Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гидрофобных аминокислот (TRP) зрелой части биназы на ее секрецию

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние гидрофобных аминокислот (TRP) зрелой части биназы на ее секрецию"

РГБ ОД 1 5 ДЕК 1996

На правах рукописи

ЛОПУХОВ Леонид Валентинович

ВЛИЯНИЕ ГИДРОФОБНЫХ АМИНОКИСЛОТ (ТКР) ЗРЕЛОЙ ЧАСТИ БИНАЗЫ НА ЕЕ СЕКРЕЦИЮ.

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ -1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биофизики Казанского института биологии и лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов Казанского государственного университета.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

доктор физ.-мат. наук профессор Федотов В.Д.

академик АН РТ, доктор биологических наук профессор Лещинская И.Б.

доктор химических наук, профессор Жданов Р.И.

доктор биологических наук, профессор Чиков В.И.

Ведущая организация Казанский государственный

медицинский университет, г. Казань

Защита диссертации состоится уё^с^^А 1996 г. ( 7из. заседании диссертациошюго Совета К 053. 29. 19. при Казанском государственном университете имени В.И.Ульянова - Ленина по адресу: 420008, Казань, ул. Ленина, 18

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан Н^^Ь^Л 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета АскароваА.Н.

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

В настоящее время исследователями накоплен большой материал по механизмам секреции полипептидов в бактериях. Наиболее значительная часть исследований касается роли в этих процессах сигнальных пептидов. Известно, однако, что зрелая часть некоторых белков может играть важную роль в процессах их секреции. В последнее время интерес исследователей к проблеме влияния зрелой части секретируемых белков на их секрецию значительно возрос. Так, показано, что замена гидрофобных остатков зрелой части на гидрофильные может блокировать секрецию некоторых белков (Robertson et al., 1994). Показано также, что определенные мотивы первичной последовательности в зрелой части белка могут существенно влиять на способность белка быть сскретированцым. Предполагается, что эти части первичной последовательности играют определяющую роль в принятии пресекреторным белком конформации, способной трапслощгроваться (Cheah et al., 1994).

Интересную модель для изучения роли зрелой части белка в его секреции представляет из себя внеклеточная рибонуклеаза Bacillus intermedius 7Р (биназа). Биназа является в настоящее время интенсивно изучаемым белком. Ее ген проклонирован в E.coli. Трехмерная структура биназы определена методом рентгеноструктурного анализа, и проведено соотнесение сигналов ее ЯМР - спектра с первичной последовательностью.

Биназа является небольшим белком, без дисульфидных связей, секретирующимся как в нативном штамме-продуценте, так и в рекомбинантных штаммах E.coli, во внешнюю среду. Видимо, биназа, как и некоторые другие внеклеточные нуклеазы, принадлежит к "самосекретирующимся" белкам. Тот факт, что нуклеазы и многие другие внеклеточные белки могут секретироваться в ростовую среду клетками граммотрицательных бактерий - рекомбинантными штаммами E.coli, свидетельствует, что определенная информация, необходимая для секреции этих белков, содержится в самой

последовательности белка и для секреции последнего не требуются дополнительные белковые факторы (И.Б.Лещинская и др. 1991) Несомненно, что гидрофобные аминокислоты зрелой части белка должны играть большую роль в реализации этой информации. Представляет большой интерес выяснить эту роль гидрофобных аминокислот. Компьютерный структурный анализ и сайт-специфический мутагенез могут дать принципиально новую информацию о механизмах влияния отдельных гидрофобных аминокислот в зрелых частях белков на их способность к секреции.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью данной работы было выяснение механизмов влиянии гидрофобных аминокислот в зрелой части сегрегируемых белков на их секрецию на примере бипазы, в сравнении с препромелиттнном и гормоном роста человека. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Провести исследование гидрофобных взаимодействий с участием некоторых гидрофобных аминокислотных остатков (Тгр) методом ЯМР.

2. Провести сайт - специфический мутагенез биназы по остаткам триптофана.

3. Исследовать влияние мутаций по остаткам триптофана на секрецию биназы.

