Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Клонирование и экспрессия генов внеклеточных РНКаз бацилл в Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Клонирование и экспрессия генов внеклеточных РНКаз бацилл в Escherichia coli"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. Энгельгардта

На правах рукописи УДК 577.113.5

Федорова Наталья Давидовна

КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ РНК A3 БАЦИЛЛ В Escherichia сой

03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I

Москва - 1994

Работа выполнена в группе белковой инженерии Института молекулярной биологии им. В.А. Эягельгардта РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, член-корр. РАН

М.П.Кирпичников кандидат биологических наук А.А.Шулъга

Официальные оппоненты:

доктор биологичеких ваук, профессор

Ю.В.Козлов кандидат биологических наук М.А. Эль даров

Ведущая организация: Институт общей генетики РАН

Защита состоится М. ■ А- 1994 года в -гг на заседании диссертационного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, Москва, ул. Вавилова, дом 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан " Т5- х/ 1994 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук

А.М. Крицын

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение внеклеточных микробных рибонуклеаз (РНКаз), катализирующих неспецифическую деградацию РНЬС, представляет интерес как с научной, так и с практической точки зрения. Среди этих ферментов наиболее изучена группа лизкомолекулярных циклизующих рибонуклеаз, сегрегируемых некоторыми видами грибов, стрептомицетов и бацилл [3.1.4.23]. Несмотря на таксономическую удаленность этих организмов, секретируемые ими РНКазы составляют одно структурно-гомологичное и эволюционно-родствегшое семейство. Области структурной гомологии находятся в районе активного центра, в еубстратсвязывающем центре и гидрофобном ядре фермента, т.е. эволюционные изменения затрагивали участки, расположенные вне функционально значимых сайтов РНКаз. Внеклеточных РНКазы бацилл имеют значительно отличаются по своей структуре от РНКаз грибов и стрептомицетоь. Однако, внутри рода бацилл эти ферменты удивительно консервативны и являются удобным объектом для изучения молекулярной эволюции ферментов.

Внеклеточные рлбонуклеазы микроорганизмов являются также модельным объектом структурно-функциональных исследований, включающих проблемы сворачивания полипептидов я структурные основы биологической специфичности. Эти исследования создают необходимые предпосылки для эффективного использования РНКаз в научных и прикладных целях.

В настоящее время интенсивно разрабатываются аспекты практического применения, рибонуклезз, что связано прежде всего с введением в практику микробных ферментов - более разнообразных, активных и стабильных, чем ферменты высших эукариот. Внеклеточные РНКазы микроорганизмов используются в растениеводстпе, в медицине я в лабораторной практике.

Возможности изучения и ■ практического применения микробных рибонуклеаз могут быть реализовали в постой мере только пои наличия широкого спектра клонированных геяоз этих ферментов. Исследование ыолекулярно-генетической структуры этих РНКаз является позволяет уточнить также механизмы регуляции их синтеза, процесеинга и секреции. Кроме того, клояиролание

- г -

соответствующих геков и создание эффективны:: систем гкспресски необходимо для проведения .структурно-функциональных исследований.

Для сравнительного анализа, затрагивающего временные и адаптационные аспекты эволюции ферментов,, особый интерес представляют рибонуклеазы микроорганизмов, выделенных и» мерзлотных пород. Установлено, что в условиях вечной мерзлоты происходит консервация микроорганизмов, существовавших на планете многие тысячи лет назад. Среди штаммов Bacilli, выделенных мерзлотных грунтоз Колымской низменности, было обнаружена несколько штаммов-продуцентов РНКаз, в том числе штамм Bacillus circulans BCF247, возраст'которого оценивался в млн. лет. Этот штамм секре-гировал РНКазу, арокиллющую структурное и функциональное сходство с другими виеклеючцнмя РНКазами бацилл.

Цель работы. Основной задачей настоящей работы было. клонирование и определение последовательности нуклеэтидов гена внеклеточной РНКазы В. circuía,is (РНКазы Bei), исследование окружения гена на хромосоме; разработка системы сайт-специфичежой интеграции чужеродной ДНК e-Xaíí-сайт хромосомы. Е. coll и интеграция в него гена РНК полямэразы бактериофага Т7; кокструнрозание на основе полученного таким образом штамма системы ди терморегулируемой экспрессии генов РНКаз на модели баранзы в слетках Е. coli; конструирование системы экспрессии генов бациллярных РНКаз, индуцируемой с помощью ИПТГ.

Научная всаизоа работы. Клонирован ген внеклеточной щелочной рибонуклеазы В. circulans. Показано, что данный гея зкспрессируется ' в клетках Е. coli с использованием собственных регуляторных сигналов, а активная РНКаза секретируется клетками ь среду роста. Определена полная вуклеотидная последовательность РНКазы Bei. Сконструирован вектор для экспрессии внеклеточной РНКазы 5. amyloUquefaciens под контролем тандема промоторов t-jm ¡¡ ¿*uc> направляющих транскрипцию генов РНК полимеразами бактериофага Т7 и Е. coli. С использованием элементов иптегративкого модуля умеренного бактериофага X сконструирована система для

высокоэффективной стабильной сайт-специфической лятеграции чужеродной ДНГС в att-cайт фага X хромосомы Е. coli. С помощью разработанной системы а хромосому Е. coli вреден ген РНК пслимеразы бастсрпофт Т7 под контролем термонндуцхбельнсго промотора. Полученный штамм использован для термонндуякбельной экспрессии гена ацеклеточной РНКазы В. arnuloliquefacienz. На основе штамма Е. coli 2I,23(DE3) разработана более эффективная система экспрессии, индуцируемая ц помощью ИПТГ.

