Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кинетика образования и свойства промежуточных и неправильно свернутых мономерных и агрегированных форм актина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Кинетика образования и свойства промежуточных и неправильно свернутых мономерных и агрегированных форм актина"

На правах рукописи

ПОВАРОВА Ольга Игоревна

КИНЕТИКА ОБРАЗОВАНИЯ И СВОЙСТВА ПРОМЕЖУТОЧНЫХ И НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТЫХ МОНОМЕРНЫХ И АГРЕГИРОВАННЫХ ФОРМ АКТИНА

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург

Научные руководители: доктор физико-математических наук

Константин Константинович ТУРОВЕРОВ, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург кандидат биологических наук Ирина Михайловна КУЗНЕЦОВА, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Владимир Иосифович ВОРОБЬЕВ,

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, Надежда Владимировна КУЛЕВА

Биолого-почвенный факультет, СПбГУ, Санкт-Петербург

Ведущая организация: Институт экспериментальной и теоретической

биофизики РАН, Пущино

Защита состоится "28" октября 2005 года в 15 ч. на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН. Автореферат разослан "24" сентября 2005 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, а

кандидат биологических наук Е. В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Вопрос о том, как белки сворачиваются в уникальное компактное высокоорганизованное функционально-активное состояние, является одним из центральных вопросов физико-химической и клеточной биологии. Основным подходом к решению проблемы фолдинга белков является изучение процессов сворачивания-разворачивания белков и характеристика возникающих при этом промежуточных частично-свернутых и неправильно свернутых состояний.

Стабилизация структуры неправильно свернутых состояний, возникающих в процессе сворачивания-разворачивания белков, часто осуществляется за счет их ассоциации и агрегации. При этом могут возникать как неупорядоченные аморфные агрегаты, так и упорядоченные структуры - амилоидные фибриллы (Kelly, 2000; Fink, 1998). Возникновение неправильно свернутых аморфных агрегированных форм рекомбинантных белков и их аккумуляция в телах включения (Frankel et al., 1990; Wetzel, 1992; Speed et al., 1996) являются существенной проблемой биотехнологии. Фибриллогенез является причиной возникновения ряда тяжких заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, прионные болезни и т.д., которые иногда называют конформационными болезнями (Carrell and Gooptu,1998; Kelly, 1997; Harper and Lansbury 1997; Koo et al., 1999; Hashimoto and Masliah, 1999; Fink, 1998). Таким образом, изучение структуры и путей образования денатурированных частично-свернутых агрегированных (ассоциированных) форм белков важно не только для решения фундаментальной проблемы фолдинга белка, но имеет также большое практическое значение.

Большинство исследований по изучению фолдинга белков выполнено на небольших однодоменных белках, для которых процесс разворачивания является обратимым. Актуальным является изучение путей сворачивания более сложных мультидоменных белков, а также изучение возникающих при этом промежуточных и неправильно свернутых агрегированных форм белков. Актин, один из основных белков системы мышечного сокращения и цитоскелета эукариотических клеток, -чрезвычайно интересная модель для такого рода исследований.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении процессов сворачивания-разворачивания актина. В задачи исследования входило:

1. Выяснить место инактивированного актина в процессах сворачивания-разворачивания актина. j РОС. национальная

J библиотека j

sws®?

2. Изучить свойства инактивированного актина и, в частности, рассмотреть влияние денатуранта на его характеристики.

3. Исследовать кинетику разворачивания актина под действием GdnHCl с тем, чтобы охарактеризовать процесс образования инактивированного актина и выяснить. существуют ли другие промежуточные состояния.

4. Выяснить причины необратимости процесса разворачивания актина in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разворачивание актина проходит через образование двух, до этого неизвестных, кинетических интермедиатов N* и U*, возникающих на ранних стадиях денатурации актина.

2. В состоянии U* макромолекула актина существенно развернута, однако ее свойства отличаются от свойств полностью развернутого актина.

3. Инактивированный актин является ассоциатом неправильно свернутых макромолекул актина, а не промежуточным состоянием белка, как это считалось ранее.

4. Обнаруженное в работе резкое возрастание светорассеяния и флуоресценции АНС при небольших концентрациях гуанидингидрохлорида является результатом образования агрегатов вследствие изменения поверхностного заряда макромолекулы актина.

Научная новизна. Показано существование двух ранее неизвестных кинетических интермедиатов, возникающих на ранних стадиях денатурации актина (N* и U*). Охарактеризован существенно развернутый интермедиат U* и, в частности, показано, что свойства этого интермедиата отличаются от свойств полностью развернутого актина. Установлено, что инактивированный актин не является промежуточным состоянием на пути разворачивания-сворачивания актина, как это считалось ранее, а является результатом неправильного сворачивания белка. Предложена новая схема процессов сворачивания-разворачивания актина, согласно которой обнаруженные кинетические интермедиаты являются промежуточными состояниями на пути разворачивания актина, в то время как инактивированный актин, стабилизация структуры которого происходит за счет ассоциации частично-свернутых денатурированных макромолекул белка, является результатом неправильного сворачивания макромолекулы.

Впервые обнаружены и объяснены аномальные изменения характеристик актина под действием небольших концентраций GdnHCI. С ростом числа ионов Guff1", связанных с белком, увеличивается количество положительных групп на поверхности белка и при некоторой концентрации GdnHCI исходно в целом отрицательно заряженная макромолекула актина становится нейтральной, что приводит к ассоциации макромолекул актина между собой. Установлено, что размеры инактивиро-ванного актина зависят от концентрации денатуранта.

Теоретическое и практическое значение. Новые представления о процессах сворачивания-разворачивания актина, полученные в настоящей работе, существенны для понимания процессов фолдинга этого белка. Обнаружение и характеристика ранее неизвестных интермедиатов, а также выяснение роли инактивированного актина в процессе сворачивания-разворачивания, может явиться основой для проведения дальнейших исследований, направленных на поиск путей ренатурации полностью развернутого актина in vitro. Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.

Существенной методической разработкой является предложенный в работе параметрический метод представления кинетических зависимостей двух независимых экстенсивных характеристик системы. Этот подход, позволивший охарактеризовать свойства вновь обнаруженного кинетического интермедиата актина U*, не только широко используется в нашей лаборатории, но также и другими исследователями в России и за рубежом (см. например, Altschuler et al., 2005).

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Международном симпозиуме "Biological motility: new trends of research" (Пущино, 2001, 2004), на III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), на 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, трех Глав, Выводов и Списка публикаций по теме диссертации. В первой главе дан обзор литературы, посвященной проблеме фолдинга белков и структуре актина. Во второй главе приводится описание использованных в работе материалов и методов исследования. И, наконец, в третьей главе изложены результаты и их обсуждение.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы. В работе использовались препараты актина, выделенные из скелетных мышц кролика с использованием стандартной методики (Pardee and Spudich, 1982). Контроль за нативностью препаратов актина осуществляли путем регистрации параметра А, характеризующего положение спектра флуоресценции (см. ниже). Использовали препараты актина, для которых величина А была не менее 2.53, что соответствует содержанию инактивированного актина не более 4 % (Turoverov et al., 1976). G-актин в буфере G (0.2 ммоль АТФ, 0.1 ммоль СаСЬ, 1ммоль NaN3, 5 ммоль трис-НС1, 0.5 ммоль DTT, pH 8.2) хранили на льду и использовали в течение недели, ежедневно контролируя нативность препарата. Инактивированный актин получали из G-актина путем его инкубирования при температуре 70 °С в течение 30 мин. Концентрацию актина в растворе определяли путем регистрации оптической плотности с помощью спектрофотометра фирмы Hitachi (Япония) с использованием известных данных о коэффициенте молярной экстинкции актина Егso = 1-09 (мг/млу'см"1 (Rees and Young, 1967). В большинстве экспериментов концентрация растворов актина составляла от 0.1 до 0.44 мг/мл.

В работе использованы препараты АНС и NaN-i фирмы Serva; формамид и DTT фирмы Wako; АТФ, трис, СаСЬ, мочевина и GdnHCl фирмы Sigma без дополнительной очистки.

Методы Флуоресцентные измерения были выполнены с использованием спектрофлуориметрической установки со стационарным возбуждением (Туроверов и др., 1998). Спектрофлуориметр оборудован термостатом, поддерживающим постоянную температуру в кювете и в специальной камере, где образцы выдерживали перед измерениями.

