Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование бациллярных внеклеточных рибонуклеаз барназы и биназы методом сайт-специфического мутагенеза

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование бациллярных внеклеточных рибонуклеаз барназы и биназы методом сайт-специфического мутагенеза"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ Р 5 Ой имени В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

3 0 опт 1С35

На правах рукописи

ПАНОВ Константин Иванович

ИССЛЕДОВАНИЕ БАЦИЛЛЯРНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ РИБОНУКЛЕАЗ БАРНАЗЫ И БИНАЗЫ МЕТОДОМ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОГО МУТАГЕНЕЗА

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссетации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва — 1995

Работа выполнена в лаборатории стереохимии ферментативных реакций Института молекулярной биологии им. В.А. Энгсльгадта РАН

Научные руководители:

кандидат биологических наук А. Л. ОКОРОКОВ

кандидат физико— математических наук К. М. ПОЛЯКОВ Официальные оппоненты:

доктор химических наук А.Г. ГАЕИБОВ

кандидат биологических наук АА. БЕЛОГУРОВ Ведущая организация: Институт Си^/имии им. А.Н.Баха, РАН

Защита состоится " 23 *' ноября 1995 года в 14:00 на заседании диссертационного совета Д 00X79.01 при Институте молекулярной биологии им. КА- Энгельгардта РАН по адресу: 117934, Москва, ул.Вавилова, дом 32. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан " 20 " октября 1995г.

Ученый секретарь диссертационного совета^^/, кандидат химических наук / А.МГКРИЦЫН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Изучение внеклеточных микробных рибоиуклеаз (РНКаз), катализирующих деградацию РНК, представляет собой интерес преимущественно с научной точки зрения. Наиболее : изученной группой среди этих ферментов является семейство микробных РНКаз, объединяющее низкомолекулярные циклизузогцие РНКазы, секретируемые некоторыми видами грибов, стрептомицетов и бацилл [КФ 3.1.4.23]. Несмотря на таксонометрическую удалбшюсть этих организмов, РНКазы семейства имеют области структурной гомологии, находящиеся в районе активного центра фермента и субстрат —связывающего участка т.е. в функционально значимых . участках РНКаз (Sevcik J., et al., 1990, TIBS, v.I5(4), pp.158-162)

Белки, представители семейства микробных РНКаз, являются удобным и широко используемым модельным объектом структурно — функциональных исследований, включающих в себя проблеммы сворачивания полипептидов и проблемы структурных основ биологической специфичности.

Как правило, проведение подобного рода исследований включает в себя не только исследование физико-химических свойств белка дикого типа, но и работы по изменению структуры этого белка (сайт—специфический мутагенез и/или химическая модификация). Подобного рода исследования требуют значительных количеств высокоочищенных белков как дикого, так и мутантого типа. Использование для этих целей природных продуцентов ферментов зачастую ограничено низким уровнем экспрессии целевого белка, а так же сложностью (и дороговизной ) работ по сайт — специфическому мутагенезу в грибах, стрептомицетах и бациллах.

Цель работы. Целью настоящей работы являлось: разработка высокоэффективной экспрессионной системы, пригодной для клонирования и __ , экспрессии рибонуклеазы из Bacillus amiloliqu с fa eien с es, (РНКаза барназа, Ва), рибонуклеазы из Bacillus intermedius (РНКаза бтгаза, Bi) и их мутантных форм, создание эффективной схемы очистки этих рибонуклеаз и их мутантов, получение ряда мутантных форм рибонуклеаз барназы и биназы в области, ответственной за связывание субстрата, и изучение основных каталитических свойств этих мутантных белков. Научная новизпа работы. Разработана высокоэффективная система для экспрессии РНКаз барназы и биназы в Я. coli, основанная на использовании сильного, хорошо регулируемого промотора Рг фага X под контролем термочувствительного рспрессора cIBS7. Для ряда бациллярных внеклеточных рибонуклеаз обнаружен эффект зависимости количества белка, элюирующегося с обращонно — . фазового сорбента, от pH подвижной фазы. Предложена гипотеза, объясняющая найденный эффект, и получено экспериментальное подтверждение этой гипотезы. Разработана 2-х стадийная схема очистки внеклеточных бациллярных РНКаз и их мутантных производных, базирующаяся на их свойствах в условиях Оф—ВЭЖХ. Получены мутантные производные барназы и биназы в области "узнающей петли". Изучены их каталитические свойства в реакциях гидролиза пуриновых гомополирибонуклеотидов.

Показало, что замена "узнающей петли" гуанилпредпочтителыюй РНКазы Bi на "узнающую петлю" гуанилепецифичной РНКазы Sa не приводит к полному изменению гуаш1лспецифичности муталтного белка в реакциях гидролиза го.мополирибонуклеотндов. Практическая ценность работы. Сконструированная

высокоэффективная система для экспрессии генов РНКаз барназы и биназы в Е. coli позволяет получать целевой белок в значительных количествах, что существенно облегчает проведение различных структурно — фнкциональных исследований. Разработанный двух — стадийный метод очистки исследуемых белков позволяет получать гомогенный препарат белка с высоким выходом.