.Прадгичссаая доппсст:. работы. Сконструиропапнзп система экспрессии ггпа РНКйзы Bei позволяет получать белковый продукт в значительных количествах, что существенно упрощает процедуру очистки белка. Полученный с помощью данной зкятрессяеткш системы белок нспольгуется для структурно-функциональных песле-геиаыш. Разргботашагй метод сайт-спсцкфическсй иптагргшш чужеродной ДНК в Х/М-Ып хромосомы Е. со И являет" удобным гсяпоив:кевсрЕШ5 кпстр>?лепт0ч и может быть иепольсевзп для решения как каучпнх, так и научно-практачёслих яадач. Полученный с яомоадо» этого метода ивш 5. coll, в хромосому которого был 'iHTcrp'.ifо"эн ген 77 РНК полимеразы под контролем термоиндуцкбельного промотора, моглет найти широкое срамезеипе в биотехнологии для гетррологичной экспрессии гезов РНКаз.

Апробация. Осиовние положения диссертационной работы были представлены SR VI конференции РФ "Новые направления биотехполопш" (1994), International Symposium on the Biology of Actinomycetes (1904).

Структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, гкеперимептальпой части, содержащей глазы "Материалы и методы", "Результату" и "Обсуждение", выводов и списка лсткроваппей литература, включающего 154 наименования. Работа изложена на 120 страницах, включает 21 рисунок и 7 таблиц.

Публикадих. По материалам диссертации опубликовано шесть печатных работ. ' -

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Молекулярное клонирование и определение сослгкодагелмхст:» геиа внекаеточкой РККааы Bacillus äraiians BCF24'?.

Мерзлые грунты 1 Колымской низменности япляютсл уникальным источником "законссрвирогаяннх." микроорганизмов, сохранившим неизменной свою генетическую структуру с течение длительного времени. В образцах мерзлы.; почз было найдем насколько штаммов бацилл, возраст которых варьировал от 40 ткгага до 1,8 млн. лот. Пять из лих продуцировали в больших количеств чх низкомолекулярные щелочные РНКазы. 'Саиык ezrnsmm продуцентом оказался штамм В. circulans BCF247, возраст которого составлял 0,5 ылк. лет.

Вавклеточная рибоиуклеаза & circulans BCF247 (РНКава Bei) [КФ 3.1.4.23] была выделена в индивидуальном состояниям и охарактеризована физико-химическими методами. Эта рибоиуклеаза проявляла структурную и функциональную гомологию с исследованными ранее внеклеточными РНКазами В. amyloliquefaciens (РНКаза Ва или барназа) к В. intermedius (РНКаза Bi или бипаза). Значцтельноельное структурное и функциональное сходство РНКазы Bei с этими РНКазами определило стратегию клонирования хромосомного- ттта- данной- РНКазы,- которая заключалась -з конструировании банка фрагментов хромосомной ДНК В. circulans обогащенного последовательностью гена РНКазы Bei, с последующим скринингом полученного банка с помощью гибридизадун.. • "" »

Для идентификации фракции хромосомной ДНК В. circulans, проявлявшей гомологию с последовательностью гена биназы, были прозедены гиеридизационные эксперименты. Хромосомную ДНК С. circulans, полностью расщепленную эндонуклеазой ресхрдкцп EcoSl, фр акционировали с помощью электрофореза з агарозасы гелэ к переносили на нейлоновый фильтр по катоду Сауз£р::;а. Фрагмеаг ДНК, использованный для приготовления г-нбрядизаяиошюго зогса, бьгл получен с помощью полиыерззяой цепной реакции. В клготвв матрицы служила илазмнда, содержавшая последоватальпооть гена бнназы, При помощи •• олиговуклеотидных ираймера.з, комплемнтарных 3'- и 5'-концам последовательности, кодирукицк;

зрелую биназу, был амплифицнрован двухцепочечяый фрагмент ДНК, из которого методом статистической гексануклеотндной затравки был получен радиоактивный зонд. В результате эксперимента в составе хромосомной ДШС В. с1гси1апя был идентифицирован £соШ-фрагмент размером 3 т.п.н., содержавший последовательность,, проявлявшую гомологию с последовательностью гена бииазы (рис. 1). Поэтому для конструирования обогащеяного банка генов использовали фракцию, содержавшую фрагмент хромосомной ДНК размером около 3,0 т.п.н.

ГИ^ЛЗ

стад» '

1 2, 3 4 5 6 Т 8

Рис. 1. Гибридизация по Сзузерну хромосомной ДНК В. circulans BCF247. Амплкфициросаяпый фрагмент гена РНКазы В. intermedius использовали в качестве зонда В. circulans: 1 - ЕсоRI, 2 - ВатHI; В. polpiixa: 3 - ЕсоRI, 4 - НЫЛИ, 5 - ВатШ.; В. thuringiensts: б - ЕсоШ, 7 - Hindlll, 8 - ВатШ.

