Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение моноспецифических антител к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка и онкодиагностики

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Получение моноспецифических антител к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка и онкодиагностики"

на правах рукописи

Аскарова Елена Владимировна

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К СУРВИВИНУ ДЛЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ БЕЛКА И

ОНКОДИАГНОСТИКИ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

г 1 .моя 2013

005538624

Москва - 2013

005538624

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова и лаборатории синтетических вакцин Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Научные руководители:

Каплун Александр Петрович, доктор химических наук, профессор кафедры органической химии им. И.М. Назарова Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова. Волкова Татьяна Даниловна, кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории синтетических вакцин ФГБУН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Официальные оппоненты:

Уткин Юрий Николаевич, доктор химических наук, заведующий лабораторией молекулярной токсинологии ФГБУН Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Желтухина Галина Александровна, кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник кафедры химии и технологии биологически активных соединений им. H.A. Преображенского Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Защита диссертации состоится «09» декабря 2013 г. в УУ на заседании диссертационного совета Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, д.86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «Q » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат химических наук,

старший научный сотрудник

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ*

Актуальность проблемы. Сурвивин - это один из представителей семейства белков-ингибиторов апоптоза (1АР), экспрессирующийся только в опухолевых, но не в здоровых тканях. В отличие от других белков семейства функции сурвивина не ограничиваются лишь ингибированием программированной клеточной смерти, он также является важным регулятором клеточного деления. Благодаря своей бифункциональное™ сурвивин играет важную роль в онкогенезе: с одной стороны он позволяет клеткам с дефектами веретена деления продолжать деление, с другой - делает их устойчивыми к действию хемотерапевтических агентов, гамма-излучения и иммунотерапии [1л й а1, 2006].

Было показано, что функции сурвивина могут зависеть от его локализации в клетке и структурного состояния [Рау1уикоу й а1, 2011]. Поэтому структурно-функциональные исследования этого белка являются актуальной задачей, решение которой приведет к лучшему пониманию процессов перерождения здоровой клетки в раковую, а также позволит разработать новые подходы к терапии и уточняющей диагностике онкозаболеваний.

Изучение структурно-функциональных особенностей сурвивина осложнено тем, что практически отсутствуют антитела, селективно связывающие различные структурные формы сурвивина. Мы предположили, что подобные антитела могут быть получены путем иммунизации животных синтетическими пептидными фрагментами сурвивина, моделирующими различные функционально важные участки белка.

Цель работы. Получение с помощью синтетических пептидов, моделирующих различные функционально важные участки сурвивина, антител, пригодных для изучения структурно-функциональных особенностей белка и уточняющей диагностики онкозаболеваний.

В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выбор пептидных фрагментов сурвивина для получения антител.

2. Иммунизация животных пептидными фрагментами сурвивина и получение противопептидных сывороток.

3. Выделение из сывороток с помощью аффинной хроматографии на сорбентах с иммобилизованными пептидами моноспецифических антител, направленных к строго определенным участкам сурвивина.

4. Изучение свойств полученных антител и оценка их пригодности для структурно-функциональных исследований сурвивина.

5. Исследование возможности использования полученных антител для уточняющей диагностики онкозаболеваний.

Научная новизна работы. В настоящей работе получена панель из 9 ранее не описанных моноспецифических антител к сурвивину, пригодных для структурно-функциональных исследований белка. Впервые показано, что

' В организации работы принимал участие академик РАН, д.х.н., проф. Швец В.И.

1

антитела к различным участкам сурвивина имеют разное сродство к мономеру белка и сурвивинсодержащему комплексу. Было впервые установлено, что лишь антитела к Ы-концевому участку сурвивина выявляют пул белка, вовлеченный в ход клеточного деления и солокализованый с комплексом белков-хромосомных пассажиров. С помощью полученных антител впервые показано, что мономер сурвивина и сурвивинсодержащий комплекс могут играть разные роли в онкогенезе и лишь мономер сурвивина принимает участие в злокачественном перерождении клетки. Разработан подход к выделению нативного сурвивина из лизата опухолевых клеток с помощью сорбентов с иммобилизованными моноспецифическими антителами к сурвивину.

Практическая значимость работы. В настоящей работе было показано, что мономер сурвивина экспрессируется только в опухолевых тканях, а сурвивинсодержащий комплекс - как в опухолевых, так и смежных с опухолью тканях, что может быть использовано для диагностики рака. Было установлено, что высокое содержание сурвивина в опухолевых тканях коррелирует со снижением степени дифференцировки опухоли и возрастанием стадии заболевания. Таким образом, моноспецифические антитела к сурвивину могут быть использованы для диагностики биологической агрессивности и метастатической активности опухоли.

Апробация работы и публикации. Результаты настоящей работы были представлены на XX, XXI, XXII, XXIII, XXIV и XXV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2008, 2009, 2010, 2011, 2012, 2013), 2-й Московской международной конференции «Иммунофизиология: естественный аутоиммунитет в норме и патологии» (Москва, 2008), XVI и XVIII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, 2008, 2010), 30ом и 31ом европейском пептидном симпозиуме (Финляндия, 2008; Дания, 2010), X чтениях, посвященных памяти академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2011), 1ом мультидисциплинарном симпозиуме «Молекулярная онкология: от лабораторного стола к медицине» (Украина, 2012), VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013) и 15ом международном конгрессе по иммунологии (Италия, 2013).

Материалы диссертационной работы изложены в 3 статьях в рецензируемых научных журналах и в 19 сообщениях в тезисной форме и в виде материалов российских и международных конференций. Получен 1 патент РФ. Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №10-04-01588-а и №12-0431590.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 126 страницах с использованием 27 рисунков, 27 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 143 ссылки.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. С помощью синтетических фрагментов сурвивина получена панель из 9 моноспецифических антител, пригодных для структурно-функциональных исследований.

2. Разработан подход к выделению нативного сурвивина из лизата опухолевых клеток с помощью моноспецифических антител, иммобилизованных на сефарозе.

3. Мономер сурвивина экспрессируется только в опухолевых тканях, а сурвивинсодержащий комплекс - как в опухолевых, так и в смежных с опухолью тканях. Содержание сурвивина в опухолевых тканях коррелирует с агрессивностью и метастатической активностью опухоли.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выбор фрагментов сурвивина для получения антител

Для получения антител, пригодных для структурно-функциональных исследований сурвивина и онкодиагностики, кроликов иммунизировали синтетическими пептидными фрагментами белка. Выбор фрагментов сурвивина был основан на результатах анализа данных литературы о структурных особенностях этого белка и его функционально важных участках, а также теоретического анализа аминокислотной последовательности белка. Часть пептидных фрагментов содержала расчетные Т-хелперные эпитопы, необходимые для стимуляции иммунного ответа у животных в свободном виде, без конъюгации с высокомолекулярным белковым носителем.

Рис.1. Схема функционально важных участков сурвивина и синтезированные фрагменты сурвивина.

D - участок димеризации; BIR - высоконсервативный домен, характерный для всех представителей семейства белков-ингибиторов апоптоза; NES - сигнал ядерного экспорта (выделен рамкой)

Выбранные фрагменты сурвивина были синтезированы в лаборатории синтетических вакцин ИБХ РАН. Всего для иммунизации животных использовали 11 синтетических фрагментов сурвивина (табл.1).

Таблица 1. Синтетические фрагменты сурвивина человека*.

Обозначение Участок белка Аминокислотная последовательность

(I) (1-22) MGAPTLPPAWOPELKDHRISTF

ai) (3-13) APTLPPAWQPE

(ni) (54-74) LAOCFFCFKELEGWEPDDDPI

(IV) (86-98) FLSVKKQFEELTL

(V) (95-105) ELTLGEFLKLD

(VI) (95-121) ELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKK

(VII) ÀYACNTSTL-( 130-142) AYACNTSTL - KVRRAIEQLAAMD

(VIII) С122-Е'-у-134) KEFEETAEKVRRA

(IX) (122-K1¿9-134) KEFEETAÄKVRRA

(X) (126-Еи*-132) ETAEKVR

(XI) (126-KU9(Ac)-132) ETAAY/lc)KVR

* Нумерация аминокислот дана по последовательности полноразмерного сурвивина человека (Swiss Prot ID 015392). Расчетные Т-хелперные эпитопы подчеркнуты (содержат девятичленный фрагмент, в первом положении которого находится гидрофобный а.о., а в девятом - R или К [Вольпина и соавт., 2002]), жирным курсивом выделена аминокислотная замена Е/К129.

