Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование компактного денатурированного состояния белка методом моделирования молекулярной динамики

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование компактного денатурированного состояния белка методом моделирования молекулярной динамики"

На правах рукописи

ИБРАГИМОВА Гулыпат Тавзиховна

ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПАКТНОГО ДЕНАТУРИРОВАННОГО СОСТОЯНИЯ БЕЛКА МЕТОДОМ МОДЕЛИРОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИ

03.00.02 - БИОФИЗИКА Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 1997

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биоф* РАН, на кафедре биохимии Казанско1 о I исударственного университета и в Институте микробиологии и молекулярной биологии университета им.Юс; Либиха (Гиссен. ФРГ).

Научные руководители -

доктор физико-математических наук Кутышенко В. П. кандидат биологических наук Киваева Л.С.

Научный консультант -

доктор биологических наук Винтер В.Г.

Официальные оппоненты: -

доктор физико-математических наук Семисотое Г.В.

доктор физико-математических паук Полтев В.И.

Ведущая организация Институт биофизики клетки РАН г. Пущине

Защита диссертации состоится 1997 г.

в ((д часов на заседании диссертационного Совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (142292 г. Пущино Московской области, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института теоретическ< и экспериментальной биофизики РАН.

Автореферат разослан

'Я/Г МЛА 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

, У - Нелипович ПА.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Глобальной проблемой белкового фолцинга остается арадокс Левинталя: каким образом из множества конформаций, которые, азалось бы, может принять аминокислотная последовательность, выбирается цна, присущая нативной молекуле белка? Одним из этапов на пути решения гой проблемы стало обнаружение компактного денатурированного состояния СДС) белка - промежуточного между нативным состоянием и беспорядочным 1убком, которое сохраняет вторичную структуру, но теряет уникальную ространственную, определяемую, главным образом, взаимодействием боковых ;пей аминокислотных остатков.

Детальный анализ структуры КДС экспериментальными методами алкивается с определенными трудностями: кристаллизация' невозможна из-за >льшой подвижности составных' частей белковой молекулы, использование 1ектроскопических методов усложнено тем, что белок находится в компактном сатурированном состоянии непродолжительное время и этих состояний, как завило, несколько. Более того, результаты исследований КДС, проведенных 1зными спектроскопическими методами, противоречат друг другу. Например, шныс кругового дихроизма свидетельствуют о сохранении вторичной структуры :больших белков в КДС, а данные метода одномерного ' Н ЯМР высокого дрешения - о практически полном ее изчезновении. Таким образом, для ¡работки единых критериев оценки структуры КДС отсутствуют точные шичественные методы изучения. В этой связи интересным представляется ;тод имитации молекулярной динамики (МД). МД сочетает в себе детальную (формацию о молекулярной структуре с необходимым временным разрешением я проведения анализа последовательности изменений в ходе процесса натурации.

Цель исследования состояла в изучении структуры компактного натурированного состояния методом имитации молекулярной динамики, юме того, необходимо было найти иную интерпретацию данных одномерного I ЯМР высокого разрешения по структуре КДС, которая бы не противоречила нным других методов исследования.

Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии Казанского государственного университета и в Институте микробиологии и молекулярной биологии университета им.Юстуса Либиха (Гиссег, ФРГ).

Научная новизна и практическая значимость работы. Изучение структуры КДС методом имитации молекулярной динамики было проведено на примере биназы (рибонуклеазы из Bacillus intermedius 7Р). Последовательность изменений конформации белковой молекулы при моделировании денатурирующих условий свидетельствовала о том, что в процессе разворачивания биназа проходит через стадию промежуточного состояния. Это промежуточное состояние характеризовалось всеми особенностями компактного денатурированного состояния: компактностью и наличием вторичной структуры, большей, по сравнению с нативной, подвижностью составных частей белковой молекулы, увеличением доступной плошали поверхности, экспонированностью неполярных аминокислотных остатков в раствор и проникновением воды внутрь белка.