Флуоресценцию возбуждали на длинноволновом краю спектра поглощения белка, т.е. в условиях, когда флуоресценция обусловлена исключительно триптофа-новыми остатками. Положение и форму спектра флуоресценции характеризовали величиной параметра А = (I3W / I¡(,5)297, где 1Ш и 1зб5 - интенсивности флуоресценции, зарегистрированные при длинах волн 320 и 365 нм, соответственно; длина волны возбуждающего света 297 нм (Туроверов и др., 1998). Значение величины параметра А и спектры флуоресценции были исправлены на спектральную чувствительность установки. Интенсивность флуоресценции гидрофобного зонда АНС регистрировали при Xmj6= 365 нм и 1/к,{, = 480 нм.

Все кинетические эксперименты были выполнены в микрокюветах I01.016-QS 5*5 мм (Helma, Germany). При проведении кинетических экспериментов перевод белка в растворы с различной концентрацией GdnHCI выполнялся путем ручного смешивания раствора белка (50 мкл) с буфером, содержащим соответствующую концентрацию GdnHCI (350 мкл). В экспериментах по ренатурации необходимую концентрацию GdnHCI получали разведением растворов актина в 4 М GdnHCI G-буфером. Измерение быстрой кинетики выполняли с помощью аппаратуры стоп-флоу MOS 450 фирмы Bio-Logic в лаборатории д-ра Форже (CEA, Гренобль). Конечная концентрация GdnHCI в растворах контролировалась по показателю преломления с использованием рефрактометра Abbe (JTOMO).

Для построения кинетических кривых анизотропии флуоресценции использовали временные зависимости вертикальной и горизонтальной составляющей интенсивности флуоресценции, на основании которых определяли анизотропию:

,=(/; -G/;,)/(/f+2G/;;) где if и /'„ - вертикальная и горизонтальная компоненты интенсивности флуоресценции, возбуждаемой вертикально поляризованным светом, G - коэффициент, характеризующий различие чувствительности установки к вертикально и горизонтально поляризованному свету (G = /," //,''). Для посгроения кинетических кривых параметра А использовались временные зависимости интенсивности флуоресценции, зарегистрированные при длинах волн 320 и 365 нм, на основании которых определяли значение параметра/!.

Для анализа зарегистрированных кинетических зависимостей интенсивности флуоресценции был использован метод "фазовых диаграмм", основанный на построении параметрических зависимостей двух независимых экстенсивных характеристик, в качестве которых были использованы интенсивности флуоресценции, измеренные при длинах волн 320 и 365 нм. Параметром выступало время, прошедшее после добавления к нативному актину растворов GdnHCI различной концЯегрнцряция спектров КД дальней УФ-области была выполнена с использованием дихрографа Mark V (Jobin-Y von, USA) и спектрополяриметра J-810 (Jasco, Япония). Длина оптического пути используемых кювет 0.1 см. При построении КД спектра белка учитывался спектр КД растворителя.

Кинетику затухания фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ) регистрировали с помощью автоматизированного высокочувствительного устройства с

монохроматорами в каналах возбуждения и регистрации (Институт фотобиологии НЛН, Минск). Возбуждение фосфоресценции проводили при X = 297 нм, регистрацию кинетики затухания фосфоресценции при X - 445 нм. ФКТ актина измеряли в кварцевой кювете с длиной оптического пути, равной 2 мм. Кислород из растворов белка удаляли с помощью сульфита натрия. Время инкубации с сульфитом натрия составляло 7 мин.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Актин, один из основных белков системы мышечного сокращения, является глобулярным двухдоменным белком. При низкой ионной силе актин является мономером (G-актин), в присутствии нейтральных солей он полимеризуется с образованием двухнитевой спирали (F-актин). F-актин является основным компонентом тонких филаментов мышечной ткани. В состав макромолекулы входит одна молекула АТФ и прочно связанный двухвалентный катион Са2+ (Kabsch et al„ 1990, рис. 1).

До недавнего времени считалось, что процесс сворачивания-разворачивания актина проходит через стадию образования промежуточного состояния, получившего название инактивированного актина. Впервые инактивированный актин был охарактеризован в работе Jlepepa и Кервера (Lehrer and Kerwar, 1972). Было показано, что отщепление катиона кальция приводит к необратимому переходу актина в денатурированное состояние, в котором белок не способен к полимеризации. Позднее было установлено, что инактивированный актин может быть получен из натив-ного белка также в результате тепловой денатурации, под воздействием умеренных концентраций мочевины или GdnHCl, путем диализа из растворов 8 М мочевины или 6 М GdnHCl и даже спонтанно при длительном хранении препаратов (Nagy and Jencks, 1962; Kuznetsova et al., 1988; Bertazzon et al„ 1990).

Характер равновесных (а точнее квазиравновесных) зависимостей ряда флуоресцентных характеристик актина от концентрации гуанидингидрохлорида (GdnHCl), казалось бы, однозначно свидетельствует о существовании двух последо-

Рис 1 Пространственная структура молекулы актина

Рис 2 Изменение параметров собственной флуоресценции актина под действием С^пНС1 (Ки/пе(50Уае!а1., 1999а) / -интенсивность флуоресценции, зарегистрированная при длине волны 320 нм (/згиУ, 2 - параметр А - (¡321/1365)297', 3 - анизотропия флуоресценции, г; открытые и закрытые символы - эксперименты по денатурации и ренатурации соответственно

[СЫпнсм], м

вательных конформационных переходов и о существовании области концентраций Ос1пНС1, в которой актин находится преимущественно в инактивированном состоянии (рис. 2). На основании подобного рода данных во всех без исключения работах, посвященных денатурации актина, считалось, что инактивированный актин является промежуточным состоянием между нативным и полностью развернутым состоянием белка. В эту схему, однако, совершенно не укладываются данные о том, что инактивированный актин является термодинамически стабильным монодисперсным ассоциатом (Кигп^воуа е1 а!., 1999Ь). В связи с этим в настоящей работе было предпринято более тщательное, с привлечением новых методических подходов, исследование равновесных (квазиравновесных) денатурационных зависимостей, а также кинетики разворачивания актина и образования инактивированного актина.

Кинетика денатурации актина

Переход от нативного к инактивированному актину необратим. Поэтому в области концентраций С<ЗпНС1 01 0 до 0.8 М зависимости флуоресцентных характеристик актина от концентрации денатуранта носят квазистационарный характер. Это обстоятельство, а также то, что инактивированный актин, является ассоциатом и должен образовываться путем постепенного наращивания массы, определило необходимость изучения кинетики денатурации актина.

Существенно развернутый кинетический интермедиат, предшествующий образованию инактивированного актина. Характер кинетических зависимостей интенсивности флуоресценции, параметра А и анизотропии триптофановой флуоресценции (кривые с минимумом при концентрациях Сс1пНС1 1.2 - 1.5 М; рис. 3)

Рис 3 Кинетические кривые денатурации актина под действием 0(1пНС1 различной концентрации (а) Изменение интенсивности собственной флуоресценции актина при ХреГ = 320 нм (б) Изменение параметра А (в) Изменение анизотропии флуоресценции Числа - концентрация Ос1пНС1 (М)

свидетельствует о том, что переход из нативного состояния в инактивированное осуществляется через некоторое промежуточное состояние, в котором интенсивность флуоресценции, параметр А и величина анизотропии флуоресценции меньше, чем в нативном и в инактивированном состояниях. Как известно, среди трех кон-формационных состояний актина (нативного, инактивированного и полностью развернутого), наименьшие значения интенсивности при длине волны 320 нм, величины параметра А и величины анизотропии флуоресценции имеет актин в полностью развернутом состоянии. На основании этого было сделано заключение, что переход от нативного к инактивированному актину осуществляется через стадию существенного разворачивания макромолекулы белка:

N —> 1Г ,

где к, - константы скорости соответствующих процессов и и* — существенно развернутый кинетический интермедиат, флуоресцентные свойства которого сходны со свойствами полностью развернутого актина.

