Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование корреляций экспрессии опухолеспецифического белка сурвивина и его природных ингибиторов SMAC и PML

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование корреляций экспрессии опухолеспецифического белка сурвивина и его природных ингибиторов SMAC и PML"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

иа346Э926

ВАЙШЛЯ НАТАЛЬЯ АРКАДЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ КОРРЕЛЯЦИЙ ЭКСПРЕССИИ ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО БЕЛКА СУРВИВИНА И ЕГО ПРИРОДНЫХ ИНГИБИТОРОВ БМАС И РМЬ

специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 А 1Ш

Москва-2009

003469926

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

академик РАН, доктор химических наук Е.Д. Свердлов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.Г. Зарайский кандидат биологических наук И.В. Коробко

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова

Защита состоится " О »июнА.2009 года в 10 часов на заседании Специализированного Совета Д002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан 45 ^ 2009 года

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор физ.-мат. наук

В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальпость проблемы

Выявление генов, вовлеченных в процесс образования опухолей, может значительно облегчить раннюю диагностику и создание новых лекарственных противоопухолевых препаратов. Нарушение путей передачи апоптотического сигнала и реализации апоптоза играет ключевую роль в ошеогенезе. Особый интерес в последние годы вызывают белки, вовлеченные в апоптоз, которые могут быть использованы как маркеры опухолевых процессов и/или как потенциальные мишени для различных терапевтических агентов. Одним из наиболее интересных с этой точки зрения является сурвивин (BIRC-5), относящийся к семейству белков-ингибиторов апоптоза (LAP, Inhibitor of Apoptosis Protein). Помимо ингибирования апоптоза сурвивин участвует в других клеточных процессах, в частности, в митотическом делегат клетки и процессе ангиогенеза.

Ген B1RC5 экспрессируется в процессе эмбрионального развития, но его мРНК и белок не детектируются в конечно дифференцированных нормальных тканях взрослого организма. Тем не менее, его повышенная экспрессия наблюдается в трансформированных клетках и практически во всех типах злокачественных опухолей.

Уровень сурвивина в клетках регулируется активностью ряда генов. Одним из природных ингибиторов сурвивина является белок SMAC (Second Mitohondria-derived Activator of Caspase). SMAC - митохондриальный белок, который выходит в цитозоль во время апоптоза и обеспечивает активацию каспаз за счёт связывания с белками семейства IAP, предотвращая тем самым их ннгибирующее действие по отношению к каспазам.

Другим известным природным ингибитором сурвивина является белок PML (Promyelocytic Leukemia). PML - много функциональный белок, представленный двенадцатью изоформами и участвующий в процессах регуляции транскрипции и трансляции, удлинении теломер, репарации ДНК, а также регуляции клеточной смерти. Потеря гетерозиготности по гену PML или мутации в этом гене присутствуют при многих типах рака различной гистологии, что часто ассоциировано с прогрессией опухоли и неблагоприятным прогнозом. Один из механизмов включения апоптоза с участием PML связап с подавлением активности промотора гена BIRC5. Такая функциональная активность показана только для изоформы PML6, относительно подобной активности других изоформ данные отсутствуют.

Таким образом, па основании литературных данных можно сделать вывод о том, что белки PML и SMAC могут быть использованы в противоопухолевой терапии для

ингибирования сурвивина, ключевого белка в регуляции апоптоза. Однако, несмотря на значительное количество работ, посвященных исследованию функций этих генов, ряд вопросов остается нерешенным. Так, например, данные по экспрессии генов SMAC и PML при опухолеобразованни противоречивы, а возможность корреляции повышенной экспрессии BIRC5 в опухолевой ткани с экспрессией генов его ингибиторов SMAC и PML вообще не исследовали. Терапевтический противопухолевый эффект белка SMAC, в том числе его влияние на активность белка сурвивина, в большинстве работ наблюдали при непосредственной обработке клеток препаратом белка, и лишь в нескольких работах проводили исследование возможности использования генно-инженерных экспрессионных терапевтических конструкций, содержащих кДНК SMAC. Способность подавлять активность промотора B1RC5 и уменьшать количество эндогенного сурвивина в опухолевых клетках была изучены лишь в двух работах и показана только для одной изоформы PML, PML6.

Настоящая работа состоит из двух частей. В первой части проведено исследование экспрессии генов B1RC5, SMAC и PML в опухолевых и нормальных тканях пациентов с диагнозами немелкоклеточный рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода, а также в опухолевых клеточных линиях человека. Было определено, что увеличение экспрессии гена BIRC5 в опухолевых тканях по сравнению с нормальными не коррелирует с изменениями экспрессии генов SMAC и PML. Во второй части изучали влияние стабильной и транзиентной экспрессии SMAC и PML1 (наиболее представленной изоформы PML в клетке) на клетки опухолевых клеточных культур человека. Было показано, что стабильная экспрессия SMAC не влияет на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu-l и NCI-H358. Транзиентная и стабильная экспрессия последовательности кДНК PML, кодирующей С-концевой фрагмент белка PML1, в опухолевых клетках человека вызывает выраженный апоптотический эффект.

Цели и задачи работы

Целью данной работы было выявление корреляций между экспрессией сурвивина и его ингибиторов на уровне РНК и белка в нормальных и опухолевых ткапях пациентов с диагнозом немелкоклеточный рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода и оценка терапевтического потенциала природных ингибиторов сурвивина SMAC и PML в генной терапии злокачественных опухолей.

В ходе работы были решены следующие задачи:

1. Создана панель гистологически охарактеризованных образцов опухолевых и прилегающих к ним нормальных тканей, взятых у одного и того же пациента с диагнозом нсмслкоклеточный рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода. Из полученных образцов тканей, а также ряда раковых клеточных линий человека выделены РНК, созданы библиотеки кДНК и получены белковые экстракты.

2. Определены уровни транскрипции и содержание белков для генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых и прилегающих к ним нормальных тканях легкого и пищевода и раковых клеточных линиях.

3. Клонированы кДНК SMAC и PML. Созданы экспрессионные генно-инженерпые конструкции, содержащие кДНК SMAC и PML, для стабильной и транзиентной трансфскции клеток человека.

4. Получены клеточные линии А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358, стабильно экспрессирующие SMAC. Не удалось получить трансфектанты, стабильно экспрсссирующие С-концевой фрагмент PML1, ни для одной из клеточных линий.

5. Проведён анализ эффекта стабильной и транзиентной экспрессии SMAC и PML1 на клеточную пролиферацию и спонтанный и индуцированный клеточный апоптоз в опухолевых клетках человека.

Научная новизна и практическая значимость работы

В работе впервые был проведен анализ корреляций экспрессии онухолсснсцифического белка сурвивина и его природных ингибиторов SMAC и PML. Показано, что уровень транскрипции гена BIRC5 повышен в опухолевых тканях легкого и не детектируется или детектируется на низком уровне в прилегающих к опухолям тканях и в тканях здорового легкого. При этом содержание белка сурвивина коррелировало с уровнем транскрипции гена BIRC5. В случае рака пищевода уровень транскрипции гена BIRC5 повышен как в опухолевых тканях, так и в прилегающих к опухолям тканях по сравнению с нормальным пищеводом. Содержание белка сурвивина не всегда коррелировало с уровнем транскрипции гена BIRC5 и было, в основном, повышено в опухолевых тканях по сравнению с прилегающими к опухолям тканями и тканями нормального пищевода. Полученные даппые могут свидетельствовать о том, что при возникновении плоскоклеточного рака пищевода транскрипция BIRC5 повышается во всем пораженном органе уже па ранних стадиях развития заболевания. Также было обнаружено, что при прогрессии опухоли происходит уменьшение разницы в уровнях транскрипции BIRC5 в опухолях и прилегающих к ним тканях пищевода. В работе впервые на одних и

тех же образцах было показано, что увеличение экспрессии гена BIRC5 в опухолевых тканях по сравнению с нормальными не коррелирует с изменениями экспрессии генов SMAC и PML.

В экспериментах по стабильной трансфекции было показано, что стабильная экспрессия SMAC не влияет на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358. Кроме того, экспрессия экзогенного SMAC приводила к детектируемому увеличению количества эндогенного сурвивина. Возможно, связывание избытка сурвивина с белком SMAC препятствовало связыванию SMAC с другими белками семейства ингибиторов апоптоза (IAP). Это может объяснять отсутствие выраженного проапоптотического эффекта SMAC. Наблюдаемый эффект ранее не был описан в литературе и дает основания считать, что SMAC не является перспективным агентом в терапии злокачественных опухолей.

В работе впервые была изучена проапоптотическая активность белка PML1, одной из 12 изоформ белковых продуктов гена PML. Эта изоформа содержит наибольшее число экзонов и является наиболее представленной в клетке среди всех изоформ PML, при этом функции PML1 практически не изучены. Было показано, что транзиентная и стабильная трансфекции опухолевых клеток человека кДНК PML, кодирующей С-концевой фрагмент белка PMJL1, приводят к выраженному апоптотическому эффекту. Интенсивность индукции апоптоза при этом минимальна в клеточных линиях с функционально дефектным белком р53. Увеличение уровня исследуемого С-концевого бежа PML1, в отличие от описанного в литературе С-концевого фрагмента белка PML6, не влияло на активность опухолеспецифического промотора гена BIRC5 человека. Полученные результаты делают PML1 возможным терапевтическим агентом для лечения опухолей с функционально активным белком р53, которые составляют примерно 50% всех опухолей.