В качестве вектора для конструирования библиотеки генов В. circulans в Е. coli использовалась пдазмида рМТ316/2Н с геном барстара, которая была любезно предоставлена профессором Р. Хартли (США). Этот гел кодирует природный белковый ингибитор барнззы, который способен количественно шггнбировать РШСазу Bei. ДНК векторной плазмнды расщепляли эндонуклеазой рестрикции ВсоГО, обрабатывали щелочной фосфатазой и использовали з реакции лигирования с полученной ранее хромосомной фракцией. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli XLl-blue. ■

Для скрининга клонотеки применили метод гибридизации колоний öi situ. В результате скрининга был идентифицирован ряд., клонов, давших положительные сигналы. Выделенные из этих клонов рекомбинантные плазмиды серии pFM содержали фрагмент хромосомной ДНК размером 3,0 т.п.н. в двух ориентациях, что было установлено спомощью рестрикционного картирований'(рис. 2).

С помощью качественного теста, заключавшегося в анализе зон деполимеризации РНК в агаре в процессе роста бактерий, было показано, ч-rö клоны pFM секретировали в среду роста активную Jy- i/ РНКазу. Таким образом присутствие рекомбинантных плазмид серии '"¡^Х ' • рРМ, содержавших клонированный фрагмент хромосомной ДНК В.

circulons в обеих ориентациях, приводило к секреции активной РНКазы. По-видимому, ген РНКазы экспреесироаался с собственных инициаторвых последовательностей в клетках Е. coli.

В связи с этим методом сиектрофотометрического анализа продуктов гидролиза высокояолимеряой РНК, неосаждаемых этанолом было проведецо количественное измерение рибонуклеазной 1 активности в сунернатанте клонов pFM,- которые содержали клонированный хромосомный фрагмент в обеих ориентациях. Было показано, что экспрессия гена РНКазы Bei в этих клонах приводила к накоплению в культуральной жидкости фермейта в 'количестве- 15 мг/л . Такой же уровень продукции был отмечен при экспрессии в аналогичных условиях гена баранзы в составе плазмиды рМТ416, которая использовалась в качестве контроля. На основании полученных результатов можно было предположить, что клонированный хромосомный фрагмент содержал сигнальную последовательность, которая обеспечивала секрецию РНКазы в среду роста рекомбинантяыми клетками Е. coli.

Был получен ряд делеционных производных плазмиды pFM2 (рис. 2). Клоны, содержавшие эти делеционяые производные, тестировались на присутствие РНКазвой активности с помощью чашечного теста, описанного выше. Ген РНКазы - был идентифицировал в составе ряда плазмид, в том числе в составе плазмиды pFA, содержавшей Snal-Pi£l фрагмент размером 0,7 т.п.н, затем была определена последовательность нуклеотидов данного фрагмента (рис. 3). -

+ pFM2 + pFMP

- pFÏ.128

D + pFM29

+ pFMA

Рис. 2. Делеционное картирование клонированного .ЕсоМ-фрагмента хромосомы В. circulons. Е - EcoRI, H - Hinàlll, P - Р.чЛ, Pv - Pvull, S -Snaï. Справа приведен РНКазяый фенотип соответствующих клонов, "+" - положительный фенотип, "-" - отрицательный фенотип.

GTATACGAAAAACACCGAAAAACCTCACOAAAGAATrfCAATGACïAGGAAAAATCCCGGT

TGGTTCATCiCCGGGGTTTATiTTTCGCTGGATCAAAAGTACrATTTI^A>^TTCrATCTA

TTCCTTTCTITCGATGCTGATACAATAAAAAGGAATCAGCTTCACATGATGAAAATGGGA

M M К Я С

GGTATrGCTTTGAAAAAACGTTrATCATGGATrTrcGTATGTrrACTGGTGCTTn'CTCG

G 1 A L К К R L S W 1 S V S I, L V L F S GCGGCGGGGATACTGTITrCAACGAATGCCAAGACGGAAACACCGTCrCACAAGGCACAC "A A G" I L- F S T fi A' К T E T P S. H- -K A H ACAGAAGCACAGGTTATrAACACATTTGACGGGGTrGCGGATTATCTrCrGACATATCAC

TEAQVI NT FDGVA DYLLTYH AAA.CITCCTGATAATrACATTACAAAATCAGAGGa^CArX>CCCrrcCKlCrTGGCTAGCATCA

К L P D M Y I T К S E' A Q A t G W V A S AAAGGGAACCTTGCAGACGTCGCTCCXîGGGAAAAGCATC&CCGGAGACATCTTCTCAAAC

K G NLADVAPG KS IGGDIFS N AGGGAAGGCAAACTX;CCGGCCAAAAGCGGGCGGACGTGGCGTGAAGCTGATATTAACTAT

RE GK LPAKSGR TWP. E ADINY ACATCACGCTTCAGAAArrCAGACCGGATTCTrrACrrCAAGCGACTMCTGAnTATAAG

TS G F К N S DR I L Y S S P W L I Y К ACAACAGATCATrATAAAACClTTACGAAAATCACATAAACœAAACAAAAAACGGCTTC '

T T P H Y Я T F T К ! К -TCCGGGAGGCCGTrTTTTTCTGACGGAAATCTGCAG

Рис. 3. Нуклеотаднал и аминокислотная последовательность РНКазы Bci. Выделены - РБС-сайт и терминатор (Term), подчеркнута -сигнальная последовательность, выделены и подчеркнуты - замены относительно аминокислотной последовательности баряазы.