Апробация. Основные положения диссертационной работы были представлены на Международной конференции "Современная энаимология: проблемы и перспетивы" (Санкт — Петербург, 1992), па 3—ей Международной конференции "Рибонуклеазы: Химия, биология, биотехнология" (Capri, Italy, 1993) И на конференции Научного общества Нидерландов (Lunteren, The Netherlands, 1993). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей, список которых приведен в конце автореферата.

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей главы "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", выводов и списка -цитируемой литературы, включающего наименований. Работа изложена на 150 страницах, включает 26 рисунков и 22 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Разработка системы экспрессии генов внеклеточных РНКаз барназы н биназы п И. coli.

К моменту начала работы ген барнази бил клонирован R.W. Hartley, л ген бипазы А Шульгой с соавт. Имелась и экспресснонная система, разработанная R.W. Hartley для экспрессии гена РНКазы барназы в Е. coli. Однако уровень продукции белка в этой системе нас не удовлетворял и поэтому нами была разработана новая система для экспрессии барназы, которая затем била использована для экспрессии бипазы и Myraimiux форм этих РНКаз в 1:, coli.

В разработанном нами эксврессиоштом векторе (рис. 1) был применен подход ранее использованный R-W.Hartley,

заключающийся в одновременной экспрессии гена РНКазы барназы, слитого с лидерным пептидом щелочной фосфатазы [pho А), и гена белкового ингибитора этой РНКазы — барстара. Барстар также шли Пирует и активность бипазы. В отличии от системы R.W. Hartley и которой для инициалу™ транскрипции использовался tac промотор, нами был применен более сильный и более строго регулируемый Р, промотор фага X. Этот промотор находится под контролем белка—репрессора clasjt который несет мутацию позволяющую инактивировать его повышением температуры и тем самым индуцировать экспрессию гена РНКазы. Ген репрессора находится под контролем собственного промотора Рт Полученный вектор был назван pTN441 (рис.1).

По причине, описанной выше для барназы, экспрессия гена биназы была осуществлена в сопряженной системе РНКаза —ингибитор.

В качестве исходных генетических конструкций были выбраны вектора для экспрессии барназы рМТ416 и рМТ702 (предоставленные R.W. Hartley), плазмида pNKMl, содержащая фрагмент хромосомы Bacillus intoimedius с геном биназы (предоставленная A.A. Шульгой) и нДНК рСО— '2V, содержащая "Р,— кассету".

Первоначальная задача сводилась к тому, чтобы заменить в этих векторах кодирующую область барназы на гомологичную биназы и при этом не нарушать, по возможности, структуру прилегающих к этой области участков ДНК. Для выполнения поставленной задачи применили замену одного гона на другой при помощи метода направленного мутагенеза. Однако в качестве праймера использовали не олигонуклеотид, а одноцепочечную копию структурного гена биназы, которую получали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). На рнс.2 представлены основные этапы конструирования.

Ген барназы переклонировали из экспрессиошюго вектора в вектор MI3 и получали одноцепочечную матр!щу, содержащую урацилы. При помощи двух праймеров методом ПЦР синтезироьали двухпеп очечную кошио гена биназы, которую очищали и затем транскрибировали только с одного из праймеров, имеющего место посадки на 3'— конце гена. Синтезированную одноцепочечную ДНК— копию гена биназы —

Рисунок 1. Схема конструирования pTN441 — вектора для экспрессии бариазы.

Г

.А.

Рп» Р, EcoRI cl" Bondi I

' ' ivf*

N

pCQ-2V

фрагмент A EcoRI-BamHI

лигирование

Лшр делеция В ■ EcoRI-BamHI

i>rin Pr

cl I о 2 J рЬдЛ-Ъолше

âBas^eNœ^b^osasarasar^---1

, Û

btinlar

p7N44l

-Hindi»

Ажлр

"отжигали" на урацил — содержащую матрицу М13 с геном бариазы и проводили мутагенез по Кункелю. Гетеродуплексными

молекулами ДНК. полученными при достройке второй цепи в ходе мутагенеза, трансформировали dut* unçf* штамм кишечной палочки JM83.

Трансформированные клетки выращивали в виде жидкой культуры, используя в качестве газонной культуры штамм Е. coli TGI, и выделяли из них ДНК. Эту ДНК гидролизовали ферментами EcoRI и Xbal, фрагмент ДНК с геном рибонуклеазы очищали и перехлонировали в исходный вектор рМТ702, из которого первоначально был взят ген барназы, по тем же сайтам, (рис. 2). В отличие от гена барназы, который имеет внутренний рестрикционный сайт Smal, ген биназы содержит EcoRV сайт. Поэтому о заменах в гене барназы судили по появлению EcoRV сайта. Из 18 ггроанализировашсых клонов семь давали расщепление при обработке EcoRV. ДНК этих клонов секвенироаали. Поскольку ген биназы насчитывает 327 п.н., за один эксперимент удавалось определить полную его

последовательность. Плазмидный вектор, в котором ген барназы был полностью заменен на ген биназы и транскрипция этого гена

направлялась с tac—промотора, получил название рВГТЗб — tsc (рис. 3).

Следующим этапом конструирования экспрессиошюго вектора для Снназы была замена промотора (ас па более сильный и хорошо регулируемый Рг промотор фага Плазмидную ДНК pBIT36— tac гидролизовали рссгр!гктазами Eco RI и Ваш И, и выделяли больший из фрагментов. По образовавшимся липким концам клонировали "Р, кассету" из плазмиды pCQ — 2V. Получетгый вектор назвали рВТТЗб (рис. 3).

