Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разнообразие компактных форм денатурированных белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Разнообразие компактных форм денатурированных белков"

^ О"

На правах рукописи

УВЕРСКИИ ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВИЧ

РАЗНООБРАЗИЕ КОМПАКТНЫХ ФОРМ ДЕНАТУРИРОВАННЫХ БЕЛКОВ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

ПУЩИНО - 1998 г.

Работа выполнена в Институте белка РАН и Институте биологического приборостроения РАН

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

академик РАН, доктор физико-математических наук,

профессор А. Р. Хохлов

доктор химических наук,

профессор А. С. Арсеньев

доктор биологических наук,

профессор . ^ Ф. Ф. Литвин

<г

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии имени В. А. Энгельгарта РАН, Москва

уЗо

Защита состоится « 2-0 » __1998 г. в / Д часов

на заседании диссертационного совета Д 200.22.01 Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, Московская область, г. Пущино, ИТЭБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН

Автореферат разослан « ¿0 » <? Л'Л. 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук / [ Нелипович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известна, что появлению нативного, нормально функционирующего глобулярного белка в живой клетке предшествуют два фундаментальных процесса - биохимический (синтез) и физический (сворачивание). Первый процесс представляет собой синтез аминокислотной последовательности белковой молекулы. Он осуществляется рибосомой при участии специального бе-лок-синтезирующего аппарата клетки. Второй процесс состоит в приобретении вновь синтезированной аминокислотной последовательностью функциональной пространственной структуры. Вопрос о том, как происходит этот процесс, т.е. в силу каких причин данная аминокислотная последовательность "знает" как она должна сложиться в единственную, именно ей присущую, уникальную пространственную структуру, является одним из центральных вопросов физики белка.

Еще в начале 60-х годов был установлен принципиальный факт, что развернутая молекула белка способна вне клетки спонтанно свернуться в нормально функционирующее нативное состояние. Данное наблюдение послужило отправной точкой для формулирования первой гипотезы самоорганизации белковых мо-леку, гласящей, что вся необходшгая и достаточная информация о пространственной организации белковой молекулы закодирована в ее аминокислотной последовательности. Практически одновременно была сформулирована и вторая гипотеза самоорганизации, согласно которой для правильного сворачивания белковой цепи в уникальную пространственную структуру не требуется полного перебора всех возможных конформаций, поскольку существует некоторый путь сворачивания, являющийся универсальным для всех глобулярных белков.

Таким образом, проблема самоорганизации белковой молекулы в итоге свелась к вполне определенной задаче - понять, какие движущие силы определяют путь сворачивания из неупорядоченного состояния в уникальную пространственную структуру. Было предложено несколько теоретических моделей этого процесса. Здесь остановимся на одной из таких моделей, получившей к настоящему моменту наибольшее экспериментальное обоснование. Речь пойдет о модели поэтапного сворачивания, известной также, как модель "рамки" (frame-work model) и предложенной в 1973 году О.Б. Птицыным (Птицын, 1973). Данная модель принимает во внимание наличие определенной иерархии структурной организации белковой молекулы, общей для всех глобулярных белков, и предполагает, что разные структурные уровни молекулы белка формируются на разных этапах самоорганизации (см. Рисунок 1.1). При этом сам процесс сворачивания протекает таким образом, что структура, образованная на каждом этапе, не перестраивается на всех последующих. Согласно этой модели, на первом этапе самоорганизации белковой молекулы происходит формирование элементов вторичной структуры (а-спиралей и р-тяжей), флуктуирующих в пространстве вокруг их позиций в нативном состоянии. На втором этапе эти зародыши вторичной структу-

Развернутое Первый Второй Нативное

состояние интермедиат интермедиат состояние

сворачивания сворачивания

Рисунок 1. Схематическое представление модели поэтапного сворачивания (framework model) глобулярных белков, предложенная О.Б. Птицыным (Птицын, 1973).

ры схлопываются в компактное промежуточное состояние, обладающее ходом полипептидной цепи, подобным нативному. На последней стадии сворачивания формируется уникальная пространственная структура белковой молекулы (см. Рисунок 1).

Как видим, данная модель предсказала существование по крайней мер? двух основных интермедиатов сворачивания: менее компактного с флуктуирующей вторичной структурой и более компактного, обладающего не только существенно более стабильной вторичной структурой, но и похожей на нативную топологией, т.е. нативоподобной взаимной ориентацией элементов вторичной структуры.

Следует отметить, что к началу 90-х годов модель поэтапного, сворачивания в общих чертах была подтверждена экспериментально. В частности, при исследовании кинетики ренатурации глобулярных белков in vitro были обнаружены два кинетических промежуточных состояния, которые по раду своих структурных свойств были похожи на предсказанные моделью интермедиаты сворачивания (Kuwajima, 1989; Ptitsyn & Semisotnov, 1991; Ptitsyn, 1992, 1995; Семисотнов, 1994). Однако детальное исследование структурных характеристик кинетических интермедиатов осложнялось чрезвычайно коротким временем их жизни (~10 мсек - для первого интермедиата и 0.1-1.0 с - для второго).

Равновесные же исследования по разворачиванию небольших глобулярных белков привели к открытию существования термодинамически стабильного промежуточного состояния - состояния расплавленной глобулы, - похожего по структурным характеристикам на второй интермедиат сворачивания (Dolgikh et al, 1981; Ptitsyn, 1992, 1995). Было также показано, что расплавленная глобула отделена от нативного состояния переходом типа "все-или-ничего", т.е. внутримолекулярным аналогом фазового перехода первого рода (Dolgikh et al., 1981,1985).

Однако целый ряд проблем все еще оставался нерешенным. Общее состояние дел в области равновесных исследований поэтапного сворачивания белков,

сложившееся к моменту начала работы над данной диссертацией, схематически отображено в Таблице 1.

Таблица 1.

Состояние дел в области равновесных исследований поэтапного сворачивания глобулярных белков к моменту начала работы над диссертацией

Конформационное состояние Условия существования Структурные свойства Характер перехода

Развернутое состояние 8 М мочевины (б М 0(1тС1) Определены

• • . . .. ©

Первый интермедиат сворачивания © ©

. X - ©

Второй интермедиат сворачивания Определены Определены

Определен

Нативное состояние Физиологические условия Определены

Как видим, эта таблица позволяет достаточно четко сформулировать принципиальные вопросы, поиск ответов на которые был одной из целей данной работы:

1) Существует ли первый интермедиат сворачивания в равновесных условиях?

2) Если да, то какие условия приводят к его стабилизации?

3) Какие свойства приобретает белковая молекула при переходе в такое равновесное промежуточное состояние?

4) Насколько общим свойством полипептидной цепи является ее способность трансформироваться в такое промежуточное состояние?

5) Каков характер переходов, отделяющих равновесные интермедиаты сворачивания друг от друга, от полностью развернутого и от нативного состояний?

Помимо указанной выше, настоящая работа имела перед собой еще одну цель - получить информацию о возможной причастности компактных денатури рованных форм к функционированию глобулярных белков в клетке. При этом в данной части работа рассматривались следующие вопросы:

1) Какие структурные изменения может претерпевать белковая молекула в процессе своего функционирования?

2) Как влияют мутации на структурные свойства белков?

3) Мс кет ли изменение диэлектрической проницаемости среды привести к формированию в молекуле белка компактного денатурированного состояния?

На защиту выносятся следующие основные положения и результаты; 1) открыто новое равновесное промежуточное состояние белковой молекулы - со-

стояние-предшественник расплавленной глобулы, похожее по структурным характеристикам на предсказанный моделью первый интермедиа! сворачивания; детальное описаны структурные свойства белковой молекулы в этом состоянии;

2) определен характер переходов, отделяющих равновесное состояние расплавленной глобулы от ее предшественника, полностью развернутого и нативного состояний;

3) определена роль, которую может играть самоассоциация в изменении структурных характеристик денатурированной белковой молекулы;

4) показано, что введение аминокислотных замен может трансформировать белковую молекулу в состояние расплавленной глобулы; .

5) показано, что уменьшение величины диэлектрической проницаемости среды может быть движущей силой перехода белковой молекулы из нативного состояния в состояние расплавленной глобулы;

6) исследованы структурные свойства онко-эмбрионального белка а-фетопро-теина и показано, что природные лиганды играют определяющую роль в стабилизации его жесткой третичной структуры; белковая молекула в безлигандной форме обладает свойствами расплавленной глобулы; данные конформационные изменения могут быть получены в условиях, моделирующих окружение белка в поле мембраны.

Научная новизна. Все перечисленные выше результаты получены впервые. Впервые экспериментально и аналитически доказано, что состояние расплавленной глобулы представляет собой третье фазовое состояние белковой молекулы, отделенное как от нативного, так и от полностью развернутого состояний переходами типа «все-или-ничего», являющимися внутримолекулярными аналогами фазового перехода. Обнаружено новое равновесное промежуточное состояние белковых молекул - состояние-предшественник расплавленной глобулы. Это состояние впервые детально охарактеризовано с помощью целого ряда физических методов, несущих информацию о различных уровнях организации белковых структур. Впервые детально исследована структурирующая, и стабилизирующая роль самоассоциации частично-свернутых конформаций белковых молекул. Исследовано влияние точечных замен и циркулярной пермутации на структурные свойства ряда глобулярных белков. Показано, что такие изменения аминокислотной последовательности могут способствовать трансформации белковой молекулы в состояние типа расплавленной глобулы. Проведено детальное исследование структурных свойств онко-эмбрионального белка а-фетопротеина и показано, что удаление природных лигандов переводит молекулу данного белка в состояние расплавленной глобулы.

Практическая ценность работы. Полученные в работе результаты дополняют существующие представления о структуре белка, позволяют вплотную приблизиться к пониманию процесса его самоорганизации. Это, в свою очередь, делает возможным конструировать искусственные белки с заранее заданными

биологическими функциями и структурой. Исследование структурных последствий самоассоциации частично-свернутых белковых молекул важно для решения целого ряда биотехнологических проблем, связанных, в первую очередь, с получением рекомбинантных белков и производством белковых лекарств. Результаты, полученные при исследовании причин, могущих вызвать дентаурацию белков in vivo (мутации, удаление лигандов, понижение диэлектрической проницаемости среды), важны для понимания механизмов функционирования белков в клетке.

- Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на V-ой .Конференции молодых ученых социалистических стран по органической и биоорганической химии (Пущино, 1988); Международном симпозиуме «Protein folding and assambly» (Newcastle-upon-Tyne, England, 1990); Международной школе-семинаре «Modem Problems of Physical Chemistry of Macromolecules» (Пущино, 1991); VIII -ой Конференции молодых ученых социалистических стран по органической и биоорганической химии (Рига, 1991); 5-ой Конференции ученых Российской Федерации по новым направлениям биотехнологии (Пущино, 1992); симпозиуме «Advances in gene technology: protein engineering and beyond» (Miami, USA, 1993); V-ой международной летней школе по биофизике (Rovinj, Chroatia,

1994); Международном семинаре «Molten Globule: its Physical Picture and Biological Meaning» (Tokyo, Japan, 1994); International Worshop on Molecular Biotechnology (Jena, Germany, 1994); 32 Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan (Tokyo, Japan, 1994); 23th ISOBM Meeting (Montreal, Canada, 1995); the 2nd International Workshop «Principles of Protein Architecture» (Tokyo, Japan, 1995); Международной конференции памяти академика Баева (Москва, 1996); Annual Meeting of American Society for Biochemistry, and Molecular Biology (San Francisco, USA,

1995); 10th Symposium of the Protein Society (San Jose, USA, 1996); а также доложены на научных семинарах в университете Ньюкастла-на-Тайне (Англия), Калифорнийском университете (Санта Круз, США), Институте молекулярной биотехнологии (Йена, Германия); на открытом семинаре по физике белка Института белка РАН (Пущино, 1997); на совместном семинаре Института биологического приборостроения и Института экспериментальной и теоретической биофизики РАН (Пущино, 1997); на научных семинарах на физическом факультете Московского государственного Университета (Москва, 1997); в Институте молекулярной биологии РАН (Москва 1997) и Институте биоорганической химии РАН (Москва, 1998).

Публикации. Основные результаты работы отражены в 71 печатной работе, включая 55 публикаций в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.

Структура и объем диссертации. Данная .работа начинается с Введения (Глава I). Глава II представляет собой обзор литературы, посвященный совре-

менному состоянию дел в области исследования равновесных частично свернутых состояний белковой молекулы. Разработка новых методических подходов к исследованию структурных свойств денатурированной белковой молекулы описана в Главе III. Данные, свидетельствующие о том, что расплавленная глобула представляет собой отдельное фазовое состояние белковой молекулы, представлены в Главе IV, а в Главе У описано новое равновесное промежуточное состояние -предшественник расплавленной глобулы. Результаты исследований по влиянию ассоциации (олигомеризации) на структурные свойства денатурированных белков приведены в Главе VI. И, наконец, данные о возможной функциональной роли компактных форм денатурированных белков суммированы в Главах УП-1Х. Содержание Главы X составляет заключение, а основные результаты и выводы суммированы в Главе XI. Завершают диссертацию разделы Приложения и Список литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА I. ВВЕДЕНИЕ

В водной части диссертации формулируются направления и цели исследования.

ГЛАВА П. СКОЛЬКО СУЩЕСТВУЕТ РАЗЛИЧНЫХ РАСПЛАВЛЕННЫХ

ГЛОБУЛ?

В данной главе диссертации, являющейся по существу литературным обзором, рассмотрена проблема разнообразия компактных денатурированных форм молекулы белка, наблюдаемых в равновесных условиях. Описаны экспериментальные условия, в которых можно ожидать появления различных ненативных состояний белковой молекулы. Коротко освещается история открытия универсального промежуточного состояния - состояния расплавленной глобулы, и современное положение дел в этой области. Обсуждается также тот факт, что имеются некоторые основания полагать, что расплавленная глобула, не является единственной денатурированной формой, наблюдаемой для данного белка в равновесных условиях, и описаны основные структурные свойства белковой молекулы в различных денатурированных конформациях.

ГЛАВА III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРНЫХ СВОЙСТВ КОМПАКТНЫХ ДЕНАТУРИРОВАННЫХ СОСТОЯНИЙ БЕЛКОВЫХ

МОЛЕКУЛ

Известно, что мы вправе ожидать формирования равновесного промежуточного состояния там и тогда, где и когда имеет место несовпадение кривых (полученных разными структурными методами, чувствительными к различным уровням структурной организации молекулы белка), описывающих изменение структурных свойств молекулы в ответ на изменение условий среды. Подробно проблема мультипараметрического подхода к исследованию структурных свойств белков была освещена в литературном обзоре моей диссертации на соискание степени кандидата физико-математических наук (Уверский, 1991). В данной части диссертации проанализированы возможности применения двух методов - высокоэффективной гель-фильтрации и анализа времен жизни флуоресценции гидрофобного зонда 8-анилино-1-сульфоната (8-АНС) - к исследованию структурных переходов в белках и свойств различных промежуточных, состояний. Здесь же рассмотрен механизм флуоресценции гидрофобного флуоресцирующего зонда 8-АНС.

Высокоэффективная гель-фильтрация как уникальный инструмент для количественного и качественного описания процессов денатурации и разворачивания глобулярных белков

Известно, что гидродинамический объем белковой молекулы, являясь одним из наиболее важных структурных параметров, подвержен значительному изменению в процессах денатурации и разворачивания белков [см., например, (Тапйэгс!, 1968)]. Известно также, что аккуратное описание свойств белковой молекулы в различных конформационных состояниях не может быть сделано без ссылки на изменение ее размеров. Действительно, когда говорят о нативной молекуле белка, то указывают на то, что она компактна, разворачивание приводит к существенному увеличению гидродинамических размеров - молекула сильно набухает; напротив, переход- в состояние расплавленной глобулы не сопровождается заметным изменением размеров и молекула белка в этом промежуточном состоянии почти столь же компактна, что и нативная молекула.

В данной части диссертации описаны особенности применения гель-фильтрации для качественного и количественного исследования денатурации и разворачивания небольших глобулярных белков, для разделения возникающих кон-формеров и описания их структурных свойств. Отмечается, что использование гель-фильтрации для изучения процессов денатурации и разворачивания глобулярных белков имеет целый ряд преимуществ по сравнению с традиционными гидродинамическими методами. К таким преимуществам относятся:

1) Возможность использования низких концентраций белка, что позволяет избежать появления ассоциации и агрегации;

2) Существенное уменьшение времени эксперимента;

3) Возможность определения гидродинамических размеров белковой молекулы с высокой степенью точности;

4) Возможность получения прямой термодинамической характеристики исследуемых переходов (наличие бимодального распределения по молекулярным размерам характеризует переходы типа "все-или-ничего")

5) В случае медленного обмена между компактным и менее компактным состояниями появляется возможность разделения этих конформеров и нездвисимого исследования их структурных свойств.

Наибольший интерес, безусловно, представляют два последних наблюдения. Дело в том, что форма профиля элюции, полученного в области перехода между двумя состояниями, отличающимися по своим гидродинамическим размерам, сильно зависит от соотношения двух характерных скоростей - скорости обмена между этими состояниями и скорости хроматографического процесса. В том

£

6.0 м с с 1

2 .6 м с а ш с i

2.2 м с<1пс1

i .9 м слшс!

i .6 м слшс1

14 м й ¿и с i

! О М СйтС!

0.0 м с лт с i

1 0 1 5 20 25 Объем элюции (мл)

^ г 01 м ап с\

1 1.72 м й¿га с1 ^//М 1 63 м слп> с1

■л V 1.49 м б¿ш с1

Л v 1.42 м ватс!

^ V 0.00 М Б <1ш С 1

10 15 20 25 Объем элюции (мл)

Рисунок 2. Профили элюции, наблюдаемые с помощью гель-фильтрации при разворачивании глобулярных белков с различным соотношением между скоростью обмена белковых конформеров и характерной скоростью хроматографического процесса:

(а) Скорость обмена между компактным и менее компактным состояниями белковой молекулы больше скорости хроматографии (карбоангидраза В при 15°С).

(б) Скорость обмена между компактным и менее компактным состояниями белковой молекулы' меньше скорости хроматографического процесса (карбоангидраза В при 4°С).

случае, когда скорость обмена между состояниями гораздо выше скорости элюции, в профиле элюции наблюдается единственный пик, описывающий поведение усредненных гидродинамических размеров молекул (см. Рисунок 2а). В том же случае, когда скорость обмена мевду конформерами заметно меньше скорости хроматографического процесса, в профиле элюции будут наблюдаться два пика, отвечающих более и менее компактным состояниям белковой молекулы (см Ри-

сунок 26). Ясно, что наличие двух пиков в профиле элюции открывает совершенно уникальную возможность исследования структурных свойств более и менее компактных белковых молекул, начиная от независимой оценки гидродинамических размеров в каждом из этих состояний и кончая описанием характерных структурных свойств каждого из них.

Применение метода затухания флуоресценции гидрофобного зонда 8-АНС для исследования структурных превращений в глобулярных белках

8-Анилино-1-нафталеносульфоновая кислота (8-АНС) является гидрофобным флуоресцирующим зондом, который наиболее часто используется для исследования структурных свойств белковых молекул. Более тридцати лет назад было показано, что при взаимодействии с доступными растворителю гидрофобными кластерами нативных белков наблюдается значительное возрастание интенсивности флуоресценции этого зонда, сопровождаемое существенным синим сдвигом положения максимума флуоресценции АНС (Stryer, 1965).

Интерес к этому зонду достиг своей наивысшей точки после того, как было показано, что АНС преимущественно взаимодействует с равновесными и кинетическими интермедиатами сворачивания глобулярных белков (Semisotnov et al., 1987, 1991; Родионова и др., 1989; Goto & Fink, 1989; Ptitsyn et al., 1990). В частности, .было установлено, что взаимодействие АНС с белковой молекулой в состоянии расплавленной глобулы сопровождается существенным увеличением интенсивности флуоресценции зонда и это свойство АНС может быть использовано для визуализации формирования этого промежуточного состояния в процессе сворачивания белка.

В данной части диссертации рассматривается молекулярный механизм флуоресценции АНС и исследуется вопрос о том, как взаимодействие 8-АНС с белками сказывается на поведении такого важного параметра флуоресценции, как время жизни в возбужденном состоянии.