Для конформаиий биназы в нативном и . компактном денатурированном состояниях были проведены расчеты величин вторичных химических сдвигов, вызванных кольцевыми токами ароматических аминокислот, для некоторых метальных и метиленовых протонов гидрофобных участков белковой молекулы. Как оказалось, высокоамплитудные внутримолекулярные движения в компактном денатурированном состоянии при условии сохранения равновесной структуры белковой молекулы уменьшают величину химического сдвига. Тем не менее, он не исчезает полностью, как показывают данные метода одномерного 'Н ЯМР высокого разрешения. Для уничтожения больших остаточных химических сдвигов требуются дополнительные факторы.

Одним из таких факторов может быть проникновение молекул воды в гидрофобные участки белка в КДС. Для неподвижных молекул воды в гидрофобной области биназы были проведены расчеты величин вторичных химических сдвигов протонов, вызываемых электрическим полем молекулярного диполя. Полученные значения оказались сравнимы по порядку величины с остаточными химическими сдвигами, которые не удалось усреднить до нулевых значений с помощью высокоамплитудных внутримолекулярных движений, и противоположны им по знаку.

Таким образом, в данной работе:

- Впервые проведена имитация молекулярной динамики биназы при ативных и денатурирующих условиях. При этом на примере конкретного белка эказана последовательность конформзпионных изменений при разворачивании :лковой молекулы и охарактеризована структура компактного ¡натурированного состояния.

- Впервые проведен сравнительный анализ величин химических сдвигов, клученных методом 'Н ЯМР высокого разрешения и рассчитанных при цитации молекулярной динамики для компактного денатурированного стояния. Результаты анализа дают альтернативную интерпретацию данных шомерного 'Н ЯМР по структуре КДС, которая не противоречит данным >угих методов исследования.

- Впервые проведено количественное сопоставление данных 'Н ЯМР для лковой молекулы и ее взаимодействия с водой. На основании проведенного доставления можно сделать вывод, что вода является структурным элементом лковой молекулы в компактном денатурированном состоянии.

Перечисленные результаты в значительной степени расширяют шествующие представления о структуре и свойствах компактного натурированного состояния и о роли воды в процессе белкового фолдинга.

На защиту выносятся: Результаты изучения характера процесса денатурации белка биназы. Данные, идетельствугошие о формировании компактного денатурированного состояния и разупорядочивании белковой молекулы биназы.

Результаты сравнительного анализа спектральных характеристик белковой лекулы, полученных методом ЯМР высокого разрешения и рассчитанных при итации молекулярной динамики.

Способность электрического поля молекул воды сдвигать сигналы протонов гильных групп в сторону низких полей как одной из возможных причин 1езновения вторичных химических сдвигов в КДС.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались

итоговых научных конференциях Казанского государственного университета шнь, 1994, 1995), семинаре Института микробиологии и молекулярной хлогии университета им.ЮЛибиха (Гиссен, ФРГ, 1996).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 9 печатны работах, включающих 3 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 110 страница машинописного текста, содержит 15 таблиц, 28 рисунков. Работа состоит и введения, шести глав, заключения и списка литературы (97 наименований). .

В первой главе представлен обзор литературы по изучению особенносте] компактного денатурированного состояния белка. Во второй главе изложен: постановка задачи и описан примененный в диссертационной работе Meroj исследования численного эксперимента. Третья глава содержит данные < моделируемом белке биназе и условиях численного эксперимента. Четвертая i пятая главы посвящены анализу полученных результатов: энергетическим i структурным характеристикам имитации молекулярной динамики в нативных i денатурирующих условиях, свойствам белковой молекулы при переходе fee ] компактное денатурированное состояние, ее взаимодействию с водой. В uiecroi главе сопоставляются спектральные характеристики, полученные методом ЯМ] высокого разрешения и рассчитанные при имитации молекулярной динамики На примере биназы показан один из возможных способов разрешенш противоречий между данными различных экспериментальных методов.