Рисунок 2. Схема опыта по замене гена барназы в имеющихся окспрессиошп>1х векторах на ген биназы:

а — клонирование гена барназы вместе с геном ингибитора в вектор ' М13гпр18 и получение одноцепочечной ДНК — матрицы, содержащей урацилы;

б — схема мутагенеза по Кункелю, где в качестве прайм ера используется одноцепочечпый фрагмент ДНК, кодирующий биназу. а.

Глс 3—*

EooHI ХЬ®1

НшШ1

| S pIioA-fonmp»*« j I 1

BhlnHI

IlindIII

pBB316/2H

Ampr

тршкзЗнтрмацях к OJ 230

EcoRI

/

jj | " Xbnl j ' HindlII

BamHI BamHI

U-мотргаи

Рисунок 2. (продолжение), б.

bornase

U-матрица b tus tar J

binase

ancres кто рои цеоя i

Ьш.аю

S T.DJDL хромо О) мы büttS /____ Ч Jbb3

d»~ binase ГШР j

м-Ъише

ЬЫ

EooRI I Xbel| HiodUI

i i ц^оЛ-Итю* I i tmrjlm' I

трвлоформацох

BainHI HaxnJHl |

ú i '

M13RP ДНК )j

bootour

После разработки экспрессионш.гх векторов была проведена работа по оптимизации уровня экспресии белка путем подбора штамма—хозяина, условий индукции и роста. Не смотря на высокое структурно — функционал!,нос сходство Оиназы и барназы имеются значительные отличия как в уровне экпрессии белка так и во времени достижения максимального уровня. Если концентрация Ва достигает своего максимального уровня (около 500 мт/л) за 17 — 19 часов, то максимальный уровень экспрессии билазы более чем в два раза даже и достигается за более значительное время (примерно в два раза). Возможное объяснение этому состоит в том, что частота встречаемости редких (для Е. cali) кодонов в гене Bi выше чем в гене барназы. Экспрессируемый белок практически полностью сосредотачивается в кулътуральной жидкости, что не является типичным для Е. coli. По всей видимости, это вызвано малыми размерами экспрессируемых РНКаз (12 кД) и/или

дефектами в клеточной стенке используемого нами штамма — хозяина XL —1 blue. Последнее подтверждается тем что при использовании других штаммов, соотношение количеств белка в кулътуральной жидкости и периплазме составляет 1:1.

В процессе использования нашей экспрессионной системы, для экспрессии больших количеств биназы и ее мутантов ■ было обнаружено, что в отдельных случаях выход целевого белка значительно (иногда в десятки раз) ниже ожидаемого.

Секвснирование плазмид, выделенных из ростовой среды ( при различных уровнях экспрессии целевого белка) и сравнение последовательностей ДНКа, показало отсутствие измеисний в составе EcoRI — Hindin — фрагмента (рис. 3) экспрессиошюго вектора.

Рисунок 3. Схема конструирования рВ1Т36 — вектора для экспрессии биназы.

tac

Xbal HiudlII ЕаоИ, | XW| HindlII

I ! phoA~l»lJuue | ! v—

ESr^^EffiSSV

. j i льан

рЬоЛ-Мплл^ I я bnratnr I

ItojnHI BanvHI Ь

Ú

M13RF ДНК . g

HindlII

Amp*

К сожалению нам не удалось найти причин объясняющих наблюдаемый эффект. Однако использование предварительного отбора клонов на индикаторных чашках позволило добиться стабильного выхода белка. Применение этого подхода гарантирует стабильный выход бипазы и ее мутантов в пределах 150 —200 мг на литр культуры.

На рис. 4 представлено типичное электрофоретическое разделение проб культуральн ой жидкости, отобранных на

различных стадиях роста культуры штамма—продуцента. Как видно, количество примесных белков весьма велико и поэтому нами был разработан новый метод очистки экспрессируемых РНКаз.

Рисунок 4. Элсктрофорстичсское разделение проб культуральпой жидкости, отобранных па разлтгчиых стадиях роста культуры штамма — продуцента биназы х£,— 1 Ыие [рВ1Т36]. Градиентный ПААГ (7-20%) п присутствии ДСН.

1— маркеры молекулярного веса 69, 55, 43, 17 и 14 кДа, 2 — 6 — образцы через 0, 6, 8, 10 и 12 ч поело индукции соответственно. На гель наносили по 100 мхл освстлёшюй культуральпой жидкости.

2. Разработка схемы очистки рекомбипантных РНКаз.

Малый размеры изучаемых белков и их высокая стабильность делают воможным применешю в качестве одной из стадий очистки такого высокоэффективного метода, как

обращенно — фазовая хроматография высокого давления. Нами было исследовано ноподешю бипазы и барнази п услоенях CD —П2ЛСХ при использошишн различных типов неподвижных фаз и элюентов. В процессе исследований было обнаружено наличие зависимости выхода белка с колонки от рН подвижной фазы (рис. 5 j. Этот эффект проявлялся п том, что РНКаза, нанесенная на ОФ — колонку с фазой С1в не элюировалась с нее градиентом концентрации ацетонитрила в том случае, если рН водной • составляющей подвижной фазы был больше 7. Но она могла быть лото и с пысоким выходом элюирована поело переуравновешивания колонки в кислый буфер (рН2 — 2.5) и повторения цикла элюции (рис. 6). Как видно из рис. 5, эффект зависимости выхода от рН наиболее ярко проявляется на фазе С18 и не отмечен на фазе С2.