Нами было установлено, что молекулы* 8-АНС склонны к самоассоциации. Данный процесс, протекающий не только в водных растворах, но и в сильно неполярных органических растворителях, приводит к заметному изменению спектральных свойств зонда. В частности, было показано, что мономерная форма характеризуется заметно более длительным временем жизни флуоресценции (например, в сильно неполярных протонных растворителях, которые могут рассматриваться в качестве относительно хорошей модели для окружения молекулы 8-АНС внутри белковой молекулы, мономерная и ассоциированная формы зонда имеют времена жизни флуоресценции тм^16 и тд~10 не, соответственно).

Известно, что время затухания свободного 8-АНС хорошо описывается моноэкспоненциальным законом как в воде, так и в органических растворителях (Gelier et al., 1987). Нами были определены параметры затухания флуоресценции

зонда в присутствии нескольких глобулярных белков, находящихся в различных конформационных состояниях (нативном, состоянии расплавленной глобулы и развернутом), и проведено исследование зависимости данных параметров от изменения условий среды (см. Таблицу 2). Из анализа времен жизни флуоресценции выяснилось, что существует по крайней мере два типа взаимодействий АНС-белок. При взаимодействиях первого типа (характеризующихся временами жизни флуоресценции порядка 1-5 не) молекулы зонда связаны с поверхностными гидрофобными кластерами белковой молекулы; при этом молекулы зонда достаточно хорошо доступны растворителю и внешнему тушителю - акриламиду (бимолекулярные константы скорости динамического тушения флуоресценции равны

Таблица 2

Параметры затухания флуоресценции 8-АНС, измеренные для комплексов зонда с глобулярными белками в различных конформационных состояниях

Белок Конформационное состояние, экспериментальные условия "С! (НС) I, (%) ■ь (не) 12 (%)

Р-Лактамаза Нативное: рН 7.5,25°С, 0.05 М №-Р 11.2 81 2.5 19

(^Лакгоглобулин Нативное: рН 7.5,25°С, 0.05 М Ыа-Р 11.4 82 ' . 23 18

Лизоцим Нативное: рН 7.5,25°С, 0.05 М Ыа-Р 10.7 76 2.8 24

Расплавленная рН 7.5, 25°С, 15.8 89 2.9 11

Р-Лактамаза глобула 0.7 М С(1тС1

Расплавленная рН 3.0,25°С, 16.2 91 3.1 9

глобула 0.05 М Ыа-Р.

Карбоангццраза В коровы Расплавленная глобула Расплавленная глобула рН 7.5,25°С, 1.8 м вата рН 3.5,25°С, 0.05 М Ыа-Р 15.9 17.3 95 92 2.3 2.8 5 8

Р-Лактоглобуетш Расплавленная глобула рН 4.0,25°С, 40% метанола 17.2 90 2.9 10

а-Лгэтальбумкн коровы Расплавленная глобула рН 2.0,25°С, 0.05 МЫа-Р 15.7 82 2.5 18

а-Лакгальбумин человека Расплавленная глобула Расплавленная глобула рН 6.8,25°С, 2.о м вата рН 2.0,25°С, 0.05 М Ыа-Р 15.1 15.9 69 88 2.5 3.1 31 12

~4х108 М"'с''). При взаимодействиях второго типа (характерные времена жизни флуоресценции - 10-17 не) молекулы 8-АНС погружены внутрь белковой молекулы, плохо доступны растворителю, и значительно менее эффективно тушатся ак-риламидом (для таких комплексов величина бимолекулярной константы скорости динамического тушения флуоресценции составляет ~

Было также показано, что структурные превращения, претерпеваемые белковой молекулой в процессе денатурации и разворачивания, сопровождаются су

щественными изменениями дол-гоживущей составляющей флуоресценции зонда, характеризующей взаимодействия АНС-белок второго типа. В качестве иллюстрации на Рисунке 3 приведены результаты, полученные при исследовании равновесного разворачивания р-лактамазы гу-анидингидрохлоридом - одного из белков, разворачивание которых .соровождается формированием состояния расплавленной глобулы (Robson & Pain, 1976; Christensen & Pain, 1991). Видно, что зависимость величины долгоживущей компоненты флуоресценции зонда от концентрации GdmCl проходит Через максимум, положение кото-

0.5 1.0 1.5

Концентрация GdmCl (М)

Рисунок 3. Изменения параметров затухания флуоресценции комплексов 8-АНС-белок (рН 7.5), индуцированные увеличением концентрации GdmCl в растворе, содержащем [5-лактамазу и связанные с переходами белковой молекулы из нативного состояния в расплавленную глобулу и из расплавленной глобулы в клубок. Кружки и квадратики относятся к далгржи-вущей и короткоживущей компонентам затухания флуоресценции зонда, соответственно.

poro совпадает с максимумом популяции состояния расплавленной глобулы. Интересно отметить, что в отличие от многих других белков, р-лактамаза способна эффективно взаимодействовать с 8-АНС даже в нативном состоянии. При этом величина долгоживущей составляющей времени жизни флуоресценции 8-АНС равна 11.2 не. Однако при переходе белка в состояние расплавленной глобулы величина данного параметра возрастает до 16.2 не. Следует отметить, что аналогичное поведение наблюдалась и для комплексов данного зонда с другими белками. Действительно, Таблица 2 показывает, что долгоживущая компонента флуоресценции 8-АНС, измеренная для комплексов этого зонда с белками, находящимися в состоянии расплавленной глобулы, в среднем в ~1.5 раза превосходит соответствующую величину, определенную для комплексов 8-АНС с нативными белками (тн~Ю-11 не, трг~15-17 не). Сравнение этих результатов с величинами времен жизни флуоресценции мономерной и ассоциированной форм зонда в сильно неполярных протонных растворителей позволяет предположить, что в комплексах АНС с нативньми белками данный зонд находится в ассоциированной форме, и является преимущественно мономерным в комплексе с белками в состоянии расплавленной глобулы.

ГЛАВА IV. РАСПЛАВЛЕННАЯ ГЛОБУЛА - ТРЕТЬЕ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ

Индуцированные сильными денатурантами переходы между нашивным состоянием, состоянием расплавленной глобулы и клубкообразным состоянием протекают по принципу "все-или-ничего". Анализ экспериментальных данных

Известно, что тепловая денатурация небольших глобулярных белков является переходом типа "все-или-ничего" (Рпуа1оу, 1979), тогда как большие белки

состоят из двух или нескольких доменов, которые могут плавиться независимо друг от друга (РпуэЬу, 1982). Было предположено также, что индуцированное сильными денатурантами разворачивание ряда небольших глобулярных белков тоже является переходом "все-или-ничего" (ТапСэг(1, 1968; РНуа1оу, 1979). С другой стороны было установлено, что зачастую разворачивание белков, индуцированное мочевиной или Ос1тС1, протекает по крайней 'мере в две стадии: переход из нативного состояния в расплавленную глобулу и переход из расплавленной глобулы в полностью развернутое состояние. Было показано, что оба перехода имеют сигмоидальную форму, что говорит о том, что они достаточно кооперативны. Однако не было никакой информации о размерах кооперативной единицы для каждого из этих переходов, и, как следствие, было непонятно, являются ли они переходами типа "все-или-ничего".

Рисунок 4. Зависимость параметров кооперативное™ переходов Н-»Р, индуцированных мочевиной (треугольники) или Сс1тС1 (кружки), в глобулярных белках.

(А) Зависимость Д от молекулярного веса белка

(измеренного в кДа).

эфф

(Б) Зависимость Д v //->/>)от 1°е(М).

Обычным методом оценки степени кооперативное™ перехода является определение крутизны наклона кривой в точке полуперехода. Параметры, определенные из ширины перехода (разница энтальпий, или разница степени ионизации, или разница числа молекул денатуранта), относятся к кооперативной единице, т.е. к той части молекулы, которая претерпевает переход, как единое целое. Использование некоторых экспериментальных методик позволяет измерять также аналогичные параметры для целой молекулы белка (или ее мономерной единицы). В отличие от хорошо известных случаев сканирующей микрокалориметрии и по-тенциометрического титрования, экспериментальное измерение разницы числа молекул1 денатуранта Ду, приходящихся на белковую молекулу в случае переходов, индуцированных мочевиной или GdmCl, является практически неосуществимым. Действительно, для того, чтобы иметь такого рода информацию было бы необходимо измерять не только разницу в активности денатурантов между разбавленными растворами белка и растворителем, но также и непонятным образом оценивать изменение этой разницы в области структурного перехода белковой молекулы. Для изучения индуцированных растворителем конформационных переходов в белках был использован иной подход. Этот подход состоял в анализе зависимости ширины структурного перехода от молекулярного веса белка (М). Известно, что крутизна фазового перехода, происходящего в малой системе, зависит от размеров этой системы (Hill, 1963-1964; Гросберг и Хохлов, 1989). Более того, в том случае, когда мы имеем дело с фазовым переходом первого рода, крутизна перехода возрастает пропорционально увеличению числа единиц, входящих в систему (Hill, 1963-1964). Это означает, что, имея информацию о том, зависит ли крутизна наклона перехода от молекулярного веса, можно понять является ли исследуемый переход фазовым или нефазовым. Очевидно, что такой подход доложен работать только для не-

1.0 log (MW)

Рисунок 5. Зависимость разницы числа молекул денатуранта, связанных с нативным и полностью развернутым состояниями (Д V р) кооперативной единицы небольших глобулярных белков (М<25-30 кДа), представленная в двойном логарифмическом масштабе. Треугольники и кружки относятся к переходам, индуцированным мочевиной и GdmCl, соответственно. Черными символами приведены результаты, полу. эфф , , эфф ценные для суммы AV //_,/>/"+ Д V

больших глобулярных белков, поскольку существование доменной структуры в больших глобулярных белках может приводить к более или менее независимому разворачиванию различных доменов.

В данной части диссертации приводится анализ существующих экспериментальных данных по индуцированным мочевиной или вётО переходам Н->Р, Н-»РГ и РГ-»Р (где символы Н, РГ и Р относятся к нативному состоянию, расплавленной глобуле и полностью развернутому состоянию, соответственно) в небольших глобулярных белках.

Определение степени кооперативности переходов, индуцируемых в белках сильными денатурантами. Константа равновесия перехода типа "все-или-ничего" между двумя состояниями Кэфф определяется соотношением 0

фф _

1-0

(1),

где © представляет долю молекул в одном из двух состояний. •

В качестве меры кооперативности для денатурант-индуцированных переходов бралась величина параметра Av, представляющего собой разницу числа молекул денатуранта, связанных с кооперативной единицей в двух состояниях (Tanford, 1968). Величина Avm может быть определена из константы равновесия (Aune & Tanford, 1969), используя соотношение

-■if

(2).

1.00 1.25

log (М)

Рисунок 6. Зависимость разницы числа молекул денатуранта, связанных с нативным состоянием и расплавлен-эфф

ной глобулой (Av я-»яг) в Небольших глобулярных белках (М<25-30 кДа), представленная в двойном логарифмическом масштабе. Треугольники и кружки относятся к переходам, индуцированным мочевиной и GdmCl, соответственно.

где а - активность денатуранта, а а, - его активность в точке полуперехода. Следовательно, величина может быть определена из зависимости любого структурного параметра от активности денатуранта.

Используя такой подход, мы проанализировали представленные в литературе данные по равновесному разворачиванию более чем девяноста глобулярных белков. Анализировали переходы, описываемые сигмои-дальной кривой и регистрируемые по изменению одного или нескольких структур-

ных параметров (включая изменение спектров КД в ближней и дальней УФ областях, вязкости, биологической активности, флуоресценции, спектров 'Н-ЯМР, хроматографических профилей и спектров поглощения). Рассматривали как белки, равновесное разворачивание которых происходит в одну стадию (перехды Н->Р), так и белки, разворачивание которых происходит в две стадии, т.е. сопровождается формированием состояния расплавленной глобулы (переходы Н-»РГ и РГ—>Р). Результаты такого анализа приведены на Рисунках 4-7,

На Рисунке 4а приведены данные по зависимости степени кооперативное™ индуцированных мочевиной или Ос1тС1 переходов Н-»Р в 90 белках, полученные из анализа доступных литературных данных. Как мера кооперативное™ использовалась величина параметра Дуэфф. Из Рисунка 4 видно, что кривая зависимости Ду,фф(М) состоит из двух частей. Для небольших глобулярных белков (с молекулярным весом М<25-30 кДа), степень кооперативности перехода возрастает с ростом М, тогда как для больших глобулярных белков (с молекулярным весом М>25-30 кДа) степень кооперативности не зависит от молекулярного веса. При использовании логарифмической шкалы такое поведение делается более выразительным (Рисунок 46).

На Рисунке 5 представлена зависимость логарифма от логарифма

молекулярного веса полученная для Н->Р переходов в небольших глобулярных белках. На Рисунке 6 приведена аналогичная зависимость для Н->РГ переходов, а на Рисунке 7 - для переходов РГ->Р. Видно, что во всех трех случаях степень кооперативности перехода возрастает с ростом М. Существование такой зависимости показывает, что индуцированные сильными денатурантами переходы Н—>Р, Н-»РГ и РГ-»Р в небольших глобулярных белков имеют фазовый характер.

На Рисунке 7 представлены два типа переходов между расплавленной глобулой и клубком. Переходы первого типа относятся к белкам, для которых равновесное разворачивание мочевиной или 0(1тС1 сопровождается формированием

0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75

log (М)

Рисунок 7. Зависимость разницы числа молекул денату-ранта, связанных с расплавленной глобулой и полностью эфф

развернутым состоянием (Д1' небольших глобу-

лярных белков (М<25-30 кДа), представленная в двойном логарифмическом масштабе. Треугольники и кружки относятся к переходам, индуцированным мочевиной и GdmCl, соответственно. Символы с точками относятся разворачиванию кислых форм белков (см. текст).

промежуточного состояния расплавленной глобулы. Переходы второго типа характеризуют белки, которые могут быть трансформированы в состояние расплавленной глобулы понижением рН раствора, а затем развернуты, используя сильные денатуранты. Отсутствие систематического отличия между зависимостями ДуЭ|М1 (М), полученными для переходов этих двух типов, позволяет заключить, что расплавленные глобулы, индуцированных умеренными концентрациями денатуран-тов или уменьшением рН, имеют одинаковые термодинамические свойства.

Статистический анализ данных представленных на Рисунках 5-7 показал, что они могут быть описаны следующими уравнениями

для переходов Н->Р, Н->РГ и РГ-»Р, соответственно.

Тот факт, что коэффициенты пропорциональности во всех трех уравнениях близок к единице позвол сделать заключение о том, что Н-»Р, Н-»РГ и РГ—>Р переходы, индуцированные в небольших глобулярных белках как мочевиной, так и Ос1тС1, являются переходами типа "все-или-ничего", т.е. внутримолекулярными аналогами фазовых переходов первого рода макроскопических систем.

Предположение, что переходы Н—>РГ и РГ—»Р следуют принципу "все-или-ничего" подтверждается также тем фактом, что сумма величин Ду*'"'' для этих двух переходов близки к соответствующей величине Ду3**, определенной непосредственно для перехода Н->Р, наблюдаемого в белках близкого молекулярного веса (см. черные символы на Рисунке 5). Очевидно, что этот факт однозначно указывает на то, что переходы всех трех типов имеют идентичную кооперативную единицу.

Результаты прямого эксперимента: СйтС1-индуцированное при 4°С разворачивание состояния расплавленной глобулы карбоангидразы В и /3-лактамазы протекает по принципу "все-или-ничего"

В предыдущем разделе аналитически было показано, что переход РГ—>Р является■ переходом типа «все-или-ничего». Данный раздел посвящен прямому экспериментальному доказательству правильности этого вывода. Доказательство основано на использовании разделительной техники (например, гель-фи-. льтрации). Выше уже говорилось о том, что для медленных переходов типа "все-или-ничего" такой подход позволяет получить два пика в области перехода. Было проведено мультипараметрическое исследование равновесного разворачивания

1оё(д = 0.97 1оё(М) -0.07 = 1.02 1о8(Л/) - 0.49 =0.89 к^(М)-0.40

(3)

(4)

(5)

GdmCl при 4°C двух глобулярных белков - карбоангидразы В коровы и Р-лактамазы из Staphylococcus aureus.

Результаты мультипараметрического исследования индуцированного гуа-нидингидролоридом разворачивания карбоангидразы В при 4°С приведены на Рисунке 8. Видно, что разворачивание этого белка протекает в несколько этапов. Первая стадия характеризуется резким (в интервале от 1.0 М до 1.5 М GdmCl) уменьшением амплитуды спектра КД в области поглощения ароматических групп и исчезновением эстеразной активности (Рисунок 8а, кривая 1), что отражает разрушение жесткой третичной структуры молекулы белка, т.е. собственно ее денатурацию. Последующие стадии характеризуют дальнейшее разворачивание уже денатурированного белка. Кривая 2 на этом рисунке описывает переход типа "все-или-ничего" между компактными и менее компактными состояниями молекулы белка, а кривая 3 описывает разворачивание молекулы карбоангидразы В, тестируемое по увеличению усредненных гидродинамических размеров (см. выше).

Следует отметить, что зависимость эллиптичности поглощения на 220 нм от концентрации GdmCl (Рисунок 86) имеет весьма сложный характер: на первой стадии наблюдается увеличение амплитуды спектра КД в дальней УФ-области (такое поведение может быть объяснено устранением положительного вклада аромати-

Кокцснтрацня GdmCl (М)

Рисунок 8. Изменение структурных характеристик карбоангидразы В при равновесном разворачивании белка гуанидингидрохлоридом при 4°С:

(A) Уменьшение эллиптичности поглощения на 270 нм (открытые кружки) и эстеразной активности белка (перевернутые треугольники); уменьшение площади под пиком элюции, отвечающим менее компактным молекулам белка (квадратики); увеличение усредненных гидродинамических размеров белковой молекулы (треугольники).

(Б) Изменение эллиптичности поглощения на 220 нм.

(B) Изменение интенсивности флуоресценции АНС.

ческих аминокислотных остатков в пептидную область спектра КД при переходе молекулы белка в состояние расплавленной глобулы (Родионова и др., 1989)). Дальнейшее увеличение концентрации денатуранта приводит к уменьшению амплитуды спектров КД в пептидной области, непосредственно связанному с разрушением вторичной структуры белка.

Из Рисунка 8в видно, что интенсивность флуоресценции гидрофобного флуоресцирующего зонда АНС претерпевает существенные' изменения по мере увеличения концентрации С<1тС1 в растворе, содержащем белок и АНС. При этом

интенсивность флуоресценции АНС проходит через максимум в районе 1.5 М 0<1тС1 (Рисунок 8в), отражая формирование промежуточного состояния с высоким сродством к этому зонду.

Следовательно, при 4°С к 1.5 М Сс1тС1 карбоан-гидраза В переходит в промежуточное состояние, почти столь же компактное, что и нативное состояние, имеющее выраженную вторичную структуру, но утратившее жесткую упаковку боковых групп и обладающее большим сродством к АНС. Иными словами, процесс равновесного разворачивания данного белка является стадийным и на первой стадии происходит формирование расплавленной глобулы. Весьма похожая картина наблюдалась и при равновесном разворачивании р-лактамазы (см. Рисунок 9).

Таким образом, примерная последовательность событий, происходящих при равновесном разворачивании обоих белков гуанидингидрохлоридом при 4°С выглядит следующим образом:

Первый этап - денатурация белковой молекулы - переход из нативного состояния в расплавленную глобулу (исчезновение эстеразной активности и спектров КД в ароматической области).

Второй этап - переход типа "все-или-ничего" между компактной расплавленной глобулой и менее компактным денатурированным состоянием, тестируемый по наличию бимодальности распределения по размерам в профиле БРЬС.