В предположении справедливости предложенной кинетической схемы были определены константы скоростей к„ и их зависимость от концентрации Ос1пНС1 (рис. 4). Константа скорости к3, как и следовало ожидать, практически равна нулю. При небольших концентрациях Ос1пНС1 величина к2 значительно больше, чем величина к!. Значит, лимитирующей стадией при этих условиях является стадия разворачивания белка, в то же время после разворачивания молекулы быстро переходят

в состояние инактивированного актина С увеличением концентрации Ос1пНС1 константа скорости к) увеличивается, а константа скорости к2 уменьшается. Это приводит к накоплению существенно развернутого интермедиата на ранних стадиях в процессе денатурации и, как следствие, к появлению характерного минимума на кинетических кривых.

Проведено измерение кинетических зависимостей интенсивности флуоресценции актина при его разворачивании под действием мочевины и формамида различной концентрации, аналогичные тем, которые были выполнены при использовании в качестве денатуранта Ос1пНС1. Полученные данные подтверждают справедливость заключения о том, что возникновению инактивированного актина предшествует стадия существенного разворачивания макромолекулы белка.

Кинетика образования инактивированного актина. Для изучения кинетики образования инактивированного актина, возможно, более удобно использовать характеристики, которые отражают изменение содержания только этого компонента системы и не зависят от наличия других компонент. Такой характеристикой может быть, в первую очередь, интенсивность флуоресценции АНС, и, в какой-то мере, -интегральная интенсивное!ь и среднее время за!ухания фосфоресценции при комнатной температуре.

Флуоресценция АНС Известно, что АНС не связывается с нативным и полностью развернутым актином, но эффективно связывается с инактивированным актином и интенсивно флуоресцирует в его присутствии в растворе. Есть все основания полагать, что краситель не будет связываться с вновь обнаруженным существенно развернутым кинетическим интермелиатом, предшествующим образованию инактивированного актина. А если эю гак, то кинетические зависимости интенсивности флуоресценции АНС при разворачивании актина Сс1пНС1 будут отражать исключительно изменение содержания инактивированного актина в системе.

Кинетические зависимости изменения интенсивности флуоресценции АНС при переводе нативного актина в растворы с различным содержанием Ос1пНС1 (рис.

0 06

- 0 04

- 0 02

0 00

00 05 1 0 1 5 20 [Ос1пНС1], М

Рис. 4. Зависимость констант скоростей (к,) денатурации актина от концентрации Сс1пНС1

5, а) свидетельствуют о том, что начальная скорость образования продукта, связывающего АНС, возрастает по мере увеличения конечной концентрации С<ЗпНС1 от 0 до 1.2 М. Однако при концентрациях С!с1пНС1 1.0, 1.1 и 1.2 М скорость образования этого продукта вскоре существенно замедляется, так что через 10 мин после начала инкубации актина в растворах 0(1п11С1 максимальная концентрация этого продукта имеет место при конечной концентрации 0.9 М Ос1пНС1. При меньших концентрациях этот процесс осуществляется дольше из-за низкой скорости превращения N —► и*, а при более высоких - из-за замедления процесса и* —> I. Зависимости интенсивности флуоресценции АНС от концентрации Ос1пНС1, зарегистрированные через 10 мин и через 24 ч после начала инкубации, существенно различаются (рис. 5, б).

Рис 5 Денатурация актина под действием 0(1пНС1, зарегистрированная путем измерения интенсивности гидрофобного зонда АНС (а) Кинетические кривые денатурации актина под действием 0<1пНС1 различной концентрации Числа - концентрация Ос1пНС1 (М), (б) квазистационарные зависимости интенсивности флуоресценции АНС от концентрации 0(1пНС1, измеренные через 10 мин (/) и через 24 ч (2) инкубации в растворах 0(1пНС1

Фосфоресценция при комнатной температуре. К настоящему времени установлено, что некоторые белки фосфоресцируют при комнатной температуре. Это обусловлено тем, что необходимая жесткость микроокружения триптофановых остатков в этих белках обеспечивается структурой самого белка (ЗШипЫш, 1989). Актин относится к числу белков, которые фосфоресцируют при комнатной температуре. Более того, при переходе от нативного актина к инактивированному значение среднего времени затухания <т> ФКТ возрастает в несколько раз (Мажуль и др., 2001). Очевидно, что существенно развернутый кинетический интермедиат не должен фосфоресцировать при комнатной температуре. Поэтому его присутствие в

00

0 100 200 300 400 500 0

2 3 4

[С<1пНС1], М

Время, с

системе должно приводить к уменьшению интегральной интенсивности фосфоресценции и не должно сказываться на среднем времени затухания фосфоресценции, которое будет определяться только соотношением вкладов нативного и инактиви-рованного актина в системе. Эти особенности фосфоресценции актина в различных структурных состояниях были использованы для того, чтобы более подробно охарактеризовать процесс образования инактивированного актина. Если бы процесс образования инактивированного актина из существенно развернутого кинетического интермедиата являлся бы одностадийным процессом, то значение среднего времени жизни фосфоресценции должно было бы быть равным значению соответствующей характеристики инактивированного актина во всем диапазоне изменения интегральной интенсивности от нуля (когда в системе присутствует в основном актин в состоянии и*) до максимального значения. Однако значение этой характеристики возрастает симбатно с увеличением /инт (рис. 6), и это означает, что инакти-вированный актин - ассоциат, состоящий из 15 мономерных единиц, - образуется из существенно развернутого состояния путем постепенного наращивания массы ассоциата:

и*-И,----)► 1,5.

Как и следовало ожидать, время достижения максимальных значений /,п, и <г> ФКТ, отвечающих образованию инактивированного актина, сокращается при увеличении содержания белка в растворе (рис. 6).

Время, мин ч Время, мин ч

Рис 6 Денатурация актина под действием 1 8 М 0<1пНС1 (а) Кинетика изменения среднего времени жизни ФКТ (б) Кинетика изменения интегральной интенсивности ФКТ Конечное содержание актина составляло 0 8, 1 0, 1 5, 2 0 и 2 5 мг/мл, кривые 2, 3,4, 5 и 6, соответственно Кривая I - контроль (инкубация без Ос1пНС1)

Таким образом, данные, полученные с использованием метода ФКТ, подтвердили образование существенно развернутого кинетического интермедиата, предшествующего образованию инактивированного актина, и показали, что превращение инактивированного актина из существенно развернутого кинетического интермедиата осуществляется путем постепенного наращивания массы образующегося ас-социата.

Специфические взаимодействия актина с С<1пНС1

Для объяснения причины сложного характера зависимости интенсивности флуоресценции АНС от концентрации Сс1пНС1 в растворах актина (см. рис. 5) были зарегистрированы аналогичные зависимости для ряда других характеристик, в том числе для интенсивности светорассеяния (рис. 7).

[Ос1пНС1], М [вс1пНС1], М

Рис 7 Зависимость интенсивности флуоресценции АНС (а) и светорассеяния (б) от концентрации С(1пНС1 для исходно нативного и исходно инактивированного актина, кривые / и 2, соответственно.

Сходство характера зависимостей интенсивности флуоресценции АНС и интенсивности светорассеяния для исходно нативного и исходно инактивированного актина заставляет искать причину обнаруженных эффектов в универсальном характере взаимодействия Ос1пНС1 при его небольших концентрациях в растворе, с макромолекулами белка. Мы объяснили этот эффект взаимодействием групп МН2 катионов 0<ЗпНС1 (ОиН+) с группами С=0 групп глутаминовой и аспарагиновой кислот, глутамина и аспарагина, локализованными на поверхности макромолекулы (рис.8). С ростом числа ионов ОиН+, связанных с белком, увеличивается количество положительных групп на поверхности белка и при некоторой концентрации Ос1пНС1 в целом исходно отрицательно заряженная макромолекула актина стано-

Рис 8 Локализация отрицательно и положительно заряженных групп, а также атомов кислорода групп С=0 на поверхности макромолекулы актина

Панели а и б отличаются друг от друга поворотом молекулы на 180° вокруг вертикальной оси Темно-серые сферы - отрицательно заряженные атомы кислорода групп ОЕ2 и OD2 глутаминовой и аспарагиновой аминокислот; белые сферы - положительно заряженные атомы азота групп NZ, NH1 и NE2 лизина, аргинина и гистидина, черные сферы - атомы кислорода групп С=0 (ОЕ1 Glu, OD1 Asp, ОЕ1 Gin, OD1 Asn)

вится нейтральной. При этом создаются условия ассоциации макромолекул актина между собой. Это и является причиной возрастания светорассеяния и связывания молекул АНС, которые встраиваются между макромолекулами актина, образующими ассоциат. При дальнейшем увеличении концентрации GdnHCl число положительно заряженных групп на поверхности макромолекулы белка начинает превышать число отрицательно заряженных групп. Наличие положительно заряженных групп на поверхности макромолекулы препятствует их ассоциации. То обстоятельство, что зависимости интенсивности флуоресценции АНС и интенсивности светорассеяния от концентрации GdnHCl для исходно нативного и исходно инактивиро-ванного актина имеют некоторые различия, позволяет предположить, что в состав ассоциатов могут входить макромолекулы как нативного актина, так и инактивиро-ванного актина.