4. Провести сравнительный компьютерный анализ особенностей структур препромслитгина, гормона роста человека и биназы с точки зрения их влияния на секрецию.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Впервые проведен сравнительный компьютерный анализ структур зрелых частей нолипептндов, влияющих на их секрецию, для таких белков, как препромелиггин, гормоны роста и внеклеточная щелочная рибонуклеаза Bacillus intermedius 7Р. Обнаружено, что зрелые части белков, для которых показано их влияние на секрецию, состоят из амфифилышх вторичных структур. На основании

компьютерного анализа и исследований методов ЯМР показано, что остаток Тгр34 биназы участвует в формировании вторичных структур амфифильной природы, которые могут влиять на секрецию белка.

Методом сайт-специфического мутагенеза показано, что замена остатков Тгр34 и Тгр70 па менее гидрофобные остатки (Asp) блокирует секрецию биназы в клетках К coli.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертационной работы были доложены на 16 Международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Пью Дели, 1994 ), VI Конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1994 ), Первом Евроазийском симпозиуме по современным достижениям в биотехнологии (Анкара, 1995).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве штаммов-рецепиентов для плазмид, несущих гены мутантных биназ и биназы дикого типа были использованы штаммы E.coli SURE и XLI Blue. Конструкции, несущие гены мутантных и собственный промотор биназы

Рис. 1. Схематическое представление конструкций, полученных для биназы дикого типа и мутантов Trp34->Asn и Trp70-^Asn биназы. (Показана только вставка.)

дикой биназы под собственными промотором и сигнальной последовательностью биназы были получены путем клонирования соответствующих PCR-фрагментов в вектор pBlueScript KS+ (см. рис. 1). Гены мутантных биназ были получены методом PCR с перекрывающимся наращиванием (overlap extention PCR) (Но, Hunt,

Xbal

-t-BOH^

зрелая часть биназы б ар стар

Horton, Pullen, & Pease, 1989). Для получения каждой мутации использовалось 4 праймера: 2 мутагенных и 2 концевых.

Для выделения плазмид использовалась стандартная методика (Birnboim, Doly, 1979). Трансформация E.coli плазмидами проводилась стандартным кальциевым методом (Маниатис и др. 1982).

Для исследования секреции мутантных и дикой биназы штаммы E.coli, несущие соответствующие плазмиды, выращивались на среде, оптимизированной для максимальной продукции биназы (под собственным промотором) (Знаменская и др. 1995). Инкубация E.coli проводилась при 37 С.

Для исследования локализации мутантных биназ применялись иммунохимические методы: иммунодиффузия по Оухтерлони (А.Ройт 1991) и Вестерн-блотгинг (Bumette W.N., 1981) с применением набора реакгивов ProtoBlot фирмы Promega (USA) и специфической антисыворотки к биназе. Блоттинг проводился на нитроцеллюлозные мембраны с применением аппарата для полусухого электропереноса.

Данные по структурам интересующих нас белков были получены из Protein Brookhaven Databank (USA) с помощью компьютерной сети Internet. Данные по структуре биназы были любезно предоставлены А.Г. Павловским.

Для анализа структур белков были составлены компьютерные программы на языке С++, позволяющие численно обрабатывать файлы структурных данных для белков, представленные в формате PDB (Protein Brookhaven Databank). Первоначально эти программы были использованы при анализе структуры фермента субтилизина (Lopoukhov et al. 1995). Для графического представления структур анализируемых белков была использована программа HyperChem (фирмы Autodesk).

Для исследований методом ЯМР на протонах использовался спектрометр фирмы Bruker с рабочей частотой 400 МГц. Образцы белка готовились в Na-ацетатном буфере с добавлением фумаровой кислоты. Фумаровая кислота служила внутренним индикатором pH.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Анализ гидрофобных взаимодействий в биназс дикого типа методом ЯМР.

Для анализа гидрофобных взаимодействий остатков триптофана с другими аминокислотами в биназе дикого типа в растворе был использован метод ЯМР. В протонном ,ЯМР-спектре биназы в растворе имеется несколько хорошо разрешенных сильнопольных сдвигов. Благодаря соотнесению ЯМР-спектра биназы, приведенному в работе (Курочкин А.В. и др. 1994) мы могли определить принадлежность этих химсдвигов к определенным остаткам.