Концентрация GdmCl (М)

Рисунок 9. Изменение структурных параметров при равновесном разворачивании Р-лактамазы из Staphylococcus aureus гуанидингидгохлоридом при 4°С: Кривая 1 - уменьшение энзиматической активности белка (треугольники) и эллиптичности поглощения на 270 нм (кружки);

Кривая 2 - уменьшение площади под пиком элюции, отвечающим менее компактным молекулам белка в профиле FPLC;

Кривая 3 - увеличение усредненных гидродинамических размеров белковой молекулы;

Кривая 4 - уменьшение эллиптичности поглощения на 220 нм

Одновременно наблюдается первая стадия уменьшения эллиптичности поглощения на 220 нм;

. Третий этап - разворачивание белковой молекулы, тестируемое по увеличению ее усредненных гидродинамических размеров. Одновременно происходит вторая стадия уменьшения интенсивности спектров КД в пептидной области.

Видно, что переход типа "все-или-ничего", тестируемый по бимодальнос-ти профиля FPLC, происходит между двумя денатурированными состояниями белковой молекулы - состоянием расплавленной глобулы и в существенной степени менее компактным состоянием. Структурные свойства этого менее компактного состояния (состояния-предшественника расплавленной глобулы) будут описаны в следующей главе.

Таким образом, совокупность полученных экспериментальных данных позволяет сделать вывод о том, что расплавленная глобулы отделена переходами типа "все-или-ничего" как от нативного, так и от полностью развернутого состояний. Из этого следует, что белковая молекула может находиться по крайней мере в трех дискретных фазовых состояниях: нативном, состоянии расплавленной глобулы и полностью неупорядоченном.

ГЛАВА V. ПРЕДШЕСТВЕННИК РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ - НОВОЕ РАВНОВЕСНОЕ СОСТОЯНИЕ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ

В вводной части уже говорилось о том, что модель поэтапного сворачивания белков (Птицын, 1973) предсказала существование двух основных интерме-диатов сворачивания: менее компактного с флуктуирующей вторичной структурой и компактного, обладающего не только существенно более стабильной вторичной структурой, но и похожей на нативную топологией, т.е. взаимной ориентацией элементов вторичной структуры - а-спиралей и р-тяжей. Говорилось также о том, что оба этих интермедиата в дальнейшем были обнаружены и охарактеризованы при кинетических исследованиях сворачивания белков. Второй интер-медиат (известный как состояние расплавленной глобулы) был обнаружен и при равновесных исследованиях. Что касается первого интермедиата (предшественник расплавленной глобулы), то долгое время он был известен лишь как коротко-живущее кинетическое состояние, малое время жизни которого (порядка 10 мсек) не позволяло проводить детальные исследования его стуктурных свойств.

В данной главе диссертации приведены результаты исследования равновесного разворачивания карбоангидразы В и р-лактамазы (из Staphylococcus aureus) в присутствии гуанидингидрохлорида при низких температурах, результаты исследования индуцированного анионами сворачивания стафилококковой нуклеазы, предварительно развернутой понижением рН раствора и результаты исследований рН-индуцируемого сворачивания случайного сополимера полярных и

неполярных аминокислот. Приведены структурные характеристики полипептидной цепи в состоянии-предшественнике расплавленной глобулы.

Трехстадийное равновесное разворачивание карбоангидразы В и fi-лактамазы гуанидингидрохлоридом при низких температурах

Уже неоднократно говорилось о том, что прежде существовали две модели равновесного разворачивания небольших глобулярных белков:

Н->Р, (I)

где Н - нативное, а Р - полностью развернутое состояния или

Н->РГ->Р, (II)

где РГ - расплавленная глобула.

Как следует из Рисунков 8 и 9, равновесное разворачивание карбоангидразы В и Р-лактамазы нельзя описать в рамках обычных схем, типа (I) и (II), - появляется необходимость ввести в рассмотрение второе равновесное промежу-: точное состояние:

Н->РГ-> ПРГ -> Р, (I'll).

где ПРГ - предшественник расплавленной глобулы (рге-molten globule state) - дополнительный йнтермедиат, обладающий свойствами, промежуточными между свойствами расплавленной глобулы и неупорядоченного клубка.

Действительно, Рисунки 8' и 9 показывают, что при 4°С GdmCl-индуцированное разворачивание данных белков происходит в три этапа (см. выше). Очевидно, что наличие трех конформационных переходов свидетельствует о существовании по крайней

\/„ f 1

/,r/V \ fppr

Б

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

Концентрация ОйтС! (М)

Рисунок 10. Трехстадийность разворачивания карбоангидразы В (А) и р-лакгамазы (Б) при 4°С: долю нативных молекул (/"н) определяли из кривой изменения интенсивности спектров КД в ближней УФ области. Долю развернутых молекул (/р) и долю компактных молекул (Д вычисляли из данных по гель-фильтрации. Долю молекул, находящихся в состоянии расплавленной глобулы (/~ег), определяли из соотношения: /Рг= /к-/р> а долю молекул в состоянии-предшественнике расплавленной глобулы -соотношением: /прг= 1-/рг- /р.

мере двух различных интермедиатов между нативным и полностью развернутым состояниями. Этот факт отражен на Рисунке 10, где для данных белков приведены зависимости долей различных конформеров (/н, /рг, /прг и _//>, см. подпись к рисунку) от концентрации Ос1тС1. Из Рисунка 10 видно, что ни в одном из исследованных случаев популяция промежуточных состояний не достигает 100 %. Тем не менее полученные данные позволяют оценить (хотя и достаточно грубо) структурные свойства ККАВ и р-лактамазы в различных конформационных состояниях, наблюдаемых в течение Ос1тС1-индуцированного равновесного разворачивания этих белков при 4°С. Данные свойства суммированы в Таблице 3. Как видно, белковая молекула в состоянии - предшественнике расплавленной глобулы заметно менее компактна, чем в состоянии расплавленной глобулы и, тем более, чем в нативном состоянии, но она остается все еще достаточно компактной. Видно также, что предшественник расплавленной глобулы хуже взаимодействует с АНС и имеет заметно более возмущенную вторичную структуру.

Таблица 3

Структурные свойства ККАВ и р-лактамазы в различных конформационных состояниях ■__:_(рН 6.8,4"С)

Белох Конформационное состояние (условия среды) Активность [9]ло. град см2 [0]2!О. град см2 к«. А % я" ,фя ' АНС

дмоль дмоль

ККАВ Н РГ ПРГ Р (0.00 М Ос1тС1) (ЫЗМОЛпС!) (1.69М вс1шС1) (6.00 М ОёгпС1) + -200 -10 0 0 -3200 -4700 -3000 -200 23.0 26.4 <30.7 52.4 1.00 1.15 <1.33 2.28 5 40 12 5

Н (0.00 М С<1шС1) + -50 -11500 23.5 1.00

р-Лактамаза РГ (0.40 М С(1тС1) - -5 -9700 27.2 1.16 -

ПРГ (0.75 М Сс1тС1) - -5 -6700 <31.4 <1.34 -

Р (6.00 М Ос1тС1) - -25 ■ -2100 53.0 2.26 -

Было бы интересно сравнить полученные результаты с теоретической моделью и трехстадийной схемой кинетического сворачивания белков. Результаты такого сравнения представлены на Рисунке 11. Как следует из рисунка, все три схемы очень близки. Эта близость основана не только на наличии интермедиатов, обладающих похожими свойствами (см. выше), но также и на существовании больших потенциальных барьеров, разделяющих различные состояния, вовлеченные в эти процессы. Действительно, накопление кинетических интермедиатов отражает наличие существенных потенциальных барьеров, отделяющих их как друг от друга, так и от развернутого и нативного состояний. С другой стороны, равновесная расплавленная глобула отделена переходами типа "все-или-ничего", т.е. очень высокими потенциальными барьерами, как от нативного, так и от полностью развернутого состояний. Более того, в тех случаях, когда было описано состояние-предшественник расплавленной глобулы, оказалось, что оно также отделено от расплавленной глобулы переходом типа "все-или-ничего".

Аь Модель поэтапного сворачивания белков

Развернутое - состояние

развернутая полипептидная цепочка

Первый интермедиат сворачивания

Второй

интермедиат

сворачивания

Нативное состояние

вторичная структура, флуктуирующая вокруг нативных позиций

нативоподобные вторичная структура и топология

натнвная третичная структура

Б. Кинетические стадии сворачивания белков

развернутая полипептидная цепочка

Кинетический предшественник расплавленной глобулы Кинетическая расплавленная глобула

Развернутое состояние —^ >

- флуктуирующая вторичная структура, частичная компактизация, слабое связывание АНС

стабильная нативоподобная вторичная структура, высокая степень компактности, высокое сродство к АНС, нативоподобная топология

Нативное состояние

натнвная третичная структура

| Развернутое | состояние

В. Трехстадийное равновесное сворачивание белков

развернутая полипептидная цепочка

Равновесный -предшественник расплавленной глобулы

флуктуирующая вторичная структура, частичная компактизация, слабое связывание АНС

Равновесная

расплавленная

глобула

Нативное состояние

стабильная нативоподобная вторичная структура, высокая степень компактности, высокое сродство к АНС, . нативоподобная топология

дативная третичная структура

Рисунок И. Сравнение модели поэтапного сворачивания белков (А) с экспериментально определенными схемами кинетического (Б) и равновесного (В) сворачивания небольших глобулярных белков.

Индуцированное анионами сворачивание стафилококковой нуклеазы

Как уже говорилось, конформационные переходы в изученных системах существенно перекрываются, и, как следствие такого перекрывания, максимальная популяция расплавленной глобулы составляла -80%, а ее предшественника ---40% (см. Рисунок 10). Это означало, что детальное исследование структурных

свойств белковой молекулы в данных промежуточных состояниях было осложнено. Чтобы решить данную, проблему была предпринята попытка найти такую систему, в которой вероятность пребывания белковой молекулы в состоянии рас-плавленой глобулы или ее предшественника была бы близка к 100%-ной.

Из анализа полученных к настоящему моменту экспериментальных данных следовало, что удобной системой для такого рода исследований может служить явление так называемого анион-индуцируемого сворачивания глобулярных белков, предварительно развернутых кислотой. Данное явление было детально описано в работах Гото и Финка (Goto & Fink, 1989, 1990; Fink et al., 1994), а его сущность сводится к следующему. Известно, что понижение pH раствора может приводить к денатурации или даже к полному разворачиванию белковой молекулы из-за кулоновского отталкивания между одноименно (положительно) заряжен-ньгми группами молекулы белка (Tanford, 1968). Было установлено, что этот эффект может быть нейтрализован путем добавления в раствор различных анионов (Goto & Fink, 1989, 1990; Fink et al., 1994), которые отличаются по своей эффективности нейтрализации суммарного положительного заряда. Экспериментально такое явление фиксируется по появлению элементов упорядоченной структуры в белковой молекуле, предварительно развернутой кислотой (pH 2.0), в ответ на увеличение концентрации анионов различной природы (в том числе и за счет увеличения концентрации анионов СГ (из HCl), наблюдаемом при дальнейшем понижении pH).

В качестве объекта исследования была выбрана стафилококковая нук-леаза, структурные свойства которой изучали с использованием большого числа физико-химических методов в широком диапазоне экспериментальных условий. Изучали также влияние различных анионов на структурирование белка, предварительно развернутого кислотой, и структурные свойства нук-леазы в различных анион-индуцированных конфор-мациях.

Рисунок 12. рН-Индуцируемые изменения в стафилококковой нуклеазе, регистрируемые по изменению эллиптичности поглощения [6]276 (треугольники) и [9]222 (кружки). Титрование осуществлялось добавлением небольших количеств HCl или NaOH к раствору нативного белка. Символы с точками отвечают результатам экспериментов по ренатурации белка, в которых небольшие количества HCl или NaOH добавляли к раствору рН-денатурированного белка. Растворы инкубировали в течение двух часов перед началом измерений.

На Рисунке 12 приведены зависимости [6]276 и [0]222 от рН, отражающие структурные изменения, индуцируемые измененеим рН в нуклеазе. Из рисунков видно, что нуклеаза имеет нативную структуру в достаточно узком диапазоне рН (рН~5.0 и ~8.0), тогда как понижение или повышение рН раствора приводит к денатурации (регистрируемой по изменению [6]276) и разворачиванию (регистрируемому по изменению [б]222) белковой молекулы. Интересно отметить, что при понижении рН среды оба исследованных параметра изменяются одновременно. Из Рисунка 12 также видно, что при рН меньших 2.0 наблюдается заметное увеличение сигнала КД в пептидной области спектра.,

Рисунок 13. Индуцированное анионами сворачивание развернутой кислотой стафилококковой нуклеазы (рН 2.5). Конформационные изменения индуцировались добавлением к раствору развернутого белка ТХА - (А) или хлорида (Б, квадратики - за счет увеличения концентрации НС1, кружки - увеличением концентрации КС1). Во врезках приведены соответствующие спектры КД в пептидной области. Спектры соответствуют 0, 20,25, 30, 30, 35,40,45, 50 и 60 мМ ТХА - (А); О, 60, 180, 240, 360, 435, 515,600 и 960 мМ КС1 - (Б).

Результаты исследования влияния различных анионов (хлорида и трихлор-ацетата) на структурные свойства развернутой кислотой стафилококковой нуклеазы приведены на Рисунке 13. Видно, что увеличение концентрации анионов приводит к кооперативному увеличению эллиптичности поглощения на 222 нм, т.е. индуцирует в белковой молекуле регулярную вторичную структуру. Рисунок 136 показывает также, что вторичная структура нуклеазы восстанавливается одинаковым образом как при увеличении концентрации КС1 (при рН 2.5, кружки), так и при понижении рН (квадратики). Интересно отметить, что влияние изученных анионов хорошо описывается сишоидальной кривой, хотя для завершения перехода требуются различные количества анионов: -50 мМ ТХА и ~ 800 мМ КС1. Интересен тот факт, что не только разное количество различных анионов необходимо для завершения перехода, но и разные анионы имеют также различный

стуктурирующий эффект. Действительно, как следует из Рисунка 13, количество упорядоченной вторичной структуры в нуклеазе существенньм образом зависит от природы аниона: минимальный эффект наводится в молекуле белка хлоридом ([0]222 -—8000 град см2 / дМ; ~ 50% нативной вторичной структуры), а максимальный структурирующий эффект достигается добавлением ТХА, при этом наводится вторичная структура, близкая к нативной ([6]г22 —13600 град см2 / дМ; - 95% нативной вторичной структуры).

Возник вопрос: являются ли различные анион-индуцированные конформа-ции данного белка отдельными конформационными состояниями?'Для ответа на этот вопрос были проведены эксперименты по равновесному разворачиванию стафилококковой нуклеазы в различных анион-индуцированных формах. Оказалось, что индуцированное мочевиной равновесное разворачивание наименее структурированного состояния представляет собой слабо кооперативный переход. Разворачивание же более структурированного конформера нуклеазы представляет собой суперпозицию по крайней мере двух простых сигмоидальных переходов. Как уже неоднократно подчеркивалось, наличие двух конформационных переходов свидетельствует о существовании по крайней мере трех различных состояний, разделенных этими переходами. Иными словами, оказалось, что в данном случае существует равновесный интермедиат разворачивания, который по своим структурным характеристикам весьма близок к менее структурированной форме. Таким образом, из всего сказанного выше следует, что увеличение концентрации анионов в растворе развернутой кислотой стафилококковой нуклеазы приводит к формированию различных конформеров этого белка. Наименее структурированное состояние вероятнее всего является состоянием-предшественником расплав-леной глобулы, тогда как наиболее структурированное - расплавленной глобулой.

На Рисунке 14 приведены результаты исследований структурных свойств различных конформационных состояний, индуцированных в стафилококковой нуклеазе разными анионами. Измерения проводили при следующих экспериментальных условиях: рН 7.5 (нативное состояние); рН 2.5, низкая ионная сила (развернутое кислотой состояние); рН 2.5, 0.9М КС1 (состояние-предшественник расплавленной глобулы); рН 2.5, 50 мМ ТХА (расплавленная глобула). Рисунок 14а показывает, что ни одна из исследованных А-форм стафилококковой нуклеазы не имела уникальной пространственной структуры. Действительно, белковая молекула имеет выраженный спектр КД в ароматической области только при нейтральных рН. Иными словами, увеличение концентрации анионов при рН 2.5 не приводит к восстановлению уникальной пространственной структуры в развернутой кислотой нуклеазе.

С другой стороны, как это уже обсуждалось выше, добавление сравнительно небольших концентраций анионов к раствору рН-развернутой нуклеазы приводит к заметному восстановлению вторичной структуры белка. Этот факт прямо

250 260 270 280 290 300 310 320 Длина волны (нм)

190 200 210 220 230 240 250 Длина волны (нм)

300 320 340 360 380 400 400 450 500 550 600 Длина волны (нм) Длина волны (нм)

0.0000 0.0025 0.0050 0.0075 0.0100 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 QiCtasinO/X^tA-1) Q( = 4lísme/K)(A"1)

Рисунох 14. Структурные свойства стафилококковой нуклеазы в различных конформацион-ных состояниях (развернутом кислотой состоянии -1; состоянии-предшественнике расплавленной глобулы - 2; состоянии расплавленной глобулы - 3; нативном состоянии - 4). А - спектры кругового дихроизма в ближней УФ области; Б - спектры кругового дихроизма в дальней УФ области; В - спектры собственной флуоресценции белка;

Г - спектры флуоресценции гидрофобного флуоресцирующего зонда АНС; Д -графики Гинье, построенные по данным малоуглового рассеяния рентгеновских лучей; Е - графики Кратки, построенные по данным малоуглового рассеяния рентгеновских лучей.

следует из спектров КД в дальней УФ области, измеренных при разных экспериментальных условиях и представленных на Рисунке 146.

Спектры флуоресценции нуклеазы в различных конформационных состояниях приведены на Рисунке 14в. Видно, что нативный белок имеет наиболее ко-

ротковолновый спектр флуоресценции (337 нм). В полностью развернутом состоянии максимум спектра сдвигается в длинноволновую область и расположен на 350 нм. При всех остальных экспериментальных условиях спектр располагается между этими двумя значениями, свидетельствуя в пользу того, что окружение триптофанового остатка в различных А-формах нуклеазы является более гидрофобным, чем в полностью развернутом состоянии. Иными словами, анион-инду-цированные конформации нуклеазы обладают некоторой степенью компактности.

Как уже неоднократно говорилось выше, существенная информация о структурной организации белковой молекулы в различных конформационных состояниях может быть получена из анализа ее взаимодействия с гидрофобными флуоресцирующими зондами. Результаты таких исследований для нуклеазы приведены на Рисунке 14г. Как следует из рисунка, ни нативная, ни развернутая кислотой нуклеаза не взаимодействует с 8-АНС - интенсивность флуоресценции АНС в этих условиях мало отличается от спектра свободного зонда. Формирование же анион-индуцированных конформаций приводит к существенному изменению как формы, так и интенсивности спектра, что свидетельствует о взаимодействии белковой молекулы с АНС. Видно также, что расплавленная глобула обладает большим сродством к АНС по сравнению с ее предшественником.

Известно, что прямую информацию о компактности белковой молекулы в различных конформационных состояниях можно получить из анализа данных по мало-угловому рентгеновскому рассеянию белковых растворов (Glatter & Rratky, 1982; Feigin & Svergun, 1987). С этой целью используют метод анализа данных по рассеянию, предложенный Гинье. Результаты такого анализа для стафилококковой нуклеазы приведены на Рисунке 14д, который показывает, что во всех изученных условиях существует линейная область Гинье при небольших углах рассеяния. Наклон линейной части зависимости пропорционален радиусу инерции (R„) рассеивающей молекулы. Величины радиуса инерции оказались равными: 19.7+0.2 А для нативного состояния; 22.5±0.9 А - для расплавленной глобулы; 29.2+ 1.9 А - для ее предшественника и 37.2±0.6 А для кислотой развернутого состояния нуклеазы.