Рисунок 5. Зависимость выхода РНКазы с колонки от рН элюента для обращенно— фазовых сорбентов, отличающихся длинной алкильного м оди фи кагора.

1 — сорбент С2, 2 — сорбент С4, 3 — сорбент С8, 4 — сорбент С18 Выход РНКазы с колонки ( в % от нанесенного)

рН элюента

Биназа и барназа являются первыми белками (из более чем нескольких сотен, поведение которых в условиях ОФ ВЭЖХ описано в литературе) для которых обнаружен подобный эффект. Нами не было отмечено ничего подобного при изучении структурных аналогов биназы и барназы из семейства микробных РНКаз таких как РНКазы Т,, РЬ, и Я и только такие близкие к биназе и барназс белки как РНКазы В1 и Вр ведут себя аналогичным образом.

Рисунок 6. Хроматографичоское разделении образца чистой барпазм с использованием "двойного градиента". Условия хроматографии: колонка — Ь)ис1ео$П 130 С18, 4" 150мм. Подвижная фаза: 0.1М ацетат аммония (рН =7.5) — ацетонитрил (первый градиент). 0.1% ТФК — ацетонитрил (второй градиент). Скорость элюции: 1мл/мип. Полная шкала — ЮЕ.

Егво (% от полной шкалы) % ацетонитрила

Время, минуты

Естественно возникает вопрос о причинах возникновения такого эффекта. Нами была предложена гипотеза, объясняющая найдешшй эфект образованием димерной молекулы РНКазы в процессе ОФ—хромапмрафии. В рамках этой гипотезы алкильная цепь сорбента оказывается встроенной между двумя молекулами белка формирующими димер. Т.к. структура такого "сэндвича" оказывается стабилизированной но только гидрофобными, но и электростатическими взаимодействиями, ослабления только гидрофобных взаимодействий увеличением концентрации органического модификатора оказывается недостаточным для разрушения этой структуры и, следовательно, элюции белка с колонки. Для проверки этого предположения были проведены эксперименты по гель—проникающей хроматографии бипазы, как » присутствии в буфере гидрофобного компонента, так и без него. Результаты этих экспериментов подтверждают образование димора биназы в присутствии гидрофобного соединения и его разрушения при сдвиге рН в кислую сторону (Таб. 1).

Обнаруженный нами эффект зависимости выхода РНКаз с ОФ—сорбента от рН элюента был положен в основу предложешюго 2-х стадийного метода очистки биназы и барназы.

Первая стадия — концентрирование белкового препарата. Для этой цели *мы используем хроматографию в объеме на фосфоцеллюлезе, но возможно использование и других методов концентрирования. Вторая стадия — ОФ —ВЭЖХ с

использованием двойного градиента. Полученный на первой

Таблица 1. Соотношение площадей пиков димера и мономера биназы при различных рН элюирующего буфера. Условия хроматографии: Колонка — Снласорб 400 Диол. 6*250 мм; буфер — 0.1 М ацетат — фосфат аммония содержащий 3% п — бутилового спирта. скорость плющи! — 500 мкл/мип.

рН элюирующего буфера Соотношение площади пика димера к площади пика мономера

7.5 21

6.0 1.2

5.0 0.45

4.0 0.19

3.5 0.09

2.2 0

стадии концентрированный препарат белка наносится на колонку с фазой С!8 и примеси элюируются градиентом ацетонитрила в буфере с рН 7.5. Затем колонка иереуравновешивается в кислый буфер рН2—25 и цикл элюции повторяется, при этом с колонки элюируется с высоким выходом гомогенная РНКаза (рис. 6). В таблице 2 представлены схемы очистки РНКаз и величины выходов целевого белка на каждой стадии.

Конечный выход составляет 88 — 91% и в основном определяется выходом на первой стадии очистки. Все полученные в данной работо мутантпыо производные РНКаз были очищены с использованием этой схемы. В виду того, что при очистке белка используются довольно жесткие условия (высокая концентрация органического растворителя и низкие значения рН) возникает вопрос о правильности и полноте фолдшпа РНКаз, очищенных по этой схеме. В лаборатории G.G. Podson (University of York, UK) была получена трехмерная структура бинлзы и одного из ее мутантов с разрешением 1.8 Л), очищенных с использованием приведенной выше схемы. Показана идентичность структуры рекомбинантной биназы с опубликованной ранее струк—турой белка и сохранение

хода цепи Са лтомоп в сфуктуро мутанта биндзы.

Для определения количества белка в культуральной жидкости наряду с определением РНКаэной активности, одним из описанных в "Материалах и Методах" способом, использовался также разработанный нами метод, основанный на применении обращенно — фазовой ВЭНСХ.