Из проведенного нами компьютерного анализа структуры биназы, определенной методом рентгеноструктурного анализа, мы нашли, что именно эти аминокислотные остатки должны иметь силыюполмтые химедвиги за счет взаимодействия с ароматическими остатками, и из них два - за счет взаимодействия с остатками триптофана: 11е50 - за счет контакта с остатком Тгр34, а Ьеи62 - за счет взаимодействия с несколькими ароматическими остатками, в том числе Тгр70.

Чтобы выяснить значение этих контактов для третичной структуры биназы, был снят ряд спектров в диапазоне рН 2 - 5. Результаты этого эксперимента показаны на рис. 2. Можно видеть, что изменение сильнопольного химедвига при различных рН для остатков Ьеи62 и 11е50 очень незначительно. Таким образом, мы видим, что те контакты остатков триптофанов с алифатическими остатками, которые мы можем предположить из данных рентгеноструктурного анализа, действительно присутствуют в биназе в растворе и являются постоянными в широком диапазоне рН. Последний факт говорит об их важности для формирования трехмерной структуры биназы. Надо также отметить, что при исследовании методом ЯМР мы не наблюдаем рН - зависимого конформационного перехода, описанного в статье (Голубенко И.А. и др. 1981).

I.... I. . . . I.... I.... I.... t.... I — I.,., I — I,,, I 1 0.5 0 .0.5 -1 -1.5

p.p.m

Рис. 2. Силыюпольная часть ЯМР -спектров биназы при разных рН.

Исследование РНКазной активности в штаммах, несущих гены биназ Trp34-Asn и Trp70-Asn.

РНКазная активность была определена методом учета прироста кислоторастворимых остатков в культуральной жидкости, периплазме и лизате еферопластов суточных культур штаммов SURE, несущих гены биназ Trp34-Asn и Trp70-Asn и ген биназы дикого типа. В культуральной жидкости и периплазме культуры штамма SURE, несущего ген биназы дикого типа, РНКазная активность составляла в среднем 6200 ед. и 4800 ед. соответственно. В лизате еферопластов

этого штамма РНКазная активность при исследовании данньм методом не наблюдалась. В культуралыюй жидкости, периплазме и лизаге сферопластов штаммов, несущих гены биназ Trp34-Asn и Trp70-Asn, РНКазная активность не наблюдалась.

Также проводилось исследование внеклеточной РНКазной активности вышеуказанных штаммов на чашках со средой для выявления внеклеточной РНКазной активности. При этом на чашку высеивалось уколом по б свежетрансформированных клонов одного из исследуемых штаммов и также высеивался положительный контроль (штамм SURE, несущий ген биназы дикого типа). На чашке со штаммом SURE, свежетрансформированным плазмидой с геном биназы дикого типа, вокруг всех шести колоний через 4-5 часов появились четкие зоны розового окрашивания (5-6 мм в диаметре), свидетельствующие о наличии РНКазной активности. Для всех колоний штамма SURE, свежетрансформировашюго плазмидами, несущими гены биназ Trp34-Asn и Trp70-Asn активность не наблюдалась даже после инкубации чашек при 37 С в течении 2 суток. При этом в положительном контроле РНКазная активность проявлялась.

Таким образом, эффективность трансформации конструкцией, несущей гены исследуемых биназ, была подтверждена тем, что все исследованные трансформанты, несущие ген биназы дикого типа, проявляли внеклеточную РНКазную активность. Однако, отсутствие РНКазной активности в культуральной жидкости, периплазме и лизате сферопластов штаммов, несущих гены биназ Trp34-Asn и Trp70-Asn, могло быть вызвано как отсутствием биназы, так и инактивацией фермента за счет глобального изменения конформации, поэтому для дальнейших исследований было необходимо применять иммунохимические методы.

Изучение локализации мутантных белков производных биназы.