Анализ данных по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей позволяет также оценить степень глобулярности белковой молекулы. Кривая рассеяния в координатах Кратки имеет характерный максимум в том случае, если рассеивающая рентгеновские лучи белковая молекула находится в нативном состоянии или состоянии расплавленной глобулы (т.е. имеет глобулярную структуру). Если же белковая молекула находится в полностью развернутом состоянии (не имеет глобулярной структуры), то ее кривая рассеяния не будет содержать такого максимума (Eliezer et al., 1993; Kataoka et al., 1993; Semisotnov et al., 1996). На Рисунке 14e приведены графики Кратки для нуклеазы в различных конформационных состояниях. Рисунок ясно показывает, что молекула стафилококковой нуклеазы имеет глобулярную структуру в нативном состоянии и состоянии расплавленной глобу-

лы (на соответствующих кривых присутствует характерный максимум) и не обладает глобулярной структурой в развернутом кислотой состоянии и в состоянии-предшественнике расплавленной глобулы. Это очень важное наблюдение, свидетельствующее в пользу того, что предшественник расплавленной глобулы относится к принципиально новому классу частично свернутых состояний, - белковая молекула в таком состоянии, не будучи глобулярной, частично компактизована и имеет выраженную вторичную структуру.

рН-индуцируемое сворачивание статистического сополимера гидрофобных и гидрофильных аминокислот сопровождается формированием интермедиата со свойствами состояния-предшественника расплавленной глобулы

В данном разделе диссертации рассмотрено поведение высокомолекулярного синтетического сополимера (-380 аминокислотных остатков), состоящего из остатков глютаминовой кислоты (82.5 %), .лейцина (16%) и триптофана (1.5%), в условиях, вызывающих его компактизацию или разворачивание. Ранее было установлено, что случайные полипептиды, имеющие в своем составе ~83% гидрофильных и -17% гидрофобных аминокислотных остатков, способны трансформироваться в глобулярное состояние при понижении рН раствора. Мы показали, что индуцированное понижением рН изменение структуры случайного сополимера гидрофобных и гидрофильных аминокислотных остатков является двустадийным процессом и сопровождается формированием промежуточного состояния, структурные свойства которого близки к свойствам белковой молекулы в состоянии-предшественнике расплавленной глобулы.

Структурные свойства полипептидной цепочки в состоянии-предшественнике рапславленной глобулы

На основании полученных в данной диссертации результатов можно сделать вывод, что для белковой молекулы в состоянии-предшественнике расплавленной глобулы характерны следующие структурные свойства:

1) отсутствие уникальной пространственной структуры;

2) сравнительно низкое сродство к гидрофобному флуоресцирующему зонду АНС (в 4-5 раз ниже, чем у состояния расплавленной глобулы);

3) низкая степень защищенности триптофановых остатков от взаимодействия с молекулами растворителя и/или тушителя;

4) наличие значительной части упорядоченной вторичной структуры (-50% от нативного значения);

5) заметная степень компактности, которая, однако, существенно меньше, чем наблюдаемая для расплавленной глобулы, - линейные размеры полипептидной цепочки в состоянии-предшественнике превышают соответствующие значения нативной глобулярной молекулы в 4 раза, аналогичное отношение для состояния расплавленной глобулы равно 1.15-1.2, а для полностью развернутого состояния >2:

6) отсутствие плотно упакованного ядра (отсутствие специфической глобулярной структуры); -7) наличие конформационных переходов, отделяющих это состояние как от расплавленной глобулы, так и от полностью развернутого состояния. Особо следует отметить тот факт, что расплавленная глобула и ее предшественник разделены переходом типа все-или-ничего (внутримолекулярным аналогом фазового перехода первого рода), тогда как переход из предшественника расплавленной глобулы в клубок, по-видимому, не является фазовым переходом первого рода.

Анализ приведенных свойств позволяет предположить, что белковая молекула в состоянии-предшественнике расплавленной глобулы может обладать и некоторыми (пусть даже и сильно флуктуирующими) зачатками нативной топологии. Действительно, белковая молекула в данном состоянии частично компакти-зована и обладает достаточно развитой вторичной структурой. Можно предположить, что частичная конденсация полипептидной цепи при ее переходе в состояние-предшественник расплавленной глобулы будет сопровождаться возникновением дополнительных ограничений в локализации элементов флуктуирующей вторичной структуры. При этом можно ожидать появления даже некоторых ограничений взаимного расположения таких флуктуирующих элементов в пространстве.

ГЛАВА VI. ВЛИЯНИЕ ОЛИГОМЕРИЗАЦИИ НА СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА ДЕНАТУРИРОВАННЫХ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ

Ассоциация денатурированных белковых молекул, как структурирующий

фактор

Известно, что склонность к ассоциации является одной из характеристик ненативной белковой молекулы (Tanford, 1968; London et al., 1974). Что касается промежуточных состояний, индуцированных в глобулярных белках анионами, то было установлено, что их склонность к ассоциации возрастает с уменьшением содержания упорядоченной структуры таким образом, что наименее структурированные состояния существуют в мономерной форме только в очень разбавленных растворах (Fink, 1995а, б). С другой стороны известно, что ассоциация белков представляет собой существенную проблему в биомедицине и биотехнологии.

Действительно, ассоциация специфических белков является причиной появления таких болезней, как синдром Дауна, болезнь Альцхеймера, злокачественная мие-пома, катаракты и многих других, включая так называемые прионные болезни. Формирование телец включения (специфических белковых преципитатов) является главной проблемой получения рекомбинантных белков, а производство и доставка белковых лекарств также зачастую осложнены ассоциацией. Известно, что ренатурация белков также может сопровождаться ассоциацией интермедиатов сворачивания. В данном разделе диссертации приведены результаты исследования влияния ассоциации на индуцированное анионами сворачивание стафилококковой нуклеазы, предварительно развернутой понижением рН.

На Рисунке 15 приведены зависимости эллиптичности поглощения на длине волны 222 нм от десятичного логарифма концентрации соли, измеренные для развернутой кислотой нуклеазы в широком диапазоне концентраций различных анионов (хлорид, сульфат, ТФА и ТХА) при низкой концентрации белка. Рисунок

показывает, что процесс ренатурации, индуцируемый в развернутой полипептидной цепочке такими анионами, как хлорид, сульфат и трифторо-ацетат имеет стадийный характер: первый переход завершается при умеренных концентрациях солей, тогда как дальнейшее увеличение содержания анионов в растворе приводит к возникновению дополнительных конформационных перестроек в белковой молекуле. Из Рисунка 15 видно, что структуры, наблюдаемые в конце второго перехода, являются различными для разных анионов: В случае ТФА белковая молекула имеет вторичную структуру, близкую к нативной, тогда как в присутствии больших концентраций хлорида или сульфата - -70% нативной вторичной структуры.

Поскольку дальнейшее увеличение содержания анионов в растворе приводило к преципитации белка, мы предположили, что второй структурный переход, индуцируемый высокими концентрациями солей, связан с ассоциацией белковых молекул. Данное предположение было подтверждено результатами исследований по влиянию концентрации белка на индуцированное анионами восстановление

1^[анион]

Рисунок 15. Зависимость эллиптичности поглощения на длине волны 222 нм от десятичного логарифма концентрации соли, измеренная для развернутой кислотой нуклеазы в широком диапазоне концентраций различных анионов (хлорид, сульфат, ТФА и ТХА) при низкой концентрации белка.

Концентрация №2504 (М) Концентрация ТФА (М)

Рисунок 16. Влияние концентрации белка на индуцированное анионами восстановление вторичной структуры в рН-развернутой нуклеазе: (А) - сульфат-индуцируемое сворачивание, (Б) - ТФА-индуцируемое сворачивание.

вторичной структуры в рН-развернутой нуклеазе. Результаты этих исследований суммированы на Рисунке 16 и они четко показывают, что структурирующий эффект больших концентраций сульфата (Рисунок 16а) или ТФА (Рисунок 166) существенно зависит от концентрации белка. Действительно, при небольших концентрациях белка (<0.2 мг/мл) возрастание содержания БОц2" в растворе индуцирует два структурных перехода. При больших концентрациях белка (0.38 мг/мл) наблюдается три последовательных перехода (см Рисунок 16а). Рисунок 16а также показывает, что первый переход, будучи наиболее кооперативным, не зависит от концентрации белка, тогда как параметры второго и третьего перехода существенно изменяются - при возрастании белковой концентрации переходы делаются более кооперативными и смещаются в область меньших концентраций аниона. При больших концентрациях белка (>0.5 мг/мл) первый и второй переходы полностью перекрываются в силу существенной концентрационной зависимости второго перехода, и, как следствие, в этих условиях наблюдаюся два, а не три перехода (см. Рисунок 16а).

Из представленных выше результатов можно заключить, что первый индуцируемый сульфатом (хлоридом) переход описывает внутримолекулярный процесс, тогда как второй и третий переходы, возможно, описывают контролируемые ассоциацией структурные превращения, т.е., вероятнее всего, являются меж-

молекулярными процессами; Было также установлено, что первый и третий переходы являются полностью обратимыми, тогда как второй переход - необратим. Это позволяет предположить, что в присутствии сульфата (хлорида) при низком значении рН раствора существуют две разные формы олигомеров. На первом этапе ассоциации (второй структурный переход) возникают высоко стабильные первичные ассоциаты, которые на последующих шагах (третий структурный переход) используются как строительные блоки для формирования олигомеров более высокого порядка. Если же предположить, что первичные ассоциаты гораздо более стабильны, чем формирующиеся из них мультимеры, то становится понятной необратимость второго перехода (формирование первичных ассоциатов) и полная обратимость третьего перехода (формирование мультимеров).

Рисунок 166 показывает, что второй структурный переход, индуцируемый в нуклеазе добавлением ТФА, также смещается в сторону меньших концентраций аниона при увеличении концентрации белка. При больших концентрациях белка первый и второй переходы полностью перекрываются и наблюдается единый образный переход. Интересно, что в случае ТФА оба структурных перехода были полностью обратимыми.

Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что структурные свойства развернутой кислотой нуклеазы изменяются не только в процессе анион-индуцируемого сворачивания, но и зависят также от ассоциации белковых молекул. Данное предположение было подтверждено экспериментами по исследованию зависимости содержания вторичной структуры в молекуле нуклеазы от концентрации белка при фиксированных концентрациях анионов.

Степень ассоциации нуклеазы в различных экспериментальных условиях определялась с помощью высокоэффективной гель-фильтрации и малоуглового рассеяния рентгеновских лучей. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что молекулы стафилококковой нуклеазы преимущественно мономерны в условиях, стабилизирующих все три индуцированных анионами интермедиата (при низкой концентрации белка), нативное и развернутое кислотой состояния. Возрастание концентрации белка при умеренных концентрациях сульфата (0.25 М) или хлорида (0.9 М) приводит к появлению димеров. Увеличение же концентрации этих анионов при высоком содержании белка приводит к формированию ассоциатов более высокого порядка (октамеров и выше). В случае же ТФА возрастание концентрации белка и/или аниона сразу приводит к возникновению ассоциатов высокого порядка.

Приведенные выше результаты позволяют предположить следующие пути индуцированного анионами сворачивания нуклеазы, предварительно развернутой понижением рН, и ассоциации при различных экспериментальных условиях: (1) Увеличение содержания сульфата (хлорида) в условиях низкого рН и низкой концентрации белка приводит к переходу развернутой кислотой нуклеазы в мономерную форму А]. Дальнейшее возрастание концентрации анионов (или увеличение концентрации белка) приводит к формированию димеров -

(Л 1)2, - которые при больших концентрациях белка и анионов ассоциируют сначала в растворимые мультимеры - [(А 1)2]", а затем - в преципитаты (П): Р-»А1-»(А1)2->[(А,)2]И-»П (схема I)

(2) В случае же использования ТФА в молекуле нуклеазы происходят следующие структурные изменения:

Р->А2->[А2Г->П (схема II)

А Б

Рисунок 17. Фазовые анаграммы для структурных изменений, происходящих в развернутой кислотой нуклеазе при возрастании концентрации белка и сульфата (А) или ТФА (Б).

Полученные данные могут быть использованы для построения фазовых диаграмм, приведенных на Рисунке 17. Границы между различными конформа-циями построены на основании величин концентрации аниона в середине перехода, полученных из соответствующих анион-индуцированных переходов при фиксированных концентрациях белка (кружки) или из соответствующих величин, определенных для переходов, индуцированных возрастающей концентрацией белка при фиксированных концентрациях анионов (квадратики). Из рисунка видно, что в обеих системах развернутые мономеры существуют в широком диапазоне концентраций белка. Частично свернутый мономер Ai возникает в разбавленных растворах белка при возрастании концентрации сульфата, тогда как частично свернутый мономер Аг существует в широком диапазоне концентраций белка и ТФА. Димеры (А 1)2, отличающиеся от мономеров Aj большим содержанием вторичной структуры, возникают при концентрациях белка > 0.3 мг/мл при увеличении концентрации сульфата больше 150 мМ. Растворимые мультимеры [(АОг]" или [Аг]" существуют в достаточно ограниченной области высоких концентраций белка и анионов. Заштрихованные участки на Рисунке 17 показывают области преципита-

ции нуклеазы. Анализ этих фазовых диаграмм приводит к очень интересному предположению о том, что мономерное состояние Аг и димерная форма (АО2, а также мономерное состояние Аз и мультимерные формы [(А^г]" и [Аг]м обладают существенной структурной близостью. Это предположение было подтверждено дальнейшими экспериментами.

Структурные свойства нуклеазы в различных формах, индуцированных олигомеризацией

В условиях, индуцирующих различную степень ассоциации белковой молекулы были изучены такие структурные свойства нуклеазы как содержание вторичной структуры, относительная компактность, возможность взаимодействия с гидрофобным флуоресцирующим зондом и степень глобулярности молекулы белка. Результаты таких исследований приведены на Рисунке 18.

На Рисунке 18а приведены спектры кругового дихроизма нуклеазы в дальней УФ области, измеренные при различных условиях среды. Спектры КД, полученные для мономерных анион-индуцированных форм (А1 - рН 2.5, 0.25 М ^504; А2 - рН 2.5, 0.27 М ТФА; А3 - рН 2.5, 50 мМ ТХА), нативной (рН 7.5) и рН-развернутой нуклеазы (рН 2.5, низкая ионная сила), отражают тот факт, что разные анионы индуцируют различное содержание упорядоченной вторичной структуры в молекуле белка. Интересно отметить, что одинаковые изменения спектральных характеристик можно получить, либо добавляя 0.27 М ТФА к раствору рН-развернутой нуклеазы (т.е. стабилизируя мономерную форму Аг), либо провоцируя димеризацию интермедиата А1 (сравни кривые 3 и 6). Сравнение кривых 4, 7 и 8 на Рисунке 18а свидетельствует в пользу того, что как эллиптичность поглощения на длине волны 222 нм [Э]г22. так и форма спектров весьма близки для мономерного состояния Аз (рН 2.5, 50 мМ ТХА) и ассоциированных форм [(АОгГ и [Аг]м- Эти данные позволяют заключить, что структурирующий эффект самоассоциации частично свернутых форм молекул белка достаточно близок к таковому, индуцированному в рН-развернутой нуклеазе добавлением различных анионов. Данное наблюдение получило дальнейшее подтверждение при исследот вании других структурных свойств нуклеазы.

Анализ Рисунка 186 показывает, что характерный синий сдвиг спектра триптофановой флуоресценции, отражающий степень компактизации белковой молекулы, делается более выраженным в соответствии со следующей последовательностью: Р (низкая ионная сила)<А1(0.25 М Ка^О^А^О.г? М ТФА)а(А|)2(1.5 М Ыа^О.,, Сбелка=0.2 мг/мл) <А3(50 мМ ТХА) * [(А))2]"(1-5 М Ка^О«,, С6елка=1.2 мг/мл) *[А2]м(0.8 М ТФА, Сбслка=0.6 мг/мл) « Н (рН 7.5).

Рисунок 18в отражает тот факт, что наибольшим сродством к гидрофобному флуоресцирующему зонду АНС обладают ассоциированные формы [(А^Г и [Аг]м. Относительно низкие значения интенсивности флуоресценции АНС, на-

Длина волны {нм) Длина волны (нм)

Рисунок 18. Структурные свойства стафилококковой нуклеазы при условиях среды, стабилизирующих различные мономерные и ассоциированные формы белка. Кривые 1-5 измерены для мономерных форм нуклеазы при концентрации белка 0.25 мг/мл: 1 - рН 2.5, низкая ионная сила (развернутое состояние); 2 - рН 2.5, 0.9 М КС1 (форма А|); J - рН 2.5, 0.27 М ТФА (форма А2); 4 - рН 2.5, 50 мМ ТСА (форма А3); J - рН 7.5 (нативное состояние). Спектры 6-8 соотвествуют олигомерным формам нуклеазы: 6 - рН 2.5, 200 мМ Na^SO^, концентрация белка 0.5 мг/мл (форма (А|)2); 7 - рН 2.5, 500 мМ Na2S04, концентрация белка 2.5 мг/мл (форма [(А|)2]"); 8 - рН 2.5, 500 мМ ТФА, концентрация белка 2.0 мг/мл (форма [А2]"). А - Спектры КД в дальней УФ области; Б - Спектры триптофановой флуоресценции белка; В - Спектры флуоресценции АНС;

Г - Графики Кратки, построенные по результатам малоуглового рассеяния рентгеновских лучей.

блюдаемые в комплексе этого зонда с мономерной Аз-формой нуклеазы объясняются существенным тушащим эффектом трихлорацетата. Введение соответствующей поправки приводит к существенному увеличению этого параметра (1днс~

115). Рисунок 18в показывает также, что сродство АНС ко всем другим структурным формам нуклеазы существенно ниже. Однако необходимо подчеркнуть, что комплексы АНС-А2 и AHC-(Ai)2, формируемые зондом с мономерной и димерной частично-свернутыми формами белка, обладают весьма близкими спектральными характеристиками. '

Данные по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей (Рисунок 18г) свидетельствует о наличии глобулярной структуры у молекулы нуклеазы в нашивном состоянии и двух более структурированных мономерных формах А2 и Аз, тогда как наименее структурированная форма А/ и полностью развернутое состояние Р не имеют глобулярной структуры. Из Рисунка 18г видно, что рассеяние рентгеновских лучей от димерной формы (АОг похоже на рассеяние от мономерной формы А2, а рассеяние от мультимерных форм [А2]4 и [(Ai)2]m характеризуется примерно такими же параметрами, что и рассеяние от мономерной формы Аз. Здесь необходимо подчеркнуть, что наблюдаемое изменение формы графиков Кратки (в частности, появление характерного максимума при формировании ди-меров (А 1)2) не может быть отнесено к формированию только межмолекулярной структуры, индуцированной ассоциацией. Действительно, межмолекулярная ассоциация белковых молекул обычно приводит к формированию межмолекулярной ß-структуры. С другой стороны известно, что график Кратки, полученный для полилизина в ß-структурной конформации, не содержит характерного максимума (Semisotnov et al., 1996). Поскольку ß-структурная конформация полилизина формируется преимущественно благодаря межмолекулярным взаимодействиям (Adler et al., 1973), то полипептидная молекула в этой конформации не имеет глобулярной структуры. Таким образом, если бы при димеризации А]-формы имело место только формирование межмолекулярной вторичной структуры, то это не приводило бы к появлению характерного максимума на зависимости Кратки. Следова-• тельно, формирование димерной формы (Ai)2 приводит не только к возникновению межмолекулярной структуры, но также, по-видимому, и к образованию некого нового структурного уровня внутри белковой молекулы.

Приведенные выше данные свидетельствуют в пользу того, что при изменении условий среды в молекуле нуклеазы, вероятно, возникают некие структурные элементы, которые стабилизируются только в том случае, если взаимодействуют с другими элементами структуры белка. При некоторых условиях (низкие концентрации бежа и умеренные концентрации ТФА) эти структурные блоки могут взаимодействовать с собственной белковой молекулой и тогда наблюдается формирование мономерного состояния А2. Однако, при иных условиях среды (в присутствии сульфата или хлорида) эти сегменты преимущественно взаимодействуют с соседаей молекулой белка, замещая в последней собственные элементы и формируя "нативные" контакты. При этом возникает димерная форма (Ai)2. Описанные выше механизмы схематически представлены на Рисунке 19. Видно, что структурные элементы - квадратики - могут иметь "нативное" положение внутри

одной молекулы, но также могут формировать аналогичные контакты и с соседней молекулуй белка. Поскольку были также получены данные, свидетельствующие о высоких константах ассоциации при формировании димерной формы белка, то можно заключить, что такая схема, предсказывающая существование специфической димеризации, является верной.

