Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Переходные состояния и доменная организация белков

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Переходные состояния и доменная организация белков"

На правах рукописи Ой УДК 577.322

Потехин Сергей Александрович

ПЕРЕХОДНЫЕ СОСТОЯНИЯ И ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ

03.00.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук.

Пущино-1999

Работа выполнена в Институте белка РАН.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор физико-математических наук,

профессор Ю. А. Лазарев

Защита состоится 28 апреля 1999 года в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета Д.200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292, г.Пухцино Московской области, ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан марта 1999 г.

Доктор химических наук, профессор Б. И. Курганов

Доктор химических наук В. Я. Гринберг

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

е <я%. о/./з-н о

I

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук <

%Л1 А. Нелипович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Цель п задачи исследования Основной целью данной работы является изучение принципов организации нативной структуры сложных мультидоменных белков. Разработка подходов и методов анализа калориметрических данных, позволяющих получать структурно-термодинамическую информацию об организации их нативной структуры и переходном (активированном) состоянии.

Актуальность проблемы. Подавляющее большинство белков представляют собой крупные мультидоменные образования. О структурных и термодинамических принципах образования и поддержания таких сложных систем известно не так уж много. Структура многих белков метасгабильна и поддерживается отнюдь не из-за ее термодинамической выгодности. Что удерживает такие белки от денатурации? Какова природа энергетического барьера, отделяющего нативное состояние от денатурированого? Что представляет собой переходное (активированное) состояние? Какими факторами определяется разбиение структуры белка на отдельные термодинамические домены? Ответить на все эти фундаментальные вопросы невозможно без обширного экспериментального материала. С другой стороны, экспериментальные возможности в этой плане крайне ограничены. По сути, кроме сканирующей микрокалориметрии не существует надежных методов определения доменной организации макромолекул.

Еще хуже обстоит дело с изучением переходного состояния. Это состояние виртуально. Нет никаких шансов зафиксировать его при каких-либо условиях и попытаться изучить его равновесными методами. Единственный путь получить хоть какую-нибудь структурную информацию об этом состоянии - это проследить за изменением его энергетических параметров при изменении внешних условий. Известные корреляции между структурными и термодинамическими параметрами могут позволить что-либо сказать о переходном состоянии в структурном плане.

Решение вышеуказанных проблем предоставляет сканирующая микрокалориметрия. Наличие доменов в структуре молекулы приводит к появлению промежуточных состояний при повышении температуры, что не может не отразиться на кривых плавления. Кинетические параметры денатурации также могут быть получены в определенных случаях из кривых плавления. Однако, извлечение вышеуказанной информации из калориметрических данных требует разработки соответствующих подходов и методов анализа, что и сделано в данной работе.

Научная новизна. В работе впервые была использована сканирующая микрокалориметрня для получения структурно-термодинамической информации о переходном состоянии белков в ходе тепловой денатурации. Проанализированы соответствующие кинетические модели. Одним из важнейших результатов использования такого подхода стал важный вывод о том, что переходное состояние является компактным слабогидратированым состоянием, а изменение структуры белка при активации охватывает далеко не всю молекулу.

Для анализа термодинамических моделей использовался специально разработанный нами аппарат обобщенных переходов между двумя состояниями. Этот аппарат устанавливает взаимно однозначное соответствие между любым комплексным числом и определенным пиком теплопоглощсния. Как показано в данной работе, обобщенная модель переходов между двумя состояниями порождает вырожденный базис по отношению к любой термодинамической системе и существенно упрощает анализ поведения сложных термодинамических моделей, в том числе и при наличии междоменных взаимодействий.

В диссертации рассматриваются методы анализа равновесных калориметрических кривых на основании статистической суммы системы. Изучены вопросы устойчивости алгоритмов и допустимая область их применения. Разработанные методы анализа позволяют во многих случаях рассчитать число и термодинамические параметры стабилизации структуры промежуточных состояний белка, реализующихся во всем рабочем температурном интервале. Наиболее впечатляющим результатом этого направления является построение карт доменной организации для ряда фибриллярных белков. Полученные карты доменной организации подтверждаются результатами ограниченного протеолиза молекул. Показано, что существует определенная корреляция между границами устойчивых протеолитических фрагментов и границами кооперативных термодинамических доменов.

Практическая ценность работы. Полученные результаты значительно расширяют наши знания о природе переходного состояния и принципах поддержания нативной структуры сложных мультидоменных белков. В ходе выполнения поставленных задач разработаны подходы и методы анализа равновесных и неравновесных микрокалориметрических кривых. В частности, значение разработанной теории обобщенных переходов между двумя состояниями не ограничивается продемонстрированными примерами. Теория может быть использована и в дальнейшем как для анализа поведения сложных термодинамических систем, так и для описания реальных калориметрических данных. Компьютерные программы анализа

калориметрических данных, созданные на основе разработанных алгоритмов, используются в нескольких лабораториях мира.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из семи частей, большинство из которых разбито на разделы. Во введении (I) кратко обоснованы и сформулированы задачи исследования. Вторая часть диссертации посвящена анализу литературных данных, касающихся исследований денатурации белков, подходов и методов анализа формы калориметрических кривых плавления. В этой же части дана краткая информация о структуре, функции и физико-химических параметрах исследуемых объектов. Следующая часть (111) - теоретическая. Она посвящена разработке методов анализа термодинамических и кинетических моделей, а также реальных калориметрических кривых. Здесь же приведена теория обобщенных переходов между двумя состояниями. Экспериментальная часть работы (IV) разбита на два раздела, включающих в себя методы выделения и очистки использованных препаратов и собственно результаты исследований Всего в данной работе представлены материалы анализа экспериментальных данных о 20 различных белках и фрагментах, принадлежащих различным структурным классам. В следующей главе (V) обсуждаются полученные результаты и формулируются общие закономерности равновесной и кинетически контролируемой тепловой денатурации. Обсуждаются структурные особенности, определяющие сложное поведение макромолекул в ходе тепловой денатурации. Далее приведены основные выводы работы (VI) va список использованной литературы (VII). Материалы диссертации изложены на /^¿страницах и иллюстрированы 56 рисунками и с! таблицами. Список цитируемой литературы включает Z3 Я работу.

Апробация работы и научные публикации. Материалы диссертации докладывались на III Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Ленинград, 1978), VIII Всесоюзной конференция по калориметрии и химической термодинамике (Иваново, 1979), V Совещании по информационным изменениям биополимеров в растворах (Телави, 1980), на международном симпозиуме "International Symposium on Biocalorimetry" (Тбилиси. 1980), на Всесоюзном симпозиуме по биохимии и биофизики мышечного сокращения (Тбилиси, 1983), на международном симпозиуме "International Symposium on Physico-Chemical Properties of Biopolymers in Solutions and Cells" (г. Пущино, 1985), на VI Всесоюзном симпозиуме по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1985), на IX Всесоюзном симпозиуме по биохимии и биофизике биологической подвижности (мышечное сокращение) (Тбилиси, 1990), на международном симпозиуме "Protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical Aspects" (Москва, 1998), на международном коллоквиуме "7th International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. 4th

International Conference on Bacillus thuringiensis", (Сапоро, Япония, 1998); работа прошла апробацию на научных семинарах в Институте белка и Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г.Пущино). Основные результаты работы отражены в 28 публикациях.

Теоретическое рассмотрение кинетически контролируемой и равновесной тепловой денатурации.

Сканирующая микрокалориметрия в настоящее время является одним из основных методов изучения энергетики самосборки структуры макромолекул. Получаемая в результате равновесных экспериментов избыточная теплоемкость несет в себе информацию об основных термодинамических функциях стабилизации структуры и механизме процесса денатурации. Использование равновесного термодинамического анализа для интерпретации калориметрических данных позволяет получать информацию о механизме сворачивания и стабильности макромолекул, доменной организации и связывании лигандов.

Однако, во многих случаях скорости разворачивания и сворачивания при истинной температуре денатурации настолько низки, что провести эксперименты в равновесных условиях, используя существующую технику, практически невозможно. Кроме того, хорошо известно, что денатурация большинства белков частично или полностью необратима. В этом случае использование равновесных методов анализа становится неприемлемым. Тем не менее, экспериментальные кривые теперь несут кинетическую информацию, которая может оказаться не менее полезной при изучении принципов самосборки макромолекул.

Неравновесная денатурация.

Мы проанализировали возможные последствия неравновесного характера денатурации и ренатурации макромолекул, используя обычную кинетическую модель двух состояний. Выявлены основные закономерности, определяющие положение и форму пика теплопоглощения при прямом и обратном сканировании. Выведено несколько оценочных формул, позволяющих получать кинетическую информацию из такого рода экспериментов, обсуждается область их применимости.

Показано, что поведение изучаемой системы при нагревании и охлаждении в неравновесных условиях может качественно отличаться. Вышеуказанные различия имеют место в тех случаях, когда скорость ренатурации замедляется при понижении температуры.

320 340 Т(К)

Рнсунок 1. Зависимость избыточного

молярного тепловыделения от температуры для кинетической модели перехода между двумя состояниями. Соответствующие скорости охлаждения указаны на рисунке. Энергия активации процесса ренатурации взята равной 10 ккал/моль.

Если при нагревании в неравновесных условиях увеличение скорости изменения температуры приводит только к смещению процесса денатурации в область более высоких температур, то неравновесное охлаждение может привести к полной или частичной необратимости (рис. 1 и 2 ).

Для реальных белков известно много случаев, когда их структура находится под кинетическим контролем. Выясненные нами закономерности позволяют внести некоторые коррективы в общепринятый алгоритм работы с использованием сканирующих

калориметров, а также в обычную интерпретацию частичной или полной необратимости.

В частности, такого рода необратимости чаще всего приписывают существованию какого-либо дополнительного процесса, переводящего белок в состояние, из которого он не может выбраться в течение сколько-нибудь разумного времени. К таким процессам обычно относят агрегацию, ковалентные модификации или образование "неправильных" К-Э связей. Наши результаты показывают, что наличие частичной или полной необратимости может быть обусловлено просто достаточно низким временем релаксации. Отличить эти две ситуации в принципе возможно, проводя несколько прогревов одного и того же препарата. В случае неполной обратимости белка из-за медленной релаксации второй и последующие прогревы должны давать один и тот же пик теплопоглощения, если

330 340 Т(К)

Рисунок 2. Зависимость избыточной

молярной теплоемкости от температуры для кинетической модели перехода между двумя состояниями. Соответствующие скорости прогрева указаны над пиками теплопоглощения. Энергия активации процесса денатурации взята равной 110 ккал/моль.

б

цикл охлаждение-нагревание проводится в постоянном режиме. Наличие дополнительной необратимой стадии приводит к тому, что пик теплопоглащения должен прогрессивно убывать при каждом последующем прогреве.

В большинстве реальных случаев наиболее вероятной причиной частичной или полной необратимости кажется влияние обоих этих явлений. Необратимость, вызванная медленной кинетикой релаксации, способна стимулировать медленные необратимые процессы, например агрегацию, просто увеличивая время жизни белка в развернутом состоянии при низкой температуре.

Для анализа поведения термодинамических систем мы разработали математический аппарат, позволяющий представлять кривые избыточного тепло поглощения произвольной термодинамической системы в виде суммы определенного типа пиков теплопоглощения. Иными словами, показано, что любая термодинамическая система эквивалентна набору независимых подсистем, каждая из которых способна находиться только в двух состояниях. Однако, термодинамические свойства этих подсистем существенно отличаются от свойств обычной модели Вант-Гоффа. Различие обусловлено следующим дополнительным допущением: вырожденность исходного состояния может быть комплексным числом. Изучены свойства новой обобщенной модели. Показано, что при заданной энтальпии полуширина перехода для нее определяется аргументом комплексной вырожденности исходного состояния и может принимать любые значения, не превосходящие полуширину перехода модели Вант-Гоффа (рис.3). Обычная модель Вант-Гоффа для переходов между двумя состояниями является частным случаем нашей обобщенной модели. Аналитический вид функции избыточного теплопоглощения может быть выражен следующим образом:

Класс обобщенных переходов между двумя состояниями порождает вырожденный базис по отношению к любой термодинамической системе.

Используя аппарат модели обобщенных переходов между двумя состояниями, проанализирована форма кривых плавления для различных термодинамических систем. В частности, изучено, как меняется форма кривой избыточного теплопоглощения в зависимости от относительной стабильности переходов у системы, способной находиться в

Равновесная денатурация.

Теория обобщенных переходов между двумя состояниями.

(1)

трех различных термодинамических состояниях. Проанализирован характер изменения формы кривой плавления двухдоменной макромолекулы в зависимости от относительной стабильности и междоменного взаимодействия. Показано, что в случае приблизительно одинаковых значений энтальпии доменов свободная энергия взаимодействия может быть определена методом сканирующей

микрокалориметрии лишь в том случае, если ее значения лежат в диапазоне от 0,3 до 2,9 ккал/моль.

Экспериментальная часть.

Микрокалориметрическая часть работы выполнена на приборах ДАСМ-1М и СКАЛ-1. Последний полностью разработан в лаборатории термодинамики белка Института белка РАН. Этот прибор-прецизионный сканирующий

микрокалориметр нового поколения со стеклянными ячейками и отличными динамическими характеристиками. Его

Рисунок 3. Зависимость действительной часта молярной теплоемкости обобщенной модели перехода между двумя состояниями от модуля комплексной константы перехода в логарифмическом масштабе при различных значениях аргумента вырожденности исходного состояния. Значения функции нормированы на величину максимальной амплитуды теплоемкости для модели Вант-Гоффа. Кривые 1-6 соответствуют значениям cosç», равным L; 0,5; 0; -0,1; -0,5 и-0,8.