Публикации и апробация работы

По теме диссертационной работы опубликованы две статьи в отечественных научных журналах. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: 3-lh International Conference "Basic Science for Medicine" (Новосибирск, 2007); II Международный молодёжный медицинский конгресс "Санкт-Петербургские научные чтения" (Санкт-Петербург, 2007); XX зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2008); IV съезд Российского общества биохимиков и

молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); 3rd ESF Functional Genomics Conference (Инсбрук, 2008); XXI зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2009).

Структура дпссертапин

Диссертационная работа изложена на ^страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка цитируемой литературы, включающего/Ссылки. Диссертация содержит /.{таблиц и ^рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC v PML в опухолевых, прилегающих к опухоли и нормальных тканях человека при немелкоклеточпом раке легкого и плоскоклеточном раке пищевода

Повышенная экспрессия гена BIRC5 показана практически во всех типах злокачественных опухолей, а данные об экспрессии SMAC и PML при опухолеобразовании противоречивы. Для выяснения механизмов регуляции экспрессии BIRC5 представляет интерес одновременное определение содержания мРНК и белков сурвивина и его ингибиторов в нормальных и опухолевых клетках. До сих пор такого сопоставления на одних и тех же образцах пе проводилось.

В работе методом ОТ-ПЦР были определены уровни транскрипции генов BIRC5, SMAC и PML в пормальных и опухолевых тканях, полученных от пациентов с диагнозами немелкоклеточный рак легкого (HMPJI) - больных аденокарциномой (АК) и плоскоклеточным раком легкого (ПРЛ), и от пациентов с диагнозом плоскоклеточный рак пищевода (ПРП). Образцы кДНК были нормализованы по содержанию кДНК 18S рибосомной РНК (гена "домашнего хозяйства"). Кроме того, методом иммуноблотинга был проведен анализ содержания соответствующих белковых продуктов в некоторых парах образцов опухолевых и прилежащих к ним пормальных тканей.

В работе были использованы образцы тканей пациентов, полученные в ходе хирургических операций. Все пациенты I-IV стадий рака наблюдались в Российском онкологическом центре им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва) в период с. мая 2004 года до ноября 2005 года. Клинико-патологические характеристики пациентов представлены в Таблице 1. Кроме того, использовали образцы здоровых тканей, взятых у пяти человек,

умерших в результате травм или внезапной смерти, без видимых признаков патологий легких и пищевода.

Таблица 1. Клинико-патологические характеристики пациентов.

Рак легких Рак пищевода

Клинико-патологические Количество Клинико-патологические Количество

характеристики пациентов Характеристики пациентов

Пол Пол

мужчины/женщины 34/4 мужчины/женщины 19/4

Возраст Возраст

разброс/ среднее значение 33-75/61 разброс/среднее значение 32-74/56

Тип рака Тип рака

ПРЛ/АК 28/10 ПРП/другие 23/0

Локализация опухоли Локализация опухоли

центральная/периферическая 21/17 средняя треть/нижняя треть 8/15

Т-статус Т-статус

Т1ЛГ2/ТЗ/Т4 8/6/23/1 Т1Я2/ТЗ/Т4 0/5/14/4

N-статус N- статус

N0/N1/N2 24/7/7 N0/N1/N2 12/11/0

М-статус М-статус

М0/М1 38/0 М0/М1 23/0

Стадия рака Стадия рака

I/IWII/IV 9/18/11/0 MI/IIWV 0/10/13/0

ПРЛ - плоскоклеточный рак легкого; АК - аденокарцинома легкого; ПРП -плоскоклеточный рак пищевода; Т - размер опухоли; N - метастазирование в регионарные лимфоузлы; М - отдаленные метастазы.

Результаты ОТ ПЦР представлены в Таблице 2. Транскрипция ВШС5 была ниже уровня детекции метода ОТ ПЦР в тканях, прилегающих к опухоли, за исключением 5 случаев (13%) и в пяти образцах тканей людей, не больных раком легкого. Высокий уровень транскрипции в опухолевых тканях по сравнению с нормальными легкими обнаружен у 26 пациентов (68%) с диагнозом НМРЛ, при этом у 24 из этих 26 пациентов уровень транскрипции ВШС5 в опухолевой ткани был выше, чем в ткани, прилегающей к опухоли. У 12 пациентов (32%) транскрипция ВШС5 была ниже уровня детекции как в опухолевых, так и в прилегающих к опухоли тканях. Возрастание уровня транскрипции не зависело ни от типа рака (ПРЛ или АК), ни от стадии, размера, локализации и других характеристик опухоли. На рис. 1а представлены результаты ОТ-ПЦР ВШС5 для двух пар образцов легкого и пищевода. Праймеры для амплификации гена сурвивина были подобраны так, что бьио возможно одновременно амплифицировать все 3 основные формы транскрипта этого гена. В случае ПРП повышенный уровень транскрипции ВШС5

по сравнению с нормальным пищеводом был обнаружен как в опухолевых, так и в прилегающих к опухоли тканях у 21 пациента (91%), и только у 10 пациентов (43%) наблюдали повышение уровня транскрипции ВШС5 в опухолевых клетках по сравнению с прилегающими нормальными клетками.

Таблица 2. Изменения уровней транскрипции генов ВШС5, РМЬ и ХШС в опухолевых и прилегающих к опухоли тканях.

Изменения уровня транскрипции генов в опухолевых клетках Легкие (38 пар образцов) Пищевод (23 пары образцов)

ВШС5 РМЬ 5МАС ВШС5 РМЬ БМАС

Повышение в опухоли по сравнению с нормальными тканями; кол-во пар (%) 26 (68%) 0 0 21 (91%) 4 (11%) 4 (17%)

Повышение в тканях, прилегающих к опухоли, по сравнению с нормальными тканями; кол-во пар (%) 5 (13%) 0 0 21 (91%) 0 9 39%

Повышение в опухоли по сравнению с прилегающими к опухоли тканями; кол-во пар (%) 24 (63%) 10 (26%) 7 (18%) 10 (43%) 7 (30%) 1 (4%)

Снижение в опухоли по сравнению с прилегающими к опухоли тканями; кол-во пар (%) 1 (2.5%) 6 (16%) 9 (24%) 3 (13%) 2 (9%) 6 (26%)

Одинаковый уровень в опухоли и в прилегающих к опухоли тканях; кол-во пар (%) 1 (2.5%) 22 (58%) 22 (58%) 9 (39%) 14 (61%) 16 (70%)

Ниже уровня детекции как в опухоли, так и в прилегающих к опухоли тканях; кол-во пар (%) 12 (32%) 0 0 1 (5%) 0 0

Изменение экспрессии ВШС5 не зависело от места локализации опухоли (нижняя или средняя треть пищевода). Следует отметить, что количество пар образцов с повышенным уровнем транскрипции ВШС5 в опухолевых тканях относительно тканей, прилегающих к опухоли, снижалось при увеличении стадии развития опухоли и ее размеров. Так, в образцах ПРП второй стадии повышение транскрипции ВШС5 наблюдали в 60% случаев, в то время как для 3 стадии рака - только в 31%. При возрастании степени распространения опухолевого роста от Т2 к ТЗ+Т4, частота повышения уровня ВШС5 в опухолевых клетках снижалась с 60% образцов до 33%. Наличие метастазов в

регионарных лимфоузлах не сказывалось на характере изменения уровня транскрипции ВШС5. В то же время, транскрипцию ВШС5 в образцах пищевода, полученных от людей без видимых патологий этого органа, не обнаруживали. Таким образом, в случае рака пищевода с профессией опухоли увеличивается изменение ткани, прилегающей к ней.

Легкое Пищевод

2Н 20 20Н 200

" i —430 11.11.

a bircs[_________________j-j28„:„: i.

33 36 33 36 33 36 33 36

2Н 20 20Н 200

Сурвивин . 16.5 кЛя — 16.5 кДа

g SMAC__23 кДа ---— 23 кДа

PMI. — — »ТкД» - — 97КД«

GAPDII ■ " — 37 кДа _. __ 37 кда

Рис. 1. Изменения содержания мРНК BIRC5 (а) и белков сурвивина, SMAC и PML (б) в опухолевых и прилегающих к ним нормальных тканях легкого и пищевода, а - результаты электрофоретического разделения продуктов ОТ ПЦР после проведения 33 и 36 циклов амплификации, б - Вестерн-блот анализ белков сурвивин, SMAC и PML в опухолевых и нормальных тканях легкого и пищевода. Цифрами указаны номера пар образцов опухолевых (О) и прилегающих к ним нормальных (Н) тканей. Справа указаны длина продуктов ОТ-ПЦР, п.н. (а) и молекулярные массы белков, кДа (б).