Определение нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента .позволило сделать ряд выводов о его организации, а также о строении кодируемого белка, В составе фрагмента была найдена полная трансляционная рамка ОРС1, которой предшествовала неполная рамка OPG2. Обе рамки оканчивались терминирующими кодонами, непосредственно, после которых были идентифицированы терминаторы.

ОРС2 кодировала белок из 182 а.о. (рис. 3). Рассчитанная аминокислотная последовательность С-конца этого белка полностью совпадала с последовательностью зрелой РНКазы Bei, установленной ранее методом деградации белков по Эдману. ОРС из 72 ¡содонов, предшествовшая последовательности, кодирующей зрелый белок, содержала несколько потенциальных стартовых кодонов трансляции в рамке. Наиболее вероятными сайтами инициации трансляции являлись два кодояа ATG (-47 и -46). На оптимальном расстоянии перед этими кодонами находился РБС сайт (AAAAGGAAT), комплементарный З'-концу 16S рРНК В. subtilis. За потенциальными сайтами инициации трансляции находилась сигнальная последовательность, кодирующая полипеитид из 47 (46) аминокислотных остатков. Рассчитанный на основе нуклеотидной последоватЕЛьнсстк сигнальный пептид содержал характерные структурные элементы: центральный гидрофобный участок и потенциальный ß-изгиб (Gly20). Потенциальными сайтами узнавания сигнальной пептидазы являлись Ala13- Lys12 или Ser7- His6 (рис. 4).

mmkíiegial.skbisvíísl'ci.z.vlvsaacaflí'sraaktetsshsahte mmkmogialkkr LSWISVSLC с L FS A AG I í fs г»актегр8 hs4bte

Рис. 4. Первичная структура сигнальных пептидов РНКаз Ва (вверху) и Bei (вешу). Выделены полужирным шрифтом аминокислотные остатки, составляющие прямой повтор. Выделены курсивом гидрофобные части екгаальных пептидов. * - аминокислотные замены относительно сигнальной последовательности барназы.

Оказалось, что рассчитанная- на основе нуклеотидной аминокислотная последовательность зрелой РНКазы Bei совпала с последовательностью зрелой барназы во всех позициях кроме трех: остаток Leu16 был заменен на Gin, Л1а6ь - на G!y, Lys104 - на Gin. Причем все замены располагались вне функционально значимых сайтов. Таким образом, структура знггедеточной РНКвзы штамма В. circulons, выделенного из мерзлотных грунтов не подвергавшихся оттаиванию в течение 0,5 миллиона лет, представляется зысококонсервативной. То есть РНКазы этих двух видов бацилл проявляют высокую степень структурной гомологии несиотря на дивергенцию организмов, связанную с их видовой, временной и географической изоляцией. Эти: данные подтверждаются сравнительным анализом последовательностей РНКаз современных видов. Было установлено, что степень токологии таветстаых аминокислотных последовательностей превышает 80%. Можно предпололситт., что консервативность бациллярных РНКаз указывает на законченность процесса фушщгояалькой адаптации структуры настоящих ферментов внутри рс^а. Bacillus. Такое объяснение подразумевает происхождение пиадизующих РНКаз от общего предшественника в результате достаточно длительного эволюционного процесса.

На основании анализа ' физжго-химических характеристик и • аминокислотных последовательностей бациллярных РНКаз эти ферменты разделяются на две грузли - барназолодобные и биназоподобные. Однако, в результате проведенного вами сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей было показшю, что все рассмотренные РНКазы имеют примерно одинаковую степень гомологии. Так» степень гомологии кодирующих последовательностей РНКаз Ва и Bei составляла 86%, а для РНКаз Ва и Bi - 84%, хотя число аминокислотных замен в последней паре РНКаз гораздо больше (17 вместо 3). Рассматривая нуклеотидные последовательности, расположенные за пределами кодирующих и лидерных областей РНКаз Ва зг Bei, необходимо отметить, что гомология сохранялась также и в эти* областях, особенно в районе терминатров. Однако, терминатсряая последовательность гена РНКазы Bei была сдвинута на восемнадцать нуклеотидов дальше от

кодирующей последовательности по сравнению с терминатором гена ..баранзы.

Пря сравнешши структуры сигнальных пептидов РНКаз Ва и Bei была выявлено шесть аминокислотных замен (уровень гомологии 76%) (рис. 4). Сигнальные пептиды содержали все необходимые структурные элементы, так что эти замены не сказывались на их функциональных сзойстах. В обоих сигнальных пептидах был обнаружен прямой повтор (АхТВ), расположенный вбднза от сайта расщеплеши. Наличие двух повторяющихся последовательностей могло быть связано с процессом дозревания белка, который характере! для бацилл. Число аминокислотных замен в сигнальном пептиде РНКазы Bei (6) превышало число замен в зрелом белке (3). Интересно» что сигнальные пептиды РНКаз Ва и Bi разительно отличались несмотря на сходство процессированных белков. Вероятно, это связано с низкой консервативностью сигнальных пептидов, для функционирования которых важна лишь определенная схема строения.

2. Конструирование систем экспрессии генов РНКаз.