высокие эксплуатационные

характеристики позволяют надежно получить парциальную теплоемкость объектов в интервале температур от 0 до 130° С при относительно низких рабочих концентрациях (-1 мг/мл). Рабочий объем ячейки составляет 0,3 мл. Скорость прогрева может быть изменена от 0,1 до 2 град/мин. Высокая чувствительность приборов обеспечивается за счет дифференциальной схемы измерения. Приборы регистрируют изменение теплопоглощения раствора по отношению к теплопоглощению растворителя. Результаты опыта легко представимы в виде зависимости парциальной молярной теплоемкости объекта от температуры по формуле:

где С* и V* - парциальные удельные значения теплоемкости и объема растворителя, Ср и

- изменение теплопоглощения раствора по отношению к теплопоглощению растворителя, М - молекулярный вес объекта.

Предварительная обработка результатов калориметрических исследований

Известно, что физико-химические параметры белков, в том числе парциальная теплоемкость, изменяются во всем интервале температур. Однако, для любого из объектов существуют две принципиально различные температурные области. Область, где нет кооперативных конформационных перестроек, охватывающих большие участки молекулы, и , собственно, область денатурационного перехода. Предполагая, в первом приближении, что пре- и пост-денатурационные теплоемкости есть линейные функции температуры, и," осуществляя экстраполяцию теплоемкости нативного и денатурированного состояний на весь исследуемый температурный интервал, может быть получена избыточная (по отношению к состоянию сравнения ) теплоемкость объекта:

Обычно одностадийный денатурационный процесс характеризуется тремя экспериментально определяемыми интегральными термодинамическими параметрами: энтальпией перехода, разницей теплоемкости между денатурированным и нативным состоянием и температурой перехода. На основании этих данных термодинамические параметры стабилизации структуры могут быть рассчитаны во всей области температур.

В случае многостадийных переходов получение всех этих параметров для каждого из реализующихся состояний также возможно. Однако, при сильном наложении переходов попытка определения собственной теплоемкости промежуточных состояний требует существенного повышения точности экспериментальных данных и экстраполяции теплоемкости состояния сравнения в область перехода. По этой причине температурная зависимость энтальпии промежуточных состояний при анализе каждой калориметрической кривой нами не учитывалась. Так как величина избыточного теплопоглощения может быть записана в виде

У° - значения тех же параметров для белка, т° - его масса в измерительной ячейке, а Д(г)

(3)

где Ср „(г) - теплоемкость состояния сравнения.

где первый член суммы¿С"'(Т) соответствует избытку теплопоглощения, связанному с распадом структуры, а второй - 5С"С(Т) - с температурной зависимостью собственной теплоемкости системы. Величина избыточной теплоемкости, соответствующая второму члену, может быть вычтена из экспериментальных кривых в предположении постоянства удельных значений энтальпии и изменения теплоемкости для всех блоков:

(5)

В формулах (4) и (5) использовались следующие обозначения: (АН(т)) = £ АЯ, ■ !■] и

- средние значения избыточной энтальпии и ее квадрата, !•] - доля

молекул в ¡-ом состоянии, п - общее число состояний, ДС' и АН: - изменение теплоемкости и энтальпии при переходе из нулевого состояния в ¡-ое. АС" и ДН"" -значения этих параметров для полностью денатурированного состояния.

На модельных кривых было показано, что такое предположение не может вносить существенных искажений в величину определяемых термодинамических параметров промежуточных состояний, а в некоторых случаях достаточно и более грубого приближения.

Ашупп кривых избыточного теплопоглощения.

По сути, задача анализа сводится к нахождению равновесной термодинамической или кинетической схемы, количественно не противоречащей всему имеющемуся экспериментальному материалу. Очевидно, что все параметры адекватной схемы процесса лежат в минимуме, либо вблизи минимума некоторого функционала, характеризующего расхождение экспериментальных и расчетных кривых. В качестве такого функционала, зависящего от параметров системы, может быть взят, например, интеграл по температуре от квадрата разности экспериментального и расчетного значений избыточной теплоемкости

Ранее для термодинамического равновесного процесса был предложен алгоритм, позволяющий путем последовательного вычленения отдельных стадий однозначно определить число и термодинамические параметры состояний, через которые проходит макромолекула в процессе плавления ее структуры. Однако, опыт применения алгоритма к анализу реальных калориметрических кривых показал, что возможности данного подхода ограничены и для успешного решения широкого круга задач предложенный алгоритм должен быть несколько дополнен и модифицирован. Во-первых, существенным недостатком метода является необходимость интегрирования избыточных теплоемкости и энтальпии, начиная с достаточно низких температур. При обработке реальных кривых это не всегда выполнимо, что приводит к заметному ухудшению разрешения метода. Нами были проанализированы несколько функций, которые могут быть использованы в секвентальном алгоритме анализа. Полученные результаты позволили выбрать функцию, наименее подверженную влиянию этого эффекта.

Во-вторых, при анализе сложных кривых плавления, вне зависимости от используемых рекурентных соотношений, происходит быстрое накопление ошибки, которая приводит к появлению колебаний модельной кривой относительно анализируемой. Для подавления этого эффекта мы сочли целесообразным ввести в алгоритм разложения обратную связь, позволяющую корректировать энтальпии и температуры отдельных стадий на каждом шаге разложения.

Кроме того, реальные экспериментальные ошибки, а также приближенная экстраполяция собственной теплоемкости системы в некоторых случаях (сильно перекрывающиеся переходы) способны заметно исказить результаты анализа отдельных кривых. Таким образом, становится очевидной необходимость следующего этапа -устранения неадекватных описаний системы. Его цель - построение единой термодинамической схемы, способной объяснить логику количественных и качественных изменений. Основным инструментом на этом этапе служит оптимизационная программа, осуществляющая минимизацию функционала (6) в рамках любой, наперед заданной схемы. В случае, если предыдущий этап дал согласующиеся между собой результаты, необходимость такой проверки, естественно, отпадает.

Методы анализа неравновесных экспериментальных данных.

Энергия активации процесса денатурации при температуре денатурации Тт рассчитывалась путем минимизации расхождения между экспериментальной и модельной кривыми. Хорошо известно, что форма кривой плавления для необратимого одностадийного процесса описывается формулой:

= г-с ■ exp

R-T.

^(r-rj

•exp-i-exp

bEt R-T1.

(T-Tj

(V)

Функция зависит от трех параметров: Tm

и \Е,Г . Вообще говоря, эти параметры не

являются независимыми. Константа скорости денатурации при температуре Тт легко может быть оценена на основании вычисленных параметров.

Зная термодинамические параметры переходного состояния, можно легко экстраполировать к любым температурам константу скорости денатурации №г, полученную из такого рода экспериментов. Температурная зависимость этой функции дается теорией активированного комплекса:

МРНД):

к.-Т

•ехр

AG'af(pH,T) R-T

(8)

гдекв - постоянная Больцмана, Ь - постоянная Планка, и АО^(рН,Т)- свободная энергия активации, то есть разница свободных энергий между нативным и переходным состояниями. Используя обычное термодинамическое соотношение

ДО„'г (рН, Т) = ДН^(Т) - Т. ^(рН, т), (9)

где ДН^(Т) и Д5*,(рН,Т) - энтальпия и энтропия активации, соответственно. Принимая во внимание характер их зависимости от температуры,

дн^(т)=дн;,(т„)+дс, • (Т-Тв),

Т

^V(pH,Т) = AS^pHTJ+äc;.,, -Inj

(10) (11)

константа скорости денатурации к^ легко может быть получена при любой заданной температуре. На основании теории активированного комплекса мы также предполагали, что Арренеусовская энергия активации приблизительно равна энтальпии этого процесса.

Объекты исследований.

В работе были использованы:

1. Метионинаминопептидаза (I^MAF) из супертермофила Pyrococcus furiosus.

1. СгуЗА 5-эндотоксин Bacillus thuringiensis vat. tenebrionis и два его протеолитических фрагмента (55кДа и 37кДа).

3. а-тропомиозин из спинных мышц кролика (Musculus psoas) и четыре его фрагмента (рис. 16), полученные путем химического расщепления полипептидной цепи по метионинам (CN1A, CN1B) и цистеину (Cyl, Су2).

4. Четыре протеолитических фрагмента миозина, выделенного из спинных мышц кролика. Для фрагментации использовались папаин (LMMn), трипсин (LMMt, LF-3) и химотрипсин (TR).

5. Феррицитохром С из сердца лошади.

6. Имунноглобулин G кролика и три его протеолитических фрагмента (Fab, pFc1 и

Fc).

7. Фибритин бактериофага Т4 и его фрагмент.

Результаты и обсуждение. Кинетически контролируемая денатурация.

Как известно, стабильность белков к воздействию температуры может иметь различную природу. Во-первых, это равновесная термостабильность. В этом случае соотношение заселенностей нативного N и денатурированного D состояний определяется константой равновесия K=[D]/[N] и не зависит от времени. В свою очередь, константа равновесия определяется свободной энергией стабилизации структуры, то есть разностью свободных энергий денатурированного и нативного состояний. Кривые плавления в этом случае носят равновесный характер и описываются моделью Вант-Гоффа или моделью многостадийной денатурации.

Во-вторых, структура белка может быть метастабильна. Белок может оставаться нативным даже при достаточно высоких температурах, когда это состояние становится термодинамически невыгодным (AG>0, К>\). Такое поведение определяется тем, что при истинной температуре денатурации Td, т.е. тогда, когда свободная энергия денатурации обращается в ноль, скорость денатурации еще настолько низка, что процесс денатурации может растягиваться на часы или даже сутки. В этом случае кривые плавления также могут быть проанализированы.

Нами была изучена тепловая денатурация нескольких объектов, стабильность которых контролируется кинетически. Это мегионинаминопептидаза из супертермофилов, СгуЗ А 5-эндотоксин и два его фрагмента. Характерной чертой полученных кривых является определенная степень асимметрии пиков избыточного теплопоглощения. Повторный прогрев препаратов показал практически полную невоспроизводимость процесса денатурации. Однако, как указывалось ранее, необратимость, установленная таким образом, не всегда является принципиальной термодинамической необратимостью. В тех случаях, когда невоспроизводимость порождается медленными процессами, следующими за равновесной денатурацией, например, медленными химическими модификациями или

агрегацией, кривые плавления практически не искажаются и могут быть проанализированы методами равновесной термодинамики. В нашем случае одна из возможных причин необратимости - это склонность белка к агрегации в денатурированном состоянии; препараты после прогрева и охлаждения становятся мутными. Однако, помутнение раствора не наблюдается при высоких температурах сразу после денатурации. Таким образом, вопрос об использовании той или иной модели для анализа требует специального изучения.

Для того, чтобы проверить является ли процесс денатурации в рабочем диапазоне скоростей равновесным, нами были получены кривые плавления при различных скоростях прогрева. В качестве примера, на рисунке 4 приведены такие кривые для 5-эндотоксина Как видно из рисунка, кривые плавления заметно смещаются по температуре в зависимости от скорости прогрева препарата, что говорит о неравновесных условиях проведения эксперимента. Это означает, что процесс денатурации при заданных условиях или в принципе необратим, или скорости прогрева слишком высоки для того, чтобы можно было считать данный процесс равновесным. Два этих случая не различимы по форме кривой плавления.

Следующий вопрос, который требует прояснения - это вопрос о числе стадий данного кинетического процесса (т.е. числе состояний молекулы, реализующихся при повышении температуры). Как мы показали в теоретической части диссертации, для необратимых (а, следовательно, и для неравновесных) одностадийных процессов степень асимметрии а (отношение площади пика до - и после - середины перехода) равна

а = -^ = е-1 = 1,72 (12)

Прямой расчет коэффициента а для всех экспериментальных кривых свидетельствует, что согласно этому критерию кривые находятся в хорошем соответствии с кинетической моделью перехода между двумя состояниями.

т(к)

Рисунок 4. Зависимость избыточной

парциальной молярной теплоемкости 5-эндогоксина от температуры при рН 3,0 и различных скоростях прогрева. Кривые 1-4 соответствуют скоростям 0,125; 0.5; 1,0 и 2,0 К/мин."

описания зависимости молярной

т (К)

Рисунок 5. Примеры

экспериментальных кривых избыточной парциальной теплоемкости для Р/МАР одностадийной кинетической моделью. Кривая I - рН 3,23, г=0.5 К/мин; 2 - рН 3,46, у=1 К/мин; 3 -рН 3,78, у=2 К/мин. Экспериментальные кривые изображены треугольниками, модельные кривые непрерывными линиями.

На одностадийность процесса указывает и следующий факт. Предварительный прогрев препарата до начала перехода хотя и приводит к заметному уменьшению площади пика теплопоглащения (~ 40% от исходного), но не искажает его формы, так что кривая может быть получена из исходной просто ее нормировкой. В случае многостадийное™ процесса, однако, следовало бы ожидать какое-либо искажение кривой, так как разные стадии могут иметь разную характерную температуру и, возможно, разные скорости и степень обратимости, а их относительный вклад в результирующую кривую должен был бы измениться.

Более прямой способ проверки соответствия денатурационного перехода такой модели - это проверка возможности описания экспериментальных кривых модельными. Используя метод наименьших квадратов, нами были найдены параметры, соответствующие наилучшему описанию экспериментальных кривых. На рисунке 5 приведены примеры такого описания. Как видно из рисунка, кривые избыточного теплопоглощения находятся в хорошем соответствии с кинетической одностадийной моделью. Кинетические параметра переходов сведены в Таблицу 1.

Для проверки правильности выбранной модели нами были выполнены эксперименты по выявлению зависимости

3 -1

кажущейся температуры перехода от (,/Тт) чо (к )

скорости прогрева. На рисунке 6

приведена такая зависимость. Как видно Рисунок 6. Зависимости 1п(у/т^) от

из рисунка, функция имеет линейный вид, °^Ратной каж>™йся температуры денатурации

1/Ттдля 5-эндотоксина. Экспериментальные что говорит о неравновесности плавления точки П0Лучень, при рН 3 0 „ скоростях

прогрева 2,0; 1,0; 0,5 и 0,125 К/мин.

-11 о -

-11-5

' с -12.0 "

I-

3 -12 5-

с

- -13 0 --13 5

I-

3 00

15

Таблица 1.

Термодинамические и кинетические характеристики денатурации

5-эндотоксина и его фрагмента.