Гены SMAC и PML транскрибировались практически на одинаковом уровне в опухолевых и прилегающих к опухоли тканях как при HMPJ1, так и при ПРП. В Таблице 2 для гена PML представлены данные по суммарному содержанию мРНК всех изоформ PML. В нашей работе было определено, что содержание мРНК всех изоформ PML было выше не более, чем в 8 раз (разница при амплификации в 3 цикла ПЦР означает, что количество транскриптов различается в 8 раз) по сравнению с содержанием мРНК только изоформы PML1. Этот результат может свидетельствовать о преимущественной транскрипции в клетках формы PML1. Определение содержания мРНК изоформы PML6, для которой было показано подавление активности промотора гена BIRC5, не представляется возможным, поскольку невозможно было подобрать уникальные праймеры для ПЦР амплификации кДНК только изоформы PML6. Уровень транскрипции генов SMAC и PML не зависел от клинико-патологических характеристик опухоли. Уровни транскрипции этих генов в образцах, полученных от здоровых людей, умерших в результате травм, совпадали с уровнями транскрипции в нормальных тканях, прилегающих к опухолям.

Методом Вестерн-блот анализа нами было проведено полуколичественное определение содержания белков BIRC5, SMAC и PML в 2 образцах тканей легкого и

пищевода, полученных от людей без видимых патологий этих органов. Также исследовали содержание белков в отобранных случайным образом 10 парах образцов опухолевых и прилегающих к ним нормальных тканей легкого и в 8 парах образцов пищевода, полученных от пациентов с диагнозами НМРЛ и ПРП. Вестерн-бдот анализ для двух пар образцов легкого и пищевода прсдставлеп на рис. 16.

В случае рака легкого содержание белка ВЖС5 полностью коррелирует с уровнем транскрипции гепа. Некоторую разницу в содержании белка В111С5 и уровнями транскрипции наблюдали в образцах пищевода, полученных от пациентов с диагнозом ПРП. Содержание БМАС и РМЬ во всех исследованных образцах легкого и пищевода было приблизительно одинаковым, что соответствовало уровням транскрипции кодирующих их генов.

Ранее рядом авторов для опухолей легкого и пищевода была показана повышеппая экспрессия ВШС5, в то время как в нормальных тканях взрослого человека транскрипция далного гепа пе детектируется. Полученные в нашей работе результаты согласуются с выводами других авторов, что транскрипция ВШС5 имеет причинно-следственную связь с опухолсобразованием, и что этот ген может служить надежным диагностическим маркером и мишеныо для противораковой терапии при раке легкого и пищевода.

В литературе мало данных, и они весьма противоречивы, об изменении экспрессии генов £ШС и РМЬ при опухолсобразовании. Для гена ВМАС в большинстве работ не обнаружено значительных изменений в уровне экспрессии при развитии опухолей легких, хотя в некоторых работах описано как повышение, так и снижение уровня экспрессии этого гепа в опухолях легких по сравпспшо с нормой. Данные об экспрессии 5А£4С в нормальных и опухолевых тканях пищевода отсутствуют. Значительное снижение экспрессии РМЬ в опухоли по сравнению с нормой, ассоциированное с неблагоприятным прогнозом, было обнаружено при лейкозах и ряде солидных опухолей. Однако из этих работ не ясно, какие из изоформ мРНК РМЬ изучали в том или ином случае. Данные по экспрессии только изоформы мРНК РМЫ в опухолях легких и пищевода и прилегающих к опухоли нормальных клетках в литературе отсутствуют.

Логично било бы предположить, что увеличение содержания сурвивина может сопровождаться уменьшением содержания его ингибиторов, БМАС и РМЬб. В случае белка БМАС мы не наблюдаем подобной корреляции. Практически постояшгый уровень трапскрипта и белка 8МЛС наблюдается параллельно с достоверно увеличивающимся уровнем мРНК и белка ВШ.С5 в опухолях по сравнению с нормальными тканями легких и пищевода. Определение содержания транскрипта РМЬб методом ОТ ПЦР, как уже

отмечалось, не представлялось возможньм. Содержание транскрипта PML1 примерно одинаково в опухолевых и нормальных тканях, но поскольку было показано в нашей работе, что С-концевой фрагмент PML1, в отличие от С-концсвого фрагмента PML6, не влияет на активность промотора BIRC5, то можно заключить, что его содержание и не может влиять на содержание сурвивина по крайней мере по тому механизму, по которому влияет С-концевой фрагмент PML6. То обстоятельство, что при постоянном содержании белка SMAC и очень низком содержании PML6 количество сурвивина повышается в опухолевых тканях, свидетельствует о сложном характере взаимосвязей в системе сурвивин - ингибиторы сурвивина, которые еще предстоит выяснить.

Анализ экспрессии геяов BIRCS, SMAC и PML в опухолевых клеточных линиях человека

Клеточные линии являются удобной моделью для исследований процессов опухолеобразования и механизмов подавления роста опухолей. Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML важен как для понимания процессов опухолеобразования, так и для возможного использования клеточных линий в экспериментах по исследованию эффекта экспрессии генов SMAC и PML в опухолевых клетках.

В нашей работе методами ОТ-ПЦР и Вестерн-блот анализа был проведен анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в 14 клеточных линиях, происходящих как от разных форм рака легкого (А549, NCI-H23, NCI-H292, NCI-H460, NCI-H596, NCI-H1299, NCI-H322, NCI-H358, Calu-1, LUDLU-1), так и в клеточных линиях нелегочного происхождения (А431 (эпидермоидная карцинома кожи), HT 1080 (фибросаркома человека), НЕК-293 (трансформированные клетки эмбриональной почки человека), Hela (аденокарцинома шейки матки)).

Образцы кДНК были нормализованы по содержанию кДНК 18S рибосомной РНК (гена "домашнего хозяйства"). Ген B1RC5 экспрессировался в клетках всех исследованных линий, при этом содержание мРНК BIRC5 не всегда коррелировало с содержанием белка сурвивина. Среди всех исследованных клеточных линий наибольший уровень содержания мРНК BIRC5 был обнаружен в легочных клеточных линиях NCI-H1299 и NCI-H460, а в остальных линиях был приблизительно одинаков. Содержание белка сурвивина в экстрактах клеток нелегочных клеточных линий было выше, чем в легочных (Рис. 2). При этом различия в уровнях транскрипции BIRC5 и содержании белка не зависело от происхождения клеточных линий.

Содержание мРНК PML1 в клеточных линиях было одинаковым за исключением NCI-11322 и Calu-1, где уровень транскрипции был снижен приблизительно в 8 раз, и NCI-Н596, где уровень экспрессии был повышен в 8 раз по сравнению с другими исследованными линиями клеток (разница при амплификации в 3 цикла ПЦР означает, что количество транскриптов различается в 8 раз). При этом содержание белка PML1 значительно отличалось от уровня транскрипции этого гена.

ВШС 5 Л- щф-мтв* «W* ч«*^ ч*«16.5кД»

PML —» „„ _-«» «#«**— 97 кДа

SMAC

^ijwimi** 23 кДа

, — 37 кД»

Рис. 2. Вестерн-блот анализ белков суривина, PML и SMAC в экстрактах опухолевых клеточных линий человека.

В легочных хлеточных линиях, за исключением линий LUDLU-1, NCI-H23 и NCI-Н1299, содержание PML1 было значительно меньше, чем в нелегочных (Рис. 2). Интересно то, что в клеточной линии NCI-H596, для которой было показано наибольшее содержание мРНК PML1, белок PML1 не был обнаружен методом Вестерн-блот анализа. Возможно, это связано с повышенной деградацией белка PML1 в этой клеточной линии. Вестерц-блот анализ также показал наличие другой изоформы PML, PML9, в клеточных линиях А549, Calu-1, NCI-H292 и NCI-H596. При этом содержание мРНК PML1 и белков PML1 и PML9 не зависело от происхождения клеточной линии. Также как и для образцов опухолевых и нормальных тканей человека в работе методом ОТ-ПЦР было определено содержание суммарной мРНК всех изоформ PML для нескольких клеточных линий: А549, Calu-1, NCI-Ш92, NCI-H596, НЕК293 и Hela. При этом содержание мРНК PML1 для всех исследованных линий полностью совпадало с содержанием суммарной мРНК всех изоформ PML.

К настоящему времени была опубликована только одна работа, где приводятся результаты по определению и сравнению различных изоформ белка PML в клетках. Авторами было показано, что изоформы PML1 и PML9 являются мажорными по представленности в клетках нормальных фибробластов линии MRC5 по сравнению с другими белками PML. Полученные нами данные подтверждают эти результаты. В то же

время, в этой работе было показано, что содержание мРНК PML1 в клетках линии Hela составляет лишь 10% от суммарного уровня транскриптов PML. В нашей работе напротив было показано, что мРНК PML1, также как и белок, являются мажорными по представленности среди всех изоформ PML как в Hela, так и в других исследованных клеточных линиях.

Содержание мРНК SMAC в клетках линий NCI-H322, NCI-H358, NCI-H1299, LUDLU-1 и НТ1080 было в 8 раз больше, чем в остальных исследованных линиях. Содержание белка SMAC было приблизительно одинаковым во всех клетках (Рис. 2).

Таким образом, экспрессия генов BIRC5, SMAC и PML детектируется во всех исследованных клеточных линиях. До настоящего времени не было данных по анализу экспрессии всех трех генов в данных линиях клеток. Литературные данные по экспрессии этих генов в опухолевых тканях человека обсуждались выше. Полученные в этой работе результаты по экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых клеточных линиях человека не противоречат данным по экспрессии этих генов в опухолевых тканях человека.