Этот метод обладает рядом преимуществ по сравнению с традициошшми методами, в которых определяется ферментативная активность РНКазы. Прежде всего, это короткое время анализа — полный цикл занимает всего 22 минуты. Результаты получаются в форме весовой концентрации белка, а не единиц активности. Метод характеризуется высокой воспроизводимостью и точностью определения количеств белка (5%) даже в случае, если в определяемом образце присутствуют примеси, ингибирующие активность фермента. Для определения концентрации белка по площади пика используется калибровочная кривая, которая

Таблица 2. Схема очистки РНКаз Ва, В1, В1 и Вр на Оф — колонке с использованием метода "двойного градиента".

Стадия очистки Объем, мл Общий белок, мг/мл Количество РНКазы, мг Выход, %

РНКаза Ва Культу альиая жидкость XL — 1 Blue [pTN441] 1000 1.3 480 100

После хроматографии на Р11 80 9.7 456 95

После ОФ-ВЭЖХ * 446 • 98

РНКаза Bi Культу АЛЫ1&Я жидкость XL— 1 Blue [pBIN36] 1000 1.1 95 100

После хроматографии на СП —Трисакриле 95 8.2 86 91

После Оф-ВЭЖХ * 83 97

РНКаза Bt Культу алш&я жидкость Вас. thiiringiensis 2000 0.4 1.2 100

После хроматографии на Р11 80 6 1.1 93

После ОФ-ВЭЖХ " 1.0 98

РНКаза Bp Сульфат — аммонийная ф акция культу— алыюй жидкости Bàc.pumilcs 15 11.3 5 100

Поело ОФ-ВЭЖХ " 4.7 95

' — после ОФ — ВЭЖХ белок лиофилыго высушивался, взвешивался и его количество определялось в отобранной навеске по коэффициенту экстинкнии. '

строится заранее. С ее помощью возможно надежное определение белка в пике от 7 до 200 мкг.

В нашей экспрессионной системе используется лидерный пептид щелочной фосфатазы Е. coli (phoA), который экспрсссируотся слитно • с геном РНКазы, а затем при транспортировке белка в периплазму отщепляется специфической протеазой. При использовании лидорных пептидов всегда встает вопрос о правильности и глубине процессинга зрелого белка.

Для доказательства правильности отщепления лидерного иеш^да экснрессированный белок был выделен, очищен и просиквешгрованы 15 а.к. с N—коща. Сиквенс показал, что аминокислотная последовательность рекомбинантных РНКаз не

отличается от аминокислотной последовательности белка, выделенного из природного источника. Однако при изучении экспрессии бипазы, в случае индукции с помощью теплового шока, нами было отмечено несовпадение данных по количеству экспрессируемой РНКазы, полученных с при измерении РНКазной активности и количества бипазы, определенной с помощью ОФ ВЭЛ<Х.

Исследования показали, что кроме правильно

процессировашгой биназы в культуральной жидкости присутствуют значительные количества (до 100 мг/л) белка, представляющего собой биназу с семью лишними аминокислотными остатками из состава сигнального пептида на N —конце. Этот' белок обладает РНКазной активностью (сравнимой с активностью белка дикого типа), но значительно более гидрофобен чем биназа дикого типа и при анализе методом ОФ ВЭЖХ элюируется с колонки позднее биназы (рис. 7). Дополнительные исследования показали, что неправильно процессировагшый болок

присутствует в культуральной жидкости как в случае бипазы так и в случае барназы. Однако если для. барназы количество неправильно процессировшшого белка не превышает 4—5 % (от количества правильно процессированпого белка) и не зависит от

Рисунок 7. Разделение правильно и неправильно процессировашюй бипазы на ОФ—колонке. Пик 1 —биназа, пик 2 — неправильно прогрессировалиая биназа. Условия хроматографии: колонка Nucleosil 130 С18, 4*150 мм, подвижная фаза: 0.1% ТФК - 0.07% ТФК в ацетонитриле, линейный градиент 30 — 42% за 25 минут. Скорость элюции 1 мл/мин.

А-230 ( % от полной шкалы) юо

% ацетонитрила

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

0.00

10 . 00

15 . 00

20.00

Время, (мин.)

метода индукции, то в случае биназы наблюдается резкое различие в количестве неправильно процессированпого белка, в зависимости от метода индукции.

При использовании "ленивой" индукции количество неправильно процессированпого белка не превышает 10 — 15%. При использовании теплового шока количества нормального и неправильно

процессировашюго белка примерно равны. Строгое объяснение этого феномена мы дать не можем, однако можно предположить, что 0ТВ0ТСТВСШ1ЫМИ за неправильный процессинг являются отличия в Ы— концевой части барназы и биназы. В виду того, что при очистке биназы и барназы используется ОФ ВЭЖХ, очищенный белок по содержит примесей неправильно процессированной формы, чем и объясняется ранее отмеченное отсутствие различий в аминокислотных последовательностях рекомбинантных РНКаз и соответствующих амшюкислотных последовательностях белков, выделенных из природных источников.

3. Изучение субстратной специфичности мутантных производных РНКазц биназы в области связывания основания субстрата.

Фермента расщепляющие РНК подразделяют на две большие группы: фосфотрансферазы (циклизующие РНКазы) и фосфогидралазы.