Локализация биназы Trp34-^Asn и Trp70r>Asn изучалась при помощи иммунохимических методов. С помощью метода

иммунодиффузии по Оухтерлони было показано отсутствие мутантных белков в культуральной жидкости и периплазме E.coli, несущих их гены. В тех же условиях в культуральной жидкости E.coli, несущей ген для белка дикого типа, фермент однозначно выявлялся. Также методом иммунодиффузии не было выявлено накопления биназы Trp34->Asn и Trp70"^Asn в цитоплазме несущих их гены E.coli.

Наличие биназы Trp34-^Asn в культуральной жидкости, периплазме, цитоплазме и полном клеточном лизате E.coli, несущей соответствующий ген, было исследовано при помощи иммуноблоттинга. Результаты иммуноблотгинга представлены на рисунках 3-5. Из рисунков 3 и 4 видно, что в культуральной жидкости E.coli, несущей ген биназы Trp34->Asn, мутантный белок не определяется. На рис. 5 видно также, что биназа Trp34-^Asn не определяется и в периплазме. Интересно также, что биназа дикого типа представлена в культуральной жидкости двумя изоформами, различающимися по длине иолипептидной цепи. Это явление само по себе весьма интересно для понимания механизмов секреции и процессинга биназы в E.coli. В треках для полного лизата клеток E.coli, несущих биназу дикого типа и биназу Trp34-^Asn видны полосы, соответствующие предшественнику биназы. В обоих случаях эти полосы весьма слабы и хорошо видны только при максимальном усилении. В треке для полного лизата клеток, несущих биназу дикого типа наблюдается также полоса, соответствующая зрелой биназе (полоса с меньшей молекулярной массой).

Количество предшественников в клетках, несущих гены как биназы дикого типа, так и биназы Trp34->Asn очень невелико (на пределе определения методом Вестсрн-блоттинга), очевидно время их жизни в клетках мало. В случае белка дикого типа это объясняется его немедленным экспортом. Предшественник биназы Trp34-^Asn, вероятно, не будучи секретированным, разлагается клеточными протеазами (ассоциированными с мембраной).

I ?f f.b^vwiíoJíiUÍi

~ ^ ¿j; f ; I■ - :' * . * ■ ' ■ - ' ^ * i-* : * . r ' ^

Рис. 3. Всстсрн-блоттинг культуральных жидкостей и клеточных лизатов культур E.coli, несущих биназу дикого Tima и биназу Trp34->Asn.

1,2- культуралъная жидкость в случае E.coli, несущих конструкцшо с биназой дикого типа. 3, 4 - культуральная жидкость E.coli, несущих биназу Trp34">Asn. 5 -клеточный лизат E.coli, несущих биназу дикого типа, б - клеточный лизат E.coli, несущих биназу Trp34^Asn. 7 - клеточный лизат бесплазмидного штамма (контроль). Пробы в треки 1-7 наносились по 20 мкл. 8 - очищенная биназа дикого

т

1 ' ♦ J

Рис. 4. Тот же блоттшгг, что и на рис. 3, сосканированный с максимальной чувствительностью. Номера треков - такие же как и на рис. 3.

1 о

Нахождение биназы Ттр34-^А5п в полном лизате (включающем цитоплазму и мембранные фракции) и отсутствие ее в отделенной цитоплазме также предполагает, что она до момента деградации является ассоциированной с мембранами.

4 3 2 1 0

р -I -.«.. '

I

- ^ . • • ', - • V '

"■т .

Щ

Рис. 5. Вестерн-блоттинт с антителами, специфичными к бицазе. О - контроль (очищенная биназа дикого типа), 1 - культуральная жидкость культуры Е.соИ, несущей биназу Тгр34-^А5П, 2,3,4 -периплазма, цитоплазма и полный лизат (см. текст) той же культуры Е.соИ, соответственно.

Анализ структурных особенностей зрелых частей пресекреторных белков, существенных для секреции.