Сделан вывод о том, что в растворах GdnHCl размер ассоциатов актина существенно зависит от концентрации денатуранта. Инактивированный актин представляет из себя монодисперсный ассоциат, состоящий из 15 мономерных единиц, лишь в водном растворе в отсутствие GdnHCl.

Новая кинетическая схема процессов сворачивания - разворачивания актина

Для того, чтобы понять роль промежуточного состояния и* в общей схеме процессов сворачивания-разворачивания актина необходимо было охарактеризовать свойства актина в этом состоянии и ответить на вопрос, не идентично ли это состояние полностью развернутому состоянию и.

Свойства кинетического предшественника инактивированного актина. Для выяснения природы кинетического интермедиата, предшествующего образованию инактивированного актина, кинетические зависимости интенсивности флуоресценции, измеренные при длинах волн 320 и 365 нм, были использованы для построения параметрических зависимостей (рис. 9). Характер параметрической зави-

Рис. 9. Параметрические зависимости между интенсивностью флуоресценции 1ш и /зб5, характеризующие кинетику разворачивания нагивного акт на под действием 0(1пНС1 Параметр - время, прошедшее после добавления к нативному актину растворов С(1пНС1 различной концентрации Числа - концентрация 0(1пНС1, (М). Длительность эксперимента 10 мин. Символы большего размера - результат измерений после инкубации растворов в течение 24 ч За единицу принята интенсивность флуоресценции нативного актина при Хрет= 320 нм М, I, и*, и - нативный, инактивиро-ванный, существенно развернутый и пол-0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 ностью развернутый актин

/365, отн. ед.

симости при денатурации актина под действием 1.8 М С(1пНС1 однозначно свидетельствует о существовании кинетического интермедиата между нативным и инак-тивированным актином. Точка на диаграмме, в которой пересекаются прямые, отвечающие процессу разворачивания нативного актина (Ы —> II*) и процессу образования инактивированного актина из существенно развернутого состояния (и* —> I), характеризует свойства кинетического интермедиата (и*). Величина параметра А, для кинетического интермедиата оказалась выше соответствующей величины для полностью развернутого актина. Этот результат позволил сделать заключение о том, что свойства кинетического интермедиата не идентичны свойствам полностью развернутого актина в 6М Ос1пНС1. Характер параметрических зависимостей между

/320 и Абч для концентраций Ос1пНС1 меньше, чем 1.8 М, свидетельствует о том, что в любой момент времени в растворе существует более чем две компоненты. Таким образом, характер параметрических зависимостей свидетельствует о том, что образование инактивированного актина происходит через стадию образования существенно развернутого белка, хотя время жизни этого состояния уменьшается с уменьшением конечной концентрации Ос1пНС1.

С использованием методов КД и флуоресценции гидрофобного зонда АНС было показано, что обнаруженный интермедиат сохраняет (в отличие от полностью развернутого состояния) выраженную вторичную структуру и не имеет (в отличие от инактивированного актина) гидрофобных кластеров, способньгх связывать АНС.

Быстрая кинетика. Несколько неожиданным результатом построения параметрических зависимостей явилось то обстоятельство, что зависимости, отвечающие процессам разворачивания актина под воздействием Сс1пНС1 различной концентрации, исходят не из одной точки, соответствующей нативному белку (N1), а из разных точек (см. рис. 9). Одно из возможных объяснений этого эффекта состоит в предположении существования быстрого конформационного превращения, которое невозможно выявить в кинетических экспериментах без применения специальной

аппаратуры. Для проверки этого предположения были выполнены эксперименты по изучению быстрой кинетики структурных превращений актина под действием Ос1пНС! различной концентрации (Рис. 10) с использованием оборудования стоп-флоу. Эти эксперименты подтвердили предположение о существовании интерме-диата Ы*, предшествующего образованию

04 06 08 Время, с

Рис 10 Быстрая кинетика разворачи- существенно развернутого кинетического вания актина под действием 0<1пНС1

Числа - концентрация ОёпНС! (М)

интермедиата и*.

Кинетика перехода инактивированный актин - полностью развернутый актин. Для более полного изучения процессов сворачивания - разворачивания актина было проведено изучение кинетики денатурации инактивированного актина. Результаты стационарных экспериментов (Тиго\его\' е1 а!., 1999) свидетельствуют о

том, что этот процесс обратим, и протекает в области концентраций Ос1п11С1 от 1.8 до 3.5 М с серединой перехода при 2.5 М. Кинетические зависимости интенсивности флуоресценции при изменении концентрации Ос1пНС1 от 1.8 до 4.0 М и от 4.0 до 1.8 М также доказывают обратимость перехода (рис. 11, а и б). Инактивирован-ный актин не разворачивается полностью даже через 24 ч после его перевода в раствор в 4М Сс1п11С1 (рис. 11, а), в то время как нативный актин при тех же условиях полностью разворачивается через 10 с (рис. 11, в). Это связано с тем, что инактиви-рованный актин представляет ассоциат, и необходимо некоторое время для того, чтобы этот ассоциат был разрушен. Следует отметить, что переход от полностью развернутого актина к инактивированному протекает быстрее, чем разворачивание инактивированного актина.

06 -9-1 — 1 06 I 10 08

ч 04 <и V 04 7 ' 06

X ч 1 1 04

02 I . 02 ¿и--1 1 1 // 02

0 10 20 24 ч У/ 0 10 20 24 ч

I I

I

-I

Время, мин

Время, мин

0 1 2 Время, мин

Рис 11 Изменение интенсивности собственной флуоресценции актина при конформационном переходе инактивированный актин (I) - полностью развернутое состояние (и) (а) Переход I —» и при изменении концентрации Ос1пНС1 от 1 8 до 4 О М, (б) переход и —► I при изменении концентрации 0<1пНС1 от 4.0 до 1.8 М, (в) денатурация нативного актина, под действием 4.0 М Сс1пНС1.

Нелинейный характер параметрических зависимостей между !т и !365 (рис. 12) и немоноэкспоненциальный закон изменения интенсивности флуоресценции свидетельствуют о том, что переход от инактивированного актина к полностью разверну-

06

5 «5 § 04

§ 03 02

•

■ ■ ' |

08 09 10 11 12 13

/,„, отел

Рис 12 Параметрические зависимости между интенсивностью флуоресценции /12(1 и /!ь5, характеризующие кинетику разворачивания инактивированного актина (/) и частичного сворачивания полностью развернутого актина (2), вызванных изменением концентрации вс1пНС1 от 1 8 до 4.0 М от 4.0 до 1 8 М соответственно Параметр - время, прошедшее после изменения концентрации 0()пНС1 За единицу принята интенсивность флуоресценции нативного актина при Хрег=320 нм (на рисунке эта точка не показана)

тому состоянию и обратный процесс не являются одностадийными. По-видимому, переход от полностью развернутого состояния к инактивированному происходит через стадию образования существенно развернутого кинетического интермедиата (рис. 12; кривая 1).

На основании всех представленных выше данных была предложена следующая схема разворачивания актина под воздействием 0<1пНС1: N и* <-> I,... о !„... о I,

и

Согласно этой схеме, вновь обнаруженные кинетические интермедиаты Ы* и и* являются промежуточными состояниями на пути сворачивания-разворачивания актина, в то время как инактивированный актин, стабилизация структуры которого происходит за счет ассоциации частично-свернутых макромолекул белка, является результатом неправильного сворачивания белка.

ВЫВОДЫ

1 Показано, что разворачивание актина проходит через образование двух вновь обнаруженных интермедиатов № и и*, возникающих на ранних стадиях денатурации актина.

2. Показано, что существенно развернутый кинетический интермедиат и*, предшествующий образованию инактивированного актина, имеет высокий уровень внутримолекулярной подвижности, но сохраняет элементы вторичной структуры и имеет несколько более коротковолновый, по сравнению с полностью развернутым состоянием, спектр флуоресценции.