Таблица 3. Участок аминокислотной последовательности, ответственный за связьшание гуанозинового основа1шя. (Выделены

Фермент Аминокислотная последовательность

РНКаза Т1 (1) 42 Туг 43 Аьп 44 Ляп 45 Туг 46 С1и 47 ау 48 РЬе

РНКаза РЬ5 (1) 40 Туг 41 Из 42 Абп 43 Туг 44 Ои 45 ау 46 РЬе

РНКаза Ба (1) 37 РЬе 38 С1п 39 Ляп 40 Агд 41 С1и 42 Бег 43 \Ла1

РНКаза ТЪ! (1) 41 Туг 42 Лаз 43 Азю 44 Туг 45 аи 46 ау 47 РЬе

Барназа (2) 56 РЬе 57 Бег 58 Аа1 59 Агд 60 аи 61 ау 62 Ьуэ

РНКаза Вр (2) 55 РЬе 56 Бег 57 Ляп 53 Агд 59 аи 60 ау 61 Агд

РНКаза Вс2 (2) 56 РЬе 57 Бог 58 Аяп 59 Агд 60 С1и 61 ау 62 Г.уз

Биназа (2) 55 РЬе 56 Бег 57 Ляп 58 Агд 59 С1и 60 ау 61 Агд

1 — гушшлспецифическио РНКазы

РНКазы. 2—гуанилпредпочтительные

Ферменты первой группы используют 2' —ОН группу рибозы во внутримолекулярной атаке на примыкающую фосфо — диэфирную (ФДЭ) связь, в результате чего образуются циклические 2',3' — диэфиры, которые затем гидролизуются до соответствующих нуклеозид—3"—монофосфатов. Циклизующие РНКазы часто проявляют более или менее ярко выражс1шую специфичность к \грироде оснований прилегающих к 3" — концевой разрываемой ФДЭ связи.

Фосфогидроллзы катализируют прямую атаку водой З'.У —ФДЭ связи в нуклеиновых кислотах. Ферменты этой группы могут но обладать специфичностью к углеводу в нуклеиновых кислотах и

таким образом способны рас1цсплятъ ФДЭ связи как между рибоиуклсотидами, так и между дезоксирибопуклеотидами.

Только ферменты первой группы, фосфотрансферазы, специфичны к типу углевода в молекуле субстрата и способны расщеплять только рибонуклеиновые кислоты, поэтому их иногда называют истинными рибонуклеазами.

В работе Hill С., et al„ (Trends. Biochem. Sei., v.8, pp.364-369, 1983) был проведен анализ и сравнение ' первичных и третичных структур ряда РНКаз продуцируемых грибами и батериями, и на основании выявленной структурной гомологии было предложено объединить эти белки п семейство микробных РНКаз. В работе Sevcik J„ et al„ (TIBS, v. 15(4), pp.158-162, 1990) в' это семейство были включены еще несколько новых белков. Все эти ферменты относятся к классу циклизующих фосфотрапсфорлз (К.Ф. 3.1.4.).

При структурно —функциональном анализе, в семействе микробных РНКаз, можно выделить две группы белков, отличающихся между собой как структурными особенностями, так и специфичностью к природе оснований прилегающих к 3'—концевой разрываемой ФДЭ связи. Первая группа — это гуанилепецифичные РНКазы, вторая — гуанилпредпоч-гатсльные РНКазы.

Ферменты принадлежащие ко второй группе получили своо название ввиду того, что проявляя специфичность к гуанозину, на коротких рибопуклеотидных субстратах они способны к эффективному гидролизу ФДЭ связей в субстратах типа поли(М), где N — пурин.

Анализ аминокислотных последовательностей и

пространственной структуры белков членов семейства микробных рибонуклеаз и их комплексов с производными гуанозина позволил выявить значительное сходство в аминокислотном составе и в пространственном строении участка полипентидной цепи в котором происходит связывание основания субстрата, так называемой "узнающей петли "(табл. 3, рис. 8). Так например отличия между гуанилспецифической РНКазой из Streplomyccs eurcofaciens (РНКаэа Sa) и гуанилпредпочтителъной РНКазой бипазой(РНКаза Bi) проявляются по трём амипокислотчшм остаткам: серии 56. глицин 60, аргинин 61 — для биназы и соотоетстаетю глутамип 38, серии 42, валин 43 для Sa (табл. 3). Оба этих фермента проявляют одинаково высокую специфичность к основанию, на коротких субстратах. таких как 2',3' — циклофосфаты и дтгуклеозидмонофосфаты. Однако, эти РНКазы заметным

образом отличаются по своей специфичности на

полирибонуклоотадщ^х субстратах (табл. 4).

Для выяснения роли аминокислотной последовательности участка узнающей петли в механизме дискриминации первого основания полирибонуклеотидного субстрата нами был получен ряд мутантов биназы, у которых эти аминокислотные остатки были заменены па соответствующие аминокислотные остатки РНКазы Sa. Эти мутанты были выделены и их свойства были исследованы в реакциях гидролиза РНКа и ттуриновых гомополирибонуклеотидов.

Представленные в таблице 5 результаты измерения относительной активности мутантов биназы в реакции гидролиза РНКа показывают, что все мутанты являются активными и следовательно основания предполагать какие либо существенные измонения в структуре белка отсутствуют. Значения кинетических параметров гидролиза пургаювых гомополирибонуклеотидов, получешшми нами мугантоми биназы, представлены в таблице 6.