Создание экепресенонных генно-инженерных конструкций, содержащих кДНК SMAC «PML

SMAC - митохондриалыгый белок, который выходит в цитозоль под действием проапоптотических стимулов. Предшественник SMAC (full SMAC) состоит из 239 аминокислотных остатков, из которых 55 аминокислотных остатков на N-конце составляют сигнальный пептид и отщепляются при транспорте в митохондрии. По литературным данным как зрелый белок (mSMAC), так и его предшественник обладают проапоптотической активностью. В нашей работе для изучения проапоптотической активности белка SMAC были клонированы 2 последовательности кДНК, одна из которых (720 п.н.) кодировала полноразмерный SMAC, содержащий N-концевую сигнальную последовательность, а вторая (555 п.н.) - зрелый белок.

кДНК PML имеет размер 2649 п.о. В результате альтернативного сплайсинга РНК PML образуется 12 изоформ PML белка, содержание которых в клетках не одинаково. Нами клонирована З'-концевая последовательность кДНК длиной 1392 п.н., содержащая 59 (последний) окзоны гена PML и кодирующая 420-882 С-концевые а.к. белка PML1. Выбранный для клонирования фрагмент PML1 включал в себя практически всю (за исключением 13 С-концевых аминокислот) С-концевую последовательность PML6, для которой была показана способность подавлять активность промотора BIRC5.

кДНК генов SMAC и PML получали методом ОТ-ПЦР, используя суммарную РНК из клеток, для которых нами была показана повышенная экспрессия этих генов (лимфоидная ткань, полученная от человека, умершего в результате травмы несовместимой с жизнью, и клеточная линия HL60 соответственно). ПЦР амплификацию с праймерами к фрагментам кДНК SMAC и PML, кодирующим full SMAC, mSMAC и 420882 а.к. С-концевого фрагмента PML1, проводили с использованием высокоточной ДНК-полимеразы Advantage 2 (Clontech, США). Полученную кДНК клонировали в вектор рС1 (Promega, США) (Рис. 3) для транзиентной экспрессии генов и вектор pFBneo (Stratagene, США) (Рис. 4), используемый для стабильной трансфекции клеток человека.

Кроме того, была получена экспрессионная конструкция на основе вектора pEGFP-N1 (Clontech, США), содержащая исследуемый фрагмент кДНК PML1 длиной 1392 п.н. в одной рамке считывания с кДНК, кодирующей зеленый флюоресцирующий белок GFP и находящейся под контролем промотора цитомегаловируса (Рис. 3).

CMV гро^огел CMV проиотор

Afnp R

Amp к

SMAC 555 пл.

full SMAC 720 п.н.

CMV npowcrop

CMV npouorop

P6GFP-N1-PML1 6088 n.H.

PML1 1392 n.H.

PML1 1392 n.H SV40 папк A

Рис. 3. Экспрессионные конструкции для транзиентной экспрессии кДНК SMAC и PML.

Для оценки эффективности транзиентной экспрессии белков тЗМАС, ЙШ 5МАС и РМЫ проводили липофекцию клеток линии НЕК293 плазмидами рС1, содержащими клонированные кДНК, и последующий Вестерн-блот анализ с использованием антител к соответствующим белкам. Результаты Вестерн-блот анализа свидетельствуют о высоком уровне экспрессии целевых белков.

Получение клеточных линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358, стабильно экспрсссирующнх SMAC и РМ1Л

На рисунке 4 представлена qíeMa получения стабильно трансфицированных клеточных линий. Исследование биологического эффекта экспрессии клонированных кДНК в стабильно трансфицированных клеточных линиях позволяет исключить из рассмотрения факторов, влияющих на экспрессию, такой параметр как эффективность трансфекции. Такие клеточные линии представляют собой удобную систему для исследования проапоптотического эффекта генно-инженерных конструкций при одновременном воздействии цитостатических препаратов. В ряде работ было показано, что сама по себе трансфекция опухолевых клеточных линий экспрессионными конструкциями, несущими гены терапевтического воздействия SMAC или PML, слабо индуцирует апоптоз. Однако, при одновременном воздействии химиотерапевтических препаратов проашптотический эффект генов - индукторов апоптоза был более выраженным.

¡ pFBneo-PML г , pFBiwo-mSMAC

Jul! SMAC 720 л.н.

Трансфекция клеток пинии Phoenix А

Ретровирусные частицы

Инфекция клеток линий HeLa, А549, Calul и NCÍ-H358

Селекция стабильно трансфицированных клеток на среде с G418 (1 мг/мл)

5' LTR I— IRES

Клонированный ген Ген устойчивости к | гакетицину !NaoRj

Стабильно трансфицированные клеточные линии Рис. 4. Схема получения стабильно трансфицированных клеточных линий

В нашей работе ретровирусные супернатанты получали путем липофекции клеток пакующей линии Phoenix А плазмидами pFBneo-mSMAC, pFBneo-full SMAC, pFBneo-

PML1 (Рис. 4) и контрольными плазмидами pFBneo и pFBneo-GFP. Затем проводили инфекцию полученными рекомбинантными ретровирусами клеток линий Hela (аденокарцинома шейки матки), А549 (аденокарцинома легкого), Calu-1 (эпидермоидная карцинома легкого) и NCI-H358 (эпидермоидная карцинома легкого). После инфекции проводили селективный отбор на среде с генетицином (G418, 1 мг/мл) в течение 2-2,5 недель. После недельного роста на селективной среде с G418 отмечали появление колоний, предположительно инфицированных ретровирусом. Вектор pFB-neo (Рис. 4) сконструирован таким образом, что клонируемый фрагмент находится в непосредственной близости с геном неомицин-фосфотрансферазы (NeoR) и отделён от него последовательностью, кодирующей IRES (Internal Ribosome Entry Site, внутренний сайт посадки рибосомы). В результате транскрипции образуется бицистронная мРНК, несущая последовательность клонируемого гена и гена устойчивости к G418. Рост колоний на среде, содержащей антибиотик, означает, что образуется неомицин-фосфотрансфераза и, следовательно, транскрипция клонированной конструкции происходит нормально. Можно также надеяться, что транслируются и ингибиторы сурвивина.

Скорость роста клеток, инфицированных ретровирусами, несущими кДНК mSMAC и full SMAC, существенно не отличалось от таховой для клеток, инфицированных ретровирусом без вставки. В случае инфекции ретровирусом, несущим кДНК PML1, через две недели селекции колонии практически не образовывались. В Таблице 3 представлены полученные стабильно трансфицированные клеточные линии.

Таблица 3. Полученные стабильно трансфицированные клеточные линии (трансфектанты pFB-Neo-PMLl ни для одной клеточной линии получить не удалось)

pFB-Neo pFB-Neo-GFP pFB-Neo-mSMAC pFB-Neo-fuIl SMAC

А549 + + + +

Hela + + + +

Calu-1 + + + +

NCI-H358 + + + +

Для белка РМ1, показана способность подавлять рост и пролиферативную активность клеток и индуцировать апоптоз по двум путям: зависимому от р53 и р53-независимому. Наши опыты по транзиентной трансфекции клеток конструкцией рЕОРР-Ш-РМЫ показали, что исследуемый нами С-концевой фрагмент РМ1Л обладает проапоптотической активностью, которая максимальна в клетках с функционально активным белком р53. В экспериментах по стабильной трансфекции нам не удалось

получить трансфсктанты ни для одной линии клеток независимо от их р53 статуса (А549 имеют дикий тин р53, Hela - функционально неактивный белок, a Calu-1 и NCI-H358 -делении в гене ТР53). Возможно, что,в этом случае конститутивная экспрессия кДНК PML1 приводила к накоплению соответствующего белка, который подавлял рост и пролиферативную активность клеток или индуцировал апоптоз по р53-независимому пути.

Методом Вестерн-блот анализа было показано, что в полученных стабильно трансфицировагагых клеточных линиях белки mSMAC и foil SMAC экспрессируются на высоком уровне (Рис. 5).

/////Z/AWZ

М líela AS49 Calti 1 NC1-H358

Сурвивнн ^ ш.'пи.и!»! !''1!, ii^i -утят ííú — 16.5кДа

SMAC **..>„„,■„„................. % ________дц - — ззцда

GAPDH кД»

Рис. 5. Изменения содержания белка сурвивина в клетках линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-Н358, стабильно экспрессирующих mSMAC и foil SMAC. Справа указаны молекулярные массы белков, кДа.

Анализ эффекта экспрессии PML1 в условиях транзиентной трансфекции клеток линий Hela, А549 и НТ1080 плазмидой pEGFP-Nl-PMLl

Анализ проапоптотической активности С-концевого фрагмента PML1 в составе экспрессионного вектора pEGFP-Nl проводили на культурах клеток линий А549 (аденокарцинома легкого), Hela (аденокарнинома шейки матки) и HTI080 (фибросаркома человека) методом флуоресцентной микроскопии. Клетки трансфицировали контрольным вектором pEGFP-Nl и зкспрессионной конструкцией pEGFP-Nl-PMLl (Рис. 3). Через 48 часов после трансфекции клетки фотографировали в случайных полях микроскопа и подсчитывали общее количество клеточных ядер и количество ядер с признаками фрагментации. В параллельных экспериментах нетрансфицированные клетки исследуемых линий окрашивали ядерным красителем Н33342, после чего окрашенные клетки фотографировали и также считали количество нормальных и деформированных ядер.