Проблемы г.етерологично экспрессии генов бациллярных РНКаз наиболее, подробно исследованы ва модели барназы. Было разработано несколько систем экспрессии-гена барназы - под контролем промотора phoA, гибридного íac-npoMQTopa и промотора фага X PR. Во всех этих системах сигнальная последовательность гена phoA обеспечивала процессинг и секрецию продукта. Для экспрессии гена интактной барназы был сконструирован вектор, содержавший ген ингибитора барназы - барстара, таким образом летальный эффект активного фермента ва клетки Е. coll предотвращался действием ингибитора. При экспрессии в Е. call интактного гена биназы были использованы аналогичные конструкции. Однако, в системах, использующих промоторы phoA и tac, выходы белка были незначительны (15 мг/л). А в системе с промотором PR наряду с правильно процессированным белком в значительных количествах (до 30%) в большинстве штаммов Е. coli ««ретировалась недопроцессированная форма. Исключение составлял штамм XLl-Ыие. К тому же эта система по непонятным причинам была недостаточно стабильна. Учитывая, что экспрессия

баранзы изучена наиболее подробно и она является близким структурным гомологом РНКазы Bei, мы решили сконструировать эффективную систему экспрессии гена барназы, которую можно было бы примепить к другим бациллярным РНКазам.

Поскольку использование строго регулируемых я мощных лромоторов бактериофагов позволяет значительно увеличить выход гетеродогичного продукта мы выбрали вектор pET21d, несущего лромотор бактериофага Т7, транскрипция с которого осуществляется в присутствии Т7РНКП. При конструировании экепргссионнои плазкнды мы использовали элементы плазмиды рМТ416 для экспрессии гена барназы, а именно: последовательность гена барстара, а такие сигнальную последовательность щелочной фосфотазы (phoA) Е. coii, необходимую для обеспечения правильного процессинга и эффективной секреции гетеродогичного белка. Наряду с этими элементами рМТ41С, мы использовали регуляторные последовательности вектора рЕТ, содержащего промотор гена 10, РВС-сайт и терминатор фага Т7. Поскольку транскрипции с прокотора Ptю осуществляется высокоспецифичной и ' " - гффектиспои РНК полимеразой фага Т7 (Т7РНКП), то вторым элементом данной системы экспрессии являлись штаммы, несущие в составе своей хромосомы гена 1 бактериофага Т7. Этот ген кодирует последовательность и -обеспечивает индуцибегьяый еззатез .РНК полимеразы бактериофага Т7. В данной работе мы использовали как щтами Е. coä BL21(DE3), широко применяемый для гетерологичной экспрессии генов, так и штаммы LE(T7P) и XLlfTTP), полученные с помощью разработанного нами метода интеграции генов в хромосому Е. coll.

Для :;ояструировагшя экспрессионных длазыид мы использовали BamHI-HindIII фрагмент размером 1,0 т.п.а. и £coRI-iTindlll фрагмент размером 1,1 т.п.н. вектора рМТ416, содержавшего сигнальную воследовательаостъ гена щелочной фссфатазы Е. coli, последовательности, кодирующие зрелую барназу и барстар. Оба фрагмента были клонированы в полилинкеряую область вектора рШ2Ы, расщепленного BamUl-Hindltt н £coRI-HindIII, соответственно (рис. £"'). . В полученных таким образом плазмидах рВВА и pRBA ген барназы находился под контролем промотора Рп0. Вектор pRBA кроме того содержал также последовательность

промотора PUc. Поскольку эти промоторы узнаются при инициации транскрипции разными РНК цошмеразами - бактериофага Т7 и Е. coli, можно было предполагать эффект аддитивности при их совыетстном действии в рЕВА и, следовательно, увеличение продукции фермента.

Учитывая, что инициация транскрипции с промотора Рпо осуществляет» исключительно Т7РНКП, для экспрессии гена барназы с помощью полученных векторов трВВА и pRBA необходимо было использовать штамм, несущий ген Т7РНКП. Поскольку было известно, что под контролем промотора jPr правильно процессированная барназа сегрегировалась только в штамме XL1-Ыце, мы решили ввести в хромосому этого штамма ген РНК полимеразы фага Т7.

Для получения термояндуцибельной системы экспрессии генов с использованием Т7РНКП сначала был сконструирован штамм Е. coli XL(T7P), в хромосому которого с помощью кассеты, направляющей сайт-специфическую интеграцию ДНК, был введен ген Т7РНКП под контролем промотора PR. В зтога штамме экспрессия гетер'ологичных генов должна была индуцироваться путем повышения температуры инкубации клеток. На первом этапе был разработан метод введения в хромосому чужеродной ДНК с помощью сайт-специфической рекомбинации. Для этого была сконструирована интегративная плазмида, которая содержала элементы интегративного модуля умеренного бактериофага X • ген int, кодировавший интегразу, и attP-сайт.

Для конструирования интегративной плазмиды Hindlll-Hindll . фрагмент ДНК фага X, содержавший ДНК гена Int и attP-сайт, был клонирован в полилинкерный участок вектора pUC18, расщепленного эндонукдеазами рестрикции ШпйШ и Smal (рис.'/). В результате этого клонирования фаговый ген int мог экспрессироваться с промотора Р!ж. В НтйШ-са&т, полученной таким образом плазмиды рШТ2, ' клонировали ВшлШ-фрагмент плазмиды pUC4K, содержавшим ген устойчивости к каяамицляу ар/г. Полученным лигатом трансформировали компетентные клетки. Отобранные по признаку КшЕ колонии, содержали ядазмиду pINTK2. Затем мы проверит способаость сконструированной кассеты к интеграции в XattB-ca&s хромосомы Е. coli.