Объекты рн Т„(К) f кдж \ \,.иоль J f кдж^\ улюль ) V (К /мин) а

5-эндотоксин 3.5 343.6 1330 464 1.00 1.77

3.0 340.4 1300 393 2.00 1.65

338.6 1200 410 1.00 1.62

337.0 1210 389 0.50 1.74

333.5 945 405 0.125 1.87

2.8 333.1 849 389 1.00 1.54

331.7 840 380 0.125 1.81

2.5 332.5 924 405 1.00 1.80

2.0 322.7 644 330 1.00 1.62

55 кДа фрагмент 3.0 343.3 832 468 1.00 1.89

2.75 334.3 815 364 1.00 1.74

2.5 330.7 727 385 1.00 1.65

2.0 322.2 652 288 1.00 1.60

Тга (К) - температура максимума пика теплопоглощения, ДНт- калориметрическая энтальпия перехода, ДЕ„, - энергия активации процесса денатурации, V - скорость сканирования, а - степень асимметрии пика теплопоглощения.

даже при минимальной скорости прогрева из изученного диапазона скоростей. Энергии активации, рассчитанные на основании такой зависимости и непосредственно из формы кривых (рис. 5 и 7), находятся в хорошем согласии, что подтверждает соответствие

экспериментальных данных

применяемому модельному описанию.

На рисунке 7 в качестве примера приведена зависимость энергии активации процесса денатурации от температуры перехода для 5-эндотоксина и его фрагмента. Как и в случае Р/МАР (см. рис. 8),

Т<К)

Рисунок 7. Зависимости энтальпии

(квадраты) и энергии активации (треугольники) процесса денатурации от кажущейся температуры денатурации Тт. Активацнонные энергии, оцененные на основании зависимости кажущейся температуры денатурации от скорости прогрева, изображены кружками. Прямые проведены методом наименьших квадратов.

зависимость имеет линейный характер, слабо увеличиваясь при повышении температуры. Там же (рис. 7 и 8) приведены зависимости энтальпии денатурации. Как уже указывалось, аномальное титрование групп, которое может происходить при денатурации и активации, не вносит заметного вклада в энтальпию этих процессов по крайней мере при кислых значениях рН. Это означает, что тангенсы углов наклонов зависимостей, приведенных на рис. 7 и 8, должны совпадать с соответствующими инкрименгами теплоемкостей.

В случае 8-эндотоксина, кроме 67 кДа интактного белка были изучены два его фрагмента - 55 кДа и 37 кДа. В настоящее время методом рентгеносгруктурного анализа установлена трехмерная структура двух 5-эндотоксинов В1 (В. Лип^епм) - СгуЗА токсина из В. /Лг/г;и#7тш \аг. 1епеЬгю>ш и Сгу1Аа токсического фрагмента из В.

эиЬзр. кипшкг НО-1. Молекулы токсинов обладают сходной конформацией, имеют клинообразную форму и состоят из трех структурных доменов: одного а-спирального (I), образованного пучком из 7 а-спиральных сегментов и двух Р-структурных (II и III). 55 кД фрагмент состоит из 4-х а-спиральных фрагментов (оц - схт) I домена и двух Р-структурных доменов. У 37 кДа фрагмента полностью отсутствует 1-ый а-спиральный домен. Он образован из И-го и большей части Ш-го Р-структурных доменов.

Следует обратить внимание, что 55 кДа фрагмент получают из 5-эндотоксина, кристаллы которого предварительно растворяют в 3,3 М растворе КВг. Молекула токсина в этих условиях теряет компактную третичную структуру, на что указывает отсутствие пика

теплопоглощения на кривой плавления. После удаления КВг токсин

восстанавливает уникальную третичную структуру. Аналогично ведет себя и 55 кД фрагмент. То есть, несмотря на кажущуюся необратимость тепловой денатурации, как структура целого белка, так и его 55кДа фрагмента при низкой температуре энергетически выгодны. Необратимость тепловой денатурации порождается, вероятно, неблагоприятным соотношением термодинамических и кинетических параметров и/или

тт(К)

Рисунок 8. Зависимости энтальпии

(квадраты) и энергии активации (треугольники) процесса денатурации мстионин-

аминопептидазы от кажущейся температуры денатурации Т„. Активационныс энергии, оцененные на основании зависимости кажущейся температуры денатурации от скорости прогрева, изображены кружками. Прямые проведены методом наименьших квадратов.

агрегационными эффектами. Как видно из таблицы 1, удаление трех а-спиралей приводит к увеличению кажущейся стабильности молекулы и заметному падению энтальпии денатурации при рН 3,0. Однако, форма кривой плавления при этом практически не меняется; кривая плавления целого белка при данной температуре может быть получена путем умножения избыточной теплоемкости 55 кДа фрагмента на соответствующий нормировочный множитель. Как и в случае целого белка, кривая прекрасно описывается кинетической одностадийной моделью, а рассчитанная на основании формы кривой энергия активации ложится на прямую зависимости этой функции от температуры для исходного белка (рис. 7). Таким образом, энергетический вклад недостающего участка в нативную конформашно и в активированное состояние идентичны, что говорит, вероятно, о его пассивной роли в поддержании нативной структуры. Кажущаяся стабилизация фрагмента по сравнению с целой молекулой объясняется преимущественным энтропийным вкладом недостающего участка в свободную энергию активированного комплекса по сравнению с нативным состоянием.

Исследовать денатурацию 37 кДа фрагмента 6-эндотоксина не удалось по следующей причине. Получить такой фрагмент оказалось возможным только в присутствии З.б М виНС!. В этих условиях молекула исходного токсина теряет компактную третичную структуру, на что указывает отсутствие пика теплопоглощения на кривых плавления. Однако, как и в случае с 3.3 М раствором КВг, денатурация 5-эндотоксина в этих условиях была обратима. Однако, попытки ренатурировать 37 кДа оказались неудачными. Удаление СиНС1 приводило к агрегации полученного С-концевого фрагмента. Были предприняты несколько различных попыток восстановить исходную конформацию фрагмента. Нерастворимый в обычных условиях 37 кД фрагмент можно было растворить в 0,1% растворе додецилсульфата натрия (5Э5). Но удаление БОЗ с помощью ацетона или длительного диализа не восстанавливало третичную структуру фрагмента, и вновь приводило к необратимой агрегации полипептида. Оставшаяся в растворе после центрифугирования небольшая доля препарата по данным КД не имела упорядоченной вторичной структуры. О том же свидетельствовали и данные сканирующем микрокалориметрии. Таким образом, кажется вероятным, что 37 кДа фрагмент не способен поддерживать свою нативную конформацию в отсутствии остальной части молекулы.

Наличие промежуточных состоянии при денатурации. В случае СгуЗА 5-эндотоксина, его 55 кДа фрагмента и метионинаминопептидазы процесс денатурации хорошо описывается кинетической необратимой одностадийной моделью Следовательно, тепловая денатурация при экспериментальных скоростях прогрева носит неравновесный, кинетический характер и проходит без каких-либо промежуточных состоянии. Тем не

менее, это вовсе не означает, что денатурация обязательно принципиально необратима, а нативное состояние белка энергетически не выгодно во всей области температур. Причиной может быть просто медленная скорость денатурации при истинной температуре перехода ТЛ. Как было показано ранее, это является достаточным условием, делающим результаты микрокалориметрических экспериментов неравновесными, а тепловую денатурацию кинетически контролируемой. Необратимость структуры, проверяемая путем повторного прогрева препарата, также не является в данном случае хорошим контролем на принципиальную обратимость процесса из-за наличия медленной агрегации, следующей за денатурацией. Так или иначе, важным результатом данной работы является то, что нативные структуры как 8-эндотоксина, так и Р/МАР по крайней мере при повышенных температурах поддерживаются благодаря высокому активационному барьеру процесса денатурации, а вовсе не из-за термодинамической выгодности этого состояния. Тем не менее, при достаточно низких температурах нативное состояние, вероятно, энергетически выгодно, так как структура этих белков полностью восстанавливается при удалении ОиНС! или КВг. Кроме того, на основании экспериментальных данных можно с полной уверенностью утверждать, что в процессе тепловой денатурации отсутствует накопление каких - либо промежуточных состояний кроме исходного и конечного.

Термодинамические параметры стабилизации нашивного состояния Учитывая, что процесс денатурации в калориметрических экспериментах в данном случае проходит неравновесно, можно определить только два термодинамических параметра, характеризующие нативное состояние. Это инкримент теплоемкости и энтальпия денатурации (рис. 7 и 8, таб. 1). Для изученных белков и фрагментов, денатурация которых контролируется кинетически, эти параметры лежат в обычном интервале значений, характерном для глобулярных белков. Нет никаких оснований полагать, что эти параметры для белков из супертермофилов (Р/МАР) хоть в какой-либо степени отличаются от аналогичных параметров для белков из обычных бактерий. В случае 5-эндотоксина вышеуказанный факт, а также наличие пика теплопоглощения для 55 кДа фрагмента позволяют утверждать, что фрагмент токсина сохраняет уникальную третичную структуру при удалении трех М-концевых а-спиралей. Неравновесность процесса денатурации не позволяет получить истинную температуру денатурации Тл а, следовательно и изменение энтропии и свободной энергии Гиббса.

Особенности переходного состояния. На основании полученных данных можно сделать несколько важных выводов о природе активированного состояния 5-эндотоксина. По определению, активированным состоянием называется виртуальное, наиболее

термодинамически невыгодное состояние на пути денатурации-ренатурации. В соответствии с теорией активированного комплекса энергия активации приблизительно равна энтальпии этого состояния. Как видно из рис. 7 и 8, инкримент теплоемкости активированного состояния существенно меньше инкримента теплоемкости при денатурации (не более 15%). Ранее было показано, что инкремент теплоемкости хорошо коррелирует с экспонированосгью гидрофобной поверхности при информационном переходе. Таким образом, следует признать, что активированное состояние по степени экспонированности гидрофобных групп слабо отличается от нативного. Иными словами, энергетически самым невыгодным состоянием на пути сворачивания структуры белка является компактное состояние со слабо гидратированным гидрофобным ядром. Аналогичные результаты были получены ранее для лизоцима, барназы, белка холодового шока CspB.

Существует еще один энергетический критерий, часто используемый для оценки компактности глобулярных белков. Как было показано ранее, удельная энтальпия денатурации, экстраполированная к П0°С, есть постоянная величина для этого класса белков и составляет около 13 кал*г"1,1С1 . Для обсуждаемых объектов эта величина оказалась равной 11,6 - 13,4 кадт'^К"1, что достаточно близко к стандартной величине. Однако энтальпия переходного состояния (удельная энергия активации) намного меньше и составляет около 2,4 - 2,6 калт'^К'1 для MAP и около 1,1 - 1,8 кал-г'-К"1 для эндотоксина . Как правило считается, что величина энтальпии при этой температуре обусловлена" ван дер Вальсовыми контактами и водородными связями. Таким образом, на основании этого критерия следует полагать, что ван дер Вальсовы контакты и водородные связи в структуре молекулы в переходном состоянии в заметной степени разрушены. Тем не менее гидрофобное ядро остается практически интактным и не гидратированым. Следовательно, энергетический барьер, отделяющий нативную и денатурированную конформации, существует благодаря необходимости разрушения короткодействующих взаимодействий в определенной части структуры молекулы. С другой стороны, большая величина активационной энергии предполагает, что эти разрушения носят коллективную природу.

Зависимость энергии активации от температуры показана на рис. 7 и 8. Очевидно, что ДБ"', положительна вплоть до очень низких температур. Так как производная константы скорости любого процесса по температуре пропорциональна энергии активации этого процесса, то скорость денатурации при повышении температуры должна возрастать, практически во всем температурном интервале. Кроме того, отношение энтальпии денатурации к энергии активации сильно зависит от температуры. Учитывая, что для

одностадийного обратимого процесса энтальпия денатурации должна быть однозначно связана с энергиями активации прямого и обратного процесса

ДЯ = Д£^-Д£/я> (13)

можно легко оценить энергию активации процесса ренатурации. Очевидно, что эта величина меняет знак в интервале температур 300-31 ОК. Следовательно, константа скорости ренатурации должна достигать своего максимального значения в этом интервале температур и уменьшаться как при уменьшении, так и при увеличении температуры. Такое поведение скоростей

денатурации/ренатурации является

достаточно обычным для белков, что

Рисунок 9. Расчетная зависимость

логарифма константы скорости денатурации Р/МАР от рН среды при температурах (сверху вниз) 353 К, 333 К, 313 К, 293 К и 273 К. Точки рассчитаны на основании экспериментальных данных. Непрерывная кривая представляет собой наилучшее приближение данной зависимости

квадратичной параболой.

подтверждается прямыми измерениями зависимостей скоростей денатурации и ренатурации от температуры.

Полученные кинетические и термодинамические параметры делают возможным оценку константы скорости денатурации в широкой области внешних условий. Рисунки 9 и 10 демонстрируют зависимости этой величины от температуры и pH среды. Как видно из рисунков, скорость денатурации замедляется при понижении температуры и увеличении pH. „

Увеличение кажущейся стабильности i

ст о

структуры молекулы (сдвиг Тт в область более высоких температур) является результатом этого замедления.

Таким образом, очевидно, что • с уменьшением pH переходное состояние

дестабилизируется по сравнению с Рисунок 10. Зависимость логарифма

нативным. Причиной этого может быть константы скорости денатурации от

температуры для Р/МАР при pH 3,78; 3,46; 3,15 только предпочтительное связывание и 2,83 (справо налево). Символы указывают

точки, измеренные экспериментально.

протонов с молекулой белка в переходном состоянии. Это предполагает

существование боковых групп, титрующихся в этой области рН, рК которых заметно различаются в нативном и переходном состояниях.

Обычно рК карбоксильных групп, титрующихся в этой области рН, способны заметно изменяться только благодаря сильным электростатическим взаимодействиям, в первую очередь, благодаря солевым связям.