В клетках, трансфицированных контрольным вектором pEGFP-Nl, наблюдали равномерную флуоресценцию в ядре и цитоплазме клеток, в то время как после трансфекции зкспрессионной конструкцией pEGFP-Nl-PMLl флуоресценцию наблюдали только в ядрах клеток (рис. 6). Ядерная локализация гибридного белка GFP-PML1

обеспечивается за счёт наличия в составе РМЫ сигнала ядерной локализации, который направляет белок в ядро клетки.

Через 4В часов после трансфекции в клетках линий А549 и НТ1080, трансфицированных рЕСРР-Ж-РМЫ, наблюдали изменение морфологии ядра и его частичную фрагментацию (рис. 662 и 6в2). В то же время ядра клеток, трансфицированых рЕвРР-Ш, сохраняли нормальную морфологию (рис. 661 и 6в1). Данные морфологические изменения являются характерными для клеток, вступивших в апоптоз, что может свидетельствовать о проапоптотическом эффекте, вызванном трансфекцией клеток экспрессионной конструкцией, несущей кДНК РМЫ.

12 12

Рис. 6. Морфологические изменения клеток линий Hela (а), А549 (б) и НТ1080 (в), трансфицированных плазмидой pEGFP-Nl (1) и экспрессионной конструкцией pEGFP-Nl-PML1 (2). (г) — Клетки линии А549, трансфицированные плазмидой pEGFP-Nl (1) и экспрессионной конструкцией pEGFP-Nl-PMLl (2), и окрашенные красителем Н33342. (д)- Клеточные ядра с апоптотическими признаками. Стрелками показаны ядра с апоптотическими признаками. В левом нижнем углу указано увеличение объектива микроскопа.

В клетках линии Hela, трансфицированных экспрессионной конструкцией pEGFP-N1-PML1, ядерной фрагментации не было обнаружено так же, как и в клетках этой линии, трансфицированных pEGFP-Nl (рис. 6а2). Полученные результаты были воспроизводимы для всех трёх линий клеток в повторных экспериментах по трансфекции конструкцией pEGFP-Nl-PMLl и контрольной плазмидой pEGFP-Nl.

В клетках линии А549, траисфицированных экспрессиониой конструкцией pEGFP-N1-PML1, фрагментированных ядер было приблизительно на 15% больше, чем в нетрасфицировшшых клетках. В клетках линии НТ1080 это увеличение составило приблизительно 20%.

Чтобы исключить возможный цитотоксический эффект трансфекции и экспрессии гена GFP, был проведён эксперимент, в котором клетки линии А549, трансфицированные экспрессионной конструкцией pEGFP-Nl-PMLl и контрольной плазмидой pEGFP-Nl окрашивали красителем Н33342, а затем детектировали раздельно флуресценцию GFP и флуресценцию красителя Н33342 в одном поле микроскопа. Полученные фотографии накладывали друг на друга с помощью программы Adobe Photoshop 7.0 и подсчитывали количество клеточных ядер с признаками фрагментации среди всех траисфицированных клеток. В клетках, траисфицированных экспрессионной конструкцией pEGFP-Nl-PMLl, фрагментированных ядер было приблизительно на 32% больше, чем в клетках, траисфицированных плазмидой pEGFP-Nl. Кроме того, фрагментации подвергались именно те клетки, которые были трансфицированы pEGFP-Nl-PMLl, а не нетрансфицированные клетки, как видно на рисунке 6г.

Известно, что в клетках линии Hela продукт гена Е6 вируса папилломы человека вызывает ускоренное разрушение опухолевого супрессора белка р53 в протеасомной системе, в то время как клетки линий А549 и НТ1080 имеют функционально активный р53. Таким образом, экспрессия клонированного С-концевого фрагмента PML1 приводит к апоптозу в клетках с функционально активным белком р53.

Описанный проапоптотический эффект может осуществляться за счет нескольких механизмов. Одним из них является возможное непосредствешюе взаимодействие С-концевого фрагмента PML1 с р53. В ряде работ показано взаимодействие С-концевого фрагмента PML6 с р53, которое способствовало стабилизации белка р53 и активации транскрипции р53-регулируемых проапоптотических генов. Белок PML, связываясь с р53, направлял белок р53 в ядерные тельца, где осуществлялось его ацетилирование. Поскольку PML1 включает в себя практически всю последовательность PML6 за исключением 13 С-концевых аминокислот, то можно предположить, что и PML1 также способен связывается с белком р53 и стабилизировать его. Другим возможным р53-зависимым механизмом индукции апоптоза является взаимодействие PML1 с белком Mdm2. Взаимодействие PML6 с Mdm2, которое защищало белок р53 от связывания с Mdm2, приводящего к деградации р53 в протеасомной системе, было показано ранее в нескольких работах. Однако сайт связывания Mdm2 локализован в Coiled-coil домене PML, который не входит

в состав белка, закодированного в клонированном нами фрагменте РМЫ. Третьим возможным механизмом является подавление активности промотора гена ВШС5, подобный эффект был описан для С-концевого фрагмента РМЬб. Однако, как будет описано ниже, исследуемый нами фрагмент РМЫ не обладает такой способностью. Поэтому механизм непосредственного взаимодействия РМЬ с р53, приводящего к стабилизации белка р53 путем его ацетилирования в ядерных тельцах, в данном случае представляется наиболее вероятным.

Изучение сигнальных путей апоптотической клеточной смерти и супрессии клеточного роста имеет важное значение для терапии злокачественных опухолей. Полученные в данной работе результаты делают С-концевой фрагмент РМЫ возможным терапевтическим агентом для лечения опухолей с функционально активным белком р53, которые составляют примерно 50% всех опухолей.

Апалпз влияния повышенной экспрессии С-концевого фрагмента РМЫ на активность промотора гена ВШС5

Характер влияния повышенной экспрессии С-концевого фрагмента РМЫ в клетках на активность промотора гена ВШС5 был определен для двух клеточных линий А549 (аденокарцинома легкого) и НЕК293 (трансформированные клетки эмбриональной почки человека). В данной работе использовался промоторный участок гена ВШС5 с координатами -1456...+42, который содержит все описанные функциональные сайты связывания транскрипционных факторов и обладает наибольшей промоторной активностью. Для этого были проведены эксперименты по совместной трансфекции клеток плазмидами рСЬРМЫ и рОЬЗ^шлЦ. Плазмида рОЬЗ-Р5иг\4 содержала репортерный ген люциферазы светлячка под управлением промотора гена ВШС5, а плазмида рСЬРМЫ содержала последовательность, кодирующую 420-882 а.к. белка РМЫ, под контролем конститутивного промотора цитомегаловируса для обеспечения высокого уровня экспрессии данного гена в трансфицированных клетках. Для наблюдения аддитивного усиления ожидаемых регуляторных эффектов мы использовали различные молярные отношения плазмид рС1-РМЫ и рОЬЗ-Р5игу4 при трансфекции. Влияние повышенной экспрессии белка РМЫ на активность промотора гена ВШС5 оценивали по уровню люциферазной активности в экстрактах трансфицированных клеток. Плазмиду р!1Ь-ТК, кодирующую люциферазу ЯетИа гет/огт1$, использовали в качестве внутреннего контроля при трансфекциях для нормирования значений активности люциферазы светлячка. В параллельных экспериментах клетки трансфицировали беспромоторной плазмидой рбЬЗ-ВУ. Промоторную активность определяли как отношение люциферазной

активности в экстрактах клеток, трансфицированных плазмидой pGL3-Psurv, к люцифсразной активиости в клетках, трансфицированных плазмидой pGL3-BV. Для каждой экспериментальной конструкции проводили три независимые трансфекции. Результаты экспериментов приведены на рис. 7.

Также методом Вестерн-блот анализа белка сурвивина в лизатах клеток А549 и НЕК293 было показано, что повышенная экспрессия С-концевого фрагмента белка PML1 практически не влияет на содержание эндогенного сурвивина.

Таким образом, в отличие от PML6, для которого было показано подавление

активности промотора гена B1RC5 за счёт его С-концевого фрагмента, С-концевой

фрагмент PML1 существенно не влияет на активность промотора BIRC5 и количество

эпдогенного сурвивина, по крайней мере, в исследованных клетках аденокарциномы

легкого и трансформированных клетках эмбриональной почки человека.

Рис. 7. Изменение активности промотора B1RC5 в клетках, транзиенто экспрессирующих кДНК PML1. Клетки были трансфицированы

¡одновременно двумя плазмидами: экспрессионной плазмидой pCI-PML и репортерной плазмидой pGL3-Psuiv. Молярное соотношение плазмид pGL3-Psurv : pCI-PML приведено по оси абсцисс. К- контрольный эксперимент, в котором клетки были трансфицированы только плазмидой pGL3-Psurv. За единицу принимали активность

-. люциферазы в экстрактах клеток,

трансфицированных беспромоторной плазмидой ' pGL3-BV. Высота столбцов отражает среднее значение люциферазной активности, полученное для трех независимых трансфекции, разброс соответствует стандартной ошибке измерения (SEM).