Пептид (I) представляет собой гидрофильный N-концевой фрагмент белка, содержит один из предполагаемых участков димеризации и расчетный Т-хелперный эпитоп. Пептид (И) является укороченным фрагментом пептида (I) и моделирует только участок димеризации. Пептид (III) представляет собой гидрофильный фрагмент BIR-домена, отвечающего за антиапоптозную функцию сурвивина, и содержит расчетный Т-хелперный эпитоп. Пептиды (IV) и (V) являются перекрывающимися фрагментами предполагаемого сигнала ядерного экспорта сурвивина, благодаря которому происходит экспорт белка из ядра в цитоплазму клетки, и содержат второй участок димеризации белка. Пептид (VI) соответствует гидрофильному N-концевому участку a-спирального домена, ответственного за регуляцию митоза, и включает в себя предполагаемый участок димеризации и два расчетных Т-хелперных эпитопа. Пептид (VII) содержит С-концевой фрагмент (130-142) a-спирального домена полноразмерного сурвивина, а также участок AYACNTSTL, соответствующий фрагменту (80-88) последовательности изоформы сурвивина-2В (Swiss Prot ID 015392-2). В результате соединения этих двух фрагментов (80-88)-(130-142) в пептиде (VII) формируется искусственный Т-хелперный эпитоп последовательности YACNTSTLK.

Известно, что в 129 положении аминокислотной последовательности нативного сурвивина может находиться либо остаток лизина, либо остаток глутаминовой кислоты. Остаток лизина в клетке подвергается ацетилированию, что способствует стабилизации димера сурвивина. С другой стороны, сурвивин, содержащий в 129 положении остаток глутаминовой кислоты, находится преимущественно в мономерной форме [Wang et al., 2010]. Для получения антител, способных распознавать аминокислотную замену в 129 положении белка, были использованы пептиды (VIII) и (IX), моделирующие участок аминокислотной замены. Пептиды (X) и (XI) - это укороченные фрагменты пептидов (VIII) и (IX) соответственно.

2. Получение панели моноспецифических антител к сурвивину с помощью синтетических фрагментов белка

Синтетическими пептидными фрагментами сурвивина иммунизировали животных, при этом пептиды, содержащие расчетные Т-хелперные эпитопы (пептиды (I), (III), (VI) и (VII)), использовали в свободном виде. Остальными пептидами иммунизацию проводили в виде конъюгатов с гемоцианином улитки (KLH). Методом иммуноферментного анализа (ИФА) было изучено связывание сывороток с пептидами, на которые они были получены, и с рекомбинантным сурвивином. Показано, что все сыворотки, за исключением сывороток к пептидам (X) и (XI), содержат большое количество противопептидных антител и связываются с рекомбинантным белком (данные не приведены).

Для выделения моноспецифических антител были получены аффинные сорбенты с иммобилизованными синтетическими пептидами и подобраны индивидуальные условия хроматографии сывороток. При хроматографии сыворотки к пептиду (1-22) антитела были не способны связываться с лигандом. Вероятно, при иммобилизации пептида (I) на сефарозе задействован остаток Lys15, входящий в центр связывания с антителами. В связи с этим мы провели иммунизацию животных конъюгатом пептида (1-22) с белковым носителем, что, как правило, приводит к выработке более широкого спектра антител. Из полученной сыворотки удалось выделить антитела с высокой концентрацией и титром (табл.2)

При выделении антител к пептиду (54-74) был получен сорбент с низким содержанием лиганда, предположительно из-за высокой гидрофобности данного пептида. Поэтому хроматографию сыворотки к пептиду (54-74) проводили на сорбенте с укороченным фрагментом (62-74), который благодаря более низкой гидрофобности эффективнее иммобилизовался на сефарозе. Для выделения антител, распознающих аминокислотную замену в 129 положении белка, были использованы сорбенты с укороченными пептидными фрагментами (126-Е129-132) и (126-К129-132). В результате нами была получена следующая панель моноспецифических антител к сурвивину:

Таблица 2. Моноспецифические антитела к сурвивину.

AT Иммуноген Лнганд на сорбенте Сляганда, нмоль/г сефарозы Сат> мг/мл Тит (-lg ) связывания разведения)

с пептидом с рекомбинантным сурвивином

АТ(1) (1-22)~KLH (1-22) 686 0.50 5.7 5.4

АТ(П) (3-13)~KLH (3-13) 663 0.12 5.4 4.5

АТ(Ш) (54-74) (62-74) 418 0.12 4.7 1.3

AT(IV) (86-98)~KLH (86-98) 95 0.50 5.5 4.4

AT(V) (95-105)~KLH (95-105) 200 0.60 5.1 5.1

AT(VI) (95-121) (95-121) 329 0.89 5.6 5.4

AT(VII) (80-88)-(130-142) (80-88)-(130-142) 357 0.54 5.4 5.4

AT(VIII) (122-E129-134) (126-EI29-132) 283 0.39 5.1 <1.3

AT(IX) (122-K129-134) (126-K1M-132) 73 0.12 5.4 3.1

3. Исследование свойств полученных моноспецифических антител к сурвивину

Определение способности антител связываться срекомбинантным

сурвивином

Была изучена способность полученных антител связываться с рекомбинантным сурвивином в условиях ИФА и иммуноблота (табл.2, рис.2). Наибольшую активность проявили АТ(1), АТ(Н), и АТ(У)-(УП). Антитела АТ(1У) и АТ(1Х) связывались с рекомбинантным сурвивином значительно слабее, а АТ(Ш) и АТ(УШ) лишь в высокой концентрации были способны взаимодействовать с белком.

1:10001:5000 1:100 1:50 1:500 1:1000 1:1000 1:200 1:200

37 кДа —

17 кДа-¡\

АТ(1) АТ(И) АТ(Ш)АТ(1У) АТ(У) АТ(У1) АТ(У11)АТ(УШ)АТ(1Х)

Рис. 2. Связывание очищенных противопептидных антител к сурвивину с рекомбинантным белком в условиях иммуноблота. Визуализация с помощью диаминобензидина.

В условиях иммуноблота все противопептидные антитела связывались с белком с молекулярной массой 17 кДа, что соответствует мономеру сурвивина, при этом многие антитела выявляли также димер сурвивина с молекулярной массой 37 кДа (рис.2). Приготовление образца белка по методу Леммли и проведение электрофореза в присутствии 805 приводит, как правило, к полной денатурации белка и разрушению олигомерных комплексов. Тем не менее, сильные межбелковые взаимодействия между двумя молекулами сурвивина в составе димера могут приводить к его сохранению в данных условиях.

Следует заметить, что антитела, полученные на пептиды, содержащие аминокислотную замену Е/К129, показали совершенно разные результаты по связыванию с рекомбинантным белком. Так, АТ(УШ) к пептиду (122-Е129-134) практически не взаимодействовали с рекомбинантным белком, а АТ(1Х) к пептиду (122-К129-134) связывались с белком значительно эффективнее. Так как в работе был использован рекомбинантный сурвивин, содержащий К129, мы предположили, что антитела АТ(УШ) и АТ(1Х) могут распознавать аминокислотную замену в 129 положении сурвивина. В связи с этим кросс-реактивность АТ(УШ) и АТ(1Х) была изучена более подробно.

Изучение способности антител к пептидам (122-Е129-!34) и (122-Кт-134) различать природную аминокислотную замену.

На первом этапе было изучено перекрестное связывание антител АТ(УШ) и АТ(1Х) с пептидами, моделирующими участок аминокислотной замены в 129 положении, (122-Е129-134) и (122-К129-134), а также с их укороченными фрагментами (126-Е129-132) и (126-К129-132) в условиях ИФА (табл.3).

Результаты проведенного исследования показали, что связывание антител АТ(УШ) и АТ(1Х) с укороченными фрагментами (126-Е129-132) и (126-К129-132) происходит селективно, т.е. антитела АТ(УШ) к пептиду (122-Е129-134) не

1ОО 1 40

связываются с пептидом (126-К1 -132) и, наоборот, АТ(1Х) к пептиду (122-К -134) не связываются с пептидом (126-Е129-132).

Таблица 3. Кросс-реактивность антител АТ(УШ) и АТ(1Х).

АТ Иммуноген Лиганд на сорбенте Титр антител (—^ разведения)

Антиген на планшете

122-Е12'-134 126-Е129-132 122-К129-134 126-К129-132

АТ(УШ) 122-Е129-134 126-Е129-132 5.1 4.7 4.3 <1.3

АТ(1Х) 122-К129-134 126-К129-132 5.4 <1.3 5.4 3.5

С другой стороны, при перекрестном связывании с пептидами (122-Е129-134) и (122-К129-134) способность узнавать аминокислотныи остаток не проявилась. Возможно, это связано с тем, что АТ(УШ) и АТ(1Х) были получены

129 129

в результате иммунизации удлиненными фрагментами (122-Е -134) и (122-К -134), и при выделении антител на укороченных фрагментах (126-Е129-132) и (126-К129-132) были получены антитела, часть из которых захватывает эпитопы удлиненных фрагментов.

На следующем этапе была изучена способность АТ(УШ) и АТ(1Х) распознавать аминокислотную замену Е/К129 в рекомбинантном сурвивине.