Краткое содержание работы Численный эксперимент

Имитация МД биназы (рибонуклеазы из Bacillus intermedins 7F) проводилас! в силовом поле GROMOS с сохранением количества частиц, температуры i давления в моделируемой системе. Молекулярная масса биназы 12,3 кДа, он; состоит из 109 аминокислотных остатков. Минимизированная рентгеновская структура биназы помещалась в центр прямоугольной ячейки с парамерам! 0=3,91, ¿=4,69, с=5,41 нм и окружалась водой. Имитация МД нативной биназь (при 300 К) продолжалась до 500 пс. Шаг интегрирования б/ составлял 1 фс Ван-дер-ваальсовая энергия взаимодействия вычислялась, если атомь находились на расстоянии не более Rc=l,l нм. Электростатически! взаимодействия учитывались вплоть до расстояния R¡=2 нм. Список пар атомов которые расположены относительно друг друга на расстоянии от 1,1 нм до 2 нм обновлялся каждые 20 фс.

Исходной структурой для имитации МД КДС стала конформация юлекулы биназы на 70-й пс. Температуру повышали до 1000 К (в первом случае) до 500 К (во втором), в 10 раз увеличили характеристические времена елаксации ^ до 0,1 пс для поддержания постоянной температуры и 1/> до 0,5 пс ля поддержания постоянного давления. Имитация МД при 1000 К обрывалась а 112-й пс, а при 500 К продолжалась вплоть до 350 пс. Для получения авновесного КДС молекулы биназы конформацию, взятую на 150-й пс митации МД при 500 К, вновь "замораживали" до 300 К с сохранением тачений всех остальных параметров имитации. Динамика охлажденного КДС рослеживалась в течение 90 пс.

Анализ данных имитации МД На рис. I приведены изменения величин КМЗРП для атомов С™ в ходе митации МД относительно исходной, структуры биназы.

I, ПС

Piic.l. RMSPL) атомов С ' при различных температурных режимах имитации МД:

---при 300 К -при 500 К ------при 1000 К

-при JU0 К посте охла«. ¡(.ния от 500 К

|я характеристики свойств нативной биназы (при 300 К) использовался участок 130-й до 450-ii пс, поскольку в этом промежутке времени молекула нативной назы представляется достаточно уравновешенной. Повышение температуры зываст все более увеличивающееся отклонение конформапии биназы от

g

первоначальной. Наиболее резко этот процесс выражен при 1000 К: уже на 112-й пс происходит разрыв ковалентных связей в структуре. Увеличивая температуру до 1000 К, мы хотели ускорить процесс получения КДС, однако нагрев осуществлялся слишком быстро.

При повышении температуры до 500 К величина RMSPD увеличивается примерно в 2 раза. На временном интервале от 100-й до 240-й пс ее рост замедляется, достигается некое квазиравновесное состояние. Затем RMSPD вновь резко увеличивается. Охлаждение нагретой биназы до 300 К на 150-й пс и последующая имитация МД в течение 90 пс поддерживает квазиравновесное состояние, сглаживает наиболее резкие колебания в значениях RMSPD.

На "квазиплато" происходит плавление вторичных структур, причем плавление в разных субдоменах: N- и С-концевом, составленных соответственно а-спиралями и p-структурой, происходит одновременно. После 240-й пс при 500К они разрушаются. По-видимому, дальнейшая имитация МД демонстрирует переход КДС в беспорядочный клубок. Каких-либо сайтов нуклеации обнаружить не удалось.

Для характеристики КДС были использованы две имитации МД длиной 140 пс каждая: (1) 100 - 240 пс при 500 К, (2) 100 - 150 пс при 500 К, объединенная с 90 пс после охлаждения до 300 К. Как выяснилось, они характеризуют разные свойства КДС. С одной стороны, нагревание до 500 К, необходимое для преодоления энергетических барьеров, моделирует увеличение внутренней энергии при денатурации. Но, с другой стороны, в силу ограниченности выбранного нами способа имитации МД - с сохранением количества частиц, температуры и давления - взаимодействие белка и воды при повышенной температуре не поддается адекватному описанию.