Анализ чувствительности к противоопухолевому препарату цисплатяну клеток линий А549. Hela. Calu-1 и NCI-H358

Для анализа возможности использования комбинированных обработок опухолевых клеток генно-терапевтическими конструкциями и стандартными противоопухолевыми цитостатиками мы определили чувствительность исследуемых клеточпых культур к цисплатину. Клетки линий Hela, А549, Calu-1, NCI-H358 обрабатывали цисплатином в концентрации от 0,5 до 25 мкМ и через 72 часа наблюдали морфологические изменения клеток под микроскопом. С ростом концентрации цисплатина наблюдали прогрессирующие морфологические изменения клеток, свидетельствующие об апоптозе.

На следующем этапе работы определяли IC50 (концентрация цитотоксического препарата, при которой 50% клеток погибает) для клеток линий Hela, А549, Calu-1 и NCI-

аЛ541

■ нькж

Í 40

Н358 при обработке противоопухолевым препаратом цисплатином. Клетки инкубировали с цисплатином 72 часа и затем определяли количество живых клеток с помощью метода МТТ.

Также для двух клеточных линий, А549 и Hela, обработанных цисплатином, был проведён Вестерн-блот анализ хорошо детектируемых белков-маркеров апоптоза: каспазы-7 и PARI' (поли-АДФ-рибоза-полимераза). Активная каспаза-7 и PARP детектируются в экстрактах клеток линии Hela при более низких концентрациях цисплатина, чем при обработке клеток А549.

На основе полученных данных по морфологическим изменениям клеток, ICjo и анализу белков-маркеров апоптоза мы расположили исследованные клеточные линии в следующий ряд по увеличению степени чувствительности к цисплатину: Calu-1, NCI-Н358, А549, Hela.

Анализ влияния стабильной экспрессии SMAC на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549. Hela, Calu-1 и NC1-H358.

В ряде работ ранее было показано, что повышенная экспрессия как зрелого, так и полноразмерного белка SMAC, или обработка белком SMAC приводят к апоптозу или к сенсибилизации клеток к противоопухолевым химиотерапевтическим препаратам. В нашей работе анализ влияния стабильной экспрессии mSMAC и full SMAC на клеточную пролиферацию линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358, стабильно экспрессирующих mSMAC и full SMAC, а также клеток дикого типа и клеток, трансфицированных ретровирусом без вставки, проводили МТТ методом. Скорость роста клеток всех исследуемых линий, стабильно экспрессирующих mSMAC и full SMAC, не отличалась от скорости роста клеток дикого типа и трансфицированных ретровирусом без целевой кДНК.

Для определения чувствительности к цисплатину к клеткам линий Hela, Calu-1 и NCI-H358 добавляли цисплатин в концентрациях от 0 до 25 мкМ. Через 72 часа инкубации с цисплатином из клеток экстрагировали белки и проводили Вестерн-блот анализ белков маркеров апоптоза, PARP и каспазы 7. Однако никаких изменений чувствительности к цисплатину в клетках стабильно эспрессирующих mSMAC и full SMAC по сравнению с трансфицированными ретровирусом без целевого гена и нетрансфицированными клетками в этих экспериментах мы не наблюдали.

В клетках линий Л549, Hela, Calu-1 и NCI-H358, стабильно экспрессирующих mSMAC и full SMAC, было проанализировано количество эндогенного белка сурвивина. Бьшо обнаружено, что в клетках, стабильно экспрессирующих mSMAC и full SMAC, практически во всех случаях наблюдается увеличение количества эндогенного сурвивина от 1,2 до 1,8 раза (Рис.5, Таблица 4).

Таблица 4. Относительное содержание белка сурвивина в клетках, стабильно экспрессирующих mSMAC и full SMAC, и клетках, стабильно трансфицировапных ретровирусом без целевой кДНК, нормированное на содержание белка GAPDH.

pFBneo mSMAC full SMAC

Hela 1 0,7 1,3

А549 1 1,4 1,4

Calu-1 I 1,8 1,3

NCI-H358 1 0,8 1,2

Таким образом, стабильная экспрессия ЭМАС, как зрелой формы, так и формы белка-предшественника, существенно не влияет на скорость роста опухолевых клеток и их чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатипу, а также может приводить к компенсаторному увеличению количества эндогенного сурвивина, что может объяснить отсутствие проапоптотического эффекта БМАС в трансфицировапных клетках. Наблюдаемый эффект увеличения количества эндогенного сурвивина ранее не был описан в литературе. На основе полученных данных можно заключить, что БМАС не является перспективным агентом в терапии злокачественных опухолей.

Полученные в данной работе результаты позволяют утверждать, что ген ВШС5 является надежным маркером при опухолеобразовашш у пациентов с нсмелкоклеточным раком легкого и плоскоклеточным раком пищевода, в то время как гены ЕМ АС и РМЬ не могут быть использованы в качестве диагностических маркеров опухолеобразования. РМ1Л является потенциалышм терапевтическим агентом в лечении злокачественных опухолей с функционально активным р53, и, в отличие от РМЬб, его проапоптотическое действие не связало с подавлением активности промотора гена ВШС5. БМАС не является перспективным агентом в противоопухолевой терапии, по крайней мере для опухолей легкого, поскольку его повышенная экспрессия в раковых клеточных культурах легочного происхождения приводит к компенсаторному увеличению содержания эндогенного сурвивина, который является ингибитором апоптоза.

выводы

1. При немелкоклеточном раке легкого человека экспрессия гена BIRC5 повышена в опухолевых тканях по сравнению с прилегающими к опухолям тканями и в здоровых легких не детектируется.

2. При плоскоклеточном раке пищевода человека повышенная экспрессия BIRC5 в большинстве случаев наблюдается как в опухолевых, так и в прилегающих к опухоли тканях, но не в нормальных тканях пищевода.

3. Полученные результаты в сочетании с литературными данными позволяют рассматривать экспрессию гена BIRC5 как диагностический маркер при немелкоклеточном раке легкого и плоскоклеточном раке пищевода человека.

4. Продемонстрировано, что экспрессия генов природных ингибиторов сурвивина, SMAC и PML, одинакова в нормальных и опухолевых тканях легкого и пищевода. Увеличение экспрессии гена BIRCS при опухолеобразовании в легком и пищеводе не коррелирует с изменениями экспрессии генов SMAC и PML.

5. Стабильная гетерологичная экспрессия SMAC приводит к компенсаторному увеличению количества эндогенного сурвивина и не влияет на клеточную пролиферацию и чувствительность клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358 к противоопухолевому препарату цисплатину.

6. Показано, что С-концевой фрагмент белка PML1 обладает проапоптотической активностью. Интенсивность индукции апоптоза в клеточных линиях в условиях транзиентной трансфекции зависит от статуса р53 и минимальна в клетках с функционально дефектным белком р53. С-концевой фрагмент белка PML1, в отличие от С-концевого фрагмента PML6, не влияет на активность опухолеспецифического промотора гена B1RC5 человека. Таким образом, С-концевой фрагмент PML1 является потенциальным терапевтическим агентом в лечении опухолей с функционально активным белком р53.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

Публикации в научных журналах

1. H.A. ВлГнпля. М.В. Зиновьева, A.B. Cace, Е.П. Копанцев, Т.В. Виноградова, Е.Д. Свердлов.

Увеличение экспрессии гена B1RC5 при плоскоклеточном раке легкого и пищевода не коррелирует с экспрессией генов SMAC/DLABLO и PML, кодирующих его ингибиторы. Молекулярная биология 2008, том 42, №4, с.652-661.

2. М.В.Зиновьева, H.A. Вайпгая. Т.В. Виноградова, Е.П. Копанцев, Е.Д.Свердлов. Структура и функции изоформ полифункциопального опухолевого супрессора PML. Молекулярная биология, микробиология и вирусология 2009, №2, с. 15-21

Материалы российских н международных конференций

1. H.A. Вайшля. Т.В. Виноградова, Е.П. Копанцев, Е.Д. Свердлов. Экспрессия BIRC-5 и его природных ингибиторов - SMAC и PML при немелкоклеточном раке легких человека. Зя международная конференция "Фундаментальные пауки — медицине", Новосибирск, 2-8 сентября 2007г., сборник тезисов устных и стендовых докладов, стр.107.

2. H.A. Вайшля (научный руководитель Е.Д. Свердлов). Экспрессия BIRC-5 и его природных ингибиторов SMAC и PML при немелкоклеточном раке легких человека. 11 Международный молодёжный медицинский конгресс "Санкт-Петербургские научные чтения", г. Санкт-Петербург, 5-7 декабря 2007 г., сборник тезисов устных и стендовых докладов, стр. 45.

3. Вайшля H.A.. Сасс A.B., Зиновьева М.В., Виноградова ТЛ., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. Изменения экспрессии BIRC5 и его природных ингибиторов SMAC и PML при немелкоклеточном раке легких и пищевода человека. XX зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 11-15 февраля 2008г., сборник тезисов докладов и стендовых сообщений, стр. 84.

4. Вайшля H.A.. Зиновьева М.В., Виноградова Т.Л., Копанцев Е.Г1. Изучение проапоптотической активности ингибиторов сурвивина, SMAC и PML. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008г., сборник тезисов докладов и стендовых сообщений, стр. 235.

