибирующего активность белка CcdB в клетках E.coli.

Da(kDa) — дальтон (килодальтон)

DEPC — диэтилпирокарбонат

dNTP(s) — дезоксирибонуклеотидтрифосфат(ы)

DTT — дитиотритол

ЕСЕРР/3 — обозначение базового алгоритма для работы со структурами белков методом Монте Карло

GATA—1 — транскрипционный фактор, распознающий консенсус —

последовательность G AT (А).

GpN — гуанозил—3',5'— нуклеозид

GpU — гуанозил—3', 5' — уридинмонофосфат

GST — глутатион — S — трансфераза

HIV— 1 — вирус иммунодефицита человека 1

ICM — internal coordinates modeling, компьютерная программа для

моделирования структуры белков

Kd — константа диссоциации

Ккат — каталитическая константа

Кт _ константа Михаэлиса

iacF — ген Lac — репрессора

M —MuLV обратная транскриптаза — обратная транскриптаза из вируса мышиной лейкемии Moloney

MOPS — 3— (N — морфолино) пропансульфоновая кислота ОтрА — сигнальный пептид мембранного белка OmpA E.coli

PBS — натрий — фосфатный буфер

PhoA — сигнальный пептид щелочной фосфатазы E.coli

RT—ПЦР— реакция обратной транскрипции и сопряженная с ней

полимеразная цепная реакция с использованием в качестве исходной

матрицы мРНК.

SDS — додецилсульфат натрия

TBS - трис - HCl буфер

TEMED — N,N,N',N' — тетраметилэтилендиамин Tris/трис — трис (оксиметил) аминометан

X — gal - 5 — бром — 4 — хлор — 3 — индолил — ß — D — галактопиранозид

АТФ — аденозин —5'— трифосфат

а.о. — аминокислотный(е) остаток(и)

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ИГ — иммуноглобулиновый(е) ген(ы).

ИПТГ — изопропил—ß —D —тиогалактопиранозид

кДНК — одноцепочечная ДНК, полученая в реакции обратной

транскрипции с использованием в качестве матрицы мРНК

мРНК — матричная РНК

ПЦР (PCR) — полимеразная цепная реакция

п.о. (bp) — пар оснований в ДНК

ПААГ — полиакриламидный гель

РНК — рибонуклеиновая кислота

РНКаза — рибонуклеаза

т.п.о. (kb) — тысяч пар оснований в ДНК

ТАЕ — трис — ацетатный буфер, содержащий ЭДТА

ТЕ — трис —HCl буфер, содержащий ЭДТА

цАМФ — аденозин —3', 5'— монофосфат

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Возрастающая интенсивность исследований по молекулярной биологии и генетике требует повышения эффективности одной из основных методических процедур — молекулярного клонирования. В последние годы быстро развивается новое биотехнологическое направление — векторные системы с позитивной селекцией, при использовании которых выживают только клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды. Очевидны преимущества таких векторов, которые не требуют дефосфорилирования линеаризированной плазмиды для клонирования. При этом отсутствует влияние неразрезанного вектора, присутствующего практически в любых препаратах. Другим преимуществом является отсутствие необходимости использования дорогостоящих реагентов, таких как X —gal, дополнительные антибиотики и пр. Все перечисленное выше снижает стоимость и повышает эффективность генно — инженерных манипуляций. Первые вектора нового поколения уже появились в

продаже, например вектор pZErO-1™ (Invitrogen Inc., USA), основанный на использовании летального эффекта гена ccdB (control of cell death В gene) [1]. Однако в ряде случаев гены, определяющие летальность, слишком велики, что приводит к значительному превышению оптимальных размеров плазмиды. Либо известные вектора с позитивной селекцией требуют использования специальных штаммов E.coli или дополнительных компонентов питательных сред.

Большинство описанных в литературе векторов с позитивной селекцией не обладают всеми необходимыми атрибутами современных векторов, такими, как секвенирование с помощью универсальных праймеров, клонирование протяженных фрагментов чужеродной ДНК с использованием широкого спектра рестриктаз, получение одноцепочечной ДНК, in vitro транскрипция. Представляется актуальной дальнейшая разработка современных векторов с позитивной селекцией, не имеющих вышеперечисленных недостатков. В настоящей работе впервые получены вектора с позитивной селекцией, основанные на использовании летального эффекта гена барназы — рибонуклеазы из Bacillus amyloliquefaciens, вызывающей при экспрессии в бактериальных клетках летальный гидролиз внутриклеточной РНК [2,3]. Полученные векторные системы функционируют таким образом, что клонирование фрагментов ДНК в полилинкеры этих векторов приводит к структурной инактивации гена барназы, в результате чего вырастают только клоны трансформантов, содержащих вставки чужеродной ДНК. Трансформанты, содержащие религированную плазмиду, погибают при выращивании в присутствии ИПТГ, индуцирующего экспрессию барназы в клетках E.coli. Полученные вектора рМТ440 и фагемида рВа —7 могут быть использованы в широком спектре штаммов E.coli и позволяют выполнять полный спектр генно-инженерных манипуляций, характерный для современных векторов.