Бес-независимая транслокация препромелитгина относится к одному из тех случаев, когда зрелая часть полипептида играет большую роль в процессе транслокации через цитоплазматическую мембрану Е.соИ препромелитгин (СоЬе1 е1 а1., 1989). Препромелиттин имеет длину всего 70 аминокислот. Его последовательность приведена ниже (аминокислотные остатки зрелой части выделены жирным шрифтом):

МКПУЯУАЬУ РМУУУ1ЯУ1У ААРЕРЕРАРЕ РЕАЕАБАЕАО

ткс,ЮА УШ УЬ ТТЫРАЫ Бткитааа

Структура зрелой части мелиттина (в составе гомотетрамера) известна (см.рис. 6). Из рис.б видно, что структура зрелой части препромелиттина состоит из двух альфа-спиралей у которых сильно гидрофобные остатки сосредоточены, в основном, на одной стороне. Видно, также, что в состав одной альфа-спирали входит остаток триптофана и что положительно заряженные остатки сосредоточены ближе к концам зрелой последовательности.

Рис. б. Структура зрелого мелиттина (в составе гомотетрамера). Гидрофобные аминокислотные остатки выделены жирными линиями. Положительно заряженные аминокислотные остатки показаны знаком +.

Гормон роста человека также относится к белкам, экспорт которых в E.coli требует определенной последовательности зрелой части белка. Авторы работы (Cheach, К.С., 1994) показывают, что необходимая для успешного экспорта часть зрелой структуры белка -альфа-спирали 3 и 4. Структура зрелого гормона роста человека известна. На рис.7 представлены спирали 3 и 4 гормона роста человека в том взаимном расположении, которое они имеют в структуре белка. Видно, что гидрофобные аминокислотные остатки также в основном сосредоточены у каждой альфа-спирали на одной стороне. Несколько положительно заряженных аминокислотных остатков сгруппированы

на противоположенной гидрофобной стороне одной из альфа-спиралей. У другой же альфа-спирали на стороне, противоположенной гидрофобной, сгруппированы несколько отрицательно заряженных аминокислотных остатков. Также видно, что в структуре зрелого белка альфа-спирали 3 и 4 контактируют своими гидрофобными сторонами.

Таким образом, в двух случаях, когда показано влияние зрелой части белка на секрецию, те участки зрелой последовательности белка, которые ответственны за это влияние, имеют (по крайней мере в зрелом белке) выраженную вторичную структуру. В данных случаях это в некоторой степени амфифильные альфа-спирали, то есть альфа-спирали на одной стороне которых расположены преимущественно сильно гидрофобные, а на другой стороне - гидрофильные аминокислотные остатки.

Важно отметить, что образование вторичных структур, альфа-спиралей и бета-слоев, наблюдается на ранней стадии сворачивания белка и может происходить очень быстро. Даже если пресекреторный белок не полностью свернут и находится в состоянии, подобном "расплавленной глобуле" за счет взаимодействия зрелой последовательности с сигнальным пептидом и за счет функционирования белка SecB и молекулярных шаперонов, по крайней мере, элементы вторичных структур в нем, скорее всего, должны существовать. Видимо, участки зрелых частей пресекреторных белков, влияющие на секрецию, действуют при этом именно в виде вторичных структур. Это кажется тем более вероятным, что сигнальные пептиды, как показано (Reddy and Nagaraj, 1989), имеют выраженную вторичную структуру в условиях близких к условиям in vivo и эта вторичная структура является важной для их функционирования.

Рис. 7. Спирали 3 и 4 из структуры зрелого гормона роста человека. Жирными линиями обозначены гидрофобные аминокислоты, (+) - положительно заряженные, (-) - отрицательно заряженные.

Анализ структуры биназы.

В структуре биназы остаток Тгр34 находится на конце малой альфа-спирали, а Тгр70 - в петле между двумя бета-слоями. Также из данных рентгеноструктурного анализа и ЯМР (см. выше) известно, что Тгр34 взаимодействует с остатком 11е50, непосредственно прилегающим к бета-слою. Взаимодействие Тгр34 с остатками альфа-спирали, на конце которой он находится, можно наблюдать из рис. 8, 9 и 10.

Тгр34-А1а29

Рис. 8. Малая альфа-спираль биназы и остаток Тгр34. Водородные связи показа1ш пунктирными линиями.

Рис. 9. Часть структуры биназы. Отмечены остатки Тгр34, А1а29, входящий в состав малой альфа-спирали, 11е24, находящийся в начале малой альфа-спирали и 11е50, контактирующий с Тгр34.