3. Предложена и обоснована новая схема процессов сворачивания - разворачивания актина, согласно которой вновь обнаруженные кинетические интермедиаты К* и и* являются промежуточными состояниями на пути сворачивания - разворачивания актина, в то время как инактивированный актин, стабилизация структуры которого происходит за счет ассоциации частично-свернутых денатурированных макромолекул белка, является результатом неправильного сворачивания макромолекулы.

4. Показано, что размеры ннактивированного актина зависят от концентрации GdnHCl. Это обусловлено тем, что с ростом числа ионов GuH+, связанных с белком, увеличивается количество положительных групп на поверхности белка и при некоторой концентрации GdnHCl исходно в целом отрицательно заряженная макромолекула актина становится нейтральной, что приводит к ассоциации макромолекул актина между собой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Kuznetsova I.M., Biktashev A G., Stepanenko О. У., Povarova O.I, Shavlovsky M.M., Turoverov К. К. 2001. Inactivated state of actin develops from native one via completely unfolding of protein macromolecule. International symposium " Biological motility: new trends of research". Pushchino, p.89. Turoverov К.К., Verkhusha VV., Shavlovsky M. M, Biktashev A.G., Povarova O.I., Kuznetsova IM. 2002 Kinetics of actin unfolding induced by guanidine hydrochloride. Biochemistry. 41: 1014-1019. Туроверов К.К., Шавловский M.M., Бикташев A.Г, Поварова О.И., Степаненко О.В, Кузнецова И.М. 2002. Кинетика процессов сворачивания - разворачивания актина. Механизм возникновения и свойства ннактивированного актина. Ill Съезд биохимического общества. Тезисы докладов. Санкт-Петербург, стр.526. Kuznetsova I M., Stepanenko OV, Stepanenko О V., Povarova O.I, Biktashev A.G., Verkhusha V.V., Shavlovsky M M., Turoverov K.K. 2002. The place of inactivated actin and its kinetic predecessor in actin folding-unfolding. Biochemistry. 41: 13127-13132. Kuznetsova I.M., Povarova O.I, Stepanenko Olesia V., Stepanenko Olga V, Shavlovsky M.M. and Turoverov К К 2004. Kinetics of formation and properties of on-pathway folding intermediates and misfolded monomeric and aggregated forms of actin. International symposium "Biological motility". Pushchino, p.90 Поварова О.И., Кузнецова И.М, Туроверов К К. 2004 Что является причиной ряда аномальных явлений в растворах актина с низким содержанием гуанидингидро-хлорида? III Съезд биофизиков России. Тезисы докладов. Воронеж, стр.84. Поварова О.И., Кузнецова ИМ и Туроверов К К 2005 Новая схема процессов сворачивания - разворачивания и физико-химические свойства актина в различных структурных состояниях. Цитология. 47: 953-977. Мажуль В M, Зайцева ЕМ, Поварова О.И, Шавловский ММ, Кузнецова ИМ и Туроверов К К 2005 Фосфоресценция при комнатной температуре интермедиатов

сворачивания белков, а также аморфных агрегатов и амилоидных фибрилл, возникающих в результате неправильного фолдинга белков. Цитология. 47: 978-987.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Туроверов К К, Бикташев А Г., Дорофеюк А. В, Кузнецова И М. 1998 Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе. Цитология. 40: 806-817.

Altschuler G. M., Klug D R, Willison K.R. 2005. Unfolding energetics of G-a-Actin: а discrete intermediate can be re-folded to the native state by CCT. J Mol. Biol. Available online at www.sciencedirect.com.

Bertazzon A., Tian G. H., Lamblin A., Tsong T. Y. 1990. Enthalpic and entropie contributions to actin stability: calorimetry, circular dichroism and fluorescence study and effect of calcium. Biochemistry. 29: 291-298.

Carrell R. W„ Gooptu B. 1998. Conformational changes and disease-serpins, prions and Alzheimer's. Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 799-809.

Fink A. L 1998 Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Fold. Des. 3: R9-23.

Frankel S., Condeelis J., Leimvand L 1990. Expression of actin in Escherichia coli: Aggregation, solubilization, and functional analysis. J. Biol. Chem. 265:17980-17987.

Harper J D„ Lansbury P. T. Jr 1997. Models of amyloid seeding in Alzheimer's disease and scrapie: mechanistic truths and physiological consequences of the time-dependent solubility of amyloid proteins. Ann. Rev. Biochem. 66: 385-407.

Hashimoto M, Masliah E. 1999 Alpha-synuclein in Lewy body disease and Alzheimer's disease. Brain Pathol. 9: 707-720.

Kabsch W„ Mannherz H. G„ Suck D„ Pai E. F„ Holmes H. C. 1990. Atomic structure of the actin: DNase I complex. Nature. 347: 37-44.

Kelly J. W. 1997. Amyloid fibril formation and protein misassembly a structural quest for insight into amyloid and prion diseases. Structure 5: 595-600.

Kelly J. W. 2000. Mechanisms of amyloidogenesis. Nature Struct. Biol. 7: 824-826.

Koo E H„ Lansbury P. T. Jr, Kelly J W 1999 Amyloid disease abnormal protein aggregation in neurodegeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 9989-9990.

Kuznetsova 1 M, Khaitlina S. Yu., Konditerov S. N.. Surin A M., Turoverov K. K. 1988 Changes of structure and intermolecular mobility in the course of actin denaturation. Biophys. Chem. 32: 73-78. Kuznetsova 1. M, Biktashev A G, Khaitlina S. Yu, Vassilenko K S, Turoverov K. K, Uversky V N 1999a Effect of self-association on the structural organization of partially folded proteins: inactivated actin. Bioph. J. 77: 2788-2800. Kuznetsova f. M, Turoverov K K., Uversky V N 1999b Inactivated actin, and aggregate comprised of partially-folded monomers, has a overall native-like packing density. Protein Peptide Lett. 6: 173-178. Lehrer S. L„ Kerwar G 1972 Intrinsic fluorescence of actin. Biochemistry. 11: 12111217.

Nagy B, Jencks W P 1962 Optical rotatory dispersion of G-actin. Biochemistry. 1: 987996.

Pardee J. D„ Spudich J A 1982. Purification of muscle actin. Mcth. Enzymol. 85: 164181.

Rees M. K, Young M. 1967 Stadies on the isolation and molecular properties of homogeneous globular actin. Evidence for a single polypeptide chain structure. J. Biol. Chem. 242: 4449-4458.

Speed M A., Wang D I, King J. 1996. Specific aggregation of partially folded polypeptide chains: the molecular basis of inclusion body composition. Nat. Biotechnol. 14: 1283-1287.16.

Strambini G.B. 1989. Tryptophan phosphorescence as a monitor of protein flexibility J.

Mol. Liq. 42: 155-163. Turoverov K. K, Khaitlina S Yu., Pinaev G P 1976. Ultra-violet fluorescence of actin.

Determination of native actin content in actin preparations. FEBS Lett. 62: 4-7. Turoverov K. K, Biktashev A G, Khaitlina S Yu , Kuznetsova 1 M 1999a The structure

and dynamics of partially folded actin. Biochemistry. 38: 6261-6269. Wetzel R. 1992 in Protein Engineering. A Practical Approach (Rees A. R., Sternberg A. R., Wetzel R„ Eds.) pp 191-219, IRL Press, Oxford.

Лицензия ЛР №020593 от 07.08.97

Подписано в печать 19.09.2005. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,25. Тираж 130. Заказ 76Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом Типографском Центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29.

m 72 00

РНБ Русский фонд

2006-4 14959

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Поварова, Ольга Игоревна

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность исследования.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна исследований.

Теоретическое и практическое значение работы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления о структуре и фолдинге белков. Промежуточные и неправильно свернутые состояния, их роль в образовании нативного белка и нарушениях фолдинга.

1.1.1. Первичная структура белка определяет его нашивную пространственную структуру и путь сворачивания.

1.1.2. Особенности фолдинга белков в клетке.

1.1.3. Одностадийное кооперативное сворачивание небольших белков.

1.1.4. Сворачивание белков через образование промежуточных состояний

1.1.5. Модель энергетической воронки.

1.1.6. Переходное состояние и ядро сворачивания.