Интересно, что процесс специфической димеризации молекул стафилококковой нуклеазы был описан ранее (Green et al., 1995). Было установлено, что укорочение поверхностной петли, связывающей С-концевую спираль с остальной частью этого белка, на 6 аминокислотных остатков (Д114-119) переводит этот мо-

Рисунок 19. Схематическое представление процессов формирования мономерного состояния А2 и димерной формы (А 1)2 стафилококковой нуклеазы. На схеме приведена предполагаемая картина сворачивания двух молекул белка. Сворачивание развернутой кислотой нуклеазы (Р) начинается с добавления к раствору белка умеренных концентраций анионов. В зависимости от природы добавляемого аниона (ТФА или Л^О,) в молекуле белка возникает большее или меньшее количество стабильных структурных элементов (элементов вторичной структуры), т.е. данная молекула трансформируется в одну из двух мономерных частичносвернутых форм (А, или А2). Структурные элементы первой молекулы представлены на схеме в виде белых квадратиков, тогда как структурные элементы второй молекулы обозначены заштрихованными квадратиками. В случае формы А] дальнейшее изменение условий среды (увеличение концентрации сульфата и/или белка) приводит к димеризации белковых молекул ((А 1)2) и сопровождается формированием дополнительных структурных элементов. При этом структурные элементы одной молекулы «встраиваются» в другую молекулу белка

номерный белок в очень стабильный димер (константа диссоциации < 10"8 М). Структура этого димера, решенная кристаллографически (с разрешением 2А), показала, что С-концевая спираль вынимается из нормального положения в одной

мономерной молекуле нуклеазы и встраивается в аналогичное положение второго (присоединенного) мономера (Green et al., 1995). Существование специфической димеризации частично-свернутых кинетических интермедиатов также обсуждалось в литературе для таких белков, как апомиоглобин (Eliezer et al, 1993), карбо-ангидраза В (Cleland & Wang, 1992), гормон роста коровы (Brems et al., 1988), ци-тохром с (неопубликованные данные лаборатории Финка) и ряда других белков (Mitraki & King, 1989). Было даже высказано предположение, что специфическая ассоциация (димеризация) является одним из этапов сворачивания белковой молекулы (Eliezer et al., 1993).

КОМПАКТНЫЕ ДЕНАТУРИРОВАННЫЕ СОСТОЯНИЯ БЕЛКОВ

IN VIVO

Хорошо известно, что белковая молекула, находящаяся в состоянии расплавленной глобулы, обладает вполне определенными структурными характеристиками, отличающими это состояние как от нативного, так и от полностью развернутого состояний белковой молекулы. Было бы достаточно странно, если бы уникальные свойства расплавленной глобулы (наличие компактной достаточно стабильной, но в тоже время очень подвижной структуры) не были бы использованы природой. В 1988 году была высказана гипотеза о том, что ненативные состояния белковой молекулы (в частности и расплавленная глобула) могут иметь существенное физиологическое значение (Bychkova et al., 1988). С физической точки зрения такая мысль не является абсурдной. Действительно, было показано, что расплавленная глобула является третьим термодинамическим состоянием белковой молекулы, отделенным от двух других термодинамических состояний (нативного и клубко-образного) переходами "все-или-ничего", являющимися внутримолекулярными аналогами фазового перехода первого рода. Очевидно, что наличие высокого потенциального барьера между расплавленной глобулой и клубком может защищать белковую молекулу от случайного разворачивания тепловыми флуктуациями при физиологических условиях. Возникает вполне резонный вопрос: откуда могут взяться в живой нормально функционирующей клетке денатурированные белки? Поскольку данная проблема была детально освещена в прекрасном обзоре Бычковой и Птицына (Bychkova & Ptitsyn, 1993), то здесь остановлюсь только на нескольких ключевых моментах. Кажется очевидным, что ответы на указанный вопрос может быть разбиты на две группы. Первая группа касается причин появления белковых молекул, которые еще не успели приобрести уникальную пространственную структуру. К данной группе можно отнести процесс сворачивания вновь синтезированной полипептидной цепи и некоторые мутации. Действительно, как известно, самоорганизация белковой молекулы протекает по стадийному механизму и сопровождается формированием нескольких ненативных промежуточных состояний. Легко представить, что в некоторых случаях скорость этого процесса

может быть несколько медленнее скорости биосинтеза белка, что и будет приводить к появлению денатурированных белковых молекул (кинетических интерме-диатов) в клетке. Понятно также, что некоторые аминокислотные замены (мутации), в принципе, могут приводить к "замораживанию" сворачивания на той или иной стадии, и, как следствие, к появлению ненативных белков. Вторая группа относится к причинам, вызывающим денатурацию белковых молекул, которые изначально были нативными, т.е. имели жесткую третичную структуру. Наиболее тривиальным примером такого рода являются процессы, связанные с нарушениями нормальной жизнедеятельности клетки - например, шоки различной природы и т.д. Однако, гораздо более интересными представляются механизмы, приводящие к денатурации изначально нативных молекул белка и связанные с функционированием последних. К механизмам такого рода можно отнести взаимодействие белков с мембранами и удаление из белков гидрофобных лигандов.

ГЛАВА VII. ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ, КАК СЛЕДСТВИЕ ИЗМЕНЕНИЯ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ.

ТОЧЕЧНЫЕ МУТАЦИИ. ЦИРКУЛЯРНАЯ ПЕРМУТАЦИЯ.

ИСКУССТВЕННЫЕ БЕЛКИ

В данной главе диссертации приведены результаты по исследованию структурных свойств объектов, полученных с помощью белковой инженерии: му-тантных форм, несущих одну или несколько точечных замен; белка с циркулярно пермутированной последовательностью и искусственных белков.

Влияние точечных аминокислотных замен на стабильность лизоцима фага Т4. Переход белковой молекулы в состояние расплавленной глобулы при тройной замене AsplO—>His, Asnl01—>Asp, Argl48—>Ser

Проведено сравнительное исследование структурных свойств лизоцима фага Т4 и его мутантной формы, содержащей тройную замену AsplO/His, AsnlOl/Asp, Argl48/Ser. Установлено, что белок дикого типа сохраняет нативную структуру в широком диапазоне рН раствора. Мутантный белок существует в растворимой форме только при низких значаниях рН. При этом, рН 2.7 тройной мутант находится в состоянии, которое обладает основными свойствами расплавленной глобулы. Действительно, в этих условиях спектр круговом дихроизма (КД) в ближней УФ области для мутантного лизоцима Т4 существенно менее выражен, чем спектр белка дикого типа и близок к спектру полностью развернутого белка. Это позволяет говорить о том, что мутантный белок при низких рН раствора денутурирован. В то же время спектр КД в дальней УФ области свидетельствует о том, что тройной мутант обладает существенной вторичной структурой. Анализ спектров триптофановой флуоресценции показывает, что молекула мутантного белка в существенной степени компактна. И, наконец, мутантный белок в от-

личие от белка дикого типа способен связывать гидрофобный флуоресцирующий зонд 8-анилинонафталено-сульфонат (АНС).

Дигидрофолатредуктаза с циркулярно пермутированной аминйкислотной последовательностью обладает свойствами расплавленной глобулы, но при взаимодействии с лигандами восстанавливает функциональную третичную

структуру

Циркулярная пермутация аминокислотной последовательности белковой молекулы (процесс, в результате которого старые К- и С-концы белковой молекулы перешиваются, а новые И- и С-концы получаются разрезанием одной из поверхностных петель), безусловно, представляет собой одну из наиболее радикальных мутагенетических перестроек молекулы белка.

Используя такие структурные методы, как КД, 'Н-ЯМР, дифференциальная сканирующая микрокалориметрия, гель-фильтрация и флуоресцентный анализ показано, что в отсутствии природных лигандов (НАДФ и ДГФ) или структурных аналогов ДГФ (МТК и ТМП) две пермутированные формы дигидрофолатредукта-зы из Е.соИ обладают свойствами расплавленной глобулы. С другой стороны, взаимодействие пермутантов с субстратами сопровождается существенными изменениями структуры белковой молекулы, вплоть до частичного восстановления жесткой третичной структуры.

Полученные данные являются первым экспериментальным подтверждением гипотезы о том, что генетические заболевания, являющиеся следствием остановки сворачивания мутантной белковой молекулы на стадии формирования расплавленной глобулы, можно лечить не путем воздействия на измененный участок гена (что кажется сложным и маловероятным), а путем "лечения" ненативных белков, используя специально разработанные лекарства (ВусЫсоуа & РШэуп, 1995). Действительно, мы показали, что в результате наиболее радикального му-тагенетического вмешательства - циркулярной пермутации аминокислотной последовательности - был получен "больной" белок, чье сворачивание остановилось на стадии формирования расплавленной глобулы. С другой стороны, добавление лигандов привело к завершению процесса сворачивания и возникновению активных белковых молекул с нативоподобными структурными свойствами. Другими словами, представленные данные позволяют заключить, что "больные" пермутированные формы дигидрофолатредуктазы могут быть "вылечены" путем добавления лигандов - "лекарств".

Искусственные белки альбебетин и альбебетин с фрагментом интерферона находятся в состоянии расплавленной глобулы

Знания, накопленные при исследовании структурных свойств белков, широко используются в белковой инженерии. С другой стороны, сама белковая инженерия позволяет получать новые данные, вносящие существенный (а порой,

просто незаменимый) вклад в понимание структурной организации белковой молекулы и связи между ее структурой и функцией. Использование белковой инженерии, в принципе, позволяет на практике, проверять правильность нашего понимания принципов структурной организации белковой молекулы. Благодаря данному подходу исследователь имеет реальную возможность перейти от позиции стороннего созерцания (т.е. исследования природных объектов) к активной позиции творца (т.е. создания совершенно новых, ранее не существовавших в природе белковых конструкций - искусственных белков - с заданными свойствами).

В данной части диссертации приводятся результаты исследования структурных свойств искусственных белков альбебетина и альбебетина с фрагментом интерферона (искусственного белка с биологической активностью). В работе использованы такие методы, как спектры КД в ближней и дальней УФ областях, гель-фильтрация и индуцированное мочевиной разворачивание. Показано, что оба искусственных белка обладают выраженной вторичной структурой и достаточной степенью компактности, но не имеют жесткой третичной структуры. Следовательно, данные белки de novo находятся в состоянии расплавленной глобулу. Данное заключение находится в хорошем соответствии с существующим убеждением, что большинство искусственных белков (если не все изученные к настоящему моменту белки de novo!) обладают структурными характеристиками, присущими природным белкам в их состоянии расплавленной глобулы.

Это означает, что в нашем понимании структурных принципов организации белковых молекул отсутствует какая-то, возможно очень существенная, деталь. В то же время данные, полученные для альбеферона, могут свидетельствовать в пользу того, что присоединение октапептида к искусственному белку слегка улучшает укладку его аминокислотной последовательности. Действительно, по сравнению с исходным искусственным альбебетином, модифицированный белок делается несколько более компактным, обладает более высокой устойчивостью к разворачиванию мочевиной и показывает наличие некоторой ассиметрии в окружении тирозинового остатка. Нельзя исключить тот факт, что это наблюдение может быть использовано для улучшения дизайна искусственных белков. Тем более, что примерно такой же эффект описан для природных белков - показано, что удаление короткого (тринадцатичленного) пептида с С-конца стафилококковой нуклеазы переводит этот белок в состояние расплавленной глобулы (Shortle & Meeker, 1989).

ГЛАВА VIII. МОЖЕТ ЛИ УМЕНЬШЕНИЕ ДИЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ СРЕДЫ ВЫЗЫВАТЬ ПЕРЕХОД БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ В СОСТОЯНИЕ РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ?

Известно, что некоторые белки, будучи изначально нативными, теряют жесткую третичную структуру при взаимодействии с мембранами. Это верно для

всевозможных токсинов претерпевающих переход в состояние типа расплавленной глобулы перед внедрением в мембрану, и ряда транспортных белков, которые денатурируют при отдаче лигандов клеткам-мишеням. Это означает, что мембрана может быть рассмотрена как один из денатурирующих факторов живой клетки. В подтверждение этого предположения было установлено, что взаимодействие белков с мембраной может приводить к частичной денатурации белков в силу существования отрицательных зарядов на мембранной поверхности (Endo & Schatz, 1988). В качестве движущей силы такой денатурации был назван тот факт, что существенный отрицательный электростатический потенциал мембранной поверхности может вызывать притяжение протонов из раствора, приводя к заметному локальному понижению рН на поверхности мембраны и формированию выраженного градиента рН в ближайшем ее окружении (Eisenberg et al., 1979; Prats et al., 1986). Было даже установлено, что в бессолевых растворах это локальное понижение рН не превосходит двух единиц рН (Prats et al., 1986). Очевидно, что такое "подкисление" среды является недостаточным для рН-индуцированной денатурации большинства глобулярных белков и поэтому не может быть рассмотрено в качестве единственного денатурирующего фактора белковой поверхности. С другой стороны из классической электродинами известно, что эффективная диэлектрическая проницаемость (г) воды на границе раздела фаз вода - гидрофобная среда существенно ниже, чем е в удаленных от границы областях растворителя (Ландау и Лифшиц, 1982). Бьио предположено, что такое локальное понижение диэлектрической проницаемости среды около мембранной поверхности может быть рассмотрено, как дополнительный денатурирующий фактор поверхности мембраны (Bychkova & Ptitsyn, 1993; Ptitsyn, 1995; Ptitsyn et al., 1995). В качестве модельных систем для исследования концертного действия локального понижения рН и диэлектрической проницаемости около мембранной поверхности на структуру белков были предложены водно-спиртовые смеси при умеренно низких значения рН раствора (Ptitsyn et al., 1995; Bychkova et al., 1996). Данная гипотеза была отчасти подтверждена открытием того, что при умеренно низких значения рН увеличение концентрации метанола трансформирует молекулу цитохрома с в состояние расплавленной глобулы (Bychkova et al., 1996; Kamatari et al., 1996). Однако один вопрос все еще оставался открытым - а что если денатурация белка является не следствием понижения диэлектрической проницаемости среды, а обусловлена специфическим взаимодействием молекул спирта с полипептидной цепочкой белковой молекулы?

Для ответа на этот вопрос было проведено исследование влияния органических растворителей различных классов на структурные свойства коровьего р-лактоглобулина. С этой целью сравнивали эффект увеличения концентрации спиртов с различной длиной алифатической части (метанол, этанол и изопропа-нол) на спектры. КД белка в ближней и дальней УФ областях, спектры собственной флуоресценции и времена затухания флуоресценции 8-АНС с влиянием ами-

дов (диметилформамид) и циклических эфиров (диоксан) на эти же структурные характеристики р-лактоглобулина.

В качестве примера на Рисунке 20 приведены результаты мультипараметрического исследования влияния увеличивающейся концентрации метанола на структурные свойства Р-лактоглобулина. Аналогичные результаты были получены и при рассмотрении других органических растворителей. Полученные данные свидетельствуют о том, что при увеличении концентрации органических растворителей имеют место два структурных перехода. Очевидно, что при наличии двух разнесенных структурных переходов можно ожидать существования по крайней мере трех конформационных состояний, разделенных этими переходами. Первое из таких состояний -нативное состояние, наблюдающееся при низких концентрациях органических растворителей, характеризуется высокой степенью компактности и наличием жесткой третичной структуры. Второе состояние существует при высоких концентрациях органических растворителей и характеризуется отсутствием жесткой третичной структуры, высоким содержанием а-спиральной структуры и существенным увеличением гидродинамических размеров

Концентрация метанола (%)

Концентрация метанола (%)

Рисунок 20. А - Индуцированное метанолом изменение структурных свойств (3-лактоглобулина при рН 2.0 и 23°С: эллиптичность поглощения на 293.5 нм (открытые кружки), 285 нм (черные кружки), 263.5 нм (серые кружки), 222 нм (квадратики); интенсивность флуоресценции Трп остатков белка (перевернутые треугольники); положения максимума Трп флуоресценции (треугольники) и отношения [6]2о8/[0]222 (ромбики).

Б - Зависимости относительного числа молекул Р-лактоглобулина, находящихся в нативном (Н), промежуточном (И) и спиральном (С) состояниях от концентрации метанола. Кривые получены из двух основных кривых структурных переходов: кривой денатурации (/¿, = 1 -/„), измеренной по изменению спектров КД в ближней УФ области и изменению величины [0]2о>/[6]г22, а также кривой формирования набухшего спирального состояния (£), полученной по изменению спектров КД в пептидной области и сдвигу максимума спектра флуоресценции. Долю молекул в промежуточном состоянии (/",) определяли из очевидного соотношения /„ = //, -

Концентрация органического растворителя (%) Диэлектрическая проницаемость среды

Рисунок 21. (А) Зависимость относительного числа молекул (З-лаюоглобулина, находящихся в состоянии расплавленной глобулы (/¡,), от концентрации различных органических растворителей: метанола (кружки), этанола (треугольники), изопропанола (перевернутые треугольники), ДМФ (квадратики) и диоксана (ромбики).

(Б) Зависимость относительного числа молекул. Р-лактоглобулина, находящихся в состоянии расплавленной глобулы (/„), от величины диэлектрической проницаемости среды, полученные для различных органических растворителей: метанола (кружки), этанола (треугольники), изопропанола (перевернутые треугольники), ДМФ (квадратики) и диоксана (ромбики).

белковой молекулы. Таким образом, есть все основания полагать, что при этих условиях наблюдается высоко спиральное некомпактное состояние (С), типичное для глобулярных белков в концентрированных растворах органических растворителей (Тапйзгс! ег а/., 1960; ТапСэгй,1968; Капрал е/ а/., 1996). Третьим состоянием является промежуточное денатурированное состояние (интермедиат, И) с выраженной вторичной структурой и высоким сродством к гидрофобному флуоресцирующему зонду АНС и высокой степенью компактности. Иными словами, имеются все основания предположить, что этим промежуточным состоянием является расплавленная глобула.

Процессы конформационных перестроек, индуцируемых в молекуле Р-лактоглобулина уменьшением полярности среды приведены на Рисунке 21а, как зависимости относительной популяции молекул белка, находящихся в промежуточном состоянии типа расплавленной глобулы (/"„) от концентрации органических растворителей. Необходимо отметить, что эти данные показывают, что промежуточное состояние может быть индуцировано в молекуле р-лактоглобулина органическими растворителями разных классов (не только спиртами, но и амидами и циклическими эфирами). Это означает, что в этих структурных структурных перестройках главную роль играет какое-то общее свойство растворителей, скажем, степень их гидрофобности. Иными словами, можно предположить, что дви-

жущей силой перехода белковой молекулы в промежуточное состояние является изменение степени гидрофобности растворителя. Действительно, как следует из Рисунка 21а, представляющего зависимость /„ от концентрации пяти органических растворителей - метанола, этанола, изопропанола, ДМФ и диоксана, - положение максимума сдвигается в сторону меньших концентраций органического растворителя по мере увеличения степени его гидрофобности, т.е. по мере уменьшения диэлектрической проницаемости среды.

При построении Рисунка 216 полученные результаты по влиянию различных органических растворителей на структурные свойства Р-лактоглобулина были пересчитаны, как зависимость /и от диэлектрической проницаемости среды. Данные, представленные на этом рисунке, показывают, что точка максимальной популяции промежуточного состояния типа расплавленной глобулы, будучи практически идентичной для всех исследованных растворителей, наблюдается при уменьшении величины диэлектрической среды до е~62. Это позволяет заключить, что уменьшение диэлектрической проницаемости растворителя может быть ответственно за переход молекулы р-лактоглобулина в состояние расплавленной глобулы. Следует отметить, что данное наблюдение является первым прямым доказательством гипотезы о денатурирующем воздействии понижения диэлектрической проницаемости среды, высказанной недавно в нашей лаборатории (ВусЫсоуа & РЙБуп, 1993; РШэуп е{ а!., 1995) для объяснения денатурации белков около мембранной поверхности. .