Следовательно, несмотря на то, что структура молекулы в переходном состоянии остается компактной, часть солевых связей при этом разрушается. Число таких дополнительно титруемых при активации групп может быть рассчитано на основании зависимости свободной энергии активации от рН среды. Действительно, хорошо известно, что разница в числе связывающихся с белком в двух различных конформациях протонов Дп определяется рН-зависимостью разницы свободных энергий, соответствующих этим конформациям:

— = 2.3-К-Т-Дп (14)

ЭрН

Это уравнение применимо и для свободной энергии активации. Однако, в этом случае оно будет определять различие в ионизации белка в нативном и переходном состояниях. Из рисунка 11 видно, что различие в числе связанных протонов в нативном и переходном состоянии растет от нуля при рН выше 3,7, до 5,3 при рН ниже 3.0. Таким образом, не менее пяти карбоксильных групп титруются дополнительно при переходе белка в активированное состояние. К сожалению, невозможно оценить число дополнительно титрующихся групп при более низких значениях рН. Р/МАР денатурирует при этих условиях уже при комнатной температуре. Однако, кажется очень вероятным, что при этих рН Дп уже достигает своего максимального значения. Действительно, рКА5р=3.9, а рК.с'и=4.1, а 0(5ласть титрования групп обычно не превосходит ±1 рН от рК данной группы. Такое поведение продемонстрировано, например, для барназы, когда Дп достигало своего максимального значения при рН около 3,0.

2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0

рН

Рисунок 11. Зависимость свободной энергии активации для Р^МАР от рН среды при температуре 360К. Точки рассчитаны на основании экспериментальных данных. Зависимость апроксимирована полиномом третьей степени (непрерывная кривая). Пунктирные линии показывают тангенсы углов наклонов (производные) этой зависимости, соответствующие минимальному и

максимальному значениям.

К сожалению, в данном случае полное число аномально титрующихся групп в структуре РУМАР неизвестно. Это не позволяет оценить, какая часть солевых связей разрушается при переходе молекулы в активированное состояние. Однако, очень похоже, что эта часть не велика. Действительно, около девяноста шести ионных пар с участием карбоксильных групп и расстоянием около 6 ангстрем было обнаружено в структуре Р/МАР. Даже если использовать более жесткий критерий, например, 3 ангстрема, число таких пар окажется не менее 12. Этот факт заставляет предположить, что далеко не все солевые связи разрушаются при активации молекулы.

Важным фактом, установленным в данной работе, является то, что удаление трех N-концевых а-спиралей в б-эндотоксине не приводит к изменению энергии активации. Это означает, что энергетический вклад этих спиралей в энтальпию нативного и активированного состояний идентичен. Иными словами, эта область не претерпевает конформационных изменений при переходе в активированное состояние. Кроме того, интересной особенностью структуры токсина является то, что удаление 7рех первых N-концевых а-спиралей приводит к стабилизации структуры оставшейся части приблизительно на 5-6°С (таб. 1). Это обусловлено снижением скорости денатурации при той же температуре для 55 кДа фрагмента по сравнению с целой молекулой. Так как энергия активации при этом не меняется, причиной замедления может быть только преимущественное увеличение энтропии молекулы в активированном состоянии по сравнению с нативным. Поскольку структура этих спиралей не меняется при переходе в активированное состояние, то остается предположить, что причиной замедления является увеличение доступного конформационного пространства белка в активированном состоянии для фрагмента по отношению к целой молекуле.

Энергетический барьер на пути сворачивания, удерживающий молекулу 5-эндотоксина от разворачивания, связан с конформационными изменениями в С-концевой части молекулы, о чем свидетельствуют данные, полученные при исследовании структуры 37 кДа фрагмента, который образован из II-ого и большей части Ш-его ß-структурных доменов. Удаление а-спирального домена и 40 аминокислотных остатков с С-конца молекулы токсина в 37 кДа фрагменте приводит к потере уникальной третичной структуры оставшейся части. Этот фрагмент, в отличие от 55 кДа фрагмента, теряет способность к ренатурации и восстановлению жесткой третичной структуры. Возможно, это обусловлено удалением N-концевого а-спирального домена. По данным РСА 7-ой а-спиральный участок имеет большую плошадь контактов как со II, так и с III ß-структурным доменом и стабилизирует третичную структуру этих доменов. Однако, не исключена и другая возможность. В 37 кДа фрагменте отсутствует около 40 аминокислот на С-конце молекулы

белка. На примере мутантов CrylAb токсина было показано, что удаление одной или нескольких аминокислот с С-конца белка приводит к образованию полипептидов, высоко чувствительных к протеолитической деградации. Эти остатки входят в пятый высококонсервативный участок структуры 5-эндотоксинов Bt. Таким образом, С-концевая часть Ш-го Р-структурного домена играет важную роль в поддержании конформационной целостности 5-эндотоксина Bt. В работе был отклонирован фрагмент ДНК, кодирующий 45.3 кДа фрагмент CrylAb б-эндотоксина, состоящий из Н-го и Ш-го доменов. К сожалению, данные по структуре полученного полипептида не приведены, так как уровень экспрессии белка был низким. Однако фрагмент взаимодействовал с мембранами чувствительных насекомых, то есть проявлял те же функции, что и в составе интактного токсина. Следует обратить внимание, что авторам работы не удалось получить фрагмент, соответствующий 11-му р-струюурному домену, что также свидетельствует о стабилизирующей роли Ш-го домена.

Таким образом, мы можем локализовать то ядро, которое поддерживает уникальную структуру б-эндотоксина и в процессе разрушения которого молекула проходит через наиболее невыгодное конформационное состояние. Ясно, что это ядро образуется С-концевой частью молекулы, к которой, возможно, примыкают четвертая-седьмая N-концевые а-спирали.

Подводя итог полученным результатам, можно утверждать, что разработан подход, позволяющий на основании данных сканирующей микрокалориметрии получить кинетические параметры денатурации - константу скорости и энергию активации денатурации. С использованием данного подхода была изучена кинетика денатурации 5-эндотоксина, метиониламинопептидазы и нескольких их фрагментов. Нативная структура этих белков является метасгабильной, по крайней мере, при повышенных температурах. Измерены температурные зависимости энергии активации и зависимости свободной энергии активации от рН среды. Полученные данные позволяют рассчитать кинетические параметры денатурации в широкой области внешних условий. В случае 5-эндотоксина показано, что изменения в структуре, связанные с процессом активации, охватывают только часть молекулы. Таким образом, ядро нуклеации при самосборке этого белка, которое и определяет его стабильность, расположено, вероятно, в С-концевой части молекулы и не захватывает три первые а-спирали N-концевого домена.

Равновесная денатурация.

Необходимым условием корректного проведения термодинамического анализа внутримолекулярного плавления макромолекулярных объектов является равновесность анализируемого процесса. Добиться равновесной ситуации можно только в том случае, если процесс плавления полностью обратим, а характерное время эксперимента достаточно велико по сравнению с временем релаксации структуры молекулы. Способность объектов исследования восстанавливать исходную конформацию после прогрева проверялась путем сравнения их парциальной теплоемкости, полученной при первом и втором прогреве. Денатурация всех последующих объектов полностью обратима, хотя кинетика восстановления структуры и зависит от размеров молекулы и степени ее разрушения. Во всех случаях, когда структура исследуемого объекта разрушена не полностью, для ее восстановления вполне достаточно того времени, за которое остывает прибор (не более 30 минут). При полном разрушении структуры характерные времена восстановления структуры возрастают. Тем не менее, отсутствие зависимости кривых удельного теплопоглощения от скорости прогрева (0,1 - 2 град/мин) указывает на равновесность анализируемого процесса.

Нативоподобное состояние.

Конформационные изменения в структуре феррицитохрома С при низкой концентрации ионов СГ.

Для изученной области внешних условий обратимость феррицитохрома С после охлаждения препарата была не хуже 80%. Наблюдаемые кривые плавления не зависели от скорости прогрева в интервале скоростей от 0.25 до 2.0 К/мин. Таким образом процесс плавления может рассматриваться как равновесный, а для анализа кривых может быть использована равновесная термодинамика.

Парциальная теплоемкость феррицитохрома С и апо-цитохрома совпадают при высокой температуре. С другой стороны, показано, что апо-цитохром С не обнаруживает упорядоченной структуры в этих условиях. Таким образом, конформационный переход феррицитохрома С, наблюдаемый как пик избыточного теплопоглощения, приводит к полной денатурации белка, что следует из совпадения теплоемкостей.

Предполагая, что молярная парциальная теплоемкость апо-цитохрома С совпадает с молярной парциальной теплоемкостью денатурированного феррицитохрома, легко вычислить заселенность всех промежуточных состояний белка во всём исследованном

температурном интервале. Результаты таких вычислений показали, что при рН >2,2 их заселенность не превышает 20% при любой температуре. Другим словами, денатурация феррицитохрома С может рассматриваться как переход между двумя состояниями, нативным и полностью развернутым, так как заметной концентрации любых термодинамически устойчивых

промежуточных форм не обнаруживается.

На рисунке 12 приведена зависимость молярной парциальной энтальпии денатурации феррицитохрома, измеренной при разных значениях рН растворов, как функция соответствующей температуры денатурации. Как видно из рисунка, зависимость представляет собой линейную функцию с наклоном, числено равным изменению парциальной молярной теплоемкости при денатурации, которое легко может быть получено непосредственно из экспериментальных кривых. Таким образом, энтальпия денатурации феррицитохрома С практически не зависит от рН и является линейной функцией температуры.

А°Н = а°„ + Т-\°„Ср. (15)

Этот результат достаточно характерен для белков. Ионизация боковых групп, аномально титруемых в кислой области рН, вносит лишь слабый вклад в энтальпийные изменения при денатурации. Однако, этот факт в данном случае является дополнительным

подтверждением того, что при любом рН 32'9 33'° 33'1

.„я - , „ -<а!/Та-л? С^п'Ы/к.мГ'-тоГ1

наЬлюдаемыи конформационныи переход " '

Рисунок 13. Зависимость рН раствора, при

осуществляется между одними и теми же ___„,„

" •• - котором переход имеет место от

состояниями. термодинамического параметра перехода

"^ы^-р 'п Та) ■ Результаты получены в растворе 25 гпМ глицин-НС1.

Рисунок 12. Зависимость калориметрической энтальпии перехода феррицитохрома С от температуры. (1) 25 гпМ глицин-НС1, рН 2,23,2. (2) ( ) 0,05-0,5 МЫаОН + НС!,рН 2.1; (х) 0,5 М КаОН + НС1, рН 2,6 и 2,9.

Хорошо известно, что тепловая денатурация белков обычно сопровождается связыванием или освобождением протонов, связанным с изменением окружения ионизируемых боковых групп. Обычно схема денатурации в этих случаях записывается как

Ы+т\. Н* 4г>ВН\ . (16)

та

Конечно, тн, вообще говоря, зависит от рН раствора и определяется конкретным распределением величин рК аномально титруемых групп. Однако, в определенных, достаточно узких областях рН, ти может оставаться приблизительно постоянным. В том случае, если единственный механизм, способный изменить стабильность белка, описывается уравнением (16), рН раствора и температура денатурации белка будут связаны следующим соотношением:

где Т0- температура, при которой энтропийное изменение при переходе из нативного состояния в денатурированное равно нулю. Г, и ДХ могут быть только слабыми функциями рН, так как основное влияние этой величины на стабильность белка прямо учитывается формулой (17).

Таким образом, если наши предположения верны, должна существовать линейная

связь между величиной рН раствора и параметром ——С}ЛпТл. Тангенс угла наклона

этой функции будет равен — ^ ^^ ^——, а ее пересечение с осью рН произойдет в точке Д"С

-—-—г-А + 1п I!) ( рис. 13 ). Полученное соотношение позволяет вычислить значения

2,303--К-Ч 0/

Та и т),. Результаты вычислений, выполненных методом наименьших квадратов, сведены в таблицу 2.

Таблица 2.

Термодинамические параметры переходов в цитохроме С.

Переход тн- тсг а (кдж/моль) ЛСР (кдж/моль/К) То{ К)

N 4-> И* 4,4 1,7 1257,1 4,44 268

1,2 -1,7 -15,4 0,56 125

5,6 - 1272,5 5,00 246

тн. и та_ - число связывающихся протонов и ионов хлора в результате перехода, а и ЛСР -

параметры, характеризующие зависимость энтальпии перехода от температуры (ЛН=а+АСр Т). То - температура, при которой энтропия перехода обращается в ноль в предположении йСр =сот1.

Конформациопные переходы феррицитохрома С в растворах с высокой концентрацией ионов СГ. *

Для того, чтобы определить термодинамические параметры стабилизации структуры феррицитохрома С при достаточно низких рН и высокой ионной силе, были рассмотрены кривые плавлення, полученные при рН в области 2,1-2,9, и концентрациях №С1 в области 0,1-0,5 М. Также, как и в случае низкой ионной силы, максимальная величина заселенности всех промежуточных состояний не превосходит 20% в области температур переходов. Конечное состояние феррицитохрома С во всех этих случаях также не отличается от состояния апо-белка, что следует из совпадения теплоемкостей этих белков в данных условиях. Как было показано ранее, теплоемкость белков чувствительна к числу экспонированных гидрофобных групп. Следовательно, можно сделать вывод, что в обоих случаях белок достигает конформации, в которой боковые группы экспонированы на воду.

Несмотря на существенные изменения условий (рН и ионной силы), в данном случае наблюдаются только небольшие температурно - зависимые изменения энтальпии переходов. Возможность, что это является результатом какой-либо компенсации, маловероятна. Более реальным предположением является то, что и в этом случае тангенс угла наклона отражает температурную зависимость энтальпии. Так как температурная зависимость энтальпии существенно отличается в растворах с низкой и высокой ионных силах, а конечное состояние по доступности гидрофобных групп идентичны, можно утверждать, что начальные состояния в этих условиях существенно различаются. Величины а и &Ср для этого перехода могут бьггь получены из температурной зависимости энтальпии денатурации. В этом случае, к сожалению, прямое измерение инкримента теплоемкости в каждом отдельном эксперименте затруднено из-за возможного наложения информационного перехода низко- и высокосолевой формы при низких температурах. Стабильность этого нового состояния (высокосолевой формы) зависит как от рН, так и от

-(«¡¡/^-а1, Ср1пТй)/ки-к" -тоГ

Рисунок 14. Зависимость рС1 раствора, при котором переход имеет место,. от термодинамического параметра перехода

концентрации МаС1 в растворе. В соответствии с рассмотрением, представленным в предыдущей части, предположим следующую схему реакции:

ЛГС£, +т;гН~ Ш+т„-СГ . (18)

Как и в предыдущем случае, выражение, связывающее температуру денатурации белка с параметрами раствора рН и рС1, легко может рассчитать.