Величина объема молекулы биназы испытывает резкие измененеия как в ходе имитации МД при 300 К, гак и при повышении температуры (рис.2). Однако, в среднем объем для второго случая оказывается выше (84,96 А3 против 81,10 Л3). Увеличение объема составляет примерно 5%.

Дня анализа динамики вторичных структур мы прослеживали динамику водородных связей. Цепочка пептидных групп, соединенных водородными связями (ЦПВС), есть последовательность -Ck=Ok...H,-N,-C,_ 1=0^,...Hj-Nj. Длина цепочки определяется числом водородных связей в ней. Параллельные ЦПВС

образуют вторичные структуры белка: первая по порядку а-спираль в бипазе эбразована тремя ЦП ВС (табл.1), вторая - фактически двумя, а |5-слой -четырьмя. Очевидно, вторичная структура исчезает, если одновременно исчезают зее составляющие ее ЦП ВС.

Г. ПС

Рис.2. Изменение объема молекулы V при имитации МЛ:

------нативпого состояния (при ЖЮ К).

-компактного денатурированного состояния (при 500 К)

В ходе имитации МД натнвного состояния было обнаружено, что всс 1ПВС, за исключением самой длинной и содержащих неустойчивые Н-связи, стаются неразорванными более половины времени имитации (табл.1). С другой тороны, для каждой ЦПВС не менее половины составляющих ее Н-связей бнаруживается одновременно более, чем в 90% времени имитации, за включением цепочек, содержащих неустойчивые Н-связи. В ходе имитации МД ЩС длина ЦПВС, за исключением 106..97-. 6..10-. 7..II- уменьшается на I габл.2).

Цепочка 24...51- более половины времени имитации разоррлна, поэтому 1Ы не будем ее рассматривать. Существование не менее половины всех связей в 1ПВС колеблется от 38% (5 . 9-) до 93% (106...97-) времени имитации. Тем не |енее, несмотря на динамическую картину постоянного разрыва и осстановления водородных связей, можно сделать вывод о сохранении

вторичных структур в КДС белка. Состав их частично изменяется: исчезают ЦПВС из 5 водородных связей, образуются 4-Н- и 6->1-витки на концах а-спиралсй. Однако, для каждой вторичной структуры сохраняется ее остов: ЦПВС 6...Ю- и 7...II для ос-1, ЦПВС 25...29- для а-2, ЦПВС 106...97- для (1 Эти цепочки были устойчивей и при моделировании нативной биназы (табл.1).

Таблица I

Образование одновременных разрывов в ЦПВС при имитации МД нативного состояния

Вторичная Частота п одновременных

ЦПВС вида -С=О...Н-]^-* структура разрывов в ЦПВС, %

л=0 я= 1 л=2 п=3 /7=4

24...51-50...74-73...87-86...98-97...106 Р 26,87 39,69 26,25 6,25 0,94

106...97-96...88-87...73 Р 82,50 16,25 0,94 0,31

94...90-89...71-70...55 Р 73,44 23.44 2,81 0,31

53...72-71...89-88...96 Р 12,81 82,81 4,38

5...9-8...12-11...15 а-1 54,69 33,12 12,19

6...10-9...13-12...16 а-1 76,88 20,00 3,12

7...11-10...14 а-1 67,50 25,00 7,50

25...29-28...32 а-2 48.75 45,31 5,94

26...30-29...33 (-29...32)** а-2 58,13 36,56 5,31

27...31-30...33 а-2 6,87 79,37 13,75

'Цифры обозначают номера остатков, входящих в состав ЦПВС. Учитываются также случаи образования укороченного витка 4-И.