В условиях ИФА при концентрации рекомбинантного сурвивина 3.8 мкг/мл АТ(УШ) не способны связываться с ним, тогда как АТ(1Х) связываются достаточно активно (табл.4). Увеличение концентрации белка до 15 мкг/мл приводит к тому, что антитела теряют свою способность распознавать Е/К129 и связываются с рекомбинантным сурвивином практически с одинаковым титром. Полученные данные говорят о том, что способность АТ(УШ) и АТ(1Х) распознавать остаток в 129 положении рекомбинантного сурвивина зависит от концентрации белка.

Таблица 4. Связывание антител АТ(УШ) и АТ(1Х) с рекомбинантным сурвивином в условиях ИФА в зависимости от концентрации белка.

АТ Иммуноген Титр антител (-Ig разведения)

Концентрация рекомбинантного сурвивина на планшете

3.8 мкг/мл 7.5 мкг/мл 15.0 мкг/мл

AT(VIII) 122-Е129-134 <1.3 2.9 3.6

AT(IX) 122-К129-134 3.1 3.6 3.9

Похожие данные были получены и при исследовании способности антител АТ(УШ) и АТ(1Х) распознавать Е/К129 в последовательности рекомбинантного сурвивина в условиях иммуноблота (рис.3).

тбелка=0,5 мкг тбелка=5 мкг

1:200 1:200 1:100 1:100 1:400 1:400 1:200 1:200

17 кДа—

AT{V11I) АТОХ) AT(V11I) АТ(К) AT(VW) ATCDQ АТ(Щ ATflX)

Рис. 3. Способность AT(VIII) и AT(IX) распознавать остаток лизина в 129 положении рекомбинантного сурвивина в условиях иммуноблота. Визуализация с помощью диаминобензидина.

При нанесении на трек 0.5 мкг белка и разведении антител 1:100 оба антитела выявляют рекомбинантный сурвивин, однако аффинность АТ(1Х) значительно выше, чем AT(VIII). Увеличение разведения антител до 1:200, при той же концентрации белка, приводит к тому, что AT(VIII) перестают связываться с белком, тогда как связывание АТ(1Х) остается практически таким же, как и при разведении 1:100. При нанесении на трек 5 мкг сурвивина, способность антител AT(VIII) и АТ(1Х) распознавать Е129/К129 значительно снижается, однако остается очевидным, что АТ(1Х) связываются с рекомбинантным сурвивином значительно активнее, чем AT(VIII). Полученные данные показывают, что способность антител AT(VIII) и АТ(1Х) распознавать остаток в 129 положении зависит не только от концентрации белка, но и от концентрации самих антител.

Таким образом, было показано, что при низких концентрациях антител или низких концентрациях сурвивина антитела к пептидам (122-К129-134) и (122-Е129-134) распознают природную аминокислотную замену в 129 положении белка.

Установление участков связывания антител

При иммунизации животных синтетическими пептидами, содержащими более 20 а.о., антитела могут вырабатываться не ко всей последовательности пептида, а к его участку. Поэтому были установлены участки связывания антител к пептидам (I), (VI) и (VII). Для этого в лаборатории синтетических вакцин ИБХ РАН были синтезированы перекрывающиеся фрагменты данных пептидов. С помощью ИФА была изучена способность очищенных антител связываться как с пептидами, на которые они были получены, так и их перекрывающимися фрагментами.

Таблица 5. Связывание антител к пептидам (I), (VI) и (VII) с перекрывающимися пептидными фрагментами.

Антитела Антиген Аминокислотная последовательность Титр АТ (-lg разведения)

АТ(1) (1-22) MGAPTLPPAWQPELKDHRISTF 5.7

(3-13) APTLPPAWQPE <1.3

(11-22) QPELKDHRISTF 5.6

AT(VI) (95-121) ELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKK 5.6

(95-105) ELTLGEFLKLD 3.5

(103-121) KLDRERAKNKIAKETNNKK 3.8

(113-121) IAKETNNKK <2.0

AT(VII) (80-88)-(130-142) AYACNTSTLKVRRAIEQLAAMD 5.4

(80-88)-(130-131) AYACNTSTLKV 2.0

(130-138) KVRRAIEQL 4.5

(135-142) IEQLAAMD 5.1

Как видно из приведенных в табл.5 результатов, антитела АТ(1) направлены на С-концевой участок пептида (11-22). АТ^1) связывались с фрагментами (95-105) и (103-121) и не взаимодействовали с фрагментом (113121). На основании полученных данных мы полагаем, что АТ(У1) обладают достаточно широкой специфичностью и связываются с участком (95-112). АТ(\Ш) направлены преимущественно на участок (132-142), так как они не взаимодействовали с фрагментом (80-88)-(130-131), но связывались с фрагментами (130-138) и (135-142).

С учетом того, что АТ(Ш), АТ(УШ) и АТ(1Х) были выделены из кроличьих сывороток с помощью сорбентов с иммобилизованными на них укороченными фрагментами пептидов, можно представить следующую схему участков связывания полученных моноспецифических антител:

Рис. 4. Участки связывания моноспецифических антител с сурвивином.

Изучение способности противопептидных антител выявлять эндогенный сурвивин в лизатах опухолевых клеток

На следующем этапе работы была изучена способность полученных антител выявлять эндогенный сурвивин в лизатах клеток НеЬа (карцинома шейки матки) и МСР-7 (аденокарцинома молочной железы) в условиях иммуноблота. Известно, что в опухолевых клетках сурвивин локализуется как в ядре, так и цитоплазме [МаЪоАса е1 а!., 2002], поэтому для исследования были получены суммарные клеточные лизаты.

12 12 1212 12 12 12 1212 40 »Да , ^^

АТ(1) АТ(П) АТ(Ш) АТ(ГУ) АТ(У) АТ(Ш) АТ(\'П) АТ(УШ) АТ(1Х)

Рис. 5. Иммуноблот лизатов клеток линий НеЬа (1) и МСР-7 (2) с помощью моноспецифических антител к сурвивину. Визуализация с помощью системы ЕСЬ.

Показано, что все антитела связываются с эндогенным сурвивином. АТ(1) выявили в лизатах клеток НеЬа белковую полосу в районе 38 кДа, а в лизатах клеток МСР-7 было обнаружено специфическое окрашивание полосы белка с молекулярной массой 40 кДа. Следует заметить, что в случае использования высоких концентраций данных антител наблюдали также слабое окрашивание белковых полос в районе 17 и 19 кДа в лизатах НеЬа и МСР-7 соответственно (данные не приведены). АТ(П) связались с полосами белка массой 17 и 19 кДа в

образцах HeLa и MCF-7. При использовании AT(III) было выявлено слабое окрашивание полосы белка с массой 17 кДа только в лизате клеток HeLa. Полученные результаты согласуются с данными о характере связывания АТ(Ш) с рекомбинантным белком в условиях ИФА и иммуноблота и еще раз подтверждают низкую аффинность данных антител к сурвивину. При использовании AT(IV) наблюдали слабое окрашивание полосы белка массой 38 кДа в лизатах клеток HeLa, в лизатах клеток MCF-7 специфической реакции выявлено не было. AT(V) в свою очередь интенсивно окрашивали белковые полосы с подвижностью 17 и 19 кДа в лизатах HeLa и MCF-7. С помощью AT(VI) и AT(VII) были выявлены белковые полосы в районах 17 и 38 кДа в лизатах клеток HeLa и в районах 19 и 40 кДа в лизатах клеток MCF-7, причем при использовании AT(VI) наблюдали диффузное окрашивание нескольких полос в диапазоне 15-19 кДа. Оба антитела продемонстрировали большее сродство к белкам массой 17 и 19 кДа. При использовании AT(VIII) было выявлено окрашивание белковых полос с массами 17 и 19 кДа в лизатах клеток HeLa и MCF-7, тогда как АТ(1Х), распознающие остаток К129, оказались не способны связаться с сурвивином. Возможно, это связано с тем, что в клетках данных линий экспрессируется сурвивин, содержащий в 129 положении остаток глутаминовой кислоты.

Таким образом, полученные нами моноспецифические антитела выявили полосы белков с молекулярными массами 17 и 38 кДа в лизатах клеток HeLa и белковые полосы с подвижностью 19 и 40 кДа в лизатах клеток MCF-7. Масса белка 17 кДа соответствует массе мономера основной изоформы -полноразмерного сурвивина. Выявляемый в лизате клеток MCF-7 белок с массой 19 кДа, возможно, соответствует другой изоформе белка — сурвивину-2В, либо, что кажется более вероятным, сурвивину, подвергшемуся посттрансляционным модификациям, характерным для данной клеточной линии.