Число связываемых протонов Н* и анионов СГ, а также температура Т„, при которой величина энтропии начального и конечного состояний совпадают при стандартных условиях, могут бьггь вычислены, как и в предыдущем случае, используя результаты двух серий экспериментов:

1) при рН 2,1 и концентрациях изменяющейся от 0,1 до 0,5 М;

2) при концентрации МаС1, равной 0,5М, и рН, изменяющемся от 2,1 до 2,9.

Одна из кривых показана на рисунке 14. Вычисленные в соответствии с уравнением (19) термодинамические параметры перехода приведены в таблице 2.

Общая схема конформационных переходов феррицитохрома С в кислой

области рН растворов. Итак, при рН < 3.2, различных концентрациях ЫаС1 и температурах феррицитохром С способен находиться в трех различных конформационных состояниях: нативном, нативоподобном, со связанными анионами СГ, и денатурированном. Общая схема реакции для конформационных переходов, имеющих место в данных условиях, может быть представлена в следующем виде:

N 4- 5,6Н* +1,7СГ ЛГя;4С/,-7 +1,2Н* ОЩ6 -I-1,7«". (20)

В принципе, могут бьтгь две причины появления дробных стехеометрических коэффициентов в полученной реакционной схеме. Во-первых, это возможная экспериментальная ошибка. Во-вторых, это то, что реальная ситуация, когда белок связывает ионы в любом из возможных состояний, но с существенно разными константами, заменена на модельную. Тем не менее, эффективное связывание ионов отражено схемой, вероятно, достаточно точно.

В действительности, эксперименты по сканирующей микрокалориметрии способны обнаружить только два из трех возможных переходов, отраженных в схеме (20). Это переход, соответствующий второму шагу процесса, а именно /V" <-»£>, или, если

концентрация №С1 достаточно мала и состояние /V* не реализуется, то прямой переход между нативным и денатурированным состоянием Константа равновесия в этом случае будет равна К = К1-Кг. Используя полученные результаты, легко вычислить

термодинамические параметры первого шага формальной схемы (20), в результате которого молекула цитохрома связывает 1,7 ионов СГ и 4,4 протона, как разницу соответствующих параметров . двух переходов. Результаты таких вычислений приведены в таблице 2. Можно видеть, что величина энтальпии для этого процесса (см. также рис. 12) настолько мала, что переход при данных условиях не может бьггь обнаружен методом сканирующей микрокалориметрии. Действительно, для того чтобы обнаружить данный переход необходимо, чтобы его температура не превосходила ЗООК. В этом случае энтальпия второго перехода будет приблизительно в 3,5 раза больше, чем энтальпия первого. Гак как амплитуда пика теплопоглощения пропорциональна квадрату энтальпии, то для второго перехода она будет в 12 раз больше, чем для первого. Принимая во внимание, что первый переход будет к тому же в 3,5 раза шире, а экспериментальные калориметрические кривые могут быть получены начиная только с 5°С, очевидно, что экспериментально обнаружить пик теплопоглощения, соответствующий первому переходу, не представляется возможным.

Единственный способ подтвердить существование первого перехода - использовать изотермическую калориметрию. На рис.15 приведена энтальпия переноса феррицитохрома С из раствора 1 мМ глицин-НС1 ( рН 2,6 ), в такой же раствор №С1. К сожалению, реальная ошибка, связанная с необходимостью экстраполяции кривой теплопоглощения, соответствующей участкам до и после перехода, на область перехода, не позволяет провести детальный термодинамический анализ. Тем не менее, можно утверждать, что величины энтальпии, полученные из этой кривой и из данных сканирующей микрокалориметрии, совпадают с экспериментальной точностью. Такое совпадение является независимым подтверждением правильности интерпретации данных сканирующей микрокалориметрии.

смосп (м)

Рисунок 15. Зависимость энтальпии

переноса феррицитохрома С из 1 тМ глицин-НС!, рН 2,6 в солевой раствор соответствующей концентрации и того же рН. Эксперименты проводились при температуре 25°С.

Доменная организация белков.

Характерной особенностью структуры изученных суперспиральных белков является наличие двух идентичных полипептидных цепей, которые, в случае отсутствия межцепочечных ЗБ-связей способны расходиться на последней стадии денатурации. Очевидно, что в этом случае плавление последнего кооперативного блока может и не описываться классической мономолекулярной моделью Вант-Гоффа АоВ. Более вероятной схемой в этом случае является схема АопВ , где п - число идентичных цепей в молекуле. Проверить это предположение можно, изучая концентрационные зависимости кривых плавления при достаточно низких концентрациях, когда межмолекулярным взаимодействием еще можно пренебречь. В случае, если модель верна, стабильность выплавляемого последним блока должна сильно зависеть от концентрации препарата, что мы реально и наблюдаем. Такая концентрационная зависимость полностью исчезает, если существует хотя бы одна межцепочечная ББ-связь.

а - тропомиозин и его фрагменты.

Нами было проведено исследование плавления структуры а-тропомиозина и четырех его фрагментов, представленных на рис. 16, при нейтральных рН раствора. Для выяснения структурных изменений, происходящих в молекуле при разрыве межцепочечной БЗ-связи, как а-тропомиозин, так и его цистеин-содержащий фрагмент €N18, были изучены в двух различных формах - с связью и без нее. Из-за наличия сильной тенденции групп в а-тропомиозине к автоокислению получить препараты с разорванными ББ связями в отсутствие редуцирующего агента без химической модификации цистеинов практически невозможно. Присутствие же р-меркаптоэтанола или дитиотрейтола в исследованном растворе приводит к возникновению побочных тепловых эффектов. По этой причине нами были использованы препараты с карбоксиметилированными 5Н-группами.

111

а-ТМ 1-284 Уга

127142 190

,1"

С(НА1Н27| ^шттппптт

И

Су 11-189 Мишина, Су 2190-284 С1НВ142-281

и,

321284

I I

I Су 190 I

Рисунок 16. Схематическое изображение молекулы а-тропомиозина и его фрагментов, использованных в работе.

Несколько важных выводов, касающихся структуры а-тропомиозина, можно сделать простым сравнением энтальпий плавления и оптических характеристик исследуемых объектов (табл. 3). Из совпадения молярных энтальпий и молекулярных весов спиральной части перекрывающихся фрагментов СМ1В/Су2 и США/Су! мы можем сделать вывод, что большие фрагменты СШВ и Су1 не имеют регулярной структуры сверх той, которая содержится в соответствующих малых фрагментах Су2 и С>!1А, а концевые участки молекулы (остатки 1-11 и 281-284) не вносят заметного вклада в его регулярную структуру. Сумма энтальпий С- и Ы- концевых фрагментов в отсутствии ЗБ-связей с точностью до погрешности эксперимента равна энтальпии денатурации а-тропомиозина. То есть участки молекулы, структурированные в его карбоксиметилированной форме, остаются структурированными и во фрагментах; фрагментация не ведет к разрушению структуры молекулы. Образование межцепочечной ЗБ-связи приводит к появлению новой структуры, что видно из увеличения энтальпии плавления и степени спиральности а-тропомиозина и фрагмента СМ Ш.

Таблица 3.

Физико-химические характеристики а-тропомиозина и его фрагментов с ББ-связыо и с карбоксиметилированными БН-группами ( СМ ).

ТМсм СМ1А Су1 Су2 ствсм

м 6,55-104 2,64-104 4,33-104 2,22-104 3,25-104

^Пбпт 3,28 1,85 1,84 6,59 5,00

6» 630 560 640 420 590 370 600

а( % ) 98 87 100 65 92 58 94

ма 6,4 5,7 2,6 2,8 2,0 1,9 3,1

(кал/г) 6,7 5,2 6,8 4,2 6,5 4,4 ' 7,3

(ккал/М) 440 340 180 180 144 144 236

М - молекулярный вес; Е171пт - коэффициент экстинкции; Ьп - параметр Моффита-Янга, измеренный при 12°С; а-стспень спиральности, рассчитанная в предположении, что 100% спирали соответствует ¿>„=-640; Ма =а.М - молекулярный вес спиральной части молекулы; Д/)„ и ДНй -удельная и молярная энтальпии плавления.

N - концевая часть молекулы.

Как видно из таблицы 3, два Ы-концевых фрагмента молекулы а-тропомиозина, США и Су 1, имеют одинаковую энтальпию плавления. Отсюда можно предположить, что в обоих этих фрагментах структурированными являются одни и те же участки. Меньший из этих фрагментов США имеет спиральность, близкую к 100%, и высокую удельную энтальпию плавления. Поэтому, весьма вероятно, что он полностью структурирован. В таком случае надо полагать, что участки, которыми отличаются эти два фрагмента (1-11, 127-190), не имеют регулярной структуры и не участвуют активно в процессе плавления.

Анализ кривых плавления СЖА и Су 1 при нейтральных рН и различных солевых условиях показывает, что оба фрагмента при повышении температуры проходят через три термодинамических состояния, энтальпии которых одинаковы для фрагментов. Это указывает на то, что плавящиеся области во фрагментах содержат одни и те же кооперативные блоки. Существуют две альтернативные интерпретации

трехстадийного плавления фрагментов США и Су 1. Первая очевидна и заключается в предположении, что каждый из наблюдаемых переходов соответствует выплавлению одного кооперативного блока, т. е. фрагменты содержат по три кооперативных блока.

Однако, можно показать, что этот результат не противоречит предположению и о наличии двух кооперативных блоков в каждом фрагменте. Более того, второе предположение оказывается более приемлемым. Для этого рассмотрим более подробно схему распада структуры, состоящей из двух кооперативных блоков. Такой модели соответствует равновесная схема денатурации, приведенная на рис. 17. Стадии 1 и 2 в такой схеме представляют выплавление элементарных блоков А и В, когда структура соседних блоков еще не разрушена. Стадии 3 и 4 представляют выплавление блоков В и А с уже денатурированным "соседом". Если существуют межблочные взаимодействия, то термодинамические параметры стабилизации блока с целым и разрушенным "соседом" не

К, /А^ К,

А*ВЫ 2(А°В°)

к2 \ дыво

К,

Рисунок 17. Термодинамическая схсма денатурации фрагментов СМ А и Су 1.

обязательно должны совпадать. Такая ситуация может быть выражена эквивалентной линейной схемой с некоторыми эффективными константами/^*, К', К],

А" В" о А°В" оП°о АпВ" К,

причем

К'Х=КХ\ С =

X,

(21) (22)

Ясно, что энтальпия взаимодействия в линейной структуре типа тропомиозина вряд ли может быть сравнима с энтальпией стабилизации отдельных блоков даже при наличии существенного межблочного взаимодействия. Следовательно, если верна двухблочная модель, энтальпия первого перехода в схеме (рис. 17) должна быть приблизительно равна энтальпии четвертого, а энтальпия второго - энтальпии третьего. Отсюда следует, что в параметрах эквивалентной линейной схемы (21) будет существовать определенная симметрия. Энтальпия первого перехода в этом случае равна энтальпии третьего, что мы реально и наблюдаем. Такое совпадение вряд ли может быть случайным. Поэтому нами была выбрана двухблочная модель IV-концевой части молекулы. Исходя из соотношений (22), легко получить параметры стабилизации блоков с целым и разрушенным "соседом". Из полученных результатов следует весьма любопытный вывод - температура перехода блока выше, если соседний блок деструктурирован. Таким образом, блоки оказывают друг на друга взаимнодестабилизирующее влияние.

Двухблочная модель денатурации подтверждается и данными ЯМР спектроскопии. При сравнении температур появление микросостояний тирозит-60 и макросостояний фрагмента видно, что между ними существует определенная корреляция: четырем состояниям молекулы

соответствуют четыре основные

конформации тирозина. Изменение в спектре ЯМР тирозина-60 при разрушении структуры соседних участков являются, вероятно,

Рисунок 18. Результаты анализа функций избыточного теплопоглощения С-концевых фрагментов в 1М КС1, 25мМ К-фосфатном буфере, рН 7,1.

(a) СШВсм, концентрация ¡,64.10^;

(b) Су2, концентрация 1,42.10"4М;

(c) СМ1В!5.

следствием некоторой релаксации оставшейся структуры в термодинамически более выгодное состояние.

С - концевая часть молекулы.

Как и в случае Ы-концевых фрагментов, фрагменты Су2 и СМ\Ва, при увеличении температуры проходят через три состояния с одинаковыми значениями энтальпии для обоих фрагментов. Следовательно, кооперативные блоки в них идентичны, а участки, которыми они отличаются (142-190), не вносят заметного вклада в образование кооперативной структуры. Как и в предыдущем случае, два перехода, а именно первый и третий, имеют одну и ту же энтальпию (рис. 18, а и в). Отсюда мы можем сделать вывод, что С-концевые фрагменты также содержат два взаимодействующих кооперативных блока.

Для выяснения термодинамических параметров вновь образовавшихся блоков при окислении БН-трупп были проанализированы кривые плавления СЫХВ^. Молекула в процессе теплового разворачивания проходит через пять различных термодинамических состояний. Исходя из того, что два уже установленных блока находятся на участке от 190 по 281 остаток и, следовательно, только один из них может находиться в непосредственной близости от БН-группы, стабильность удаленного С-концевого блока с неразрушенным "соседом" должна меняться мало. Сравнение Т„ и ДНт переходов указывает на то, что этим С-концевым блоком является блок 4. Отсутствие переходов, сравнимых по энтальпии с энтальпией уже установленного блока 3, а также наличие определенной симметрии (третий и пятый переходы по энтальпии совпадают), позволяют предположить, что три последних состояния не что иное, как следствие существования двух взаимодействующих кооперативных участков, одним из которых является блок 3. Термостабильность этого блока во фрагменте СШВ при образовании ББ-связи возрастает приблизительно на 20 градусов. Блоки 5 и 6 находятся на участке от 142 до 190 остатока, причем 5-ый и 3-ий скорее всего расположены рядом, так как между ними существует сильное дестабилизирующее взаимодействие.