Целью настоящего исследования являлась разработка новых векторных систем с позитивной селекцией для клонирования фрагментов чужеродной ДНК, использующих летальный эффект гена барназы. Исходя из поставленной цели, были сформулированы

следующие задачи: а) изучить плазмиду рМ416, представляющую собой вектор для экспрессии барназы в клетках E.coli, содержащий кассету генов барназа —барстар, на предмет летальности для различных штаммов E.coli; б) использовать плазмиду рМТ416 в качестве модельного вектора с позитивной селекцией для клонирования фрагментов чужеродной ДНК; в) разработать на основе плазмиды рМТ416 вектор с позитивной селекцией, содержащий протяженный полилинкер из pUC19 внутри гена барназы; г) изучить эффективность новой векторной системы с позитивной селекцией для клонирования фрагментов чужеродной ДНК; д) разработать на основе вектора pBluescript KS II + (Stratagene, USA) современную полифункциональную векторную систему с позитивной селекцией, обладающую рядом специфических функций, таких, как синтез РНК in vitro (промотор ТЗ РНК — полимеразы), получение одноцепочечной ДНК (fl ориджин), секвенирование с помощью унивесальных праймеров (М13 rev, ТЗ, KS, SK), клонирование протяженных фрагментов чужеродной ДНК с использованием широкого спектра рестриктаз.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Вектора с позитивной селекцией.

Для клонирования фрагментов ДНК и идентификации или отбора клонов, содержащих рекомбинантные плазмиды, разработан целый ряд векторных систем [4 — 8]. Однако они не лишены недостатков, основным из которых является наличие балластных колоний, представляющих собой клоны, содержащие плазмиды без вставок чужеродной ДНК. Для увеличения количества и селекции позитивных клонов применяются различные методы, например дефосфорилирование вектора после линеаризации [9], что делает невозможным религирование вектора, но не мешает включению в вектор фосфорилированной (кинированной) вставки.

Другие методы, основанные на использовании репортерных генов, функционируют таким образом, что при клонировании нарушается структура репортерного гена или его промотора [10]. На этом принципе работает распространенная система, основанная на инактивации Im.cZ пептида Р — галактозидазы, теряющего способность участвовать в акте а — комплементации с большим фрагментом [10] Р — галактозидазы, экспрессирующимся в клетках ряда штаммов Е.соИ конститутивно [10]. При использовании этой системы селекции негативные клоны окрашиваются в голубой цвет, а рекомбинантные клоны остаются неокрашенными.

Примером высокоэффективного клонирования с предварительной обработкой вектора является ТА—клонирование, основанное достраивании Гадг—полимеразой 3'— концов ПЦР — продуктов

преимущественно на один dA—нуклеотид [11]. Такой продукт может быть напрямую лигирован в линеаризованный вектор, содержащий на 5' —концах комплементарные dT—нуклеотиды. Подобные вектора могут быть получены с помощью находящегося в полилинкере сдвоенного сайта рестриктазы Xcml [11]. После разрезания соответствующей [Xcml] рестриктазой образуются одиночные dT на 3' —концах линеаризированного вектора. В данном случае вектор не может быть религирован и балластные клоны образуются только в том случае, если в препарате вектора присутствует неразрезанная плазмида или при контаминации нуклеазами.

Интересен ставший в последнее время популярным подход, вызывающий значительное увеличение эффективности клонирования, разработанный фирмой Invitrogen Inc., USA и основанный на использовании топоизомеразы I из Vaccinia virus [12, 13]. Эта топоизомераза специфично узнает две СССТТ —последовательности, находящиеся в полилинкерной области вектора pCR 2.1—TOPO (Invitrogen Inc., USA). Хотя этот процесс слабо изучен, известно, что топоизомераза I из Vaccinia virus, вносит разрыв в ДНК по СССТТ— сайтам. В дальнейшем при ликвидации разрыва при других условиях реакции она может интегрировать ПЦР —фрагмент в последовательность вектора pCR®2.1— TOPO при наличии у него 3'— концевых dA— нуклеотидов [13].