Белковые полосы с массами 38 и 40 кДа, как мы полагаем, соответствуют сурвивинсодержащим белковым комплексам. Косвенным подтверждением того, что в них присутствует сурвивин, служит тот факт, что их выявляют антитела, направленные к различным участкам сурвивина: AT(I), AT(IV), AT(VI) и AT(VII). Мы полагаем, что сурвивинсодержащий белковый комплекс с массой 38 кДа в клетках HeLa может являться димером сурвивина. Данное предположение было сделано на основании того, что при связывании антител с рекомбинантным сурвивином, образующим в растворе устойчивые димеры, антитела выявляют полосу димера в этом районе. Кроме того, в ряде работ было показано сохранение димерной формы эндогенного сурвивина в условиях иммуноблота [Singh et al., 2007; Conway et al. 2003]. Белковый комплекс с массой 40 кДа в клетках MCF-7 в свою очередь может соответствовать либо гетеродимеру сурвивина с какой-либо из его изоформ, либо димеру сурвивина, подвергшегося посттрансляционным модификациям, характерным для данной клеточной линии.

Для того, чтобы доказать, что белковая полоса массой 38 кДа соответствует белковому комплексу, мы подобрали условия для его разрушения. Известно, что димер рекомбинантного сурвивина разрушается при обработке

мочевиной [Ег^еЬта й а1., 2007]. Поэтому мы изучили влияние обработки образцов лизата клеток НеЬа 6М мочевиной на интенсивность окрашивания белковой полосы, соответствующей 38 кДа. В качестве контроля использовали образец лизата без добавления мочевины.

Из рис. 6 видно, что при обработке лизата клеток НеЬа 6М мочевиной интенсивность окрашивания белковой полосы с массой 38 кДа значительно снижалась, что подтверждает наше предположение о том, что данная полоса соответствует белковому комплексу.

Следует заметить, что интенсивность окрашивания полосы мономера сурвивина оставалась практически неизменной. Мы полагаем, что в лизатах клеток равновесие мономер-сурвивинсодержащий комплекс смещено в сторону мономера, поэтому разрушение комплекса не приводило к видимому повышению концентрации мономера.

Необходимо подчеркнуть, что все полученные антитела проявили разное сродство к мономеру и сурвивинсодержащему комплексу (рис.5). Наибольшую специфическую активность показали антитела к пептидам (I), (V) и (VII), при этом АТ(1) связываются преимущественно с сурвивинсодержащим комплексом, AT(V) связываются только с мономером белка, a AT(VII) выявляют и мономер и сурвивинсодержащий комплекс.

Показано, что AT(II), полученные к фрагменту (3-13), в отличие от АТ(1), полученных к участку (1-22), выявляют только мономер сурвивина. Из данных литературы известно, что в образовании димера сурвивина задействован участок белка (6-9) [Chantalat et al., 2000]. По-видимому, участок (3-13) находится в контактной области двух молекул сурвивина в составе димера и оказывается недоступным для связывания антител, поэтому антитела к фрагменту (3-13) выявляют лишь мономерную форму сурвивина. В свою очередь низкое сродство к мономеру АТ(1) может быть связано с посттрансляционными модификациями сурвивина на данном участке, например, фосфорилированием остатка Ser20 [Colnaghi et al., 2010]. Возможно, в результате подобных модификаций антитела, полученные к фрагменту (1-22), не могут выявлять фосфорилированный мономер белка. Не исключено, что сурвивин в составе комплекса не фосфорилирован, и поэтому АТ(1) способны с ним связываться.

AT(V), полученные к фрагменту (95-105), проявили высокую аффинность к мономеру белка. Даже в высоких концентрациях данные антитела не продемонстрировали перекрестного связывания с сурвивинсодержащим белковым комплексом. Мы полагаем, что специфичность AT(V) именно к

1 2

Рис. 6. Иммуноблот лизатов клеток линии НеЬа без добавления мочевины (1) и с добавлением 6М мочевины (2). Визуализация с помощью системы ЕСЬ.

AT(V)

мономеру сурвивина связана с вовлечением участка белка (95-105) в образование димера. В результате димеризации данный участок оказывается внутри гидрофобного кора белка и не доступен для связывания антител [СЬап1а1а1 е1 а1., 2000]. В отличие от АТ(У), антитела АТ(У1) были получены с помощью более длинного фрагмента белка (95-121) и направлены, как было ранее показано при установлении участков связывания антител, на участок (95112), чем, по-видимому, объясняется связывание данных антител как с мономерной формой сурвивина, так и с сурвивинсодержащим комплексом.

АТ(УШ), распознающие Е129, выявили мономер сурвивина, что полностью согласуется с данными литературы о том, что сурвивин, содержащий в 129 положении остаток глутаминовой кислоты, находится преимущественно в мономерной форме.

Таким образом, в результате данного исследования было установлено, что полученные нами антитела выявляют эндогенный сурвивин в лизатах опухолевых клеток линий НеЬа и МСР-7, при этом имеют различное сродство к мономеру и сурвивинсодержащему комплексу. Для дальнейшего исследования мы отобрали наиболее активные и специфичные антитела - АТ(1), связывающиеся с сурвивинсодержащим комплексом, АТ(У), выявляющие мономер сурвивина, а также АТ(УП), связывающиеся как с мономером, так и с сурвивинсодержащим комплексом.

Иммуноцитохимическое исследование клеток НеЬа, находящихся на различных стадиях клеточного цикла, с помощью противопептидных

антител к сурвивину.

Была изучена способность антител АТ(1), АТ(У) и АТ(УП) связываться с сурвивином в клетках НеЬа, находящихся в интерфазе и митозе. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток было проведено совместно с сотрудниками лаборатории структурной биохимии ИБХ РАН.

В интерфазных клетках АТ(1) диффузно и ярко окрашивали нуклеоплазму ядер и очень бледно цитоплазму (рис.7а). В ходе митоза на стадиях профазы и метафазы (рис. 16) данные антитела отчетливо маркировали хромосомы. В клетках, находящихся на стадии анафазы, было выявлено яркое окрашивание в зоне образующейся перетяжки (рис.7в), а на стадии телофазы — яркое окрашивание в зонах перетяжки и остаточных телец Флеминга (рис.7г,с)). Из данных литературы известно, что в ходе митоза сурвивин встраивается в комплекс белков-хромосомных пассажиров (СРС) [МеуаргакаБЬ й а1., 2007]. В ходе деления клетки СРС имеет ту же локализацию, что и сурвивин, выявляемый антителами АТ(1), поэтому мы полагаем, что АТ(1) связываются с пулом сурвивина, принимающим участие в митозе и локализованном совместно с комплексом хромосомных пассажиров.

(а)

(б)

(в)

(г)

(Д)

Рис. 7. Локализация пула сурвивина, выявляемого антителами АТ(1) в клетках HeLa в интерфазе (а) и митозе (б-д). На рисунке приведены результаты окрашивания клеток с помощью AT(I), DAPI и совмещение результатов окрашивания АТ(1) и DAPI.

а - интерфаза: ядра окрашены практически однородно и ярче, чем цитоплазма; стрелками указаны отдельные фокусы повышенной локальной концентрации белка в ядре; б - метафаза: стрелкой указаны окрашенные хромосомы; в - анафаза: стрелкой указано окрашивание в зоне образующейся клеточной перетяжки; г,д - телофаза: стрелками указано окрашивание в зоне перетяжки и остаточных телец Флеминга.

Антитела AT(V) и AT(VII) в интерфазных клетках диффузно окрашивали ядро и цитоплазму клеток, при этом окрашивание цитоплазмы было интенсивнее, чем при использовании АТ(1) (рис.8, данные приведены только для AT(V)). В митотических клетках при использовании обоих антител окрашивалась только цитоплазма клеток, тогда как в области хромосом, зонах перетяжки и остаточных телец Флеминга специфическое окрашивание отсутствовало.

AT(I) DAPI Совмещение

АТ(У) 0АР1 Совмещение

Рис. 8. Локализация пула сурвивина, выявляемого антителами АТ(У) в интерфазных клетках НеЬа. На рисунке приведены результаты окрашивания клеток с помощью АТ(У), ОАР1 и совмещение результатов окрашивания АТ(У) и ОАР1.

Мы полагаем, что антитела АТ(У) и АТ(УП) не смогли выявить сурвивин, участвующий в регуляции митоза, так как они направлены на участки белка, задействованные в образовании комплекса хромосомных пассажиров и поэтому недоступные для связывания с антителами УеуаргакаБЬ е1 а1., 2007].

В результате иммуноцитохимического исследования клеток НеЬа было установлено, что лишь антитела АТ(1) к пептиду (1-22) выявляют пул сурвивина, принимающий участие в клеточном делении и локализованый совместно с комплексом белков-хромосомных пассажиров.

4. Разработка подхода к выделению сурвивина из лизата опухолевых

клеток НеЬа с помощью противопептидных антител

При изучении взаимосвязи структуры и функций сурвивина большинство исследователей использует рекомбинантный сурвивин и белковые конструкции на его основе. Очевидно, что для получения наиболее полной информации необходимо проводить также исследования эндогенного сурвивина. Такие работы в настоящее время практически не ведутся, что связано с очень низким содержанием сурвивина в клетках. В связи с этим была поставлена задача разработать подход к выделению сурвивина из опухолевых клеток.