1.1.7. Развернутое состояние белка.

1.1.8. Нативное состояние — отвечает ли оно глобальному минимуму свободной энергии?.

1.1.9. Промежуточные состояния, их роль в образовании агрегированных форм белков.

1.2. Свойства актина в различных структурных состояниях.

1.2.1. Собственная флуоресценция нативного актина. Микроокружение триптофановых остатков и их вклад во флуоресценцию белка.

1.2.2. Инактивированный актин - термодинамически стабильное промежуточное состояние белка.

1.2.3. Вторичная структура нативного и инактивированного актина.

1.2.4. Диэлектрические и релаксационные свойства микроокружения триптофановых остатков нативного и инактивированного актина

1.2.5. Локализация триптофановых остатков в инактивированном актине.

1.2.6. Гидродинамические размеры инактивированного актина.

1.2.7. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков нативного и инактивированного актина.

1.2.8. Свойства поверхности инактивированного актина.

1.2.9. Представляет ли инактивированныи актин структуру типа расплавленной глобулы?.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Получение, очистка и характеристика препаратов актина.

2.2. Флуоресцентные измерения.

4 2.3. Кинетические эксперименты по сворачиванию-разворачиванию актина

2.4. КД измерения.

2.5 Фосфоресцентные измерения.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Кинетика денатурации актина.

3.1.1. Существенно развернутый кинетический интермедиат, предшествующий образованию инактивированного актина.

3.1.2. Кинетические константы процесса денатурации актина

4 гуанидингидрохлоридом.

3.1.3. Кинетика разворачивания актина формамидом.

3.1.4. Кинетика образования инактивированного актина.

3.2. Специфические взаимодействия актина с гуанидингдрохлоридом.

3.3. Новая схема процессов сворачивания-разворачивания актина.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Кинетика образования и свойства промежуточных и неправильно свернутых мономерных и агрегированных форм актина"

Актуальность исследования

Вопрос о том, как белки сворачиваются в уникальное компактное высокоорганизованное функционально-активное состояние, является одним из центральных вопросов физико-химической и клеточной биологии. Основным подходом к решению проблемы фолдинга белков является изучение процессов их сворачивания-разворачивания и характеристика возникающих при этом промежуточных частично-свернутых и неправильно свернутых состояний.

Стабилизация структуры неправильно свернутых состояний, возникающих в процессе сворачивания-разворачивания белков, часто осуществляется за счет их ассоциации и агрегации. При этом могут возникать как неупорядоченные аморфные агрегаты, так и упорядоченные структуры - амилоидные фибриллы (Kelly, 2000; Fink, 1998). Возникновение неправильно свернутых аморфных агрегированных форм рекомбинантных белков и их аккумуляция в телах включения (Frankel et al., 1990; Wetzel, 1992; Speed et al., 1996) является существенной проблемой биотехнологии. Фибриллогенез является причиной возникновения ряда тяжких заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, прионные болезни и т.д., которые иногда называют конформационными болезнями (Carrell and Gooptu, 1998; Kelly, 1997; Harper and Lansbury 1997; Koo et al., 1999; Hashimoto and Masliah, 1999; Fink, 1998). Таким образом, изучение структуры и путей образования денатурированных частично-свернутых агрегированных (ассоциированных) форм белков важно не только для решения фундаментальной проблемы фолдинга белка, но имеет также большое практическое значение.

Большинство исследований по изучению фолдинга белков выполнено на небольших однодоменных белках, для которых процесс разворачивания является обратимым. Актуальным является изучение путей сворачивания более сложных мультидоменных белков, а также изучение возникающих при этом промежуточных и неправильно свернутых агрегированных форм белков. Актин, один из основных белков системы мышечного сокращения и цитоскелета эукариотических клеток, -чрезвычайно интересная модель для такого рода исследований.

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в изучении процессов сворачивания-разворачивания глобулярного актина. В задачи исследования входило:

1. Изучение кинетики разворачивания актина и образования инактивированного актина под действием гуанидингидрохлорида (GdnHCl) различной концентрации, поиск возможных кинетических интермедиатов, возникающих при реализации этих процессов.

2. Выяснение места инактивированного актина в процессах сворачивания-разворачивания белка.

3. Изучение влияния GdnHCl на свойства инактивированного актина.

4. Выяснение причин необратимости процесса разворачивания актина in vitro. Научная новизна

Показано существование двух ранее неизвестных кинетических интермедиатов, возникающих на ранних стадиях денатурации актина (N* и U*). Охарактеризован существенно развернутый интермедиат U* и, в частности, показано, что свойства этого интермедиата отличаются от свойств полностью развернутого актина. Предложена новая схема процессов сворачивания-разворачивания актина, согласно которой обнаруженные кинетические интермедиаты являются промежуточными состояниями на пути разворачивания актина, в то время как инактивированный актин является ассоциатом частично-свернутых денатурированных макромолекул белка.

Показано, что инактивированный актин является монодисперсным ассоциатом лишь в водном растворе. В присутствии GdnHCl происходит агрегация ассоциатов. Размеры агрегатов инактивированного актина зависят от концентрации денатуранта. Эффект объяснен изменением поверхностного заряда инактивированного актина при его взаимодействии с ионами GuH1".

Теоретическое и практическое значение

Новые представления о процессах сворачивания-разворачивания актина, полученные в настоящей работе, существенны для понимания процессов фолдинга этого белка. Обнаружение и характеристика ранее неизвестных интермедиатов, а также выяснение роли инактивированного актина в процессе сворачивания-разворачивания, может явиться основой для проведения дальнейших исследований, направленных на поиск путей ренатурации полностью развернутого актина in vitro. Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.

Существенной методической разработкой является использование параметрического метода представления экспериментальных данных по денатурации белков (Бурштейн, 1976) для анализа результатов кинетических экспериментов. Этот подход, позволивший охарактеризовать свойства вновь обнаруженного кинетического интермедиата актина U*, не только широко используется в нашей лаборатории, но и другими исследователями (см. например, Altschuler et al., 2005).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Поварова, Ольга Игоревна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что разворачивание актина проходит через образование двух вновь обнаруженных кинетических интермедиатов N* и U*, возникающих на ранних стадиях денатурации актина.

2. Показано, что существенно развернутый кинетический интермедиат U*, предшествующий образованию инактивированного актина, имеет высокий уровень внутримолекулярной подвижности, но сохраняет элементы вторичной структуры и имеет несколько более коротковолновый, по сравнению с полностью развернутым состоянием, спектр флуоресценции.

3. Предложена и обоснована новая схема процессов сворачивания-разворачивания актина, согласно которой вновь обнаруженные кинетические интермедиаты N* и U* являются промежуточными состояниями на пути сворачивания-разворачивания актина, в то время как инакгивированный актин образуется в результате ассоциации частично-свернутых денатурированных макромолекул белка. Последнее является причиной необратимости процесса разворачивания актина in vitro.

4. Показано, что в присутствии GdnHCl происходит агрегация инактивированного актина (агрегация ассоциатов), обусловленная изменением поверхностного заряда инактивированного актина при его взаимодействии с ионами GuH*.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Поварова, Ольга Игоревна, Санкт-Петербург

1. Бландел Т. и Джонсон Л. 1979. Кристаллография белка. М: "Мир", 620 с.

2. Бычкова В.А. и Птщын О.Б. 1995. Функциональное состояние денатурированных белков: принципы моделирования и первые результаты. Цитология. 37: 12381250.

3. Гилъманшин Р.И., Долгих Д.А., Птщын O.E., Финкельштейн A.B. и Шахнович Е.И. 1982. Белковые глобулы без уникальной пространственной структуры: экспериментальные данные для а-лактальбуминов и общая модель. Биофизика. 27: 1005-1015.

4. Кузнецова И.М., Хайтлина С.Ю., Туроверов К.К. и Пинаев Г. П. 1981. Поляризация УФ-флуоресценции актина. Биофизика. 26: 762-764.

5. Кузнецова И.М. и Туроверов К.К. 1983. Поляризация собственной флуоресценции белков. III. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков. Мол.биол. 17: 741-754.

6. Кузнецова И.М. и Туроверов К.К. 1998. Что определяет характеристики собственной УФ-флуоресценции белков? Анализ свойств микроокружения и особенностей локализации их триптофановых остатков. Цитология. 40(8/9): 747-762.