Амплитуда крутильных колебаний колец ароматических аминокислотных остатков в нативной биназе в среднем равна 18°, для биназы в КДС - 24,9°. Частота перехода бензольных колец Фен и Тир из одной симметричной конформации в другую ("флипы") также характеризует подвижность структуры. Для нативного состояния в течение 320 пс не наблюдалось флиппов ароматических колец, за исключением Фен-105, кольцо которого больше

экспонировано в раствор по сравнению с другими остатками. Для КДС в течение 140 пс переходы происходили от 0 (Тир-96) до 6 раз (Фен-6).

Таблица 2

Образование одновременных разрывов в ЦП ВС при имитации МД КДС

ЦПВС вида -С=0 ..Н-Ы-* Вторичная структура Частота п одновременных разрывов в ЦПВС, %

л=0 я= 1 я=2 п=3

24...51-50...74 Р 0,71 53,57 66,43

86..98-97...106 Р 5,71 82,86 11,43

106...97-96...88-87...73 Р 75,71 17,86 6,43

94...90-89...71-70...55 Р 0,71 40,71 57,14 1,43

51...72-71...89-88...96 Р 2,14 91,43 4.28 2,14

5...9-8...12-11...15 а-1 5,71 32,14 47,86 14,28

6...10-9...13-12...16 (-12... 15)** <х-1 53,57 32,86 13,57

7...11-10...14 а-1 60,00 32,14 7,86

25.. .29-28.. .32 а-2 9,28 78,57 12,14

26...30-29...33 (-29...32)** (-29...34)*** а-2 19,29 60,00 20,71

*Цифры обозначают номера остатков, входящих в состав ЦПВС. "Учитываются также случаи образования укороченного витка 4->1. "'Учитываются также случаи образования удлиненного витка 6-> 1.

В ходе имитации как НС, так и КДС площадь доступной поверхности 8пов биназы увеличивается (рис.3). Для НС белка ее начальное значение составляет -2200А2, конечное -2400Л2 Для КДС эти величины равны соответственно -2350А2 и -2800А2.

Таким образом, увеличение 8„0в для нативной биназы составляет ~ 200 А2 за время имитации 320 пс, тогда как для КДС ~ 450 А2 за 140 пс. Первоначальный высокий уровень 5лов для КДС связан с большей доступностью для молекул воды остатков аминокислот, составляющих гидрофобное ядро биназы: Иле, Лей - а также Фен. Дальнейшее увеличение доступной площади

поверхности для КДС происходит за счет двух других ароматических остатков: Трп и Тир - а также Apr и Асп. Изменения на поверхности нативной биназы обусловлены в целом теми же причинами: ароматические кольца Фен и Тир экспонируются в "раствор", частично открывая доступ к расположенным внутри остаткам Лей. Этот процесс происходит с меньшей скоростью, чем для КДС.

I, пс

Рис.3. Изменение плошали поверхности биназы 5л0в в ходе имитации МД ------нативного состояния, -КДС

Число временных шагов в ходе имитации МД, для которых существует по меньшей мере один контакт между молекулами воды и метильными группами, составляющими гидрофобное ядро биназы, отражает проникновение воды внутрь белка (табл.3).

При повышении температуры контакты между водой и атомными группами происходят реже, чем в случае последующего понижения температуры вновь до 300 К. При этом "замороженные" конформационные перестройки делают структуру биназы более проницаемой для молекул воды. За исключением случаев У1СН3 Вал-9 и 52СН3 Лей-41 доля временных шагов, содержащих по меньшей мере один контакт с водой, увеличивается. Даже если это увеличение

незначительно и составляет менее 10%, растет число одновременных контактов (табл.4).