5. N. Vavshlya. М. Zinovyeva, Т. Vinogradova, Е Kopantzev. Analysis of proapoptotic activity of survivin inhibitors SMAC and PML. 3rd ESF Functional Genomics Conference, Innsbruck, Austria, October 1-4,2008. Abstract book p.l 14.

6. Вайтпля H.A.. Зиновьева M.B., Виноградова Т.Л., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. Анализ проапоптотической активности ингибиторов сурвивина SMAC и PML. XXI зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 9-11 февраля 2009 г., сборник тезисов докладов и стендовых сообщений, стр. 22.

Подписано в печать: 24.04.2009

Заказ № 1933 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Вайшля, Наталья Аркадьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Апоптоз - запрограммированная клеточная смерть.

2.1.1 Молекулярные механизмы апоптоза.

Каспазы.

Семейство белков Bcl-2.

2.1.2 Внешний путь развития апоптоза.

2.1.3 Внутренний (митохондриальный) путь развития апоптоза.

2.2. Ингибиторы апоптоза.

2.3. Сурвивин.

2.3.1 Структура сурвивина.

2.3.2 Экспрессия гена BIRC5.

2.3.3 Биологические активности сурвивина.

Ингибирование апоптоза.

Роль сурвивина в митотическом делении клетки.

Влияние сурвивина на ангиогенез.

2.4. PML - (promyelocytic leukemia gene - ген промиелоцитарной лейкемии).

2.4.1 Структура гена PML и классификация изоформ мРНК.

2.4.2 Доменная структура белка PML, характеристика его изоформ и компартментализации в клетке.

2.4.3 Экспрессия гена PML.

2.4.4 Биологические активности PML.

PML —регулятор экспрессии генов.

Супрессия клеточного роста и проапоптотическая активность PML.

Противовирусная активность PML.

2.5. SMAC/DIABLO (Second Mitohondria-derived Activator of Caspases).

2.5.1 Структура SMAC/DIABLO.

2.5.2 Экспрессия гена SMAC/DIABLO.

2.5.3 Проапоптотическая активность SMAC/DIABLO.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование корреляций экспрессии опухолеспецифического белка сурвивина и его природных ингибиторов SMAC и PML"

4.2. Анализ экспрессии гена BIRC5 и генов его ингибиторов SMAC и PML.58

Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых и нормальных тканях человека при немелкоклеточном раке легкого и плоскоклеточном раке пищевода.58

Анализ экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых клеточных линиях человека.66

4.2. Создание экспрессионных генно-инженерных конструкций, содержащих гены SMAC и PML.69

4.3. Получение клеточных линий А549, HeLa, Calul и NCI-H358, стабильно экспрессирующих SMAC и PML.72

4.4. Анализ эффекта экспрессии гена PML в условиях транзиентной трансфекции клеток линий HeLa, А549 и НТ1080 плазмидой pEGFP-N1-PML1 75

4.5. Анализ влияния повышенной экспрессии С-концевого фрагмента PML1 на активность промотора гена BIRC5.78

4.6 Анализ чувствительности к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358.80

4.7 Анализ влияния стабильной экспрессии гена SMAC на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, HeLa, Calu-1 и NCI-H358.82

4.8. Заключение.84

5. ВЫВОДЫ .86

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.87

БЛАГОДАРНОСТИ. 100

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ п.н. - пар нуклеотидов ед. — единица об/мин — оборотов в минуту ПЦР - полимеразная цепная реакция ДНК-аза I - дезоксирибонуклеаза I

BIR - baculoviruses inhibitor of apoptosis repeat domains, повторяющиеся домены бакуловирусного ингибитора апоптоза

BIRC5 - baculoviral IAP repeat-containing 5 (survivin), белок, содержащий повторяющиеся домены бакуловирусного ингибитора апоптоза PML — promyelocyte leukaemia, ген промиелоцитарной лейкемии

SMAC/DIABLO - second mitohondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pi, второй митохондриальный активатор каспаз/связывающийся с ингибиторами апоптоза белок с низким значением изоэлектрической точки

IAP — inhibitors of apoptosis proteins, белки ингибиторы апоптоза

XIAP - X-linked inhibitor of apoptosis, ассоциированный с X хромосомой ингибитор апоптоза

RING — Really Interesting New Gene

RAR-a — receptor a-retinoic acid, рецептор а-ретиноевой кислоты PML-NB - PML nuclear body, PML ядерное тельце CARD — caspase recruitment domain, домен рекрутирующий каспазы RBCC/TRIM - RING-B-Coiled-Coil/TRIpartite Motif

МНС I - major histocompatibility complex I, главный комплекс гистосовместимости I

HDAC — гистондеацетилаза

ОПЛ — острый промиелоцитарный лейкоз

GAPDH - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа

GFP — green fluorescence protein, зелёный флуоресцентный белок

NF-kB - nuclear factor kappa-B, ядерный фактор к В

NLS - nuclear localisation signal, сигнал ядерной локализации

NES - nuclear export signal, сигнал ядерного экспорта

Taq ДНК-полимераза - термостабильная ДНК-полимераза Thermus aquaticus

ДТТ — дитиотриэтол

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота кДНК - кодирующая ДНК мРНК - матричная РНК рРНК - рибосомная РНК кДа - килоДальтон

ОТ - обратная транскрипция

ПААГ - полиакриламидный гель

ТЕМЕД - тетраэтиленметилендиамин

X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-р-Б-галактопиранозид

ЭДТА — этилендиаминтетраацетат

SV40 - simian virus 40, обезьяний вирус 40

BRUCE - BIR Repeat Containing Ubiquitin-conjugating Enzyme, коньюгированный с убиквитином белок, содержащий BIR-домен c-IAP - cellular inhibitor of apoptosis protein 1, клеточный ингибитор апоптоза NAIP - Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein, нейрональный белок, ингибирующий апоптоз

TNF - tumor necrosis factor, фактор некроза опухоли

VEGF - vascular endothelial growth factor, фактор роста эндотелия сосудов dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфаты

HMPJI — немелкоклеточный рак легкого

АК - аденокарцинома

ПРЛ - плоскоклеточный рак легкого

ПРП - плоскоклеточный рак пищевода

IgG - иммуноглобулин G

INF - интерферон

ISRE - INF-a и —/З-stimulated response element GAS - INF-^-activation site DISC - death-inducing signalling complex PARP - поли-АДФ-рибоза-полимераза

1. ВВЕДЕНИЕ

Выявление генов, вовлеченных в процесс образования опухолей, может значительно облегчить раннюю диагностику и создание новых лекарственных противоопухолевых препаратов. Нарушение путей передачи апоптотического сигнала и реализации апоптоза играет ключевую роль в онкогенезе. Особый интерес в последние годы вызывают белки, вовлеченные в апоптоз, которые могут быть использованы как маркеры опухолевых процессов и/или как потенциальные мишени для различных терапевтических агентов. Одним из наиболее интересных с этой точки зрения является сурвивин (BIRC-5), относящийся к семейству белков-ингибиторов апоптоза (IAP, Inhibitor of Apoptosis Protein) [1]. Помимо ингибирования апоптоза сурвивин участвует в других клеточных процессах, в частности, в митотическом делении клетки и процессе ангиогенеза.

Ген BIRC5 экспрессируется в процессе эмбрионального развития, но его мРНК и белок не детектируются в конечно дифференцированных нормальных тканях взрослого организма. Тем не менее, его повышенная экспрессия наблюдается в трансформированных клетках и практически во всех типах злокачественных опухолей [1].

Уровень сурвивина в клетках регулируется активностью ряда генов. Одним из природных ингибиторов сурвивина является белок SMAC (Second Mitohondria-derived Activator of Caspase). SMAC - митохондриальный белок, который выходит в цитозоль во время апоптоза и обеспечивает активацию каспаз за счёт связывания с белками семейства IAP, предотвращая тем самым их ингибирующее действие по отношению к каспазам [2].

Другим известным природным ингибитором сурвивина является белок PML (Promyelocytic Leukemia) [3]. PML - многофункциональный белок, представленный двенадцатью изоформами и участвующий в процессах регуляции транскрипции и трансляции, удлинении теломер, репарации ДНК, а также регуляции клеточной смерти. Потеря гетерозиготности по гену PML или мутации в этом гене присутствуют при многих типах рака различной гистологии, что часто ассоциировано с прогрессией опухоли и неблагоприятным прогнозом [4]. Один из механизмов включения апоптоза с участием PML связан с подавлением активности промотора гена BIRC5. Такая функциональная активность показана только для изоформы PML6, относительно подобной активности других изоформ данные отсутствуют [3].

Таким образом, на основании литературных данных можно сделать вывод о том, что белки PML и SMAC могут быть использованы в противоопухолевой терапии для ингибирования сурвивина, ключевого белка в регуляции апоптоза. Однако, несмотря на значительное количество работ, посвященных исследованию функций этих генов, ряд вопросов остается нерешенным. Так, например, данные по экспрессии генов SMAC и PML при опухолеобразовании противоречивы, а возможность корреляции повышенной экспрессии BIRC5 в опухолевой ткани с экспрессией генов его ингибиторов SMAC и PML вообще не исследовали. Терапевтический противопухолевый эффект белка SMAC, в том числе его влияние на активность белка сурвивина, в большинстве работ наблюдали при непосредственной обработке клеток препаратом белка [5-7], и лишь в нескольких работах проводили исследование возможности использования генно-инженерных экспрессионных терапевтических конструкций, содержащих кДНК SMAC [8, 9]. Способность подавлять активность промотора BIRC5 и уменьшать количество эндогенного сурвивина в опухолевых клетках была изучена лишь в двух работах и показана только для одной изоформы PML, PML6 [3, 10].