На рис.8 видно, что пептидная груша, относящаяся к остатку Тгр34 имеет водородную связь с пептидной группой остатка малой альфа-спирали.

Из рис.9 видно, что Тгр34 имеет гидрофобный контакт с остатком А1а29, входящим в состав малой альфа-спирали биназы. Видно также, что остаток 11е24 контактирует с остатками 11е50 и А1а29, что тоже может быть важно для понимания функции Тгр34 в образовании вторичной и третичной структуры в этой области биназы, как это будет показано далее.

На рис.10 изображены аминокислотные остатки Тгр34, А1а29,

Рис. 10 Остатки 11е24, А1а29, Тгр34, Пе50 биназы.

11е24, Ие50. Видно, что остаток Тгр34 тесно взаимодействует с остатками А1а29 и 11е50. 11е24 также имеет гидрофобный контакт с А1а29 и 11е50. Гидрофобный контакт Тгр34-А1а29 может сам по себе стабилизировать альфа-спираль. Также, остаток Тгр34 служит как бы "основой" на которой "закрепляются" остатки А1а29 и 11е50, образуя, таким образом, гидрофобную поверхность, с которой взаимодействует

11е24. Важно, что "закрепляя" остатки А1а29 и 11е50, Тгр34 обеспечивает взаимодействие альфа-спирали и бета-слоя.

Конечно, все эти рассуждения относятся к сформированной структуре зрелого белка, однако, весьма вероятно, что такие же взаимодействия имеют место и в пресекреторной форме биназы. По крайней мере, ясно, что Тгр34 может участвовать в стабилизации расположенной рядом альфа-спирали и взаимодействовать с ней, даже если структура всего белка не является нативной. В свою очередь, малая альфа-спираль может принимать (в том числе за счет контакта Тгр34-11е50) участие в фолдинге бета-слойной структуры биназы.

Проведенный нами компьютерный анализ показывает, что малая альфа-спираль биназы имеет с ее бета-слойной структурой гидрофобные контакты, ионные и водородные связи и, таким образом, может оказывать серьезное влияние на ее формирование, так как известно, что бета-структурная часть барназы (близкого гомолога биназы) вообще неспособна принять упорядоченную конформацию без контакта с альфа-спиральной частью. Также проведенный нами компьютерный анализ показывает, что бета-слойная структура биназы является, в значительной степени, амфифильной.

Учитывая результаты, полученные нами при компьютерном анализе структур препромелиттина и гормонов роста, можно сказать, что именно амфифильные вторичные структуры играют важную роль в возникновении транслокационно-компетенгной конформации. Поэтому бета-слойная структура биназы должна быть важной частью ее транслокационно-компетентной конформации. Взаимодействия Тгр34 с остатками альфа-спирали и остатками, близкими к бета-слоям (11е50), могут "катализировать" дальнейший фолдинг пресекреторной формы биназы в транслокационно-компетентное состояние.

Таким образом, проведенный компьютерный анализ позволяет нам предположить, что наиболее вероятное обьяснение влияния Тгр34 на секрецию биназы заключается в его участии в формировании транслокационно-компстентной структуры.

Данные, получение с помощью сайт-специфического мутагенеза биназы, и анализ литературных источников в сочетании с компьютерным анализом, указывающие на важную роль амфифильных вторичных структур в процессе транслокации белков через мембраны, позволяют нам постулировать механизм, обьясняюгций их участие в процессе транслокации.

Основные положения нашей модели схематически показаны на рис. 11. Согласно предложенному нами механизму, транслокация белков, имеющих амфифильные вторичные структуры, происходит в четыре этапа. Первый этап включает электростатическое взаимодействие положительно заряженных остатков, находящихся рядом с амфифильной вторичной структурой, с отрицательно заряженными головками фосфолипидов мембраны. На следующем этапе происходит встраивание гидрофобной части амфифильной структуры в липидный бислой, сопровождающееся нарушением бислойной конформации липидов.