Для выделения сурвивина из лизата опухолевых клеток было предложено использовать противопептидные антитела, конъюгированные с сефарозой. Получено три аффинных сорбента с иммобилизованными антителами АТ(1), АТ(У) и АТ(УП) соответственно.

На первом этапе была изучена способность полученных сорбентов связывать рекомбинантный сурвивин из раствора (рис.9). Для этого аффинные сорбенты инкубировали в растворе рекомбинантного белка, после чего путем центрифугирования отделяли сефарозу с образовавшимися иммунокомплексами от фракции несвязавшегося белка. Далее иммунокомплексы разрушали кипячением сорбента в буфере Леммли.

абв абв абв

37 кДа 17 кДа •

Ата)

АТ(У)

АТ(У11)

Рис. 9. Иммуннопреципитация рекомбинантного сурвивина из раствора с помощью аффинных сорбентов с иммобилизованными противопептидными антителами. Визуализация с помощью диаминобензидина.

а - исходный раствор рекомбинантного сурвивина; б - фракция несвязавшегося белка; в -выделенный белок.

Было показано, что все сорбенты эффективно связывают рекомбинантный сурвивин из раствора, при этом удается выделить белок в значительно большей концентрации, чем в исходном растворе. Наибольшую активность проявили антитела АТ(1) и АТ(УП), тогда как АТ(У) связывались с белком с меньшей аффинностью. В растворе после инкубации с аффинными сорбентами концентрация сурвивина была исчезающе мала. Полученные данные говорят о том, что аффинные сорбенты с иммобилизованными моноспецифическими антителами являются высокоэффективным инструментом для выделения белка из раствора.

На следующем этапе при отработке условий выделения эндогенного сурвивина с помощью АТ(УП) из лизата клеток НеЬа были изучены различные способы разрушения иммунокомплексов и подобраны оптимальные условия для выделения белка (рис.10). Показано, что наиболее эффективный способ выделения сурвивина - это инкубация сорбента со связавшимся белком в элюирующем буфере при рН 2.5 в течение 10 мин (рис.10, дорожка 5). Следует отметить, что такая обработка приводит к эффективному выделению сурвивина без разрушения антител (как в случае кипячения в буфере Леммли, рис.10 дорожка 3), что означает, что этот сорбент может быть использован повторно.

Рис. 10. Подбор условий выделения белка, связавшегося с аффинным сорбентом с иммобилизованными антителами АТ(УП). Визуализация с помощью системы ЕСЬ. 1 -лизат клеток НеЬа; 2 -фракция несвязавшихся белков; 3, 4 и 5 - белок, выделенный различными способами: 3 -кипячение в буфере Леммли; 4 -инкубация в элюирующем буфере (рН 2.5) в течение 5 мин; 5 - инкубация в элюирующем буфере (рН 2.5) в течение 10 мин.

На следующем этапе была изучена способность всех полученных аффинных сорбентов с иммобилизованными антителами связывать эндогенный сурвивин из лизата клеток НеЬа (рис. 11).

абв абв абв

17 кДа —

АТ(1) АТ(У) АТ(УП)

Рис. 11. Иммунопреципитация сурвивина из лизата клеток НеЬа с помощью сорбентов с иммобилизованными противопептидными антителами. Визуализация с помощью системы ЕСЬ.

а - лизат клеток НеЬа; б - фракция неевязавшихся белков; в - выделенный белок.

АТ(1), иммобилизованные на сефарозе, оказались не способны связаться с сурвивинсодержащим комплексом в нативной форме, и полученный образец не содержал сурвивина, тогда как во фракции несвязавшихся белков концентрация сурвивинсодержащего комплекса была такой же, что и в лизате. В случае использования сорбента с АТ(У) образец выделенного белка содержал мономер сурвивина, при этом во фракции несвязавшихся белков сурвивин не был обнаружен. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что АТ(У) связываются с мономером нативного сурвивина с высоким сродством. При использовании антител АТ(УН) был выделен мономер сурвивина с примесью сурвивинсодержащего комплекса.

Таким образом, было показано, что аффинные сорбенты, полученные на основе антител АТ(У) и АТ(УП), связывают нативный сурвивин с высоким сродством и пригодны для выделения эндогенного сурвивина из лизата опухолевых клеток линии НеЬа.

5. Исследование диагностического потенциала противопептидных антител к сурвивину

Исследование опухолевых и смежных с опухолью тканей молочной железы с помощью моноспецифических антител к сурвивину

С помощью АТ(1) и АТ(У), специфичных к сурвивинсодержащему комплексу и мономеру соответственно, было проведено исследование опухолевых и смежных с опухолью тканей молочной железы от 5 пациентов. Из образцов тканей были получены гомогенаты, которые в дальнейшем изучали с помощью иммуноблота (рис. 12).

Антитела АТ(1) во всех образцах выявили сурвивинсодержащие комплексы с массами 38-40 кДа, при этом в зоне мономера (17 кДа)

специфическое окрашивание отсутствовало. АТ(У), в свою очередь, связывались только с мономером сурвивина в образцах опухолевых тканей, в образцах смежных с опухолью тканей специфическая реакция отсутствовала. В данном исследовании антитела вновь продемонстрировали свою специфичность к мономеру и сурвивинсодержащему комплексу.

абабаб абаб 38-40 кДа I — -

17 кДа —

38-40 кДа —^

АТО/)

17 кДа —>

Рис. 12. Иммуноблот образцов опухолевых (а) и смежных с опухолью (б) тканей от пяти пациентов с диагнозом рак молочной железы. Визуализация с помощью системы ЕСЬ.

Таким образом, было показано, что мономер сурвивина присутствует только в опухолевых тканях, а сурвивинсодержащий комплекс - как в опухолевых, так и в смежных с опухолью тканях, что может быть использовано для диагностики рака. Полученные данные позволяют предположить, что мономер и сурвивинсодержащий комплекс играют разную роль в онкогенезе, причем именно мономер участвует в злокачественном перерождении клеток. Возможно, процесс образования сурвивинсодержащего комплекса является механизмом регуляции функций сурвивина в клетке. Продолжение данного исследования требует изучения значительно большего количества образцов, а также сопоставления полученных данных с клинико-патологическими показателями исследуемых опухолей.

Исследование серии образцов опухолевых тканей мочевого пузыря с помощью

противопептидных антител к сурвивину методом иммуноблота

Проведенное нами исследование образцов опухолевых и смежных с опухолью тканей молочной железы показало, что в отличие от сурвивинсодержащего комплекса мономер сурвивина присутствует только в опухолевых тканях. Представляло интерес изучить содержание мономера и сурвивинсодержащего комплекса в опухолевых тканях другого типа. В связи с этим мы провели исследование гомогенатов опухолевых тканей мочевого пузыря от 14 пациентов методом иммуноблота с помощью антител АТ(1) и АТ(У).

9 10 11 12 13 14

38 кДа —-

17 кДа — 42 кДа —-

АТ(1) АТ(У)

анти-актин

Рис. 13. Иммуноблот гомогенатов опухолевых тканей от 14 пациентов с диагнозом рак мочевого пузыря. Визуализация с помощью системы ЕСЬ.

С помощью антител АТ(1) и АТ(У) сурвивин был выявлен практически во всех образцах опухолевых тканей (рис.13). Лишь в двух образцах сурвивин не был обнаружен ни в виде мономера, ни в виде сурвивинсодержащего комплекса (образцы 8 и 9). В мономерной форме сурвивин был выявлен в 10 образцах из 14 исследованных, причем интенсивность специфической реакции в разных образцах была неодинаковой. Сурвивинсодержащий комплекс в значимых количествах присутствовал лишь в трех опухолевых образцах (образцы 1, 5 и 11).

Таким образом, было показано, что мономер сурвивина содержится в большинстве исследованных образцов опухолевых тканей. Остается открытым вопрос о взаимосвязи содержания мономера и сурвивинсодержащего комплекса, выявляемых методом иммуноблота, с агрессивностью опухоли. Для ответа на этот вопрос необходимо провести широкомасштабное исследование гомогенатов опухолевых тканей и сопоставление полученных данных с клинико-патологическими показателями.

Иммуногистохимическое исследование серии образцов рака мочевого пузыря с помощью противопептидных антител к сурвивину

С помощью противопептидных антител к сурвивину АТ(1), АТ(У) и АТ(УН) совместно с сотрудниками патологоанатомического отделения Московского научно-исследовательского онкологического института им. П. А. Герцена было проведено иммуногистохимическое исследование образцов опухолевых тканей молочной железы. Наилучшие результаты были получены при использовании АТ(УН), связывающихся в иммуноблоте с мономером и сурвивинсодержащим комплексом. Данные антитела выявляют эндогенный сурвивин ядерной и цитоплазматической локализации, при этом интенсивность специфической реакции различается от случая к случаю (рис. 14).