Из сравнительного анализа кинетических констант РНКаз Ба и биназы в реакциях гидролиза полирибонуклеотидов (таб. 4) видно, что кажущиеся константы связывания для поли(1) и поли(А) (для каждого фермента в отдельности) отличаются примерно на порядок. РНКаза Ба явлстся самым гуанилспецифическим ферментом в семействе (гидролизуег поли(1) в 4.8*10® раз более эффективно чем поли(А)), а биназа обладает наименее ярко выраженной гуанилспсцифичностыо (1/А=»5.7). Однако если сравнить отношения Ктполи^ к Кт0ОЛИ(д) для биназы и За, то окажется что эта величина у Ба тол].ко в 3.6 раза меньше чем у биназы и следовательно вклад именно специфического связывания основания в петле узнавания не может превышать порядок величины Кто. Сравнение индивидуальных величин Кт для каждого субстрата вданном случае не корректно из за значительной разницы в количестве положительно заряжстшых аминокислотных остатков имеющихся на поверхности Ба и ¡Ей (Е.Ю. Колбановская, неопубликованные данные), и следовательно различного вклада неспецифического связывания полисубстрата в величину Кт для этих ферментов. Таким образом и строго гуанилспецифическая РНКаза Ба и гуанилпредпочтительпая РНКаза биназа связывают субстраты типа поли(Ы) (где N — пурин) с практически одинаковой эффективностыо.Учитывая что, ранее) было показано примерное равенство величин Кя и Кта для рибонуклеаз, (Э. Фершт. Структура и механизм действия ферментов, Москва, Мир 1980) можно сделать вывод о том что связывание основания в петле незначительно влияет на величину константы связывания. По этому, замены аминокислотных остатков в узнающей петле биназы на аминокислотные остатки из узнающей петли РНКазы Ба не должны приводить к существенным изменениям Кт у мутантных белков. Этот вывод подтверждается полученными нам и экспериментальными результатами (таб. 6). Как видно из этой таблицы, величины кажущихся констант связывания, в реакциях гидролиза пуриновых гомополирибопуклеотидов, для всех мутантных белков существенно не изменились по сравнению с белком дикого типа.

Как видно из таб. 6 наибольшим изменениям, у получещгых нами мутантных форм биназы, подверглась величина кса1. Легко найти следующие 'особенности характерные для всех мутантных белков:

1. Величина кса, для поли(А) у всех полученных нами мутантов меньше чем у биназы дикого типа.

Z Соотношение к^, для поли(1) к к^, для поли(А) у всех полученных нами мутантов не менее чем в 10 раз больше чем у биназы дикого типа.

Рисунок 8. Структура участка связывания первого основания субстрата РНКаэ биназы (а) и За (б).

а

б.

Таблица 4. Кинетические параметры реакции гидролиза гомополирибонуклеотидов микробными РНКазами. рН = 6.2, t — 25° С, I-0.1M.

РНКаза Споци — Субст ат Kin kco,/ Km I/A

фичлость (цМ) (с"') (lyre-1)

1 поли(1) 833 485 5.84 0' 29*10'

п оли (А) 2000 4.Г10-3 2

поли(и) — — <0.02

поли (С) — — <0.02

РЬ,° 1 поли(1) 770 118 1.1-10' 7.3-10'

поли (А) — — 0.15

иоли(Ч) — v <0.02 '

поли(С) — — <0.02

Sa" 1 ноли(1) 133 385 29" 10° 4.8-10°

поли (А) 2500 1.5-10"3 0.6

а поли (и) поли(С) - - <0.02 <0.02

Bi 2 поли(1) 29 28 1.1-10" 5.7

поли (А) 150 30 1.9- 10s

а поли (У) а поли(С) 5000 170 2 0.025 400 150

Вл ' 2 поли(1) 37 1108 3*10' 404

поли (А) 350 24 6.8*101

вРь 2 поли(1) 22 105 4.8-10° 38

поли (А) 500 58 1.2-104

1 — гуанилспецифичоские РНКазы, 2 — гуанилпродпочтительные РНКазы

* - 1/А ^(к^/КттЦполит)/!^, /Km(поли(А)), а - Both V., et al„ BBRS, v. 177(2), pp.630-63S, 1991 b — H.K. Струминская и др., Виол, науки, т.2, с.41 —44, 1992

Таблица 5. Относительная активность мутантов биназы и РНКазы Sa в реакции гидролиза РНК, рН«=7.5, 1 = 0.1М

Белок Опшсительная активность, в %

Bi, w.t 100

Sa 94

Bi, Arq61Va] 280

Bi. Gly60Ser 20

Bi.Gly60Sor, Arq61Va) /go

Bi. Se-г £bZe.hfAt<j£/Y«€

Bi,Gly60Ser, Ser56Gln, Arg61Val 25

Эти данные позволяют сделать вывод что правильное связывание первого основания субстрата в петле узнавания, т.е. ограничение его подвижности, приводит к увеличению эффективности катализе!, по всей видимости за счёт ограничения конформационной подвижности

Таблица 6. Кинетические параметры реакции гидролиза поли(1) и поли (А) при рН 6.2, t = 25°C, 1 = 0.1М для РНКазы Sa, бипазы и ее мугат iron._