л.

В. Е, |В

Ияс Ва Врг

рМТ416

Ыа

2.9 кь

г

л

12.

Ыа

рЕТ21й 5.6 кЬ

т

рпо

1ас1

Е+Н Т4 ВИА И^агН

г

I

Е+Н

* < - Ь-Ч-

У

Ваг Ва

Ыа

рЯВА 6.7 кЬ

Р1ас РПО

а

1яс1 оп у

Рис. 5. А: Конструирование плазмиды рВВА для экспрессии гена барназы под контролем промотора Рпо. В. Конструирование плазмиды рЯВА для экспрессии гена барназы под контролем промоторов Рис и Рпо. В - ВатШ, Е - £соШ, Н - ШпИП. Ва - ген барназы, Ваг - ген барстара.

Для этого ДНК плазмвды pINTK2 была расщеплена эадонуклеазой рестрикции Л«Л1 на два-фрагмента, один иг которых содержал ДНК определявшего устойчивость к ампициллину гена bla и плазмидный репликон рМВ1, а другой - ннтегративную кассету, несущую гены aph и Int, а также сцепленный с последним XattP-cain. Оба фрагмента использовали в реакциях мономолекулярного лигирования к трансформировали лигазной смесью компетентные клетка Е. coll LE392.

Клетки Е. coli LE(INTK2), в хромосому которых произошла интеграция нерешшцировавшейся интегративной кассеты, отбирались по признаку КшЕ. Одновременно по признаку ApR отбирали

клетки, трансформированные лигировавным фрагментом, содержавшим плазмидный решшкон и ген bla. Такая схема эксперимента позволила оценить эффективность сайт-специфической интеграции кассеты в Xaiiß-сайт хромосомы относительно частоты трансформации дигированной в тех же условиях кольцевой ДНК, содержавшей плазмидный репликон. Полученный результат показал, что эффективность интеграции составила 5% (рис. 6).

А Б

Рис. 6. (А) Клоны интегравтов Е. coli LE(INTK2), отобранные по признаку KmR; • (Б). Клоны Е. coli LE392, трансформированные фрагментом, содержавшим плазмидный репликон и ген Ыа, отобранные по признаку Арк.

1.4 kb

-

attP mt lad

В (P

attP iat iacl

H+Klenow

T4 DNA ligsse P

рЮТ2 4.1 kb

-aph

T4 DNA ligssi PUjg int ^ attP

рШТК2 5.0 kb

gal ' attB

^X^hitegrase • -

gal

—-d>

attL mt

Ptac

-O —

aph attR

bio

bio

Рис. 7. Конструирование плазмиды pINTK2 и интеграция кассеты в attB-Ып хромосомы Е. coll. В - ВатН1, Ш - Hindll, Н - Htndlll, Р -Pvull, S - Smal.

Для подтверждения интеграции в хромосому клеток В. coll LE(INTK2) фрагмента ДНК, содержавшего последовательность гена aph, была проведена гибридизация по Саузерну хромосомной ДНК интегрантов, расщепленной эндонуклеаэой рестрикции Mlul. В качестве зонда использовали интегративную кассету из плазмиды pINTK2. Результаты гибридизации подтвердили, что кассета находилась в составе хромосомы (рис. 8);

1 2 3 4 5

Рис. 8. Гибридизация rio Саузерну хромосомной ДНК интограитов Е. coli ЩШТК2)(2, S, 4) и исходного штамма Е. coli LE392 (5), расщепленной Mlul, г также ДНК плазмиды pINTK2, расщепленная £ccRI (1). В качестве зонда использовали интернируемый Рш11-фрагмент рЩТК2.

Для контроля сайт-специфичности интеграции была проведена трансдукция бактериофагом Т4 участка хромосомы, включавшего фрагмент плазмиды pINTK2 и сцепленные'с ним мутантные гены galK и gair, из штамма ЩШТК2) в Gal+ штамм XLl-Ыие. В результате трансдукции ряд KmR кловов приобрел признак Gal" , что подтвердило, что ген aph ■ был интегрирован в XaííB-сайт, тесно сцепленный на хромосоме Е. coll с генами galK и galT. При изучении стабильности наследования признака KmR было показано, что боле? 99% клонов сохранили устойчивость к антибиотику, что подтвердило генетическую стабильность интегралтов.

Плазмида "рВДТК2 была применена для интеграции гена Т7РНКП под контролем термоиндуцибельного промотора в atí-сайт фага X. хромосомы Е. coli. Источником данного гена служила плазмида рАСТ7, содержавшая последовательность структурной части гена Т7РНКП под контролем промотора РЕ и ген clts857 фага X. Плазмида была предоставлена сотрудниками .лаборатории энзимологии транскрипции. В Clal-сайт плазмиды рАСТ7 был введен участок

полилинкера вектора pTZ19RJLl, содержавший SaЯ-еайт (рис. 9). Затем в SpAI-сайт полученной плазмиды pACT7S была клонирована интегративпая кассета. Для этого ДНК плазмиды pACT7S была расщеплена эндонуклеазой рестрикции SphI, обработана ДНК полимеразой фага Т4, и лигироваиа с PuuII-фрагментом плазмиды pINTK.2, содержавшим необходимые для интеграции элементы.