2

3

Рис. 14. Иммуногистохимическая реакция с AT(VII) в трех образцах опухолевых тканей молочной железы.

То, что интенсивность окрашивания клеток в разных образцах была неодинакова, косвенно свидетельствует о вариабельности экспрессии сурвивина при раке молочной железы и возможности использования AT(VII) для уточняющей диагностики онкозаболеваний. В связи с этим диагностический потенциал антител к пептиду (VII) был изучен более подробно.

Совместно с сотрудниками патологоанатомического отделения Московского научно-исследовательском онкологического института им. П. А. Герцена было проведено иммуногистохимическое исследование серии образцов опухолевых тканей мочевого пузыря от 60 пациентов. Исследуемый материал был разделен на группы по стадиям G и Т. Стадия G описывает метастатическую активность опухоли, чем выше стадия G, тем ниже степень дифференцировкиопухолевых клеток, тем менее благоприятен прогноз течения заболевания. Стадия Т описывает распространение и агрессивность первичной опухоли, чем выше стадия Т, тем больше размер опухоли и тем хуже прогноз.

Образцы опухолевой ткани всех 60 пациентов исследовали с помощью иммуногистохимии с антителами AT(VII). В каждом образце полуколичественным методом был определен процент клеток, имеющих цитоплазматическое и ядерное окрашивание. На рис.15 представлены примеры специфического окрашивания.

Рис. 15. Иммуногистохимическая реакция в опухолевых тканях мочевого пузыря с антителами к сурвивину.

а - отрицательная реакция; б - положительная реакция в ядрах клеток опухоли; в -положительная реакция в цитоплазме клеток опухоли; г - положительная реакция в ядрах и цитоплазме клеток опухоли.

Для каждой группы пациентов (разделенных по стадии О и Т) была проведена статистическая обработка полученных данных, результаты которой приведены на рис.16.

100,0

[□ядро ■ цитоплазма]

Рис. 16. Процент окрашивания клеток в зависимости от стадии виТ. Число пациентов со стадией - 19; Ш - 22; вЗ - 19; со стадией Т1 - 20; Т2 - 17; ТЗ - 14; Т4 -8.

Было показано, что повышение содержания сурвивина как ядерной, так и цитоплазматической локализации коррелирует со снижением степени дифференцировки клеток опухоли, при этом достоверные различия были выявлены между группами С1, С2 и ОЗ (рис.16).

При сопоставлении экспрессии сурвивина со стадией заболевания было показано, что содержание сурвивина и в ядре, и в цитоплазме опухолевых клеток повышается на стадиях Т2-Т4, однако достоверные различия были выявлены только между Т1 и группой Т2-Т4 (рис.16).

Таким образом, с помощью антител к пептиду (VII) было установлено, что высокое содержание сурвивина в опухолевых клетках коррелирует со снижением степени дифференцировки клеток и возрастанием стадии заболевания. Эти данные показывают, что АТ(Ш1) могут быть с успехом применены для уточняющей диагностики биологической агрессивности и метастатической активности рака мочевого пузыря методом иммуногистохимии.

выводы

1. С помощью синтетических пептидов получена панель из девяти моноспецифических антител, направленных к различным участкам сурвивина и пригодных для структурно-функциональных исследований белка.

1 00 1 00

2. Установлено, что антитела к пептидам (122-К -134) и (122-Е -134)

распознают природную аминокислотную замену в 129 положении белка.

3. Выявлено, что все антитела связываются с эндогенным сурвивином в лизатах опухолевых клеток, при этом антитела к пептиду (95-105) выявляют мономер сурвивина, антитела к пептиду (1-22) — сурвивинсодержащий комплекс, антитела к пептиду (80-88)-(130-142) связываются с мономером и сурвивинсодержащим комплексом.

4. Показано, что только антитела к пептиду (1-22) выявляют пул сурвивина, принимающий участие в клеточном делении и солокализованый с комплексом белков-хромосомных пассажиров.

5. Разработан подход к выделению нативного сурвивина из лизата клеток линии НеЬа с помощью антител к пептидам (80-88)-(130-142) и (95-105).

6. С помощью антител к пептидам (1-22) и (95-105) показано, что мономер сурвивина присутствует только в опухолевых тканях, а сурвивинсодержащий комплекс - как в опухолевых, так и в смежных с опухолью тканях.

7. С помощью антител к пептиду (80-88)-(130-142) установлено, что высокое содержание сурвивина в опухолевых тканях коррелирует со снижением степени дифференцировки клеток и возрастанием стадии заболевания, что может быть использовано для уточняющей диагностики рака мочевого пузыря.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах:

1. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.ВЛ. Волкова Т.Д., Короев Д.О., Ким Я.С., Филатова М.П., Владимирова Н.М., Кармакова Т.А., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Вольпина О.М. Антитела к синтетическим пептидам для выявления сурвивина в опухолевых тканях. // Биоорган. Химия - 2010 - Т. 36, №2,-С. 178-186.

2. Вольпина О.М., Завалишина Л.Э., Волкова Т.Д., Ахидова Е.В. (Аскарова Е.ВЛ. Короев Д.О., Андреева Ю.Ю., Петров А.Н., Франк Г.А. Ингибитор апоптоза сурвивин в переходноклеточном раке мочевого пузыря. // Архив патологии,-2011,-Т. 73, №2,-С. 8-10.

3. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.ВЛ. Волкова Т.Д., Короев Д.О., Якупов И.Ю., Калинцева М.В., Завалишина Л.Э., Каплун А.П., Жарская О.О., Зацепина О.В., Вольпина О.М. Получение аффинноочищенных антител к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка. // Биоорг. Химия-2013,- Т.39, № 3,- с. 326-337.

Патенты:

1. Волкова Т.Д., Короев Д.О., Ахидова Е.В. (Аскарова Е.ВЛ. Вольпина О.М., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю. Пептид, стимулирующий образование специфических антител, выявляющих сурвивин в опухолевых тканях. Патент РФ №2396277 от 24.04.2009.

Основные тезисы докладов:

1. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.ВЛ. Короев Д.О., Титова М.В., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И., Волкова Т.Д., Вольпина О.М. Получение антител к опухолеассоциированному белку сурвивину с помощью синтетических пептидов. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XX зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».- М.,- 2008 - С. 114.

2. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.ВЛ. Волкова Т.Д., Короев Д.О., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И., Филатова М.П., Вольпина О.М. Выявление опухолеассоциированного белка сурвивина с помощью антител к синтетическим пептидам. // Материалы 2-й Московской международной конференции «Иммунофизиология: естественный аутоиммунитет в норме и патологии»,- М.,- 2008,- С. 28-29.

3. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.ВЛ. Волкова Т.Д., Короев Д.О., Ким Я.С., Кармакова Т.А., Якубовская Р.И., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Батева М.В., Вольпина О.М. Антитела к синтетическим фрагментам белка сурвивина для уточняющей диагностики раковых опухолей. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXI зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».- М.,- 2009.- С. 56.

4. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Волкова Т.Д., Короев Д.О., Ким Я.С., Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Вольпина О.М. Изучение диагностического потенциала антител к синтетическим фрагментам сурвивина. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии".- М.,- 2010 - С. 76

5. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Волкова Т.Д., Антонова Л.П., Короев Д.О., Завалишина Л.Э., Филатова М.П., Вольпина О.М. Моноспецифические антитела к сурвивину для уточняющей диагностики онкологических заболеваний. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIII международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».- М.,- 2011- С. 28.

6. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.ВЛ. Волкова Т.Д., Антонова Л.П., Короев Д.О., Каплун А.П., Якупов И.Ю., Завалишина Л.Э., Вольпина О.М. Моноспецифические антитела к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка. // Сборник тезисов «X чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова.- М.,- 2011- С.7

7. Ахидова Е.В. (Аскарова Е.В.), Антонова Л.П., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Якупов И.Ю., Завалишина Л.Э., Каплун А.П., Вольпина О.М. Антитела к синтетическим фрагментам сурвивина - инструмент для структурно-функциональных исследований белка и диагностики онкозаболеваний. // Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIV международной зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии».- М.,- 2012 - С. 9

8. Akhidova E.V. (Askarova E.V.), Volkova T.D., Antonova L.P., Koroev D.O., Filatova M.P., Kaplun A.P., Zavalishina L.E., Volpina O.M. Monospecific antibodies to survivin for cancer diseases diagnostics and structure functional study. // Abstract book of The 1st Multidisciplinary Symposium «Molecular Oncology: from Laboratory Bench to Medicine».- Kyiv, Ukraine.- 2012 - P. 68.

9. Ахидова Е.В. (Аскарова E.B.), Калинцева М.В., Волкова Т.Д., Короев Д.О., Якупов И.Ю., Каплун А.П., Завалишина Л.Э., Вольпина О.М. Противопептидные антитела к сурвивину - инструмент для структурно-функциональных исследований белка. // Материалы VI Российского симпозиума «Белки и пептиды».- Уфа - 2013 - С. 194.