ГЛАВА IX. СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА ОНКО-ЭМБРИОНАЛЬНОГО БЕЛКА а-ФЕТОПРОТЕИНА. МОДЕЛИРОВАНИЕ КОНФОРМАЦИОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ФУНКЦИОНИРОВАНИЕМ БЕЛКА

Данная глава диссертационной работы посвящена исследованию онко-эмбрионального белка а-фетопротеина (АФП). Описано влияние условий среды на структурные свойства и конформационную стабильность АФП. Показана роль природных лигандов в стабильности данного белка. Приведены результаты сравнительного исследования физико-химических свойств АФП и гомологичного ему белка сывороточного альбумина (САЧ). Показано, что при понижении рН или в присутствии умеренных концентраций органических растворителей, а также при удалении природных лигандов молекула А ФП находится в состоянии растав-ленной глобулы. Рассматривается возможная функциональная роль таких конфор-мационных изменений молекулы данного белка.

а-Фетопротеин (АФП) - большой гликопротеин с молекулярной массой порядка 68 кДа, являющийся мажорным белком плазмы зародыша (НаШгесЬ & КНЬашИ, 1956). Концентрация АФП в плазме эмбриона и новорожденных млекопитающих велика (находится в диапазоне 1-10 мг/мл), однако она резко уменыпа-

ется вскоре после рождения (Halbrech & Klibanski, 1956). К концу второго месяца жизни ребенка в крови наблюдаются лишь следовые количества АФП - он практически полностью замещается сывороточным альбумином (Halbrech & Klibanski, 1956; Deutsch, 1991). Существенное увеличение содержания АФП в крови взрослых свидетельствует о развитии ряда онкоглогических заболеваний (Abelev 1971; Deutsch, 1991).

В дополнение к диагностической значимости АФП было установлено, что этот белок имеет ряд чрезвычайно важных биологических функций. Прежде всего здесь следует отметить транспортную роль этого белка. Установлено, что данный белок обладает высоким сродством к различным жирным кислотам и билирубину. Он также способен связывать ионы меди и никеля (Deutsch, 1991). Подчеркивается, что транспортная функция является важной, но далеко не единственной функцией АФП. Было показано, что данный белок принимает участие в регуляции клеточного размножения и метаболизма, может эффективно взаимодействовать с макрофагами и Т-лимфоцитами. Широко обсуждается также иммунорегуляторная роль АФП (Deutsch, 1991). В частности полагают, что данный белок принимает участие в подавлении иммунного ответа организма матери на развивающийся плод и ответа организма онкологического больного на развивающуюся раковую опухоль.

Суммируя, необходимо подчеркнуть, что АФП имеет существенное диагностическое значение, а исследование механизма его функционирования может оказаться важным для решения целого ряда молекулярно-биологических проблем. Не вызывает сомнений и тот факт, что понимание молекулярного механизм функционирования АФП (как, впрочем, и других белков) не возможно без детального исследования структурных свойств белка. Поскольку АФП является транспортным белком, взаимодействует с мембранными рецепторами и может находиться как в клетке, так и за ее пределами, можно предположить, что в ходе функционирования окружение этого белка (а как следствие и его структура) претерпевают существенные изменения. Однако механизм таких функционально важных кон-формационных перестроек остается до настоящего момента малоизученным. Данная часть диссертации имеет целью отчасти восполнить данный пробел.

Удаление природных лигандов приводит к трансформации белка в состояние расплавленной глобулы

Методами кругового дихроизма, флуоресценции вискозиметрии и сканирующей микрокалориметрии проведено сравнительное исследование структурных свойств и конформационной стабильности холо- и апо-форм АФП. Результаты этих исследований представлены в Таблице 3. Они не оставляют никаких сомнений, что удаление природных лигандов приводит к трансформации молекулы АФП в состояние расплавленной глобулы. Действительно, как следует из данных,

полученных с помощью сканирующей микрокалориметрии и спектров КД в ближней УФ области (см. Таблицу 3) безлигандная форма АФП не имеет жесткой третичной структуры. С другой стороны, в данном состоянии белковая молекула сохраняет вторичную структуру, близкую к нативной (Таблица 3). В заключение

Таблица 3

Структурные свойства а-фетопротеина человека в различных конформационных

состояниях

Конформационное состояние Пик теплопо-глощения град см2/дМ [9Ьо, град см'/дМ м. мл/г 14. А

Нативное + 55±3 15200±200 3.3±0.5 32.3 1.00

Безлигандная форма - ■ 35±3 14800±200 5.6±0.8 38.5 1.19

Развернутое - 30±3 ' 700±200 33.7±0.8 70.0 2.17

необходимо отметить, что безлигандная форма АФП практически столь же компактна, что и молекула нативного белка: радиус Стокса (Л5), рассчитанный для безлигандной формы АФП из данных по характеристической вязкости, превышает соответствующую величину для нативного белка в ~1.2 раза, что является характерным при переходе белковой молекулы в состояние расплавленной глобулы.

а-Фетопротеин человека находится в состоянии расплавленной глобулы в условиях, моделирующих окружение белка в поле мембраны

Выше уже говорилось, что в процессе своего функционирования молекула АФП взаимодействует с мембранными рецепторами и может находиться как в клетке, так и за ее пределами (т.е. какое-то время белок пребывает в поле мембраны). Как отмечалось в предыдущем разделе диссертации, влияние поля мембраны на структурные свойства белка может быть смоделировано водно-органическими смесями при умеренно низких значениях рН. Результаты исследования структурных свойств АФП в таких модельных условиях представлены в данном разделе диссертации.

С помощью мультипараметрического подхода было показано, что добавление умеренных концентраций спиртов при умеренно низких рН (рН 5.5) трансформирует молекулу АФП в компактное денатурированное состояние с выражен ной (и похожей на нативную) вторичной структурой, иными словами, в состояние расплавленной глобулы. Поскольку выше было показано, что переход в состояние расплавленной глобулы приводит к необратимому выходу лигандов из молекулы АФП, то вполне обоснованно можно предположить, что в описанных модельных условиях молекула данного белка не только находится в состоянии расплавленной глобулы, но и не содержит природных лигандов. Таким образом, имеются основания предполагать, что в процессе функционирования (например, при взаимодействии с мембраной) молекула АФП действительно может претерпевать кон-

формационные изменения, сопровождающиеся выходом гидрофобных лигандов. На основании микробиологических исследований ранее была предложена двухре-

Ы ы

у * U

ЫАФП (закрытая форма)

АФП (открыта! форма)

Рецептор Г7—Л гидрофобного

Гидрофобный лиганд

Рисунок 22, Схематическое представление двухрецепторной модели андоцитоза АФП и транспорта гидрофобных лигандов (адаптировано из работы (Uriel et а!., 1989).

цепторная модель, описывающая эндоцитоз АФП и перенос гидрофобных лигандов (жирных кислот) в клетку-мишень (Uriel et al., 1989). Согласно этой модели, представленной на Рисунке 22, на поверхности клетки-мишени существуют два типа рецепторов, отвечающих за связывание АФП и жирных кислот (ЖК), соответственно. Для объяснения полученных результатов авторы вводят в рассмотрение также две формы АФП - "закрытую" (closed, насыщенную лигандами) и "открытую" (open, безлигандную). В соответствии с данной моделью события развиваются следующим образом (см. Рисунок 22). К поверхности клетки-мишени, содержащей специфические места связывания АФП, подходит "закрытая" форма белка. Происходит связывание этой формы с соответствующим рецептором, которое приводит к информационным изменениям в молекуле АФП - белковая молекула трансформируется в "открытую" форму. Как следствие, высвобождаются лиганды (ЖК), которые затем переносятся на специфические рецепторы жирных кислот, также расположенные на мембранной поверхности. Что касается белка, то он либо диссоциирует с рецептора, либо вместе с ЖК попадает внутрь клетки путем эндоцетоза (см. Рисунок 22). Таким образом, согласно рассмотренной модели в организме могут существовать две формы АФП - "закрытая" и "открытая", - которые, на наш взгляд, соответствуют описанным в данном разделе диссертации нативному состоянию и состоянию расплавленной глобулы данного белка. Следовательно, обнаруженные в результате наших исследований конформационные из-

менения, сопровождающие (или сопровождающиеся) выход(ом) гидрофобных ли-гандов из молекулы АФП, имеют прямое отношение к транспортной функции этого белка. Интересно, что аналогичный вывод был сделан на основании исследования структурных свойств другого транспортного белка - ретинол-связываю-щего белка (ВусЬкоуа & РМэуп, 1993; Дюйсекина и др., 1998).

В заключение этой части необходимо отметить следующеее. Поскольку наряду с транспортом многочисленных лигандов, АФП имеет целый ряд других важных биологических функций, в частности, принимает участие в регуляции иммунного ответа, то привлекательным выглядит предположение о том, что структурные преобразования молекулы АФП, сопровождающие выход из нее гидрофобных лигандов (т.е. переход из "открытой" формы в "закрытую", или, иными словами, переход из нативного состояния в расплавленную глобулу), не только прямо связаны с транспортом жирных кислот, но и имеют отношение к дальнейшему функционированию АФП, например в качестве иммунорегулятора.

ГЛАВА X. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключительном разделе представлены некоторые новые результаты, наблюдения и предположения, полученные и сформулированные в ходе работы над диссертацией. Это также своего рода отчет об испытании разработанных методов и концепций в «полевых условиях».

В первой части заключения приведены данные, полученные при исследовании влияния избыточного фосфорилирования на структурные свойства белка тау. На основании полученных результатов сделан ряд важных выводов. Во-первых, процесс модификации белковой молекулы (в данном случае фосфорили-рование) потенциально может приводить не только к регуляции функционирования молекулы белка, но и к ее денатурации. Таким образом, получены дополнительные основания предполагать, что в клетке имеется богатый арсенал денатурирующих воздействий на нативную белковую молекулу (который далеко не ограничивается воздействием мембранных поверхностей). Во-вторых, поскольку известно, что гиперфосфорилирование белка тау приводит к возникновению ряда нервно-дегенеративных заболеваний (болезни Альцхеймера в том числе), то данный пример показывает, насколько тонка грань между нормальными и патологическими условиями. В-третьих, тау не является глобулярным белком в привычном понимании этого слова, однако данные, полученные для него, показывают, что наблюдения н выводы, сделанные в данной диссертации для глобулярных белков вполне применимы и для белков, относящихся к другим классам.

Во второй части заключения приведены некоторые весьма предварительные данные, свидетельствующие о том, что одной из важных характеристик белковой молекулы в состоянии-предшественнике расплавленной глобулы может

быть наличие у нее нативоподобной топологии. Иными словами, те элементы вторичной структуры, которые формируются в молекуле белка на стадии перехода в данное состояние имеют близкую к нативной взаимную ориентацию.

В третьей части коротко представлены результаты анализа литературных данных по влиянию лигандов на структурные свойства и конформационну'ю стабильность белков и предложена классификация классификации безлигандных форм с точки зрения изменения структурных свойств белковой молекулы.

ГЛАВА XI. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

Как говорилось в водной части, при работе над данной диссертацией рассматривался достаточно широкий круг вопросов. Отмечалось также, что некоторые из исследованных проблем имели принципиальное значение для понимания процесса самоорганизации белковой молекулы, тогда как результаты, полученные в качестве ответов на другие вопросы, носят скорее иллюстративный характер. Необходимо отметить, что часть важных наблюдений была получена также как ' следствие разработки экспериментальных подходов для исследования структурных превращений белков в ходе их равновесного разворачивания.

Часть из принципиально важных результатов, полученных в ходе работы над данной диссертацией, суммирована ниже.

1) Аналитически (путем исследования зависимости Крутизны структурного перехода от молекулярной массы белковой молекулы) и экспериментально (методом гель-фильтрации в условиях, обеспечивающих существенное замедление скорости обмена между конформерами в области структурного перехода) изучен характер конформационных переходов И—>и, N-»N40 и Мв->и, индуцированных сильными денатурантами в глобулярных белках. Показано, что состояние расплавленной глобулы отделено как от нативного, так и от полностью развернутого состояний переходами типа «все-или-ничего», являющимися внутримолекулярными аналогами фазового перехода первого рода. Иными словами, доказано, что данный интермедиат представляет собой отдельное фазовое состояние белковой молекулы.

2) Обнаружено новое равновесное состояние белковых молекул, промежуточное по своим свойствам между состояниями расплавленной глобулы и неупорядоченного клубка, получившее название состояния-предшественника расплавленной глобулы. Данное состояние является характерным для многих белков. Белковая молекула может быть трансформирована в него при равновесном разворачивании сильными денатурантами в условиях нейтральных рН и низких температур или при низких значениях рН в присутствии различных анионов. Состояние с похожими свойствами также формируется в молекуле случайного сополимера, состоящего из гидрофобных и гидрофильных аминокислотных остатков, при понижении рН раствора.

3) С помощью целого ряда физико-химических методов, несущих информацию о различных уровнях организации молекулы белка проведено детальное изучение состояния-предшественника расплавленной глобулы. Показано, что основными структурными характеристиками белковой молекулы в данном состоянии являются: отсутствие уникальной пространственной структуры; достаточно низкое сродство к гидрофобному флуоресцирующему зонду АНС (в 4-5 раз ниже, чем у состояния расплавленной глобулы); низкая степень защищенности триптофановых остатков от взаимодействия с молекулами растворителя и/или тушителя; наличие значительной части упорядоченной вторичной структуры (-50% от нативного значения); заметная степень компактности, которая, однако, существенно меньше компактности расплавленной глобулы; отсутствие плотно упакованного ядра (отсутствие специфической глобулярной структуры); наличие конформационных переходов, отделяющих это состояние как от расплавленной глобулы, так и от полностью развернутого состояния. Особо следует отметить тот факт, что расплавленная глобула и ее предшественник разделены переходом типа «все-или-ничего», тогда как переход из предшественника расплавленной глобулы в клубок, по-видимому, не является фазовым переходом первого рода.

4) С помощью широкого арсенала физико-химических подходов исследовано одно из самых характерных свойств частично-свернутых белковых молекул - их склонность к самоассоциации. Установлено, что данный процесс может играть существенную роль в структурировании негативных молекул белка. При этом не только имеет место существенное увеличение устойчивости данных кон-формаций к внешним воздействиям, но и наблюдается возникновение внутри белковой молекулы дополнительных структурных элементов и даже формирование новых внутримолекулярных уровней структуры.

В ходе работы над диссертацией был также разработан ряд экспериментальных подходов для исследования структурных превращений, протекающих в молекуле глобулярного белка в ходе ее равновесного разворачивания:

1) Показано, что гель-фильтрация является весьма удобным инструментом для изучения процессов денатурации и разворачивания глобулярных белков. Данный метод не только позволяет определять с высокой точностью гидродинамические размеры белковой молекулы в различных конформационных состояниях, но и получать прямую термодинамическую характеристику исследуемых переходов (наличие бимодального распределения по молекулярным размерам характеризует переходы типа "все-или-ничего"), и даже проводить независимое исследование структурных свойств двух состояний с различной степенью компактности.

2) Показано, что существует прямая корреляция между изменениями параметров затухания флуоресценции комплексов 8-АНС-белок и процессами денатурации

и разворачивания белковой молекулы. Таким образом, установлено, что метод затухания флуоресценции этого зонда может быть использован для исследования структурных превращений в глобулярных белках.

Проведено исследование причин, могущих приводить к денатурации белковой молекулы in vivo. Результаты, полученные в ходе таких исследований свидетельствуют о том, что:

1) Изменения аминокислотной последовательности (точечные мутации или циру-лярная пермутация) могут существенным образом влиять на структуру глобулярных белков, приводя к появлению денатурированных форм белковых молекул, в том числе и в живой клетке. Возможной причиной этого феномена является остановка сворачивания мутантных белков на стадии формирования кинетических промежуточных состояний.

2) Уменьшение диэлектрической проницаемости среды может приводить к формированию в молекуле глобулярного белка промежуточного состояния, в котором она обладает всеми свойствами расплавленной глобулы. Таким образом получено подтверждение гипотезы о том, что локальное увеличение степени гидрофобности среды может представлять собой один из денатурирующих факторов поверхности мембраны.

3) Природные лиганды могут играть существенную роль в стабилизации натив-ной структуры в белковой молекулы. Установлено, в частности, что удаление лигандов из молекулы онко-эмбрионального белка а-фетопротеина сопряжено с конформационной перестройкой белковой молекулы в состояние типа расплавленной глобулы. Проведен также анализ литературных данных, показывающих, насколько различным может быть воздействие лигандов различной природы - от электрона и ионов металлов до сложных органических молекул -на уникальную структуру белков. Предложена также классификация систем ли-ганд-белок, принимающая во внимание масштаб структурных изменений, индуцируемых в белковой молекуле удалением лигандов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в отечественных журналах

1. Родионова H.A., Семисотнов Г.В., Кутышенко В.П., Уверский В.Н., Болотина И.А., Бычкова В.Е., Птицын О.Б. Стадийность равновесного разворачивания карбоангидразы В сильными денатурантами. // Молекулярная биология. 1989. Т.23. No.3. С. 683-692.

2. Уверский В.Н., Семисотнов Г.В., Птицын О.Б. Разворачивание расплавленной глобулы сильными денатурантами протекает по принципу "все-или-ничего". // Биофизика. 1993. Т.38. No.l. С.37-46.

3. Уверский В.Н., Леонтьев В.В., Гудков А.Т. Влияние точечных аминокислотных замен на стабильность лизоцима фага Т4: I. Замена AsnlOl-Asp. // Биофизика. 1993. Т.38. No. 4. С.602-605.

4. Леонтьев В.В., Уверский В.Н., Грязнова О.И., Гудков А.Т. Влияние точечных аминокислотных замен на стабильность лизоцима фага Т4: II. Переход белковой молекулы в состояние "расплавлен-ной глобулы" при заменах AsplO-His, AsnlOl-Asp, Argl48-Ser. //

Биофизика. 1993. Т.38. No. 4. С.606-610.

5. Киркитадзе М.Д., Нарижнева Н.В., Томашевский А.Ю., Потехин С.А., Уверский В.Н. Стабилизация структуры а-фетопротеина сахарозой. // Биоорганическая химия. 1996. Т.

. 22. No. б. С.408-414.

6. Карнуп A.C., Уверский В.Н., Медведкин В.Н. Синтетические полиаминокислоты и полипептиды. N-карбокс'иангидридный метод. // Биоорганическая химия. 1996. Т.22. No.8. С.563-574.

7. Уверский В.Н., Птицын О.Б. Трехстадийное равновесное разворачивание небольших глобулярных белков сильными денатурантами: I. Карбоангидраза В. // Молекулярная биология. 1996. Т.ЗО. No. 5. С. 1124-1134.

8. Уверский В.Н., Птицын О.Б. Трехстадийное равновесное разворачивание небольших глобулярных белков сильными денатурантами: II. ß-лактамаза и общая модель. II Молекулярная биология. 1996. Т.ЗО. No. 5. С.1135-1143.

9. Нарижнева Н.В., Иванова Т.В., Томашевский А.Ю., Уверский В.Н. Сравнение структурных свойств гомологичных белков сывороточного альбумина и а-фетопротеина человека. // Молекулярная биология. 1997. Т.31. No.6. С.1043-1048.

10. Латыпов Р.Ф., Абдулаев З.Х., Бадретдинов А.Я., Бочаров Э.В., Мельник Т.Н., Афасижева И.Ю., Арсеньев A.C., Долгих Д.А., Уверский В.Н., Финкелыитейн, A.B., Кирпичников. Циркулярная пермутация рибосомального белка S6 из Thermus Thermophylus с целью придания ему топологии искусственного белка апьбебетина. // Молекулярная биология. 1998. Т.32. No.l. С.129-136.

11. Уверский В.Н., Нарижнева Н.В. Влияние природных лигандов на структурные свойства и конформационную стабильность белков. (Обзор) // Биохимия. 1998. Т.63. No.4. С.68-83.

12. Нарижнева Н.В., Уверский В.Н. Понижение диэлектрической проницаемости среды может трансформировать белковую молекулу в состояние расплавленной глобулы. // Биохимия. 1998. Т.63. No.4. С.100-108.

13. Уверский В.Н., Финк А.Л. Олигомеризация может структурировать белковые молекулы, находящиеся в частично свернутых ненативных состояниях. // Биохимия. 1998. Т.63. No.4. С.109-116.