7. Кузнецова И.М., Хайтлина С.Ю. и Туроверов К.К. 1998. Структурные свойства инактивированного актина: интермедиат формируется в процессе сворачивания-разворачивания актина. Биоорганическая химия. 24:783-791.

8. Родионова H.A., Семисотнов Г.В., Кутышенко В.П., Уверский В.Н., Болотина H.A., Бычкова В.Е. и Птщын О.Б. 1989. Стадийность равновесного разворачивания карбоангидразы В сильными денатурантами. Мол. биол. 23: 683-692.

9. Татунашвили JI.B. и Привалов П.Л. 1984. Калориметрическое исследование денатурации G-актина. Биофизика 29: 583-585.

10. Тенфорд Ч. 1965. Физическая химия полимеров. Изд. "Химия". М.

11. Туроверов К. К. и Кузнецова И. М. 1983. Поляризация собственной флуоресценции белков. II. Использование для изучения равновесной динамики триптофановых остатков. Мол.биол. 17: 468-473.

12. Туроверов К.К., Бикташев А.Г., Дорофеюк А.В. и Кузнецова И. М. 1998. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе. Цитология. 40(8/9): 806-817.

13. Уверский В.Н. 1998. Разнообразие компактных форм денатурированных белков. Дисс. на соискание уч. степени докт. физ. мат. наук, Пущино.

14. Финкелыитейн А.В. 1976. Стереохимический анализ вторичной структуры полипептидной цепи при помощи пространственных моделей Курто. 1.Разрешенные конформации дипептидов. Мол.биол. 10: 507-513.

15. Финкелыитейн А.В. и Птицын О.Б. 2002. Физика белка. М: Книжный дом "Университет", 376 с.

16. Agekyan T.V., Bezborodova S.I., Kuznetsova I.M., Polyakov K.M. and Turoverov K.K. 1988. Spectral and polarizational characteristics of ribonuclease C2. Unusual fluorescence of tyrosine residues. Mol. Biol. 22: 612-623.

17. Akiyama S., Takahashi S., Ishimori K. and Morishima I. 2000. Stepwise formation of a-helices during cytochrome с folding. Nat. Struct. Biol. 7: 514-520

18. Altschuler G. M., Klug D.R., Willison K.R. 2005. Unfolding energetics of G-a-Actin: а discrete intermediate can be re-folded to the native state by CCT. J Mol. Biol. Available online at www.sciencedirect.com.

19. Anfinsen C.B. 1973. Principles that govern the folding of proteins chains. Science. 181: 223-230.

20. Arai M., Inobe Т., Maki K., Ikura Т., Kihara H., Amemiya Y., and Kuwajima K. 2003. Denaturation and reassembly of chaperonin GroEL studied by solution X-ray scattering, Protein Sci. 12,672-680.

21. Bader M.V. and Bardwell J.C.A. 2002. Catalysis of disulfide bond formation and isomerization in Escherichia coli. Adv. Protein. Chem. 59: 283-301.

22. Baldwin R.L. and Rose G.D. 1999. Is protein folding hierarchic? Trends Biochem. Sci. 24: 26-33; 77-83.

23. Bam N.B., Cleland J.L. and Randolph T.W. 1996. Molten globule intermediate of recombinant human growth hormone: stabilization with surfactants. Biotechnol. Prog. 12: 801-809.

24. Dobson C.M. 1992. Unfolded proteins, compact states and molten globules.

25. Curr.Opin.Struct.Biol. 2 :6-12. Dobson C.M. 2003. Protein folding and misfolding. Nature. 18; 426: 884-890.

26. Dobson C.M. 2004. Experimental investigation of protein folding and misfolding. Methods. 34: 4-14.

27. Eftink M. and Ghiron C. A. 1977. Exposure of tryptophanyl residues and proteindynamics. Biochemistry. 16: 5546-5551. Eftink M. and Ghiron C.A. 1981. Fluorescence quenching studies with proteins. Anal.

28. Biochem. 114: 199-227. Eisinger, J., Feuer B. and Lamola A.A. 1969. Intramolecular singlet excitation transfer.

29. Applications to polypeptides. Biochemistry. 8: 3908-3915. Ellis R.J. and Hartl F. U. 1999. Principles of protein folding in the cellular environment.

30. Fersht A. 1998. Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme

31. Catalysis and Protein Folding. W.H. Freeman and Company, N. Y., p. 631. Forster Th. 1960. Transfer mechanisms of electronic excitation energy. Rad. Res. Suppl. 2: 326-339.

32. Frankel S., Condeelis J. and Leinwand L. 1990. Expression of actin in Escherichia coli: Aggregation, solubilization, and functional analysis. J. Biol. Chem. 265: 17980-17987.

33. Goldbeck R.A., Kim-Shapiro D.B. and Kliger D.S. 1997. Fast natural and magnetic circular dichroism spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem.48,453-479.

34. Gezimati J., Singh H. and Creamer L.K. 1996. Heat-induced interactions and gelation of mixtures of bovine beta-lactoglobulin and serum albumin. J.Agricult. and Food Chem. 44: 804-810.

35. Gilbert H.F. 1994. Protein chaperones and protein folding. Cur. Opin. Struct. Biol. 5: 534539.

36. Goers J., Permyakov S.E., Permyakov E.A., Uversky V.N. and Fink A.L. 2002. Conformational prerequisites for alpha-lactalbumin fibrillation. Biochemistry. 41: 12546-12551.

37. Gokhale R.S., Agarwalla S., Santi D. V. and Balaram P. 1996. Covalent reinforcement of a fragile region in the dimeric enzyme thymidylate synthase stabilizes the protein against chaotrope-induced unfolding. Biochemistry. 35: 7150-7158.

38. Gonnelli M. and Strambini G.B. 1993. Glycerol effects on protein flexibility: a tryptophan phosphorescence study. Biophys J. 65: 131-137.

39. Harper J.D. and Lansbury P.T. Jr. 1997. Models of amyloid seeding in Alzheimer's disease and scrapie: mechanistic truths and physiological consequences of the time-dependent solubility of amyloid proteins. Ann. Rev. Biochem. 66: 385-407.

40. Hartl F. U. and Martin J. 1995. Molecular chaperones in cellular protein folding. Cur. Opin. Struct. Biol. 5:92-102.

41. Hashimoto M. and Masliah E. 1999. Alpha-synuclein in Lewy body disease and Alzheimer's disease. Brain Pathol. 9: 707-720.

42. Humphrey W., Dalke A. and Schulten K. 1996. VMD: visual molecular dynamics, J. Molec. Graphics. 14:33-38.

43. Jablonski A. 1957. Decay of fhotoluminescence of solutions. Acta Phys. Polon. 16: 471479.

44. Joly M. 1965. A Physico-Chemical Approach to the Denaturation of Proteins. In Molecular Biology an International Series of Monographs and Textbooks. Horecker B., Kaplan N.O. Scheraga H.A., editors. Vol. 6. Academic Press. London. New York.

45. Kabsch W., Mannherz H.G., Suck D., Pai E.F. and Holmes H.C. 1990. Atomic structure of the actin: DNase I complex. Nature. 347: 37-44.

46. Kelly J. W. 1997. Amyloid fibril formation and protein misassembly a structural quest for insight into amyloid and prion diseases. Structure. 5: 595-600.

47. Kelly J. W. 2000. Mechanisms of amyloidogenesis. Nature Struct. Biol. 7: 824-826.

48. Koo E.H., Lansbury P.T. Jr, Kelly J.W. 1999. Amyloid disease abnormal protein aggregation in neurodegeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 9989-9990.

49. Kuznetsova I.M., Khaitlina S.Yu., Konditerov S.N., Surin A.M. and Turoverov K.K. 1988. Changes of structure and intermolecular mobility in the course of actin denaturation. Biophys. Chem. 32: 73-78.

50. Kuznetsova I.M., Biktashev A.G., Khaitlina S.Yu., Vassilenko K.S., Turoverov K.K. and Uversky V.N. 1999a. Effect of self-association on the structural organization of partially folded proteins: inactivated actin. Bioph. J. 77: 2788-2800.

51. Kuznetsova I.M., Turoverov K.K, Uversky V. N. 1999b. Inactivated actin, and aggregate comprised of partially-folded monomers, has a overall native-like packing density. Protein Peptide Lett. 6: 173-178.