10. Akhidova E.V. (Askarova E.V.), Kalintseva M.V., Volkova T.D., Yakupov I.Y., Koroev D.O., Zavalishina L.E., Volpina O.M. Synthetic immunoactive fragments of Survivin: selection and application for monomer and dimer detection. // Book of abstracts of The 15th International Congress of Immunology.- Milan, Italy - 2013-P. 456.

Аскарова Елена Владимировна Получение моноспецифических антител к сурвивину для структурно-функциональных исследований белка и онкодиагностики Формат 60x90/16 Тираж 100 экз. Подписано в печать 30.10.2013 Заказ № 112 Типография ООО «Генезис» 8 (495) 434-83-55 119571, г. Москва, пр-т Вернадского, 86

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Аскарова, Елена Владимировна, Москва

Московский государственный университет тонких химических технологий

им. М.В. Ломоносова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Аскарова Елена Владимировна ПОЛУЧЕНИЕ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К СУРВИВИНУ ДЛЯ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ БЕЛКА И ОНКОДИАГНОСТИКИ

на правах рукописи

04201365475

03.01.26 - Биотехнология (в т.ч. бионанотехнология) 02.00.10 - Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители: д.х.н., проф. Каплун А.П. к.х.н., с.н.с. Волкова Т.Д.

Москва - 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................6

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ «СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СУРВИВИНА - ПРЕДСТАВИТЕЛЯ СЕМЕЙСТВА БЕЛКОВ-ИНГИБИТОРОВ АПОПТОЗА»..............8

1.1. сурвивин - представитель семейства белков-ингибиторов апоптоза.......................8

12. Структурные особенности сурвивина.......................................................... 11

121 BIR-домен 11

12 2 С-концевая а-спиралъ 11

12 3 Участки димеризации 12

12 4 Сигнал ядерного экспорта 13 1.3 Белки-партнеры сурвивина.................................................................................16

13 1 Ran 16 13 2 Комплекс хромосомных пассажиров 17 1 3 3 Гистон НЗ 18 1 34 Smac 19 13 5 IAP-IAP комплексы 20 1 3 6 Hsp90 20

13 7 Тубулин 21 1 3 8 HBXIP 22 139 STAT3 23

1 4. Функции сурвивина в клетке............................................................23

14 1 Ингибироеание апоптоза 23 14 2 Регуляция клеточного депения 26

14 3 Функции сурвивина в онкогенезе 28

1.5. Изоформы сурвивина.......................................................................................30

15 1 Строение основных изоформ сурвивина 30 15 2 Локализация изоформ сурвивина в клетке 32 15 3 Функции изоформ сурвивина 35

1.6. Взаимосвязь локализации сурвивина в клетке и выполняемых им функций ... .38

1.7. Димеризация сурвивина и ее влияние на локализацию белка в клетке................39

1 8 Взаимосвязь структуры и функций сурвивина.............................................40

18 1 Гомодимер сурвивина 40

18 2 Гетеродимеры сурвивина 41 1 9. Посттрансляционные модификации сурвивина и их влияние на функции белка. 42

19 1 Фосфорилирование 43 19 2 Ацетилирование 46 19 3 Убиквитинирование 47

110 сурвивин как прогностический биомаркер онкозаболеваний................... 50

II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................................................55

2 1 Выбор фрагментов сурвивина для получения антител 56

2 2 Получение панели моноспецифических антител к различным участкам сурвивина с помощью синтетических пептидов 60

2 21 .Получение иммунных сывороток к синтетическим фрагментам сурвивина и изучение их свойств 60

2 2 2 Выделение моноспецифических антител из сывороток с помощью аффинной хроматографии 65

2 3 Исследование свойств полученных моноспецифических антител к сурвивину 75 2 31 Определение способности антител связываться с рекомбинантным сурвивином 75 2 3 2 Изучение способности антител к пептидам (122-Е129-!34) и (122-К129-134) различать природную аминокислотную замену 77

23 3 Установление участков связывания антител 79

2 3 4 Изучение способности противопептидных антител выявлять эндогенный сурвивин в лизатах опухолевых клеток 81

2 3 5 Иммуноцитохимическое исследование клеток HeLa, находящихся на различных стадиях клеточного цикла, с помощью противопептидных антител к сурвивину 85

2 4 Разработка подхода к выделению сурвивина из лизата опухолевых клеток HeLa помощью противопептидных антител 87

2 5 Исследование диагностического потенциала противопептидных антител к сурвивину 91

2 5 1 Исспедование образцов опухолевых и смежных с опухолью тканей молочной железы с помощью моноспецифических антител к сурвивину 91

2 5 2 Исспедование серии образцов опухолевых тканей мочевого пузыря с помощью противопептидных антител к сурвивину методом им муноблота 92

2 5 3 Ичмуногистохимическое исследование серии образцов рака мочевого пузыря с помощью противопептидных антител к сурвивину 94

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ........................................................................................98

3 1 Химические реагенты и биологические препараты 98 3 2 Оборудование и расходные материалы 99 3 3 Животные 100 3 4 Культуры клеток 100 3 5 Образцы тканей 100 3 6 Состав буферов 103 3 7 Получение конъюгатов пептидных фрагментов с овальбумином 103 3 8 Получение конъюгатов пептидных фрагментов с KLH 104 3 9 Иммунизация животных и приготовление сывороток крови 104 3 10 Твердофазный иммуноферментный анализ 104 3 11 Приготовление аффинных сорбентов 105

3 111 Приготовление аффинного сорбента с иммобилизованным пептидом 105

3 112 Приготовление аффинного сорбента с иммобилизованными антителами 105

3 12 Аффинная хроматография противопептидных сывороток.............................106

3 121 Проведение аффинной хроматографии — стандартная методика 106

3 12 2 Проведение аффинной хроматографии — модифицированная методика 107

3.13. Приготовление лизатов клеток ....................................................................107

3 13 1 Ведение клеточных культур 107

3 13 2 Замораживание и размораживание клеток 107

3 13 3 Приготовление лизатов клеток 108

3.14. Приготовление гомогенатов ткеней молочной железы и мочевого пузыря..........108

3.15. Определение концентрации тотального белка в лизатах клеток и гомогенатах тканей по методу Брэдфорд.............................................................................................................109

3 15 1 Приготовление реагента Брэдфорд 109

3 15 2 Определение концентрации белка по Брэдфорд 109

3.16. Иммунопреципитация сурвивина с помощью сорбентов с иммобилизованными антителами к сурвивину...................................................................................................109

3 161 Иммунопреципитация рекомбинантного сурвивина из раствора 109

3 16 2 Иммунопреципитация сурвивина из лизата клеток HeLa 110

3 17. Иммуноблот........................................................................................111

3.18 Иммуноцитохимическое исследование клеток линии HeLa.............................112

3 19 иммуногистохимическое исследование образцов опухолевых тканей мочевого пузыря и молочной железы.............................................................................113

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................................115

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................................116

Список сокращений

AT - антитела

БСА - бычий сывороточный альбумин ИФА - иммуноферментный анализ НАФ - неполный адъювант Фрейнда ПАФ - полный адъювант Фрейнда ЦОМТ - центр организации микротрубочек

BIR - высококонсервативный домен, характерный для всех представителей семейства СРС - комплекс хромосомных пассажиров HeLa - линия клеток карциномы шейки матки IAP - семейство белков-ингибиторов апоптоза

IBM - тетрапептид, связывающийся с BIR-доменами белков семейства IAP

GFP - зеленый флуоресцентный белок

GST - глутатион-Б-трансфераза

KLH - гемоцианин улитки Megathura crenulata

MCF-7 - линия клеток аденокарциномы молочной железы

OVA - овальбумин

PBS - фосфатный буфер

SDS - додецилсульфат натрия

Введение

Онкологические заболевания в структуре смертности населения занимают второе место после сердечно-сосудистых заболеваний, в развитых европейских странах они являются причиной смертности 20% населения. В связи с изменением экологии и образа жизни людей их частота в последние десятилетия неуклонно возрастает. Разработка новых методов уточняющей диагностики рака является актуальным направлением в современной онкологии, так как адекватное лечение в большинстве случаев заканчивается полным выздоровлением больного.

Опухоль - это патологический процесс, представленный новообразованной тканью, в которой изменения генетического аппарата клеток приводят к нарушению регуляции их роста и дифференцировки. Для большинства злокачественных опухолей также характерны нарушения в регуляции программированной клеточной смерти - апоптоза. Важная роль в регуляции апоптоза принадлежит семейству белков-ингибиторов апоптоза (1АР), которые выполняют функции внутриклеточных ингибиторов каспаз. Наибольшее внимание из белков данного семейства привлекает к себе сурвивин.