14. Уверский В.Н., Финк А.Л. Структурные свойства стафилококковой нуклеазы в олигомер-ных А-формах. // Биохимия. 1998. Т.63. No.4. С.117-124.

15. Уверский В.Н. Равновесное разворачивание частично свернутых форм форм Аг и Аз стафилококковой нуклеазы сопровождается формированием промежуточного состояния. // Биохимия. 1998. Т.63. No.4. С.125-130.

16. Уверский В.Н. Разнообразие денатурированных форм глобулярных белков: I. Индуцированное анионами сворачивание стафилококковой нуклеазы. // Молекулярная биология. 1998. Т.32. No. 3. С.482-487.

17. Уверский В.Н. Разнообразие денатурированных форм глобулярных белков: II. Структурные характеристики А-форм. // Молекулярная биология. 1998. Т.32. No. 3. С.488-497.

18. Карнуп A.C., Уверский В.Н. рН-Индуцируемое сворачивание статистического сополимера гидрофобных и гидрофильных аминокислот сопровождается формированием интерме-диата со свойствами состояния-предшественника расплавленной глобулы. // Молекулярная биология. 1998. Т.32. No. 3. С.550-556.

19. Афасижева И.Ю., Абдуллаев З.К., Долгих Д.А., Латыпов Р.Ф., Тиктопуло Е.И., Уверский В.Н., Птицын О.Б., Кирпичников М.П. Исследование влияния биологически активного фрагмента интерферона на структуру искусственного белка-носителя. // Биофизика. 1998. Т.43. В печати.

20. Уверский В.Н. Сколько существует различных расплавленных глобул? (Обзор) // Биофизика. 1998. Т.43. В печати.

21. Томашевский А.Ю., Уверский В.Н. Новая схема крупномасштабного выделения а-фетопротеина человека. //Биоорганическая химия. 1998. В печати.

Статьи в зарубежных журналах

22. Uversky V.N. Cementing the folding community. // The Biochemist. 1991. V.13. No.3. P.9.

23. Semisotnov G.V., Rodionova N.A., Razgulyaev O.I., Uversky V.N., Gripas' A.F., Gilmanshin R.I. Study of the "molten globule" intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe.//Biopolymers, 1991. V.13. P.l 19-128.

24. Uversky V.N., Leontiev V.V., Gudkov A.T. Triple point mutation AsplO-His, AsnlOl-Asp, Argl48-Ser in T4 phage lysozyme leads to the molten globule. // Protein Engineering. 1992. V.5. No.8. P.781-783.

25. Uversky V.N., Semisotnov G.V., Pain R.H., Ptitsyn O.B. "All-or-none" mechasnism of the molten globule unfolding. FEBS Letters. 1992. V.314. No.l. P.89-92.

26. Leontiev V.V., Uversky V.N., Gudkov A.T. Comparative stability of dihydrofolate reductase mutants in vitro and in vivo. Protein Engineering. 1993. V.6. No.l. P.81-84.

27. Leontiev V.V., Uversky V.N., Permyakov E.A., Murzin A.G. Introduction of Ca2+-binding ammo-acid sequence into the T4 Lysozyme. Biochimica et Biophysica Acta. 1993. V.1162. P,.84-88.

28. Uversky V.N. Use of fast protein size-exlusion liquid chromatography to study the unfolding of proteins which denature through the molten globule. Biochemistry. 1993. V.32. P13288-13298.

29. Uversky V.N. Gel-permeation chromatography as a unique instrument for quantitative and qualitative analysis of protein denaturation and unfolding. // International Journal of Bio-Chromatography. 1994. V.l. P.103-114.

30. Chemeris V.V., Dolgikh D.A., Fedorov A.N., Finkelstein A.V., Kirpichnikov M.P., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. A new approach to artificial and modified proteins: theory-based design, synthesis in a cell-free system and fast testing of structural properties by radiolabeles. // Protein Engineering. 1994. V.7.No.8. P.1041-1052.

31. Protasova N.Yu., Kireeva M.L., Murzina N.V., Murzin A.G., Uversky V.N., Gryaznova O.I., Gudkov A.T. Circularly permuted dihydrofolate reductase of E.coli has functional activity and a destabilized tertiary structure. //Protein Engineering. 1994. V.7. No.ll. P. 1373-1377.

32. Ptitsyn O.B., Uversky V.N. The molten globule is a third thermodinamical state of protein molecules. //FEBS Letters. 1994. V.341. P.15-18.

33. Uversky V.N., Ptitsyn O.B. "Partly folded" state, a new equilibrium state of protein molecules: Four-state guanidinium chloride-induced unfolding of p.-lactamase at low temperature. // Biochemistry. 1994. V.33. P.2782-2791.

34. Ptitsyn O.B., Bychkova V.E., Uversky V.N. Kinetic and equilibrium folding intermediates. // Phil. Trans. R. Soc. Lond. 1995.V.348. Р.Й-41.

35. Uversky V.N.,Kirkitadze M.D.,Narizhneva N.V.,Potekhin S.A., Tomashevski A.Yu. Structural properties of a-fetoprotein from human cord serum : the protein molecule at low pH possesses all the propertis of the molten globule. // FEBS Letters. 1995. V.364. P.165-167.

36. Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Lushchik V.B., Klenin S.I., Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. "Domain" coil-globule transition in homopolimers. // Macromolecules. 1995. V. 28. P. 75197524.

37. Dolgikh D.A., Uversky V.N., Gabrielian A.E., Chemeris V.V., Fedorov A.N., Navolotskaya E.V., Zav'yalov V.P., Kirpichnikov M.P. The de novo protein with grafted biological function: transferring of interfron blast-transforming activity to albebetin. // Protein Engineering. 1996. V. 9. P. 195-201.

38. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Klenin S.I., Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. Molten globule-like state of cytochrome с under conditions simulating those near the membrane surface. // Biochemistry. 1996. V.35. P.6058-6063.

39. Uversky V.N., Winter S., L6ber G. Use of fluorescence decay times of 8-ANS-protein complexes to study the conformational transitions in proteins which denature through the molten globule state. // Biophysical Chemistry. 1996. V.60. P.79-88.

40. Uversky V.N., Ptitsyn O.B. All-or-none mechanism of solvent-induced transitions between native, molten globule and unfolded states in globular proteins. // Folding & Design. 1996. V.l. P.l 17-122.

41. Uversky V.N., Ptitsyn O.B. Further evidence on the equilibrium "pre-molten globule state" : Four-state guanidinium chloride-induced unfolding of carborriic anhydrase В at low temperature. //J. Mol. Biol. 1996.. V.255. P.215-228. '

42. Uversky V.N., Kutyshenko V.P.-, Protasova N.Yu., Rogov V.V., Vassilenko K.S., Gudkov A.T. Circularly permuted dihydrofolate reductase possesses all the properties of the molten globule, but can resume functional tertiary structure by interaction with its ligands. // Protein Sci. 1996. V.5. P.1844-1851.

43.Dolgikh D.A., Gabrielian A.E., Uversky V.N., Kirpichnikov M.P. Protein engineering of de nojo protein with predesigned structure ans* activity. // Applied Biochemistry and Biotechnology. Protein Engineering. 1996. V.61. P.85-96. -

44. Uversky V.N., Narizhneva N.V., Kirschstein S.O., Lober G. Coformational transitions provoked by organic solvents in P-lactoglobulin: Can a molten globule-like intermediate be induced by the decrease in dielectric constant? // Folding & Design. 1997. V.2. P.163-173.

45. Uversky V.N., Narizhneva N.V., Ivanova T.V., Kirkitadze M.D., Tomashevski A.Yu. Ligand-free form of human a-fetoprotein: Evidence for the molten globule state. // FEBS Letters. 1997. V.410. P.280-284.

46. Uversky V.N., Narizhneva N.V., Ivanova T.V., Tomashevski A.Yu. Rigidity of human a-fetoprotein structure is under the ligand control. // Biochemistry. 1997. V.36. P. 13638-13645.

47. Karnbup A.S., Uversky V.N. Sequential compactization of random copolymer of hydrophilic and hydrophobic amino acid residues. // Macromolecules. 1997. V.30. No.24. P.7427-7434.

48. Abdullaev Z.Kh., Latypov R.F., Badretdinov A.Ya., Dolgikh D.A., Finkelstein A.V., Uversky V.N., Kirpichnikov M.P. S6 permutein shows that the unusual target topology is not responsible for the absence of rigid tertiary structure in de novo protein albebetin. // FEBS Letters. 1997. V.414. P.243-246.

49. Narizhneva N.V., Uversky V.N. Human a-fetoprotein is in the molten globule state under conditions modelling protein environment near the membrane surface. // Protein and Peptide Letters.

1997. V.4. No.4. P.243-249.

50. Uversky V.N. Diversity of equilibrium compact forms of denatured globular proteins. (Minireview) // Protein and Peptide Letters. 1997. V.4. No.6. P.355-367.

51. Aphasizheva I.Yu., Dolgikh D.A., Abdullaev Z.K., Uversky V.N., Kirpichnikov MP., Ptitsyn O.B. // Attachment of an octapeptide can improve structure of the de novo protein? FEBS Letters.

1998. Vol.425. No.l. P.101-104

52. Uversky V.N., Segel D.J., Doniach S., Fink A.L. // Association-induced Folding of Globular proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 1998. In press.

53. Uversky V.N., Kamoup A.S., Segel D.J., Seshadri S., Doniach S., Fink A.L. H Anion-induced Folding of Staphylococcal Nuclease: Characterization of Multiple Equilibrium Partially-folded Intermediates J. Mol. Biol. 1998. In press.

54. Uversky V.N., Karnoup A.S., Khurana R„ Segel D.J., Doniach S., Fink A.L. // Association of partially-folded intermediates of Staphylococcal nuclease induces structure and stability. Protein Sci. 1998. In press.

55. Uversky V.N., Winter S., Lober G. // Mg^-mediated self-association of 8-anilino-l-naphthalene-sulfonate molecules: Spectroscopic characterization and aplication to the investigation of prdtein folding. Biophys. Chem. 1998. Послано в редакцию.

Тезисы отечественных конференций

56. Леонтьев В.В., Уверский В.Н., Гудков А.Т. Сравнительное исследование стабильности мутантов дигидрофолатедуктазы in vivo и in vivo. // 5-я Конференция ученых Российской Федерации по новым направлениям биотехнологии. Пущино. 1992. С.55.

57. Леонтьев В.В., Уверский В.Н., Пермяков Е.А., Мурзин А.Г. Введение кальций связывающей аминокислотной последовательности в лизоцим фага Т4. И 5-я Конференция ученых Российской Федерации по новым направлениям биотехнологии. Пущино. 1992. С.55.

Тезисы международных конференций

58. Uversky V.N., Gutin A.M., Sokolovsky I.V., Semisotnov G.V. The nature of slow processes in the kinetics of carbonic anhydrase В refolding. // V Conference of Young Scientists of Socialist Countries on Organic and Bioorganic Chemistry. Pushchino. USSR. 1988. Abstracts. P.86-87.

59. Uversky V.N., Rodionova N.A., Semisotnov G.V., Pain R.H., Ptitsyn O.B. Experimental evidence for all-or-none nature of molten globule - coil transition in globular proteins. // Modem Problems of Physical Chemistry of Macromolecules. International School-Seminar. Pushchino. USSR. 1991. Abstracts. P.171. *

60. Ptitsyn O.B., Bychkova V.E., Dolgikh D.A., Semisotnov G.V., Uversky V.N. Molten globule and protein folding. // Modem Problems of Physical Chemistry of Macromolecules. International School-Seminar. Pushchino. USSR. 1991. Abstracts. P.57-58.

61. Uversky V.N., Pain, R.H., Rodionova N.A., Semisotnov G.V., Ptitsyn O.B. Unfolding of globular proteins as two first order phase transitions. // VIII Conference of Young Scientists of Socialist Countries on Organic and Bioorganic Chemistry. Riga. USSR. 1991. Abstracts. P.234-235.

62. Ptitsyn O.B., Chemeris V.V., Dolgikh D.A., Fedorov A.N., Finkelstein A.V., Kirpichnikov M.P., Uversky V.N. A new approach to artificial proteins: theory-based design, synthesis in the cell-free system and structural probing at nanogram level. // Protein Engineering. 1993. V.6. Suppl. P. 122.

63. Chemeris V.V., Dolgikh D.A., Fedorov A.N., Finkelstein A.V., Kirpichnikov M.P., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. A new approach to artificial and modified proteins. // V International Summer School on Biophysics. Rovinj. Chroatia. 1994. Abstract. P.76.

64. Uversky V.N. Intermediates and protein folding. // International Worshop on Molecular Biotechnology. Jena. Germany. 1994. Abstracts. P.76a.

65. Uversky V.N., Winter S., Lober G. Studies of protein folding by the use of fluorescence decay times in 8-ANS-protein complexes. // International Worshop on Molecular Biotechnology, jena. Germany. 1994. Abstracts. P.76.

66. Ptitsyn O.B., Uversky V.N. The molten globule as the third thermodinamic state of proetin molecule. // 32 Annual Meeting of the Biophysical Society of Japan. Tokyo. 1994. Abstracts. P.sl51.

67. Uversky V.N., Narizhneva N.V., Kirkitadze M.D., Tomashevski A.Yu. Crucial role of logands • in the stabilization of a-fetoprotein native structure. // 23th ISOBM Meeting. Montreal. Canada.

1995. Abstracts. P.48.

68. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Klenin S.I., Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. An equilibrium intermediate of cytochrome с under conditions simulating those near negatively charged membrane surface. // 2nd Workshop of Protein Architecture. Tokyo. Japan. 1995. Abstracts. P.80.

69. Ptitsyn O.B., Uversky V.N. «Pre-molten globule» - a new equilibrium state of protein molecules. // Annual Meeting of American Society for Biochemistry and Molecular Biology. San Francisco. 1995, May 21-25. FASEB J.

70. Latypov R.F., Badretdinov A.Ya., Scherbakov D.V., Dolgikh D.A., Finkelstein A.V., Uversky V.N. Permutation in ribosomal protein S6 leads to the formation of de novo protein albebetin-like topology. // Baev Memorial Conference. Moscow. 1996. Abstracts. P.269.

71. Uversky V.N., Fink. A.V. Effect of association on anion-induced folding of Staphylococcal nuclease. // 10th Symposium of the Protein Society. San Jose. USA. 1996. Abstracts. P.89.

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Гросберг А.Ю., Хохлов А.Р. II Статистическая физика макромолекул. / Москва: Наука. 1989.342 с.

Дюйсекина А.Е., Бычкова, В.Е., Фантуцци, А., Росси, Дж.-Л., Птицын, О.Б. // Мопекуляр.

Биология. 1998, в печати. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. // Теоретическая физика. Электродинамика постоянных сред. Т.

8. Наука. Москва. 1982. С.60. Птицын О.Б. // Стадийный механизм самоорганизации белковых молекул. Докл. АН СССР.

1973. Т.210. С.1213-1215. Семисотнов Г.В. // Автореф. дисс. докт. физ.-мат. наук. Пущино: Институт белка РАН. 1994. 50 с.

Abelev G.I. И Adv. Cancer Res. 1971. V.14. P.295-358.

Adler A.J., Greenfield N.J., Fasman G.D. II Methods Enzymol. 1973. V.27. P.675-735. ArakawaT., Goddette D. II Arch. Biochem Biophys. 1985. V.240. P.21-32. Aune K.C., Tanford C. // Biochemistry. 1969. V.8. P.4586-4590.

Brems D.N., Plaisted S.M., Havel H.A., Tomich C.-S.C. II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1988. V.85. P.3367-3371.

Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. IIChemtracts: Biochem. Mol. Bio!. 1993. V.4. P.133-163. Bychkova V.E., Ptitsyn O.B. II FEBS Lett. 1995. V.359. P.6-8. Bychkova V.E., Pain R.H., Ptitsyn O.B. II FEBS Leu. 1988. V. 238. P.231-234. Bychkova V.E., Dujsekina A.E., Klenin S.I., Tiktopulo E.I., Uversky V.N., Ptitsyn O.B. II Biochemistry. 1996. V.35. P.6058-6063. Christensen H., Pain R.H. // Eur. Biophys. J. V. 19. P.221 -229. Cleland J.L., Wang D.I.C.'// Biotechnol. /Yog. 1992. V.8. P.97-103. Deutsch H.F. //Adv. CancerRes. 1991. V56. P.253-312.

Dolgikh D.A., Gilmanshin R.I., Brazhnikov E.V. Bychkova V.E., Semisotnov G.V., Venyaminov

S.Yu., Ptitsyn O.B. II FEBS Lett. 1981. V.136. P.311-315. Dolgikh D.A., Abaturov L.V., Bolotina I.A., Brazhnikov E.V. Bushuev V.N., Bychkova V.E., Gilmanshin R.I., Lebedev Yu.O., Tiktopulo E.I., Semisotnov G.V., Ptitsyn O.B. II Eur. Biophys. J. 1985. V.13. P.109-121. Eisenberg M.A., Gresalfi Т., Riccio Т., McLaughlin S. II Biochemistry. 1979. V.18. P.5213-5223. Eliezer D., Chiba K., TsurutaH., Doniach S„ Hodson K.O., Kihara H. //Biophys. J. 1993. V.65. P.912-917.

Endo Т., Schatz G .II EMBOJ. 1988. V.7. P.l 153-1158.

Feigin L.A., Svergun D.I. II Structural analysis by small-angle X-ray and neutron scattering. 1 New

York: Plenum Press. 1987. Fink A.L. // Methods Mol. Biol. 1995a. V.40. P.343-360. Fink A.L. II Annu. Rew. Biophys. Biomol. Struct. 1995b. V.24. P.495-522.

Fink A.L., Calciano L.J., Goto Y„ Kurotsu Т., Palleros D.R. // Biochemistry. 1994. V.33. P.12504-12511.

Gelier К., Stutter E., Nahschmann G., Löber G., Schütz H., Birkner E. // Studia Biophysica. 1987. V.117. P.67-72.

Glatter О., Kratky О. // Small Angle X-ray Scattering / London: Academic Press. 1982. 515 p. Goto Y., Fink A.L. II Biochemistry. 1989. V.28. P.945-952. Goto Y., Fink A.L. II J. Mol. Biol. 1990. V.214. P.803-805.

Green S.M., Gittis A.G., Meekler A.K., Lattman E.E. II Nature - Struct. Biol. 1995. V.2. P.746-751. Halbrech I., Klibanski С. II Nature. 1956. V.178. P.794-795.

Hill T.L. II Thermodynamics of the Smal Systems. / New-York: Wiley. 1963-1964. Kamatari, Y.O., KonnoT., KataokaM., AkasakaK. II J. Mol. Biol. 1996. V.259. P.512-523. Kataoka M., Hagihara Y., Mihara K„ Goto Y. // Proteins: Struct. Fund. Genet. 1993. V.229. P.591-596.

KuwajimaK. II Proteins: Struct. Fund. Genet. 1989. V.6. P. 87-103.

London, J., C. Skrzynia, and M. E. Goldberg. II Eur. J. Biochem. 1974. V.47. P.409-415.

Mitraki A., King J. // Bio-Technology. 1989. V.7. P.690-697. Prats M„ Teissie J., Tocanne J.-F. // Nature. 1986. V.322. P.756-758. Privalov P.L. // Aclv. Prot. Chem. 1979. V.33. P. 167-241. Privalov P.L. // Adv. Prot. Chem. 1982. V.35. P.1-104-.

Ptitsyn O.B. IIIn: Protein Folding!Creighton T.E., Ed. N.-Y.: Freeman and Co. 1992. P.243-300. Ptitsyn O.B. II Adv. Prot. Chem. 1995. V.47. P.83-229.

Ptitsyn O.B., Semisotnov G.V. // In Conformations and Forces in Protein Folding (Nail B.T., Dill

K.A., Eds.). 1991. P.155-168.AAAS Press. Washigton. DC. Ptitsyn O.B., Pain R.H., Semisotnov G.V., Zerovnik E., Razgulyaev O.I. f/ FEBSLett. 1990. V.262. P.20-24.

Robson B., Pain R.H. II Biochem J. 1976. V.155. P.331-334.