Полученная таким образом ллазмида рАСТ7К использовалась для интеграции термоиядуцибельного гена РНК полимеразы в XattB-сайт хромосомы Е. coli. Для проведения интеграции ДНК плазмиды рЛСТ7К подвергалась расщеплению эндонуклеазой рестрикции Sail на два фрагмента, один из которых содержал последовательность гена cat, а также плазмидпый репликон р15, а другой - последовательность гена Т7РНКП и материал интегративной кассеты. Фрагмент, содержавший интегратИЕную кассету и ген Т7РНКП, обрабатывался лигазой и использовался для трансформации клеток Е. coli XLl-blue. Клетки, в хромосому которых произошла интеграция, отбирались по признаку KraR и проверялись на отсутствие шгазмвдного репликока по признаку

Сконструированный в результате интеграции штамм получил Егаззание XL(T7P). Для контроля интеграции гена Т7РНКП, была проведена гибридизация по Саузерну хромосомной ДНК интёгрантов Е. coli ХЦТ7Р). Результаты гибридизации подтвердили, что ннтегратпвная кассета находилась в составе хромосомы. Для контроля сайт-специфичности интеграции была проведена трансдукция фагом PI участка хромосомы, включавшего фрагмент плазмиды рАСТК и сцепленные с ним гены galK и galT из штамма XL(T7P) в Gal" штамм LE392. В результате трансдукции некоторые клоны (10%) Km11 приобрели признак Gar, что подтвердило, что фрагмент рАСТ71С, содержавший ген aph, был интегрирован в kattB-сайт, тесно сцепленный на хромосоме Е. coli с генами galK и galT.

Штамм, полученный в результате трансдукции, был назван LE(T7P). Присутствие копии гена Т7РНКП в составе хромосомы штамма LE(T7P) было подтверждено с помощью экспрессии гена РНКазы Ва

под контролем промотора Pfio в составе плазмиды рВВА в клетках Е. coll LE(T7P). Трансформации проверялись на наличие РНКазной активности с помощью теста с толуидиновым голубым. В то время как вокруг колоний, выращенных при 30°С, зоны

E| S| jSp|H-

pTZ19RJLl Sp+E+T4 DNA poiimerase T4 DNA ligase

pact7s

I \ att int cat

LjLpb ГУ^гЫУ

pACTTK

attB

bio

attL int

. xO—О—=-rr

CI857 pj; T7RNAP aph attR 010

Рис. 9. Конструирование плазмиды pACT7K и интеграция Sail -фрагмента этой плазмиды, содержащего ген Т7РНКП, в хромосому Е. coli XLl-blue. С - Clai; Е - i'coRI, Р - PvuU, S - Seil, Sp - Sphl. T7RNAP - ген T7 РНК полимеразы.

деполимеризованной ДНК были незаметны, после термоиндукции вокруг колоний появлялись обширные зоны гидролизоваяной РНК, что указывало на присутствие в клетках активной РНКазы и, следовательно, гена Т7РНКП.

Штаммы ХЦТ7Р) и LE(T7P) были использованы для получения терморегулируемой системы экспрессии генов бациллярных РНКаз. Штаммы трансформировали плззмидой pLysS и затем плазмидами рВВА и pRBA. В отсутствие плазмиды pLysS клетки медленно росли и переставали делиться и секретировать РНКхазу после индукции. Штамм XL(T7P) продуцировал небольшие количества барназы - 15 мг/л, что сравнимо с выходами в системе экспрессии на основе плазмиды рМТ416. Тогда как в LE(T7P) после термоиндуцибельной экспрессии синтеза уровень продукции барназы достиг 65.мг/л для плазмиды pRBA, и 35 мг/л - для плазмиды рВВА, что было показано с помощью спектрофотометрического метода. Таким образом, мы показали эффективность использования тандема промоторов Р£10 и Рис для экспрессии геяоз бациллярных внеклеточных РНКаз.

Поскольку для экспрессии генов РНКаз в штамме LE(T7P) не 4 требуется добавление дорогостоящих индукторов, то, по-видимому, он является перспективным штаммом для создания промышленных продуцентов РНКаз. Вместе с тем не менее актуальной оставалась проблема ■ дальнейшего увеличения выхода рибонуклеазы, з количествах необходимых для лабораторных исследований. Для этого мы решили использовать штамм Е. coli BL21(DE3), содержавший в составе хромосомы интегрированный ген Т7РНКП под контролем ., промотора lacUV5, который широко используется для экспрессии чежеродных генов. В этой эспрессиоцной системе необходимой стадией являлось проведение индукции синтеза белка путем добавления з культуральную среду ИШТ, который является дорогим реактивом и по экономическим соображениям не прнменеяяется в промышленной биотехнологии. Необходимость использования этого соединения в клетках BL21(DE3) обусловлена тем, что ген Т7РНКП находится в составе хромосомы данного штамма под контролем индуцибельного промотора lacUV5.

Полученными ранее плазмидами ■ рВВА и pRBA • трансформировали штамм BL21(DE3). Этот штамм BL21(DE3) содержал также плазмиду pLysS, обеспечивающую ингибирование Т7РНКП в процессе роста клеток, предшествующем индукции, поскольку в отсутствие pLysS, клетки переставали делиться после индукции. Пеле индукции с помощью ИШТ уровень продукции барназы в присутствии плазм ид pLysS и рВВА достигал 80 мг/л.