а-тропо миозин.

Как отмечалось ранее, суммарная' энтальпия С- и №концевых фрагментов равна энтальпии целой молекулы, как в отсутствие, так и при наличии БЗ-связи. Создается впечатление, что в обоих этих случаях расщепление молекулы не приводит к существенным структурным изменениям: блоки, структурированные в целой молекуле, остаются структурированными и после ее расщепления. Разрыв межцепочечной ББ-связи во фрагментах и в целой молекуле приводит к разрушению одних и тех же блоков. Это

подтверждается и анализом формы калориметрических кривых. Распад структуры а-тропомиозина с карбоксиметиллрованной 5Н-группой идет через шесть термодинамических состояний,

соответствующих различным комбинациям состояний ранее обнаруженных блоков 1-4 (Рис.19, а).

В а-тропомиозине с ЗБ-связью кривые плавления, в соответствии с полученной моделью, должны представлять собой выплавление шести взаимодействующих блоков. Учитывая тип взаимодействия и параметры стабилизации, полученные на фрагментах, можно заключить, что в этом случае должны реализоваться не менее восьми термодинамических состояний. Анализ первого визуально различимого пика (Рис.19, в) показывает, что его появление связано, как и следовало ожидать, с выплавлением двух низкостабильных блоков: С-концевого блока 4 и центрального блока 6. Все остальные участки выплавляются в относительно узком температурном интервале, соответствующем второму пику теплопоглощения. Из-за большого числа состояний на узком температурном интервале при наличии экспериментальной ошибки анализ кривой на этом участке неоднозначен. Существует несколько наборов возможных параметров реализующихся состояний, достаточно хорошо описывающих второй пик тепло поглощения и не противоречащих полученной модели, но нет веских оснований отдать предпочтение какому-либо из них.

Таким образом, наличие в структуре а-тропомиозина шести блоков, обнаруженных во фрагментах, хорошо согласуется с кривыми плавления целой молекулы. Однако, ни один из установленных блоков не захватывает участки от 127 по 142 остаток. Можно гарантировать, что во фрагменте Су 1, единственном фрагменте, где присутствует этот участок, он не участвует активно в процессе плавления и, следовательно, находится в деструктурированной форме. В случае же целой молекулы, когда абсолютная ошибка измерения энтальпии уже сравнима с энтальпией минимально возможного блока, гарантировать отсутствие еше одного, седьмого блока, включающего этот участок, нельзя.

г/к

Рисунок 19. Анализ функции избыточного теплопоглощения а-тропомиозина в 1М КС1, 25 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,1. (а ) а-ТМс«; ( в ) а-ТМ показаны только три первые стадии теплопоглощения.

Однако, если он существует, его энтальпия плавления не может превышать величины 30 ккал/моль.

На основании энтальпий плавления кооперативных блоков, мы можем легко оценить их относительные размеры, если предположить, что удельная энтаьпия плавления структуры не меняется в зависимости от участка молекулы. Размеры кооперативных блоков а-тропомиозина и их взаимное расположение приведены на рисунке 20. Оба концевых участка молекулы, как и предсказывалось из анализа

последовательности, не включены в кооперативные блоки и не образуют устойчивой регулярной структуры. Действительно, как было показано, отсутствие или присутствие этой части молекулы не вносит заметных изменений в энтальпию плавления молекулы. Структура незаштрихованной области в середине молекулы (рис. 20) также, вероятно, неустойчива. На том же рисунке приведены известные триптические фрагменты а-тропомиозина. Можно видеть, что термодинамически неустойчивые в отсутствие Я 5-связи блоки 5-7, также неустойчивы по отношению к протеолизу, как и концевые участки молекулы. Хорошее соответствие между кооперативными блоками и устойчивыми протеолптпческими фрагментами подтверждает правильность полученной калориметрическим методом модели, а следовательно, и наличие дестабилизирующего взаимодействия между соседними блоками. Действительно, в соответствии с альтернативной моделью, не учитывающей возможность взаимодействия, число кооперативных блоков, а следовательно, и фрагментов, должно быть намного больше.

Суперспиральные фрагменты миозина.

На рис. 21 приведены кривые плавления спиральных фрагментов миозина в стандартных для данной работы условиях. Уже простое сравнение эффективных и калориметрических энтальпий хорошо разрешенных стадий показывает, что они соответствуют модели перехода между двумя состояниям. Таким образом и в этом случае существование отдельных кооперативных блоков не вызывает сомнений. Впервые анализ

N1(2) N2(1) N7 N6 N5 N3 N4 37 79 $20-20-28 -65 -25

(27142 СувЮО Т1 НЗЗ 12 134-284

I-,,-,

ТЗ 13-125 Т5 (83-244

I-1 |-1

( Т4 183-284 |

Рисунок 20. Схематическое изображение кооперативных блоков в молекуле а-тропомиозина. Сверху указаны условные номера блоков и их размеры, выраженные в числе остатков на одну полипептидную цепь. В нижней части рисунка приведены известные протсолитическио фрагменты (Т1-Т5 ).

а. О

1 ~ а I* / А А/\ * / А /' \ / / Ц/ 6 11111 1 1 ,л \ 1 \ / \ / \ / V' \ / .4 /1 V' 3 \ / 5 \ 11111

6 |||<| /'\ Л \ /' 1 л/ \л\ 1 I 'з гЛй А / ж к \у«\ \ \ \ \ \

30 40 50 60 ТО 30 40 50 60 70

Рисунок 21. Результаты анализа функции избыточного теплопоглощения суперспиральных фрагментов инозина в 0,5 М КС1, 25 тМ К - фосфатном буфере, рН 6,5;

(а) - ШМТ, (б ) - ШМ„, ( в ) - и-3, ( г) - ТЯ.

этих кривых был проведен в предположении независимости этих переходов на аналоговой машине СК-1 (СКБ БП). Последующий машинный анализ подтвердил правильность первоначального разложения. Все отдельные стадии денатурации приведены на рис. 21, а их термодинамические параметры сведены в табл. 4. Как видно из рисунка, кривая плавления ТЯ может быть представлена в виде шести кривых, соответствующих отдельным стадиям, пять из которых характерны для ЬММ (1-3, 5, 6) и две (3 и 5) для и-З. Различия в кривых плавления ЬММт и ЬММи сводятся к дестабилизации шестой стадии плавления на 10 градусов без заметного изменения энтальпии, что, вероятно, объясняется небольшим возмущением на данную стадию, вызванным расщеплением молекулы папаином.

Так как при получении легкого меромиозина места атаки миозинового хвоста папаином и трипсином практически совпадают, то дестабилизацию кооперативной единицы, соответствующей шестой стадии плавления, можно объяснить, лишь предположив, что она находится в непосредственной близости от атакуемого участка. Кооперативные участки, соответствующие стадиям 3 и 5, следует отнести к М-концевой области молекулы миозина ввиду их присутствия в 1Л?-3, однако, выбрать, какой из них

лежит непосредственно на конце молекулы, не представляется возможным. Переход, соответствующий четвертой стадии и характерный только для ТЯ, связан, вероятно, с денатурацией блока, расположенного на участке, отличающем ТЯ от ЬММ, то есть в спиральной части НММ. Полученная для него температура, соответствующая середине перехода, хорошо согласуется с температурой денатурации протеолитического фрагмента 8-2, в который включен данный кооперативный участок. Два последних участка, соответствующие стадиям 1 и 2, лежат в области, ограниченной с одной стороны участком 6, а с другой участками 3 и 5. Причем блок 1, характеризующийся температурой перехода 43°С, лежит, вероятно, ближе к середине всего миозинового хвоста, т.е. рядом с участком б. Последнее утверждение следует из данных Бурке и др., установивших, что вязкость раствора ТЛ очень сильно падает после прогрева свыше 43°С, в то время как для ЬММ, это не приводит к столь заметным изменениям.

Таблица 4.

Энтальпии (ДН„) и температуры середин переходов ( Тт) различных кооперативных участков в спиральных фрагментах миозина.

Объекты Номер кооперативного участка.

1 2 3 4 5 6

LF-3 т„ дн„ - - 51 160 - 56 153 -

LMMn Tm 43 49 49 - 58 53*

АН™ 182 96 182 - 158 112

LMMr тга 43 48 51 - 56 63

днт 206 115 172 - 178 127

TR Тт 43 46 49 51 54 60

днт 199 103 167 182 167 110

Средние Тт 43 48 50 51 56 61

значения. АН„ 196 105 170 182 164 116

(*) - не учтено при вычислении среднего. Значения Тт приведены в градусах Цельсия. Значения ДНт приведены в ккал/моль.

Успешное разложение кривых плавления, несмотря на наличие гетерогенности молекул по длине, в препаратах TR и LMM, объясняется, вероятно, тем, что во всех

Ж

S7000 Ж

•тштт

■

3+5 31000t зоооо

г

19000

6

21 ООО

4

33000

случаях, при получении данного образца, атака молекулы ферментом, а следовательно, и разброс по длине осуществляется в пределах одного кооперативного участка,

разрушаемого при любом из этих расщеплений и не оказывающего заметного влияния на

кооперативное™ и стабильность соседних участков. Постоянство стабильности блоков вне

зависимости от фрагмента, в который они включены, говорит о практически полном отсутствии межблочного взаимодействия.

Небольшие расхождения в температуре переходов (не более 2°С) и энтальпиях (не более ± 10%), полученные при анализе различных кривых, не превышают суммарную ошибку эксперимента.

Зная молекулярный вес всей спиральной части LMM, его суммарную энтальпию и энтальпию плавления каждого блока, можно легко оценить их размеры в предположении постоянства удельной энтальпии. Полученные молекулярные веса кооперативных участков и их положения в спиральной части молекулы миозина приведены на рис. 22. Там же указаны известные протеолитические фрагменты миозинового хвоста. Из этого рисунка можно видеть наличие четкой корреляции между концами устойчивых структурированных фрагментов и концами кооперативных блоков.

Рисунок 22. Схематическое изображение

структуры молекулы миозина. Сверху указаны молекулярные веса возможных протеолитических фрагментов; фигурными скобками - расположение кооперативных участков в суперспиральном "хвосте" молекулы. В нижней части рисунка стрелками показаны наборы кооперативных участков, соответствующие протеолитическим фрагментам, и их молекулярный вес, полученный на основании термодинамического анализа.

Возможные причины дискретности структуры а - суперспиральных белков.

Одним из наиболее важных результатов данной работы является то, что регулярная структура а-суперспиральных белков не непрерывна, но дискретна, то есть разделена на отдельные кооперативные блоки в некоторых "точках", расположение которых и

определяет размеры устойчивых протеолитических фрагментов. Между структурами соседних блоков существует слабое взаимодействие, которое в некоторых случаях имеет дестабилизирующий характер. Так как кооперативный блок не может существовать в частично структурированной форме, то расщепление полипептидной цепи в любой его точке приводит к дестабилизации блока и, как следствие, к быстрому его удалению Однако, это практически не уменьшает стабильность соседних блоков, а в некоторых случаях даже приводит к их стабилизации. В результате относительно устойчивыми будут только те фрагменты, границы которых совпадают с границами кооперативных блоков.

Однако, причины разбиения структуры а-суперспиралей на отдельные кооперативные блоки и механизм их взаимнодестабилизирующего влияния остается не ясен. Это может быть связано с аккумуляцией напряжений в деформированной а-спирапи, что подтверждается и полученными нами данными по ЯМР спектроскопии. Как упоминалось ранее, Тир-60 в структуре Я-концевого фрагмента оказывается очень чувствителен к структурным изменениям в других частях молекулы. При разрушении структуры соседних участков, напряжение может ослабевать, что и приводит к релаксационным структурным изменениям.

В нативной структуре молекулы напряжение будет сниматься в некоторых слабых точках регулярной структуры и проявляться как дефект этой структуры, который и может служить зоной, разделяющей кооперативные блоки. В связи с этим нужно упомянуть данные Филипса и сотр., полученные методом рентгеноструктурного кристаллографического анализа. Карта электронной плотности а-тропомиозина, полученная авторами с разрешением 15 ангстрем, указывает на то, что структура молекулы неоднородна. На некоторых участках молекулы наблюдаются заметные утолщения. В результате проведенного исследования авторы сделали вывод, что существующая в настоящее время структурная модель а-тропомиозина, предполагающая высокое содержание а-суперспиралей и наличие квазиэквивалентных участков связывания молекулы с актином, слишком упрощена. Реальная молекула намного менее регулярна и намного менее жесткая. То же самое, вероятно, можно сказать о других представителях этого структурного класса.

Однако, дискретность структуры а-суперспиралей не может быть объяснена только на основании необходимости снятия напряжений, так как кооперативные блоки имеют существенно различающиеся размеры. Нарушения структуры, разделяющей блоки, должны, вероятно, кодироваться однозначным образом аминокислотной последовательностью молекулы в виде некоторых отклонений от характерной для а-суперспиралей периодичности. Анализ последовательности а-тропомиозина дает

несколько таких нарушений в распределении гидрофобных остатков на поверхности а-спирали. Например, в положениях 1 и 4 гептапептидов, в которых, как правило, находятся гидрофобные остатки, обнаружены глугамин и глутаминовая кислота (положения 144, 218, 263), аспарагиновая кислота (137), треонин (53), серии (36, 123, 186), лизин (15, 29), тирозин (60, 162, 214, 221, 267). Некоторые из этих нарушений действительно расположены на граничных участках между блоками.

Другой аспект проблемы - биологическая значимость дискретного характера а-суперспиральных структур. Возможно, что наличие участков, связывающих жесткие кооперативные блоки, обеспечивает необходимый уровень их относительной подвижности. С другой стороны, дискретность структуры дает возможность осуществлять конформационные перестройки отдельных кооперативных блоков, никак не влияя на структуру большей части молекулы, что существенно снижает необходимый уровень энергетических затрат. Например, разрушение регулярной структуры низкостабильных блоков способно заметно изменить длину молекулы без существенных затрат энергии.