52. Kuznetsova I.M., Yakusheva T.A., Turoverov K.K. 1999c. Contribution of separate tryptophan residues to intrinsic fluorescence of actin. Analysis 3D structure. FEBS Lett. 452: 205-210.

53. Kuznetsova I.M., Stepanenko O.V., Turoverov K.K., Zhu L., Zhou J.-M., Fink A.L. and Uversky V. N. 2002b. Unravelling multistate unfolding of rabbit muscle creatine kinase. Biochem. Biophys. Acta. 1596: 138-155.

54. Vine H 3rd. 1999. Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309: 274-84.1.vinthal C. 1968. Are there pathways for protein folding? J. Chim. Phys. 65: 44-45.

55. Marquardt D. W. 1963. An algorithm for least-squares estimation of non linear parameters. J. Soc. Ind. Appl. Math. 11: 431-441.

56. Matouschek A., Kellis J.T. Jr, Serrano L. and Fersht A.R. 1989. Mapping the transition state and pathway of protein folding by protein engineering. Nature. 340: 122-126.

57. Matouschek A., Kellis J.T. Jr, Serrano L., Bycroft M. and Fersht A.R. 1990. Transient folding intermediates characterized by protein engineering. Nature. 346: 440-445.

58. Matveyev V.V., Usmanova A.M., Morozova A.V., Collins J.H. and Khaitlina S.Yu. 1996. Purification and characterization of the proteinase ECP 32 from Escherichia coli A2 strain. Biochim. Biophys. Acta. 1296: 55-62.

59. Mazhul' V M., Zaitseva E.M., Shavlovsky M.M., Stepanenko Olesia V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2003. Monitoring of Actin Unfolding by Room Temperature Tryptophan Phosphorescence. Biochemistry. 42: 13551-13557.

60. Melanie R.N. 2004. Techniques to study amyloid fibril formation in vitro, Methods. 34: 151-160.

61. Merritt E.A. and Bacon D.J. 1977. Raster3D: Photorealistic molecular graphics. Methods in enzymol. 277: 505-524.

62. McLaughlin P.J., GoochJ.T., Mannherz H.G. and Weeds A.G. 1993. Structure of gelsolin segment 1-actin complex and the mechanism of filament severing. Nature. 364: 685692.

63. Mulqueen P.M. and Kronman M.J. 1982. Binding of naphthalene dyes to the N and A conformers of bovine alpha-lactalbumin. Arch Biochem Biophys. 215: 28-39.

64. Nagy B. and Jencks W.P. 1962. Optical rotatory dispersion of G-actin. Biochemistry. 1: 987-996.

65. Nagy B. and Strzelecka-Golaszewska H. 1972. Optical rotatory dispersion and circular dichroic spectra of G-actin. Arch. Biochem. Biophys. 150: 428-435.

66. Netzer W.J. and Hartl F. U. 1998. Protein folding in the cytosol: chaperonin-dependent and-independent mechanisms. Trends Biochem. Sci. 23:2:68-73.

67. Otterbein L.R., Gracejfa P. and Dominquez R. 2001. The crystal structure of uncomplexed actin in the ADP state. Science. 293: 708-711.

68. Pardee J.D. and Spudich J. A. 1982. Purification of muscle actin. Meth. Enzymol. 85: 164181.

69. Permyakov E.A., Yarmolenko V.V., Emelyanenko V.I., Burstein E.A., Closset J. and Gerday C. 1980. Fluorescence study of the calcium binding to whiting (Gadus merlangus) parvalbumin. Eur. J. Biochem. 109: 307-315.

70. Plotkin S.S. and Onuchic J.N. 2002. Understanding prtein folding with energy landscape theory. Part I: Basic concepts Quart. Rev. Biophys. 35: 111-167.

71. Pollack L. 1999. Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle X-ray scattering. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1011510117.

72. Pollard T.D., Blanchoin L. and Mullins R.D. 2000. Molecular mechanism controlling actin filament dynamics in nonmuscle cells. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29: 545576.

73. Ptitsyn O.B. 1995. Molten globule and protein folding. Adv.Protein.Chem. 47: 83-229.

74. Radford S.E. 2000. Protein folding: progress made and promises ahead. TIBS. 25: 611618.

75. Rees M.K. and Young M. 1967. Stadies on the isolation and molecular properties of homogeneous globular actin. Evidence for a single polypeptide chain structure. J. Biol. Chem. 242: 4449-4458.

76. Robinson R.G., Mejillano M., Le V.P., Burtnick L.D., Yin H.L. and Choe S. 1999. Domain movement in gelsolin: a calcium-activated switch. Science. 286: 1939-1942.

77. Roder H. andShastry M.C.R. 1999. Methods for exploring early events in protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 9: 620-626.

78. Schuler H., Lindberg U., Schutt C. E., Karlsson R. 2000. Thermal unfolding of G-actin monitored with DNase-I-inhibition assay stabilities of actin isoforms. Eur. J. Biochem. 267:476-486.

79. Schutt C.E., Myslik J.C., Rozycki M.D., Goonesekere N.C. and Linberg U. 1993. The structure of crystalline profiling-P-actin. Nature. 365: 810-816.

80. Schmid F.X. 2002. Prolyl isomerases. Adv. Protein.Chem. 59: 243-282.

81. Sheterline P., Clayton J. and Sparrow J. 1998. Actin. Protein Profile. Oxford University Press, Oxford.

82. Turoverov K.K., Khaitlina S.Yu. andPinaev G.P. 1976. Ultra-violet fluorescence of actin.

83. Turoverov K.K., Verkhusha V.V., Shavlovsky M.M., Biktashev A.G., Povarova O.I., and Kuznetsova I.M. 2002. Kinetics of actin unfolding induced by guanidine hydrochloride. Biochemistry. 41: 1041-1019.

84. Uversky V. N. 1993. Use of fast-protein size-exclusion chromatography to study the unfolding of proteins which denature through the molten globule. Biochemistry. 32: 13288-13298.

85. Uversky V.N. and Ptitsyn O.B. 1996. Further evidence on the equibrium "pre-molten globule state": four-state GdmCl-induced unfolding opf carbonic anhydrase B at low temperature. J.Mol.Biol. 255: 215-228.

86. Uversky V.N., Winter S. and Lober G. 1996. Use of fluorescence decay times of 8-ANS-protein complexes to study the conformational transition in proteins which unfold through the molten globule state Biophys. Chem. 60: 79-88.

87. Uversky V.N., Narizhneva N.V., Ivanovo T.V., Kirkitadze M.D. and Tomashevski A.Y. 1997. Ligand-free form of human alpha-fetoprotein: evidence for the molten globule state. FEBS Lett. 410: 280-284.

88. Uversky V.N., Talapatra A., Gillespie J.R.and Fink A.L. 1999. Protein deposits as the molecular basis of amyloidoses. Part II. Localized amyloidoses and neurodegenerative disorders. Med. Sci. Monitor. 5: 1238-1254.

89. WestJ.J., Nagy B. and GergelyJ. 1967. Free adenosine diphosphate as an intermediary in the phosphorylation by creatine phosphate of adenosine diphosphate bound to actin. J. Biol. Chem. 242: 1140-1145.

90. Wetzel R. 1992. in Protein Engineering. A Practical Approach (Rees A.R., Sternberg A.R., Wetzel R., Eds.) pp 191-219, IRL Press, Oxford.

91. Wetzel R. 1994. Mutations and off-pathway aggregation of proteins. Trends Biotechnol. 12: 193-198.

92. Yamamoto Yu. and Tanaka J. 1970. Spectroscopic studies on the configurational structures of ribonuclease Tl. Biochim. Biophys. Acta. 207: 522-531.

93. Zahn R. 1999. Prion propagation and molecular caperons. Q. Rev. Biophys. 32: 309-370.

94. Zeeb M. and Balbach J. 2004. Protein folding studied by real-time NMR spectroscopy. Methods. 34: 65-74.

95. Я приношу глубокую благодарность моим научным руководителям К.К. Туроверову и И.М. Кузнецовой, за предоставленную возможность заниматься данной темой и внимательное научное руководство, постоянное внимание и заботу.

96. Я благодарна сотрудникам нашей Лаборатории Олесе и Оле Стапаненко за творческую атмосферу, способствовавшую работе.

97. Я также хочу выразить благодарность моей семье за постоянную поддержку и терпение.