Semisotnov G.V., Rodionova N.V., Kutyshenko V.P., Ebert, B., Blank J., Ptitsyn O.B. II FEES Lett. 1987. V.224. P.9-13.

Semisotnov G.V., Kihara H., Kotova N.V., Kimura K., Amemiya Y„ Wakabayashi K., Serdyuk I.N., Timchenko A.A., Chiba K., Nikaido K., Ikura T., Kuwajima K. // J. Mol. Biol. 1996. V.262. P.559-574.

Shortle D., Meeker A.K. // Biochemistry. 1989. V.28. P.936-944. Stryer L. II J Mol. Biol. 1965. V.13. P.482-495. Tanford C. II Adv. Prot. Chem. 1968. V.23. P.121-282.

Tanford C„ De P.K., Taggart V.G. // J. Am. Chem. Soc. 1960. V.82. P.6028-6034. Uriel J., Naval J., Laborda J., Geusken M. // in Biological activities of alpha¡-fetopro-tein (Mezejewski G.J„ Jackobson H.I., Eds.). 1989. V.2. Pp.103-117. Boca Raton. FL: CRC Press.

Научное издание

Автореферат Уверского В.Н.

РАЗНООБРАЗИЕ КОМПАКТНЫХ ФОРМ ДЕНАТУРИРОВАННЫХ БЕЛКОВ

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции СЖ-005-93; том 2; 953000 - книги и брошюры.

03.04.98 г. 3. 7953Р. Т. 100 экз. Усл.печ.л. 3,75. Отпечатано с оригинала-макета в Отделе научно-технической информации Пущинского научного центра РАН. 142292 г. Пущино Московской обл., проспект Науки, 3. ОНТИ ПНЦ РАН.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Уверский, Владимир Николаевич, Пущино



российская академия наук институт биологического приборостроения институт белка

Пре. ___.......

,. -На правах рукописи

М (решение от " " /(

ЗИДиум ВАК

19/

присудил ученую степень Л Г и,

начальник управленг

/

УВЕРСКИИ ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВИЧ

РАЗНООБРАЗИЕ КОМПАКТНЫХ ФОРМ ДЕНАТУРИРОВАННЫХ БЕЛКОВ

03.00.02 - Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

Пущино- 1998

Моей семье с любовью и благодарностью

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ГЛАВА I. ВВЕДЕНИЕ.................................. 12

ГЛАВА II. СКОЛЬКО СУЩЕСТВУЕТ РАЗЛИЧНЫХ РАСПЛАВЛЕННЫХ

ГЛОБУЛ?.................................. 21

1.Введени е........................................ 21

2. Белковая молекула как объект физических исследований. Основные определения .......................................... 21

3. История открытия расплавленной глобулы................... 24

4. Разнообразие денатурированных форм белковой молекулы - расплавленная глобула, высоко структурированная расплавленная глобула, предшественник расплавленной глобулы............................ 26

ЧАСТЬ ПЕРВАЯ. КОМПАКТНЫЕ ДЕНАТУРИРОВАННЫЕ

СОСТОЯНИЯ И СВОРАЧИВАНИЕ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ 32 ГЛАВА III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРНЫХ СВОЙСТВ КОМПАКТНЫХ ДЕНАТУРИРОВАННЫХ СОСТОЯНИЙ

БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ......................... 32

§1. Как зарегистрировать формирование равновесного промежуточного состояния? Общее состояние вопроса...................... 32

§2. Условия эксперимента...........:................... 33

§3. Высокоэффективная гель-фильтрация как уникальный инструмент для количественного и качественного описания процессов денатурации и

разворачивания глобулярных белков....................... 38

п. 3.3.а. Введение................................... 38

п. 3.3. б. Определение величин радиуса Стокса для нашивных и полностью

развернутых белков (анализ литературных данных).......... 41

п. 3.3. в. Количественный анализ разворачивания глобулярных белков сильными денатурантами с помощью гель-фильтрации............ 43

п. 3.3.г. 1. Калибровка гель-фильтрационной колонки Superóse-12...... 45

п.З.З.г.2. Определение величин радиуса Стокса для нативных и полностью

развернутых белков с помощью гель-фильтрации.......... 47

п.З.З.г.З. Определение величин радиуса Стокса для белков в состоянии

расплавленной глобулы с помощью гель-фильтрации......... 47

п. 3.3. д. Качественный анализ процессов денатурации и разворачивания глобулярных белков с помощью гель-фильтрации. Получение кривых, описывающих структурные переходы в белках................ 50

п. 3.3. е. Гель-фильтрация прямо указывает на существование переходов типа "все-или-ничего " между компактным и менее компактным состояниями белковой молекулы.......................... 55

п. 3.3.ж. Использование гель-фильтрации для разделения конформационных состояний, отличающихся по гидродинамическим размерам, и исследования их свойств............................... 57

§4. Применение метода затухания флуоресценции гидрофобного зонда 8-

АНС для исследования структурных превращений в глобулярных белках. 59

п. 3.4. а. Введение................................... 59

п. 3.4. б. Самоассоциация молекул 8-АНС. Спектральные характеристики . . 60

п. 3.4. б. 2. Спектральные свойства 8-АНС в водных растворах....... 61

Влияние самоассоциации на спектральные свойства 8-АНС...... 61

Роль ионов в ассоциации молекул АНС............... 63

п. 3.4.6.3. Спектральные свойства 8-АНС в органических растворителях . 66 Общий эффект растворителя на спектральные свойства 8-АНС... 66 Влияние ассоциации на спектральные свойства молекул 8-АНС в органических растворителях....................... 68

Влияние ионов магния на спектральные свойства 8-АНС в органических растворителях........................... 70

п. 3.4. б. 4. Спектральные свойства 8-АНС в комплексах с белками..... 74

Характеристики затухания флуоресценции зонда в комплексах АНС-

белок................................... 74

Короткоживущая компонента флуоресценции комплексов АНС-белок относится к молекулам зонда, находящимся на поверхности белковой молекулы и доступным растворителю............. 77

Долгоживущая компонента флуоресценции комплексов АНС-белок относится к молекулам зонда, погруженным внутрь белковой молекулы и недоступным растворителю................. 79

Использование метода затухания флуоресценции гидрофобного зонда 8-АНС для исследования структурных превращений в глобулярных

белках................................... 80

Долгоживущая компонента флуоресценции комплексов 8-АНС-белок больше в том случае, когда зонд взаимодействует с белком, находящимся в состоянии расплавленной глобулы............. 83

Модельный механизм флуоресценции 8-АНС в комплексах этого зонда

с белками................................. 83

п. 3.4. б. 5. Основные выводы........................... 86

ГЛАВА IV. РАСПЛАВЛЕННАЯ ГЛОБУЛА - ТРЕТЬЕ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ........... 88

§1. Условия эксперимента............................... 88

§2. Индуцированные сильными денатурантами переходы между нашивным состоянием, состоянием расплавленной глобулы и клубкообразным состоянием являются переходами типа "все-или-ничего". Анализ экспериментальных данных................................. 90

п.4.2.а. Введение................................... 90

п.4.2.6. Зависимость кооперативности индуцированных мочевиной или GdmCl Н—>Р переходов в глобулярных белках. Разворачивание небольших белков является внутримолекулярным аналогом фазового

перехода................................... 94

п.4.2.в. Индуцированные растворителем переходы Н—>Р, Н—>РГ и РГ-+Р в небольших глобулярных белках являются переходами типа "все-или-

ничего ".................................... 95

Переходы Н->Р.............................. 95

Переходы Н->РГ............................. 96

Переходы РГ^Р............................. 97

п. 4.2. г. Реабилитация полученных результатов................. 100

п. 4.2.д. Индуцированные сильными денатурантами переходы между натив-ным состоянием, состоянием расплавленной глобулы и клубкообразным состоянием протекают по принципу "все-или-ничего "...... 100

§3. Результаты прямого эксперимента: Индуцированное при 4°С гуанидин-гидрохлоридом разворачивание состояния расплавленной глобулы карбо-ангидразы В и (3-лактамазы протекает по принципу "все-или-ничего. 107

п. 4.3.а. Введение.................................. 107

п. 4.3. б. Как экспериментально показать, что исследуемый переход является

переходом типа "все-или-ничего"?................... 109

п.4.3.в. Мультипараметрическое исследование разворачивания ККАВ гуани-

дингидрохлоридом при 4°С........................ 111

п. 4.3.г. Мультипараметрическое исследование денатурации /3-лактамазы

гуанидингидрохлоридом при 4°С..................... 114

п. 4.3.д. Хроматографическое исследование денатурации белков....... 114

п. 4.3. е. Индуцированное гуанидингидрохлоридом при 4°С разворачивание состояния расплавленной глобулы карбоангидразы В и (З-лактамазы 118 протекает по принципу "все-или-ничего "................

ГЛАВА V. ПРЕДШЕСТВЕННИК РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ - НОВОЕ 123

РАВНОВЕСНОЕ СОСТОЯНИЕ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ..... 123

§1. Введение....................................... 126

§2. Условия эксперимента...............................

§3. Трехстадийное равновесное разворачивание карбоангидразы В и /3-лак- 131

тамазы гуанидингидрохлоридом при низких температурах........ 131

п. 5.3. а. Введение.................................. 131

п. 5.3. б. Одностадийное разворачивание малых глобулярных белков.....

п.5.3.в. Двухстадийноеразворачивание малых глобулярных белков. Расплав- 133

ленная глобула................................

п.5.3.г. Трехстадийное разворачивание малых глобулярных белков. Расплав- 137

ленная глобула и ее предшественник...................

п. 5.3. д. Структурные свойства карбоангидразы В и /З-лактамазы в новом

промежуточном состоянии - предшественнике расплавленной глобу- 142

лы.......................................

п.5.3.е. Трехстадийный механизм равновесного разворачивания небольших

глобулярных белков. Сходство с кинетической схемой сворачивания и 144

моделью поэтапного сворачивания глобулярных белков......... 147

§4. Индуцированное анионами сворачивание стафилококковой нуклеазы. . . 147

п. 5.4.а. Введение...................................

п.5.4.6. Краткая характеристика объекта исследования. Конформационные

переходы, индуцируемые в нуклеазе изменениемрН. Разворачивание 150

белка мочевиной................................

п.5.4.в. Влияние анионов на развернутую кислотой стафилококковую нуклеа- 153

зу. Разнообразие компактных денатурированных состояний......

п.5.4.г. Структурные свойства стафилококковой нуклеазы в различных ани- 157

он-индуцированных А-формах........................

п. 5.4.г. Равновесное разворачивание форм А2 и A3 сопровождается форми- 166

рованием промежуточного состояния...................

п. 5.4.е. Пять равновесных конформаций нуклеазы. Структурные характеры- 170

стики.....................................

§5. рН-индуцируемое сворачивание статистического сополимера гидрофоб-

ных и гидрофильных аминокислот сопровождается формированием ин~ термедиата со свойствами состояния-предшественника расплавленной глобулы....................................... 173

п. 5.5.а. Введение................................... 173

п. 5.5.в. рН-индуцируемое сворачивание случайного сополимера. Изменения в

спектрах КД................................. 175

п. 5.5.г. рН-Индуцируемое сворачивание случайного сополимера. Гель-

фильтрация и тушение флуоресценции.................. 178

п. 5.5. д. Стабильности полипептида в различных конформационных состояниях. Влияние мочевины........................... 180

п. 5.5. е. Стабильности полипептида в различных конформационных состояниях. Эффект температуры........................ 181

п.5.5.ж. Структурные свойства молекулы случайного сополимера в промежуточной конформации........................... 182

§6. Главы IV и V: Резюме и рассуждения....................... 184

п. 5. б. а. Структурные свойства полипептидной цепи в состоянии-предшественнике расплавленной глобулы....................... 2 g4

п.5.6. б. Как отличить одно "расплавленное " состояние от другого? Конфор-

мационное пространство белковой молекулы..........................187

п. 5. б. в. Состояние-предшественник расплавленной глобулы является равновесным аналогом первого кинетического интермедиата сворачивания

глобулярных белков.............................. 189

п.5.6.г. Природа состояния-предшественника расплавленной глобулы. Предшественник расплавленной глобулы тождественен глобуле Лифшица? . 190 п. 5. б. д. Как выглядит фазово-конформационное пространство белковой молекулы?..................................... 194

ГЛАВА VI. ВЛИЯНИЕ ОЛИГОМЕРИЗАЦИИ НА СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА ДЕНАТУРИРОВАННЫХ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ........ 197

§6.1. Ассоциация денатурированных белковых молекул, как структурирующий фактор.................................... 197

§6.2. Структурные свойства нуклеазы в различных формах, индуцированных

олигомеризацией................................. 206

§6.3. Ассоциация интермедиата разворачивания более структурированных

форм Аг и Аз.................................... 213

§6.4. Конформационные переходы, индуцируемые в развернутой кислотой

стафилококковой нуклеазе анионами и ассоциацией............ 217

ЧАСТЬ ВТОРАЯ. КОМПАКТНЫЕ ДЕНАТУРИРОВАННЫЕ СОСТОЯНИЯ БЕЛКОВ ш vivo....................... 220

Введение. Откуда берутся денатурированные белки в клетке?......... 220

ГЛАВА VII. ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ, КАК СЛЕДСТВИЕ ИЗМЕНЕНИЯ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ. ТОЧЕЧНЫЕ МУТАЦИИ. ЦИРКУЛЯРНАЯ ПЕРМУТАЦИЯ.

ИСКУССТВЕННЫЕ БЕЛКИ....................... 222

§7.1. Введение...................................... 222

§7.2. Условия эксперимента.............................. 222

§7.3. Влияние точечных аминокислотных замен на стабильность лизоцима фага Т4. Переход белковой молекулы в состояние расплавленной глобулы при тройной замене AsplO—>His, AsnlOl —>Asp, Argl48—>Ser...... 225

п. 7.3.a. Введение................................................................225

п. 7.3.6. Растворимая форма тройного мутанта лизоцима фага Т4 обладает

свойствами расплавленной глобулы..................... 226

§7.4. Дигидрофолатредуктаза с циркулярно пермутированной аминокислот-

ной последовательностью обладает свойствами расплавленной глобулы,

но при взаимодействии с лигандами восстанавливает функциональную третичную структуру.............................. 230

п. 7.4.а. Введение................................. 230

п. 7.4.6. Пермутанты ДГФР в отсутствие лигандов обладают свойствами

расплавленной глобулы............................ 231

п. 7.4.6 1. Молекулы пермутантов ДГФР не имеют жесткой третичной

структуры.................................. 232

п. 7.4.6.2. Пермутированные формы ДГФР распознаются молекулярным

шапероном Сго-ЕЬ............................. 237

п. 7.4.6.3. Пермутанты в отсутствии лигандов компактны......... 237

п. 7.4.6.4. Пермутированные формы ДГФР имеют выраженную вторичную структуру............................... 239

п. 7.4. в. Влияние лигандов на структурные свойства и стабильность ДГФР и

ее пермутированных форм......................... 240

п. 7.4.г. Взаимодействие с лигандами индуцирует в пермутированных формах ДГФР переход расплавленная глобула - нативное состояние . . . 241 п. 7.4. д. Индуцированный взаимодействием с лигандами переход расплавлен-

ная глобула - нашивное состояние и генетические болезни..............243

п.7.4.е. Основные выводы..........................................................243

§7.5. Искусственные белки альбебетин и альбебетин с фрагментом интерферона находятся в состоянии расплавленной глобулы....................244

п. 7.5. а. Введение......................................................................244

п. 7.5.6. Спектры кругового дихроизма алъбебетина и альбебетина с фрагментом интерферона в ближней УФ области............................246

п. 7.5.в. Белки de novo имеют выраженную вторичную структуру..............247

п. 7.5.г. Искусственные белки компактны..........................................247

п. 7.5.д. Стабильность искусственных белков. Разворачивание................249

п. 7.5. е. Искусственные белки альбебетин и альбебетин с фрагментом интерферона находятся в состоянии расплавленной глобулы..............252

п. 7.5. лс. Основные выводы..........................................................253

ГЛАВА VIII. МОЖЕТ ЛИ УМЕНЬШЕНИЕ ДИЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ СРЕДЫ ВЫЗЫВАТЬ ПЕРЕХОД БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ В СОСТОЯНИЕ РАСПЛАВЛЕННОЙ ГЛОБУЛЫ? . . . 254

§8.1. Введение............................................................................254

§8.2. Условия эксперимента............. ................................256

§8.3. Индуцированные метанолом структурные изменения в ß-лактогло-

булине..............................................................................258

п. 8.3.а. Денатурация белка. Спектры КД в ближней УФ области............258

п.8.3.6. Изменение вторичной структуры (Спектры КД в дальней УФ области) ........................................................................259

п.8.3.в. Изменение компактности (Триптофановая флуоресценция)............260

п. 8.3.г. Взаимодействие с гидрофобным флуоресцирующим зондом (Затухание флуоресценции АНС)....................................................262

п. 8.3. д. Индуцированное метанолом промежуточное состояние белковой

молекулы......................................................................263

§8.4. Влияние других органических растворителей на структурные свойства

ß-лактоглобулина................................................................266

п. 8.4. а. Денатурация (Спектры КД в ближней УФ области)....................266

п.8.4.6. Изменение вторичной структуры (Спектры КД в дальней УФ области) ........................................................................267

п. 8.4. в. Изменение компактности (Триптофановая флуоресценция)..........268

п. 8.4.г. Взаимодействие с АНС....................................................268

п. 8.4. д. Расплавленная глобула, индуцированная уменьшением диэлектрической проницаемости раствора...................... 270

§8.5. Заключение.................................... 273

ГЛАВА IX. СТРУКТУРНЫЕ СВОЙСТВА ОНКО-ЭМБРИОНАЛЬНОГО БЕЛКА ос-ФЕТОПРОТЕИНА. МОДЕЛИРОВАНИЕ КОНФОРМАЦИ-ОННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ФУНКЦИОНИРОВАНИЕМ БЕЛКА ................................. 274

§9.1. Введение...................................... 274

§9.2. Условия эксперимента............................. 279

§9.3. Новая схема выделения а-фетопротеина из пуповинной сыворотки человека ....................................... 284

п. 9. З а. Процедура очистки АФП. Первая стадия - очистка на колонке с голубой сефарозой.............................. 285

п. 9.3. б. Процедура очистки АФП. Вторая стадия - очистка на колонке с Бе-

ркагоБе 4В - М2+............................... 286

п.9.3.в. Процедура очистки АФП. Третья стадия - очистка на колонке с Бе-

рИагозе 4В - Си2+.............................. 287

п.9.3.г. Процедура очистки АФП. Четвертая стадия - очистка на обращен-

нофазовой колонке.............................. 288

п.9.3.д. Эффективность очистки АФП..................... 289

§9.4. Структурные свойства АФП при низких значенияхрН.......... 292

п.9.4.а. Влияние понижениярНна третичную структуру белка (Спектры

КД в ближней УФ области и кривые температурного плавления) . . . 292 п.9.4.б. Влияние рН среды на вторичную структуру АФП (Спектры КД в

дальней УФ области)............................ 295

п.9.4.в. Влияние рН среды на компактность молекулы АФП (Спектры трип-

тофановой флуоресценции)........................ 295

п.9.4.г. Взаимодействие АФП с гидрофобным флуоресцирующим зондом

АНС..................................... 296

п. 9.4. д. Влияние рН среды на устойчивость АФП к разворачиванию мочевиной ..................................... 297

п.9.4.е. Понижение рН среды переводит молекулу АФП в состояние расплавленной глобулы............................... 298

§9.5. Влияние лигандов на структурные свойства АФП. Стабилизация белка

сахарозой..................................... 299

п. 9.5. а. Введение.................................. 299

п.9.5.6. Исследование устойчивости свежевыделенного АФП к изменению

температуры и рН среды......................... 300

п. 9.5. в. Исследование устойчивости АФП, лиофилизованного из сахарозы, к

тепловой ирН-индуцированной денатурации.............. 301

п. 9.5.г. Исследование устойчивости АФП к индуцированному мочевиной разворачиванию ................................ 303

п.9.5.д. АФП связывает сахарозу специфически................. 305

§9.6. Влияние лигандов на структурные свойства АФП. Удаление природных лигандов приводит к