Таблица 3

Характеристики взаимодействия воды и метильных групп п ходе имитаций МД

Остаток Атомная Число временных шагов, содержащих по меньшей мере один контакт с водой, %*

группа НС КДС при 500 К КДС при 300 К

Вал-9 лсн3 66,67 47,14 62,22

у2СН3 50,63 42,86 67,72

Лей-19 б[СНз 38,13 82,86 84,44

й2сн3 61,56 76,43 93,33

Лей-41 5[СНз 86,87 63,57 93,33

62СНз 90,31 73,57 84,44

Иле-50 йен 95,00 68,57 95,56

Г2сн3 90,63 72,14 93,33

Лей-62 рсн2 69,37 57.14 82,22

уСН 42,50 47,86 51,11

Й,СН3 85,94 71,43 100,00

52СН3 91,25 82,86 94.44

Иле-75 6СН 0,31 76,43 92,22

т2сн3 7,50 57,14 94,44

Лей-87 6]СНз «,13 42,29 60,00

ЬСНз 10.63 55,71 58,89

"Относительно обшей продолжительности имитации МД.

Таблица 4

Характеристика взаимодействия воды и метальных групп __в ходе имитаций МД_

Остаток, атомная группа

Число временных шагов, содержащих я контактов с водой, ""

/1=0 п=1 и=2 л=3 и=4

Вал-9 У1СН3 НС 54,38 36,88 ' 8,44 0,31 0,00

КДС, 300 к 74,44 25,56 0,00 0,00 0,00

Вал-9 Г2СН3 НС 84.38 15,31 0,3' 0,00 0,00

КДС, 300 к 72,22 21,11 6,67 0,00 0,00

Лей-19 Й|СН3 НС 83,12 14,06 2,50 0,31 0,00

КДС, 300 К 50,00 40,00 7,78 2,22 0,00

Лей-19 б2СН3 НС 73,75 21,25 4,69 0,31 0,00

КДС,- 300 к 43,33 35,56 • 17,78 2,22 1,11

Лей-41 61СН3 НС 60,00 37,50 2,50 0,00 ' 0,00

КДС, 300 к 48,89 42,22 7,78 1,11 0,00

Лей-41 82СН3 НС 48,75 39,06 10,94 1,25 0,00

КДС, 300 к 52,22 36,67 ш;оо М1 0,00

Лей-62 РСН2 НС 70,62 26,25 3,12 0,00 0,00

КДС, 300 к 66,67. 27,78 5,56 0,00 0,00

Лей-62 уСН НС 96,25 3,75 0,00 0,00 0,00

КДС, 300 к 95,56 4,44 0,00 0,00 0,00

Лей-62 6)СНз НС 52,19 33,44 10,62 3,75 0,00

КДС, 300 к 37,78 38,89 17,78 4,44 1,11

Лей-62 52СН3 НС 45,94 38,44 13,75 1,56 0,31

КДС, 300 к 33,33 43,33 18,89 3,33 1,11

Иле-75 5СНз НС 100,00 0,00 0,00 0,00 0,00

КДС, 300 к - 47,78 36,67 12,22 3,33 0,00

Лей-87 5]СНз НС 99,38 0,62 0,00 0,00 0,00

КДС, 300 к 71,11 25,56 3,33 0,00 0,00

Лей-87 Й2СНз НС 97,19 2,81 0,00 0,00 0,00

КДС, 300 к 76,67 20,00 3,33 0,00 0,00

■"Относительно общей продолжительности имитации МД.

Анализ ВХС, обусловленных кольцевыми токами ароматических а.к. остатков, для нативного и компактного денатурированного состояний Величина вторичного химического сдвига, вызванного кольцевым током, ВХС КТ, 5, зависит от взаимной ориентации ароматического кольца и протона и рассчитывается по формуле Джонсона-Бови:

Ьктс 1а (1-рН + г 2

где п - число л-электронов ароматического кольца, е,т - заряд и масса электрона, с - скорость света, а - радиус кольцевого тока, г и г. - координаты протона (в единицах радиуса а) в системе координат с началом в центре кольца и осью г, являющейся нормалью к плоскости кольца, К(к) и Е(к) - полные нормальные эллиптические интегралы Лежандра первого и второго ранга с к= 4я/((1 + р)2 + <;2)