В миозине, два сегмента нерегулярной или очень низкостабильной структуры расположены на участках, которые соответствуют концам фрагмента S2, то есть в тех местах молекулы, которые обеспечивают функционально важную относительную подвижность "хвоста" и "головки". Более того, не исключено, что конформационный низкостабильный переход спираль-клубок, происходящий в этой части молекулы, является основным источником тянущего усилия при мышечном сокращении.

В а-тропомиозине сегменты с пониженной стабильностью локализованы в центральной части молекулы и, что особенно интересно, их стабильность может регулироваться изменением состояния цистеиновых остатков. В связи с этим возникает вопрос, не моделирует ли изменение структуры молекулы, происходящее при восстановлении SS-связи, тех изменений in vivo, которые имеют место в процессе кальциевой регуляции актомиозиновой АТФ-азы, тем более, что тропонин, основной элемент Са2*-чувствительного регуляторного комплекса, связывается с тропомиозином, вероятно, вблизи этого участка. Эта гипотеза становится особенно привлекательной, если вспомнить, что до сих пор не ясно, каким образом тропомиозин перемещается в канавках тонких нитей без изменения его длины.

Другой вопрос, который необходимо упомянуть, это то, что концевые части а-тропомиозина, не включенные в кооперативные блоки, играют важную роль в образовании длинных надмолекулярных структур. В результате проведенного исследования можно сделать вывод, что полимеризация а-тропомиозина не является простым

комплементарным контактом двух, достаточно жестких структур, но представляет процесс образования кооперативной системы из четырех неструктурированных пептидов.

Другие многодоменные белки и фрагменты.

Иммуноглобулин G кролика и его фрагменты.

Нами была изучена тепловая денатурация иммуноглобулина G и трех его фрагментов Fab, pFc' и Fc в кислой области рН. На рисунке 23 приведено схематическое изображение структуры этой молекулы. Равновесный термодинамический анализ калориметрических кривых, полученных при различных рН, позволил сделать следующие выводы:

1. Fab и Fc фрагменты в структуре иммуноглобулина G практически не взаимодействуют. Протеолитическое расщепление молекулы на эти два фрагмента практически не меняют стабильность их структуры.

2. Разрушение структуры Fab фрагмента проходит в три стадии. Первая, низкоэнтальпийная стадия плавления обусловлена, вероятно, разрушением структуры в области контактной зоны между вариабельными и константными доменами. Два вариабельных структурных домена из легкой и тяжелой цепи, точно так же как и два константных домена, образуют единую кооперативную систему. Две последующие стадии денатурации обусловлены разрушением вышеупомянутых блоков. Энтальпия денатурации и стабильность блока, состоящего из константных доменов, ниже, чем соответствующие параметры для блока вариабельных доменов.

3. Денатурация Fc и pFc' фрагментов проходит в четыре и две стадии, соответственно. Причины для такого поведения могут быть две. Одна из них -гетерогенность препарата по степени гликозилирования. Известно, что гликозилирование способно заметно изменить стабильность модифицированной структурной единицы. Если же это не так, то полученные данные могут быть объяснены, только если предположить, что структурные СцЗ домены не представляют собой единое структурное компактное формирование, но состоят из двух неидентичных субдоменов, которые объединяются в несимметричный Сн2 димер, образуя два неидентичных кооперативных блока.

N-коней г.ь

Рисунок 23. Схематическое изображение молекулы иммуноглобулина G.

Фибритии.

Еще один белок, денатурация которого протекает в несколько стадий - это фибритин, продукт гена \юс бактериофага Т4. Этот белок содержит 486 аминокислотных остатков. Анализ аминокислотной последовательности выявил область, состоящую из 408 аминокислот с последовательностью, характерной для а-суперспиралей, и концевые области ( 47 на 1Ч-конце и 29 на С-конце), для которых эти закономерности в распределении аминокислотных остатков нарушаются. Суперспиральная область молекулы разбита на сегменты короткими участками различной длины с высоким содержанием пролина и глицина. Было показано, что большая часть структуры фибритина - трехзаходная параллельная а-суперспираль. Эксперименты по прямому и обратному сканированию показали существование определенного гистерезиса в процессе денатурации-ренатурации молекулы. Это указывает на достаточно большие времена релаксации в области температуры перехода. Исключение составляет первая стадия плавления. Сравнение кривых плавления целой молекулы и фрагмента ШАС-Ы2 с делецией на Ы-конце дает основание утверждать, что этот наиболее низкостабильный пик соответствует Ы-концевому домену молекулы.

Учитывая большие времена релаксации, строго говоря, термодинамический анализ оставшейся части кривых плавления не может считаться правомочным. Использование простых кинетических моделей также не дало удовлетворительных результатов. Тем не менее, сложность кривых плавления, наличие ярко выраженных максимумов и точек перегиба позволяют утверждать, что молекула состоит не менее чем из пяти термодинамических доменов.

ВЫВОДЫ.

1. На основании теории комплексных чисел разработан аппарат обобщенных переходов между двумя состояниями, позволяющий представлять кривые избыточного теплопоглощения произвольной термодинамической системы в виде суммы определенного вида пиков теплопоглощения. Класс обобщенных переходов между двумя состояниями представляет собой вырожденный базис по отношению к любой термодинамической системе.

2. Используя аппарат обобщенных переходов между двумя состояниями, проанализированы несколько простейших моделей конформационных переходов в реальных биополимерах. В частности, оценена область энергий междоменных

взаимодействий, которые могут быть реально измерены в микрокалориметрических экспериментах.

3. Разработан аппарат анализа (деконволюции) экспериментальных кривых избыточного теплопоглощения в равновесных и неравновесных экспериментах. Проанализированы области устойчивости алгоритмов.

4. Проанализирована модель одностадийной обратимой неравновесной тепловой денатурации. Показано, что в определенных случаях причиной кажущейся необратимости при тепловой денатурации может быть неравновесность процесса охлаждения.

5. Разработанные методы применены к большому набору фибрилярных и глобулярных белков (а-тропомиозин, суперспиральный хвост молекулы миозина, 6-эндотоксин, метионинаминопептидаза, имуноглобулин в, фибритин и их фрагменты). В случаях равновесной денатурации построены карты доменной организации изученных белков. Показана определяющая роль доменной организации в образовании продуктов ограниченного протеолиза молекул. Концы структурированых протеолитических фрагментов всегда совпадают с границами кооперативных блоков.

6. В случаях метасгабильных структур получены термодинамические параметры их активированного (переходного) состояния. Показано, что белки в активированном состоянии представляют собой компактные, слабогидратированые структуры, близкие к нативным. Изменение структуры белка, происходящее при активации, затрагивает далеко не всю структуру молекулы.

Публикации автора по теме диссертации:

1. Потехин С.А., Привалов П.Л. (1978) Тепловая денатурация а-тропомиозина и его

фрагментов. Биофизика, 23,219-223.

2. Потехин С.А., Филимонов В.В. Специфическое расщепление а-тропомиозина по

цистеину-190 и физико-химическое изучение фрагментов. (1978} Биофизика, 23, 986-990.

3. Потехин С.А., Трапков В.А., Привалов П.Л. (1978) Структура миозинового "хвоста" и

тепловая денатурация его спиральных фрагментов. III Всесоюзная конференция по биохимии мышц. Ленинград, 24-26 мая, тезисы докладов, 142.

4. Потехин С.А., Трапков В. А., Привалов П.Л. (1979) Стадийность тепловой денатурации

спиральных фрагментов миозина. Биофизика, 24,46-50.

5. Потехин С.А., Привалов П.Л. (1979) Тепловая денатурация парамиозина и его

фрагментов. Мол. биол., 13, 666-672.

6. Потехин С.А., Привалов П.Л. (1979) Основные закономерности тепловой денатурации а-

суперспиральных белков. VIII Всесоюзная конференция по калориметрии и химической термодинамике. Иваново, 25-27 сентября, тезисы докладов, 418-420.

7. Матвеев C.B., Потехин С.А., Привалов П.Л., Филимонов В.В. (1980)

Термодинамический подход к исследованию структурной организации

макромолекул. V Совещание по конформационным изменениям биополимеров в растворах. Телави, 1-3 октября, тезисы докладов, 74.

8. Potekhin S.A. & Privatov P L. (1980) Cooperative blocks in tropomyosin molecules.

International Symposium on Biocalorimelry, Tbilisi (USSR), September 21-27, abstracts, 20.

9. Potekhin S.A. & Privalov P L. (1982) Co-operative blocks in tropomyosin. J. Mol. Bio!., 159,

519-535.

10. Филимонов В В., Потехин C.A., Матвеев С.В., Привалов П.Л. (1982)

Термодинамический анализ данных сканирующей микрокалориметрии. I. Алгоритмы деконволюции кривых избыточного теплопоглащения. Мол. виол., 26, 551-562.

11. Tishchenko V.M., Zav'yalov V.P., Medgyesi G.A., Potekhin S.A. & Privalov P.L. (1982) A

thermodynamic study of cooperative structures in rabbit immunoglobulin G. Eur. J. Biochem., 126,517-521.

12. Потехин С.А., Привалов П.Л. (1983) Блочная структура а-тропомиозина. Всесоюзный

симпозиум по биохимии и биофизике мышечного сокращения. Тбилиси, тезисы докладов, 55-56.

13. Potekhin S.A. and Pfeil W. (1985) Physico-chemical properties of biopolymers in solution and

cells. International Symposium on Physico-Chemical Properties of Biopolymers in Solutions and Cells, Pushchino, 1985, p.59.

14. Потехин С.A. (1985) Термодинамический анализ конформационных изменений

феррицитохрома с при кислых значениях рН. VI Всесоюзный симпозиум по конформационным изменениям биополимеров в растворах. Тбилиси, 15.

15. Privalov P L. & Potekhin S.A. (1986) Scanning microcalorimetry in studying temperature-

induced changes in proteins. Methods in Enzymology, 131, 1-51.

16. Potekhin S.A. & Pfeil W. Microcalorimetric studies of conformational transitions of

ferricytochrome-C in acidic solution. Biophys. Chem. 34, 55-62, 1989.

17. Потехин C.A., Кутытенко В.П. (1990) Изучение денатурации N-концевого фрагмента

а-тропомиозина методами сканирующей микрокалориметрии и ЯМР. IX Всесоюзный симпозиум по биохимии и биофизике биологической подвижности (мышечное сокращение). Тбилиси, тезисы докладов, 32.

18. Кутышенко В.П., Потехин С.А., СмаллаК.Х. (1991) Изучение N-концевых фрагментов

а-тропомиозина методом ЯМР спектроскопии. Биофизика, 36, 762-769.

19. Потехин С.А. (1993) Обобщенная модель переходов между двумя состояниями;

удобный аппарат для анализа формы кривых плавления. Биофизика, 38, 47-57.

20. Потехин С.А. (1993) Обобщенная модель переходов между двумя состояниями.

Применение к анализу формы кривых избыточной теплоемкости по статистической сумме системы. Биофизика, 38, 239-252.

21. Efimov V.P., Nepluev I.V., Sobolev B.N., Zurabishvili T.G., Schulthess Т., Lusting A., Engel

J., HaenerM., Aebi U., Venyaminov S.Yu., Potekhin S.A. & Mesyanzhinov V.V, (1994) Fibritin encoded by bacteriophage T4 gene wac has a parallel triple-stranded alpha-helical coiled coil structure. J. Mol. Biol. 242, 470-486.

22. Potekhin S.A. (1994) A generalized model for two-state transitions; Additive representation of

curves of excessive heat absorption. International and III Sino-Japanese Symp. on Thermal Measurements. Xi'an, China, June 5-9.

23. Лосева О.И., Киркитадзе М.Д., Добрица А.П., Потехин С.А. (1996) Термодинамический

анализ доменной организации токсинов из Bacillus thuringiensis. Биоорг. химия., 22, 900-906.

24. Потехин С.А., Ковригин Е.Л. (1998) Влияние кинетики на тепловую денатурацию и

ренатурацию биополимеров. Биофизика, 43, 223-232

25. Potekhin S.A. & Kovrigin E.L. (1998) Folding under inequilibrium conditions as a possible

reason for partial irreversibility of heat-denatured proteins: computer simulation study. Biophys. Chem., 73, 241-248.

26. Potekhin, S.A., Loseva O.I., Tiktopulo, E.I & Dobritsa, A.P. (1998) Microcalorimetric study of

Cry 3A 5-endotoxin from Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis denaturation. International Symposium "Protein structure, stability and folding. Fundamental and medical aspects." Moscow, Russia, June 22-26, 59.

27. Loseva O.I., Potekhin, S.A., Tiktopulo, E.I., Kirkitadze, M.D. & Dobritsa, A.P. (1998)

Thermodynamic analysis of heat denaturation of Bacillus thuringiensis 5-endotoxins. VII-th International colloquium on invertebrate pathology and microbial control. IVth International conference on Bacillus thuringiensis. Sapporo, Japan, August 23-28, 39-40.

28. Potekhin S.A., Loseva O.I., Tiktopulo E.I. & Dobritsa A.P. (1999) Transition state of the rate

limiting step of heat denaturation of Cry3 A 8-endotoxin. Biochemistry, accepted.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора физико-математических наук, Потехин, Сергей Александрович, Пущино

," „^ - А / ^^ с

,/ / ^ о- / / /"

российская академия наук

7 А>Г

Президиум ВАК Р(ШШУТ . и -1 хк.......