Различный уровень экспрессии сурвивина в нормальных и раковых тканях обусловливает значительный интерес исследователей к возможности использования данного белка в качестве биомаркера онкологических заболеваний, а также определению взаимосвязи уровня его экспрессии и локализации в раковых клетках с клинико-патологическими показателями. Результаты подобных исследований, однако, зачастую противоречивы, и связано это не только с различной специфичностью применяемых антител, но и с особенностями самого белка. Сурвивин - это один из так называемых «узловых» белков, он образует сложную сеть взаимодействий с белками-посредниками и принимает участие в таких важнейших процессах, как регуляция клеточного деления и ингибирование программированной смерти. Накапливается все больше данных о том, что функции сурвивина в клетке могут зависеть от его локализации в клетке и структурного состояния. Становится очевидным, что для успешной диагностики рака необходимо иметь информацию не только о его содержании в тканях, но и о его локализации в опухолевых клетках, а также о мономер-димерном состоянии. Для подобных исследований необходимы антитела, способные селективно связывать различные структурные формы сурвивина.

В связи с этим, данная работа направлена на получение антител, с одной стороны пригодных для проведения структурно-функциональных исследований сурвивина, с

другой - для уточняющей диагностики онкозаболеваний. Для получения антител было предложено использовать синтетические фрагменты сурвивина. Такой подход позволяет получить узконаправленные антитела к структурно и функционально важным участкам белковой цепи. Для выбора фрагментов сурвивина для последующего получения антител, было необходимо проанализировать имеющуюся информацию о структурных и функциональных особенностях сурвивина, и именно этому посвящен обзор литературы.

I. Обзор литературы «Структурные и функциональные особенности сурвивина - представителя семейства белков-

ингибиторов апоптоза»

1.1. Сурвивин - представитель семейства белков-ингибиторов

апоптоза

Семейство белков-ингибиторов апоптоза (IAP) - это группа структурно и функционально родственных белков, принимающих участие в целом ряде клеточных процессов, начиная с ингибирования каспаз - цистеиновых протеиназ, принимающих участие в программированной клеточной смерти - и заканчивая регуляцией клеточного деления. В семействе IAP человека к настоящему времени идентифицировано 8 представителей. Пять членов этого семейства экспрессируются в нормальных взрослых тканях: c-IAPl (cellular IAP1), C-IAP2, XIAP (X-linked IAP), NAIP (neuronal apoptosis inhibitory protein) and Appolon/BRUCE (BIR-repeat-containing-ubiquitin-conjugating enzyme). Экспрессия еще двух представителей данного семейства, а именно сурвивина и ML-IAP (melanoma IAP)/Livin, наблюдается только в опухолевых тканях [1, 2]. Экспрессия же последнего известного представителя - ILP2 (IAP-like protein 2) в нормальных и опухолевых тканях практически не изучена, однако данный белок был обнаружен в лимфобластоидных клетках и семенниках [3] и в образцах сыворотки крови пациентов с диагнозом рак молочной железы [4].

Первоначально полагали, что функции белков данного семейства связаны лишь с подавлением активности каспаз, то есть с ингибированием апоптоза. Более поздние исследования показали, что белки IAP также участвуют в убиквитин-зависимых сигнальных событиях, которые регулируют активацию транскрипционного фактора NF-кВ, который в свою очередь активирует экспрессию генов, принимающих участие в развитии процессов воспаления, иммунитета, миграции клетки и ее выживании. Кроме того, было показано, что белки данного семейства способны модулировать сигнальные события, приводящие к активации киназ, ответственных за подвижность клетки и метастазирование, а также они регулируют сигнальные пути митотических киназ, клеточную пролиферацию и митоз [5, 6]. Регуляция многих из упомянутых выше клеточных процессов нарушена в раковых клетках, что, как полагают, прямым или

косвенным образом требуется для инициации перерождения клеток в раковые и поддержания и/или развития опухоли [7].

Такое обилие функций белков 1АР может быть связано с многообразием специфических доменов, присутствующих у отдельных представителей семейства (рис.1).

xiAP — ДД n'Cgiw^^H

C-IAP2 —' Н—1 CARD KÜR'NGT) I

Сурвивин ——

ILP2 -J

ML-IAP -

LRR

NAip ^lor^-^Ä-iTiiiV

Рис. 1. Доменная организация представителей белков семейства IAP человека. BIR -высококонсервативный домен, характерный для всех представителей семейства IAP; RING - С-концевой домен, обладающий убиквитин-лигазной активностью; UBC -убиквитин-конъюгирующий домен; CARD - домен взаимодействия с каспазами; LRR -обогащенный остатками лейцина повтор; NOD - домен олигомеризации [8].

Характерная особенность всех белков семейства IAP - это наличие по крайней мере одного, а как правило двух-трех, высококонсервативных участков, названных BIR (baculoviral IAP repeat). Такое название данный домен получил из-за того, что впервые эти супрессоры апоптоза были обнаружены в геноме бакуловирусов. BIR-домен - это цинк-связывающая область белка приблизительно из 70 аминокислотных остатков, которая имеет характерную последовательность R-X2-OF-X2-4-a-X5.jo-pXh-X3-Ghha-X2.6-pX2-6-ChXC-X3-h-X2-aX3-pphhXpH-X5-pCXah, где X - это любой аминокислотный остаток; О - это остаток серина или треонина; а, р, и h - это ароматические, полярные и гидрофобные остатки соответственно. Подчеркнутые аминокислотные остатки в этой последовательности инвариантны, что предполагает их важность для правильной укладки BIR-домена и/или его функций. Таким образом, практически все BIR-домены содержат 3 остатка цистеина и 1 остаток гистидина, координирующие ион цинка, в результате чего формируется мотив «цинковый палец».

Имея в своей последовательности как гидрофобные, так и гидрофильные аминокислотные остатки, BIR-домен, как полагают, принимает участие в белок-белковых взаимодействиях и важен для реализации анти-апоптозного потенциала большинства белков семейства IAP.

В зависимости от наличия в BIR-домене пептид-связывающей впадины их условно подразделяют на 2 группы: BIR-домены I типа (BIR1) и BIR-домены II типа (BIR2). В отличие от BIR1, не имеющего пептид-связывающей впадины, BIR2 имеет характерную гидрофобную щель, через которую происходит связывание с N-концевыми тетрапептидами белков-мишеней, называемыми IAP-связывающими мотивами (IBMs). Наиболее характерная черта всех IBMs - это присутствие на N-конце остатка аланина или серина, которые должны быть экспонированы и незаблокированы. Такой аминокислотный остаток может взаимодействовать с пептид-связывающим участком на поверхности BIR-домена, образуя водородные связи с соседними аминокислотными остатками. Боковая цепь остатка аргинина в третьем положении обеспечивает лучшее взаимодействие с гидрофобной составляющей BIR, гидрофобные остатки во втором и четвертом положении также необходимы для связывания IBM-содержащих белков с BIR.

Белки семейства IAP, принимающие участие в регуляции апоптоза, такие как XIAP, cIAPl, cIAP2 имеют по два BIR2, а кроме того содержат домены I типа, которые не связываются с каспазами или IAP антагонистами, но принимают участие во взаимодействии с рядом других белков. Например, BIR1-домен cIAPl и с1АР2 может связываться с белком TRAF1 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 1) и TRAF2, тогда как BIR 1-домен XIAP участвует во взаимодействии с киназа ТАК1 (transforming growth factor-P-activated кта8е)-связывающим белком TAB 1.

Другой характерный для представителей семейства IAP домен - это С-концевой RING-домен, обладающий убиквитин-лигазной ЕЗ активностью. В состав данного домена (С3НС4) входят два атома цинка, один из которых хелатирован тремя остатками цистеина и одним остатком гистидина, а второй - хелатирован четыремя остатками цистеина.

Белки cLAPl и с1АР2 имеют также каспаза-захватывающие домены CARD, которые, как полагают, принимают участие в белок-белковых взаимодействиях. Кроме того, в некоторых белках IAP были выявлены уникальные для этого семейства домены, такие как нуклеотид-связывающий и олигомеризационный домен (NOD) и лейцин-обогащенные повторы (LRR) в NAIP и убиквитин-конъюгирующий домен в Apollon.

Сурвивин - это структурно и функционально уникальный представитель семейства белков-ингибиторов апоптоза (IAP). Он является самым малым представителем семейства (молекулярная масса всего 16390Да), имеет лишь один BIR-домен, экспрессируется только в опухолевых клетках и участвует как в ингибировании апоптоза, так и в регуляции клеточного деления.

1.2. Структурные особенности сурвивина

Сурвивин - это один из важнейших представителей семейства белков-ингибиторов апоптоза, так как его экспрессия является наиболее специфичной для опухолевых клеток среди всех транскриптомов человека [9]. Его экспрессия была обнаружена практически во всех типах рака человека [10]. Кроме того, недавнее исследование Кхана и соавторов [11] показало, что раковые клетки способны высвобождать во вн