Угловые флуктуации положения протона в поле кольца оказывают наибольшее влияние на ВХС КТ. Зависимости ВХС КТ от амплитуды крутильных колебаний ароматических колец были рассчитаны для ряда протонов метальных и метиленовых групп, расположенных вблизи ароматических колец, при различных увеличениях расстояний (от 0 до 100%) между центром кольца и протоном относительно таковых в нативном белке. Вклады для Н&1 Лей-62 и НУ^ Иле-75 - ВХС КТ, обусловленные расположенными вблизи ароматическими кольцами (каждым по отдельности) в зависимости от амплитуды колебаний -представлены на рис.4. Высокоамплитудное внутримолекулярное движение может существенно снизить дисперсию химического сдвига протона, но полного усреднения ВХС КТ до нулевых значений не происходит. Даже при 6т = 90° (что намного больше найденных ограничивающих углов 0тах) остаточные величины ВХС КТ, обусловленные одним или несколькими кольцами, могут быть весьма значительными (до 0,6 м.д.). Исчезновение ВХС КТ может быть связано с сильными изменениями расстояний между атомами гидрофобных участков, > 70%. Но это существенно больше, чем в среднем по макромолекуле, 10-15%, и представляется маловероятным, поскольку гидрофобные структуры в биназе весьма стабильны.

Электрическое поле молекул воды обуславливают изменение ВХС близлежащих протонов метальных групп в сторону низких полей (табл.5).

гран

О 20 40 60 80

0.8

0.6

0.4

и

X ш

0.2

0.0

а 1 1 1 1 1 1 1 1. 6

• "ч \

- Ч 2 \ 5

Ч

Ь 7 \

— ^ ' ■--

- " — :

_____

'1. 1 1 , Т"

0.4

в X

о

0.2 Г1 £ Я

0.0

О 20 40 60 80

Угловая амплитуда, град

Рис.4. Величины ВХС КТ 5 Н51 Лей-62 (а) и НУ2 Иле-75 (б), обусловленные кольцевыми токами остатков Фен-55, Трп-70, Тир-96, Фен-105 (кривые/--/) и Фен-6 (кривые 5-7) в зависимости от амплитуды колебаний плоскостей колец и от изменений равновесных координат. Для кривых 1-4 увеличение расстояний между атомами относительно данных РСА - 0%, для кривых 5-7, 2а, 26 - 20, 50, 70, 40, 100% соответственно.

Таблица 5

Изменение химического сдвига протонов биназы, обусловленное молекулами воды, при переходе молекулы белка в КДС

Остаток Атомная группа ВХС дв* статок томная группа ВХС дв*

Лей-62 5]СНз -0,31 Иле-50 5СН -0,07

82СН3 -0,26 Вал-9 у,СН3 0,10

гСН -0,18 у2СН3 -0,18

рсн2 -0,22 Иле-75 У2СН3 -0,61

Лей-41 81СНЗ -0,27 Лей-87 51СН3 -0,30

62сн3 -0,21 52СН3 -0,24

Лей-19 61СН3 -0,30

*Рассматривались молекулы воды в радиусе 4,5 А.

ВХС, вызванные диполями воды, сравнимы по порядку величины и противоположны по знаку остаточным химическим сдвигам, которые не удалось усреднить до нулевых значений с помощью высокоамплитудных крутильных колебаний ароматических колец. Так, если наибольшую амплитуду флуктуаций принять равной 25° (значение среднеквадратичного отклонения угла у}-ароматических остатков, полученное для КДС методом имитации МД), то величины остаточных ВХС будут находиться в пределах от 0,03 до 0,94 м.д.