степенъ ДОКТОРА

_наук

Начальник Управления ВАК России

белка

Потехин Сергей Александрович

ПЕРЕХОДНЫЕ СОСТОЯНИЯ И ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВ

Диссертация на соискание ученой степени доктора физико-математических наук

СОДЕРЖАНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................5

II.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8 II. 1. Термодинамическое исследование тепловой

денатурации белков..........................................................................9

ii. 2. Микрокалориметрическое исследование

кинетики тепловой денатурации.....................................................20

ii. 3. Изучение природы активированного состояния.........................24

ii. 4. Объекты исследования..........................................................................25

II. 4.1. а -тропомиозин.....................................................................................25

II. 4.2. Миозин...................................................................................................27

II. 4.3. СгуЗА 5-эндотоксин..............................................................................29

II. 4.4. Другие белки использованные в работе...............................................30

III. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 32

III. 1. Равновесная денатурация..................................................................33

III. 1.1. Термодинамическое описание многостадийных процессов.............33

III. 1.2. Теория обобщенных переходов между двумя состояниями............36

III. 1.2(а). Общие положения........................ .............................................36

111.1.2(6). Переход между двумя состояниями

с комплексной вырожденностью...........................................38

Ш.1.2(в). Вырожденность представления термодинамических

систем......................................................................................45

Ш.1.2(г). Алгоритм анализа поведения термодинамических

систем............................... .........................................................46

III. 1.3. Поведение двухстадийной модели тепловой денатурации..............48

III. 1.4. Двухдоменная модель денатурации с взаимодействующими............

доменами................................................................................................54

III. 1.5. Методы термодинамического анализа реальных

калориметрических данных..............................................................60

III. 2. Неравновесная денатурация 73

III. 2.1. Влияние кинетических факторов на тепловую

денатурацию и ренатурацию биополимеров............... ..........................73

III.2.1(a). Методы расчета..........................................................................74

III.2.1(6). Влияние медленной кинетики и констант скоростей реакций на калориметрические.

кривые при прогреве образца..................................................77

Ш.2.1(в). Обратное сканирование....................... .......................................84

Ш.2.1(г). Повторное сканирование препаратов............... .........................88

III. 2.2. Методы анализа неравновесных

экспериментальных данных..............................................................91

IV. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАС ТЬ 92 IV. 1. Методы выделения и очистки препаратов..................................93

IV. 1.1. Выделение и очистка а-тропомиозина

и его фрагментов.................................................................................93

IV. 1.2. Выделение и очистка суперспиральных

фрагментов миозина........................... ................................................96

IV. 1.3. Выделение и очистка СгуЗА 5-эндотоксина

и его фрагментов...............................................................................98

IV. 1.4. Другие экспериментальные методики

использованные в работе...................................................................99

IV. 2. Результаты............................................................................................103

IV. 2.1. Неравновесная денатурация................................................104

IV. 2.1 (а). Метионинаминопептидаза......................................................104

IV. 2.1(6). СгуЗА б-эндотоксин................................................................110

IV. 2. 2. Равновесная денатурация.....................................................119

IV. 2.2(а). Цитохром С.............................................................................119

IV. 2.2 (б), а -Тропомиозин и его фрагменты.........................................129

IV. 2.2 (в). Суперспиральные фрагменты миозина............ .....................142

IV. 2.2 (г). Другие белки и фрагменты....................................................146

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 153

V. 1. Кинетически контролируемая денатурация

и природа переходного состояния........................................154

V. 2. Дискретность структуры.........................................................163

VI. ВЫВОДЫ...............................................................................................................166

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 167

I. ВВЕДЕНИЕ

Изучение процессов денатурации и ренатурации белков - основной способ получения информации о природе кооперативное™, механизме поддержания и энергетике структуры макромолекул. Особая роль при этом, как и при изучении любого другого термодинамического процесса, отводится измерению сопряженных термодинамических параметров. Появление дополнительной связи между интенсивным и экстенсивным параметрами позволяет существенно повысить надежность анализа получаемых экспериментальных данных и интерпретацию получаемых результатов [7,10,15,29-32].

Новая прецизионная микрокалориметрическая техника, способная надежно измерять малые тепловые эффекты, сопровождающие конформационные перестройки биополимеров в разбавленных растворах, предоставляет такую возможность. Метод сканирующей микрокалориметрии позволяет измерять температурную зависимость энтальпии системы с достаточной точностью. Знание этой функции для равновесных экспериментов автоматически означает и знание статистической суммы, которая является ключевой функцией для физического описания любой термодинамической системы [7,10,15,29,30,32]. Группа термодинамики Института белка РАН традиционно занимается разработкой прецизионных сканирующих микрокалориметров. Один из лучших приборов нового поколения, сканирующий микрокалориметр "$САЬ-1" с уникальной стеклянной ячейкой и отличными динамическими свойствами, разработан под научным руководством автора диссертации.

Однако, определение парциальной энтальпии или теплоемкости биологических макромолекул в разбавленных растворах - лишь первый шаг в развитии экспериментального подхода к получению структурно-термодинамической информации. Следующим шагом является разработка методов анализа (деконволюции) этих функций, то есть способов извлечения информации, содержащейся в температурной зависимости энтальпии. В этом направлении работали многие калориметрические группы как у нас, так и зарубежом [15,29,32]. В диссертации рассматриваются методы анализа равновесных калориметрических кривых на основании статистической суммы системы. Изучены вопросы устойчивости алгоритмов и допустимая область их применения. Как будет показано далее, разработанные методы анализа позволяют во многих случаях рассчитать

число и термодинамические параметры стабилизации структуры промежуточных состояний белка, реализующихся во всем рабочем температурном интервале. Наличие таких устойчивых конформаций прямо указывает на существование в молекуле отдельных кооперативных структурных образований - доменов, структура которых может поддерживаться в значительной степени независимо. Наиболее впечатляющими результатами развития этого направления является построение карт доменной организации ряда белков. Полученные карты доменной организации подтверждаются результатами ограниченного протеолиза молекул. Как будет показано далее, существует определенная корреляция между границами устойчивых протеолитических фрагментов и границами кооперативных термодинамических доменов. Компьютерные программы анализа калориметрических данных, созданные на основе разработанных алгоритмов, используются во многих лабораториях мира.

Еще один важный вопрос, который может быть решен методом сканирующей микрокалориметрии, - это каким образом домены в белках взаимодействуют друг с другом? Каким образом междоменные взаимодействия могут сказываться на кривых плавления? Как такая информация может быть получена из калориметрических данных? Для решения этих вопросов был использован аппарат обобщенных переходов между двумя состояниями, ставящий в соответствие любому комплексному числу определенный пик теплопоглощения [19,22]. Как будет продемонстрировано, класс обобщенных переходов между двумя состояниями порождает вырожденный базис по отношению к переходам любой термодинамической системы. Использование этого аппарата позволило просто и наглядно продемонстрировать поведение двухдоменной системы в присутствии междоменных взаимодействий. Значение разработанной теории обобщенных переходов между двумя состояниями не ограничивается продемонстрированными примерами. Теория может быть использована и в дальнейшем как для анализа поведения сложных термодинамических систем, так и для описания реальных калориметрических данных.

Однако, многочисленные исследования позволяют утверждать, что денатурация далеко не всегда является равновесной. Структура многих белков существует в растворе только благодаря высокому энергетическому активационному барьеру, отделяющему денатурированное состояние от нативного. Нами были изучены те последствия, к которым приводит такая ситуация [24]. И хотя кривые в этом случае не могут быть проанализированы термодинамически, они несут много другой полезной информации о кинетике и параметрах активированного (переходного) состояния. На нескольких

примерах будет показано, каким образом такая информация может быть получена из калориметрических данных, и каким образом, используя корреляционный анализ, может быть получена структурная информация об особенностях переходного состояния. Одним из важнейших результатов использования такого подхода стал важный вывод о том, что переходное состояние является компактным слабогидратированым состоянием, а изменения в структуре белка при активации охватывают далеко не всю молекулу.

Всего в данной работе представлены материалы анализа экспериментальных данных о 20 различных белках и фрагментах, принадлежащих различным структурным классам. Полученные данные позволили сформулировать некоторые достаточно общие выводы о структурно-термодинамических принципах организации белков в нативном и переходном состояниях.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

II. 1. Термодинамическое исследование тепловой денатурации белков.

Явление денатурации - одно из свойств белка, установленное еще в прошлом веке. Однако, количественные исследования этого явления равновесными и кинетическими методами берут начало, вероятно, с работ Германса [34], Брандтса, Ламри и Билтонена [35-38]. Основой для получения количественной термодинамической информации было введение предположения, что денатурация - мономолекулярный процесс перехода белка из одного состояния N - нативного, в другое О - денатурированное. Денатурация здесь понималась как высококооперативный процесс изменения конформации, охватывающий всю молекулу, что позволило получать эффективные константы равновесия на основании любых физико-химических параметров, характеризующих состояние белка.

(5) _ (м)

Кэф = /П-1ч

где и ©0 - значения параметров белка в нативном и денатурированном состояниях, соответственно, а ©х- текущее значение этого параметра при заданных условиях. Изучая зависимость константы равновесия от внешних условий, можно получить изменение термодинамических параметров, характеризующих денатурационный процесс. Например: свободную энергию АСэф = -Я ■ Т • 1п К3*, (П-2)

г]\п Кзф

энтальпию АНэф = Я ■ Т2 ■ , (П-З)

йТ К '

с11п Кэф

парциальный молярный объем ЬУэф = -Я ■ Т--, (П-4)

ф

¿Лп Кзф

количество связанных лигандов Ауэф = Я-Т--, (П-5)

с1а

где Я - универсальная газовая постоянная, Т - соответствующая абсолютная температура, р - давление, и а - активность лигандов. Такой подход начал широко использоваться, и мнение о том, что денатурация - кооперативный процесс, проходящий по принципу "все или ничего", постепенно стало превалирующим. Сильным толчком для такого рода исследований послужило открытие полной обратимости процесса денатурации [39], а следовательно, и принципиальной возможности применения равновесной термодинамики к его изучению. Однако, второе постулируемое

предположение - применимость модели двух состояний, вызывало серьезные возражения. Нелинейность графиков зависимости логарифма константы равновесия от обратной температуры, обнаруженная при повышении точности измерений, допускала двоякую интерпретацию. Брандтс [35-36], Ламри и сотр. [88], исходя из детального анализа формы кривых перехода, пришли к выводу, что вышеуказанная нелинейность отражает температурную зависимость энтальпии процесса денатурации. Это, в свою очередь, означает, что теплоемкости нативного и денатурированного состояний должны существенно отличаться, так как

и Ср- соответствующие величины для нативного состояния, Аср - изменение молярной

теплоемкости белка при денатурации. Предполагалось, что разность теплоемкостей обусловлена экспонированием гидрофобных групп белка в водную среду. Такое предположение основывалось на данных по исследованию модельных соединений, согласно которым теплоемкость гидрофобных групп существенно возрастает при переносе из неполярного окружения в воду [40-41].

Тем не менее, Поланд и Шерага [42] на основании дополнительных кинетических исследований денатурации рибонуклеазы [43] подвергли резкой критике модель двух состояний. Появились наблюдения [44-45], говорящие о несимбатности изменения различных параметров при денатурации белков. Кроме того, было установлено, что изменения физико-химических параметров происходят во всей области внешних условий [35, 46]. Применимость модели двух состояний к столь большим объектам, как белки, начала казаться маловероятной. Значительно проще было предположить, что процесс разворачивания полипептидной глобулы осуществляется постепенно [47] или хотя бы через определенные стадии [48]. В связи с этим была опубликована целая серия работ, обосновывающая правдоподобность секвентальной модели денатурации глобулярных белков [49-50].

В такой ситуации стало очевидным, что решение вопроса о применимости модели двух состояний и использование этой модели для получения термодинамических функций стабилизации макромолекул требует более детальной проверки, чем это делалось ранее; все используемые ранее критерии были, как правило, необходимыми, но не достаточными.

(П-6)

где Н° и Ср - молярные энтальпия и теплоемкость денатурированного состояния, а Н

N

Рисунок. 1 Блок-схема сканирующего микрокалориметра.

С1 и С2 - калориметрические ячейки; и 02 - подводящие капилляры; А и В - внешняя и внутренняя адиабатизирующие оболочки; Т - термометр сопротивлений; ДТ1 и ДТ2 -термопарные батареи терморегуляторов; (1) - система создания дополнительного давления; (2) - терморегулятор оболочки; (3) - блок индикации температуры; (4) - система термостатирования оболочек блока; (5) - блок регистрации; (6) - система измерения теплового эффекта.

В решении этой проблемы главная роль отводилась калориметрическому методу. Хотя значение прямых термодинамических измерений было осознано давно [37], создание приборов, удовлетворяющих всем необходимым требованиям, наталкивалось на серьезные технические трудности. Решение проблемы стало возможным после появления прецизионных сканирующих калориметров. Типичная блок-схема сканирующего микрокалориметра приведена на рисунке 1. С помощью такого прибора удается выделить и измерить теплопоглощение, связанное с самим объектом исследования, на фоне в тысячи раз большего теплопоглощения растворителя. Такой эффект достигается благодаря тому, что данные приборы работают по дифференциальному принципу. С их помощью измеряется не абсолютная теплоемкость раствора, а разность теплоемкостей раствора и растворителя, залитых в разные ячейки. Создание сканирующих

микрокалориметров позволило, наконец, дать однозначный ответ о числе состояний, реализующихся в процессе равновесной тепловой денатурации малых глобулярных белков.

В качестве примера на рисунке 2 показан внешний вид сканирующего микрокалориметра нового поколения "Бса!-!". Это полностью автоматизированный

Таблица 1.

Основные характеристики микрокалориметра "Бса!-!".

Максимальный высокочастотный шум.........................................0.25 мкват

Время релаксации............................................................................20 с

Рабочая область температур........................ ................................-10 : • 130Х

Камеры:

материал:...............................................................................стекло

форма:..................................................................................цилиндр

объем:.....................................................................................0.34 мл

Воспроизводимось базовой линии при

скорости прогрева 1°С/мин.............................................................1.0 мкват

Возможные скорости прогрева ,°С/мин.......................0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0 и 2.0

Дополнительное давление..................................................................2.5 атм

Размер.......................................................................................660x340x260 (мм)

Вес.......................................................................................................25 кг

прибор с цилиндрической стеклянной ячейкой. Ячейка обладает высокой химической устойчивостью и отличными динамическими характеристиками (Таблица 1). Прибор разработан в Лаборатории термодинамики белк