Таким образом эффективность полученной экспрессионной системы превышала в аналогичных условиях исходной системы с рМТ416 более, чем в 5 раз. Для дальнейшего увеличения уровня экспрессии мы использовали вектор рНВА, содержащий тандем из двух промоторов - промотора РЫс и РГ10. Уровень продукции барназы составил 163 мг/л культуры, т.е. вдвое превысил продукцию в присутствии плазмиды рВВА и в 5 раз продукцию в присутствии в плазмиды рМТ416. Следовательно, и в этом случае вместо ожидаемого аддитивного эффекта в результате суперпозиции промоторов мы получили амплификацию их действия. Таким образом, полученная система экспрессии в клетках ВЬ21(ВЕЗ) обеспечивала продукцию барназы вдвое превышающую продукцию в штамме ЬЕ(Т7Р).

е» ' _.

с«» Ш: £2:

12 3 4

Рис.¿О. Электрофорез белков в 15% ПААГ-ДСН. 1, 3 - препарат бараназы после хрматографии на фосфоцеллюлозе, 2, 4 - препарат после обращенно-фазовой хроматографии. 1, 2 - штамм ЬЕ(Т7Р), 3, 4 -ВЬ21фЕЗ). Слева показаны маркеры молекулярных масс: 94,0; 67,0; 43,0; 30,0; 20,1 .и 14,4 кДа. '

В лаборатории стереохимии ферментативных реакций 1С.И. Пановым (ИМВ РАН) был проведен анализ рекомбиналтнсй барангы, продуцируемой штаммами LE(T7P) и BL21(DB3) с ллазмидой pRBA, методом образденяо-флзовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). Было псказапо, что значение времени удерживания на колонке ц Bondapak С-18 для полученных игми препарате;: барназы совпало со значением этого парат,íerpa для контрольного препарата белка. Электрофорез в 15% ПААГ а присутствии ДОН очищенного преперата бараяазы показал наличие одной полоеп, совпадающей по подвижности с контрольным препаратом (рис. оыли проведены измерения кинетических

копстяят очншеяяого реяомбинантиого препарата барназы для двух субстратов, которые соьрали с литературными данными в пределах ошибки измерения „ На основе полученных данных мы

предположили, что процессикг барназы з скоястр^горозааных нш системах экспрессии происходят правильно и к.теткч Е. coli еекретируют з оеяозяои зрелую форму белка и лишь :1<м;:гЛ'мтельно8 .количество (менее 10%) недопроцессировакной барназы.

ВЫВОДЫ

' 1. В клетках Е. coli клонирован ген внеклеточной шелочной рнбонуклпази В. círculans. Показано, что реаомбнваитные клетки Е. coli оекретнрозалк в среду роста актнвяую РНКазу.

2. На ccnese нптегратизг.сгэ модуля умеренного бактериофага X разработана система для высокоэффеютг^гоД сдйг-спешгфичее.'сой иитеграция «гуясерсдЕоГг ДШС г. (Tíf-еайт фаг« X .хромосом? t S. coli. С пококтио этой яятагратлвпой «истоми з иромогэ«у Е. cotí введен ген РНК полииерчоы Т7 под контролем термоиядунпбельяого про:;отора.

3. Скоаотрупрэваязий штамм еооотзчявая тормоиндуцибалытую экспрессию rsiía барназы . з сосию экспрессяопныя плазтшд, явпрзвляющях тргчег.рипцито геаоч РНК нолккеразами фага Tí и Е.

со Ч.

4. Разработана более эффективная система экспрессии гена барапзы. Индукция экспрессии в данной системе осуществляется добавлением ИПТГ в среду роста клеток.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Окороков A.JI., Паков К.Й., Федорова Н.Д., Карпейсккй" М.Я. Новые подходы в изучении экспрессии и очистки внеклеточных бациллярных РНКаз и их мутантнкх производных. Биотехнология, 1992, Зй 5: 40-42.

2. Федорова Н.Д., Шульга A.A., Передельчук М.Ю., Кожаринова Л.В., Рябченко Н.о>., Голышки Ü.M., Кирпичников М.П. Клонирование гена внеклеточной РНКазы Bacillus circulans. Молекулярная биология, 1994, № 2: 468-471.

3. Передельчук М.Ю., Федорова Н.Д., Смирнов 10.В., Дебабов В.Г. Интеграция генов lysC и asd Corynebactcrium glutamicum в att-сайт фага хромосомы .Е. coli. Биотехнология, 19S4, №1: 12-15.

4. Кожаринова Л.В., Федорова Н.Д., Передельчук М.Ю., Рябченко Н.Ф., Шульга A.A., Кирпичшк:ов М.П. Клонирование гена внеклеточной РНКазы Bacillus thuringitnsis var. subtoxicus. Биотехнология, 1994, К» 2: 9-11.

ó. Федорова Н.Д., Передельчук М.Ю., Кожаринова Л.В., - Шульга- A.A., - Кирпичников М.П. Клонирование, -определение -вуклеотвдной последовательности и экспрессия в Е. coli генов внеклеточных РНКаз Bacillus circulans к В. thuringiensis. Тезисы докл. VI конференции РФ "Новые направления биотехнологии", Пущиио, 1994.

6. Pcredelcbuk М., Fyodorova N.. Sladkova I., Debabov Y. Streplomyces recombinant plasmid pINS32 is an integrative vector for use in E. coli. ISBA'94 International Symposium on the Biology of Actincmycetes, Moscow, 1994.