Однако все перечисленные выше методы, повышающие количество позитивных клонов, требуют предварительной обработки вектора, которая может протекать с различной эффективностью. Наличие баластных клонов определяется также условиями проведения реакции

лигирования [10]. Новейший подход в области молекулярного клонирования, так называемая позитивная селекция, основана на использовании токсичных для E.coli генов. Клонирование вставки с нарушением рамки считывания токсичного гена или непосредственно внутрь последовательности токсичного гена приводит к исчезновению летальности и выживанию только рекомбинантных клонов. Клоны, содержащие религированный вектор, погибают при востановлении исходной структуры токсичного гена. В настоящем обзоре сделана попытка обобщить основной массив описанных в литературе векторов с позитивной селекцией и проанализировать возможные области их применения.

Одними из самых успешных на сегодняшний день векторов с позитивной селекцией являются вектора pZErO™ фирмы Invitrogen Inc., USA [14], функционирующие на основе использования ccdB гена [15]. Ген ccdB входит в состав локуса ccd (control of cell death), находящегося в F'—плазмиде E.coli и кодирующего два белка CcdA из 72 и CcdB из 101 а.о. [16—19]. Локус ccd ответственен за ликвидацию клеток E.coli, утративших F'— плазмиду после конъюгации. [20]. Белок CcdB способен взаимодействовать с бактериальной гиразой (топоизомеразой II), которая катализирует АТФ — зависимое раскручивание ДНК, необходимое для репликации. В процессе каталитического акта топоизомераза II образует параллельный разрыв в обеих цепях двухцепочечной ДНК. 5'— фосфат ДНК в области разрыва ковалентно связывается с остатком тирозина в А—субъединице топоизомеразы II. Белок CcdB, как было показано исследованиями in vivo

[21] и in vitro [22], взаимодействуя с интермедиатом гираза—ДНК, ингибирует восстановление двухцепочечного разрыва в ДНК, что является летальным для бактериальной клетки. Механизм ликвидации клеток E.coli, утративших F'— плазмиду, основан на том, что время полужизни в бактериальной клетке белка CcdB значительно продолжительнее, чем белка CcdA, который является его специфическим ингибитором [21]. Таким образом, после потери или передачи F' — плазмиды, оставшиеся в клетке CcdB и CcdA инактивируются с различной скоростью, до тех пор пока избыточное присутствие ccdB не становится летальным для бактериальной клетки. Искусственная сверхпродукция белка CcdB также является летальной для E.coli [23, 24].

ccdB ген как перспективный ген, обеспечивающий летальность, был использован для создания вектора pKIL18/19 с позитивной селекцией [25] (рис.1). В качестве основы для создания вектора были выбраны плазмиды pUC18 и pUC19. ПЦР —продукт, кодирующий ccdB ген, фланкированный содержащимися в праймерах HmdIII — (для pUC18) или £coRI — (для pUC19) сайтами, был клонирован в последний в направлении от lac— промотора сайт рестрикции полилинкера (HmdIII — или EcoRl — ) в плазмидах pUC18 и pUC19, соответственно. Рамка считывания LacZ — пептида была сохранена таким образом, что клонирование фрагмента чужеродной ДНК в полилинкер pKIL18/19 за счет сбоя рамки считывания приводило к инактивации ccdB гена [25].

Позже фирма Invitrogen Inc., USA разработала на основе гена ccdB вектора pZEro™ "1 и -2 (рис. 2) и pBAD — 1 и — 2, снабженные всеми необходимыми элементами для клонирования и секвенирования

Рис.1. Схема векторов с позитивной селекцией pKILtß/19, функционирующих на основе ccdB гена [1].

фрагментов чужеродной ДНК. Ограничениями векторных систем на основе ccdB гена являются невозможность использования как штаммов, содержащих F'— плазмиду, так как в ней находится ген ингибитора — CcdA, что вызывает значительное повышение количества негативных клонов, так и штаммов дугА462+, полностью резистентных к продукту гена ccdB.

Перспективным вектором с позитивной селекцией, разработанным фирмой Boehrmger Mannheim, Germany, является вектор pCAPs [26].

Рис.2. Схемы векторов с позитивной селекцией pZErO ™—1 и —2 фирмы Invitrogen Inc., USA, функционирующих на основе ccdB гена. Векторные системы различаются по генам антибиотикорезистентности (к зеоцину и канамицину), а также различными ориджинами репликации: ColEl ориджин и дополнительный ft ориджин (pZErO — 2) или pUC ориджин (pZErO—1). Представленные векторные системы могут быть использованы только в штаммах, не содержащих F'— эписому.

Принцип действия векторной системы основан на открытом Schlieper и соавт. [26] токсическом эффекте мутанта САР —белка (catabolite gene

activator protein) — транскрипционного фактора, регулирующего экспрессию генов, ответственных за катаболизм в клетке E.coli [27]. САР состоит из двух идентич