Белок Субс- Km Ст. Ст. k^/Km I/A*

трат (цМ) ошибка (с ) ошибка (M-'c-'j

(%) (%)

Sa [1] "pïïT"1 t33 385 29-10° 4.8*10"

JEÍñ) 2500 1.5*10_ï 0.6

Bi Г P(i) 29 ±11.3 30 ±9.4 1.1-10° 5.7

P(A) 150 ±15.2 28 ±14.1 1.9" 10s

BÍR61V P(D 110 ±6.8 203 ±4.3 1.8-10" 18

P(A) 150 ±14.4 15 ±7.5 Í.O'IO5

BÍG60S PÜT 56 ±10.8 7.2 ±8.6 1.3-10' 42

P(A) 230 ±8.2 0.71 ±4.8 3.1-10э

BÍR61V, P(I) 46 ±10.8 40 ±7.7 8.7*103 72

G 60S P(A) 130 ±11.3 1.5 ±5.8 1.2-104

BÍR6IV, P(I) 86 ±7.8 7 ±5.4 8.1-10J 27

G60S, P(A) 184 ±7.2 0.5 ±4.4 3.4*103

S56Q

" - I/A = к„,/Кт(поли(1)) / к^,/Кт(поли(А)) р(1) — поли(1), р(А) — цоли(А)

[1] — Both V., Moiscyev G.P., Sevcik J., Specificity of guanilic RNases to polinuclootíde substrates - 1991, BBRC, v.177, N2, p.630-635.

рибозы и следовательно увеличения вероятности её нахождения в каталитически продуктивной конформации.

Важным результатом является то, что хотя ни один из мутантных белков но стал полностью гуанилепецифичным, соотношение /Km для поли(1) к /Km для поли(А), т.е.

гуаиилепецкфичность, у всех полученных нами мутантов больше чем у бипазы дикого типа.

Таким образом полученные нами результаты в совокупности показывают, что различия в специфичности гуанилспецифич1сьсс и гуанилпредпочтительных РНКаз в реакциях гидролиза полисубстратов обусловлены не только различиями в структуре участка связывания гуанилового основания, но и другими причинами, например неспецифическими электростатическими взаимодействиями белка с полисубстратами.

На основании только кинетических данных однозначная интерпретация роли таких замен как Arg61Val и Gly60Ser затруднительна. Поэтому, в сотрудничестве с лабораторией структуры белков Йоркского университета, в настоящее время ведутся работы по получению 3-х мерных структур некоторых из полученных нами мутантов бипазы а также их комплексов с производными гуанозина и адеиозина.

ВЫВОДЫ

1. Разработана высокоэффективная система для экспрессии барназы и биназы в £. coli, основанная на использовании сильного, строго регулируемого промотора Рг фага \ под контролем термочувствительного репрессора.

2. Для ряда бациллярных внеклеточных рибонуклеаз обнаружен эффект зависимости количества белка, элгоиругащегося с обращешго — фазового сорбента от pH' подвижной фазы. Предложена гипотеза, объясняющая найденный эффект и получено экспериментальное подтверждение этой гипотезы.

3. Разработана 2-х стадийная схема очистки внеклеточных бациллярных РНКаз и их мутантных производных базирующаяся на их свойствах в условиях ОФ— ВЭЖХ.

4. Получены мутантные производные барназы и биназы в области "узнающей петли". Изучены их каталитические свойства в реакциях гидролиза пуриновых гомополирибонуклеотидов.

5. Продемонстрировано, что вклад специфического связывания основания субстрата в "узнающей петле", в величину константы связывания, незначителен. . '\

6. Показано, что замена "узнающей петли" гуанил— предпочтительной РНКазы Bi на "узнающую петлю" гуаш1лспецифичной РНКазы Sa не приводит к полному измснешгно гуанилспецифичности мутантного белка в реакциях гидролиза гомополирибонуклеотидов.

Список ]->.бот опубликованных по тог-'! диссертации

1. АЛ. Окороков, К.И. Панов, Н.Д. Федорова, Новые подходы в изучении экспрессии и очистки внеклеточных бациллярных РНКаз и их мутантпых производных; Биотехнология, 1992, т.5, стр.40—42

2. АА. Шульга, А-Л. Окороков, К.И. Панов, Ф.Т. Курбанов, Б.К. Чернов, К.Г. Скрябин, М.П. Кирпичников, Суперпродукция рибонуклеазы Bacillus intermedins TP (биназы) в Escbetihia coli. Молекулярная биология, 1994, т.28, вьш.2, стр.453 — 463.

3. ЕЛО. Колбановская, А-Л. Окороков, К.И. Панов, К.М. Поляков, Р.В. Хартли, М.Я. Карпейский, Мутант барназы Ser57Ala: Получение и свойства. Молекулярная биология, 1994, т.28, вып.З, стр, 602—609

4. Panov К.1., Purification of ЬасШ ribonucleases by reversed—phase high—performance liquid chromatography, J of Chromatography A 1994, V. 670, pp. 229 - 233

5. Okorokov A.L, Hartley R.W., Panov K.L, An improved system for ribonuclease Ba expression, Protein expression and purification, 1994, V. 5, pp.95-108