Настоящая работа состоит из двух частей. В первой части проведено исследование экспрессии генов BIRC5, SMAC и PML в опухолевых и нормальных тканях пациентов с диагнозами пемелкоклеточный рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода, а также в опухолевых клеточных линиях человека. Было определено, что увеличение экспрессии гена BIRC5 в опухолевых тканях по сравнению с нормальными не коррелирует с изменениями экспрессии генов SMAC и PML. Во второй части изучали влияние стабильной и транзиентной экспрессии SMAC и PML1 (наиболее представленной изоформы PML в клетке) на клетки опухолевых клеточных культур человека. Было показано, что стабильная экспрессия SMAC не влияет на клеточную пролиферацию и чувствительность к противоопухолевому препарату цисплатину клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358. Транзиентная и стабильная экспрессия последовательности кДНК PML, кодирующей С-концевой фрагмент белка PML1, в опухолевых клетках человека вызывает выраженный апоптотический эффект. Цель работы

Целью данной работы было выявление корреляций между экспрессией сурвивина и его ингибиторов на уровне РНК и белка в нормальных и опухолевых тканях пациентов с диагнозом немелкоклеточный рак легкого и плоскоклеточный рак пищевода и оценка терапевтического потенциала природных ингибиторов сурвивина SMAC и PML в генной терапии злокачественных опухолей.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Онкологические заболевания являются одной из важнейших причин смертности в мире и их число с каждым годом растет. Нарушение процесса программируемой клеточной гибели, или апоптоза, играет ключевую роль в прогрессии злокачественных опухолей. Процесс апоптоза контролируется большим числом индукторов и ингибиторов [11]. Семейство белков-ингибиторов апоптоза IAPs (Inhibitors of apoptosis proteins) включает в себя белки различного происхождения, способные ингибировать процесс апоптоза путём снижения активности каспаз [12]. Сурвивин (BIRC5) - уникальный белок семейства IAP, который участвует в трёх клеточных процессах (ангиогенез, клеточное деление и процесс апоптоза) и экспрессируется на повышенном уровне практически при всех типах рака [1]. SMAC и PML - природные ингибиторы сурвивина [2, 3], которые могут быть использованы для подавления сурвивина в опухолевых клетках.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Вайшля, Наталья Аркадьевна

5. ВЫВОДЫ

1. При немелкоклеточном раке легкого человека экспрессия гена BIRC5 повышена в опухолевых тканях по сравнению с прилегающими к опухолям тканями и в здоровых легких не детектируется.

2. При плоскоклеточном раке пищевода человека повышенная экспрессия BIRC5 в большинстве случаев наблюдается как в опухолевых, так и в прилегающих к опухоли тканях, но не в нормальных тканях пищевода.

3. Полученные результаты в сочетании с литературными данными позволяют рассматривать экспрессию гена BIRC5 как диагностический маркер при немелкоклеточном раке легкого и плоскоклеточном раке пищевода человека.

4. Продемонстрировано, что экспрессия генов природных ингибиторов сурвивина, SMAC и PML, одинакова в нормальных и опухолевых тканях легкого и пищевода. Увеличение экспрессии гена BIRC5 при опухолеобразовании в легком и пищеводе не коррелирует с изменениями экспрессии генов SMAC и PML.

5. Стабильная гетерологичная экспрессия SMAC приводит к компенсаторному увеличению количества эндогенного сурвивина и не влияет на клеточную пролиферацию и чувствительность клеток линий А549, Hela, Calu-1 и NCI-H358 к противоопухолевому препарату цисплатину.

6. Показано, что С-концевой фрагмент белка PML1 обладает проапоптотической активностью. Интенсивность индукции апоптоза в клеточных линиях в условиях транзиентной трансфекции зависит от статуса р53 и минимальна в клетках с функционально дефектным белком р53. С-концевой фрагмент белка PML1, в отличие от С-копцевого фрагмента PML6, не влияет на активность опухолеспецифического промотора гена BIRC5 человека. Таким образом, С-концевой фрагмент PML1 является потенциальным терапевтическим агентом в лечении опухолей с функционально активным белком р53.

4.8. Заключение

Полученные в данной работе результаты позволяют утверждать, что ген BIRC5 является надежным маркером при опухолеобразовании у пациентов с немелкоклеточным раком легкого и плоско клеточным раком пищевода, в то время как гены SMAC и PML не могут быть использованы в качестве диагностических маркеров опухолеобразования. PML1 является потенциальным терапевтическим агентом в лечении злокачественных опухолей с функционально активным р53, и, в отличие от PML6, его проапототическое действие не связано с подавлением активности промотора гена BIRC5. SMAC не является перспективным агентом в противоопухолевой терапии, по крайней мере для опухолей легкого, поскольку его повышенная экспрессия в раковых клеточных культурах легочного происхождения приводит к компенсаторному увеличению содержания эндогенного сурвивина, который является ингибитором апоптоза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Вайшля, Наталья Аркадьевна, Москва

1. Altieri DC. Survivin, cancer networks and pathway-directed drug discovery. Nat Rev Cancer 2008,8:61-70.

2. Du C, Fang M, Li Y, Li L, Wang X. Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell 2000,102:33-42.

3. Xu ZX, Zhao RX, Ding T, Tran TT, Zhang W, Pandolfi PP, Chang KS. Promyelocytic leukemia protein 4 induces apoptosis by inhibition of survivin expression. J Biol Chem 2004,279:1838-1844.

4. Salomoni P, Ferguson BJ, Wyllie AH, Rich T. New insights into the role of PML in tumour suppression. Cell Res 2008,18:622-640.

5. Arnt CR, Chiorean MV, Heldebrant MP, Gores GJ, Kaufmann SH. Synthetic Smac/DIABLO peptides enhance the effects of chemotherapeutic agents by binding XIAP and cIAPl in situ. J Biol Chem 2002,277:44236-44243.

6. Petrucci E, Pasquini L, Petronelli A, Saulle E, Mariani G, Riccioni R, et al. A small molecule Smac mimic potentiates TRAIL-mediated cell death of ovarian cancer cells. Gynecol Oncol 2007,105:481-492.

7. Mao HL, Liu PS, Zheng JF, Zhang PH, Zhou LG, Xin G, Liu C. Transfection of Smac/DIABLO sensitizes drug-resistant tumor cells to TRAIL or paclitaxel-induced apoptosis in vitro. Pharmacol Res 2007,56:483-492.

8. McNeish IA, Lopes R, Bell SJ, McKay TR, Fernandez M, Lockley M, et al. Survivin interacts with Smac/DIABLO in ovarian carcinoma cells but is redundant in Smac-mediated apoptosis. Exp Cell Res 2005,302:69-82.

9. Li L, He D, He H, Wang X, Zhang L, Luo Y, Nan X. Overexpression of PML induced apoptosis in bladder cancer cell by caspase dependent pathway. Cancer Lett 2006,236:259-268.

10. Zimmermann КС, Bonzon C, Green DR. The machinery of programmed cell death. Pharmacol Ther 2001,92:57-70.1213,14,15,16,17,18,19,20,21.22,23,24.25,26.

11. Schimmer AD. Inhibitor of apoptosis proteins: translating basic knowledge into clinical practice. Cancer Res 2004,64:7183-7190.

12. В.Д. Самуилов A.B. Олескин, E.M. Лагунова. Программируемая клеточная смерть. Биохимия 2000,65:1029-1046.

13. Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer 1972,26:239-257.

14. Wyllie AH, Kerr JF, Currie AR. Cell death: the significance of apoptosis. Int Rev Cytol1980,68:251-306.

15. Cohen GM, Sun XM, Fearnhead H, MacFarlane M, Brown DG, Snowden RT, Dinsdale D. Formation of large molecular weight fragments of DNA is a key committed step of apoptosis in thymocytes. J Immunol 1994,153:507-516.

16. Fischer U, Janicke RU, Schulze-Osthoff K. Many cuts to ruin: a comprehensive update of caspase substrates. Cell Death Differ 2003,10:76-100.

17. Nicholson DW, Thornberry NA. Caspases: killer proteases. Trends Biochem Sci 1997,22:299-306.

18. Stennicke HR, Salvesen GS. Properties of the caspases. Biochim Biophys Acta 1998,1387:17-31.

19. Vermeulen K, Van Bockstaele DR, Berneman ZN. Apoptosis: mechanisms and relevancein cancer. Ann Hematol 2005,84:627-639.

20. Wajant II. Death receptors. Essays Biochem 2003,39:53-71.

21. Ashkenazi A, Dixit VM. Apoptosis control by death and decoy receptors. Curr Opin Cell Biol 1999,11:255-260.

22. Peter ME, Krammer PH. The CD95(APO-l/Fas) DISC and beyond. Cell Death Differ 2003,10:26-35.

23. Scaffidi C, Fulda S, Srinivasan A, Friesen C, Li F, Tomaselli KJ, et al. Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways. Embo J 1998,17:1675-1687.27