Выводы

1) При моделировании процесса тепловой денатурации биназы в силовом поле GROMOS обнаруживается компактное денатурированное состояние, обладающее следующими свойствами:

а) объем белковой молекулы увеличивается на 5% по сравнению с нативным состоянием;

б) сохраняется большая часть вторичной структуры;

в) увеличивается подвижность составных частей белковой молекулы;

г) увеличивается площадь поверхности белка;

д) растет число контактов неполярных аминокислотных остатков с водой: молекулы воды проникают внутрь гидрофобных участков белка.

2) Высокоамплитудные внутримолекулярные движения в компактном денатурированном состоянии при условии сохранения равновесной структуры белковой молекулы уменьшают величины вторичных химических сдвигов протонов, обусловленных кольцевыми токами ароматических аминокислотных остатков. Таким образом, подвижность составных частей белковой молекулы является одной из причин кажущегося противоречия между данными разных спектроскопических методов по структуре компактного денатурированного состояния.

3) Исчезновение вторичных химических сдвигов протонов метильных и метиленовых групп можно объснить влиянием электрических полей молекул воды. С одной стороны, этот факт, вместе с высокой внутримолекулярной подвижностью, объясняет причину кажущегося противоречия между данными разных спектроскопических методов. С другой стороны, он свидетельствует о том, что вода является структурным элементом белковой молекулы в компактном денатурированном состоянии.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Киваева Л.С., Кутышенко В.П., ИбраГимова Г.Т. Исследование влияния флуктуирующего микроокружения на вторичные химические сдвиги протонов в ' Н Я MP спектре биназы в нативном и компактном денатурированном состояниях. В сб. "Физико-химические методы исследования структуры и динамики молекулярных систем". Матер. Всерос. совещ. 4.1. Йошкар-Ола, 199.4. С. 124-127.

2. Kivaeva L.S., Kutyshenko V.P., Ibragimova G.T. Analysis of chemical shift dispersion in lH NMR spectra of binase in native and compact denatured states. 27 Intern.Congress AMPERE. Kazan, 1994. P.895-896.

3. Kivaeva L.S., Ibragimova G.T., Kutyshenko V.P. Calculation of ' H NMR chemical shifts of alfa-CH protons in protein With high amplitude internal motion. Intern.Symp.Molec.Mobility&Order in Polym.Systems. St.-Peterburg 1994. Abstracts. P. 16.

4. Киваева Л.С., Кутышенко В.П., Ибрагимова Г.Т. Анализ вторичных химических сдвигов в спектре 'Н Я MP биназы в нативном и компактном денатурированном состояниях // Мол.биология. - 1995 - Т.29. - С.627-633.

5. Ibragimova G.T., Hahnen J., Kivaeva L.S., Vinter V.G., Kutyshenko V.P. A comparison study of protein in native and molten globule states by molecular dynamics simulation // Karadeniz J. of Med.Sci. - 1995 - V.8. - P.202-203.

6. Kivaeva L.S., Ibragimova G.T., Kutyshenko V.P. Compact denatured state of proteins: analysis of 'H NMR data for binase considered as a model protein. Ninth Symp.Prot.Soc. Boston. Massachsets. July 1995. Abstracts.

7. Kivaeva L.S., Ibragimova G.T., Kutyshenko V.P. Compact denatured state of protein. Analysis of 'H NMR data for binase. Europ.Soc.Magn.Reson.in Medicine&Biology. Nice. France. August 1995. Abstracts. P. 1750.

8. Киваева Л.С., Ибрагимова Г.Т., Кутышенко В.П. Расчеты дисперсии химических сдвигов протонов а-СН-групп биназы // Мол.биология. - 1996 -Т.38. - С.647-654.

9. Киваева-Л.С., Ибрагимова Г.Т., Кутышенко В.П. Расчеты низкопольных химических сдвигов протонов а-СН-групп биназы в нативном и компактном денатурированном состояниях // Мол.биология. - 1996 - Т.38. - С.655-661.

Соискатель