Существенным моментом нашей модели является то, что существование определенной структуры необходимо для частичного встраивания. Амфифильная вторичная структура "собирает" гидрофобные аминокислоты на одной стороне, что позволяет им кооперативно встроиться в мембрану. На следующем этапе транслокации согласно нашей модели происходит перенос гидрофильных частей белка на противоположенную сторону мембраны. Этот этап может осуществляться за счет изменения конформации встроившейся в мембрану части белка (рис. 11, За ) либо за счет "переворота" частично встроенного белка (рис. 11, 36), который облегчается тем, что липиды находятся в частично небислойной конформации. Следующим этапом в транслокации по нашей модели является освобождение белка из мембраны.

111111!1111111М111!11Ш111111 Ш111111ШШ

Ш ? ннпЯпппнннпппннп

ктформационный переход,

транслокация | л переворот

ппннпшщннншшнн

Рис. 11. Модель самостоятельной транслокации белка через мембрану, осуществляемой посредством амфифильных структур.

1. Сближение с мембраной за счет электростатических сил.

2. Встраивание гидрофильной стороны амфифильной структуры в мембрану, сопровождающееся изменением конформации липидного бислоя.

За. Конформационный переход во встроившихся в мембрану вторичных структурах, сопровождающийся переносом части гидрофильной последовательности белка (наиболее вероятно для амфифильных бета-слоев).

36. "Переворот" амфифильной вторичной структуры в мембране, сопровождающийся переносом гидрофильной части гидрофильных остатков белка на другую сторону мембраны (наиболее вероятно для альфа-спиралей).

4. Окончательное освобождение белка из мембраны.

ВЫВОДЫ:

1. На основании данных ЯМР - спектроскопии и компьютерного анализа установлено, что в молекуле биназы остаток Тгр34 контактирует с альфа-спиралыо и бета-слоем и может обеспечивать их взаимодействие на этапе фолдинга.

2. Данные полученные с помощью иммунохимических методов, показывают, что замена остатка Тгр34 в биназе на Asn приводит к блокированию ее секреции в E.coli.

3. Проведенный анализ структуры биназы и сравнение с результатами, полученными для других белков, позволяют заключить, что наиболее вероятной причиной блокирования секреции биназы Trp34->Asn является то, что пресекреторный белок не может принять конформацшо, способную к транслокации.

4. Па основе полученных экспериментальных данных предложена модель участия амфифильных вторичных структур зрелых частей белков в процессе транслокации.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Lopookhov L.V., Rizvanov A.A., Shakirov E.V., Sharipova M.R. and Leshchinskaya I.B. Computer analysis of hydrophobic core and correlation between primary and three dimensional structure of proteins// Abstracts of the 16th International Congress of Biochemistry & Molecular Biology. New Delhi, India, Septermber 19-22, 1994

2. Lopoukhov L.V, Sitnitsky A.E., and Fedotov V.D. Mathematical modelling of electrostatic fluctuations in subtilisin active site// Journal of Biomolecular Structure & Dynamics. - 1995 - V.12 . - P. 767-780.

3. Lopoukhov L.V. Sharipova M.R., Rizvanov A.A., The role of hydrophobic residues (Trp) of Bacillius intermedius RNase in secretion// Abstracts of the Euroasian symposium on current trends in biotechnology. Ankara, Turkey, October 29 - November 6,1995

4. Lopoukhov L.V., Sharipova M.R., Rizvanov A.A., Influence of Hydrophobic Residues (TRP) Substitutions on the Secretion of Bacillius Intermedius Rnase// Karadeniz Medical Journal. - 1996 - V.9. - N. 6. -in press.

5. Лопухов JI.B., Шарипова M.P. Современные исследования механизмов секреции белков. Депонировано в ВИНИТИ, РЖ "Биохимия" - 1996 - в печати

6. Лопухов Л.В., Шарипова М.Р. Получение мутантов РНКазы Bacillus

intermedius 7Р по остаткам триптофана и исследование их секреции. Депонировано в ВИНИТИ, РЖ "Биохимия" - 1996 - в печати

Сдано в набор /3. Ч. -96 . Подписано в печать

Форм. бум. 60 х 84 1/16. Печ.л. 1,25. Тираж 100. Заказ Ю5~